単分子配列のためのシステム、方法および装置
実施形態は、概して、検体の分析のためのシステムに関する。該システムは、透明基質を含むことができる。該システムはまた、蛍光標識した分子のエバネッセント波励起を、該透明基質、および該蛍光標識した分子を検出するための検出器への接近点近傍で、誘起するように構成される励起光源を含む。上記システムはまた、標識部分と、色素標識したヌクレオチドと、酵素であって、該酵素の１つの末端は、該標識部分に付着しており、該酵素の第２の末端は、該色素標識したヌクレオチドに付着している、酵素とをさらに備え得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年５月１６日に出願された、名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６０／８００，４４０号に対する優先権を主張し、該仮特許出願は本明細書において、その全ての目的のために、参考により援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、単分子配列決定に関し、より具体的には、ゼロモード導波路を使用せずに単分子を検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
単分子事象の検出のためのアッセイシステムにおけるバックグラウンドを減少させることは、概して、有意である。バックグラウンドは、検出量内の高濃度の標識したヌクレオチドに由来し得る。参照することでその全体が本願によって援用される、特許文献１（‘７８１出願）は、複数の塩基を有する標的核酸を配列する方法を記載する。‘７８１出願は、流体への光の伝播を防止し、その結果として励起された量を制限するために、選択された波長よりほぼ１０倍小さい導波路である、ゼロモード導波路の仕様について記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態は、概して、検体の分析のためのシステムに関する。システムは、透明基質を含むことができる。システムはまた、無機吸収体によって蛍光標識した分子にエネルギを与えるように構成される励起光源と、蛍光標識した分子を検出するように構成される検出器とを含むことができる。
【０００６】
別の実施形態は、概して、検体の分析のためのシステムに関する。システムは、金属層で被覆される透明基質と、金属層に堆積した除去コーティングとを含むことができる。システムは、除去コーティングの空孔内へ拡散するように構成される蛍光標識した分子と、除去コーティングの基質側に、プラズモン結合発光励起を産生するように構成される励起光源をさらに含むことができる。
【０００７】
さらに別の実施形態は、概して、ルミネセンス検出システムに関する。システムは、共鳴性光キャビティを含み、発光団の放射は、共鳴性光キャビティの境界で確立されるエバネッセント励起によって誘発される。
【０００８】
実施形態の種々の特徴は、付随の図面と関連して考慮される際に、続く発明を実施するための最良の形態を参照の上、より良く理解されるようになるのと同じように、より完全に説明されることができる。
【０００９】
当業者には、本願に描写する図面は一般化した略図を表し、他の構成要素を追加してもよく、あるいは既存の構成要素を除去または修正してもよいことは、容易に明らかとなるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態により、励起装置の側面図を図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図２】図２は、図１に示す励起装置の部分の上面図を図示する。
【図３Ａ】図３Ａは、実施形態により、別の励起装置の側面図を図示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示す励起装置内の、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図４】図４は、さらに別の実施形態による、図３Ａに示す励起装置の上面図を図示する。
【図５Ａ】図５Ａは、さらに別の実施形態による、量子励起装置を図示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示す励起装置内の、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、量子ドット周辺のエネルギ移動帯を描写する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、多重量子ドットの例示的実施形態を図示する。
【図７Ａ】図７は、放射および励起の統計データによる、ローダミン６Ｇおよび量子の色素の比較を描写する。
【図７Ｂ】図７は、放射および励起の統計データによる、ローダミン６Ｇおよび量子の色素の比較を描写する。
【図８】図８は、いくつかの市販の量子ドットに対する放射の統計データを描写する。
【図９】図９は、量子ドットへの表面付着のための、三官能性試薬のための過程を描写する。
【図１０】図１０は、量子ドット含有単一ポリメラーゼ、単一ビオチンの合成過程を描写する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、さらに別の実施形態による、クレッチマン配置を描写する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、さらに別の実施形態による、別のＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、さらに別の実施形態による、さらに別のＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、さらに別の実施形態による、逆クレッチマンシステムを図示する。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、例示的反射および反射屈折レンズを図示する。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、さらに別実施形態による、さらに別の例示的ＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１２】図１２は、従来の共鳴性レーザーキャビティを描写する。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図１５】図１５は、共振器キャビティ励起装置の種々の実施形態を図示する。
【図１６】図１６は、共振器キャビティ励起装置の種々の実施形態における、光線の角度を図示する。
【図１７】図１７は、さらに別の実施形態による、システムを図示する。
【図１８】図１８は、さらに別の実施形態による、システムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
平易さおよび説明の目的のため、本発明の原則は、主にその例示的実施形態に言及することによって説明される。しかしながら、当業者は、同一の原則は、全ての型のアッセイシステムにおいて平等に適用可能であり、実装されることができ、一部かかる変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱しないことは、容易に理解するであろう。さらに、続く本発明を実施するための最良の形態では、特定の実施形態を図示する付随の図面を参照する。電気的、機械的、論理的、および構造的変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、実施形態に対して行われてもよい。続く本発明を実施するための最良の形態は、それゆえ、限定的意味に取られることはなく、本発明の範囲は、添付の請求項およびその同等物によって定義される。
【００１２】
本発明の広い範囲を説明する数値的範囲およびパラメータが、近似であるものの、特定の例を説明する数値的値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、一部数値的値も、本質的に、それぞれの検査測定で発見された標準偏差の結果必ず起こる、ある一定の誤差を包含する。さらに、本願で開示される全範囲は、その中に包含される、一部および全ての部分的範囲を網羅することは理解されるものとする。例えば、「１０未満」という範囲は、最小値のゼロと、最大値の１０との間の一部および全ての部分的範囲、すなわち、ゼロと等しいか、またはゼロより大きい最小値、および１０と等しいか、または１０未満の最大値を有する、例えば、１から５等、一部および全ての部分的範囲を含むことができる。
【００１３】
一実施形態は、概して、単分子事象を検出するためのシステムおよび方法に関する。より具体的には、内部反射を使用して、光が流体に入るのを防止する励起装置である。励起装置は、基質およびコーティングを含むことができる。基質は、融合シリカ、ガラス、および／または結晶材料等、透明材料であることができる。コーティングは、基質に適用されることができる。コーティングは、透明、半不透明、または不透明であることができ、基質よりより低い屈折率を有するはずである。微視的空孔は、コーティング内で実装されることができる。検体の流体は、励起装置上に置かれることができる。例えば、選択された周波数のレーザといった、励起光源は基質内へ向けられ、内部全反射（ＴＩＲ）によって、微視的空孔内のコーティングおよび流体に反射する。この反射は、コーティング内へ延在するエバネッセント波、およびそのそれぞれの空孔を生成する。このエバネッセント波の強度は、基質表面から迅速に減衰する。いくつかの例では、望ましい場所、通常微視的空孔内以外では、分子が励起光から除外されるため、コーティングは、除去コーティングと呼ぶことができる。
【００１４】
したがって、このエバネッセント波励起は、励起装置の基質の近くにある検体流体を照射のみすることができる。エバネッセント波強度は、基質表面から迅速に減衰するため、コーティングは、検体流体、すなわち、色素分子が、検体流体が基質の近くにある空孔の底にある以外、励起に達するのを妨害する障害を形成することができる。さらに、コーティングが透明である場合、光は、基質表面の上、下、または両側から収集されてもよい。検出領域における基質表面は、優先的に平面であるが、画像処理に有利な場合は、非平面であり得る。非平面の基質表面の例は、多層で実装される基質であることができ、層は、屈折のそれぞれおよび適切な指標を有する、異なる材料であることができる。
【００１５】
他の実施形態は、概して、エネルギ移動帯を生成し、「有用な」励起帯を、励起光変換器の近くにある、より小さな帯に置く方法を包含し、励起光変換器は基質に化学的に付着する。より具体的には、実施形態は、光を吸収し、着目標識部分へ移す励起光変換器として、少なくとも１つの量子ドットを含んでもよい。エネルギの転移は、波長シフトに関与することができる。標識部分は、その後、通常は、より長い波長で放射するであろう。他の実施形態では、異なる大きさの量子ドットは、異なる波長に対して使用することができる。
【００１６】
