医薬組成物
【解決手段】 発明は、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、すい臓癌、前立腺癌、軟組織癌、腎臓癌、骨肉種、中皮種、多発性骨髄腫、膀胱癌及び食道癌などの癌の転移抑制及び治療医薬組成物、及び前記転移およびがんの治療に対するこれらの医薬組成物の使用方法に関する。本発明の別の観点は、ヒトインターロイキン１０の形成とそれらの合成を抑制する新たなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の更なる観点は、医薬組成物の調整、及びがん及び転移の治療に対するＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療における効果的な薬物に関連する。癌の形成は、望ましくない組織成長を併発する一方で、他方では転移形成を併発する。この分野における研究は多くのメカニズムを開示しているが、依然として、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は卵巣癌などの固形癌それぞれの転移を抑制する又は腫瘍進行を抑制する深刻な副作用のない治療法が存在しない。さらに、この分野における癌は、中皮腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、腎臓癌、食道癌、又は軟組織癌である。腫瘍由来の形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）は、転移、血管形成、及び腫瘍細胞の増殖を誘導することにより悪性進行に極めて重要な役割を果たすために議論されている。さらに、腫瘍細胞における免疫機構からの回避機構において中心的役割を果たしていると見られている。しかし、前記文献におけるＴＧＦ−β役割は、さまざまに議論されている。ＴＧＦ−βによる腫瘍成長の抑制を示唆する実験の一方で、他方では、ＴＧＦ−βによる細胞増殖の誘導を指摘する実験があり、これらが腫瘍の治療法におけるＴＧＦ−βの役割を曖昧にしている。
【０００２】
さらに重要なことは、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３という多くの異なるサブクラスを有しており、それらの腫瘍進行における具体的役割が別々に議論され、しばしばＴＧＦ−βとして要約され、時折混同されるということである。ＴＧＦ−βの各サブクラス、すなわちＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３の具体的役割は、これまでのところ十分には調査されていない。
【背景技術】
【０００３】
欧州特許第１００８６４９号及び欧州特許第０６９５３５４号において、ＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦ−ベータ２両方のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、乳房の腫瘍、食道癌、胃癌及び皮膚発癌症の治療のための医薬組成物の製造に使用されうることが教示されている。臨床研究は、神経膠腫中において前記ＴＧＦ−ベータが重要な役割を果たし、そのために前記ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが神経膠腫及び乳癌などの治療の好ましい対象であるように示すのに対し、他の腫瘍においては状況が全く異なっている。 前立腺癌においては、例えば（Ｗｉｋｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｕｒ−ｏｌ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３４ Ｓ．８５−９４）、他の癌におけるのと同様に、ＴＧＦ−ベータレベルは上昇するという示唆があるが、このシステムが治療目的で操作され得るかどうかは明らかではない。
【０００４】
インタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）によりそれが免疫応答の制御に中心的な役割を果たすことが知られている。一部のインタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞媒介免疫応答を増強することが示されたため、腫瘍細胞の回避機構を補填し腫瘍成長を阻害して転移形成を減少させる方法において、免疫応答を調節するためにヒトにおけるＩＬ−１０の強力な阻害剤を見出すことが重要であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、腫瘍成長における望ましくない細胞増殖を抑制及び／又は転移の形成を抑制する適切な腫瘍の治療法を見つけることが本発明の課題であった。
【０００６】
本発明の１つの課題は、転移形成を抑制する治療法を見出すことである。
【０００７】
例えば膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌及び前立腺癌などの腫瘍は予後不良であり、現在まで有効な治療法は発見されていない。これはまた、中皮腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、腎臓癌、食道癌、軟組織癌などの腫瘍にもあてはまる。従って、このような腫瘍を特異的に抑制する特性を有する新たな治療方法、及び各々の癌の治療に対するこのような治療法の使用方法を見出すのが本発明の課題であった。本発明のもう１つの課題は、免疫機構を調節するインタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）の新しい阻害剤及び適切なそれらの合成方法と、癌治療及び免疫修飾において好まれる医薬組成物の調整のためのそのような阻害剤の使用とを見出すことである。
【０００８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの機構は、直接的効果だけでなく免疫調節効果により作用するようであり、実験的研究において証明され得る。これは、ＴＧＦ−ベータ抗体で可能であったものより効果的にＴＧＦ−ベータアンチセンスヌクレオチドによって細胞移動が阻害されるということを我々が示すことができたため、例えば抗体などによるＴＧＦ−ベータの最先端の阻害より優れている。本発明の医薬組成物は、副作用がより少なく、より有効性があり、より高い生物学的利用可能性（バイオアベイラビリティ）を有し、より高い安全性及び／又は改善された化学安定性を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
我々は、驚くべきことに、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３の形成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）及び／又はインタ−ロイキン１０特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞株及び腫瘍における転移形成を阻害するということを発見した。
【００１０】
我々はさらに、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ３、インタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、白血病及びリンパ腫などの悪性骨髄増殖性疾患だけでなく、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、メラノ−マ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、及び前立腺癌などの固形腫瘍の腫瘍増殖を阻害することを見出した。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ３及びインタ−ロイキン１０アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる適応症は、腎臓癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌及び／又は軟組織癌である。
【００１１】
ＴＧＦ−ベータ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１ＴＧＦ−ベータ３及び／又はインタ−ロイキンのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する上述のように、腫瘍増殖を阻害する。
【００１２】
本発明の別の観点は、インタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）の形成を阻害する新しくより優れたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これにより免疫応答を調節する。
【００１３】
本発明のまた別の観点は、ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドの生成である。
【００１４】
本発明の更なる観点は、医薬組成物の調整に対するインタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。インタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、転移及び／又は腫瘍成長の治療のための医薬組成物の調整にも使用され、このような病気の治療に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は活性誘導体は、転移形成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の調整に使用される。これらの医薬組成物は転移治療に使用される。
【００１６】
本発明の本文中における転移は、少なくとも１つの細胞が腫瘍組織から分離又は解離し、例えばリンパ系及び／又は血管などによりヒト又は動物の身体の別の部位に移動し、そこで留まり新しい腫瘍組織を形成することを意味する。
【００１７】
別の実施形態において、前記オリゴヌクレオチド又は活性誘導体は、転移の形成に関連したタンパク質合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
更なる実施形態において、そのような合成において阻害されたタンパク質は、例えば、腫瘍成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰＳ）及び／又はインタ−ロイキン１０などからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の本文中において、腫瘍成長因子は、形質転換成長因子の同義語として使用される。ＴＧＦ−ベータという用語は、特にＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及び／又はＴＧＦ−ベータ３を含む。
【００２０】
本発明の一実施形態は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はそのＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３活性誘導体、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）及び／又はインタ−ロイキン１０及び／又は癌治療にいて転移形成を阻害する医薬組成物を調整するためのそれらの活性誘導体の使用である。
【００２１】
分子間接着分子（ＣＡＭｓ）は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、内皮性白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１）などの分子を含む。
【００２２】
金属プロテア−ゼは、細胞外マトリックスの成分に幅広いタンパク質分解活性を有し同定順に番号付けされた（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２など）少なくとも１５個の構造的に関連した構成物を含む。金属プロテア−ゼは、これらに限られないが、コラゲナ−ゼ、ゼラチナ−ゼ、ストロメライシン及び金属エラスタ−ゼを含む。
【００２３】
本発明の活性誘導体は、後述のように、オリゴヌクレオチドの修飾物である。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は転移形成の阻害に対する医薬組成物を調整するための活性誘導体は、配列ＩＤ番号１〜６８に基づいて羅列した配列において特定される配列であり、さらに好ましくは、配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、４０及び４２として記載した配列において特定される配列である。転移形成の阻害に対する医薬組成物を調整するためのこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの更なる実施形態は、実施例１９から２４において与えられている。これらのオリゴヌクレオチドは、標的分子に対して改善された親和性を有する。さらに、最先端技術において記載したそれらのオリゴヌクレオチドと比較して、これらの分子の利点は、副作用がより少なく、より有効性があり、生物学的利用可能性がより高く、より高い安全性及び／又は改善された化学安定性を示す。
【００２５】
発明のさらに別の実施例において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、次に挙げる癌における転移阻害において有益で、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄芽細胞腫、メラノ−マ、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、膠肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、ウィルムス腫瘍などの癌における転移阻害において有益である。
【００２６】
より好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、例えば膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、卵巣癌、膵臓癌、軟組織癌などの癌における転移阻害に有益である。本発明の本文中において有益であることは、それらが医薬組成物の調整のために使用されること及び／又は各々の癌、癌腫、及び／又は転移の治療に使用されることを意味する。
【００２７】
本発明の本文中において、癌の使用は癌腫と同意語である。
【００２８】
さらに、適応症及びＴＧＦ−ベータの全ての組み合わせは、本明細書において開示されていると理解される。
【００２９】
別の好ましい本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、医薬組成物の調整及び／又は腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、食道癌、及び／又は多発性骨髄腫の治療に使用される。
【００３０】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌を治療するための医薬組成物の調整に使用される。他の実施形態において、本発明の前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、腎臓癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌、及び／又は軟組織癌を治療するための医薬組成物の調整に使用される。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明の前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、例えば胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管細胞腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、膠肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、及び／又はウィルムス腫瘍などの癌の治療、及び／又は前記癌の治療のための医薬組成物の調整に使用される。
【００３２】
これらのオリゴヌクレオチドの各々の活性誘導体は本明細書の後半でより詳細に記載されている。
【００３３】
また別の実施形態において、上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整におけるオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、腫瘍成長因子ベ−タ１、各形質転換成長因子（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−ベータ３、及び／又はインタ−ロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
別の実施形態において、上述したような癌の治療及び／又は上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整におけるオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
より好ましい実施形態において、上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整における前記オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、配列ＩＤ番号１〜２１又は４９〜６８、２２〜４８又は６９〜１０７に基づいて羅列した配列中で特定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２５、２６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、及び３７に基づいて羅列した配列中で特定される配列がさらにより好ましい。これらの配列は特に高い親和性を有する。
【００３６】
これらの配列は各々の遺伝子のｍ−ＲＮＡに特に高い親和性を有し、副作用がより少なく、より高い有効性を示し、より高い生物学的利用可能性を有し、安全性及び／又は改善された化学的安定性を有する。本発明の別の観点は、大腸癌、前立腺癌、黒色腫、膀胱癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮腫の群から選択される癌を治療するためのＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストの使用方法である。これらの腫瘍のいくつかは、高いレベルのＴＧＦ−ベータ１を伴い、驚くべきことにＴＧＦ−ベータ２の阻害によって腫瘍細胞増殖が顕著に減少し、このことはこれらの癌の治療に重要な因子である。
【００３７】
本発明の本文中におけるＴＧＦ−ベータ２（形質転換成長因子２）アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２の機能を阻害するいかなる化合物も含み、これはＴＧＦ−ベータにより誘導されるいかなる効果も阻害されることを意味する。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２の生成を阻害する物質であり、ＴＧＦ−ベータ２に結合する物質であり、及び／或いは、ＴＧＦ−ベータ２の下流のその活性カスケ−ドの機能を阻害する物質である。より詳細なＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストに関しては、Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ２１：２１−３２，２００３を参照のこと。
【００３９】
阻害剤は、ＴＧＦ−ベータ２結合性タンパク質、阻害剤関連ＴＧＦ−ベータ受容体、Ｓｍａｄ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ２結合性ペプチド（潜伏関連ペプチド）、抗ＴＧＦ−ベータ２抗体、ＴＧＦ−ベータ発現制御因子を含むがこれらに限定されてない。
【００４０】
ＴＧＦ−ベータ２結合性タンパク質の例は、フェチュイン、デコリン、小型コンドロイチン−デルマタン硫酸プロテオグリカン、及びプロテオグリカンの一種のバイグリカン及びフィブロモジュリンである。ＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤は、例えば、ベータタグリカン（細胞外領域のＴＧＦ−ベータタイプＩＩＩ受容体）である。
【００４１】
ＴＧＦ−ベータ発現制御因子の例は、トラニスト（Ｎ−［３，４−ジメチトキシシンナモイル］−アントラニル酸）又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスプラスミドベクタ−又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましい実施形態において、ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号２２〜４８、より好ましくは配列ＩＤ番号２５、２６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、３７を用いて記載される配列から選択される。
【００４２】
本発明のまた別の観点は、新しいＩＬ−１０アンチセンス−オリゴヌクレオチド、及び配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるその活性誘導体である。これらのオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１０のｍ−ＲＮＡに対して非常に高い親和性を有し、これによりＩＬ−１０の合成を効率的に阻害する。
【００４３】
一実施形態において、ＩＬ−１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体を生産する工程は、段階的に又はより長いオリゴヌクレオチド鎖からオリゴヌクレオチドを切断することにより、連続したヌクレオチド及びリンカーを添加することを含む。
【００４４】
本発明のまた別の観点は、配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体を含む医薬組成物である。
【００４５】
本発明の更なる実施形態は、癌及び／又は転移の治療のための医薬組成物の調整における、配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用方法である。
【００４６】
本発明の１つのオリゴヌクレオチドは、癌治療における転移形成を阻害するための医薬組成物の調整において使用されるものであり、本発明のオリゴヌクレオチドは、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、又は軟組織癌を治療するための医薬組成物の調整においても使用されるものであり、ＩＬ−１０の合成を阻害する新しいオリゴヌクレオチドもまた本発明の一部である。
【００４７】
オリゴヌクレオチド又は核酸という用語は、多数のヌクレオチド（すなわちリン酸基に結合した糖（例えばリボース又はデオキシリボースなど）、及び置換ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））或いは置換プリン（例えばアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）など）のいずれかの可変性の有機塩基に結合した糖を含む分子、）又はそれらの修飾物を指す。本明細書において使用されているように、前記用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチドと同様にオリゴリボヌクレオチドを指す。前記用語は、また、オリゴヌクレオシド（すなわちリン酸基のないオリゴヌクレオチド）及びポリマーを含む他の任意の有機塩基を含む。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖であるのに対し、一部の実施形態において前記一本鎖の核酸の少なくとも一部分は二本鎖である。一本鎖の分子が増強された活性を有するのに対し、二本鎖の分子は生体内においてより安定である。
【００４９】
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子のｍ−ＲＮＡの全体に対して相補的であるか、又は、阻害されるタンパク質の任意の小部位が例えばＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０などから選択され得る。より好ましい実施形態において、本発明の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約６〜約３００ヌクレオチドの長さを有し、また別の実施形態において前記ヌクレオチドはそれぞれ約７〜約１００ヌクレオチド、約８〜約３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは１２〜２４ヌクレオチドの長さ有する。
【００５０】
それぞれの遺伝子の配列は当業者に周知であり、またその一部は実施例１４において示されるものである。
【００５１】
さらに別の実施形態において、核酸はアンチセンス核酸ではなく、相補的遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡ種に細胞内で結合してその結果前記ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ種の機能を阻害することによって機能しないということを意味する。核酸の結合ユニットに関して本明細書において使用されるように、「結合された」又は「結合」は、二つの実体が互いに物理化学的手段で結合されているということを意味する。共有結合又は非共有結合など、当業者に周知のいかなる結合も包含される。天然結合は、核酸の個々のユニットを結合する性質において通常見出されるものであり、最も一般的である。しかしながら、核酸の個々のユニットは、合成又は修飾された結合で結合されてもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのリン酸リンカーはペプチドによって置換される。前記オリゴヌクレオチドのこれらの誘導体は、また、ペプチド核酸とも呼ばれる。
【００５３】
一実施形態において、この線形重合構造のそれぞれの末端は、さらに環状構造を形成するように結合される。しかしながら、開環線形構造が通常好まれる。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成としてみなされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの標準的な結合又は骨格は、３’−５’リン酸ジエステル結合である。
【００５４】
オリゴヌクレオチド又は核酸は、類似の機能を有する非天然発生部位を持つオリゴヌクレオチドを含む。そのように装飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞内取り込み、核酸標的（例えばタンパク質）への増強された親和性、変更された細胞内局在化、及びヌクレアーゼ存在下における増大された安定性などの望ましい特性のために、しばしば、天然形態よりも好まれる。本明細書において使用されるオリゴヌクレオチドの装飾は、糖、塩基部分、及び／又はヌクレオシド結合のいかなる化学的装飾も含むものである。
【００５５】
一実施形態において、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を有する核酸又はオリゴヌクレオチドは、例えば、３’及び／又は２’の位置におけるヒドロキシル基以外、及び５’の位置におけるリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合的に結合された糖骨格を有する核酸を含む。従って装飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでも良い。さらに別の実施形態において、装飾された核酸はリボースの代わりにアラビノースなどの糖を含む。従って前記核酸は、骨格組成において異種である可能性があり、その結果ペプチド核酸（核酸塩基と共にアミノ酸骨格を有する）などと一緒に結合したポリマーユニットの任意の可能な組み合わせを含むものである。一部の実施形態において、前記核酸は骨格組成において同種である。
【００５６】
前記核酸の置換プリン及びピリミジンは、Ｃ−Ｓプロピン置換塩基などの塩基類似体と同様にシトシンなどの標準のプリン及びピリミジンを含むものである（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０−８４４，１９９６）。プリン及びピリミジンは、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、及び他の天然及び非天然に存在する核酸塩基、置換及び無置換の芳香族部分を含むものである。
【００５７】
各オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドポリマー中の一本鎖ヌクレオチドは、同じ装飾を含むものであっても良く、そのような装飾の組み合わせを含むものであっても良く、或いは、そのような装飾をリン酸ジエステル結合で結合していても良い。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドポリマーにヌクレアーゼ耐性を与える方法は、これに限定されないが、共有結合的に修飾したプリン又はピリミジン塩基を含むものである。例えば塩基は、メチル化されるか、ヒドロキシメチル化されるか、或いは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが実質的に酸及びヌクレアーゼ耐性を与えられるように置換（例えば、グリコシル化）されていても良い。
【００５８】
前記配列の一部のヌクレオチドが別のヌクレオチド或いはさらにスペーサーによって置換されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体であっても、例えばＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０などのタンパク質の合成を阻害することが当業者に理解される。より好ましい実施形態において、約０．１％〜約５０％、又は約０．１％〜約１０％、又は約０．１％〜約５％のヌクレオチドが置換される。
【００５９】
上述したようにスペーサーは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２つの部分を連結するいかなる化学物質でもよく、少なくとも１つの核酸のスペースを置換する。
【００６０】
また別の実施形態において少なくとも１つのＴ（チミジン）は、Ｕ（ウラシル）によって置換される。
【００６１】
好ましい実施形態においてスペーサーは、別のヌクレオチド、又はグルコース、リボースなどの糖、又はアミノ酸、又はポリプロピレンなどの１又はいくつかのポリマーユニットである。
【００６２】
より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端ブロック（ｅｎｄ−ｂｌｏｃｋ）は、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、又はアビジン類似体である。これらの分子は、保護されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの分解をブロックし且つ修飾された核酸の固体担体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）への高い親和性結合手段を提供する能力がある。アビジン及びビオチン誘導体は、本発明の試薬を調整するために使用され得るものであり、ストレプトアビジン、コハク酸化アビジン、単量体アビジン、ビオシチン（ビオチン−イプシロン−Ｎ−リジン）、ビオチンヒドラジド、２−イミノビオチンのアミノ又はスルフヒドリル誘導体、及びビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸ヒドラジドを含む。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオシチン及び３−（Ｎ−マレイミドプロピニル）ビオシチンなどの更なるビオチン誘導体もまた、本発明のポリヌクレオチド上の末端ブロッキング基として使用される。
【００６３】
別の実施形態において、装飾されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドのリボース基の環状構造は、Ｎ−Ｈ、Ｎ−Ｒ（Ｒは、アルキル又はアリール置換基）、Ｓ、及び／又はメチレンで置換された環状構造において酸素を有する。
【００６４】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの糖成分
は、モルホリノ誘導体であり、その活性誘導体は、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
別の実施形態において、少なくとも１つの糖部分の２つの炭素は結合している。その結合は、メトキシ基又はその他を伴っていても良い。このリンカーは、ある特定の立体構造においてそれが維持されるような方法で糖部分をを固定し、これによって、例えば、このように固定された核酸がより高い選択性及びより高い安定性有することが可能になる。固定された核酸は、例えば、Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２０，５４５８−５４６３（１９９９）又はＪ．Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（６&７），Ｓ．１３６５−１３７０中に記載されており、これらはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
また別の実施形態において、塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。そのようなオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが明らかにされているオリゴヌクレオチド類似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含むアミドで置換される。核酸塩基は、前記骨格のアミド部位のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調整を教示する代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号を含み、各々はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見いだされ得る。
【００６７】
さらに、修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、チオリン酸、キラルなチオリン酸、ジチオリン酸、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’−アルキルホスホンサンエステル及びキラルホスホンサンエステルを含むメチル及び他のアルキルのホスホンサンエステル、３’アミノホスホアミデート及びアミノアルキルホスホアミデートを含むホスホアミデート、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、及び標準的３’−５’結合を有するボラノホスフェイト、これらの２’−５’結合類似体、及び反対の極性を有するものであってヌクレオシドユニットの隣接したペアが３’−５’から５’−３、又は２’−５’から５’−２’に結合したものなどを含む。さまざまな塩、混合塩、及び遊離酸もまた含まれる。
【００６８】
本発明の一部の実施形態において有益な骨格修飾を有する核酸は、Ｓ又はＲキラル抗新生物薬の核酸である。本明細書で使用される"Ｓキラル核酸"は、少なくとも２つのヌクレオチドがキラル中心を形成する骨格修飾を有し、多数のキラル中心がＳキラリティを有する核酸である。本明細書で使用される"Ｒキラル核酸"は、少なくとも２つのヌクレオチドがキラル中心を形成する骨格修飾を有し、多数のキラル中心がＲキラリティを有する核酸である。骨格修飾は、キラル中心を形成するいかなるタイプの修飾であってもよい。前記修飾は、これらに限定されないが、チオリン酸、メチルリン酸、メチルチオリン酸、ジチオリン酸、ｐ−エトキシ、２’−メトキシ及びこれらの組み合わせを含む。
【００６９】
本発明に有益である修飾された骨格の他の種類は、ペプチド核酸である。前記骨格はアミノエチルグリシンから成り、核酸の特徴を与える塩基を支持する。前記骨格はいかなるリン酸塩も含まず、従って選択的に正味荷電を待たないものである。この電荷の欠如により２本鎖間の電荷反発が存在しないために、より強力なＤＮＡ−ＤＮＡ結合を可能にする。さらに、前記骨格が余分なメチレン基を有するために、オリゴヌクレオチドは酵素／プロテアーゼ耐性である。ペプチド核酸は、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒなどの様々な商業的供給源から購入、或いは新規に合成可能である。
