化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法及びその評価方法を応用したスクリーニング方法
【課題】 簡便かつ迅速にＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法を提供すること。
【解決手段】 化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激し、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定し、測定結果に基づいて化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法。
【解決手段】 化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激し、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定し、測定結果に基づいて化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法及びその評価方法を応用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗炎症薬としてよく使用されている非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の主な作用機序は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害による、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン（ＰＧｓ）合成阻害である。ＣＯＸには、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の２つのアイソザイムが存在することが知られている（例えば、非特許文献１）。ＣＯＸ−１は全ての細胞に存在する構成型の酵素であり、胃粘膜細胞の保護や正常な腎機能維持、止血作用など、生体保護に関与するＰＧｓを合成する。それに対して、ＣＯＸ−２は誘導型であり、炎症刺激によって様々な炎症関連細胞において発現が誘導され、特に、炎症に関与するＰＧｓがＣＯＸ−２を介して産生される。
【０００３】
ＮＳＡＩＤｓは、その種類によってＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２への選択性が異なり、ＣＯＸ−２を選択的に阻害するＮＳＡＩＤｓは胃腸障害などの副作用を引き起こす可能性が低いと考えられている。したがって、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価することは臨床上及び薬の開発上、重要なことである。
【０００４】
ＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法として、以下のものが知られている。
（１）ヒト絨毛刺激ホルモンで刺激したラット前排卵卵胞の顆粒膜細胞の抽出液から、ＣＯＸ−１酵素及びＣＯＸ−２酵素を単離し、過酸化水素を基質として各酵素のパーオキシダーゼ活性を測定する方法（非特許文献２）。
（２）マウスのＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞由来）を用いる方法（非特許文献３）。
（３）ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみを専ら発現しているヒトの全血由来の成分を使用する方法（非特許文献４）。
【０００５】
【非特許文献１】Byron Cryer et al., Prostaglandins & other Lipid Mediators, vol. 56, pp. 341-361 (1998)
【非特許文献２】Jean Sirois et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 267, pp. 6382-6388 (1992)
【非特許文献３】Elizabeth A. Meade et al., Journal of Lipid mediators, vol. 6, pp. 119-129 (1993)
【非特許文献４】C. Brideau et al., Inflammation Research, vol. 45, pp. 68-74 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）及び（２）の方法では、種差があるためＣＯＸの構造及び活性に違いがあり、ヒトにおけるＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価するには不適当である。また、酵素や細胞の調製といった手間がかかり、酵素活性やｍＲＮＡの発現量を測定するため、評価に時間がかかるという問題点もある。上記（３）のヒトの全血を使用する方法は、ヒトのＣＯＸを利用しているという利点もあるが、成分の分離の煩雑さや、個体差によるばらつきが大きい等の問題点も多い。また、放射性物質を使用するため、被爆や廃棄の制限も大きな問題となる。さらに、この方法は刺激によってＣＯＸ−２が発現し、それによって合成されるＰＧｓを測定するため、２４時間以上の培養が必要となり、迅速性にも欠ける。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、簡便かつ迅速にＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法を提供することにある。本発明の別の目的は、ＣＯＸ阻害の選択性の評価方法を応用したスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ阻害の選択性と、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量に与えるＮＳＡＩＤｓの影響との間に、一定の関係があることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法を提供する。
【００１０】
上記方法によれば、ＣＯＸ酵素やＣＯＸをトランスフェクトした細胞を調製する必要がなく、かつ、ＣＯＸの酵素活性やＣＯＸのｍＲＮＡの発現量を測定する必要もないため、簡便かつ迅速に評価することが可能である。
【００１１】
本発明は、また、上記評価方法を応用した以下のスクリーニング方法を提供する。
［１］ シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１２】
［２］ シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１３】
［３］ シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１４】
［４］ 上記［１］又は［２］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。
【００１５】
［５］ 上記［２］又は［３］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。
【００１６】
［６］ 抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は、簡便かつ迅速に化合物を評価することが可能である。また、本発明のスクリーニング方法は、簡便かつ迅速に化合物をスクリーニングすることが可能であり、ハイスループットスクリーニングに適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
（化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法）
まず、化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法について説明する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程。
（２）好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３） Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程。
【００２０】