２光子励起に関与する他の実施形態では、光は、励起波長より短い波長で放射することができる。これは、通常パルスレーザ励起によって行われ、２光子が短時間で、蛍光標識を励起することができることを確実にする。放射光が、励起より短い波長であるため、バックグラウンドが通常、励起より長い波長である際、選別によってバックグラウンドを拒絶するのはより簡単である。色素分子によって放射される光子の蛍光の波長は、通常は、蛍光放射を誘発した励起光子の波長より、長い波長である。
【００１７】
２光子励起は、標準フルオロフォアを利用してもよいか、または上方変換する蛍光体を利用してもよいかのいずれかである。上方変換する蛍光体は、希土類酸化物を含む、混合金属酸化物ナノ粉末から成る。Ｙ２Ｏ３：Ｙｂ，Ｅｒ，Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，Ｅｒ，Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，ＨＯ，およびＹ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，Ｔｍ，ランタニド化合物は、文献からの例である。量子ドットまたは標準フルオロフォアとは違い、放射光は、励起光の波長より短い波長であり、それゆえ、２光子フルオロフォア励起に対して前に記載した利点を有する一方、量子ドットの狭い放射帯および光安定性を保持する。上方変換する蛍光体は、２０ｎｍと同じくらい小さな粉末を含む、種々の大きさで作られることができる。そのようなものとして、上方変換する蛍光体は、量子ドットの様式と類似の様式で使用することができ、それゆえ、用語量子ドットがこれ以後使用されるいずれの場所でも、量子ドットと記載される以外は、上方変換する蛍光体をも指す場合がある。
【００１８】
２光子励起に対するエネルギ転移は、誘起される双極子間相互作用を介して、非放射で生じることができる。代替的に、エネルギ転移は、放射結合によって生じることができる。しかしながら、放射結合は双極子間相互作用に対し、１／Ｒ２対１／Ｒ６下がるので、放射結合は、より大きな励起帯という結果を生じ得る。さらに、放射結合は、拒絶または選別される必要がある光を放射することができる。放射波長におけるこのシフトにより、検出の間、フィルタが両励起源を遮断することを可能にする。フィルタの遮断は、一部の過程の間に除去され、標的位置の決定を可能とすることができる。
【００１９】
量子ドットが、ドットの大きさに依存する波長を産生するので、量子ドットは、望ましい第２の励起を提供するように作られることができる。さらに、量子ドットは、ＦＲＥＴ色素より狭いスペクトル放射、より短いスペクトル尾、およびより幅広い吸収帯を有することができる。
【００２０】
図１Ａは、実施形態による、励起装置１００の側面図を図示する。図１に示すように、励起装置１００は、基質１０５および除去コーティング１１０を含むことができる。いくつかの実施形態では、基質１０５および除去コーティング１１０は、バックグラウンド雑音を最小にする低い蛍光特性を有する材料で、実装されることができる。他の実施形態では、基質１０５は、融合シリカ（ｎ＝１．４７）、結晶石英（ｎ＝１．５４３）、あるいは他の型の低い蛍光ガラス、プラスチック、またはその組み合わせにさらに特定化することができる。
【００２１】
さらに別の実施形態では、基質１０５は、Ｔａ２Ｏ５（ｎ＝２．１）またはＴｉＯ２（ｎ＝２．５−２．９）等、高い屈折率の材料で実装されることができる。基質１０５における高屈折率の材料の使用は、励起光伝播に対して光導波層を促進することができる。光は、図３ＡＢに関して後に記載するような、プリズムまたは格子を使用して、光導波層内へ共役することができる。除去コーティング１０５は、この光導波層に堆積されることができる。さらに、コーティングおよび流体の率が、基質未満でなくてはならない際、高屈折率基質は、より多くの除去コーティング１１０の選択肢を可能とすることができる。種々の他の実施形態では、材料に対する屈折率における急速な変化が、エバネッセント波侵入深さ１４０を減少するので、エバネッセント波は、必要な除去コーティング厚を減少させるために、より速く落ちることができる。
【００２２】
除去コーティング１１０の実装は、基質１０５または光導波層３３０の率に依存し得る。より詳細には、高屈折率基質に対しては、多くのより低率材料が、選択されてもよい。例えば、ＰＭＭＡ（ｎ＝１．４９１）、ポリカーボネート（ｎ＝１．５８６）、環状ポリオレフィン（ｎ＝１．５２５）、および他の類似材料は、除去コーティングとして選択されることができる。いくつかの実施形態では、基質１０５より低い率を有する、ＭｇＦ２等の光学的除去コーティングまたはＳｉＯ２等のガラスもまた、使用されることができる。さらに別の実施形態では、除去コーティング１１０は、融合シリカ（ｎ＝１．４７）、テフロン（登録商標）ＦＥＰ（ｎ＝１．３４１〜１．３４７）、テフロン（登録商標）ＡＦ（ｎ＝１．３２）、ＭｇＦ２（ｎ＝１．３８）を使用して、実装されることができる。
【００２３】
除去コーティング１１０は、透明または不透明であることができる。除去コーティング１１０はまた、部分的に吸収、反射、または選択的に反射性があることができる。不透明な除去コーティング、および他の型の除去コーティングでの実施形態に対しては、空孔外側の試料からの望ましくない光は、減弱される。除去コーティング１１０または基質１０５が適切に形成されず、検体流体内の遠方にまで励起光１３５が漏れすぎ、試料１２０に到達する結果となる場合、望ましくない光が生じ得る。透明な除去コーティングでの実施形態に対しては、放射は、検体流体試料１２０と調和する側、基質側、または同時に両側から収集されることができる。これはまた、多層構造でも可能である。
【００２４】
空孔（または溝、通路、ウェル等）１１５は、除去コーティング１１０内に形成され、検体流体試料１２０が、基質１０５との調和を可能とすることができる。いくつかの実施形態では、検体流体試料１２０は、３リン酸塩、すなわちｄＮＴＰ上に、非蛍光消光剤１２５を有する色素標識したヌクレオチドを含有することができる。非蛍光消光剤１２５を３リン酸塩上に置くことで、遊離ヌクレオチドを消光する。ＤＮＡ鎖に組み入れる際、消光剤は切断され、蛍光色素が、全ての他の遊離ヌクレオチドが薄暗い場所を照らし出す。除去コーティング１１０は、空孔１１５または空孔１１５のパターンによって画定される望ましい場所を除き、分子を励起光から除外するように構成されることができる。それゆえ、励起光は、空孔１１５の底で、蛍光分子を効率的に励起のみすることができる。
【００２５】
ある一部の実施形態に対しては、空孔１１５の量は、拡散事象からバックグラウンド雑音を制御するのに十分小さくすることができる。例えば、標準濃度の蛍光標識したヌクレオチドは、直径３０〜１５０ｎｍの間の大きさ、またはそれより大きい空孔１１５で達成することができる。標識したｄＮＴＰがより低濃度の場合、より大きな空孔の使用を可能とすることができる。
【００２６】
空孔１１５は、図１Ａの側面図に描写されているが、当業者には、空孔１１５の形は、円形、四角形、楕円形、または任意の他の３次元形状であってもよいことは、容易に明らかとなるはずである。いくつかの他の実施形態では、空孔１１５は、先細りまたは曲線の側部等、非垂直側部を有してもよい。多層構造を使用する除去層実装に対しては、空孔１１５は、大きな空孔を生成し、別の除去層を再適用し、それゆえ小さな空孔を生成することによって構成されることができる。空孔１１５を生成する他の方法は、当業者には既知である。
【００２７】
励起装置１００は、検体流体試料１２０と接触することができる。検体流体試料１２０は、色素、ヌクレオチド、および他の材料（例えば、３リン酸塩１２５上の色素標識したヌクレオチドの非蛍光消光剤）を包含することができる。励起の間、内部反射ＴＩＲが、基質１０５／コーティング１１０または基質１０５／流体１２０の界面で生じるように、光源１３０は、基質１０５内へ向けられる励起光１３５を提供することができる。光１３５を内部へ反射する際、細いエバネッセント波１４０は、低率層、すなわち、除去コーティング１１０内に生成される。
【００２８】
図１Ｂは、別の実施形態による、励起帯１４５内にある１つの空孔の断面を描写している。図１Ｂに示すように、励起波１４０は、励起光１３５のＴＩＲから生成される。エバネッセント波１４０の輝度は、ゼロに向かい表面から離れて、指数関数的に落ちるため、区域１４５は、空孔１１５の底の基質１０５近傍にある、有意なエネルギの帯を表す。ＴＩＲはまた、基質の非試料側に光を反射させるために使用され、励起光１３５を再使用することができる。エバネッセント波１４０により、検体流体試料１２０内の分子が、例えば、分子１５０の蛍光を発するようにすることができる。小さな励起帯１４５は、エバネッセント波１４０によって効率的に励起され、および試料１２０と流体接触する両方である領域である。
【００２９】
図２は、図１Ａに示す励起装置１００の一部の上面図（すなわち、流体側面図）を図示する。図２に示すように、除去コーティング１１０は、空孔１１５を除き、基質（図示せず）を被覆することができる。空孔１１５の底内へ遊走する蛍光分子は、励起帯１４５（図１Ｂ参照）に入り、蛍光１１５Ａを放射することができる。
【００３０】
図３Ａは、実施形態による、励起装置３００の側面図を図示する。図３Ａに示すように、励起装置３００は、励起装置１００に類似している。励起装置３００は、基質３０５、および空孔３１５を有する除去コーティング３１０を含むことができる。励起装置３００は、３リン酸塩３２５上に非蛍光消光剤で蛍光標識したヌクレオチドを含むことができる、検体流体試料３２０と接触してもよい。基質３０５、除去コーティング３１０、空孔３１５、および検体流体試料３２０は、励起装置１００のそれぞれの成分に類似または同一の性質／特性を有する。
【００３１】
励起装置３００は、光導波層３３０を含むことができる。光導波層３３０は、前に記載した通り、高屈折率の材料を使用して実装されることができる。光源３３５からの光３４０は、米国特許第５，８８２，４７２号に記載の通り、プリズムまたは格子を介して、光導波層３３０内へ共役されることができ、同号は、その全体を参照することで、本願に援用される。
【００３２】
励起の間、内部全反射ＴＩＲが、光導波層３３０／除去コーティング３１０、および光導波層３３０／流体３２０の界面で生じるように、光源３３５は、光導波層３３０内へ向けられる光３４０を提供することができる。光を内部へ反射する際、細いエバネッセント波３４５は、低屈折率層内、すなわち、除去コーティング３１０および流体内で生成される。エバネッセント波により、光導波層３３０近傍にある検体流体試料３２０内の分子が、例えば、分子３５５の蛍光を発する。
【００３３】
図３Ｂは、別の実施形態による、エバネッセント波３４５内にある１つの空孔の断面を描写する。図３Ｂに示すように、エバネッセント波３４５は、光導波層３３０内で励起光３４０のＴＩＲから生成される。エバネッセント波３４５の強度は、境界から離れるように移動して、ゼロに向かい指数関数的に落ちるので、区域３５０は、空孔３１５の底にある光導波層３３０近傍の、有意なエネルギの帯を表す。ＴＩＲはまた、光を光導波層３３０の非試料側に反射するために使用され、励起光３４０を再使用することができる。エバネッセント波３４５により、光導波層３３０近傍にある検体流体試料３２０内の分子が、例えば、分子３５５の蛍光を発することができる。小さな励起帯３５０は、エバネッセント波３４５によって励起され、および試料３２０と流体接触する両方である領域である。
【００３４】