【００７０】
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、上述の修飾のうちの１つにおいて修飾されたように修飾される。
【００７１】
また別の実施形態において、オリゴヌクレオチドのこのような修飾は一緒にされる。
【００７２】
好ましい実施形態において、１から約１２、又は１から約８、又は１から約４、又は１から約２のオリゴヌクレオチド及び／又はヌクレオチドのオリゴヌクレオチド３’及び／又は５’末端での結合は上述のように修飾される。
【００７３】
また別の実施形態において、同一の標的（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０）とハイブリッド形成し、表記された配列のオリゴヌクレオチドの１つを含むがさらに約１〜約２０までのヌクレオチド、さらに好ましくは２’、３’、及び／又は５’末端の少なくとも１つにおいて１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２のヌクレオチドを有する配列を有する本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
【００７４】
つまり、本発明の任意の配列が選出され得る。例えばある配列は、表記された配列又は実施例から抽出される。このような配列は、例えば実施例１６において与えられたＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、又はＩＬ−１０などの標的分子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスの一部分である。ヌクレオチドは、標的分子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスの配列に続くこれらの配列の一方の末端に添加され、ｍＲＮＡとハイブリッド形成する新しいオリゴヌクレオチドを作り出す。オリゴヌクレオチドの任意末端において、長さ約１〜約２０の長さのヌクレオチド、より好ましくは約１〜約２５、さらに好ましくは約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約３のヌクレオチドが添加される。上述のように、いくつかのヌクレオチドが置換されるか或いはスペーサーがヌクレオチドの代わりに含まれる場合、このオリゴヌクレオチド誘導体は依然として標的分子のｍＲＮＡとハイブリッド形成することが当業者には理解される。
【００７５】
本発明において言及したオリゴヌクレオチドの標的は当業者には既知である。好ましい実施形態において、前記標的は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織細胞（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０のｍＲＮＡの群から選択される。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの配列は、実施例６において与えられる。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、及びインターロイキン１０のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列及びＴＧＦ−βに相補的なスプライスバリエーションのアンチセンスは、実施例１６において与えられる。
【００７６】
本発明のまた別の課題は、本発明のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の製造工程を見出すことであった。
【００７７】
本発明の使用に関して、核酸は、当業者には良く知られた数多くの手順を使用して新規に合成され得る。そのような化合物は、‘合成の核酸’と称される。例えば、ｂ−シアノエチルホスホアミデート方法（Ｂｅａｕｃａｕｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９，１９８１）；ヌクレオシド Ｈ−ホスホン酸塩方法（Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４、１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７，１９８６，Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２，１９８８）がある。これらの化学は、市販の種々の自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置により遂行され得る。
【００７８】
好ましい工程において、本発明のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’−５’方向にヌクレオチド鎖を伸長させる亜リン酸塩トリエステル化学を使用して合成され、各ヌクレオチドは固相に共有結合的に付着した第一のヌクレオチドに結合しており、前記工程は、前記ヌクレオチド５’ＤＭＴ保護基を開裂する第一工程と、その後鎖の伸長のために各ヌクレオチドを添加する工程と、その後亜リン酸基とキャップ（ｃａｐ）した未反応の５’−水酸基を修飾する工程と、固体担持からオリゴヌクレオチドを開裂する工程と、最後に合成生成物をワークアップする工程とを含む。
【００７９】
また別の実施形態において、核酸はプラスミドにおいて大規模に生産され（例えば、Ｓａｍｂｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）、小片に分離されるか或いは全体として投与される。
【００８０】
さらに別の実施形態において、核酸は、例えば制限酵素であるエクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼの使用など当業者に既知の技術を使用して、既存の核酸配列（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）から調整される。この方法において調整された核酸は単離された核酸である。核酸という用語は、合成及び単離された核酸及び坑新生物薬坑腫瘍性核酸を含む。
【００８１】
他の実施形態において、例えばチオリン酸結合を有するものなどの修飾された骨格を有する核酸は、例えば、ホスホアミデート又はＨ−ホスホン酸塩化学などを使用した自動化された技術を使用して合成される。アリール及びアルキルホスホン酸塩は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号広報に記載されるように作られ得る。米国特許第５，０２３，２４３号広報及び欧州特許第０９２，５７４号広報に記載されるように電荷を持った酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルは、商業的に入手可能な試薬を使用した自動固相合成により調整される。
【００８２】
他の核酸骨格修飾及び置換の作成方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【００８３】
核酸を欠いた前記合成の記載は当業者に既知であり、更なる詳細は、例えばＷｅｎｇｌｅ，Ｊ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２０，Ｓ．５４５８−５４６３（１９９９）、又はＫｏｃｈ，Ｔ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｃｏｎｄｅｓｅ Ｍａｔｔｅｒ １５，Ｓ．１８６１−１８７１（２００３）を参照のこと。
【００８４】
一実施形態において、チオリン酸は、ホスホアミデート又はＨ−ホスホン酸塩化学のいずれかを使用した自動化された技術を用いて合成される。アリール及びアルキルホスホン酸塩は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号広報に記載されるように作られても良く、さらにアルキルホスホトリエステル（電荷を持った酸素成分が米国特許第５，０２３，２４３号広報及び欧州特許第０９２，５７４号広報に記載されるようにアルキル化されている）は、商業的に入手可能な試薬を使用した自動化された固相合成により調整され得る。他のＤＮＡ骨格修飾及び置換の作成方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【００８５】
本発明による有用な他の核酸源は標準のウィルス及び細菌性ベクターを含み、それらの多くは商業的に入手可能である。最も広義において「ベクター」とは任意の核酸物質であり、核酸の細胞への移動を供給及び促進する目的で通常使用される。本明細書に使用されるベクターは発現され得る遺伝子を持った空ベクター又はベクターである。ベクターが遺伝子を持っている場合、一般的にこのベクターは、遺伝子をターゲット細胞に運び、ベクターがない場合にもたらわれる分解の程度と比較して分解が低減される。この場合、前記ベクターは選択的に遺伝子の発現配列を含み、免疫細胞などの標的細胞における遺伝子発現を促進するが、前記細胞において遺伝子が発現されている必要はない。
【００８６】
本発明内のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の活性誘導体と同義語であり、診断及び治療において研究用試薬及びセットとして使用され得る。治療上の使用に関して、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、例えば病気、より好ましくは腫瘍及び／又は転移を患った動物、特にヒトに投与される。
【００８７】
好ましい実施形態において、ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌の治療のため及び／又は転移形成を阻害する医薬組成物の調整に使用される。
【００８８】
好ましい実施形態において、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特に本発明の対象である。このように、薬学的に許容な担体において本発明に従った本オリゴヌクレオチド及びその活性誘導体は非常に有用である。これは、例えば癌及び転移などの特に望ましくない病気にあてはまる。
【００８９】
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、これらに限らないが、例えば胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胚性癌腫、上皮性癌、食道癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮細胞癌、脂腺癌、睾丸癌、子宮癌などの望ましくない癌又は癌腫の治療において有用である。
【００９０】
聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、血管細胞腫、ホジキンスリンパ腫、髄芽細胞腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンス、リンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、乏突起膠腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、及び／又はウィルムス腫瘍。
【００９１】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、等張水溶液中において投与され、腫瘍内と同様に静脈内での用途に適切である。さらに本発明の医薬組成物は、１つ以上の非中毒性の薬学的に許容される担体、賦刑剤、及び／又はアジュバント（まとめて本明細書において「担体物質」として称される）を伴ったオリゴヌクレオチドを含む。前記担体物質は、前記組成物の他成分と親和性があるという意味において許容され、受容体に有害ではない。本発明の医薬組成物は、適切な担体、及び意図する治療に対して効果的なオリゴヌクレオチドの投与量を選択することにより、任意の適切な経路によって投与されることに適応され得る。例えば、これらの組成物は、経口、血管内、腹腔内、皮下、筋肉内、直腸、又は腫瘍内投与に適切な形態に調整され得る。
【００９２】
従って、使用される担体物質は、固体又は液体、又はその両者であっても良く、例えばタブレットなどの投与単位組成物として化合物が処方され、オレゴヌクレオチドの重量で約１％〜約９５％含み得る。溶液中のオレゴヌクレオチドの濃度は、投与される容量に依存する。そのような本発明の医薬組成物は、本質的に成分の混合から成る薬学的な任意の既知の技術により調整され得る。
【００９３】
本発明の医薬組成物は単独又は混合物中において輸送される。混合物は、１つ又は複数の本発明のオリゴヌクレオチド含む。本明細書における少なくとも２つのこれらの物質は、化合物としても称される。
【００９４】
一実施形態において、前記少なくとも２つの化合物は、混合物でされるか、純物質であるか、又は薬学的に許容な担体中にある。また別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも２つの化合物は、分離されて純粋であるか、又は分離されて医薬組成物中にある。一実施形態において、前記少なくとも２つの成分は同一の薬学的に許容な担体中にあり、さらに別の実施形態において、前記少なくとも２つの成分は異なる薬学的に許容な担体中にある。
【００９５】
投与形態
本発明の医薬組成物の投与は、当業者に既知であるいかなる手段において行われても良い。投与経路は、これに限定されないが、経口、経鼻、髄腔内、接眼、経肺、膣内、直腸、非経口（例えば筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、又は皮下、又は直接注射）、局所、経皮を含む。
【００９６】
望ましくない癌又癌腫の治療のための医薬組成物の一実施形態において、この医薬組成物は、生分解性ポリマーインプラント又は埋め込み式カテーテルにより送達される。
【００９７】
「医薬組成物」という用語は本組成物の液体又は物質に関与し、純物質であり、及び／又は薬学的に許容な担体と組み合わされる。
【００９８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、１若しくはそれ以上の親和性固体又は液体充填剤、希釈剤、又はカプセル化された物質を意味し、ヒト又は他の脊椎動物の投与に適する。「担体」という用語は、有機又は無機成分を意味し、天然物又は合成物であり、活性成分が結合して用途を促進するものである。前記医薬組成物の成分はまた、望ましい薬学的効果が実質的に損なわれる作用がない方法で、本発明の化合物と混合され得る。
【００９９】
そのような担体は、本発明の化合物を、タブレット、コーティングされたタブレット、顆粒、粉末、錠剤、糖衣錠、（微小）カプセル、液状、ゲル状、シロップ、スラリー、懸濁液、エマルジョン、及びそのようなものとして処方され、治療される対象物によって経口摂取される。
【０１００】
前記医薬組成物はまた、顆粒、粉末、タブレット、コーティングされたタブレット、（微小）カプセル、坐薬、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、被覆された金粒子、又は活性化合物の遅延された放出を伴う調整物を含んでも良く、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、着香剤、甘味剤、又は可溶化剤などの調整賦形剤及び添加剤及び／又は補助剤は、通常上述のように使用される。
【０１０１】
薬物送達の本方法の簡潔な概説に関しては、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３，１９９０を参照し、それはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
経口投与に関して、前記医薬組成物はいかなる薬物担体もなく単独で送達されるか、或いは化合物を薬学的に許容な担体と結合することによって容易く処方される。
【０１０３】
一実施形態において、経口用医薬組成物は固体賦形剤として得られ、必要に応じて適切な補助剤を加えた後、選択的に得られる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工し、タブレット又は糖衣錠の核が得られる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールなどの糖；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ジェラチン、トラガカント・ガム、メチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調整剤などの充填剤である。
【０１０４】
また別の実施形態において、例えば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム等のその塩など、崩壊剤が加えられる。選択的に経口製剤はまた、内部酸性状態を中和するために生理食塩水又は緩衝液中において処方されても良い。
【０１０５】
さらに別の実施形態において、糖衣錠の核は、適切な被覆剤と共に提供される。この目的に対して、濃縮糖溶液が使用されても良く、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液（ｌａｃｑｕｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を選択的に含んでも良い。
【０１０６】
また別の実施形態において、活性化合物の投与量の異なる組み合わせを特定又は特徴付けるために、色素又は顔料がタブレット又は糖衣錠被覆剤に加えられる。
【０１０７】
別の実施形態において、経口に使用され得る医薬調製物は、グリセロール、ソルビトールなどのゼラチンで作られた押し込み型カプセル及びゼラチンで作られた軟質密閉カプセル、及び例えばグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤を含む。一実施形態において、前記押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び選択的に安定剤を伴った混合物中において活性成分を含む。また別の軟カプセルの実施形態において、前記活性化合物は、例えば脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中で溶解又は懸濁される。さらに、安定剤が添加されても良い。
【０１０８】
また別の実施形態において、経口投与用に処方された微小球が使用され、これは当業者には既知である。
【０１０９】
経口投与の製剤は、投与量においてそのような投与に適切である。
【０１１０】
さらに別の口腔投与に対する実施形態において、前記組成物は、従来方法において処方されたタブレット又はトローチ剤の形態をとっても良い。
【０１１１】
吸入
吸入投与に対する別の実施形態において、本発明に従った使用に対する化合物は、エアロゾールスプレーの形態で便利に送達されてもよく、加圧パック又は噴霧器から、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなどの適切な高圧ガス使用を伴っても良い。加圧されたエアロゾールの場合、投与量単位は、定量を送達するためにバルブを提供することにより決定されても良い。例えば吸入器中において使用するゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含んで処方されても良い。
【０１１２】
適切な薬学的担体は、例えば、吸入用の水又は生理食塩水であり、微小カプセル化され、渦巻き型で（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、リポソームに含まれ、中和されたエアロゾールである。
【０１１３】
また別の実施形態において、非経口、髄腔内、心室内、又は腫瘍内投与のための薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液を含み、緩衝液、希釈剤、及びこれに限定されないが、例えば貫通促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容な担体又は賦型剤などの他の適切な添加剤を含んでも良い。
【０１１４】
さらなる別の実施形態において、前記化合物の系統的な送達に対して、その化合物は注射による非経口投与（例えば、静脈内ボーラス、又は連続的注入）のために薬学的担体中にある。注射用の製剤は、例えば、アンプル又は複数投与する容器中などの単一投与量形態中において保存料と共に与えられる。医薬組成物は、油又は水媒体中の懸濁、溶液、又はエマルジョンなどの形態をとり、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの補助剤を含む。
【０１１５】
一実施形態において、非経口投与のための薬学的担体は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を含む。
【０１１６】
また別の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調整される。適切な親油性の溶媒又は媒体は、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させるカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの物質を含む。選択的に、前記懸濁液は、化合物の溶解性を増大させる適切な安定剤又は試薬もまた含んでいても良く、高濃度溶液の調整を可能にする。
【０１１７】
さらに別の実施形態において、前記活性化合物は、例えば滅菌無発熱水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）などの適切な媒体とともに形成するための粉末形態であっても良く、使用前又は鋭利な物体に乾燥して皮膚に傷をつける。
【０１１８】
また別の実施形態において、前記化合物は、坐薬又は保持かん腸剤などの直腸又は膣の組成物において処方され、例えばココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む。
【０１１９】
また別の実施形態において、前記化合物は持続性薬剤調整物として処方される。一実施形態において、そのような長く作用する処方は、適切なポリマー又は疎水性化合物（例えば許容な油中のエマルジョンとして）として、又はイオン交換樹脂、又は例えば少量可溶化塩など少量可溶化誘導体として処方される。
【０１２０】
他の実施例において、送達システムは、持続放出、遅延放出、又は持続放出送達システムを含む。そのようなシステムは、化合物の反復投与回避し、対象物及び医者に対する利便性が増大するものである。放出送達システムの多くの種類が利用可能であり、当業者に既知である。
【０１２１】
１つの実施形態において、送達システムは、ポリマー（ラクチド−グリコリド）、共重合シュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオートエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などの、ポリマーベースシステムを含む。薬剤を含む上述のポリマーの微小カプセルは、例えば、米国特許第５、０７５、１０９号広報に記載される。
【０１２２】
また別の実施形態において、送達システムは、例えばコレステロール、コレステロールエステル、及び脂肪酸などのステロールを含む脂質又はモノ−ジ−及びトリ−グリセリドなどの中性脂質である非ポリマーシステム；ヒドロゲルリリースシステム；シラスティックシステム；ペプチドベースシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮タフレット；部分的に溶解したインプラント；及びそのようなものを含む。
【０１２３】
特異的な実施例は、これに限定されるないが；（ａ）エアロゾールシステムを含み、そこにおいて本発明の基剤は、米国特許第４、４５２、７７５号広報、第４、６７５、１８９号、及び５、７３６、１５２号に記載されるものなどのマトリックス内での形態で含まれる及び（ｂ）拡散系を含み、そこにおいて活性成分は、米国特許第３、８５４、４８０号広報、第５、１３３、９７４号広報、及び５、４０７、６８６号広報に記載されるポリマーから制御された割合で浸透する。さらに、ポンプベースハードウェア送達システムは使用され、それらのいくつかは、移植に使用される。
【０１２４】
また他の実施形態において、アンタゴニスト及び抗新生物薬抗腫瘍性基剤は、ＧＥＬＦＯＡＭと共に形成され、商業製品は徐々に分解する修飾されたコラーゲン線維から成る。
【０１２５】
１つの実施形態において、医薬組成物はまた、適切な固相又はゲル相担体又は賦形剤を含む。そのような担体又は賦形剤の実施例は、これに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ジェラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーを含む。
【０１２６】
１つの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、慎重に又は薬学的に許容な塩の形態で投与される。この塩は、薬学的に許容であるが、薬学的に非許容な塩は、薬学的に許容な先述の塩の混合物の調整に利便的に使用される。そのような塩は、これに限定されないが、以下の酸から調整されたものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸系列のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩である。
【０１２７】
１つの実施形態において、適切な緩衝剤は、これに限定されないが、酢酸及びその塩（１〜２％ ｗ／ｖ）；クエン酸（１〜３％ ｗ／ｖ）；ホウ酸及びその塩（０．５〜２．５％ ｗ／ｖ）；及びリン酸及びその塩（０．８％〜２％ ｗ／ｖ）を含む。
【０１２８】
適切な保存料は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ ｗ／ｖ）；塩化ブタノール（０．３〜０．９％ ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ ｗ／ｖ）；及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）を含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明記載の医薬組成物の少なくとも２つの化合物の局所投与のための薬学的に許容な担体は、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、及びパウダーを含む。従来の薬学的担体、水、パウダー、又は油性基剤、増粘剤などが望ましい。また別の実施形態において、コーティングされたコンドーム、手袋などが有用である。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、医薬組成物はまた、栄養送達の増強のため浸透エンハンサーを含む。貫通エンハンサーは、５つの広範なカテゴリーの内の１つに属すると分類され、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤、非界面活性剤である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，１９９０，７，１−３３）。１つ以上のこれらの広範なカテゴリーからの１つ以上の貫通エンハンサーが含まれる。
【０１３１】
種々の脂肪酸及びその活性誘導体は、浸透エンハンサーとして作用し、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、レシンレン酸塩、モノオレイン（別名 １−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリリン酸、アリキドニン酸、１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−及びジ−グリセリド、及び先述の生理学的に許容される塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩など）を含む（Ｌｅｅ ａｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。現在好まれるいくつかの脂肪酸の例は、カプリン酸ナトリウム及びラウリン酸ナトリウムであり、単体または０．５％〜５％の濃度の組み合わせで使用される。
【０１３２】
胆汁の生理学的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の簡易化含む（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ´ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭａｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，ｐａｇｅｓ ９３４−９３５）。種々の天然胆汁酸塩、及びそれらの合成活性誘導体は、浸透エンハンサーとして作用する。このように「胆汁酸塩」という用語は、任意の胆汁の活性誘導体と同様に天然に発生する胆汁成分も含む。現在好まれる胆汁酸塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）であり（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、一般的に０．５％〜２％の濃度で使用される。
【０１３３】
１若しくはそれ以上の浸透エンハンサーを含む複雑な形式が使用される。例えば、胆汁酸塩は脂肪酸との組み合わせで使用されても良く、複雑な製剤を作り出す。好まれる組み合わせは、カプリン酸ナトリウム又はラウリン酸ナトリウム（一般的に０．５％〜５％まで）と結合したＣＤＣＡを含む。
【０１３４】
一実施形態において、さらにキレート剤が使用され、これに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトン（エナミン）のラウレス−９及びＮ−アミノアシル誘導体を含む（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。キレート剤は、Ｄ−Ｎａｓｅ阻害剤としても働くという更なる利点を有する。
【０１３５】
また別の実施形態において、さらに界面活性剤が使用される。界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）；及びＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２−２５７）などのペルフルオロ化合物の乳濁液を含む。
【０１３６】
非界面活性剤は、例えば、不飽和環状ウレアーゼ、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）；及びジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）などの非ステロイド性抗炎症剤含む。
【０１３７】
一実施形態において、本発明の医薬組成物はさらに、医薬組成物において従来見出されている他の添加成分をこれらの技術において確立された利用レベルにおいて含む。このように、例えば医薬組成物は、例えば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬、又は抗炎症剤などのさらなる適合性薬学的活性物質を含んでも良く、或いは例えば染料、着香料、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤など、本発明の組成物において物理的に処方された種々の投与形態において有用な追加物質を含んでも良い。しかしながらそのような物質は、添加された場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。
【０１３８】
例えば大腸結腸直腸癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、又は軟組織癌などの癌治療における転移形成の阻害、又は癌の治療において、医薬組成物を調整するためのオリゴヌクレオチドの実施形態において、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが有効量で適用される。他の実施形態において活性誘導体が有効量で使用される。また別の実施形態において、例えば腎臓癌、子宮内膜癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌、又は本発明において述べられた他の任意の癌などの癌治療における転移形成の阻害、又は癌治療の医薬組成物の調整において、オリゴヌクレオチド又はそれらの活性誘導体が有効量で使用される。
【０１３９】
アンタゴニスト、オリゴヌクレオチド、及びそれらの活性誘導体は、医薬組成物の調整において使用されるだけでなく、有効量において各癌を治療するためにも使用される。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、活性誘導体、又はアンタゴニストの「有効量」という用語は、望ましい生物学的効果を得るのに必要な量又は十分な量ということである。特に前記有効量は、癌又は癌腫の形成速度を減少するか或いは阻害する量、又は転移形成を阻害する量である。例えば、対象物が望ましくない癌を有する場合の有効量は、前記望ましくない癌を縮小させるか或いは除去する量である。さらに有効量は、新たな望ましくない癌における増大を抑制又はその減少を引き起こし、及び／又は転移形成を減少させる量である。
【０１４０】
前記有効量は、医薬組成物が単回又は反復投与で使用されるものか否か、更に１つのみ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１つの医薬組成物中にあるか否かによって変わる。
【０１４１】
本明細書において与えられた投与量は成人向けである。ヒトが子供であるか、さらなる病気又は他の状況によりストレスを受けているヒトである場合、これらの投与量が適合されることが当業者には明白である。本発明の範囲内である動物が治療される場合において、同様に有効量はが適合されるべきである。
【０１４２】
有効量は送達の方法及び手段にも依存し、それは局所化又は全身性であっても良い。例えば一部の用途において、黒色腫又は眼癌の治療におけるこの組み合わせは好ましくは局所的又は眼科担体において送達される。
【０１４３】
一実施形態において、本明細書において記載されたオリゴヌクレオチドの対象物への投与量は、一般的に１回の投与あたり約０．１μｇ〜約１０ｍｇの範囲であり、これは時間、日、週、又は月、及びそれらの間の他の時間で与えられる用途に依存する。また別の実施形態において、前記投与量は、時間、日、又は週で間隔が空いた１〜１０回の投与であって、１回の投与あたり約１０μｇ〜約５ｍｇの範囲、又は約１００μｇ〜約１ｍｇまでの範囲である。しかしながら、一部の実施形態において、投与は前述の一般的な投与より２〜１００倍高い又は低い範囲で使用されても良い。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、本発明記載の医薬組成物の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０の生産を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与範囲、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日投与範囲、又は約１００μｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の投与範囲で投与される。
【０１４５】
実施例
別の方法を示していない場合、本試験に使用される配列はホスホロチオエートとして使用されるものである。本発明の本文中におけるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２はそれぞれＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２と同じ意味である。ＡＰ１２００９及びＡＰ１１０１４はアンチセンスオリゴヌクレオチドと同義語であり、ＡＰ１２００９はＴＧＦ−ベータ２のｍ−ＲＮＡと相補的であるアンチセンスヌクレオチドであり、及びＡＰ１１０１４はＴＧＦ−ベータ１のｍ−ＲＮＡと相補的であるアンチセンスヌクレオチドである。
【実施例１】
【０１４６】
試験系に対する細胞培養条件
試験下における細胞株
結腸癌： ＨＣＴ−１１６メラノーマ：ＭＥＲ１９１ａ，ＭＥＲ１１６，ＭＥ
Ｓ１００ａ
ＮＳＣＬＣ： ＳＷ９００，ＮＣＩ−Ｈ６６１
卵巣癌： ＥＦＯ−２１，Ｃｏｌｏ７０４
膵臓癌： ＰＡＴＵ−８９０２，Ｈｕｐ−Ｔ３，Ｈｕｐ−Ｔ４
前立腺癌： ＰＣ−３，ＤＵ−１４５
細胞株はそれぞれＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、及びＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手した。すべての細胞は前記提供者による記述どおりに培養した。
【０１４７】
更なる試験下における細胞株
肝細胞癌 ＨｅｐＧ２