以下、各工程を説明する。工程（１）では、好中球あるいは好中球様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、好中球様の培養細胞も含めて好中球と表現する場合がある。）を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の由来は限定されないが、哺乳類、特にヒトの好中球であることが好ましい。好中球は、常法により血液から採取・精製することができる。例えば、モノ・ポリ分離溶液（大日本製薬）を用いた密度勾配遠心により血液から調製可能である。好中球様の培養細胞とは、好中球様に分化した細胞をいい、例えば、ＨＬ−６０細胞（ヒト前骨髄芽球系株化細胞）をＤＭＳＯなどの分化誘導剤で分化させた細胞やＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系株化細胞）をＢｔ２ｃＡＭＰ（ジブチリルｃＡＭＰ）などの分化誘導剤で分化させた細胞などが挙げられる。
【００２１】
好中球の刺激は、培養液中や緩衝液中で行うことが可能である。好中球の培養に用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地など）や一般的な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）が使用可能である。培地又は緩衝液の好適なｐＨ及び温度は、それぞれ６〜８及び３７℃である。Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていても含まれていなくてもよいが、Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていることが望ましく、典型的には０．５ｍＭ〜２ｍＭにＣａ２＋濃度は調整される。Ｃａ２＋キレート剤としては、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）やＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などの公知のＣａ２＋キレート剤を用いることが可能である。培養液や緩衝液にＣａ２＋キレート剤を添加することにより、好中球の細胞内へのＣａ２＋流入を阻害している。Ｃａ２＋キレート剤の濃度は好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入を阻止できるのに充分な濃度であればよく、好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。Ｃａ２＋キレート剤としてＥＧＴＡやＥＤＴＡを用いる場合、その濃度は典型的には１ｍＭ〜１０ｍＭである。
【００２２】
好中球の刺激は、ｆＭＬＰ（ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）、Ｃ５ａ（活性化補体成分の一種）及びＳＯＺ（ｓｅｒｕｍ−ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ−Ｚｙｍｏｓａｎ；血清オプソニン化ザイモサン）等の走化性因子を好中球に接触させることにより達成される。走化性因子の濃度は好中球を刺激できる濃度であればよく、その種類に応じて濃度は異なるが、各走化性因子の好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。そして、好中球の刺激を、被検対象である化合物の存在下（複数の濃度であってもよい）及び非存在下の双方で行うことにより、好中球の挙動（具体的には、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量）の変化が異なるため、その挙動の違いにより化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価することが可能である。
【００２３】
工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。ｆＭＬＰ等による刺激を受けた好中球は、通常、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し、スーパーオキシド産生量が増加する。しかし、ＣＯＸ阻害化合物の存在下では、ＣＯＸ阻害の選択性に依存して、その挙動が変化する。また、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激すると、好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入が生じない。そのため、Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下では、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の変化は異なり、しかも、その違いはＣＯＸ阻害の選択性に依存する。
【００２４】
細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量は、常法に従って、また、市販の試薬や測定キットを用いて、測定することが可能である。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、例えば、カルシウム蛍光指示薬（例えば、Ｆｕｒａ−２やＦｌｕｏ−３、膜透過性を高めたそれらのエステル誘導体など、数多くのカルシウム蛍光指示薬が市販されている）を好中球に導入し、励起光を照射して発生した蛍光を測定することにより可能である。スーパーオキシド産生量の測定は、例えば、ＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）などのスーパーオキシドと反応して化学発光を生じる試薬を測定系に添加し、好中球がスーパーオキシドを産生するに伴い発生する化学発光を測定することにより可能である。
【００２５】
本発明者らが開発した化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−３３８０４５号公報及び特開２０００−１３１２３４号公報等に記載）は、化学発光及び蛍光を同時に測定できるため、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の測定に特に適している。
【００２６】
工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する。ここで、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「変化しない」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が０．７以上１．３以下であることが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加する」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が１．３よりも大きいことが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「減少する」とは、０．７未満であることが好ましい。さらに、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加しない」とは、「変化しない」又は「減少する」のいずれかの状態を表し、「減少しない」とは「変化しない」又は「増加する」のいずれかの状態を表す。特に、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の評価に当っては、複数用量（濃度）の被検化合物で測定を行い、用量依存曲線を作成し、その最大変化量について評価を行うことが好ましい。
【００２７】
（ＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法）
次に、本発明のＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００２８】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００２９】
このようにして選択されたＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬として利用できるだけでなく、抗血栓薬としても利用することが可能である。血小板には核がなくタンパク質合成はおきない。したがって、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであり、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。