図４は、さらに別の実施形態による、図３Ａに示す励起装置３００の上面図を図示する。図４に示すように、除去コーティング３１０は、空孔３１５を除き、光導波層３３０（図示せず）を被覆することができる。空孔３１５の底へ遊走する蛍光分子は、励起帯３５０（図３Ｂ参照）に入り、蛍光３１５Ａを放射することができる。
【００３５】
図５Ａは、さらに別の実施形態による、量子励起装置５００を図示する。図５Ａに示すように、量子励起装置５００は、励起装置１００に類似している。量子励起装置５００は、基質５０５、および空孔５１５を有する除去コーティング５１０を含むことができる。基質５０５および除去コーティング５１０は、図１Ａ〜４に関して前に記載した通りの材料で、実装されることができる。さらに、除去コーティング５１０の屈折率は、基質５０５未満である。
【００３６】
量子励起装置５００は、３リン酸塩５２５上に非蛍光消光剤で蛍光標識したヌクレオチドを含むことができる、検体流体試料５２０と接触することができる。基質５０５、除去コーティング５１０、空孔５１５、および検体流体試料５２０は、励起装置１００のそれぞれの成分に類似および／または同一の性質／特性を有する。量子励起装置５００はまた、光源５３０を含むことができる。光源５３０からの光５３５は、基質５０５に共役されることができる。励起装置３００（図３ＡＢ参照）と同様に、励起装置５００は、他の実施形態の光導波層３３０に類似する光導波層で実装されることができる。
【００３７】
量子励起装置５００は、少なくとも１つの量子ドット５４０を含むことができる。量子ドットは、伝導帯電子、価電子帯空孔、または励起子（伝導帯電子と価電子帯空孔との組を結合）の動きを、全ての３空間方向に限局する半導体ナノ構造であることができる。量子ドットは、ケイ素およびゲルマニウムと、おそらく他の材料と、ＣｄＳｅと、から成る構造を含むことができる。量子ドットはまた、例えば、コア内のＣｄＳｅ、およびシェル内のＺｎＳを有するコアシェル構造として、製作されることができる。他の型の材料は、量子ドットを生成するために使用されることが可能であり、請求する発明の精神および範囲に含まれ得ることは、容易に明らかとなるはずである。
【００３８】
他の実施形態は、異なる大きさおよび／または型の多重量子ドットを使用することができる。励起相の間、量子ドット５４０は、エネルギ移動帯を生成することができる。より詳細には、ＴＩＲが、基質５０５／除去コーティング５１０、および基質５０５／流体５２０の界面で生じるように、光源５３０は、基質５０５内へ向けられる光５３５を提供することができる。光５３５を内部へ反射する際、細いエバネッセント波５４５は、より低い屈折率層、すなわち、除去コーティング５１０内で生成される。エバネッセント波５４５は、エバネッセント波５４５の急速な減衰のため、小さな励起帯５５０（図５Ｂ参照）を生成することができる。量子ドット５４０は、励起エネルギを望ましい波長へ変換する小さな励起帯５５０で、エネルギを吸収することができる。変換過程は、図６Ａに描写されている量子ドット５４０の周りに、エネルギ移動帯を生成することができる。
【００３９】
図６Ａに示すように、移動帯６０５内のエネルギは、標識部分、すなわち、励起された色素標識したヌクレオチド６１０へ移動されることができる。色素標識したヌクレオチド６１０は、酵素６１５によって、量子ドット５４０に付着していることができる。いくつかの実施形態では、異なる型および／または大きさの多重量子ドットは、図６Ｂに図示されるいくつかの励起波長を有するために使用されることができる。
【００４０】
図６Ｂに示すように、量子ドット１（「Ｑ１」と標識）６５０は、周囲のエネルギ移動帯６５５を生成してもよい。量子ドット２（「Ｑ２」と標識）６６０はまた、周囲のエネルギ移動帯６６５を生成してもよい。エネルギ帯６５５、６６５は、励起エネルギの存在によって生成されてもよい。量子ドット６５０および６６０は異なる大きさから成り、異なる型から成っていてもよいため、両方は、いくつかの波長を産生するために使用されることができる。図６Ａに示す実施形態のように、色素標識したヌクレオチド６１０は、少なくとも１つの酵素６１５によって、量子ドット６５０、６６０に付着していることができる。
【００４１】
図５Ａを参照すると、量子励起装置はまた、量子ドットからの放射の型を同定するように構成される、検出器５５０を含む。検出された放射は、それから、放射に対応する分子が同定され、その同定が保存される際、コンピュータ（図示せず）へ向けられる。
【００４２】
図７は、ＣｄＳｅ量子ドットとローダミン６Ｇ色素との間の、（ａ）励起および（ｂ）放射の統計データの比較７００を描写する。量子ドット放射スペクトル（（ｂ）内）はほぼ対照的であり、ピーク幅はより狭い。しかしながら、励起曲線は、広く継続的である。それゆえ、量子ドットは、５３０ｎｍより短い波長によって効率的に励起させることができる。一方、有機色素ローダミン６Ｇは、励起波長選択を制限する励起のピークを有する。
【００４３】
図８は、いくつかの市販の量子ドットに対する放射曲線８００を描写する。図８に示すように、市販の試料から伝播する波長は、合理的とみなすことができる。したがって、慎重な選択および／または製作により、さらにより緊密な分布を可能とすることができることと予測される。
【００４４】
図６Ａに戻ると、量子ドット５４０は、色素標識したヌクレオチド６１０および酵素６１５に付着して、描写されている。理想的には、単一酵素６１５は単一量子ドット５４０に付着し、付着した組は、それから基質５０５に付着する。量子励起装置５００では、各励起帯に単一部分を有することが、さらに望ましい。標準のポアソン分布が生成される場合、ウェルにある各部分、および付着した組のうちのたった一つを得る可能性は低い。良くても、０．３７２（１４パーセント）までであろうが、通常は、１０パーセント代の可能性がより高い。この有用な低濃度は、システムの効果的な処理量を減少させ得る。
【００４５】
従来の戦略の１つは、正しい組の数を充実させることである。例えば、解決法の１つは、大部分の分子が１組の一部ではないように、薄い溶液を使用して、付着化学反応を行うことである。低濃度のため、それぞれのうちの１つより多くを有する成分はほとんどない。次いで、この溶液は、当業者には既知である、選別（蛍光活性化細胞選別装置を使用する等）、またはストレプトアビジン−ビオチン等の化学的フックを使用する引き抜きによって、濃縮されることができる。
【００４６】
量子励起装置の実施形態は、３つの付着部位を有するリンカー分子を使用することができる。図９は、量子ドット５４０への表面付着のための、三官能性試薬に対する過程９００を描写する。図１０は、単一ポリメラーゼ、単一ビオチンを含有する量子ドット５４０の合成の過程１０００を描写する。
【００４７】
図９〜１０の過程を通して、少なくとも１つのシスチンを含有する酵素は、反応を完了へと駆動することで、各マレイミド含有量子ドットに付着することができる。それゆえ、単一フックビオチンを付着する各量子ドットは、単一酵素を有するであろう。これは、基質５０５に付着することができる。他の実施形態では、ウェルは、２００５年６月１０日に出願した「Ｍｏｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ」の米国仮出願第６０／６８９，６９２号に記載される通り、多重ストレプトアビジンを含むことができ、同号は、その全体を参照することで本願に援用される。
【００４８】
したがって、量子励起装置の実施形態は、従来のシステムに関していくつかの利点を提供することができる。例えば、励起装置内の量子ドットは、単一システムにおける、減弱の複数の方法を提供することができる。別の利点は、励起のエバネッセント層は、ＴＩＲを使用して、略１００ｎｍの厚さであることである。これにより、Ｚ軸で励起光を制限することで、励起帯を減少する。さらに、励起源は、着目部分を弱く励起する波長であることができる。例えば、４０５ｎｍの波長は、図７に示すローダミン６Ｇ色素を弱く励起するであろうが、量子ドットは、これらのより短い波長で良く励起される。この幅広い吸収範囲はまた、異なる励起源の使用を可能とする。例えば、４０５ｎｍレーザ（高解像度ＤＶＤプレーヤに使用）は、従来の蛍光励起に使用される４８８ｎｍレーザよりさらに安価である。
【００４９】
実施形態のさらに別の利点は、量子ドットまたは他の寿命の長い供与体が、第２の励起帯を生成することである。これにより、全ての方向における源の数が制限される。組み込まれた、または結合されたヌクレオチドは、量子ドットの非常に近傍にある場合、高水準の効率的に吸収された光に見える。効率的なエネルギ転移距離は約５ｎｍであるため、これにより小規模の励起帯が生成される。
【００５０】
さらに別の利点は、エネルギ移動帯（図６Ａの６０５参照）内へ拡散する遊離ヌクレオチドが、通常、極度に小さな励起量のおかげで、非常に迅速に出ることである。遊離ヌクレオチドがエネルギ移動帯に出入りする時間は、酵素がヌクレオチドを組み込む時間よりさらに短い。これにより、単一光子包含とは対照的に、蓄積された信号（例えば、ＣＣＤ検出を介して）に基づき、部分決定が改良される。
【００５１】
２光子励起を使用する別の実施形態は、バックグラウンド雑音を減少するために使用されることができる。２光子励起では、光の放射は、励起光より短い波長で行われる。２光子放射は、高励起水準が存在する場合にのみ産生される。任意のバックグラウンド蛍光は、励起源より長い波長で行われ、ショートパスフィルタまたはバンドパスフィルタ等のフィルタを使用して、簡単に除去される。
【００５２】
別の実施形態は、ＴＩＲの代替物を使用することができる。これらの実施形態は、表面プラズモン結合の方向放射（「ＳＰＣＥ」）を使用する。ＳＰＣＥは、金属表面で表面プラズモン波によって励起された、色素分子の角度放射曲線を含むことができ、それは第ＷＯ２００５／００３７４３号に記載されている。第ＷＯ２００５／００３７４３号の全体は、参照することにより本願に援用される。ＳＰＣＥ技術は、図１１Ａ〜Ｄに描写する、ゼプトリットル励起量で改良された励起および収集を提供することを、前に記載した励起装置の実施形態と組み合わせることができる。
【００５３】
図１１Ａは、クレッチマン配置システム１１００Ａの例示的実施形態を図示する。この配置では、蛍光分子からのエネルギは、金属表面の他方側の光として放射される。バックグラウンドは抑制されることができ、励起および放射効率の両方を、著しく改良することができる。蛍光分子が金属表面に近すぎる（＜２０ｎｍ）場合、それからエネルギは消光される。スペーサ層は、かかる密接な接触を防止するために使用されることができる。スペーサ層は、ＳｉＯ２等、低蛍光を有する誘電性材料であることができる。
【００５４】
ＳＰＣＥ技術は、ＴＩＲシステムに関していくつかの利点を提供することができる。例えば、エバネッセント波が、低屈折率の材料への移行によって生成されないため、除去コーティングに対する選択はより大きい。加えて、放射された光の方向性の本質により、収集光学を単純化し、バックグラウンド拒絶を改良することができる。最終的には、金属への近接は、光安定性を増加することを示しており、単分子適用には特に重要である。
【００５５】