メラノーマ ＲＰＭＩ−７９５１，ＳＫ−Ｍｅｌ３
ＮＳＣＬＣ Ａ−５４９
腎臓癌 Ｃａｋｉ−１
細胞株はさらにＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）から入手した。
【実施例２】
【０１４８】
細胞媒介細胞毒性試験
腫瘍細胞を生成するために、１％ＦＣＳ及び３％Ｐａｎｅｘｉｎ（Ｐａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した培地において上清細胞を培養し、培地中のＴＧＦ−β量を減少させた。細胞はリポフェクチン、リポフェクチンと各試験物質によって２日連続で処理するか、或いは未処理のまま放置した。培養上清は最後のリポフェクチン処理の後３日で取り除いた。腫瘍細胞により生成されたＴＧＦ−ベータは１Ｎ ＨＣｌ（１：２０希釈）を用いて室温１０分間で活性化した。中和のためにＮａＯＨを加えた。キラー細胞を活性化するリンフォカインを生成するために、健康な供血者から単離したヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２の存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）腫瘍細胞上清と共にインキュベートした。活性化ＴＧＦ−ベータ１を阻害するためにＴＧＦ−ベータ１特異抗体（１μｇ／ｍｌ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた。３日後、４ｈ ＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験において、標的として各癌細胞株に対するＬＡＫ細胞の細胞毒性活性を測定した。
【０１４９】
ＴＧＦ−ベータ２に対して同様の手順を適用した。ＴＧＦ−ベータ１特異抗体の代わりにＴＧＦ−２特異抗体を加えた。ＬＡＫ細胞の測定下におけるＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２を測定するための試験において、ＰＢＭＣの細胞活性は４ｈＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験において測定した。
【実施例３】
【０１５０】
リポフェクチン（登録商標）を用いた増殖試験
１ミリリットルあたり約７５．０００細胞の各腫瘍細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により推奨されているように、１２ウェル平底マイクロタイタープレートにおける１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中において培養した。２４時間後及び４８時間後、前記細胞を各ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの指示濃度で６時間処理した。細胞再取り込みを促進するために、更に指示濃度のリポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）をこの２×６時間加えた。一部の実験はリポフェクチン（登録商標）を添加せずに行った。この６時間と最終３日間と２つの期間の間、細胞をリポフェクチン（登録商標）の不在下において上述のＴＧＦ−ベータ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド５μＭで処理した。コントロール細胞は同じ期間純粋培地で培養した。さらに対照細胞は指示濃度のリポフェクチン（登録商標）で処理した。
【０１５１】
ＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地の代わりに、前記細胞株の提供者の推奨に従って、別の培地を使用しても良い。
【０１５２】
最終的に、トリパンブルーを用いて細胞を染色し、「ノバウエル」血球計算板においてそれらの数を数えることにより、全ての検体中の細胞数を測定した。
【０１５３】
生細胞を定量する別の方法は、製造者の手順に従ってＥＺ４Ｕアッセイを用いて行うか、或いは製造者の使用説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｚ２（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を用いて電子細胞の数を数えることによって行った。
【０１５４】
また、製造者の使用説明書に従って、ＴＧＦ−ベータ１ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ１ ＥＬＩＳＡ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によって上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度を測定した。細胞のない血清補足培地からの値を血清誘導ＴＧＦ−ベータ１から差し引き、バックグラウンドを計算した。
【０１５５】
この増殖試験はＴＧＦ−ベータ２値の測定に対しても実施した。この場合、ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにＴＧＦ−ベータ２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、ＴＧＦ−ベータ１濃度を測定する代わりにＴＧＦ−ベータ２Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ２ＥＬＩＳＡ）によって上清中のＴＧＦ−ベータ２濃度を測定した。
【実施例４】
【０１５６】
リポフェクチン（登録商標）を添加しない増殖試験
細胞直径及び細胞増殖速度に依存しているが１ミリリットルあたり約２５．０００〜２００．０００細胞を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により推奨されているように、１２ウェル平底マイクロタイタープレートにおける１０％仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中において培養した。さらに、ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを３日間添加したが、コントロール細胞は３日間未処理で維持した。
【０１５７】
３日後、トリパンブルー法により染色し、「ノバウエル」血球計算板において数を数えることによって全ての検体中の細胞数を測定した。
【０１５８】
更に、３日目に製造者の使用説明書に従ってＴＧＦ−ベータ１ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ１ ＥＬＩＳＡ，Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて上清中ＴＧＦ−ベータ１濃度を測定した。細胞のない血清補足培地からの値を血清誘導ＴＧＦ−ベータ１から差し引き、バックグラウンドを計算した。
【０１５９】
別の増殖試験において、ＴＧＦ−ベータ２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。これらの試験において、３日目の上清中のＴＧＦ−ベータ２値を測定した。メラノーマ細胞株に対して使用される６日間持続試験において、ＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２の値は３日目及び６日目に測定した。ＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦ−ベータ２値は、ＴＧＦ−ベータ１又は、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから提供されるＴＧＦ−ベータ２ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙを用いて測定した。
【０１６０】
６日間持続試験において、３日後前記培地を交換し、指示濃度における各アンチセンスヌクレオチドを用いて更に３日間細胞を処理した。その後前記細胞数を３日後及び６日後に測定した。生細胞の定量は、ＥＺ４Ｕ−アッセイを用いて製造者の手順に従って実施するか、或いはＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｚ２（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を用いて製造者の使用説明書に従って電子細胞数をの数を数えることによって実施した。
【０１６１】
ＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地の代わりに、別の細胞株の提供者の推奨に従って、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足した別の培地を使用した。
【実施例５】
【０１６２】
スクラッチ試験
腫瘍細胞（約９００，０００／ウェル）を６ウェルプレートに播種した。次の日この細胞を検体物質及びリポフェクチンを用いて一度処理し、それぞれＯｐｔｉｍｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中６時間リポフェクチンで処理するか、或いは未処理で放置した。その後、滅菌プラスチックピペットチップを用いた標準的な方法において前記細胞の密集単層に傷をつけ（着手）、各ウェルに約１，０００の幅の細胞のない帯域を作製した。その後、前記細胞を一度洗浄し、正常培地中３７℃でインキュベートした。写真撮影することによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遊走を記録し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．６を使用したコンピューター援用画像解析によって前記遊走距離を定量した。核実験は４回ずつ行った。
【０１６３】
遊走は転移形成において重要な役割を果たすため、この"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"試験は"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移の形成と関連する。"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"における遊走の阻害は、"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移形成の阻害を示すものである。
【実施例６】
【０１６４】
球状遊走モデル
遊走の球状モデルは別のもので記載されている通りに確立した（Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。腫瘍細胞は、２％寒天で被膜した組織培養フラスコにおいて培養した。３日後、多細胞球状体を９６ウェルプレートに移し、未処理のまま放置、試験物質を用いて処理、或いは１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−β２（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。各細胞株の遊走反応を位相差顕微鏡（×１０）を用いて分析した。
【０１６５】
遊走は転移形成において重要な役割を果たすため、この"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"試験は"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移の形成と関連する。"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"における遊走の阻害は、"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移形成の阻害を示すものである。
【実施例７】
【０１６６】
ＴＧＦ−β１／β２−ＥＬＩＳＡ
腫瘍細胞から分泌されたＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の量はそれぞれＥＬＩＳＡによって測定した。簡便に腫瘍細胞（細胞の大きさと細胞成長によるが、１５，０００〜２００，０００）を１２ウェルの組織培養プレート中に播種し、陽イオン性脂質（リポフェクチン試薬、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の存在下、無血清Ｏｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、試験下のオリゴヌクレオチドを用いて６時間２日連続で処理、又は未処理のまま放置した。その後この細胞を５μｍｏｌ／ＡＰ１１０１４の存在下で培養、又は未処理のまま放置した。７２時間後、リポフェクチン及び試験下のオリゴヌクレオチドを用いて２回目の処理を行い、この細胞培養上清を収集した。標準ＴＧＦ−β１−ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ及びＴＧＦ−β２−ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて上清中のＴＧＦ−β１／β２の量を測定した。
【０１６７】
この試験におけるＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度はそれぞれ３μｇ／ｍｌリポフェクチン濃度と共に２００ｎＭｏｌ／ｌ、６μｇ／ｍｌと共に４００ｎＭｏｌ／ｌであった。
【実施例８】
【０１６８】
ＴＧＦ−β１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＴＧＦ−β１の分泌が１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約１３．８％減少した。別の増殖実施例においては、約４６％減少した。
【０１６９】
細胞増殖：
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４によって、結腸癌細胞株（ＨＣＴ−１１６）の増殖が１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約３５％減少した。配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭｏｌ用いた。
【０１７０】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下２００ｎＭの濃度において、結腸癌細胞株の遊走を顕著に抑制した。
【実施例９】
【０１７１】
肝細胞癌
ＴＧＦ−β抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２におけるＴＧＦ−β１の分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約７５％抑制された。
【０１７２】
細胞増殖：
実施例３に従った増殖試験において、６μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭ濃度において、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２の増殖を１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約３９％減少させた。
【実施例１０】
【０１７３】
メラノーマ
ＴＧＦ−ベータ１
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、１μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、メラノーマ癌細胞株ＭＥＲ−１１６におけるＴＧＦ−β１の分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約０％減少した。
【０１７４】
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、メラノーマ癌細胞株ＭＥＳ−１００ａにおけるＴＧＦ−ベータの分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート１０μＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約２３％減少した。
【０１７５】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、６μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、メラノーマ細胞株ＲＰＭＩ−７９５１におけるＴＧＦ−β２の分泌が配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート４００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約１４．２％減少した。
【０１７６】
増殖抑制
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、５０ｎＭ濃度においては約３３％、２００ｎＭ濃度においては約２３％、メラノーマ細胞株（ＭＥＲ−１１６）の増殖を減少させた。Ａ−５４９細胞株を用いた別の試験において、前記増殖は１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約０．４％減少した。
【０１７７】
増殖抑制
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０は、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、４００ｎＭ濃度において約１７．８％までメラノーマ細胞株（ＲＰＭＩ−７９５１）の増殖を減少させた。
【実施例１１】
【０１７８】
ＮＳＣＬＣ
ＴＧＦ−β１抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処コントロールと比較して、非小細胞肺癌株ＳＷ−９００におけるＴＧＦ−β１の分泌が約３４％減少し、ＮＣＩ−Ｈ６６１において約３８％減少した。
【０１７９】
同条件下、癌細胞株Ａ−５４９ＴＧＦにおけるＴＧＦ−β１の分泌は、約０．４％減少した。
【０１８０】
細胞増殖
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、ＮＳＣＬＣ細胞株（ＳＷ−９００）の増殖を約３０％減少させた。配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度を適用した。実施例３に従った増殖試験の別の実施例において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度においてＮＳＣＬＣ細胞株Ａ−５４９の増殖を約３６％減少させ、ＮＣＩ−Ｈ６６１を約４４％減少させた。
【０１８１】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４はリポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下２００ｎＭ及び４００ｎＭの濃度においてＮＳＣＬＣ癌細胞株ＳＷ−９００の遊走を顕著に阻害した。配列ＩＤ番号１４の前記両方の濃度で処理した前記細胞の１７時間後の遊走は約５０μｍであったのに対し、リポフェクチンと共にインキュベートした前記細胞は約７５μｍの遊走であり、コントロール細胞は約８０μｍであった。２４時間後の結果は、コントロール１２０μｍ、リポフェクチン処理細胞１１５μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞は約６０μｍであった。４８時間の遊走は、コントロール及びリポフェクチン処理細胞が２５０μｍ、配列ＩＤ番号１４で処理した細胞が前記両方の濃度において１５０μｍであった。
【０１８２】
同条件下におけるスクラッチ試験において、リポフェクチンと共にインキュベートした配列ＩＤ番号１４の細胞は約７５μｍの遊走であり、コントロール細胞は約８０μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールが１２０μｍ、リポフェクチン処理細胞が１１５μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞が約６０μｍであった。４８時間後の遊走は、コントロール及びリポフェクチン処理細胞において約２５０μｍ、配列ＩＤ番号１４で処理した細胞の前記両方の濃度において約１５０μｍであった。
【実施例１２】
【０１８３】
卵巣癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からの１０ｎＭのホスホチオエートによって、１００％にあわせた未処理コントロール細胞と比較して、卵巣癌Ｃｏｌｏ ７０４におけるＴＧＦ−β１の分泌が約５４％減少した。
【０１８４】
ＴＧＦ−β２抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からの２００ｎＭのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、卵巣癌ＥＦＯ−２１におけるＴＧＦ−β２の分泌が約３１％減少した。
【０１８５】
細胞増殖
ＴＧＦ−ベータ１：実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は５０ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株Ｃｏｌｏ７０４の増殖を約５４％減少させた。
【０１８６】
実施例３に従った別の増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株Ｃｏｌｏ７０４の増殖を約４０％減少させた。
【０１８７】
実施例３に従った別の増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株ＥＦＯ−２１の増殖を約６３％減少させた。
【実施例１３】
【０１８８】
膵臓癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホチオエート１０μＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して膵臓癌Ｈｕｐ Ｔ３におけるＴＧＦ−β１の分泌が約７４％減少した。
【０１８９】
実施例７の別の試験において、ＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して膵臓ＤａｎＧにおけるＴＧＦ−β１の分泌が約３％減少した。
【０１９０】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において記載したように、ＴＧＦ−ベータ２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３におけるＴＧＦ−β２の分泌が約２％減少し、さらにＰＡＴＵ−８９０２においては約１０％減少した。
【０１９１】
実施例７に記載したようにＴＧＦ−ベータ２特異的ＥＬＩＳＡを用いて、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ４におけるＴＧＦ−β２の分泌が約２４％減少し、ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞においては約６％減少した。
【０１９２】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ２
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約１％減少させ、細胞株ＰＡＴＵ−８９０２における増殖を約１０％減少させた。
【０１９３】
実施例３に従った別の増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約２４％減少させ、Ｈｕｐ−Ｔ４においては約２４％、ＰＡＴＵ−８９０２においては約２７％増殖を減少させた。
【０１９４】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ１
実施例４に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は１０μＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約１３％減少させ、細胞株ＰＡＴＵ−８９０２においては約１０％減少させた。
【０１９５】
実施例４に従った別の増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株ＤａｎＧの増殖を約２７％減少させた。
【０１９６】
細胞遊走
膵臓細胞株ＰＡＴＵ−８９０２の遊走は、実施例６の手順に従って測定し、５μＭｏｌ／ｌ濃度の配列ＩＤ番号３０は未処理対照と比較して約６５時間ほぼ完全に阻害したが、コントロール細胞の球状体の直径は同じ期間において約１０００μｍ増大した。
【０１９７】
ヒトＴＧＦ−ベータ２抗体を試験した同様の実験においてはほとんど効果が示されなかった。これは、遊走阻害を示すことはアンチセンスオリゴヌクレオチドに非常に特異的であり、さらに拮抗するＴＧＦ−ベータと関連するだけではないことを示している。
【実施例１４】
【０１９８】
前立腺癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３におけるＴＧＦ−β１の分泌を約３６％減少させ、ＤＵ−１４５においては約５７％減少させた。
【０１９９】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において示したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺細胞癌株ＰＣ−３におけるＴＧＦ−β２の分泌が約１９％減少し、ＤＵ−１４５においては約２０％減少した。
【０２００】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ１：
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖を約７４％減少させた。
【０２０１】
実施例３に従った別の実施例において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５の増殖を約８１％減少させた。
【０２０２】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ２：
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖を約２９％減少させ、さらにＤＵ−１４５においては約３４％減少させた。
【０２０３】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭの濃度において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下前立腺癌細胞株ＰＣ−３の遊走を阻害した。配列ＩＤ番号１４を用いて処理した細胞の１７時間後の遊走が約３７μｍであったのに対して、リポフェクチンと共にインキュベートした細胞は約１４０μｍであり、コントロール細胞は約１６５μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールにおいて２８８μｍ、リポフェクチン処理細胞において２１３μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞において約６０μｍであった。４８時間後の移動は、コントロールにおいて約３６６μｍ、リポフェクチン処理細胞において３２８μｍ、配列ＩＤ番号１４処理細胞において約１５０μｍであった。
【０２０４】
実施例５に従ったスクラッチ試験の別の実験において、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭ濃度において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、前立腺癌細胞株ＰＣ−３における遊走を有意に阻害した。配列ＩＤ番号ｘｘを用いて処理した前記細胞の１７時間後の遊走は約１１８μｍであったが、リポフェクチンと共にインキュベートした前記細胞は約２０７μｍ遊走し、コントロール細胞は約２１５μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールにおいて２８８μｍ、リポフェクチン処理細胞において３１３μｍ、配列ＩＤ番号１４処理細胞において約１６６μｍであった。４８時間後の遊走は、コントロール細胞において約４２０μｍ、リポフェクチン処理細胞において４２１μｍ、配列ＩＤ番号１４を用いて処理した細胞において約１９７μｍであった。
【実施例１５】
【０２０５】
腎臓癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭは、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１におけるＴＧＦ−β１の分泌を約４％減少させた。
【０２０６】
細胞増殖
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭの濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１における増殖を約５％減少させた。
【実施例１６】
【０２０７】
ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３ ＩＬ−１０遺伝子のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス
ヒト変換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス：
【化１−１】
【０２０８】
【化１−２】
【０２０９】
ヒト転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス：
【化２】
【０２１０】
更にヒト転換成長因子ベータ２のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンスと比較した挿入を含むヒト転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンスのスプライス変化を上記に示す。前記挿入は上部から数えて８１２と９００との間にある。このアンチセンス分子の部分とハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内でもある。
【０２１１】
【化３−１】
【０２１２】
【化３−２】
【０２１３】
【化３−３】
【０２１４】
ヒト変換成長因子ベータ３（ＴＧＦ−ベータ３）のｍ−ＲＮＡと相補的なアンチセンス
【化４−１】
【０２１５】
【化４−２】
【０２１６】
ヒトインターロイキン１０のｍ−ＲＮＡのアンチセンス
【化５−１】
【０２１７】
【化５−２】
【実施例１７】
【０２１８】
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成方法は、亜リン酸トリエステル化学を用いたヌクレオシドの保護を含む５段階によって実施される。最初のヌクレオチドは、５’−ジメトキシトリチル−デオキシアデノシン（Ｎ４ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミド（０１Ｍ）として導入し、Ｃは５’ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（Ｎ４ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドによって導入し、Ｇは５’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン（Ｎ８イソブチリル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドとして導入し、さらにＴは５’−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−Ｎ，Ｎ’−ジ−イソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドとして導入した。前記ヌクレオシドは好ましくはアセトニトリル中０．１Ｍ濃度において適用した。
【０２１９】
合成は、制御された約１５０Ｆｍ直径の細孔ガラス粒子（細孔直径はおよそ５００Å）において実施し、最大３つのヌクレオシドは長鎖アルキルアミン結合を通じて共有結合的に結合していた（平均ローディングはおよそ３０Ｆｍｏｌ／ｇ固体支持体）。
【０２２０】
固体支持体は、試薬は適切に流れるが前記固体支持体を押しとどめるフィルターによって両端がかぶせられた円筒型の合成カラム中にロードした。試薬は、不活性ガスの陽圧を用いることによって、輸送され、合成カラムから引き抜いた。前記ヌクレオチドは、３’−>５’の方向で成長オリゴヌクレオチド鎖に添加した。各ヌクレオチドは以下の合成循環の１回目で結合した。
【０２２１】
ジクロロメタン中の３−クロロ酢酸を用いて前記ヌクレオチドの５’ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）保護基を脱離した後、無水アセトニトリルを用いてカラムを洗浄した。その後、配列による保護された誘導体の１つの塩基形態とアセトニトリル中のテトラゾールとを同時に加えた。この反応の後、前記反応混合物を引き抜き、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中の硫黄（Ｓ８）の混合物を用いて亜リン酸を参加した。前記酸化反応の後、この混合物を引き抜き、アセトニトリルでカラムを洗浄した。前記未反応５’−ヒドロキシ基は、１−メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同時に添加することによって保護した。その後、前記合成カラムをアセトニトリルで洗浄し、次の循環を開始した。
【０２２２】
ワークアップ（ｗｏｒｋ ｕｐ）方法及び合成生成物の精製は以下に示す。
最終ヌクレオチドを添加した後、アンモニア溶液中インキュベートすることによって、デオキシヌクレオチドを固体支持体から分割した。環外（ｅｘｏｘｙｃｌｉｃ）の保護基をさらにアンモニア中でインキュベートすることによって除去した。その後、前記アンモニアを真空下でエバポレートした。シリカＣ１８固定相逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、より短い失敗混合物から５’ＤＭＴ保護基を有する全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）合成生成物を分離した。生成物ピークからの溶出物を収集し、真空下で乾燥し、酢酸中におけるインキュベートにより５’−ＤＭＴ保護基を開裂し、その後酢酸を真空下でエバポレートした。前記合成生成物を純水中に可溶化させ、ジエチルエーテルを用いて３回抽出した。その後前記生成物を真空中で乾燥した。別に、ＨＰＬＣ−ＡＸクロマトグラフィーを行い、生成物ピークの溶出物を過剰のＴｒｉｓ−バッファーに対して透析し、その後純水で透析した。最終生成物を凍結乾燥して乾燥保存した。
【実施例１８】
【０２２３】
実施例２に従って、ＴＧＦベータ２ＩＤ配列３０及びＴＧＦ−ベータ１配列ＩＤ１４それぞれのホスホチオエート化オリゴヌクレオチド細胞媒介性細胞毒性試験を実施した。
【０２２４】
ＴＧＦ−ベータ２−膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２
驚くべきことに、高値ＴＧＦ−ベータ２によって阻害される膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２における細胞媒介性毒性は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によってほとんど完全に回復した。前記試験は、腫瘍細胞に対する抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（１０：１、５：１、２．５：１）によって確立した。前記細胞媒介細胞毒性の各回復は、８０％、８８％、及び１００％であった。結果は三回のものを採用した。同等の結果が、非小細胞肺癌細胞株Ｋ５６２、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６において見出された。
ＴＧＦ−ベータ２−膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＡ−ＴＵ−８９０２の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１４０〜４００％増大した。結果は４回のもの採取した。
【０２２５】
ＴＧＦ−ベータ１−結腸癌細胞株Ｋ−５６２
高値ＴＧＦ−ベータ１によって阻害された細胞媒介細胞毒性は、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によって結腸癌細胞株Ｋ５６２において完全に回復した。前記試験は腫瘍細胞に対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）によって確立した。これらすべての比において細胞媒介性細胞毒性の回復は１００％であった。結果は３回の試験のものを採用した。
【０２２６】