【００３０】
本発明のＣＯＸを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程。
【００３１】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００３２】
このようにして選択された非選択的にＣＯＸ阻害する化合物は、心臓疾患（特に、心筋梗塞）の患者に投与する抗炎症薬として利用することが可能である。ＣＯＸ−２選択的なＮＳＡＩＤｓは心筋梗塞のリスクを増加させるという報告があり、非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、前述のように血小板のＣＯＸ−１を阻害することにより血栓形成を防止するため、心筋梗塞のリスクを低減できるからである。
【００３３】
本発明のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及び好中球のスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００３４】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００３５】
このようにして選択されたＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、胃腸障害などの副作用の少ない抗炎症薬として利用することが可能である。また、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、癌の成長に関与していることが指摘されている（例えば、非特許文献１）。このことから、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬としてだけでなく、抗腫瘍薬としても利用することが可能と考えられる。
【００３６】
（抗血栓薬のスクリーニング方法）
次に、本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法は、上記のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択することを特徴とする。
【００３７】
既に説明したように、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであって、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。したがって、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗血栓薬の候補となり得る。
【００３８】
（抗腫瘍薬のスクリーニング方法）
最後に、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択することを特徴とする。
【００３９】
既に説明したように、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、腫瘍の成長に関与していることが指摘されている。また、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頚部の扁平上皮癌などのヒト癌細胞において、ＣＯＸ−２の発現が増強していることが報告されている。さらに、ＮＳＡＩＤｓ服用者は、大腸癌や乳癌などの癌の発症率が有意に低いことも報告されている。
【００４０】
より具体的には、大腸癌におけるＣＯＸ−２の発現及び選択的ＣＯＸ−２阻害剤によって大腸癌の増殖が抑制されることが、Hongmiao Sheng et al., The Journal of Clinical Investigation, vol. 99, pp. 2254-2259 (1997) において報告されている。また、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌におけるＣＯＸ−２の発現及びＣＯＸ−２が癌転移へ関与（原発巣からの離脱、基底膜の破壊、血管内皮細胞への接着、転移巣での増殖、血管新生など）することは、垣内佳美ら、肝胆膵、４５巻、５２７−５３３頁（２００２年）において報告されている。また、ヒトの大腸癌、乳癌、前立腺癌及び肺癌の生検組織やその新生腫瘍血管の細胞においてＣＯＸ−２の発現が認められ、ＣＯＸ−２阻害剤が血管新生を阻害して腫瘍細胞の増殖を抑制することが、Jaime L. Masferrer et al., Cancer Research, vol. 60, pp. 1306-1311 (2000) において報告されている。また、癌化に伴い子宮内膜におけるＣＯＸ−２の発現が増加し、ＣＯＸ−２阻害剤によって癌の増殖、進展が抑制されることが、長谷川清志ら、産婦人科治療、８３巻、６１０頁（２００１年）において報告されている。さらに、ＣＯＸ−２阻害剤は腫瘍起因性の血管新生を阻害し、癌の転移を抑制する効果があり、ヒトの癌治療に対する新たな治療薬となりうることが、Jaime L. Masferrer et al., Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 889, pp. 84-86 (1999) やStephen Gately et al., Seminars in Oncology, vol. 31, pp. 2-11 (2004) で報告されている。
【００４１】
したがって、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗腫瘍薬（抗癌薬）の候補となり得る。抗腫瘍薬の中でも、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌及び頭頚部の扁平上皮癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましく、特に大腸癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましい。
【００４２】
さらに、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物と、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物と、を区別する方法は、抗腫瘍薬のスクリーニング方法に応用することが可能である。すなわち、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００４３】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物又はＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明について詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
ＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。
【００４６】
好中球として、ＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；分化誘導剤）で分化させたものを用いた。すなわち、終濃度１．２８％のＤＭＳＯを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）入りＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＨＬ−６０細胞を３．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの密度で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。培地から細胞を回収し、ＲＨバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
【００４７】