図１１Ｂは、ＳＰＣＥシステム１１００Ｂの別の実施形態を図示する。図１１Ｂに示すように、励起装置は、金属層１１１５Ｂと調和する基質１１１０Ｂ、および除去コーティング１１２０Ｂを含むことができる。基質１１１０Ｂおよび除去コーティング１１２０Ｂは、前に記載したような材料および技術で実装されることができる。金属層１１１５Ｂは、金、銀、あるいは５〜７５ｎｍ以上、好ましくは金に対しては２５〜３０ｎｍ、および銀に対しては５０ｎｍの厚さを有する、ＳＰＣＥに対して適切な他の金属で実装されることができる。加えて、クロム等の別の金属は、接着を改良するために、基質に適用されてもよいが、一方、引き続き適用されるより厚い層の反射率に干渉せず、この層は、２から５ｎｍの間であると報告されている。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｂは、基質１１１０Ｂからの率において著しい変化を有する、非金属材料であることもできる。
【００５６】
除去コーティング１１２０Ｂは、金属層１１１５Ｂの片側に堆積されるか、または伸ばされることができる。除去コーティング１１２０Ｂは、図１Ａ〜４に関して前に記載した通り、高屈折率の材料（例えば、融合シリカ、ポリカーボネート）で実装されることができる。空孔（通路、溝等）１１２５Ｂは、検体溶液１１３０Ｂに対して、除去コーティング１１２０Ｂ内に形成され、金属層１１１５Ｂに接触することができる。いくつかの他の実施形態のように、色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）は、空孔１１２５Ｂの底へ遊走することができる。
【００５７】
ＳＰＣＥシステム１１００Ｂはまた、不完全な球、半球、または他の類似の３次元形状として実装されるレンズ１１３５Ｂを含むことができる。レンズ１１３５Ｂは、無収差状態にあるように構成されることができ、すなわち、レンズ１１３５Ｂは球面収差またはコマを生成しない。レンズ１１３５Ｂは、必要とされる鋭い角度で、出入りして光を共役することができる、率が適合する流体１１４０Ｂを介して、基質１１１０Ｂと調和するように構成されることができる。いくつかの実施形態では、励起源１１４５Ｂは、単一周波数で、または本実施形態の場合、４８８ｎｍおよび５３２ｎｍ等の多重周波数で、作動することができる。
【００５８】
したがって、励起源１１４５Ｂからの光が、基質１１１０Ｂに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｂおよび基質１１１０Ｂの界面で励起される。表面プラズモンは表面に沿って伝播し、それ自体を電場として表す金属層１１１５Ｂの、表面上に結合される光線とみなすことができる。電場は、除去層１１２０Ｂおよび空孔１１２５Ｂ内へ延在し、金属表面から距離を取って急速に減衰する。電場の減衰に先駆けて、エネルギ移動帯は、図１Ｂの著しいエネルギ１４５の帯に類似して生成されることができる。このエネルギ移動帯内へ伝播されている色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）は、放射光１１５０Ｂの円錐体を形成するプラズモン結合発光によって、放射されることができる。
【００５９】
１１００Ｂのいくつかの実施形態では、除去コーティング１１２０Ｂは、内部全反射を支持しない、すなわち基質以上の率、すなわち、率が適合する流体１１４０Ｂと適合しない材料で実装されることができる。ＴＩＲが発生しないため、コーティングはより低くなることができるが、それが必要というわけではない。他の実施形態では、除去コーティング１１２０Ｂは、より少ない屈折率を有する材料で実装されることができる。材料は、当業者に既知であるような金属、または非透明材料であることができる。
【００６０】
図１１Ｃは、さらに別の実施形態による、別の例示的ＳＰＣＥシステム１１００Ｃを図示する。図１１Ｃに示すように、システム１１００Ｃは励起装置を含む。励起装置は、図１Ａおよび図３Ａに関して前に記載した通り、類似の材料で実装されることができる、基質１１１０Ｃを含むことができる。基質１１１０Ｃは、金属層１１１５Ｃと接触することができる。金属層１１１５Ｃは、本願の上記の通り、図１１Ｂの金属層１１１５Ｂに類似する材料で実装されることができる。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｃは、基質１１１０Ｃから率において著しい変化を有する、非金属材料であることができる。金属層１１１５Ｃおよび基質１１１０Ｃの界面は、ＳＰＣＥ励起のために使用されることができる。
【００６１】
スペーサ層１１２０Ｃは、金属層１１１５Ｃの片側に形成されることができる。スペーサ層１１２０Ｃは、１〜１００ｎｍ、および好ましくは５〜２５ｎｍ厚の範囲のＳｉＯ２で実装されることができる。金属コーティング１１２５Ｃは、スペーサ層１１２０Ｃの片側に形成されることができる。金属コーティング１１２５Ｃは、金、アルミニウム、チタン、または他の類似材料等の材料で実装されることができる。空孔１１３０Ｃは、金属コーティング１１２５Ｃ内に形成されることができ、流体１１４０Ｃ内の色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）１１３５Ｃは、空孔１１３０Ｃの底へ遊走できる、
したがって、励起源からの光が基質１１１０Ｃに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｃおよび基質１１１０Ｃの界面で励起される。表面プラズモンは、急速に減衰する空孔１１３０Ｃ内へ延在する、電磁場を生成することができる。エネルギ移動帯は、図１Ｂの著しいエネルギ１４５の帯に類似して、生成されることができる。このエネルギ移動帯内へ遊走した標識したヌクレオチド１１３５Ｃは、エネルギを与えられ、蛍光を発することができる。
【００６２】
さらに、厚い金属コーティング１１２５Ｃと色素の相互作用のおかげで、消光帯１１４５Ｃを生成することができる。消光帯１１４５Ｃは、略２０ｎｍであることができる。この帯内の任意の色素分子は、蛍光発色することを抑制される。
【００６３】
図１１Ｄは、ＳＰＣＥ用の逆クレッチマン励起システム１１００Ｄを図示する。バックグラウンドとして、逆クレッチマン（「ＲＫ」）は、ＳＰＣＥに対する従来のアプローチである。ＲＫでは、励起は試料側からであるが、放射は金属表面の他方側上で起こる。励起光は試料側に取り込まれる際、色素分子をその道に沿って励起する。表面から離れて多くの色素分子が存在し、金属が全ての光を遮断するのに十分なほど厚くないため、放射された光の一部は、金属表面を介して透過するだろう。これにより、高すぎるバックグラウンドが生じるであろう。さらに、励起光は、試料が表面近傍になる前に、試料を退色することができる。図１１Ｄに示す実施形態は、これらの問題を解決することができる。
【００６４】
図１１Ｄに示すように、励起システム１１００Ｄは、金属層１１１５Ｄと調和する基質１１１０Ｄを含むことができる励起装置１１０５Ｄと、スペーサ層１１２０Ｄとを含むことができる。基質１１１０Ｄ、金属層１１１５Ｄ、およびスペーサ層１１２０Ｄは、図１１Ａ〜Ｃに関して前に記載したような、材料および技術で実装されることができる。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｄは、基質１１１０Ｄからの率において著しい変化を有する、非金属材料であることができる。スペーサ層１１２０Ｄは、検体溶液１１２５Ｄと接触することができる。量子ドット１１３０Ｄは、スペーサ層１１２０Ｄに結合されることができる。明瞭さのため、量子ドットは記載されているが、貴金属ナノドット（コロイド粒子）等、他の吸収体が使用されることができ得ることは理解されるものとする。
【００６５】
基質１１１０Ｄの片方は、率が適合する流体１１３５Ｄと接触することができる。レンズ１１４０Ｄは、基質１１１０Ｄ上で、率が適合する流体１１３５Ｄを網羅することができる。レンズ１１４０Ｄは、不完全な球、半球、または他の類似する３次元形状として実装されてもよい。レンズ１１４０Ｄは、無収差状態にあるように構成されることができ、すなわち、レンズ１１４０Ｄは球面収差を防止する。レンズ１１４０Ｄはまた、一般的に反射または反射屈折のレンズとして、および特にシュワルツシルト対物として実装されてもよい。中央反射システムの１次の鏡を貫通する必要な空孔、および２次の鏡による掩蔽は、多くの画像処理システムにとって制限である一方で、それらはクレッチマンシステムにとっては制限ではない。それらは１次の鏡内の空孔、および２次の鏡による掩蔽を備えるが、誘発された発光は、２つの鏡システムによって完全に収集することができる管状パターン内へ放射されるため、それらは制限ではない。例示的な反射１１９０Ｄおよび反射屈折の１１９５Ｄレンズは、図１１Ｅに示されている。システム１１００Ｄはまた、１次の励起バックグラウンド放射を遮断するように構成される開口部１１４５Ｄと、収集センサ（図示せず）からの量子ドット１３３０Ｄからのプラズモン放射とを含むことができる。
【００６６】
励起源（図示せず）からの光線１１５０Ｄ（例えば、上方変換する蛍光体に対して波長４０５ｎｍ、または９８０ｎｍ）は、低バックグラウンドを有する小さな放射帯を産生する、量子ドット１１３０Ｄを励起することができる。励起光を、色素放射および吸光度から、スペクトル的に非常に除去するため、励起光線１１５０Ｄは、容易に光学的に選別されることができ、色素は１次の放射光を不十分ではあるが吸収し、それによって、色素の光分解を減少させる。コロイド粒子１１３０Ｄ近傍の色素から放射される光は、光１１５５Ｄの円錐体内にある、基質１１１０Ｄ側の狭い角分布で、放射されることができる。光１１５５Ｄの円錐体は、効率的に収集され、選別され、それから電荷結合検出器等のセンサによって検出されることができる。励起光線１１６０Ｄの一部は、基質側１１１０Ｄへ透過することができるが、この光は、容易に収集領域から、遮断されるか、選別されるか、または離れた方に向かうことができる。
図１１Ｇは、さらに別の実施形態による、別の例示的ＳＰＣＥシステム１１００Ｆを図示する。図１１Ｆに示すように、システム１１００Ｆは励起装置を含む。励起装置は、図１Ａおよび図３Ａに関して先に記載した通り、類似の材料で実装されることができる、基質１１１０Ｆを含むことができる。基質１１１０Ｆは、薄い金属層１１１５Ｆと接触することができる。金属層１１１５Ｆは、略２５〜５０ナノメートルの厚みを有し、本願上記の図１１Ｂの金属層１１１５Ｂに類似する材料で実装されることができる。第２の金属層１１２０Ｆは、金属層１１１５Ｆの上に堆積されることができる。第２の金属層１１２０Ｆは、略１００ｎｍの厚みであり、金属層１１１５Ｆまたは異なる金属に類似する材料で実装されることができる。第２の金属層１１２０Ｆの厚みは、一部表面プラズモンの共役を防止し、表面プラズモンを反射する。したがって、金属層１１１５Ｆおよび基質１１１０Ｆの界面は、ＳＰＣＥ励起のために使用されることができる。第１の金属は純粋であることができるか、または合金が提供するプラズモンは支持される。第２の層の追加により、表面プラズモンは支持されるべきではない（すなわち、同一金属より厚い層であることができるか、または異なる金属または合金であることができる）。
【００６７】
空孔１１３０Ｆは、流体１１４０Ｆ内の色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）１１３５Ｆが、空孔１１３０Ｆの底へ遊走することができる、第２の金属層１１２０Ｆ内に形成されることはできる。空孔は任意の大きさであることができ、より小さな空孔が、より速い速度論に対してより高濃度を可能とする。大きさは、１０００ｎｍ未満、好ましくは２００ｎｍ未満、さらにより好ましくは、１００ｎｍ未満の場合がある。