ＴＧＦ−ベータ１−結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＨＣＴ−１１６の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１７０〜２８５％増大した。結果は４回のもの採取した。
【０２２７】
ＴＧＦ−ベータ１：非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）癌細胞株ＨＣＩ−Ｈ６６１細胞媒介性細胞毒性は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によって非小細胞肺癌細胞株ＨＣＩ−Ｈ６６１において完全に回復した。前記試験は、腫瘍細胞に対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）によって確立した。これらすべての比において細胞媒介性細胞毒性の回復は１００％であった。結果は３回の試験のものを採用した。
【０２２８】
ＴＧＦ−ベータ１：非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）癌細胞株Ａ−５４９
驚くべきことに、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＳ−ＴＵ−８９０２の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約２５０〜４１５％増大した。結果は４回のもの採取した。
ＴＧＦ−ベータ１：膵臓癌細胞株ＰＣ−３
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＣ−３細胞の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１３０〜２７０％増大した。結果は４回のもの採取した。
【実施例１９】
【０２２９】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
ＴＧＦ−ベータ１ アンチセンスオリゴヌクレオチド
【化６−１】
【０２３０】
【化６−２】
【０２３１】
【化６−３】
【０２３２】
【化６−４】
【０２３３】
【化６−５】
【０２３４】
【化６−６】
【０２３５】
【化６−７】
【０２３６】
【化６−８】
【実施例２０】
【０２３７】
この実施例のＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ２の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２３８】
ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化７−１】
【０２３９】
【化７−２】
【０２４０】
【化７−３】
【０２４１】
【化７−４】
【０２４２】
【化８−１】
【０２４３】
【化８−２】
【０２４４】
【化９】
【０２４５】
【化１０−１】
【０２４６】
【化１０−２】
【実施例２１】
【０２４７】
この実施例のＴＧＦ−ベータ３アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ３の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２４８】
ＴＧＦ−ベータ３アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１１−１】
【０２４９】
【化１１−２】
【０２５０】
【化１１−３】
【０２５１】
【化１１−４】
【０２５２】
【化１１−５】
【０２５３】
【化１１−６】
【実施例２２】
【０２５４】
この実施例のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＩＬ−１０の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２５５】
ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド
【化１２−１】
【０２５６】
【化１２−２】
【０２５７】
【化１２−３】
【０２５８】
【化１２−４】
【実施例２３】
【０２５９】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１、２、及び３アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１、２、及び３の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２６０】
ＴＧＦ−ベータ１、２、及び３アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１３−１】
【０２６１】
【化１３−２】
【実施例２４】
【０２６２】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１及び２アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１及び２の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２６３】
ＴＧＦ−ベータ１のｍ−ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１４−１】
【０２６４】
【化１４−２】
【０２６５】
ＴＧＦ−ベータ２のｍ−ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化１５】
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】図１は前立腺癌ＰＣ−３の阻害を示した図である。上位２つの配列は、リポフェクチンのみでインキュベートした対照グループの遊走を示している。前記２つの配列より下のものは、リポフェクチンと配列ＩＤ番号１４に示したアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞における明らか遊走の減少を示す。左側の２つの配列は、最初の状態を示す。右側の２つの配列は２４時間後の遊走を示し、明らかに阻害していた。これは転移形成の低減を示す。
【図２】図２は、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが実施例８によるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌の抑制を示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度を１００％に合わせた（無地の棒）。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度は、未処理コントロールに対する％において示されている。指示（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）は３つの独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３】図３は、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯは、実施例８におけるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞の増殖を示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）のデータを１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は未処理コントロールに対する％において示されている。指示は３つの独立した試験の平均及びＳＤである。
【図４】図４は、実施例８において、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＨＣＴ−１１６ＣＲＣ球状体の遊走の抑制を示した図である。０、２４、４８時間における未処理球状体の面積は（白抜き丸（ｏｐｅｎ ｃｙｃｌｅ））μｍ２で示されている。リポフェクチン処理球状体の面積は白抜き三角（ｏｐｅｎ ｔｒｉａｎｇｌｅ）として示されている。配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯの面積は、黒塗り四角（ｃｌｏｓｅｄ ｓｑｕａｒｅ）として示されている。指示は少なくとも４回の平均±ＳＤである。
【図５】図５は、実施例１８における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞上清において培養されたＰＢＭＣの細胞毒性の増進を示した図である。未処理ＨＣＴ−１１６の上清において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、指示エフェクター：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）におけるＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理ＨＣＴ−１１６細胞の上清中において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はチェック模様の棒で示されており、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理ＨＣＴ−１１６細胞の情勢中において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性毒性を斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図６】図６は、実施例９における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨｅｐ−Ｇ２ ＨＣＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌の抑制を示した図である。未処理細胞上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は（無地の棒）ｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の細胞上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプとして示した。指示は３回の平均及びＳＤを示している。
【図７】図７は、実施例９における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨｅｐ−Ｇ２ ＨＣＣ細胞の増殖の抑制を示した図である。電子細胞（ｅｌｃｔｒｏｎｉｃ ｃｅｌｌ）を数えることにより決定した未処理細胞数は、無地の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯの細胞数／リポフェクチン処理細胞は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図８】図８は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＭＥＳ１００ａメラノーマ細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制したことを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度は、ｐｇ／ｍｌで示した。配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプで示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図９】図９は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＭＥＲ−１１６メラノーマ細胞の増殖を抑制したことを示した図である。電子細胞を数えることによって決定した未処理細胞数は、無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数は、チェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ細胞数／リポフェクチン処理細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１０】図１０は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが、Ａ−５４９、ＳＷ−９００、及びＮＣＩ−Ｈ６６１ ＮＳＣＬＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制したことを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度（斜めストライプ）は未処理対照に対する％で示した。指示は各細胞株の独立した３回の試験の平均及びＳＤである。
【図１１】図１１は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが、Ａ−５４９、ＳＷ−９００、及びＮＣＩ−Ｈ６６１ ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を抑制したことを示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ）のデータ（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞のデータ（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞のデータ（斜めストライプ）は未処理対照に対する％で示した。指示は各細胞株における独立した少なくとも２つの試験の平均及びＳＤである。
【図１２】図１２は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＳＷ−９００ ＮＳＣＬＣの遊走を阻害したことを示した図である。スクラッチ試験の０、１７、２４、４８、及び６５時間において測定された未処理細胞の遊走（白抜き丸）はμｍで示した。リポフェクチン処理細胞の遊走は白抜き三角でしめし、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の遊走は黒塗り三角（２００ｎＭ）又は黒塗りダイアモンド（４００ｎＭ）として示した。指示は３回の独立した試験の平均±ＳＤである。
【図１３】図１３は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＡ−５４９ ＮＳＣＬＣ細胞上清中において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を増進したことを示した図である。未処理Ａ−５４９細胞の細胞上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞における細胞媒介性細胞毒性（無地の棒）は、エフェクター：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）において示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理Ａ−５４９細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞における細胞媒介性細胞毒性をチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理Ａ−５４９細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞の細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図１４】図１４は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが卵巣癌細胞Ｃｏｌｏ７０４のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は４回の平均及びＳＤである。
【図１５】図１５は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣｏｌｏ ７０４卵巣癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は、チェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は１回の計算データである。
【図１６】図１６は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＤａｎｇ膵臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度をチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４／リポフェクチン処理細胞上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度を斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１７】図１７は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＤａｎｇ膵臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１８】図１８は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は未処理細胞の％として示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した栄研の平均及びＳＤである。
【図１９】図１９は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）のデータは（無地の棒）１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）および配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）のデータは未処理対照の％として示した。指示は、各細胞株における少なくとも３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２０】図２０は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＰＣ−３前立腺癌細胞の遊走を抑制したことを示した図である。０、６、１７、及び２４時間におけるスクラッチ試験によって測定される未処理細胞の遊走（白抜き丸）は、μｍで示した。リポフェクチン処理細胞の遊走は白抜き三角として示し、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の遊走は黒塗り四角として示した。指示は３回の独立した試験の平均である。
【図２１】図２１は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＰＣ−３前立腺癌細胞上清において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を抑制したことを示した図である。未処理ＰＣ−３細胞の上清において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理ＰＣ−３細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介細胞毒性チェック模様の棒で示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理ＰＣ−３細胞の上清において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図２２】図２２は、実施例１５に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣａｋｉ−１腎臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２３】図２３は、実施例１５に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣａｋｉ−１腎臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２４】図２４は、実施例８に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２５】図２５は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＲＰＭＩ−７９５１メラノーマのＴＧＦ−ベータ２の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２の濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は４回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２６】図２６は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＲＰＭＩ−７９５１メラノーマ細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の細胞数（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は４回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２７】図２７は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＥＦＯ−２１卵巣癌細胞のＴＧＦ−ベータ２分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２８】図２８は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＥＦＯ−２１ライン相癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の細胞数（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２９】図２９は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨｕｐ−Ｔ３、Ｈｕｐ−Ｔ４、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ２分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３０】図３０は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨｕｐ−Ｔ３、Ｈｕｐ−Ｔ４、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。未処理細胞から得たテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）又は電子細胞計測データを１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）及び配列ＩＤ番号３０／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）のデータは、未処理対照の％で示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３１】図３１は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌球状体の遊走を阻害することを示した図である。０、１７、２４、４１、及び６５時間における未処理球状体の直径（白抜き丸）はμｍで示した。配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯで処理した球状体の直径は黒塗り四角として示した。ｒｈＴＧＦ−ベータ２処理球状体の直径は白抜き四角として示した。高ＴＧＦ−ベータ２抗体処理球状体の直径は白抜き三角として示した。指示は少なくとも４回の平均、最大及び最小である。
【図３２】図３２は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞上清中において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を促進することを示した図である。未処理ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は（無地の棒）はエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチンで処理したＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号３０／リポフェクチン処理ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞を有するＰＴＯの上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図３３】図３３は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞のＴＧＦ−ベータ２の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は３回の平均及びＳＤである。 図３４は、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌治療における効果的な薬物に関連する。癌の形成は、望ましくない組織成長を併発する一方で、他方では転移形成を併発する。この分野における研究は多くのメカニズムを開示しているが、依然として、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は卵巣癌などの固形癌それぞれの転移を抑制する又は腫瘍進行を抑制する深刻な副作用のない治療法が存在しない。さらに、この分野における癌は、中皮腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、腎臓癌、食道癌、又は軟組織癌である。腫瘍由来の形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）は、転移、血管形成、及び腫瘍細胞の増殖を誘導することにより悪性進行に極めて重要な役割を果たすために議論されている。さらに、腫瘍細胞における免疫機構からの回避機構において中心的役割を果たしていると見られている。しかし、前記文献におけるＴＧＦ−β役割は、さまざまに議論されている。ＴＧＦ−βによる腫瘍成長の抑制を示唆する実験の一方で、他方では、ＴＧＦ−βによる細胞増殖の誘導を指摘する実験があり、これらが腫瘍の治療法におけるＴＧＦ−βの役割を曖昧にしている。
【０００２】
さらに重要なことは、ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３という多くの異なるサブクラスを有しており、それらの腫瘍進行における具体的役割が別々に議論され、しばしばＴＧＦ−βとして要約され、時折混同されるということである。ＴＧＦ−βの各サブクラス、すなわちＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３の具体的役割は、これまでのところ十分には調査されていない。
【背景技術】
【０００３】
欧州特許第１００８６４９号及び欧州特許第０６９５３５４号において、ＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦ−ベータ２両方のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、乳房の腫瘍、食道癌、胃癌及び皮膚発癌症の治療のための医薬組成物の製造に使用されうることが教示されている。臨床研究は、神経膠腫中において前記ＴＧＦ−ベータが重要な役割を果たし、そのために前記ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが神経膠腫及び乳癌などの治療の好ましい対象であるように示すのに対し、他の腫瘍においては状況が全く異なっている。 前立腺癌においては、例えば（Ｗｉｋｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｕｒ−ｏｌ Ｎｅｐｈｒｏｌ ３４ Ｓ．８５−９４）、他の癌におけるのと同様に、ＴＧＦ−ベータレベルは上昇するという示唆があるが、このシステムが治療目的で操作され得るかどうかは明らかではない。
【０００４】
インタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）によりそれが免疫応答の制御に中心的な役割を果たすことが知られている。一部のインタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞媒介免疫応答を増強することが示されたため、腫瘍細胞の回避機構を補填し腫瘍成長を阻害して転移形成を減少させる方法において、免疫応答を調節するためにヒトにおけるＩＬ−１０の強力な阻害剤を見出すことが重要であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、腫瘍成長における望ましくない細胞増殖を抑制及び／又は転移の形成を抑制する適切な腫瘍の治療法を見つけることが本発明の課題であった。
【０００６】
本発明の１つの課題は、転移形成を抑制する治療法を見出すことである。
【０００７】
例えば膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌及び前立腺癌などの腫瘍は予後不良であり、現在まで有効な治療法は発見されていない。これはまた、中皮腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、腎臓癌、食道癌、軟組織癌などの腫瘍にもあてはまる。従って、このような腫瘍を特異的に抑制する特性を有する新たな治療方法、及び各々の癌の治療に対するこのような治療法の使用方法を見出すのが本発明の課題であった。本発明のもう１つの課題は、免疫機構を調節するインタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）の新しい阻害剤及び適切なそれらの合成方法と、癌治療及び免疫修飾において好まれる医薬組成物の調整のためのそのような阻害剤の使用とを見出すことである。
【０００８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの機構は、直接的効果だけでなく免疫調節効果により作用するようであり、実験的研究において証明され得る。これは、ＴＧＦ−ベータ抗体で可能であったものより効果的にＴＧＦ−ベータアンチセンスヌクレオチドによって細胞移動が阻害されるということを我々が示すことができたため、例えば抗体などによるＴＧＦ−ベータの最先端の阻害より優れている。本発明の医薬組成物は、副作用がより少なく、より有効性があり、より高い生物学的利用可能性（バイオアベイラビリティ）を有し、より高い安全性及び／又は改善された化学安定性を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
我々は、驚くべきことに、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３の形成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）及び／又はインタ−ロイキン１０特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞株及び腫瘍における転移形成を阻害するということを発見した。
【００１０】
我々はさらに、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ３、インタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、白血病及びリンパ腫などの悪性骨髄増殖性疾患だけでなく、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、メラノ−マ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、及び前立腺癌などの固形腫瘍の腫瘍増殖を阻害することを見出した。ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ３及びインタ−ロイキン１０アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる適応症は、腎臓癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌及び／又は軟組織癌である。
【００１１】
ＴＧＦ−ベータ２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１ＴＧＦ−ベータ３及び／又はインタ−ロイキンのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する上述のように、腫瘍増殖を阻害する。
【００１２】
本発明の別の観点は、インタ−ロイキン１０（ＩＬ−１０）の形成を阻害する新しくより優れたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、これにより免疫応答を調節する。
【００１３】
本発明のまた別の観点は、ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドの生成である。
【００１４】
本発明の更なる観点は、医薬組成物の調整に対するインタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用である。インタ−ロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、転移及び／又は腫瘍成長の治療のための医薬組成物の調整にも使用され、このような病気の治療に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は活性誘導体は、転移形成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の調整に使用される。これらの医薬組成物は転移治療に使用される。
【００１６】
本発明の本文中における転移は、少なくとも１つの細胞が腫瘍組織から分離又は解離し、例えばリンパ系及び／又は血管などによりヒト又は動物の身体の別の部位に移動し、そこで留まり新しい腫瘍組織を形成することを意味する。
【００１７】
別の実施形態において、前記オリゴヌクレオチド又は活性誘導体は、転移の形成に関連したタンパク質合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
更なる実施形態において、そのような合成において阻害されたタンパク質は、例えば、腫瘍成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰＳ）及び／又はインタ−ロイキン１０などからなる群から選択される。
【００１９】
本発明の本文中において、腫瘍成長因子は、形質転換成長因子の同義語として使用される。ＴＧＦ−ベータという用語は、特にＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及び／又はＴＧＦ−ベータ３を含む。
【００２０】
本発明の一実施形態は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はそのＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３活性誘導体、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテア−ゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）及び／又はインタ−ロイキン１０及び／又は癌治療にいて転移形成を阻害する医薬組成物を調整するためのそれらの活性誘導体の使用である。
【００２１】
分子間接着分子（ＣＡＭｓ）は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、内皮性白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１）などの分子を含む。
【００２２】
金属プロテア−ゼは、細胞外マトリックスの成分に幅広いタンパク質分解活性を有し同定順に番号付けされた（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２など）少なくとも１５個の構造的に関連した構成物を含む。金属プロテア−ゼは、これらに限られないが、コラゲナ−ゼ、ゼラチナ−ゼ、ストロメライシン及び金属エラスタ−ゼを含む。
【００２３】
本発明の活性誘導体は、後述のように、オリゴヌクレオチドの修飾物である。