この細胞懸濁液に３μＭのＦｌｕｏ３−ＡＭ（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−ザンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；カルシウム検出試薬；蛍光性指示薬）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分間インキュベーションし、細胞内にＦｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた。この細胞をＲＨバッファーで２回洗浄し、同バッファーに懸濁させた。得られた細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）に５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、さらにＣａＣｌ２及びＣＬＡ（スーパーオキシド検出試薬；化学発光性指示薬）をそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加えた。
【００４８】
このように調製した試料溶液１ｍＬをセルに入れ、化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報に記載の装置）のセルホルダーにセルをセットした。セル内の試料溶液は、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。試料溶液に１００μＭのｆＭＬＰを１０μＬ加えて好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。
【００４９】
用いたＣＯＸ阻害薬は以下の通りである：ＣＯＸ−１選択的阻害薬としてフルルビプロフェン及びケトプロフェン、非選択的ＣＯＸ阻害薬としてアスピリン及びイブプロフェン、ＣＯＸ−２選択的阻害薬としてエトドラク及びニメスリド。また、ＣＯＸ阻害薬の添加量（測定セルの試料溶液の含量）は、成人１回分の投与量の１／５００、１／５０００及び１／５００００倍量となるように添加した。
【００５０】
図１〜３は、ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。縦軸はＣＯＸ阻害薬添加時の蛍光（細胞内Ｃａ２＋濃度）及び化学発光（スーパーオキシド産生量）のピーク面積をブランクのピーク面積（ＤＭＳＯ添加時のピーク面積）で除した比を表し、横軸はＣＯＸ阻害薬の添加量（対数）を表す。図１はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図２は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図３はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。
【００５１】
図１から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は変化せず、また、スーパーオキシド産生量も変化しなかった。一方、図２及び３から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。
【００５２】
（実施例２）
ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。
【００５３】
実施例１と同様にして、Ｆｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた好中球の細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）を調製した。細胞懸濁液に、ＣａＣｌ２及びＣＬＡをそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加え、室温にて５分間インキュベートし、ＥＧＴＡを終濃度が５ｍＭとなるように加え、室温にて２．５分間インキュベートした。さらに、５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、室温にて２．５分間インキュベートした。その後は、実施例１と同様に好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。
【００５４】
用いたＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ阻害薬の添加量は、実施例１と同様である。
【００５５】
図４〜６は、ＥＧＴＡ存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。図４はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図５は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図６はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。
【００５６】
図４から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。また、図５から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少せず、スーパーオキシド産生量も減少しなかった。さらに、図６から明らかなように、ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。
【図２】非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。
【図３】ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。
【図４】ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。
【図５】ＥＧＴＡの存在下かつ非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。
【図６】ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法及びその評価方法を応用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗炎症薬としてよく使用されている非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）の主な作用機序は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害による、炎症性メディエーターであるプロスタグランジン（ＰＧｓ）合成阻害である。ＣＯＸには、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の２つのアイソザイムが存在することが知られている（例えば、非特許文献１）。ＣＯＸ−１は全ての細胞に存在する構成型の酵素であり、胃粘膜細胞の保護や正常な腎機能維持、止血作用など、生体保護に関与するＰＧｓを合成する。それに対して、ＣＯＸ−２は誘導型であり、炎症刺激によって様々な炎症関連細胞において発現が誘導され、特に、炎症に関与するＰＧｓがＣＯＸ−２を介して産生される。
【０００３】
ＮＳＡＩＤｓは、その種類によってＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２への選択性が異なり、ＣＯＸ−２を選択的に阻害するＮＳＡＩＤｓは胃腸障害などの副作用を引き起こす可能性が低いと考えられている。したがって、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価することは臨床上及び薬の開発上、重要なことである。
【０００４】
ＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法として、以下のものが知られている。
（１）ヒト絨毛刺激ホルモンで刺激したラット前排卵卵胞の顆粒膜細胞の抽出液から、ＣＯＸ−１酵素及びＣＯＸ−２酵素を単離し、過酸化水素を基質として各酵素のパーオキシダーゼ活性を測定する方法（非特許文献２）。
（２）マウスのＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞由来）を用いる方法（非特許文献３）。
（３）ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２のいずれか一方のみを専ら発現しているヒトの全血由来の成分を使用する方法（非特許文献４）。
【０００５】
【非特許文献１】Byron Cryer et al., Prostaglandins & other Lipid Mediators, vol. 56, pp. 341-361 (1998)