【００６８】
従って、励起源からの光が基質１１１０Ｆに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｆおよび基質１１１０Ｆの界面で励起される。表面プラズモンは、急速に減衰する空孔１１３０Ｆ内へ延在する、電場を生成することができる。このエネルギ移動帯内へ遊走されている、標識したヌクレオチド１１３５Ｆは、エネルギが与えられ、蛍光を発することができる。
【００６９】
さらに、消光１１４５Ｆの帯は、第２の金属層１１２０Ｆと色素の相互作用のおかげで、生成されることができる。消光１１４５Ｅの帯は、略２０ｎｍであることができる。この帯内の任意の色素分子は、蛍光を発するのを抑制される。
【００７０】
図１Ａおよび３Ａを参照すると、それぞれの光源（１３０および３３５）は、概して、選択された波長での励起エネルギの源として説明することができる。従来のシステムでは、光源は、図１２に描写する通り、共振器キャビティレーザであってもよい。図１２に示すように、共振器キャビティレーザ１２００は、高反射性の鏡１２０５を含む。キャビティ１２１０内では、レーザポンプ１２１５、例えば、アルゴンイオンレーザポンプは、出力カプラ１２２０を貫通して通過することができるまで、鏡１２０５の間で反射される、選択された波長を産生してもよい。
【００７１】
従来の共振器キャビティレーザは、弱点および不都合を有する。例えば、共振器キャビティレーザも外側のレーザ出力は、共振器キャビティの内側より、略１００倍少ない。したがって、さらなる実施形態は、概して、蛍光産生の増加に関する。より詳細には、実施形態は、キャビティの実質的な外側のビームの励起場振幅よりむしろ、フルオロフォアが、キャビティ内に存在するのに匹敵する励起場振幅に曝されるように、共振器キャビティと連通してフルオロフォアを置くことによって、光学過程を増強することができる。他の実施形態では、レーザ出力の効率的使用が、図１３に描写した通り、キャビティ鏡等の励起装置１３２０を使用することによって、シリカ基質上のレーザの波長より小さい寸法および高さを有する空孔を備える除去コーティング、または金属コーティングで実装される励起装置の、実施形態の空孔内に置かれる、フルオロフォアを励起している場合がある。
【００７２】
図１３は、本発明の実施形態による、システム１３００を図示する。図１３に示すように、システム１３００は、高反射性の鏡１３０５Ａ、および１３０５Ｂを含むことができる。光源１３１５は、共鳴性キャビティ１３１０の内部に設置されることができる。レーザ共鳴性キャビティ内部に位置付けられるのは、基質１３２０、例えば、図１に示す基質１０５であることができる。共鳴性ビームがキャビティ内を循環する間、エバネッセント波が、除去層の空孔を貫入するフルオロフォアを励起できるように、基質１０５は、例えば、ＴＩＲによって、除去層界面で光を効率的に反射するように構成されるべきである。厳密に言えば、ＴＩＲ表面が共振器の境界のうちの１つを備えるため、フルオロフォアはキャビティの外側にある。しかし、界面を越えてナノメートル延在する、キャビティ内ビームのエバネッセント成分がある。
【００７３】
図１４は、本発明の実施形態による、システム１４００を図示する。図１４に示すように、システム１４００は、外部レーザ１４１０を介する、励起装置１４２０上の発光団の励起を描写する。システム１４００は、高反射性の鏡１４０５を含むことができる。外部レーザ１４１０は、鏡１４０５によって画定される共鳴性キャビティ内へ向けられる選択される周波数で、干渉性光エネルギを産生してもよい。能動型キャビティ整合装置１４１４は、共鳴に必要なキャビティ長および整合を、確立し維持する。共鳴により、高い磁場をキャビティ内に築き上げることができる。励起装置１４２０の基質は、エバネッセント波が、除去コーティングの空孔内へ遊走する蛍光標識したｄＮＴＰを励起することができるように、共鳴性キャビティと効率的に調和するように構成されることができる。干渉性光エネルギの進路は、第２の高反射性の鏡１４０５Ｂを反射することができ、それから励起装置１４２０に向かって反射し返される場合もある。
【００７４】
図１５Ａ〜Ｄは、共振器キャビティ励起装置１５００の種々の実施形態を描写する。図１５Ａ〜Ｃに示すように、基質１５０５は、水性発光検体１５１０と調和することができる。界面は、ＴＩＲ界面１５２５を構成することができる。１５１５の共振器キャビティは、高反射性の鏡１５２０およびＴＩＲ界面１５２５によって結合される。光の進路１５３０は、基質１５０５への光線の種々の角度を表す。明瞭さのため、空孔またはウェルは省略されている。注目すべきは、ウェルは実際の装置で省略されてもよく、図１５Ａ〜Ｄに描写される装置はさらに機能するであろうことである。例えば、界面の流体側に混成配列のパターン形成をし、共鳴性キャビティ増強を使用することができ得る。いくつかの実施形態では、基質は、少なくとも１片の反射材料を意味することができる。図１５Ａ〜Ｄに示す実施形態に対して、１片のガラスが描写される。好ましくは、プリズムまたはレンズと光学的に接触するガラスの非常に薄い層を有し、薄い層の片側に接触する流体を有するであろう。
【００７５】
図１５Ａは、図１６Ａ〜Ｂにより詳細に描写されるブルースター角で、光線がプリズムに入る共振器キャビティを描写する。図１６Ａ〜Ｂは、ＴＩＲを惹起する角度を示す、例示的共振器キャビティ励起装置１６００を図示する。図１６Ａに示すように、励起装置１６００の断面は、単一空孔１６１５を含む。励起装置の基質１６０５は、シリカ（ｎ＝１．４５７）で実装されることができ、除去コーティング１６１０は、ＭｇＦ２（ｎ＝１．３７７）で実装される。レーザ光は、使用される色素に適切である、任意の入手可能な色であることができる。例えば、４８８ｎｍまたは６３２ｎｍが、通常入手可能なレーザ色である。多重レーザは、独立してか、または同時にかのいずれかで使用されることができる。
【００７６】
基質１６０５内では、光の進路１６２５は、臨界角（ブルースター角）５５．５３度で接近し、大気から基質１６０５へのゼロ反射通過を成し遂げることができる。光の進路１６２５は、臨界角以上で空孔１６１５に接近し、ＴＩＲ界面１６２０で誘起する。本実施形態に対しては、臨界角は、６３３ｎｍの光に対して７１．２６であるが、入射の角度はより大きい場合もある。反射された光は、同じ角度で出ることができるが入射の角度、光の波長、および／または材料により、偏向することができる。
【００７７】
図１６Ａに描写する通り、基質１６０５の側壁の角度は、界面から、基質１６０５と除去コーティング１６１０との間が１０５度である。
【００７８】
図１６Ｂは、光の進路１６２５が臨界角以上で空孔１６１５に接近し、ＴＩＲを誘起する、共振器キャビティ励起装置１６００を描写する。本実施形態に対しては、臨界角は、入射から７２．５７８度である。反射された光は、同じ角度で出ることができるが、入射の角度、光の波長、および／または材料により、偏向することができる。
【００７９】
図１５Ｂに転じると、この図は、共振器キャビティの高反射性の鏡１５２０が、光線１５２５を垂直入射に向ける、共鳴性キャビティ励起装置の別の実施形態を描写する。図１５Ｃに転じると、この図は、共振器キャビティ励起装置１５００のさらに別の実施形態を描写する。基質１５０５は、半球であるように構成されることができる。高反射性の鏡１５２０は、光線１５２５を基質１５０５に垂直入射で入らせるように位置付けられる。
【００８０】
図１５Ｄは、共振器キャビティ励起装置１５００のさらに別の実施形態を描写する。本実施形態では、複数のキャビティ１５５０〜１５６５を形成することができる。各キャビティは、選択された波長でレーザを支持することができる。したがって、本実施形態に対しては、４つの異なる波長を、検出の際に使用することができる。キャビティがいくつでも、本発明の範囲を逸脱することなく、支持することができることは、当業者には容易に明らかとなるはずである。
【００８１】
図１７は、さらに別の実施形態による、システム１７００を図示する。図１７に示すように、励起装置は、シリカ材料で実装される基質１７０５と、アルミニウムで実装される除去コーティング１７１０とを含むことができる。空孔１７１２は、除去コーティング１７１０内に形成され、色素溶液１７１４と相互作用することができる。基質１７０５は、プリズム表面１７１５ＡＢを有するように構成されることができる。システム１７００はまた、高反射性の鏡１７２０ＡＢを含むこともできる。
【００８２】
励起の間、入力レーザは、選択された波長で、入力カプラ（図示せず）を貫通して高反射性の鏡１７２０Ａを介し、干渉性光エネルギ１７２５を放射することができる。高反射性の鏡１７２０Ａからの干渉性光エネルギ１７２５は、固定プリズム１７１５Ａの側に向かって透過されることができる。干渉性光エネルギ１７２５はまた、高反射性の鏡１７２０Ｂへ向けられ、プリズム表面１７１５Ｂの他方側に向かって反射されることができる。プリズム表面１７１５Ｂは、光を空孔１７１２に向かって反射するように構成されることができる。
【００８３】
さらに別の実施形態は、光ファイバを使用し、図１８に描写される。図１８に示すように、システム１８００は、１つ以上の光ファイバ１８１０の下方へ光を放つ、励起装置１８０５を含む。検出領域１８１５は、一部のファイバ１８１０の上に生成されてもよい。ファイバ上のコーティングは、ファイバの表面のエバネッセント波を誘起するように設計されることができる。検出領域１８１５では、小さな空孔（図示せず）はファイバのコーティング１８１０が、除去コーティングとして機能するように、コーティング内に置かれてもよい。光ファイバ１８１０の走行は、ＴＩＲを保存するのに十分大きなループ１８２０を含むことができる。
【００８４】
本発明を、その例示的実施形態を参照の上、説明してきた一方で、当業者は、真の精神および範囲を逸脱ことなく、記載の実施形態に対する種々の修正を行うことができるであろう。本願で使用される用語および説明は、図示の手段として記載されており、制限を意味しない。特に、方法が例によって説明されているが、方法のステップは、図示の通りまたは同時ではなく、異なる順序で実行されてもよい。当業者は、続く請求項およびそれらに同等するものに定義される精神ならびに範囲内で、これらおよび他の変形が可能であることを認識するであろう。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００６年５月１６日に出願された、名称「Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６０／８００，４４０号に対する優先権を主張し、該仮特許出願は本明細書において、その全ての目的のために、参考により援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、単分子配列決定に関し、より具体的には、ゼロモード導波路を使用せずに単分子を検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