【００２４】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は転移形成の阻害に対する医薬組成物を調整するための活性誘導体は、配列ＩＤ番号１〜６８に基づいて羅列した配列において特定される配列であり、さらに好ましくは、配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、４０及び４２として記載した配列において特定される配列である。転移形成の阻害に対する医薬組成物を調整するためのこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの更なる実施形態は、実施例１９から２４において与えられている。これらのオリゴヌクレオチドは、標的分子に対して改善された親和性を有する。さらに、最先端技術において記載したそれらのオリゴヌクレオチドと比較して、これらの分子の利点は、副作用がより少なく、より有効性があり、生物学的利用可能性がより高く、より高い安全性及び／又は改善された化学安定性を示す。
【００２５】
発明のさらに別の実施例において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、次に挙げる癌における転移阻害において有益で、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄芽細胞腫、メラノ−マ、中皮腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、膠肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、ウィルムス腫瘍などの癌における転移阻害において有益である。
【００２６】
より好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、例えば膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬ）、卵巣癌、膵臓癌、軟組織癌などの癌における転移阻害に有益である。本発明の本文中において有益であることは、それらが医薬組成物の調整のために使用されること及び／又は各々の癌、癌腫、及び／又は転移の治療に使用されることを意味する。
【００２７】
本発明の本文中において、癌の使用は癌腫と同意語である。
【００２８】
さらに、適応症及びＴＧＦ−ベータの全ての組み合わせは、本明細書において開示されていると理解される。
【００２９】
別の好ましい本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、医薬組成物の調整及び／又は腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、食道癌、及び／又は多発性骨髄腫の治療に使用される。
【００３０】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌を治療するための医薬組成物の調整に使用される。他の実施形態において、本発明の前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、腎臓癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌、及び／又は軟組織癌を治療するための医薬組成物の調整に使用される。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明の前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、例えば胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管細胞腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、膠肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、及び／又はウィルムス腫瘍などの癌の治療、及び／又は前記癌の治療のための医薬組成物の調整に使用される。
【００３２】
これらのオリゴヌクレオチドの各々の活性誘導体は本明細書の後半でより詳細に記載されている。
【００３３】
また別の実施形態において、上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整におけるオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、腫瘍成長因子ベ−タ１、各形質転換成長因子（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−ベータ３、及び／又はインタ−ロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
別の実施形態において、上述したような癌の治療及び／又は上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整におけるオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
より好ましい実施形態において、上述したような癌を治療するための医薬組成物の調整における前記オリゴヌクレオチド又はその活性誘導体は、配列ＩＤ番号１〜２１又は４９〜６８、２２〜４８又は６９〜１０７に基づいて羅列した配列中で特定されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２５、２６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、及び３７に基づいて羅列した配列中で特定される配列がさらにより好ましい。これらの配列は特に高い親和性を有する。
【００３６】
これらの配列は各々の遺伝子のｍ−ＲＮＡに特に高い親和性を有し、副作用がより少なく、より高い有効性を示し、より高い生物学的利用可能性を有し、安全性及び／又は改善された化学的安定性を有する。本発明の別の観点は、大腸癌、前立腺癌、黒色腫、膀胱癌、子宮内膜癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮腫の群から選択される癌を治療するためのＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストの使用方法である。これらの腫瘍のいくつかは、高いレベルのＴＧＦ−ベータ１を伴い、驚くべきことにＴＧＦ−ベータ２の阻害によって腫瘍細胞増殖が顕著に減少し、このことはこれらの癌の治療に重要な因子である。
【００３７】
本発明の本文中におけるＴＧＦ−ベータ２（形質転換成長因子２）アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２の機能を阻害するいかなる化合物も含み、これはＴＧＦ−ベータにより誘導されるいかなる効果も阻害されることを意味する。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２の生成を阻害する物質であり、ＴＧＦ−ベータ２に結合する物質であり、及び／或いは、ＴＧＦ−ベータ２の下流のその活性カスケ−ドの機能を阻害する物質である。より詳細なＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストに関しては、Ｗｏｊｔｏｗｉｃｚ−Ｐｒａｇａ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ２１：２１−３２，２００３を参照のこと。
【００３９】
阻害剤は、ＴＧＦ−ベータ２結合性タンパク質、阻害剤関連ＴＧＦ−ベータ受容体、Ｓｍａｄ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ２結合性ペプチド（潜伏関連ペプチド）、抗ＴＧＦ−ベータ２抗体、ＴＧＦ−ベータ発現制御因子を含むがこれらに限定されてない。
【００４０】
ＴＧＦ−ベータ２結合性タンパク質の例は、フェチュイン、デコリン、小型コンドロイチン−デルマタン硫酸プロテオグリカン、及びプロテオグリカンの一種のバイグリカン及びフィブロモジュリンである。ＴＧＦ−ベータ受容体阻害剤は、例えば、ベータタグリカン（細胞外領域のＴＧＦ−ベータタイプＩＩＩ受容体）である。
【００４１】
ＴＧＦ−ベータ発現制御因子の例は、トラニスト（Ｎ−［３，４−ジメチトキシシンナモイル］−アントラニル酸）又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスプラスミドベクタ−又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましい実施形態において、ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号２２〜４８、より好ましくは配列ＩＤ番号２５、２６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、３７を用いて記載される配列から選択される。
【００４２】
本発明のまた別の観点は、新しいＩＬ−１０アンチセンス−オリゴヌクレオチド、及び配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるその活性誘導体である。これらのオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１０のｍ−ＲＮＡに対して非常に高い親和性を有し、これによりＩＬ−１０の合成を効率的に阻害する。
【００４３】
一実施形態において、ＩＬ−１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体を生産する工程は、段階的に又はより長いオリゴヌクレオチド鎖からオリゴヌクレオチドを切断することにより、連続したヌクレオチド及びリンカーを添加することを含む。
【００４４】
本発明のまた別の観点は、配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体を含む医薬組成物である。
【００４５】
本発明の更なる実施形態は、癌及び／又は転移の治療のための医薬組成物の調整における、配列ＩＤ番号４９〜６８で表記する配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用方法である。
【００４６】
本発明の１つのオリゴヌクレオチドは、癌治療における転移形成を阻害するための医薬組成物の調整において使用されるものであり、本発明のオリゴヌクレオチドは、膀胱癌、大腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、又は軟組織癌を治療するための医薬組成物の調整においても使用されるものであり、ＩＬ−１０の合成を阻害する新しいオリゴヌクレオチドもまた本発明の一部である。
【００４７】
オリゴヌクレオチド又は核酸という用語は、多数のヌクレオチド（すなわちリン酸基に結合した糖（例えばリボース又はデオキシリボースなど）、及び置換ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））或いは置換プリン（例えばアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）など）のいずれかの可変性の有機塩基に結合した糖を含む分子、）又はそれらの修飾物を指す。本明細書において使用されているように、前記用語は、オリゴデオキシリボヌクレオチドと同様にオリゴリボヌクレオチドを指す。前記用語は、また、オリゴヌクレオシド（すなわちリン酸基のないオリゴヌクレオチド）及びポリマーを含む他の任意の有機塩基を含む。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖であるのに対し、一部の実施形態において前記一本鎖の核酸の少なくとも一部分は二本鎖である。一本鎖の分子が増強された活性を有するのに対し、二本鎖の分子は生体内においてより安定である。
【００４９】
一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子のｍ−ＲＮＡの全体に対して相補的であるか、又は、阻害されるタンパク質の任意の小部位が例えばＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０などから選択され得る。より好ましい実施形態において、本発明の前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約６〜約３００ヌクレオチドの長さを有し、また別の実施形態において前記ヌクレオチドはそれぞれ約７〜約１００ヌクレオチド、約８〜約３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは１２〜２４ヌクレオチドの長さ有する。
【００５０】
それぞれの遺伝子の配列は当業者に周知であり、またその一部は実施例１４において示されるものである。
【００５１】
さらに別の実施形態において、核酸はアンチセンス核酸ではなく、相補的遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡ種に細胞内で結合してその結果前記ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ種の機能を阻害することによって機能しないということを意味する。核酸の結合ユニットに関して本明細書において使用されるように、「結合された」又は「結合」は、二つの実体が互いに物理化学的手段で結合されているということを意味する。共有結合又は非共有結合など、当業者に周知のいかなる結合も包含される。天然結合は、核酸の個々のユニットを結合する性質において通常見出されるものであり、最も一般的である。しかしながら、核酸の個々のユニットは、合成又は修飾された結合で結合されてもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのリン酸リンカーはペプチドによって置換される。前記オリゴヌクレオチドのこれらの誘導体は、また、ペプチド核酸とも呼ばれる。
【００５３】
一実施形態において、この線形重合構造のそれぞれの末端は、さらに環状構造を形成するように結合される。しかしながら、開環線形構造が通常好まれる。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格の形成としてみなされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの標準的な結合又は骨格は、３’−５’リン酸ジエステル結合である。
【００５４】
オリゴヌクレオチド又は核酸は、類似の機能を有する非天然発生部位を持つオリゴヌクレオチドを含む。そのように装飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞内取り込み、核酸標的（例えばタンパク質）への増強された親和性、変更された細胞内局在化、及びヌクレアーゼ存在下における増大された安定性などの望ましい特性のために、しばしば、天然形態よりも好まれる。本明細書において使用されるオリゴヌクレオチドの装飾は、糖、塩基部分、及び／又はヌクレオシド結合のいかなる化学的装飾も含むものである。
【００５５】
一実施形態において、共有結合的に修飾された塩基及び／又は糖を有する核酸又はオリゴヌクレオチドは、例えば、３’及び／又は２’の位置におけるヒドロキシル基以外、及び５’の位置におけるリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合的に結合された糖骨格を有する核酸を含む。従って装飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでも良い。さらに別の実施形態において、装飾された核酸はリボースの代わりにアラビノースなどの糖を含む。従って前記核酸は、骨格組成において異種である可能性があり、その結果ペプチド核酸（核酸塩基と共にアミノ酸骨格を有する）などと一緒に結合したポリマーユニットの任意の可能な組み合わせを含むものである。一部の実施形態において、前記核酸は骨格組成において同種である。
【００５６】
前記核酸の置換プリン及びピリミジンは、Ｃ−Ｓプロピン置換塩基などの塩基類似体と同様にシトシンなどの標準のプリン及びピリミジンを含むものである（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０−８４４，１９９６）。プリン及びピリミジンは、これらに限定されないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、及び他の天然及び非天然に存在する核酸塩基、置換及び無置換の芳香族部分を含むものである。
【００５７】
各オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドポリマー中の一本鎖ヌクレオチドは、同じ装飾を含むものであっても良く、そのような装飾の組み合わせを含むものであっても良く、或いは、そのような装飾をリン酸ジエステル結合で結合していても良い。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドポリマーにヌクレアーゼ耐性を与える方法は、これに限定されないが、共有結合的に修飾したプリン又はピリミジン塩基を含むものである。例えば塩基は、メチル化されるか、ヒドロキシメチル化されるか、或いは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが実質的に酸及びヌクレアーゼ耐性を与えられるように置換（例えば、グリコシル化）されていても良い。
【００５８】
前記配列の一部のヌクレオチドが別のヌクレオチド或いはさらにスペーサーによって置換されているアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体であっても、例えばＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０などのタンパク質の合成を阻害することが当業者に理解される。より好ましい実施形態において、約０．１％〜約５０％、又は約０．１％〜約１０％、又は約０．１％〜約５％のヌクレオチドが置換される。
【００５９】
上述したようにスペーサーは前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも２つの部分を連結するいかなる化学物質でもよく、少なくとも１つの核酸のスペースを置換する。
【００６０】
また別の実施形態において少なくとも１つのＴ（チミジン）は、Ｕ（ウラシル）によって置換される。
【００６１】
好ましい実施形態においてスペーサーは、別のヌクレオチド、又はグルコース、リボースなどの糖、又はアミノ酸、又はポリプロピレンなどの１又はいくつかのポリマーユニットである。
【００６２】
より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端ブロック（ｅｎｄ−ｂｌｏｃｋ）は、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、又はアビジン類似体である。これらの分子は、保護されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの分解をブロックし且つ修飾された核酸の固体担体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）への高い親和性結合手段を提供する能力がある。アビジン及びビオチン誘導体は、本発明の試薬を調整するために使用され得るものであり、ストレプトアビジン、コハク酸化アビジン、単量体アビジン、ビオシチン（ビオチン−イプシロン−Ｎ−リジン）、ビオチンヒドラジド、２−イミノビオチンのアミノ又はスルフヒドリル誘導体、及びビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸ヒドラジドを含む。ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベンゾイルビオシチン及び３−（Ｎ−マレイミドプロピニル）ビオシチンなどの更なるビオチン誘導体もまた、本発明のポリヌクレオチド上の末端ブロッキング基として使用される。
【００６３】
別の実施形態において、装飾されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドのリボース基の環状構造は、Ｎ−Ｈ、Ｎ−Ｒ（Ｒは、アルキル又はアリール置換基）、Ｓ、及び／又はメチレンで置換された環状構造において酸素を有する。
【００６４】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの糖成分
は、モルホリノ誘導体であり、その活性誘導体は、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００６５】
別の実施形態において、少なくとも１つの糖部分の２つの炭素は結合している。その結合は、メトキシ基又はその他を伴っていても良い。このリンカーは、ある特定の立体構造においてそれが維持されるような方法で糖部分をを固定し、これによって、例えば、このように固定された核酸がより高い選択性及びより高い安定性有することが可能になる。固定された核酸は、例えば、Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２０，５４５８−５４６３（１９９９）又はＪ．Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８（６&７），Ｓ．１３６５−１３７０中に記載されており、これらはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
また別の実施形態において、塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。そのようなオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが明らかにされているオリゴヌクレオチド類似物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含むアミドで置換される。核酸塩基は、前記骨格のアミド部位のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調整を教示する代表的な米国特許は、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、及び第５，７１９，２６２号を含み、各々はこの参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００において見いだされ得る。
【００６７】
さらに、修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、チオリン酸、キラルなチオリン酸、ジチオリン酸、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’−アルキルホスホンサンエステル及びキラルホスホンサンエステルを含むメチル及び他のアルキルのホスホンサンエステル、３’アミノホスホアミデート及びアミノアルキルホスホアミデートを含むホスホアミデート、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホン酸エステル、チオノアルキルホスホトリエステル、及び標準的３’−５’結合を有するボラノホスフェイト、これらの２’−５’結合類似体、及び反対の極性を有するものであってヌクレオシドユニットの隣接したペアが３’−５’から５’−３、又は２’−５’から５’−２’に結合したものなどを含む。さまざまな塩、混合塩、及び遊離酸もまた含まれる。
【００６８】
本発明の一部の実施形態において有益な骨格修飾を有する核酸は、Ｓ又はＲキラル抗新生物薬の核酸である。本明細書で使用される"Ｓキラル核酸"は、少なくとも２つのヌクレオチドがキラル中心を形成する骨格修飾を有し、多数のキラル中心がＳキラリティを有する核酸である。本明細書で使用される"Ｒキラル核酸"は、少なくとも２つのヌクレオチドがキラル中心を形成する骨格修飾を有し、多数のキラル中心がＲキラリティを有する核酸である。骨格修飾は、キラル中心を形成するいかなるタイプの修飾であってもよい。前記修飾は、これらに限定されないが、チオリン酸、メチルリン酸、メチルチオリン酸、ジチオリン酸、ｐ−エトキシ、２’−メトキシ及びこれらの組み合わせを含む。
【００６９】
本発明に有益である修飾された骨格の他の種類は、ペプチド核酸である。前記骨格はアミノエチルグリシンから成り、核酸の特徴を与える塩基を支持する。前記骨格はいかなるリン酸塩も含まず、従って選択的に正味荷電を待たないものである。この電荷の欠如により２本鎖間の電荷反発が存在しないために、より強力なＤＮＡ−ＤＮＡ結合を可能にする。さらに、前記骨格が余分なメチレン基を有するために、オリゴヌクレオチドは酵素／プロテアーゼ耐性である。ペプチド核酸は、例えばＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒなどの様々な商業的供給源から購入、或いは新規に合成可能である。
【００７０】
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、上述の修飾のうちの１つにおいて修飾されたように修飾される。
【００７１】
また別の実施形態において、オリゴヌクレオチドのこのような修飾は一緒にされる。
【００７２】
好ましい実施形態において、１から約１２、又は１から約８、又は１から約４、又は１から約２のオリゴヌクレオチド及び／又はヌクレオチドのオリゴヌクレオチド３’及び／又は５’末端での結合は上述のように修飾される。
【００７３】
また別の実施形態において、同一の標的（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０）とハイブリッド形成し、表記された配列のオリゴヌクレオチドの１つを含むがさらに約１〜約２０までのヌクレオチド、さらに好ましくは２’、３’、及び／又は５’末端の少なくとも１つにおいて１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２のヌクレオチドを有する配列を有する本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
【００７４】
つまり、本発明の任意の配列が選出され得る。例えばある配列は、表記された配列又は実施例から抽出される。このような配列は、例えば実施例１６において与えられたＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、又はＩＬ−１０などの標的分子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスの一部分である。ヌクレオチドは、標的分子のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスの配列に続くこれらの配列の一方の末端に添加され、ｍＲＮＡとハイブリッド形成する新しいオリゴヌクレオチドを作り出す。オリゴヌクレオチドの任意末端において、長さ約１〜約２０の長さのヌクレオチド、より好ましくは約１〜約２５、さらに好ましくは約１〜約１０、約１〜約５、約１〜約３のヌクレオチドが添加される。上述のように、いくつかのヌクレオチドが置換されるか或いはスペーサーがヌクレオチドの代わりに含まれる場合、このオリゴヌクレオチド誘導体は依然として標的分子のｍＲＮＡとハイブリッド形成することが当業者には理解される。
【００７５】
本発明において言及したオリゴヌクレオチドの標的は当業者には既知である。好ましい実施形態において、前記標的は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織細胞（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０のｍＲＮＡの群から選択される。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの配列は、実施例６において与えられる。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、及びインターロイキン１０のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス配列及びＴＧＦ−βに相補的なスプライスバリエーションのアンチセンスは、実施例１６において与えられる。
【００７６】
本発明のまた別の課題は、本発明のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の製造工程を見出すことであった。
【００７７】
本発明の使用に関して、核酸は、当業者には良く知られた数多くの手順を使用して新規に合成され得る。そのような化合物は、‘合成の核酸’と称される。例えば、ｂ−シアノエチルホスホアミデート方法（Ｂｅａｕｃａｕｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９，１９８１）；ヌクレオシド Ｈ−ホスホン酸塩方法（Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１−４０５４、１９８６；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４０７，１９８６，Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５−４０５８，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９−２６２２，１９８８）がある。これらの化学は、市販の種々の自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置により遂行され得る。
【００７８】
好ましい工程において、本発明のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’−５’方向にヌクレオチド鎖を伸長させる亜リン酸塩トリエステル化学を使用して合成され、各ヌクレオチドは固相に共有結合的に付着した第一のヌクレオチドに結合しており、前記工程は、前記ヌクレオチド５’ＤＭＴ保護基を開裂する第一工程と、その後鎖の伸長のために各ヌクレオチドを添加する工程と、その後亜リン酸基とキャップ（ｃａｐ）した未反応の５’−水酸基を修飾する工程と、固体担持からオリゴヌクレオチドを開裂する工程と、最後に合成生成物をワークアップする工程とを含む。
【００７９】
また別の実施形態において、核酸はプラスミドにおいて大規模に生産され（例えば、Ｓａｍｂｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）、小片に分離されるか或いは全体として投与される。
【００８０】
さらに別の実施形態において、核酸は、例えば制限酵素であるエクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼの使用など当業者に既知の技術を使用して、既存の核酸配列（例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）から調整される。この方法において調整された核酸は単離された核酸である。核酸という用語は、合成及び単離された核酸及び坑新生物薬坑腫瘍性核酸を含む。
【００８１】
他の実施形態において、例えばチオリン酸結合を有するものなどの修飾された骨格を有する核酸は、例えば、ホスホアミデート又はＨ−ホスホン酸塩化学などを使用した自動化された技術を使用して合成される。アリール及びアルキルホスホン酸塩は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号広報に記載されるように作られ得る。米国特許第５，０２３，２４３号広報及び欧州特許第０９２，５７４号広報に記載されるように電荷を持った酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルは、商業的に入手可能な試薬を使用した自動固相合成により調整される。
【００８２】
他の核酸骨格修飾及び置換の作成方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【００８３】
核酸を欠いた前記合成の記載は当業者に既知であり、更なる詳細は、例えばＷｅｎｇｌｅ，Ｊ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１２０，Ｓ．５４５８−５４６３（１９９９）、又はＫｏｃｈ，Ｔ．，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｃｏｎｄｅｓｅ Ｍａｔｔｅｒ １５，Ｓ．１８６１−１８７１（２００３）を参照のこと。
【００８４】
一実施形態において、チオリン酸は、ホスホアミデート又はＨ−ホスホン酸塩化学のいずれかを使用した自動化された技術を用いて合成される。アリール及びアルキルホスホン酸塩は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号広報に記載されるように作られても良く、さらにアルキルホスホトリエステル（電荷を持った酸素成分が米国特許第５，０２３，２４３号広報及び欧州特許第０９２，５７４号広報に記載されるようにアルキル化されている）は、商業的に入手可能な試薬を使用した自動化された固相合成により調整され得る。他のＤＮＡ骨格修飾及び置換の作成方法が記載されている（Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４，１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５，１９９０）。
【００８５】
本発明による有用な他の核酸源は標準のウィルス及び細菌性ベクターを含み、それらの多くは商業的に入手可能である。最も広義において「ベクター」とは任意の核酸物質であり、核酸の細胞への移動を供給及び促進する目的で通常使用される。本明細書に使用されるベクターは発現され得る遺伝子を持った空ベクター又はベクターである。ベクターが遺伝子を持っている場合、一般的にこのベクターは、遺伝子をターゲット細胞に運び、ベクターがない場合にもたらわれる分解の程度と比較して分解が低減される。この場合、前記ベクターは選択的に遺伝子の発現配列を含み、免疫細胞などの標的細胞における遺伝子発現を促進するが、前記細胞において遺伝子が発現されている必要はない。
【００８６】
本発明内のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体は、本発明の活性誘導体と同義語であり、診断及び治療において研究用試薬及びセットとして使用され得る。治療上の使用に関して、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、例えば病気、より好ましくは腫瘍及び／又は転移を患った動物、特にヒトに投与される。
【００８７】
好ましい実施形態において、ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌の治療のため及び／又は転移形成を阻害する医薬組成物の調整に使用される。
【００８８】
好ましい実施形態において、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特に本発明の対象である。このように、薬学的に許容な担体において本発明に従った本オリゴヌクレオチド及びその活性誘導体は非常に有用である。これは、例えば癌及び転移などの特に望ましくない病気にあてはまる。
【００８９】
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチド及び／又はその活性誘導体は、これらに限らないが、例えば胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳房の腫瘍、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、胚性癌腫、上皮性癌、食道癌、子宮頸癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胆嚢癌、胃癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、頸部癌、非小細胞気管支／肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、皮膚癌、小細胞気管支／肺癌、扁平上皮細胞癌、脂腺癌、睾丸癌、子宮癌などの望ましくない癌又は癌腫の治療において有用である。
【００９０】
聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコ−マ及び化膿性肉芽腫；前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユ−イング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、血管細胞腫、ホジキンスリンパ腫、髄芽細胞腫、白血病、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、非ホジキンス、リンパ腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、黒色腫、髄膜腫、筋肉腫、乏突起膠腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノ−マ、トラコ−マ、及び／又はウィルムス腫瘍。
【００９１】