【非特許文献２】Jean Sirois et al., The Journal of Biological Chemistry, vol. 267, pp. 6382-6388 (1992)
【非特許文献３】Elizabeth A. Meade et al., Journal of Lipid mediators, vol. 6, pp. 119-129 (1993)
【非特許文献４】C. Brideau et al., Inflammation Research, vol. 45, pp. 68-74 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記（１）及び（２）の方法では、種差があるためＣＯＸの構造及び活性に違いがあり、ヒトにおけるＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ選択性を評価するには不適当である。また、酵素や細胞の調製といった手間がかかり、酵素活性やｍＲＮＡの発現量を測定するため、評価に時間がかかるという問題点もある。上記（３）のヒトの全血を使用する方法は、ヒトのＣＯＸを利用しているという利点もあるが、成分の分離の煩雑さや、個体差によるばらつきが大きい等の問題点も多い。また、放射性物質を使用するため、被爆や廃棄の制限も大きな問題となる。さらに、この方法は刺激によってＣＯＸ−２が発現し、それによって合成されるＰＧｓを測定するため、２４時間以上の培養が必要となり、迅速性にも欠ける。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、簡便かつ迅速にＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法を提供することにある。本発明の別の目的は、ＣＯＸ阻害の選択性の評価方法を応用したスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＮＳＡＩＤｓのＣＯＸ阻害の選択性と、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量に与えるＮＳＡＩＤｓの影響との間に、一定の関係があることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法を提供する。
【００１０】
上記方法によれば、ＣＯＸ酵素やＣＯＸをトランスフェクトした細胞を調製する必要がなく、かつ、ＣＯＸの酵素活性やＣＯＸのｍＲＮＡの発現量を測定する必要もないため、簡便かつ迅速に評価することが可能である。
【００１１】
本発明は、また、上記評価方法を応用した以下のスクリーニング方法を提供する。
［１］ シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１２】
［２］ シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１３】
［３］ シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【００１４】
［４］ 上記［１］又は［２］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。
【００１５】
［５］ 上記［２］又は［３］に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。
【００１６】
［６］ 抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は、簡便かつ迅速に化合物を評価することが可能である。また、本発明のスクリーニング方法は、簡便かつ迅速に化合物をスクリーニングすることが可能であり、ハイスループットスクリーニングに適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
（化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法）
まず、化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法について説明する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する方法は以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程。
（２）好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３） Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程。
【００２０】
以下、各工程を説明する。工程（１）では、好中球あるいは好中球様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、好中球様の培養細胞も含めて好中球と表現する場合がある。）を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の由来は限定されないが、哺乳類、特にヒトの好中球であることが好ましい。好中球は、常法により血液から採取・精製することができる。例えば、モノ・ポリ分離溶液（大日本製薬）を用いた密度勾配遠心により血液から調製可能である。好中球様の培養細胞とは、好中球様に分化した細胞をいい、例えば、ＨＬ−６０細胞（ヒト前骨髄芽球系株化細胞）をＤＭＳＯなどの分化誘導剤で分化させた細胞やＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系株化細胞）をＢｔ２ｃＡＭＰ（ジブチリルｃＡＭＰ）などの分化誘導剤で分化させた細胞などが挙げられる。
【００２１】
好中球の刺激は、培養液中や緩衝液中で行うことが可能である。好中球の培養に用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地など）や一般的な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など）が使用可能である。培地又は緩衝液の好適なｐＨ及び温度は、それぞれ６〜８及び３７℃である。Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていても含まれていなくてもよいが、Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で好中球を刺激する場合には培養液中にＣａ２＋が含まれていることが望ましく、典型的には０．５ｍＭ〜２ｍＭにＣａ２＋濃度は調整される。Ｃａ２＋キレート剤としては、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸）やＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などの公知のＣａ２＋キレート剤を用いることが可能である。培養液や緩衝液にＣａ２＋キレート剤を添加することにより、好中球の細胞内へのＣａ２＋流入を阻害している。Ｃａ２＋キレート剤の濃度は好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入を阻止できるのに充分な濃度であればよく、好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。Ｃａ２＋キレート剤としてＥＧＴＡやＥＤＴＡを用いる場合、その濃度は典型的には１ｍＭ〜１０ｍＭである。
【００２２】
好中球の刺激は、ｆＭＬＰ（ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）、Ｃ５ａ（活性化補体成分の一種）及びＳＯＺ（ｓｅｒｕｍ−ｏｐｓｏｎｉｚｅｄ−Ｚｙｍｏｓａｎ；血清オプソニン化ザイモサン）等の走化性因子を好中球に接触させることにより達成される。走化性因子の濃度は好中球を刺激できる濃度であればよく、その種類に応じて濃度は異なるが、各走化性因子の好適な濃度は当該技術分野でよく知られている。そして、好中球の刺激を、被検対象である化合物の存在下（複数の濃度であってもよい）及び非存在下の双方で行うことにより、好中球の挙動（具体的には、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量）の変化が異なるため、その挙動の違いにより化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価することが可能である。