単分子事象の検出のためのアッセイシステムにおけるバックグラウンドを減少させることは、概して、有意である。バックグラウンドは、検出量内の高濃度の標識したヌクレオチドに由来し得る。参照することでその全体が本願によって援用される、特許文献１（‘７８１出願）は、複数の塩基を有する標的核酸を配列する方法を記載する。‘７８１出願は、流体への光の伝播を防止し、その結果として励起された量を制限するために、選択された波長よりほぼ１０倍小さい導波路である、ゼロモード導波路の仕様について記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態は、概して、検体の分析のためのシステムに関する。システムは、透明基質を含むことができる。システムはまた、無機吸収体によって蛍光標識した分子にエネルギを与えるように構成される励起光源と、蛍光標識した分子を検出するように構成される検出器とを含むことができる。
【０００６】
別の実施形態は、概して、検体の分析のためのシステムに関する。システムは、金属層で被覆される透明基質と、金属層に堆積した除去コーティングとを含むことができる。システムは、除去コーティングの空孔内へ拡散するように構成される蛍光標識した分子と、除去コーティングの基質側に、プラズモン結合発光励起を産生するように構成される励起光源をさらに含むことができる。
【０００７】
さらに別の実施形態は、概して、ルミネセンス検出システムに関する。システムは、共鳴性光キャビティを含み、発光団の放射は、共鳴性光キャビティの境界で確立されるエバネッセント励起によって誘発される。
【０００８】
実施形態の種々の特徴は、付随の図面と関連して考慮される際に、続く発明を実施するための最良の形態を参照の上、より良く理解されるようになるのと同じように、より完全に説明されることができる。
【０００９】
当業者には、本願に描写する図面は一般化した略図を表し、他の構成要素を追加してもよく、あるいは既存の構成要素を除去または修正してもよいことは、容易に明らかとなるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、実施形態により、励起装置の側面図を図示する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図２】図２は、図１に示す励起装置の部分の上面図を図示する。
【図３Ａ】図３Ａは、実施形態により、別の励起装置の側面図を図示する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示す励起装置内の、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図４】図４は、さらに別の実施形態による、図３Ａに示す励起装置の上面図を図示する。
【図５Ａ】図５Ａは、さらに別の実施形態による、量子励起装置を図示する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示す励起装置内の、励起帯のより詳細な図を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、量子ドット周辺のエネルギ移動帯を描写する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、多重量子ドットの例示的実施形態を図示する。
【図７Ａ】図７は、放射および励起の統計データによる、ローダミン６Ｇおよび量子の色素の比較を描写する。
【図７Ｂ】図７は、放射および励起の統計データによる、ローダミン６Ｇおよび量子の色素の比較を描写する。
【図８】図８は、いくつかの市販の量子ドットに対する放射の統計データを描写する。
【図９】図９は、量子ドットへの表面付着のための、三官能性試薬のための過程を描写する。
【図１０】図１０は、量子ドット含有単一ポリメラーゼ、単一ビオチンの合成過程を描写する。
【図１１Ａ】図１１Ａは、さらに別の実施形態による、クレッチマン配置を描写する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、さらに別の実施形態による、別のＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、さらに別の実施形態による、さらに別のＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、さらに別の実施形態による、逆クレッチマンシステムを図示する。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、例示的反射および反射屈折レンズを図示する。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、さらに別実施形態による、さらに別の例示的ＳＰＣＥシステムを図示する。
【図１２】図１２は、従来の共鳴性レーザーキャビティを描写する。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図１４】図１４は、本発明の実施形態による、システムを図示する。
【図１５】図１５は、共振器キャビティ励起装置の種々の実施形態を図示する。
【図１６】図１６は、共振器キャビティ励起装置の種々の実施形態における、光線の角度を図示する。
【図１７】図１７は、さらに別の実施形態による、システムを図示する。
【図１８】図１８は、さらに別の実施形態による、システムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
平易さおよび説明の目的のため、本発明の原則は、主にその例示的実施形態に言及することによって説明される。しかしながら、当業者は、同一の原則は、全ての型のアッセイシステムにおいて平等に適用可能であり、実装されることができ、一部かかる変形は、本発明の真の精神および範囲から逸脱しないことは、容易に理解するであろう。さらに、続く本発明を実施するための最良の形態では、特定の実施形態を図示する付随の図面を参照する。電気的、機械的、論理的、および構造的変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、実施形態に対して行われてもよい。続く本発明を実施するための最良の形態は、それゆえ、限定的意味に取られることはなく、本発明の範囲は、添付の請求項およびその同等物によって定義される。
【００１２】
本発明の広い範囲を説明する数値的範囲およびパラメータが、近似であるものの、特定の例を説明する数値的値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、一部数値的値も、本質的に、それぞれの検査測定で発見された標準偏差の結果必ず起こる、ある一定の誤差を包含する。さらに、本願で開示される全範囲は、その中に包含される、一部および全ての部分的範囲を網羅することは理解されるものとする。例えば、「１０未満」という範囲は、最小値のゼロと、最大値の１０との間の一部および全ての部分的範囲、すなわち、ゼロと等しいか、またはゼロより大きい最小値、および１０と等しいか、または１０未満の最大値を有する、例えば、１から５等、一部および全ての部分的範囲を含むことができる。
【００１３】
一実施形態は、概して、単分子事象を検出するためのシステムおよび方法に関する。より具体的には、内部反射を使用して、光が流体に入るのを防止する励起装置である。励起装置は、基質およびコーティングを含むことができる。基質は、融合シリカ、ガラス、および／または結晶材料等、透明材料であることができる。コーティングは、基質に適用されることができる。コーティングは、透明、半不透明、または不透明であることができ、基質よりより低い屈折率を有するはずである。微視的空孔は、コーティング内で実装されることができる。検体の流体は、励起装置上に置かれることができる。例えば、選択された周波数のレーザといった、励起光源は基質内へ向けられ、内部全反射（ＴＩＲ）によって、微視的空孔内のコーティングおよび流体に反射する。この反射は、コーティング内へ延在するエバネッセント波、およびそのそれぞれの空孔を生成する。このエバネッセント波の強度は、基質表面から迅速に減衰する。いくつかの例では、望ましい場所、通常微視的空孔内以外では、分子が励起光から除外されるため、コーティングは、除去コーティングと呼ぶことができる。
【００１４】
したがって、このエバネッセント波励起は、励起装置の基質の近くにある検体流体を照射のみすることができる。エバネッセント波強度は、基質表面から迅速に減衰するため、コーティングは、検体流体、すなわち、色素分子が、検体流体が基質の近くにある空孔の底にある以外、励起に達するのを妨害する障害を形成することができる。さらに、コーティングが透明である場合、光は、基質表面の上、下、または両側から収集されてもよい。検出領域における基質表面は、優先的に平面であるが、画像処理に有利な場合は、非平面であり得る。非平面の基質表面の例は、多層で実装される基質であることができ、層は、屈折のそれぞれおよび適切な指標を有する、異なる材料であることができる。
【００１５】
他の実施形態は、概して、エネルギ移動帯を生成し、「有用な」励起帯を、励起光変換器の近くにある、より小さな帯に置く方法を包含し、励起光変換器は基質に化学的に付着する。より具体的には、実施形態は、光を吸収し、着目標識部分へ移す励起光変換器として、少なくとも１つの量子ドットを含んでもよい。エネルギの転移は、波長シフトに関与することができる。標識部分は、その後、通常は、より長い波長で放射するであろう。他の実施形態では、異なる大きさの量子ドットは、異なる波長に対して使用することができる。
【００１６】
２光子励起に関与する他の実施形態では、光は、励起波長より短い波長で放射することができる。これは、通常パルスレーザ励起によって行われ、２光子が短時間で、蛍光標識を励起することができることを確実にする。放射光が、励起より短い波長であるため、バックグラウンドが通常、励起より長い波長である際、選別によってバックグラウンドを拒絶するのはより簡単である。色素分子によって放射される光子の蛍光の波長は、通常は、蛍光放射を誘発した励起光子の波長より、長い波長である。
【００１７】
２光子励起は、標準フルオロフォアを利用してもよいか、または上方変換する蛍光体を利用してもよいかのいずれかである。上方変換する蛍光体は、希土類酸化物を含む、混合金属酸化物ナノ粉末から成る。Ｙ２Ｏ３：Ｙｂ，Ｅｒ，Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，Ｅｒ，Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，ＨＯ，およびＹ２Ｏ２Ｓ：Ｙｂ，Ｔｍ，ランタニド化合物は、文献からの例である。量子ドットまたは標準フルオロフォアとは違い、放射光は、励起光の波長より短い波長であり、それゆえ、２光子フルオロフォア励起に対して前に記載した利点を有する一方、量子ドットの狭い放射帯および光安定性を保持する。上方変換する蛍光体は、２０ｎｍと同じくらい小さな粉末を含む、種々の大きさで作られることができる。そのようなものとして、上方変換する蛍光体は、量子ドットの様式と類似の様式で使用することができ、それゆえ、用語量子ドットがこれ以後使用されるいずれの場所でも、量子ドットと記載される以外は、上方変換する蛍光体をも指す場合がある。
【００１８】