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、等張水溶液中において投与され、腫瘍内と同様に静脈内での用途に適切である。さらに本発明の医薬組成物は、１つ以上の非中毒性の薬学的に許容される担体、賦刑剤、及び／又はアジュバント（まとめて本明細書において「担体物質」として称される）を伴ったオリゴヌクレオチドを含む。前記担体物質は、前記組成物の他成分と親和性があるという意味において許容され、受容体に有害ではない。本発明の医薬組成物は、適切な担体、及び意図する治療に対して効果的なオリゴヌクレオチドの投与量を選択することにより、任意の適切な経路によって投与されることに適応され得る。例えば、これらの組成物は、経口、血管内、腹腔内、皮下、筋肉内、直腸、又は腫瘍内投与に適切な形態に調整され得る。
【００９２】
従って、使用される担体物質は、固体又は液体、又はその両者であっても良く、例えばタブレットなどの投与単位組成物として化合物が処方され、オレゴヌクレオチドの重量で約１％〜約９５％含み得る。溶液中のオレゴヌクレオチドの濃度は、投与される容量に依存する。そのような本発明の医薬組成物は、本質的に成分の混合から成る薬学的な任意の既知の技術により調整され得る。
【００９３】
本発明の医薬組成物は単独又は混合物中において輸送される。混合物は、１つ又は複数の本発明のオリゴヌクレオチド含む。本明細書における少なくとも２つのこれらの物質は、化合物としても称される。
【００９４】
一実施形態において、前記少なくとも２つの化合物は、混合物でされるか、純物質であるか、又は薬学的に許容な担体中にある。また別の実施形態において、前記医薬組成物の少なくとも２つの化合物は、分離されて純粋であるか、又は分離されて医薬組成物中にある。一実施形態において、前記少なくとも２つの成分は同一の薬学的に許容な担体中にあり、さらに別の実施形態において、前記少なくとも２つの成分は異なる薬学的に許容な担体中にある。
【００９５】
投与形態
本発明の医薬組成物の投与は、当業者に既知であるいかなる手段において行われても良い。投与経路は、これに限定されないが、経口、経鼻、髄腔内、接眼、経肺、膣内、直腸、非経口（例えば筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、又は皮下、又は直接注射）、局所、経皮を含む。
【００９６】
望ましくない癌又癌腫の治療のための医薬組成物の一実施形態において、この医薬組成物は、生分解性ポリマーインプラント又は埋め込み式カテーテルにより送達される。
【００９７】
「医薬組成物」という用語は本組成物の液体又は物質に関与し、純物質であり、及び／又は薬学的に許容な担体と組み合わされる。
【００９８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、１若しくはそれ以上の親和性固体又は液体充填剤、希釈剤、又はカプセル化された物質を意味し、ヒト又は他の脊椎動物の投与に適する。「担体」という用語は、有機又は無機成分を意味し、天然物又は合成物であり、活性成分が結合して用途を促進するものである。前記医薬組成物の成分はまた、望ましい薬学的効果が実質的に損なわれる作用がない方法で、本発明の化合物と混合され得る。
【００９９】
そのような担体は、本発明の化合物を、タブレット、コーティングされたタブレット、顆粒、粉末、錠剤、糖衣錠、（微小）カプセル、液状、ゲル状、シロップ、スラリー、懸濁液、エマルジョン、及びそのようなものとして処方され、治療される対象物によって経口摂取される。
【０１００】
前記医薬組成物はまた、顆粒、粉末、タブレット、コーティングされたタブレット、（微小）カプセル、坐薬、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップ、被覆された金粒子、又は活性化合物の遅延された放出を伴う調整物を含んでも良く、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、着香剤、甘味剤、又は可溶化剤などの調整賦形剤及び添加剤及び／又は補助剤は、通常上述のように使用される。
【０１０１】
薬物送達の本方法の簡潔な概説に関しては、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３，１９９０を参照し、それはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
経口投与に関して、前記医薬組成物はいかなる薬物担体もなく単独で送達されるか、或いは化合物を薬学的に許容な担体と結合することによって容易く処方される。
【０１０３】
一実施形態において、経口用医薬組成物は固体賦形剤として得られ、必要に応じて適切な補助剤を加えた後、選択的に得られる混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工し、タブレット又は糖衣錠の核が得られる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールなどの糖；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン、ジェラチン、トラガカント・ガム、メチルセルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調整剤などの充填剤である。
【０１０４】
また別の実施形態において、例えば架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム等のその塩など、崩壊剤が加えられる。選択的に経口製剤はまた、内部酸性状態を中和するために生理食塩水又は緩衝液中において処方されても良い。
【０１０５】
さらに別の実施形態において、糖衣錠の核は、適切な被覆剤と共に提供される。この目的に対して、濃縮糖溶液が使用されても良く、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液（ｌａｃｑｕｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を選択的に含んでも良い。
【０１０６】
また別の実施形態において、活性化合物の投与量の異なる組み合わせを特定又は特徴付けるために、色素又は顔料がタブレット又は糖衣錠被覆剤に加えられる。
【０１０７】
別の実施形態において、経口に使用され得る医薬調製物は、グリセロール、ソルビトールなどのゼラチンで作られた押し込み型カプセル及びゼラチンで作られた軟質密閉カプセル、及び例えばグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤を含む。一実施形態において、前記押し込み型カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又はタルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び選択的に安定剤を伴った混合物中において活性成分を含む。また別の軟カプセルの実施形態において、前記活性化合物は、例えば脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中で溶解又は懸濁される。さらに、安定剤が添加されても良い。
【０１０８】
また別の実施形態において、経口投与用に処方された微小球が使用され、これは当業者には既知である。
【０１０９】
経口投与の製剤は、投与量においてそのような投与に適切である。
【０１１０】
さらに別の口腔投与に対する実施形態において、前記組成物は、従来方法において処方されたタブレット又はトローチ剤の形態をとっても良い。
【０１１１】
吸入
吸入投与に対する別の実施形態において、本発明に従った使用に対する化合物は、エアロゾールスプレーの形態で便利に送達されてもよく、加圧パック又は噴霧器から、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなどの適切な高圧ガス使用を伴っても良い。加圧されたエアロゾールの場合、投与量単位は、定量を送達するためにバルブを提供することにより決定されても良い。例えば吸入器中において使用するゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含んで処方されても良い。
【０１１２】
適切な薬学的担体は、例えば、吸入用の水又は生理食塩水であり、微小カプセル化され、渦巻き型で（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、リポソームに含まれ、中和されたエアロゾールである。
【０１１３】
また別の実施形態において、非経口、髄腔内、心室内、又は腫瘍内投与のための薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液を含み、緩衝液、希釈剤、及びこれに限定されないが、例えば貫通促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容な担体又は賦型剤などの他の適切な添加剤を含んでも良い。
【０１１４】
さらなる別の実施形態において、前記化合物の系統的な送達に対して、その化合物は注射による非経口投与（例えば、静脈内ボーラス、又は連続的注入）のために薬学的担体中にある。注射用の製剤は、例えば、アンプル又は複数投与する容器中などの単一投与量形態中において保存料と共に与えられる。医薬組成物は、油又は水媒体中の懸濁、溶液、又はエマルジョンなどの形態をとり、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの補助剤を含む。
【０１１５】
一実施形態において、非経口投与のための薬学的担体は、水溶性形態における活性化合物の水溶液を含む。
【０１１６】
また別の実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調整される。適切な親油性の溶媒又は媒体は、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。水性注入懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させるカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの物質を含む。選択的に、前記懸濁液は、化合物の溶解性を増大させる適切な安定剤又は試薬もまた含んでいても良く、高濃度溶液の調整を可能にする。
【０１１７】
さらに別の実施形態において、前記活性化合物は、例えば滅菌無発熱水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）などの適切な媒体とともに形成するための粉末形態であっても良く、使用前又は鋭利な物体に乾燥して皮膚に傷をつける。
【０１１８】
また別の実施形態において、前記化合物は、坐薬又は保持かん腸剤などの直腸又は膣の組成物において処方され、例えばココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む。
【０１１９】
また別の実施形態において、前記化合物は持続性薬剤調整物として処方される。一実施形態において、そのような長く作用する処方は、適切なポリマー又は疎水性化合物（例えば許容な油中のエマルジョンとして）として、又はイオン交換樹脂、又は例えば少量可溶化塩など少量可溶化誘導体として処方される。
【０１２０】
他の実施例において、送達システムは、持続放出、遅延放出、又は持続放出送達システムを含む。そのようなシステムは、化合物の反復投与回避し、対象物及び医者に対する利便性が増大するものである。放出送達システムの多くの種類が利用可能であり、当業者に既知である。
【０１２１】
１つの実施形態において、送達システムは、ポリマー（ラクチド−グリコリド）、共重合シュウ酸塩、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオートエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などの、ポリマーベースシステムを含む。薬剤を含む上述のポリマーの微小カプセルは、例えば、米国特許第５、０７５、１０９号広報に記載される。
【０１２２】
また別の実施形態において、送達システムは、例えばコレステロール、コレステロールエステル、及び脂肪酸などのステロールを含む脂質又はモノ−ジ−及びトリ−グリセリドなどの中性脂質である非ポリマーシステム；ヒドロゲルリリースシステム；シラスティックシステム；ペプチドベースシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用する圧縮タフレット；部分的に溶解したインプラント；及びそのようなものを含む。
【０１２３】
特異的な実施例は、これに限定されるないが；（ａ）エアロゾールシステムを含み、そこにおいて本発明の基剤は、米国特許第４、４５２、７７５号広報、第４、６７５、１８９号、及び５、７３６、１５２号に記載されるものなどのマトリックス内での形態で含まれる及び（ｂ）拡散系を含み、そこにおいて活性成分は、米国特許第３、８５４、４８０号広報、第５、１３３、９７４号広報、及び５、４０７、６８６号広報に記載されるポリマーから制御された割合で浸透する。さらに、ポンプベースハードウェア送達システムは使用され、それらのいくつかは、移植に使用される。
【０１２４】
また他の実施形態において、アンタゴニスト及び抗新生物薬抗腫瘍性基剤は、ＧＥＬＦＯＡＭと共に形成され、商業製品は徐々に分解する修飾されたコラーゲン線維から成る。
【０１２５】
１つの実施形態において、医薬組成物はまた、適切な固相又はゲル相担体又は賦形剤を含む。そのような担体又は賦形剤の実施例は、これに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ジェラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーを含む。
【０１２６】
１つの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、慎重に又は薬学的に許容な塩の形態で投与される。この塩は、薬学的に許容であるが、薬学的に非許容な塩は、薬学的に許容な先述の塩の混合物の調整に利便的に使用される。そのような塩は、これに限定されないが、以下の酸から調整されたものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸系列のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩である。
【０１２７】
１つの実施形態において、適切な緩衝剤は、これに限定されないが、酢酸及びその塩（１〜２％ ｗ／ｖ）；クエン酸（１〜３％ ｗ／ｖ）；ホウ酸及びその塩（０．５〜２．５％ ｗ／ｖ）；及びリン酸及びその塩（０．８％〜２％ ｗ／ｖ）を含む。
【０１２８】
適切な保存料は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ ｗ／ｖ）；塩化ブタノール（０．３〜０．９％ ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ ｗ／ｖ）；及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）を含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明記載の医薬組成物の少なくとも２つの化合物の局所投与のための薬学的に許容な担体は、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、及びパウダーを含む。従来の薬学的担体、水、パウダー、又は油性基剤、増粘剤などが望ましい。また別の実施形態において、コーティングされたコンドーム、手袋などが有用である。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、医薬組成物はまた、栄養送達の増強のため浸透エンハンサーを含む。貫通エンハンサーは、５つの広範なカテゴリーの内の１つに属すると分類され、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤、非界面活性剤である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ，１９９０，７，１−３３）。１つ以上のこれらの広範なカテゴリーからの１つ以上の貫通エンハンサーが含まれる。
【０１３１】
種々の脂肪酸及びその活性誘導体は、浸透エンハンサーとして作用し、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、レシンレン酸塩、モノオレイン（別名 １−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリリン酸、アリキドニン酸、１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−及びジ−グリセリド、及び先述の生理学的に許容される塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩など）を含む（Ｌｅｅ ａｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。現在好まれるいくつかの脂肪酸の例は、カプリン酸ナトリウム及びラウリン酸ナトリウムであり、単体または０．５％〜５％の濃度の組み合わせで使用される。
【０１３２】
胆汁の生理学的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の簡易化含む（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ´ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ＭａｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，ｐａｇｅｓ ９３４−９３５）。種々の天然胆汁酸塩、及びそれらの合成活性誘導体は、浸透エンハンサーとして作用する。このように「胆汁酸塩」という用語は、任意の胆汁の活性誘導体と同様に天然に発生する胆汁成分も含む。現在好まれる胆汁酸塩は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）であり（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、一般的に０．５％〜２％の濃度で使用される。
【０１３３】
１若しくはそれ以上の浸透エンハンサーを含む複雑な形式が使用される。例えば、胆汁酸塩は脂肪酸との組み合わせで使用されても良く、複雑な製剤を作り出す。好まれる組み合わせは、カプリン酸ナトリウム又はラウリン酸ナトリウム（一般的に０．５％〜５％まで）と結合したＣＤＣＡを含む。
【０１３４】
一実施形態において、さらにキレート剤が使用され、これに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ジナトリウム、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトン（エナミン）のラウレス−９及びＮ−アミノアシル誘導体を含む（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。キレート剤は、Ｄ−Ｎａｓｅ阻害剤としても働くという更なる利点を有する。
【０１３５】
また別の実施形態において、さらに界面活性剤が使用される。界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）；及びＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２−２５７）などのペルフルオロ化合物の乳濁液を含む。
【０１３６】
非界面活性剤は、例えば、不飽和環状ウレアーゼ、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９２−１９１）；及びジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）などの非ステロイド性抗炎症剤含む。
【０１３７】
一実施形態において、本発明の医薬組成物はさらに、医薬組成物において従来見出されている他の添加成分をこれらの技術において確立された利用レベルにおいて含む。このように、例えば医薬組成物は、例えば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬、又は抗炎症剤などのさらなる適合性薬学的活性物質を含んでも良く、或いは例えば染料、着香料、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、及び安定剤など、本発明の組成物において物理的に処方された種々の投与形態において有用な追加物質を含んでも良い。しかしながらそのような物質は、添加された場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。
【０１３８】
例えば大腸結腸直腸癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、前立腺癌、又は軟組織癌などの癌治療における転移形成の阻害、又は癌の治療において、医薬組成物を調整するためのオリゴヌクレオチドの実施形態において、少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが有効量で適用される。他の実施形態において活性誘導体が有効量で使用される。また別の実施形態において、例えば腎臓癌、子宮内膜癌、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、食道癌、又は本発明において述べられた他の任意の癌などの癌治療における転移形成の阻害、又は癌治療の医薬組成物の調整において、オリゴヌクレオチド又はそれらの活性誘導体が有効量で使用される。
【０１３９】
アンタゴニスト、オリゴヌクレオチド、及びそれらの活性誘導体は、医薬組成物の調整において使用されるだけでなく、有効量において各癌を治療するためにも使用される。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、活性誘導体、又はアンタゴニストの「有効量」という用語は、望ましい生物学的効果を得るのに必要な量又は十分な量ということである。特に前記有効量は、癌又は癌腫の形成速度を減少するか或いは阻害する量、又は転移形成を阻害する量である。例えば、対象物が望ましくない癌を有する場合の有効量は、前記望ましくない癌を縮小させるか或いは除去する量である。さらに有効量は、新たな望ましくない癌における増大を抑制又はその減少を引き起こし、及び／又は転移形成を減少させる量である。
【０１４０】
前記有効量は、医薬組成物が単回又は反復投与で使用されるものか否か、更に１つのみ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが１つの医薬組成物中にあるか否かによって変わる。
【０１４１】
本明細書において与えられた投与量は成人向けである。ヒトが子供であるか、さらなる病気又は他の状況によりストレスを受けているヒトである場合、これらの投与量が適合されることが当業者には明白である。本発明の範囲内である動物が治療される場合において、同様に有効量はが適合されるべきである。
【０１４２】
有効量は送達の方法及び手段にも依存し、それは局所化又は全身性であっても良い。例えば一部の用途において、黒色腫又は眼癌の治療におけるこの組み合わせは好ましくは局所的又は眼科担体において送達される。
【０１４３】
一実施形態において、本明細書において記載されたオリゴヌクレオチドの対象物への投与量は、一般的に１回の投与あたり約０．１μｇ〜約１０ｍｇの範囲であり、これは時間、日、週、又は月、及びそれらの間の他の時間で与えられる用途に依存する。また別の実施形態において、前記投与量は、時間、日、又は週で間隔が空いた１〜１０回の投与であって、１回の投与あたり約１０μｇ〜約５ｍｇの範囲、又は約１００μｇ〜約１ｍｇまでの範囲である。しかしながら、一部の実施形態において、投与は前述の一般的な投与より２〜１００倍高い又は低い範囲で使用されても良い。
【０１４４】
本発明の一実施形態において、本発明記載の医薬組成物の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、細胞間接着分子（ＣＡＭｓ）、インテグリン、セレクチン、金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）、及び／又はインターロイキン１０の生産を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、約１μｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の投与範囲、約１０μｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日投与範囲、又は約１００μｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の投与範囲で投与される。
【０１４５】
実施例
別の方法を示していない場合、本試験に使用される配列はホスホロチオエートとして使用されるものである。本発明の本文中におけるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２はそれぞれＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２と同じ意味である。ＡＰ１２００９及びＡＰ１１０１４はアンチセンスオリゴヌクレオチドと同義語であり、ＡＰ１２００９はＴＧＦ−ベータ２のｍ−ＲＮＡと相補的であるアンチセンスヌクレオチドであり、及びＡＰ１１０１４はＴＧＦ−ベータ１のｍ−ＲＮＡと相補的であるアンチセンスヌクレオチドである。
【実施例１】
【０１４６】
試験系に対する細胞培養条件
試験下における細胞株
結腸癌： ＨＣＴ−１１６メラノーマ：ＭＥＲ１９１ａ，ＭＥＲ１１６，ＭＥ
Ｓ１００ａ
ＮＳＣＬＣ： ＳＷ９００，ＮＣＩ−Ｈ６６１
卵巣癌： ＥＦＯ−２１，Ｃｏｌｏ７０４
膵臓癌： ＰＡＴＵ−８９０２，Ｈｕｐ−Ｔ３，Ｈｕｐ−Ｔ４
前立腺癌： ＰＣ−３，ＤＵ−１４５
細胞株はそれぞれＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、及びＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手した。すべての細胞は前記提供者による記述どおりに培養した。
【０１４７】
更なる試験下における細胞株
肝細胞癌 ＨｅｐＧ２
メラノーマ ＲＰＭＩ−７９５１，ＳＫ−Ｍｅｌ３
ＮＳＣＬＣ Ａ−５４９
腎臓癌 Ｃａｋｉ−１
細胞株はさらにＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）から入手した。
【実施例２】
【０１４８】
細胞媒介細胞毒性試験
腫瘍細胞を生成するために、１％ＦＣＳ及び３％Ｐａｎｅｘｉｎ（Ｐａｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した培地において上清細胞を培養し、培地中のＴＧＦ−β量を減少させた。細胞はリポフェクチン、リポフェクチンと各試験物質によって２日連続で処理するか、或いは未処理のまま放置した。培養上清は最後のリポフェクチン処理の後３日で取り除いた。腫瘍細胞により生成されたＴＧＦ−ベータは１Ｎ ＨＣｌ（１：２０希釈）を用いて室温１０分間で活性化した。中和のためにＮａＯＨを加えた。キラー細胞を活性化するリンフォカインを生成するために、健康な供血者から単離したヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をＩＬ−２の存在下（１０ｎｇ／ｍｌ）腫瘍細胞上清と共にインキュベートした。活性化ＴＧＦ−ベータ１を阻害するためにＴＧＦ−ベータ１特異抗体（１μｇ／ｍｌ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えた。３日後、４ｈ ＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験において、標的として各癌細胞株に対するＬＡＫ細胞の細胞毒性活性を測定した。
【０１４９】
ＴＧＦ−ベータ２に対して同様の手順を適用した。ＴＧＦ−ベータ１特異抗体の代わりにＴＧＦ−２特異抗体を加えた。ＬＡＫ細胞の測定下におけるＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２を測定するための試験において、ＰＢＭＣの細胞活性は４ｈＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験において測定した。
【実施例３】
【０１５０】
リポフェクチン（登録商標）を用いた増殖試験
１ミリリットルあたり約７５．０００細胞の各腫瘍細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により推奨されているように、１２ウェル平底マイクロタイタープレートにおける１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中において培養した。２４時間後及び４８時間後、前記細胞を各ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの指示濃度で６時間処理した。細胞再取り込みを促進するために、更に指示濃度のリポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）をこの２×６時間加えた。一部の実験はリポフェクチン（登録商標）を添加せずに行った。この６時間と最終３日間と２つの期間の間、細胞をリポフェクチン（登録商標）の不在下において上述のＴＧＦ−ベータ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド５μＭで処理した。コントロール細胞は同じ期間純粋培地で培養した。さらに対照細胞は指示濃度のリポフェクチン（登録商標）で処理した。
【０１５１】
ＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地の代わりに、前記細胞株の提供者の推奨に従って、別の培地を使用しても良い。
【０１５２】
最終的に、トリパンブルーを用いて細胞を染色し、「ノバウエル」血球計算板においてそれらの数を数えることにより、全ての検体中の細胞数を測定した。
【０１５３】
生細胞を定量する別の方法は、製造者の手順に従ってＥＺ４Ｕアッセイを用いて行うか、或いは製造者の使用説明書に従ってＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｚ２（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を用いて電子細胞の数を数えることによって行った。
【０１５４】
また、製造者の使用説明書に従って、ＴＧＦ−ベータ１ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ１ ＥＬＩＳＡ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によって上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度を測定した。細胞のない血清補足培地からの値を血清誘導ＴＧＦ−ベータ１から差し引き、バックグラウンドを計算した。
【０１５５】
この増殖試験はＴＧＦ−ベータ２値の測定に対しても実施した。この場合、ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりにＴＧＦ−ベータ２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、ＴＧＦ−ベータ１濃度を測定する代わりにＴＧＦ−ベータ２Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ２ＥＬＩＳＡ）によって上清中のＴＧＦ−ベータ２濃度を測定した。
【実施例４】
【０１５６】
リポフェクチン（登録商標）を添加しない増殖試験
細胞直径及び細胞増殖速度に依存しているが１ミリリットルあたり約２５．０００〜２００．０００細胞を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）により推奨されているように、１２ウェル平底マイクロタイタープレートにおける１０％仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中において培養した。さらに、ＴＧＦ−ベータ１特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを３日間添加したが、コントロール細胞は３日間未処理で維持した。
【０１５７】
３日後、トリパンブルー法により染色し、「ノバウエル」血球計算板において数を数えることによって全ての検体中の細胞数を測定した。
【０１５８】
更に、３日目に製造者の使用説明書に従ってＴＧＦ−ベータ１ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＴＧＦ−ベータ１ ＥＬＩＳＡ，Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて上清中ＴＧＦ−ベータ１濃度を測定した。細胞のない血清補足培地からの値を血清誘導ＴＧＦ−ベータ１から差し引き、バックグラウンドを計算した。
【０１５９】
別の増殖試験において、ＴＧＦ−ベータ２特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。これらの試験において、３日目の上清中のＴＧＦ−ベータ２値を測定した。メラノーマ細胞株に対して使用される６日間持続試験において、ＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２の値は３日目及び６日目に測定した。ＴＧＦ−ベータ１及びＴＧＦ−ベータ２値は、ＴＧＦ−ベータ１又は、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから提供されるＴＧＦ−ベータ２ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙを用いて測定した。
【０１６０】
６日間持続試験において、３日後前記培地を交換し、指示濃度における各アンチセンスヌクレオチドを用いて更に３日間細胞を処理した。その後前記細胞数を３日後及び６日後に測定した。生細胞の定量は、ＥＺ４Ｕ−アッセイを用いて製造者の手順に従って実施するか、或いはＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｚ２（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）を用いて製造者の使用説明書に従って電子細胞数をの数を数えることによって実施した。
【０１６１】
ＭＥＭ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地の代わりに、別の細胞株の提供者の推奨に従って、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）を補足した別の培地を使用した。
【実施例５】
【０１６２】
スクラッチ試験
腫瘍細胞（約９００，０００／ウェル）を６ウェルプレートに播種した。次の日この細胞を検体物質及びリポフェクチンを用いて一度処理し、それぞれＯｐｔｉｍｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中６時間リポフェクチンで処理するか、或いは未処理で放置した。その後、滅菌プラスチックピペットチップを用いた標準的な方法において前記細胞の密集単層に傷をつけ（着手）、各ウェルに約１，０００の幅の細胞のない帯域を作製した。その後、前記細胞を一度洗浄し、正常培地中３７℃でインキュベートした。写真撮影することによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遊走を記録し、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．６を使用したコンピューター援用画像解析によって前記遊走距離を定量した。核実験は４回ずつ行った。
【０１６３】
遊走は転移形成において重要な役割を果たすため、この"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"試験は"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移の形成と関連する。"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"における遊走の阻害は、"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移形成の阻害を示すものである。
【実施例６】
【０１６４】
球状遊走モデル
遊走の球状モデルは別のもので記載されている通りに確立した（Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。腫瘍細胞は、２％寒天で被膜した組織培養フラスコにおいて培養した。３日後、多細胞球状体を９６ウェルプレートに移し、未処理のまま放置、試験物質を用いて処理、或いは１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−β２（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて処理した。各細胞株の遊走反応を位相差顕微鏡（×１０）を用いて分析した。