【００２３】
工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。ｆＭＬＰ等による刺激を受けた好中球は、通常、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇し、スーパーオキシド産生量が増加する。しかし、ＣＯＸ阻害化合物の存在下では、ＣＯＸ阻害の選択性に依存して、その挙動が変化する。また、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で好中球を刺激すると、好中球の細胞内へのＣａ２＋の流入が生じない。そのため、Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下では、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の変化は異なり、しかも、その違いはＣＯＸ阻害の選択性に依存する。
【００２４】
細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量は、常法に従って、また、市販の試薬や測定キットを用いて、測定することが可能である。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、例えば、カルシウム蛍光指示薬（例えば、Ｆｕｒａ−２やＦｌｕｏ−３、膜透過性を高めたそれらのエステル誘導体など、数多くのカルシウム蛍光指示薬が市販されている）を好中球に導入し、励起光を照射して発生した蛍光を測定することにより可能である。スーパーオキシド産生量の測定は、例えば、ＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）などのスーパーオキシドと反応して化学発光を生じる試薬を測定系に添加し、好中球がスーパーオキシドを産生するに伴い発生する化学発光を測定することにより可能である。
【００２５】
本発明者らが開発した化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−３３８０４５号公報及び特開２０００−１３１２３４号公報等に記載）は、化学発光及び蛍光を同時に測定できるため、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の測定に特に適している。
【００２６】
工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物のＣＯＸ阻害の選択性を評価する。ここで、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「変化しない」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が０．７以上１．３以下であることが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加する」とは、化合物の存在下での測定値を化合物の非存在下での測定値で除した数値が１．３よりも大きいことが好ましい。また、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「減少する」とは、０．７未満であることが好ましい。さらに、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度（スーパーオキシド産生量）が「増加しない」とは、「変化しない」又は「減少する」のいずれかの状態を表し、「減少しない」とは「変化しない」又は「増加する」のいずれかの状態を表す。特に、細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の評価に当っては、複数用量（濃度）の被検化合物で測定を行い、用量依存曲線を作成し、その最大変化量について評価を行うことが好ましい。
【００２７】
（ＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法）
次に、本発明のＣＯＸ阻害化合物のスクリーニング方法について説明する。本発明のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００２８】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００２９】
このようにして選択されたＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬として利用できるだけでなく、抗血栓薬としても利用することが可能である。血小板には核がなくタンパク質合成はおきない。したがって、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであり、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。
【００３０】
本発明のＣＯＸを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程。
【００３１】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００３２】
このようにして選択された非選択的にＣＯＸ阻害する化合物は、心臓疾患（特に、心筋梗塞）の患者に投与する抗炎症薬として利用することが可能である。ＣＯＸ−２選択的なＮＳＡＩＤｓは心筋梗塞のリスクを増加させるという報告があり、非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、前述のように血小板のＣＯＸ−１を阻害することにより血栓形成を防止するため、心筋梗塞のリスクを低減できるからである。
【００３３】
本発明のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及び好中球のスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００３４】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物がＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【００３５】
このようにして選択されたＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、胃腸障害などの副作用の少ない抗炎症薬として利用することが可能である。また、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、癌の成長に関与していることが指摘されている（例えば、非特許文献１）。このことから、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物は、抗炎症薬としてだけでなく、抗腫瘍薬としても利用することが可能と考えられる。
【００３６】
（抗血栓薬のスクリーニング方法）
次に、本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗血栓薬のスクリーニング方法は、上記のＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択することを特徴とする。
【００３７】
既に説明したように、血小板に存在するＣＯＸはＣＯＸ−１のみであって、誘導型であるＣＯＸ−２は存在しない。ＣＯＸ−１を阻害する化合物は血小板においてＣＯＸ−１を阻害し、アラキドン酸からＰＧＩ２の合成抑制することにより、血小板の凝集を抑制し、血栓形成を防止することが可能である。したがって、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗血栓薬の候補となり得る。
【００３８】
（抗腫瘍薬のスクリーニング方法）
最後に、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法について説明する。本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、上記の非選択的にＣＯＸを阻害する化合物をスクリーニングする方法又は上記のＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択することを特徴とする。
【００３９】