２光子励起に対するエネルギ転移は、誘起される双極子間相互作用を介して、非放射で生じることができる。代替的に、エネルギ転移は、放射結合によって生じることができる。しかしながら、放射結合は双極子間相互作用に対し、１／Ｒ２対１／Ｒ６下がるので、放射結合は、より大きな励起帯という結果を生じ得る。さらに、放射結合は、拒絶または選別される必要がある光を放射することができる。放射波長におけるこのシフトにより、検出の間、フィルタが両励起源を遮断することを可能にする。フィルタの遮断は、一部の過程の間に除去され、標的位置の決定を可能とすることができる。
【００１９】
量子ドットが、ドットの大きさに依存する波長を産生するので、量子ドットは、望ましい第２の励起を提供するように作られることができる。さらに、量子ドットは、ＦＲＥＴ色素より狭いスペクトル放射、より短いスペクトル尾、およびより幅広い吸収帯を有することができる。
【００２０】
図１Ａは、実施形態による、励起装置１００の側面図を図示する。図１に示すように、励起装置１００は、基質１０５および除去コーティング１１０を含むことができる。いくつかの実施形態では、基質１０５および除去コーティング１１０は、バックグラウンド雑音を最小にする低い蛍光特性を有する材料で、実装されることができる。他の実施形態では、基質１０５は、融合シリカ（ｎ＝１．４７）、結晶石英（ｎ＝１．５４３）、あるいは他の型の低い蛍光ガラス、プラスチック、またはその組み合わせにさらに特定化することができる。
【００２１】
さらに別の実施形態では、基質１０５は、Ｔａ２Ｏ５（ｎ＝２．１）またはＴｉＯ２（ｎ＝２．５−２．９）等、高い屈折率の材料で実装されることができる。基質１０５における高屈折率の材料の使用は、励起光伝播に対して光導波層を促進することができる。光は、図３ＡＢに関して後に記載するような、プリズムまたは格子を使用して、光導波層内へ共役することができる。除去コーティング１０５は、この光導波層に堆積されることができる。さらに、コーティングおよび流体の率が、基質未満でなくてはならない際、高屈折率基質は、より多くの除去コーティング１１０の選択肢を可能とすることができる。種々の他の実施形態では、材料に対する屈折率における急速な変化が、エバネッセント波侵入深さ１４０を減少するので、エバネッセント波は、必要な除去コーティング厚を減少させるために、より速く落ちることができる。
【００２２】
除去コーティング１１０の実装は、基質１０５または光導波層３３０の率に依存し得る。より詳細には、高屈折率基質に対しては、多くのより低率材料が、選択されてもよい。例えば、ＰＭＭＡ（ｎ＝１．４９１）、ポリカーボネート（ｎ＝１．５８６）、環状ポリオレフィン（ｎ＝１．５２５）、および他の類似材料は、除去コーティングとして選択されることができる。いくつかの実施形態では、基質１０５より低い率を有する、ＭｇＦ２等の光学的除去コーティングまたはＳｉＯ２等のガラスもまた、使用されることができる。さらに別の実施形態では、除去コーティング１１０は、融合シリカ（ｎ＝１．４７）、テフロン（登録商標）ＦＥＰ（ｎ＝１．３４１〜１．３４７）、テフロン（登録商標）ＡＦ（ｎ＝１．３２）、ＭｇＦ２（ｎ＝１．３８）を使用して、実装されることができる。
【００２３】
除去コーティング１１０は、透明または不透明であることができる。除去コーティング１１０はまた、部分的に吸収、反射、または選択的に反射性があることができる。不透明な除去コーティング、および他の型の除去コーティングでの実施形態に対しては、空孔外側の試料からの望ましくない光は、減弱される。除去コーティング１１０または基質１０５が適切に形成されず、検体流体内の遠方にまで励起光１３５が漏れすぎ、試料１２０に到達する結果となる場合、望ましくない光が生じ得る。透明な除去コーティングでの実施形態に対しては、放射は、検体流体試料１２０と調和する側、基質側、または同時に両側から収集されることができる。これはまた、多層構造でも可能である。
【００２４】
空孔（または溝、通路、ウェル等）１１５は、除去コーティング１１０内に形成され、検体流体試料１２０が、基質１０５との調和を可能とすることができる。いくつかの実施形態では、検体流体試料１２０は、３リン酸塩、すなわちｄＮＴＰ上に、非蛍光消光剤１２５を有する色素標識したヌクレオチドを含有することができる。非蛍光消光剤１２５を３リン酸塩上に置くことで、遊離ヌクレオチドを消光する。ＤＮＡ鎖に組み入れる際、消光剤は切断され、蛍光色素が、全ての他の遊離ヌクレオチドが薄暗い場所を照らし出す。除去コーティング１１０は、空孔１１５または空孔１１５のパターンによって画定される望ましい場所を除き、分子を励起光から除外するように構成されることができる。それゆえ、励起光は、空孔１１５の底で、蛍光分子を効率的に励起のみすることができる。
【００２５】
ある一部の実施形態に対しては、空孔１１５の量は、拡散事象からバックグラウンド雑音を制御するのに十分小さくすることができる。例えば、標準濃度の蛍光標識したヌクレオチドは、直径３０〜１５０ｎｍの間の大きさ、またはそれより大きい空孔１１５で達成することができる。標識したｄＮＴＰがより低濃度の場合、より大きな空孔の使用を可能とすることができる。
【００２６】
空孔１１５は、図１Ａの側面図に描写されているが、当業者には、空孔１１５の形は、円形、四角形、楕円形、または任意の他の３次元形状であってもよいことは、容易に明らかとなるはずである。いくつかの他の実施形態では、空孔１１５は、先細りまたは曲線の側部等、非垂直側部を有してもよい。多層構造を使用する除去層実装に対しては、空孔１１５は、大きな空孔を生成し、別の除去層を再適用し、それゆえ小さな空孔を生成することによって構成されることができる。空孔１１５を生成する他の方法は、当業者には既知である。
【００２７】
励起装置１００は、検体流体試料１２０と接触することができる。検体流体試料１２０は、色素、ヌクレオチド、および他の材料（例えば、３リン酸塩１２５上の色素標識したヌクレオチドの非蛍光消光剤）を包含することができる。励起の間、内部反射ＴＩＲが、基質１０５／コーティング１１０または基質１０５／流体１２０の界面で生じるように、光源１３０は、基質１０５内へ向けられる励起光１３５を提供することができる。光１３５を内部へ反射する際、細いエバネッセント波１４０は、低率層、すなわち、除去コーティング１１０内に生成される。
【００２８】
図１Ｂは、別の実施形態による、励起帯１４５内にある１つの空孔の断面を描写している。図１Ｂに示すように、励起波１４０は、励起光１３５のＴＩＲから生成される。エバネッセント波１４０の輝度は、ゼロに向かい表面から離れて、指数関数的に落ちるため、区域１４５は、空孔１１５の底の基質１０５近傍にある、有意なエネルギの帯を表す。ＴＩＲはまた、基質の非試料側に光を反射させるために使用され、励起光１３５を再使用することができる。エバネッセント波１４０により、検体流体試料１２０内の分子が、例えば、分子１５０の蛍光を発するようにすることができる。小さな励起帯１４５は、エバネッセント波１４０によって効率的に励起され、および試料１２０と流体接触する両方である領域である。
【００２９】
図２は、図１Ａに示す励起装置１００の一部の上面図（すなわち、流体側面図）を図示する。図２に示すように、除去コーティング１１０は、空孔１１５を除き、基質（図示せず）を被覆することができる。空孔１１５の底内へ遊走する蛍光分子は、励起帯１４５（図１Ｂ参照）に入り、蛍光１１５Ａを放射することができる。
【００３０】
図３Ａは、実施形態による、励起装置３００の側面図を図示する。図３Ａに示すように、励起装置３００は、励起装置１００に類似している。励起装置３００は、基質３０５、および空孔３１５を有する除去コーティング３１０を含むことができる。励起装置３００は、３リン酸塩３２５上に非蛍光消光剤で蛍光標識したヌクレオチドを含むことができる、検体流体試料３２０と接触してもよい。基質３０５、除去コーティング３１０、空孔３１５、および検体流体試料３２０は、励起装置１００のそれぞれの成分に類似または同一の性質／特性を有する。
【００３１】
励起装置３００は、光導波層３３０を含むことができる。光導波層３３０は、前に記載した通り、高屈折率の材料を使用して実装されることができる。光源３３５からの光３４０は、米国特許第５，８８２，４７２号に記載の通り、プリズムまたは格子を介して、光導波層３３０内へ共役されることができ、同号は、その全体を参照することで、本願に援用される。
【００３２】
励起の間、内部全反射ＴＩＲが、光導波層３３０／除去コーティング３１０、および光導波層３３０／流体３２０の界面で生じるように、光源３３５は、光導波層３３０内へ向けられる光３４０を提供することができる。光を内部へ反射する際、細いエバネッセント波３４５は、低屈折率層内、すなわち、除去コーティング３１０および流体内で生成される。エバネッセント波により、光導波層３３０近傍にある検体流体試料３２０内の分子が、例えば、分子３５５の蛍光を発する。
【００３３】
図３Ｂは、別の実施形態による、エバネッセント波３４５内にある１つの空孔の断面を描写する。図３Ｂに示すように、エバネッセント波３４５は、光導波層３３０内で励起光３４０のＴＩＲから生成される。エバネッセント波３４５の強度は、境界から離れるように移動して、ゼロに向かい指数関数的に落ちるので、区域３５０は、空孔３１５の底にある光導波層３３０近傍の、有意なエネルギの帯を表す。ＴＩＲはまた、光を光導波層３３０の非試料側に反射するために使用され、励起光３４０を再使用することができる。エバネッセント波３４５により、光導波層３３０近傍にある検体流体試料３２０内の分子が、例えば、分子３５５の蛍光を発することができる。小さな励起帯３５０は、エバネッセント波３４５によって励起され、および試料３２０と流体接触する両方である領域である。
【００３４】
図４は、さらに別の実施形態による、図３Ａに示す励起装置３００の上面図を図示する。図４に示すように、除去コーティング３１０は、空孔３１５を除き、光導波層３３０（図示せず）を被覆することができる。空孔３１５の底へ遊走する蛍光分子は、励起帯３５０（図３Ｂ参照）に入り、蛍光３１５Ａを放射することができる。
【００３５】
図５Ａは、さらに別の実施形態による、量子励起装置５００を図示する。図５Ａに示すように、量子励起装置５００は、励起装置１００に類似している。量子励起装置５００は、基質５０５、および空孔５１５を有する除去コーティング５１０を含むことができる。基質５０５および除去コーティング５１０は、図１Ａ〜４に関して前に記載した通りの材料で、実装されることができる。さらに、除去コーティング５１０の屈折率は、基質５０５未満である。
【００３６】
量子励起装置５００は、３リン酸塩５２５上に非蛍光消光剤で蛍光標識したヌクレオチドを含むことができる、検体流体試料５２０と接触することができる。基質５０５、除去コーティング５１０、空孔５１５、および検体流体試料５２０は、励起装置１００のそれぞれの成分に類似および／または同一の性質／特性を有する。量子励起装置５００はまた、光源５３０を含むことができる。光源５３０からの光５３５は、基質５０５に共役されることができる。励起装置３００（図３ＡＢ参照）と同様に、励起装置５００は、他の実施形態の光導波層３３０に類似する光導波層で実装されることができる。
【００３７】