【０１６５】
遊走は転移形成において重要な役割を果たすため、この"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"試験は"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移の形成と関連する。"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"における遊走の阻害は、"ｉｎ ｖｉｖｏ"における転移形成の阻害を示すものである。
【実施例７】
【０１６６】
ＴＧＦ−β１／β２−ＥＬＩＳＡ
腫瘍細胞から分泌されたＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の量はそれぞれＥＬＩＳＡによって測定した。簡便に腫瘍細胞（細胞の大きさと細胞成長によるが、１５，０００〜２００，０００）を１２ウェルの組織培養プレート中に播種し、陽イオン性脂質（リポフェクチン試薬、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の存在下、無血清Ｏｐｔｉｍｅｍ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、試験下のオリゴヌクレオチドを用いて６時間２日連続で処理、又は未処理のまま放置した。その後この細胞を５μｍｏｌ／ＡＰ１１０１４の存在下で培養、又は未処理のまま放置した。７２時間後、リポフェクチン及び試験下のオリゴヌクレオチドを用いて２回目の処理を行い、この細胞培養上清を収集した。標準ＴＧＦ−β１−ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ及びＴＧＦ−β２−ＥＬＩＳＡ−Ｋｉｔ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて上清中のＴＧＦ−β１／β２の量を測定した。
【０１６７】
この試験におけるＴＧＦ−ベータ１又はＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度はそれぞれ３μｇ／ｍｌリポフェクチン濃度と共に２００ｎＭｏｌ／ｌ、６μｇ／ｍｌと共に４００ｎＭｏｌ／ｌであった。
【実施例８】
【０１６８】
ＴＧＦ−β１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６におけるＴＧＦ−β１の分泌が１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約１３．８％減少した。別の増殖実施例においては、約４６％減少した。
【０１６９】
細胞増殖：
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４によって、結腸癌細胞株（ＨＣＴ−１１６）の増殖が１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約３５％減少した。配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭｏｌ用いた。
【０１７０】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下２００ｎＭの濃度において、結腸癌細胞株の遊走を顕著に抑制した。
【実施例９】
【０１７１】
肝細胞癌
ＴＧＦ−β抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２におけるＴＧＦ−β１の分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約７５％抑制された。
【０１７２】
細胞増殖：
実施例３に従った増殖試験において、６μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭ濃度において、肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２の増殖を１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約３９％減少させた。
【実施例１０】
【０１７３】
メラノーマ
ＴＧＦ−ベータ１
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、１μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、メラノーマ癌細胞株ＭＥＲ−１１６におけるＴＧＦ−β１の分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約０％減少した。
【０１７４】
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、メラノーマ癌細胞株ＭＥＳ−１００ａにおけるＴＧＦ−ベータの分泌が配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート１０μＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約２３％減少した。
【０１７５】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、６μｇ／ｍｌのリポフェクチンの存在下、メラノーマ細胞株ＲＰＭＩ−７９５１におけるＴＧＦ−β２の分泌が配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート４００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約１４．２％減少した。
【０１７６】
増殖抑制
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、５０ｎＭ濃度においては約３３％、２００ｎＭ濃度においては約２３％、メラノーマ細胞株（ＭＥＲ−１１６）の増殖を減少させた。Ａ−５４９細胞株を用いた別の試験において、前記増殖は１００％に合わせた未処理コントロールと比較して約０．４％減少した。
【０１７７】
増殖抑制
実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０は、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、４００ｎＭ濃度において約１７．８％までメラノーマ細胞株（ＲＰＭＩ−７９５１）の増殖を減少させた。
【実施例１１】
【０１７８】
ＮＳＣＬＣ
ＴＧＦ−β１抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処コントロールと比較して、非小細胞肺癌株ＳＷ−９００におけるＴＧＦ−β１の分泌が約３４％減少し、ＮＣＩ−Ｈ６６１において約３８％減少した。
【０１７９】
同条件下、癌細胞株Ａ−５４９ＴＧＦにおけるＴＧＦ−β１の分泌は、約０．４％減少した。
【０１８０】
細胞増殖
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、ＮＳＣＬＣ細胞株（ＳＷ−９００）の増殖を約３０％減少させた。配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度を適用した。実施例３に従った増殖試験の別の実施例において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度においてＮＳＣＬＣ細胞株Ａ−５４９の増殖を約３６％減少させ、ＮＣＩ−Ｈ６６１を約４４％減少させた。
【０１８１】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４はリポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下２００ｎＭ及び４００ｎＭの濃度においてＮＳＣＬＣ癌細胞株ＳＷ−９００の遊走を顕著に阻害した。配列ＩＤ番号１４の前記両方の濃度で処理した前記細胞の１７時間後の遊走は約５０μｍであったのに対し、リポフェクチンと共にインキュベートした前記細胞は約７５μｍの遊走であり、コントロール細胞は約８０μｍであった。２４時間後の結果は、コントロール１２０μｍ、リポフェクチン処理細胞１１５μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞は約６０μｍであった。４８時間の遊走は、コントロール及びリポフェクチン処理細胞が２５０μｍ、配列ＩＤ番号１４で処理した細胞が前記両方の濃度において１５０μｍであった。
【０１８２】
同条件下におけるスクラッチ試験において、リポフェクチンと共にインキュベートした配列ＩＤ番号１４の細胞は約７５μｍの遊走であり、コントロール細胞は約８０μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールが１２０μｍ、リポフェクチン処理細胞が１１５μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞が約６０μｍであった。４８時間後の遊走は、コントロール及びリポフェクチン処理細胞において約２５０μｍ、配列ＩＤ番号１４で処理した細胞の前記両方の濃度において約１５０μｍであった。
【実施例１２】
【０１８３】
卵巣癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からの１０ｎＭのホスホチオエートによって、１００％にあわせた未処理コントロール細胞と比較して、卵巣癌Ｃｏｌｏ ７０４におけるＴＧＦ−β１の分泌が約５４％減少した。
【０１８４】
ＴＧＦ−β２抑制
実施例７に記載したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からの２００ｎＭのホスホロチオエートによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、卵巣癌ＥＦＯ−２１におけるＴＧＦ−β２の分泌が約３１％減少した。
【０１８５】
細胞増殖
ＴＧＦ−ベータ１：実施例３に従った増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は５０ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株Ｃｏｌｏ７０４の増殖を約５４％減少させた。
【０１８６】
実施例３に従った別の増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株Ｃｏｌｏ７０４の増殖を約４０％減少させた。
【０１８７】
実施例３に従った別の増殖試験において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、１００％にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株ＥＦＯ−２１の増殖を約６３％減少させた。
【実施例１３】
【０１８８】
膵臓癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホチオエート１０μＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して膵臓癌Ｈｕｐ Ｔ３におけるＴＧＦ−β１の分泌が約７４％減少した。
【０１８９】
実施例７の別の試験において、ＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号１４からのホスホチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して膵臓ＤａｎＧにおけるＴＧＦ−β１の分泌が約３％減少した。
【０１９０】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において記載したように、ＴＧＦ−ベータ２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３におけるＴＧＦ−β２の分泌が約２％減少し、さらにＰＡＴＵ−８９０２においては約１０％減少した。
【０１９１】
実施例７に記載したようにＴＧＦ−ベータ２特異的ＥＬＩＳＡを用いて、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、配列ＩＤ番号３０からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ４におけるＴＧＦ−β２の分泌が約２４％減少し、ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞においては約６％減少した。
【０１９２】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ２
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約１％減少させ、細胞株ＰＡＴＵ−８９０２における増殖を約１０％減少させた。
【０１９３】
実施例３に従った別の増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約２４％減少させ、Ｈｕｐ−Ｔ４においては約２４％、ＰＡＴＵ−８９０２においては約２７％増殖を減少させた。
【０１９４】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ１
実施例４に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は１０μＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Ｈｕｐ−Ｔ３の増殖を約１３％減少させ、細胞株ＰＡＴＵ−８９０２においては約１０％減少させた。
【０１９５】
実施例４に従った別の増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株ＤａｎＧの増殖を約２７％減少させた。
【０１９６】
細胞遊走
膵臓細胞株ＰＡＴＵ−８９０２の遊走は、実施例６の手順に従って測定し、５μＭｏｌ／ｌ濃度の配列ＩＤ番号３０は未処理対照と比較して約６５時間ほぼ完全に阻害したが、コントロール細胞の球状体の直径は同じ期間において約１０００μｍ増大した。
【０１９７】
ヒトＴＧＦ−ベータ２抗体を試験した同様の実験においてはほとんど効果が示されなかった。これは、遊走阻害を示すことはアンチセンスオリゴヌクレオチドに非常に特異的であり、さらに拮抗するＴＧＦ−ベータと関連するだけではないことを示している。
【実施例１４】
【０１９８】
前立腺癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３におけるＴＧＦ−β１の分泌を約３６％減少させ、ＤＵ−１４５においては約５７％減少させた。
【０１９９】
ＴＧＦ−ベータ２抑制
実施例７において示したようにＴＧＦ−β２特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭによって、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺細胞癌株ＰＣ−３におけるＴＧＦ−β２の分泌が約１９％減少し、ＤＵ−１４５においては約２０％減少した。
【０２００】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ１：
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖を約７４％減少させた。
【０２０１】
実施例３に従った別の実施例において、配列ＩＤ番号１４は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５の増殖を約８１％減少させた。
【０２０２】
細胞増殖ＴＧＦ−ベータ２：
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号３０は２００ｎＭ濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株ＰＣ−３の増殖を約２９％減少させ、さらにＤＵ−１４５においては約３４％減少させた。
【０２０３】
スクラッチ試験
実施例５に従ったスクラッチ試験において、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭの濃度において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下前立腺癌細胞株ＰＣ−３の遊走を阻害した。配列ＩＤ番号１４を用いて処理した細胞の１７時間後の遊走が約３７μｍであったのに対して、リポフェクチンと共にインキュベートした細胞は約１４０μｍであり、コントロール細胞は約１６５μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールにおいて２８８μｍ、リポフェクチン処理細胞において２１３μｍ、及び配列ＩＤ番号１４処理細胞において約６０μｍであった。４８時間後の移動は、コントロールにおいて約３６６μｍ、リポフェクチン処理細胞において３２８μｍ、配列ＩＤ番号１４処理細胞において約１５０μｍであった。
【０２０４】
実施例５に従ったスクラッチ試験の別の実験において、配列ＩＤ番号１４は４００ｎＭ濃度において、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、前立腺癌細胞株ＰＣ−３における遊走を有意に阻害した。配列ＩＤ番号ｘｘを用いて処理した前記細胞の１７時間後の遊走は約１１８μｍであったが、リポフェクチンと共にインキュベートした前記細胞は約２０７μｍ遊走し、コントロール細胞は約２１５μｍであった。２４時間後の結果は、コントロールにおいて２８８μｍ、リポフェクチン処理細胞において３１３μｍ、配列ＩＤ番号１４処理細胞において約１６６μｍであった。４８時間後の遊走は、コントロール細胞において約４２０μｍ、リポフェクチン処理細胞において４２１μｍ、配列ＩＤ番号１４を用いて処理した細胞において約１９７μｍであった。
【実施例１５】
【０２０５】
腎臓癌
ＴＧＦ−ベータ１抑制
実施例７において記載したようにＴＧＦ−β１特異的ＥＬＩＳＡを用いて分析し、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、配列ＩＤ番号１４からのホスホロチオエート２００ｎＭは、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１におけるＴＧＦ−β１の分泌を約４％減少させた。
【０２０６】
細胞増殖
実施例３に従った増殖試験において、配列ＩＤ番号１４は２００ｎＭの濃度において、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、１００％に合わせた未処理コントロールと比較して、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ−１における増殖を約５％減少させた。
【実施例１６】
【０２０７】
ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３ ＩＬ−１０遺伝子のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス
ヒト変換成長因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス：
【化１−１】
【０２０８】
【化１−２】
【０２０９】
ヒト転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンス：
【化２】
【０２１０】
更にヒト転換成長因子ベータ２のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンスと比較した挿入を含むヒト転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−ベータ２）のｍ−ＲＮＡに相補的なアンチセンスのスプライス変化を上記に示す。前記挿入は上部から数えて８１２と９００との間にある。このアンチセンス分子の部分とハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内でもある。
【０２１１】
【化３−１】
【０２１２】
【化３−２】
【０２１３】
【化３−３】
【０２１４】
ヒト変換成長因子ベータ３（ＴＧＦ−ベータ３）のｍ−ＲＮＡと相補的なアンチセンス
【化４−１】
【０２１５】
【化４−２】
【０２１６】
ヒトインターロイキン１０のｍ−ＲＮＡのアンチセンス
【化５−１】
【０２１７】
【化５−２】
【実施例１７】
【０２１８】
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成方法は、亜リン酸トリエステル化学を用いたヌクレオシドの保護を含む５段階によって実施される。最初のヌクレオチドは、５’−ジメトキシトリチル−デオキシアデノシン（Ｎ４ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミド（０１Ｍ）として導入し、Ｃは５’ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（Ｎ４ベンゾイル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドによって導入し、Ｇは５’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン（Ｎ８イソブチリル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドとして導入し、さらにＴは５’−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−Ｎ，Ｎ’−ジ−イソプロピル−２−シアノエチルホスホアミドとして導入した。前記ヌクレオシドは好ましくはアセトニトリル中０．１Ｍ濃度において適用した。
【０２１９】
合成は、制御された約１５０Ｆｍ直径の細孔ガラス粒子（細孔直径はおよそ５００Å）において実施し、最大３つのヌクレオシドは長鎖アルキルアミン結合を通じて共有結合的に結合していた（平均ローディングはおよそ３０Ｆｍｏｌ／ｇ固体支持体）。
【０２２０】
固体支持体は、試薬は適切に流れるが前記固体支持体を押しとどめるフィルターによって両端がかぶせられた円筒型の合成カラム中にロードした。試薬は、不活性ガスの陽圧を用いることによって、輸送され、合成カラムから引き抜いた。前記ヌクレオチドは、３’−>５’の方向で成長オリゴヌクレオチド鎖に添加した。各ヌクレオチドは以下の合成循環の１回目で結合した。
【０２２１】
ジクロロメタン中の３−クロロ酢酸を用いて前記ヌクレオチドの５’ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）保護基を脱離した後、無水アセトニトリルを用いてカラムを洗浄した。その後、配列による保護された誘導体の１つの塩基形態とアセトニトリル中のテトラゾールとを同時に加えた。この反応の後、前記反応混合物を引き抜き、二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン中の硫黄（Ｓ８）の混合物を用いて亜リン酸を参加した。前記酸化反応の後、この混合物を引き抜き、アセトニトリルでカラムを洗浄した。前記未反応５’−ヒドロキシ基は、１−メチルイミダゾール及び無水酢酸／ルチジン／テトラヒドロフランを同時に添加することによって保護した。その後、前記合成カラムをアセトニトリルで洗浄し、次の循環を開始した。
【０２２２】
ワークアップ（ｗｏｒｋ ｕｐ）方法及び合成生成物の精製は以下に示す。
最終ヌクレオチドを添加した後、アンモニア溶液中インキュベートすることによって、デオキシヌクレオチドを固体支持体から分割した。環外（ｅｘｏｘｙｃｌｉｃ）の保護基をさらにアンモニア中でインキュベートすることによって除去した。その後、前記アンモニアを真空下でエバポレートした。シリカＣ１８固定相逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、より短い失敗混合物から５’ＤＭＴ保護基を有する全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）合成生成物を分離した。生成物ピークからの溶出物を収集し、真空下で乾燥し、酢酸中におけるインキュベートにより５’−ＤＭＴ保護基を開裂し、その後酢酸を真空下でエバポレートした。前記合成生成物を純水中に可溶化させ、ジエチルエーテルを用いて３回抽出した。その後前記生成物を真空中で乾燥した。別に、ＨＰＬＣ−ＡＸクロマトグラフィーを行い、生成物ピークの溶出物を過剰のＴｒｉｓ−バッファーに対して透析し、その後純水で透析した。最終生成物を凍結乾燥して乾燥保存した。
【実施例１８】
【０２２３】
実施例２に従って、ＴＧＦベータ２ＩＤ配列３０及びＴＧＦ−ベータ１配列ＩＤ１４それぞれのホスホチオエート化オリゴヌクレオチド細胞媒介性細胞毒性試験を実施した。
【０２２４】
ＴＧＦ−ベータ２−膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２
驚くべきことに、高値ＴＧＦ−ベータ２によって阻害される膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２における細胞媒介性毒性は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によってほとんど完全に回復した。前記試験は、腫瘍細胞に対する抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（１０：１、５：１、２．５：１）によって確立した。前記細胞媒介細胞毒性の各回復は、８０％、８８％、及び１００％であった。結果は三回のものを採用した。同等の結果が、非小細胞肺癌細胞株Ｋ５６２、結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６において見出された。
ＴＧＦ−ベータ２−膵臓癌細胞株ＰＡ−ＴＵ−８９０２
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＡ−ＴＵ−８９０２の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１４０〜４００％増大した。結果は４回のもの採取した。
【０２２５】
ＴＧＦ−ベータ１−結腸癌細胞株Ｋ−５６２
高値ＴＧＦ−ベータ１によって阻害された細胞媒介細胞毒性は、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によって結腸癌細胞株Ｋ５６２において完全に回復した。前記試験は腫瘍細胞に対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）によって確立した。これらすべての比において細胞媒介性細胞毒性の回復は１００％であった。結果は３回の試験のものを採用した。
【０２２６】
ＴＧＦ−ベータ１−結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＨＣＴ−１１６の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１７０〜２８５％増大した。結果は４回のもの採取した。
【０２２７】
ＴＧＦ−ベータ１：非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）癌細胞株ＨＣＩ−Ｈ６６１細胞媒介性細胞毒性は、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０によって非小細胞肺癌細胞株ＨＣＩ−Ｈ６６１において完全に回復した。前記試験は、腫瘍細胞に対する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の異なる比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１）によって確立した。これらすべての比において細胞媒介性細胞毒性の回復は１００％であった。結果は３回の試験のものを採用した。
【０２２８】
ＴＧＦ−ベータ１：非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）癌細胞株Ａ−５４９
驚くべきことに、リポフェクチン３μｇ／ｍｌの存在下、２００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＳ−ＴＵ−８９０２の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約２５０〜４１５％増大した。結果は４回のもの採取した。
ＴＧＦ−ベータ１：膵臓癌細胞株ＰＣ−３
驚くべきことに、リポフェクチン６μｇ／ｍｌの存在下、４００ｎＭの配列ＩＤ番号３０を用いて処理したＰＣ−３細胞の細胞培養上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター：標的細胞比（２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１）において未処理標的細胞と比較して、約１３０〜２７０％増大した。結果は４回のもの採取した。
【実施例１９】
【０２２９】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
ＴＧＦ−ベータ１ アンチセンスオリゴヌクレオチド
【化６−１】
【０２３０】
【化６−２】
【０２３１】
【化６−３】
【０２３２】
【化６−４】
【０２３３】
【化６−５】
【０２３４】
【化６−６】
【０２３５】
【化６−７】
【０２３６】
【化６−８】
【実施例２０】
【０２３７】
この実施例のＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ２の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２３８】
ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化７−１】
【０２３９】
【化７−２】
【０２４０】
【化７−３】
【０２４１】
【化７−４】
【０２４２】
【化８−１】
【０２４３】
【化８−２】
【０２４４】
【化９】
【０２４５】
【化１０−１】
【０２４６】
【化１０−２】
【実施例２１】
【０２４７】
この実施例のＴＧＦ−ベータ３アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ３の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２４８】
ＴＧＦ−ベータ３アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１１−１】
【０２４９】
【化１１−２】
【０２５０】
【化１１−３】
【０２５１】
【化１１−４】
【０２５２】
【化１１−５】
【０２５３】
【化１１−６】
【実施例２２】
【０２５４】
この実施例のＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＩＬ−１０の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２５５】
ＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド
【化１２−１】
【０２５６】
【化１２−２】
【０２５７】
【化１２−３】
【０２５８】
【化１２−４】
【実施例２３】
【０２５９】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１、２、及び３アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１、２、及び３の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２６０】
ＴＧＦ−ベータ１、２、及び３アンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１３−１】
【０２６１】
【化１３−２】
【実施例２４】
【０２６２】
この実施例のＴＧＦ−ベータ１及び２アンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の一部である。これらは、"ｉｎ ｖｉｔｒｏ"及び"ｉｎ ｖｉｖｏ"におけるＴＧＦ−ベータ１及び２の形成を阻害するオリゴヌクレオチドに対する更なる実施形態であり、これにより、薬学的組成物として薬学的許容可能な担体において、本発明に記載された癌の治療及び／又は転移形成の阻害に対して使用され得るものである。
【０２６３】
ＴＧＦ−ベータ１のｍ−ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１４−１】
【０２６４】
【化１４−２】
【０２６５】
ＴＧＦ−ベータ２のｍ−ＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化１５】
【図面の簡単な説明】
【０２６６】
【図１】図１は前立腺癌ＰＣ−３の阻害を示した図である。上位２つの配列は、リポフェクチンのみでインキュベートした対照グループの遊走を示している。前記２つの配列より下のものは、リポフェクチンと配列ＩＤ番号１４に示したアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした細胞における明らか遊走の減少を示す。左側の２つの配列は、最初の状態を示す。右側の２つの配列は２４時間後の遊走を示し、明らかに阻害していた。これは転移形成の低減を示す。
【図２】図２は、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが実施例８によるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌の抑制を示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度を１００％に合わせた（無地の棒）。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度は、未処理コントロールに対する％において示されている。指示（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）は３つの独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３】図３は、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯは、実施例８におけるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞の増殖を示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）のデータを１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は未処理コントロールに対する％において示されている。指示は３つの独立した試験の平均及びＳＤである。
【図４】図４は、実施例８において、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＨＣＴ−１１６ＣＲＣ球状体の遊走の抑制を示した図である。０、２４、４８時間における未処理球状体の面積は（白抜き丸（ｏｐｅｎ ｃｙｃｌｅ））μｍ２で示されている。リポフェクチン処理球状体の面積は白抜き三角（ｏｐｅｎ ｔｒｉａｎｇｌｅ）として示されている。配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯの面積は、黒塗り四角（ｃｌｏｓｅｄ ｓｑｕａｒｅ）として示されている。指示は少なくとも４回の平均±ＳＤである。
【図５】図５は、実施例１８における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞上清において培養されたＰＢＭＣの細胞毒性の増進を示した図である。未処理ＨＣＴ−１１６の上清において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、指示エフェクター：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）におけるＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理ＨＣＴ−１１６細胞の上清中において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はチェック模様の棒で示されており、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理ＨＣＴ−１１６細胞の情勢中において培養されたＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性毒性を斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図６】図６は、実施例９における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨｅｐ−Ｇ２ ＨＣＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌の抑制を示した図である。未処理細胞上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は（無地の棒）ｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の細胞上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプとして示した。指示は３回の平均及びＳＤを示している。