既に説明したように、ＣＯＸ−２により産生されるＰＧは、腫瘍血管の新生を誘導することによって、腫瘍の成長に関与していることが指摘されている。また、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頚部の扁平上皮癌などのヒト癌細胞において、ＣＯＸ−２の発現が増強していることが報告されている。さらに、ＮＳＡＩＤｓ服用者は、大腸癌や乳癌などの癌の発症率が有意に低いことも報告されている。
【００４０】
より具体的には、大腸癌におけるＣＯＸ−２の発現及び選択的ＣＯＸ−２阻害剤によって大腸癌の増殖が抑制されることが、Hongmiao Sheng et al., The Journal of Clinical Investigation, vol. 99, pp. 2254-2259 (1997) において報告されている。また、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌におけるＣＯＸ−２の発現及びＣＯＸ−２が癌転移へ関与（原発巣からの離脱、基底膜の破壊、血管内皮細胞への接着、転移巣での増殖、血管新生など）することは、垣内佳美ら、肝胆膵、４５巻、５２７−５３３頁（２００２年）において報告されている。また、ヒトの大腸癌、乳癌、前立腺癌及び肺癌の生検組織やその新生腫瘍血管の細胞においてＣＯＸ−２の発現が認められ、ＣＯＸ−２阻害剤が血管新生を阻害して腫瘍細胞の増殖を抑制することが、Jaime L. Masferrer et al., Cancer Research, vol. 60, pp. 1306-1311 (2000) において報告されている。また、癌化に伴い子宮内膜におけるＣＯＸ−２の発現が増加し、ＣＯＸ−２阻害剤によって癌の増殖、進展が抑制されることが、長谷川清志ら、産婦人科治療、８３巻、６１０頁（２００１年）において報告されている。さらに、ＣＯＸ−２阻害剤は腫瘍起因性の血管新生を阻害し、癌の転移を抑制する効果があり、ヒトの癌治療に対する新たな治療薬となりうることが、Jaime L. Masferrer et al., Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 889, pp. 84-86 (1999) やStephen Gately et al., Seminars in Oncology, vol. 31, pp. 2-11 (2004) で報告されている。
【００４１】
したがって、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物は、抗腫瘍薬（抗癌薬）の候補となり得る。抗腫瘍薬の中でも、大腸癌、乳癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌及び頭頚部の扁平上皮癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましく、特に大腸癌に対する抗腫瘍薬であることが好ましい。
【００４２】
さらに、ＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物及び非選択的にＣＯＸを阻害する化合物と、ＣＯＸ−１を選択的に阻害する化合物と、を区別する方法は、抗腫瘍薬のスクリーニング方法に応用することが可能である。すなわち、本発明の抗腫瘍薬のスクリーニング方法は、以下の工程（１）〜（３）を備える。
（１）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球を刺激する工程。
（２）好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程。
（３）Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程。
【００４３】
工程（１）では、好中球を刺激することにより、好中球に活性酸素の産生を促す。好中球の種類、好中球の刺激等については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。工程（２）では、刺激を受けた好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した測定方法と同様の測定方法で、測定を行うことが可能である。工程（３）では、工程（２）で得られた測定結果に基づいて被検対象の化合物が非選択的にＣＯＸを阻害する化合物又はＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物であるか否かを評価し選択する。評価方法については、本発明の化合物のＣＯＸ阻害の選択性の評価方法に記載した通りである。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明について詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
ＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。
【００４６】
好中球として、ＨＬ−６０細胞をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；分化誘導剤）で分化させたものを用いた。すなわち、終濃度１．２８％のＤＭＳＯを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）入りＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＨＬ−６０細胞を３．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの密度で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。培地から細胞を回収し、ＲＨバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、５．６ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１０％ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。
【００４７】
この細胞懸濁液に３μＭのＦｌｕｏ３−ＡＭ（１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−ザンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；カルシウム検出試薬；蛍光性指示薬）を加えて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３０分間インキュベーションし、細胞内にＦｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた。この細胞をＲＨバッファーで２回洗浄し、同バッファーに懸濁させた。得られた細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）に５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、さらにＣａＣｌ２及びＣＬＡ（スーパーオキシド検出試薬；化学発光性指示薬）をそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加えた。
【００４８】
このように調製した試料溶液１ｍＬをセルに入れ、化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報に記載の装置）のセルホルダーにセルをセットした。セル内の試料溶液は、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。試料溶液に１００μＭのｆＭＬＰを１０μＬ加えて好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。
【００４９】
用いたＣＯＸ阻害薬は以下の通りである：ＣＯＸ−１選択的阻害薬としてフルルビプロフェン及びケトプロフェン、非選択的ＣＯＸ阻害薬としてアスピリン及びイブプロフェン、ＣＯＸ−２選択的阻害薬としてエトドラク及びニメスリド。また、ＣＯＸ阻害薬の添加量（測定セルの試料溶液の含量）は、成人１回分の投与量の１／５００、１／５０００及び１／５００００倍量となるように添加した。
【００５０】