【図７】図７は、実施例９における配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯによるＨｅｐ−Ｇ２ ＨＣＣ細胞の増殖の抑制を示した図である。電子細胞（ｅｌｃｔｒｏｎｉｃ ｃｅｌｌ）を数えることにより決定した未処理細胞数は、無地の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯの細胞数／リポフェクチン処理細胞は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図８】図８は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＭＥＳ１００ａメラノーマ細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制したことを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度は、ｐｇ／ｍｌで示した。配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプで示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図９】図９は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＭＥＲ−１１６メラノーマ細胞の増殖を抑制したことを示した図である。電子細胞を数えることによって決定した未処理細胞数は、無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数は、チェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ細胞数／リポフェクチン処理細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１０】図１０は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが、Ａ−５４９、ＳＷ−９００、及びＮＣＩ−Ｈ６６１ ＮＳＣＬＣ細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制したことを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１の濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度（斜めストライプ）は未処理対照に対する％で示した。指示は各細胞株の独立した３回の試験の平均及びＳＤである。
【図１１】図１１は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが、Ａ−５４９、ＳＷ−９００、及びＮＣＩ−Ｈ６６１ ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を抑制したことを示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ）のデータ（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞のデータ（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞のデータ（斜めストライプ）は未処理対照に対する％で示した。指示は各細胞株における独立した少なくとも２つの試験の平均及びＳＤである。
【図１２】図１２は、実施例１１に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＳＷ−９００ ＮＳＣＬＣの遊走を阻害したことを示した図である。スクラッチ試験の０、１７、２４、４８、及び６５時間において測定された未処理細胞の遊走（白抜き丸）はμｍで示した。リポフェクチン処理細胞の遊走は白抜き三角でしめし、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の遊走は黒塗り三角（２００ｎＭ）又は黒塗りダイアモンド（４００ｎＭ）として示した。指示は３回の独立した試験の平均±ＳＤである。
【図１３】図１３は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＡ−５４９ ＮＳＣＬＣ細胞上清中において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を増進したことを示した図である。未処理Ａ−５４９細胞の細胞上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞における細胞媒介性細胞毒性（無地の棒）は、エフェクター：標的細胞の比（Ｅ：Ｔ）において示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理Ａ−５４９細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞における細胞媒介性細胞毒性をチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理Ａ−５４９細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＮＣＩ−Ｈ６６１標的細胞の細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図１４】図１４は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯが卵巣癌細胞Ｃｏｌｏ７０４のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は４回の平均及びＳＤである。
【図１５】図１５は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣｏｌｏ ７０４卵巣癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は、チェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は１回の計算データである。
【図１６】図１６は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＤａｎｇ膵臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度をチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４／リポフェクチン処理細胞上清におけるＴＧＦ−ベータ１濃度を斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１７】図１７は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＤａｎｇ膵臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図１８】図１８は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞のＴＧＦ−ベータ１分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は未処理細胞の％として示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した栄研の平均及びＳＤである。
【図１９】図１９は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。未処理細胞からのテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）のデータは（無地の棒）１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）および配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）のデータは未処理対照の％として示した。指示は、各細胞株における少なくとも３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２０】図２０は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＰＣ−３前立腺癌細胞の遊走を抑制したことを示した図である。０、６、１７、及び２４時間におけるスクラッチ試験によって測定される未処理細胞の遊走（白抜き丸）は、μｍで示した。リポフェクチン処理細胞の遊走は白抜き三角として示し、さらに配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の遊走は黒塗り四角として示した。指示は３回の独立した試験の平均である。
【図２１】図２１は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号１４のＰＴＯがＰＣ−３前立腺癌細胞上清において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を抑制したことを示した図である。未処理ＰＣ−３細胞の上清において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチン処理ＰＣ−３細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介細胞毒性チェック模様の棒で示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理ＰＣ−３細胞の上清において培養したＰＢＭＣのＫ５６２標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図２２】図２２は、実施例１５に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣａｋｉ−１腎臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ１の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中のＴＧＦ−ベータ１濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２３】図２３は、実施例１５に従って、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯがＣａｋｉ−１腎臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２４】図２４は、実施例８に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨＣＴ−１１６ＣＲＣ細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、更に配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【図２５】図２５は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＲＰＭＩ−７９５１メラノーマのＴＧＦ−ベータ２の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２の濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は４回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２６】図２６は、実施例１０に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＲＰＭＩ−７９５１メラノーマ細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の細胞数（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は４回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２７】図２７は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＥＦＯ−２１卵巣癌細胞のＴＧＦ−ベータ２分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２８】図２８は、実施例１２に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＥＦＯ−２１ライン相癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数（無地の棒）は１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の細胞数（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図２９】図２９は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨｕｐ−Ｔ３、Ｈｕｐ−Ｔ４、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞のＴＧＦ−ベータ２分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）を１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（チェック模様の棒）、及び配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）は、未処理対照の％で示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３０】図３０は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＨｕｐ−Ｔ３、Ｈｕｐ−Ｔ４、及びＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。未処理細胞から得たテトラゾリウムに基づく増殖試験（ＥＺ４Ｕ試験）又は電子細胞計測データを１００％に合わせた。リポフェクチン処理細胞（チェック模様の棒）及び配列ＩＤ番号３０／リポフェクチン処理細胞（斜めストライプ模様の棒）のデータは、未処理対照の％で示した。指示は各細胞株に対する３回の独立した試験の平均及びＳＤである。
【図３１】図３１は、実施例１３に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌球状体の遊走を阻害することを示した図である。０、１７、２４、４１、及び６５時間における未処理球状体の直径（白抜き丸）はμｍで示した。配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯで処理した球状体の直径は黒塗り四角として示した。ｒｈＴＧＦ−ベータ２処理球状体の直径は白抜き四角として示した。高ＴＧＦ−ベータ２抗体処理球状体の直径は白抜き三角として示した。指示は少なくとも４回の平均、最大及び最小である。
【図３２】図３２は、実施例１８に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＡ−ＴＵ−８９０２膵臓癌細胞上清中において培養したＰＢＭＣの細胞媒介性細胞毒性を促進することを示した図である。未処理ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は（無地の棒）はエフェクター：標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で示したＣＡＲＥ−ＬＡＳＳ試験によって測定した。リポフェクチンで処理したＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞の上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性はチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号３０／リポフェクチン処理ＰＡ−ＴＵ−８９０２細胞を有するＰＴＯの上清中において培養したＰＢＭＣのＨｕｐ−Ｔ３標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は４回の平均、最大及び最小である。
【図３３】図３３は、実施例１４に従って、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞のＴＧＦ−ベータ２の分泌を抑制することを示した図である。未処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度（無地の棒）はｐｇ／ｍｌで示した。リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ１濃度はチェック模様の棒で示し、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の上清中におけるＴＧＦ−ベータ２濃度は斜めストライプ模様の棒で示した。指示は３回の平均及びＳＤである。 図３４は、配列ＩＤ番号３０を有するＰＴＯがＰＣ−３及びＤＵ−１４５前立腺癌細胞の増殖を抑制することを示した図である。電子細胞の数を数えることにより決定した未処理細胞の細胞数は無地の棒として示した。リポフェクチン処理細胞の細胞数はチェック模様の棒として示し、配列ＩＤ番号１４を有するＰＴＯ／リポフェクチン処理細胞の細胞数は斜めストライプ模様の棒として示した。指示は３回の平均及びＳＤである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌治療における転移形成を阻害するための薬学的組成物を調整するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用。
【請求項２】
請求項１の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、前記転移形成の阻害に関与するタンパク質の合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項３】
請求項１又は２の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭ）、インテグリン、セレクチン、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、及び／又はインターロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号６８、６９〜１０７に示した配列において特定されるか、或いは実施例１９〜２４において特定されるものである。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかによるオリゴヌクレオチドの使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、４０、４２に示した配列において特定されるものである。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの使用において、前記癌は、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、嚢胞癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／胚癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、非小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫、前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管細胞腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、メラノーマ、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍、及び／又は多発性骨髄腫の群から選択されるものである。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの使用において、前記癌は、前立腺癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び軟組織癌の群、或いはメラノーマ、腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、及び／又は膀胱癌の群から選択されるものである。
【請求項８】
前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌の治療、又はメラノーマ、腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、又は膀胱癌の群から選択される癌の治療のための薬学的組成物の調整のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用。
【請求項９】
請求項８の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−３、及び／又はインターロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるか、或いは形質転換成長因子ＴＧＦ−ベータ２の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項１０】
請求項９の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１〜２１又は４９〜６８、２２〜４８、又は６９〜１０７において示した配列において特定されるものであるか、或いは実施例１９〜２４において特定されるものである。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号４９〜６８に示した配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド、或いは実施例２２において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体。
【請求項１２】
請求項１１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の製造方法であって、前記製造方法は、
連続的なヌクレオチド及びリンカーを段階的に付加する工程、又は
より長いオリゴヌクレオチド鎖からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を有するものである。
【請求項１３】
請求項１２の製造方法であって、３’から５’の方向にヌクレオチド鎖を伸長する亜リン酸トリエステル化学を使用する工程を有し、前記ヌクレオチドは、各々、固相に共有結合的に結合した第一のヌクレオチドと結合しており、前記製造方法は、
前記ヌクレオチドの５’ＤＭＴ保護基を開裂する工程と、
前記各ヌクレオチドを付加して鎖を伸長する前記付加する工程と、
亜リン酸基、その後キャップ（ｃａｐ）未反応５’−水酸基を修飾する工程、及び前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを開裂する工程と、
前記合成生成物をワークアップする工程と
を有するものである。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号４９〜６８において示された配列において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いは実施例２２において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、癌及び／又は転移の治療のための薬学的組成物の調整におけるものである。
【請求項１６】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮癌の治療のための薬学的組成物の調整におけるＴＧＦ−ベータ２のアンタゴニストの使用。
【請求項１７】
請求項１６の使用において、前記アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２結合タンパク質、阻害剤に関連するＴＧＦ−ベータ受容体、Ｓｍａｄ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ２結合ペプチド、ＴＧＦ−ベータ抗体、ＴＧＦ−ベータ２発現調節因子、ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその活性誘導体の群から選択されるものである。
【請求項１８】
請求項１７の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号２２〜４８において示される配列において特定されるか、或いは実施例２０、実施例２３、又は実施例２４において特定されるものである。
【請求項１９】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮癌の治療におけるＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストの使用。
【請求項２０】
転移治療のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の少なくとも１つの使用。
【請求項２１】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、膀胱癌、子宮内膜癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、骨肉腫、中皮腫、腎臓癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、白血病、リンパ腫、及び／又は軟組織癌の治療のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の少なくとも１つの使用。
【請求項２２】
癌及び／又は転移の治療のための配列ＩＤ番号４９〜６９において示される配列において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施例２２において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの使用。
【請求項１】
癌治療における転移形成を阻害するための薬学的組成物を調整するための少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用。
【請求項２】
請求項１の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、前記転移形成の阻害に関与するタンパク質の合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項３】
請求項１又は２の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２、ＴＧＦ−ベータ３、細胞間接着分子（ＣＡＭ）、インテグリン、セレクチン、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、それらの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、及び／又はインターロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号６８、６９〜１０７に示した配列において特定されるか、或いは実施例１９〜２４において特定されるものである。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかによるオリゴヌクレオチドの使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１、５、６、８、９、１４、１５、１６、２８、２９、３０、３４、３５、３６、４０、４２に示した配列において特定されるものである。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの使用において、前記癌は、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、嚢胞癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、肝臓癌、肺癌、髄様癌、非小細胞気管支／胚癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、非小細胞気管支／肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫、前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管細胞腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫（血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、メラノーマ、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む）、セミノーマ、トラコーマ、ウィルムス腫瘍、及び／又は多発性骨髄腫の群から選択されるものである。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかの使用において、前記癌は、前立腺癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、及び軟組織癌の群、或いはメラノーマ、腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、及び／又は膀胱癌の群から選択されるものである。
【請求項８】
前立腺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌の治療、又はメラノーマ、腎臓癌、白血病、リンパ腫、骨肉腫、中皮腫、多発性骨髄腫、又は膀胱癌の群から選択される癌の治療のための薬学的組成物の調整のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の使用。
【請求項９】
請求項８の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、ＴＧＦ−３、及び／又はインターロイキン１０の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるか、或いは形質転換成長因子ＴＧＦ−ベータ２の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項１０】
請求項９の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号１〜２１又は４９〜６８、２２〜４８、又は６９〜１０７において示した配列において特定されるものであるか、或いは実施例１９〜２４において特定されるものである。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号４９〜６８に示した配列において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチド、或いは実施例２２において特定されるＩＬ−１０アンチセンスオリゴヌクレオチドの群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体。
【請求項１２】
請求項１１のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の製造方法であって、前記製造方法は、
連続的なヌクレオチド及びリンカーを段階的に付加する工程、又は
より長いオリゴヌクレオチド鎖からオリゴヌクレオチドを切断する工程
を有するものである。
【請求項１３】
請求項１２の製造方法であって、３’から５’の方向にヌクレオチド鎖を伸長する亜リン酸トリエステル化学を使用する工程を有し、前記ヌクレオチドは、各々、固相に共有結合的に結合した第一のヌクレオチドと結合しており、前記製造方法は、
前記ヌクレオチドの５’ＤＭＴ保護基を開裂する工程と、
前記各ヌクレオチドを付加して鎖を伸長する前記付加する工程と、
亜リン酸基、その後キャップ（ｃａｐ）未反応５’−水酸基を修飾する工程、及び前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドを開裂する工程と、
前記合成生成物をワークアップする工程と
を有するものである。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号４９〜６８において示された配列において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いは実施例２２において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１０のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、癌及び／又は転移の治療のための薬学的組成物の調整におけるものである。
【請求項１６】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮癌の治療のための薬学的組成物の調整におけるＴＧＦ−ベータ２のアンタゴニストの使用。
【請求項１７】
請求項１６の使用において、前記アンタゴニストは、ＴＧＦ−ベータ２結合タンパク質、阻害剤に関連するＴＧＦ−ベータ受容体、Ｓｍａｄ阻害剤、ＴＧＦ−ベータ２結合ペプチド、ＴＧＦ−ベータ抗体、ＴＧＦ−ベータ２発現調節因子、ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその活性誘導体の群から選択されるものである。
【請求項１８】
請求項１７の使用において、前記オリゴヌクレオチドは、配列ＩＤ番号２２〜４８において示される配列において特定されるか、或いは実施例２０、実施例２３、又は実施例２４において特定されるものである。
【請求項１９】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、及び／又は中皮癌の治療におけるＴＧＦ−ベータ２アンタゴニストの使用。
【請求項２０】
転移治療のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の少なくとも１つの使用。
【請求項２１】
結腸癌、前立腺癌、メラノーマ、膀胱癌、子宮内膜癌、食道癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、骨肉腫、中皮腫、腎臓癌、多発性骨髄腫、膵臓癌、白血病、リンパ腫、及び／又は軟組織癌の治療のためのオリゴヌクレオチド又はその活性誘導体の少なくとも１つの使用。
【請求項２２】
癌及び／又は転移の治療のための配列ＩＤ番号４９〜６９において示される配列において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は実施例２２において特定されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２００７−５２３９４３（Ｐ２００７−５２３９４３Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００１８２（Ｐ２００７−５００１８２）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４７１２
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４２８２７４０）アンティセンス ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００２１０１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８４７１２
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【出願人】（５０４２８２７４０）アンティセンス ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (8)
【Ｆターム（参考）】
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