図１〜３は、ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。縦軸はＣＯＸ阻害薬添加時の蛍光（細胞内Ｃａ２＋濃度）及び化学発光（スーパーオキシド産生量）のピーク面積をブランクのピーク面積（ＤＭＳＯ添加時のピーク面積）で除した比を表し、横軸はＣＯＸ阻害薬の添加量（対数）を表す。図１はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図２は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図３はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。
【００５１】
図１から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は変化せず、また、スーパーオキシド産生量も変化しなかった。一方、図２及び３から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。
【００５２】
（実施例２）
ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下における、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を以下の方法により確認した。
【００５３】
実施例１と同様にして、Ｆｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた好中球の細胞懸濁液（８．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬ）を調製した。細胞懸濁液に、ＣａＣｌ２及びＣＬＡをそれぞれ終濃度が１ｍＭ、１μＭとなるように加え、室温にて５分間インキュベートし、ＥＧＴＡを終濃度が５ｍＭとなるように加え、室温にて２．５分間インキュベートした。さらに、５μＬのＣＯＸ阻害薬の溶液又は５μＬのＤＭＳＯ（ブランクとして）を加え、室温にて２．５分間インキュベートした。その後は、実施例１と同様に好中球を刺激し、Ｆｌｕｏ−３の蛍光強度及びＣＬＡの化学発光強度の変化をモニターした。
【００５４】
用いたＣＯＸ阻害薬及びＣＯＸ阻害薬の添加量は、実施例１と同様である。
【００５５】
図４〜６は、ＥＧＴＡ存在下かつＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化を表すグラフである。図４はＣＯＸ−１選択的阻害薬の結果を表し、図５は非選択的ＣＯＸ阻害薬の結果を表し、図６はＣＯＸ−２選択的阻害薬の結果を表す。
【００５６】
図４から明らかなように、ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。また、図５から明らかなように、非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少せず、スーパーオキシド産生量も減少しなかった。さらに、図６から明らかなように、ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下では、非存在下と比べて、好中球を刺激したときの細胞内Ｃａ２＋濃度は減少し、スーパーオキシド産生量も減少した。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。
【図２】非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。
【図３】ＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。
【図４】ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−１選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）フルルビプロフェン、（ｂ）ケトプロフェン。
【図５】ＥＧＴＡの存在下かつ非選択的ＣＯＸ阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）アスピリン、（ｂ）イブプロフェン。
【図６】ＥＧＴＡの存在下かつＣＯＸ−２選択的阻害薬の存在下での、好中球の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の変化量を表すグラフである。（ａ）エトドラク、（ｂ）ニメスリド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項３】
シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項４】
シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項１】
化合物のシクロオキシゲナーゼ阻害の選択性を評価する方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を、シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物であると評価し、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物であると評価する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
シクロオキシゲナーゼ−１を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が変化せず、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項３】
シクロオキシゲナーゼを非選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少しない化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項４】
シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の存在下及び非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少し、かつ、Ｃａ２＋キレート剤の存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗血栓薬として選択する、抗血栓薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のスクリーニング方法で選択された化合物を抗腫瘍薬として選択する、抗腫瘍薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗腫瘍薬をスクリーニングする方法であって、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の存在下及び非存在下で好中球あるいは好中球様の培養細胞を刺激する工程と、
好中球あるいは好中球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、
Ｃａ２＋キレート剤の非存在下で、化合物の非存在下と比較して化合物の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する化合物を選択する工程と、
を備える方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１８０８２８（Ｐ２００６−１８０８２８Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３８０１２２（Ｐ２００４−３８０１２２）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人農業・生物系産業技術研究機構 生物系特定産業技術研究支援センターからの委託研究事業、産業再生法第３０条の適用を受ける出願
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１６年度、独立行政法人農業・生物系産業技術研究機構 生物系特定産業技術研究支援センターからの委託研究事業、産業再生法第３０条の適用を受ける出願
【出願人】（０００２３６４３６）浜松ホトニクス株式会社 (1,479)
【Ｆターム（参考）】
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