量子励起装置５００は、少なくとも１つの量子ドット５４０を含むことができる。量子ドットは、伝導帯電子、価電子帯空孔、または励起子（伝導帯電子と価電子帯空孔との組を結合）の動きを、全ての３空間方向に限局する半導体ナノ構造であることができる。量子ドットは、ケイ素およびゲルマニウムと、おそらく他の材料と、ＣｄＳｅと、から成る構造を含むことができる。量子ドットはまた、例えば、コア内のＣｄＳｅ、およびシェル内のＺｎＳを有するコアシェル構造として、製作されることができる。他の型の材料は、量子ドットを生成するために使用されることが可能であり、請求する発明の精神および範囲に含まれ得ることは、容易に明らかとなるはずである。
【００３８】
他の実施形態は、異なる大きさおよび／または型の多重量子ドットを使用することができる。励起相の間、量子ドット５４０は、エネルギ移動帯を生成することができる。より詳細には、ＴＩＲが、基質５０５／除去コーティング５１０、および基質５０５／流体５２０の界面で生じるように、光源５３０は、基質５０５内へ向けられる光５３５を提供することができる。光５３５を内部へ反射する際、細いエバネッセント波５４５は、より低い屈折率層、すなわち、除去コーティング５１０内で生成される。エバネッセント波５４５は、エバネッセント波５４５の急速な減衰のため、小さな励起帯５５０（図５Ｂ参照）を生成することができる。量子ドット５４０は、励起エネルギを望ましい波長へ変換する小さな励起帯５５０で、エネルギを吸収することができる。変換過程は、図６Ａに描写されている量子ドット５４０の周りに、エネルギ移動帯を生成することができる。
【００３９】
図６Ａに示すように、移動帯６０５内のエネルギは、標識部分、すなわち、励起された色素標識したヌクレオチド６１０へ移動されることができる。色素標識したヌクレオチド６１０は、酵素６１５によって、量子ドット５４０に付着していることができる。いくつかの実施形態では、異なる型および／または大きさの多重量子ドットは、図６Ｂに図示されるいくつかの励起波長を有するために使用されることができる。
【００４０】
図６Ｂに示すように、量子ドット１（「Ｑ１」と標識）６５０は、周囲のエネルギ移動帯６５５を生成してもよい。量子ドット２（「Ｑ２」と標識）６６０はまた、周囲のエネルギ移動帯６６５を生成してもよい。エネルギ帯６５５、６６５は、励起エネルギの存在によって生成されてもよい。量子ドット６５０および６６０は異なる大きさから成り、異なる型から成っていてもよいため、両方は、いくつかの波長を産生するために使用されることができる。図６Ａに示す実施形態のように、色素標識したヌクレオチド６１０は、少なくとも１つの酵素６１５によって、量子ドット６５０、６６０に付着していることができる。
【００４１】
図５Ａを参照すると、量子励起装置はまた、量子ドットからの放射の型を同定するように構成される、検出器５５０を含む。検出された放射は、それから、放射に対応する分子が同定され、その同定が保存される際、コンピュータ（図示せず）へ向けられる。
【００４２】
図７は、ＣｄＳｅ量子ドットとローダミン６Ｇ色素との間の、（ａ）励起および（ｂ）放射の統計データの比較７００を描写する。量子ドット放射スペクトル（（ｂ）内）はほぼ対照的であり、ピーク幅はより狭い。しかしながら、励起曲線は、広く継続的である。それゆえ、量子ドットは、５３０ｎｍより短い波長によって効率的に励起させることができる。一方、有機色素ローダミン６Ｇは、励起波長選択を制限する励起のピークを有する。
【００４３】
図８は、いくつかの市販の量子ドットに対する放射曲線８００を描写する。図８に示すように、市販の試料から伝播する波長は、合理的とみなすことができる。したがって、慎重な選択および／または製作により、さらにより緊密な分布を可能とすることができることと予測される。
【００４４】
図６Ａに戻ると、量子ドット５４０は、色素標識したヌクレオチド６１０および酵素６１５に付着して、描写されている。理想的には、単一酵素６１５は単一量子ドット５４０に付着し、付着した組は、それから基質５０５に付着する。量子励起装置５００では、各励起帯に単一部分を有することが、さらに望ましい。標準のポアソン分布が生成される場合、ウェルにある各部分、および付着した組のうちのたった一つを得る可能性は低い。良くても、０．３７２（１４パーセント）までであろうが、通常は、１０パーセント代の可能性がより高い。この有用な低濃度は、システムの効果的な処理量を減少させ得る。
【００４５】
従来の戦略の１つは、正しい組の数を充実させることである。例えば、解決法の１つは、大部分の分子が１組の一部ではないように、薄い溶液を使用して、付着化学反応を行うことである。低濃度のため、それぞれのうちの１つより多くを有する成分はほとんどない。次いで、この溶液は、当業者には既知である、選別（蛍光活性化細胞選別装置を使用する等）、またはストレプトアビジン−ビオチン等の化学的フックを使用する引き抜きによって、濃縮されることができる。
【００４６】
量子励起装置の実施形態は、３つの付着部位を有するリンカー分子を使用することができる。図９は、量子ドット５４０への表面付着のための、三官能性試薬に対する過程９００を描写する。図１０は、単一ポリメラーゼ、単一ビオチンを含有する量子ドット５４０の合成の過程１０００を描写する。
【００４７】
図９〜１０の過程を通して、少なくとも１つのシスチンを含有する酵素は、反応を完了へと駆動することで、各マレイミド含有量子ドットに付着することができる。それゆえ、単一フックビオチンを付着する各量子ドットは、単一酵素を有するであろう。これは、基質５０５に付着することができる。他の実施形態では、ウェルは、２００５年６月１０日に出願した「Ｍｏｔｈｏｄ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ」の米国仮出願第６０／６８９，６９２号に記載される通り、多重ストレプトアビジンを含むことができ、同号は、その全体を参照することで本願に援用される。
【００４８】
したがって、量子励起装置の実施形態は、従来のシステムに関していくつかの利点を提供することができる。例えば、励起装置内の量子ドットは、単一システムにおける、減弱の複数の方法を提供することができる。別の利点は、励起のエバネッセント層は、ＴＩＲを使用して、略１００ｎｍの厚さであることである。これにより、Ｚ軸で励起光を制限することで、励起帯を減少する。さらに、励起源は、着目部分を弱く励起する波長であることができる。例えば、４０５ｎｍの波長は、図７に示すローダミン６Ｇ色素を弱く励起するであろうが、量子ドットは、これらのより短い波長で良く励起される。この幅広い吸収範囲はまた、異なる励起源の使用を可能とする。例えば、４０５ｎｍレーザ（高解像度ＤＶＤプレーヤに使用）は、従来の蛍光励起に使用される４８８ｎｍレーザよりさらに安価である。
【００４９】
実施形態のさらに別の利点は、量子ドットまたは他の寿命の長い供与体が、第２の励起帯を生成することである。これにより、全ての方向における源の数が制限される。組み込まれた、または結合されたヌクレオチドは、量子ドットの非常に近傍にある場合、高水準の効率的に吸収された光に見える。効率的なエネルギ転移距離は約５ｎｍであるため、これにより小規模の励起帯が生成される。
【００５０】
さらに別の利点は、エネルギ移動帯（図６Ａの６０５参照）内へ拡散する遊離ヌクレオチドが、通常、極度に小さな励起量のおかげで、非常に迅速に出ることである。遊離ヌクレオチドがエネルギ移動帯に出入りする時間は、酵素がヌクレオチドを組み込む時間よりさらに短い。これにより、単一光子包含とは対照的に、蓄積された信号（例えば、ＣＣＤ検出を介して）に基づき、部分決定が改良される。
【００５１】
２光子励起を使用する別の実施形態は、バックグラウンド雑音を減少するために使用されることができる。２光子励起では、光の放射は、励起光より短い波長で行われる。２光子放射は、高励起水準が存在する場合にのみ産生される。任意のバックグラウンド蛍光は、励起源より長い波長で行われ、ショートパスフィルタまたはバンドパスフィルタ等のフィルタを使用して、簡単に除去される。
【００５２】
別の実施形態は、ＴＩＲの代替物を使用することができる。これらの実施形態は、表面プラズモン結合の方向放射（「ＳＰＣＥ」）を使用する。ＳＰＣＥは、金属表面で表面プラズモン波によって励起された、色素分子の角度放射曲線を含むことができ、それは第ＷＯ２００５／００３７４３号に記載されている。第ＷＯ２００５／００３７４３号の全体は、参照することにより本願に援用される。ＳＰＣＥ技術は、図１１Ａ〜Ｄに描写する、ゼプトリットル励起量で改良された励起および収集を提供することを、前に記載した励起装置の実施形態と組み合わせることができる。
【００５３】
図１１Ａは、クレッチマン配置システム１１００Ａの例示的実施形態を図示する。この配置では、蛍光分子からのエネルギは、金属表面の他方側の光として放射される。バックグラウンドは抑制されることができ、励起および放射効率の両方を、著しく改良することができる。蛍光分子が金属表面に近すぎる（＜２０ｎｍ）場合、それからエネルギは消光される。スペーサ層は、かかる密接な接触を防止するために使用されることができる。スペーサ層は、ＳｉＯ２等、低蛍光を有する誘電性材料であることができる。
【００５４】
ＳＰＣＥ技術は、ＴＩＲシステムに関していくつかの利点を提供することができる。例えば、エバネッセント波が、低屈折率の材料への移行によって生成されないため、除去コーティングに対する選択はより大きい。加えて、放射された光の方向性の本質により、収集光学を単純化し、バックグラウンド拒絶を改良することができる。最終的には、金属への近接は、光安定性を増加することを示しており、単分子適用には特に重要である。
【００５５】
図１１Ｂは、ＳＰＣＥシステム１１００Ｂの別の実施形態を図示する。図１１Ｂに示すように、励起装置は、金属層１１１５Ｂと調和する基質１１１０Ｂ、および除去コーティング１１２０Ｂを含むことができる。基質１１１０Ｂおよび除去コーティング１１２０Ｂは、前に記載したような材料および技術で実装されることができる。金属層１１１５Ｂは、金、銀、あるいは５〜７５ｎｍ以上、好ましくは金に対しては２５〜３０ｎｍ、および銀に対しては５０ｎｍの厚さを有する、ＳＰＣＥに対して適切な他の金属で実装されることができる。加えて、クロム等の別の金属は、接着を改良するために、基質に適用されてもよいが、一方、引き続き適用されるより厚い層の反射率に干渉せず、この層は、２から５ｎｍの間であると報告されている。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｂは、基質１１１０Ｂからの率において著しい変化を有する、非金属材料であることもできる。
【００５６】
除去コーティング１１２０Ｂは、金属層１１１５Ｂの片側に堆積されるか、または伸ばされることができる。除去コーティング１１２０Ｂは、図１Ａ〜４に関して前に記載した通り、高屈折率の材料（例えば、融合シリカ、ポリカーボネート）で実装されることができる。空孔（通路、溝等）１１２５Ｂは、検体溶液１１３０Ｂに対して、除去コーティング１１２０Ｂ内に形成され、金属層１１１５Ｂに接触することができる。いくつかの他の実施形態のように、色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）は、空孔１１２５Ｂの底へ遊走することができる。
【００５７】
ＳＰＣＥシステム１１００Ｂはまた、不完全な球、半球、または他の類似の３次元形状として実装されるレンズ１１３５Ｂを含むことができる。レンズ１１３５Ｂは、無収差状態にあるように構成されることができ、すなわち、レンズ１１３５Ｂは球面収差またはコマを生成しない。レンズ１１３５Ｂは、必要とされる鋭い角度で、出入りして光を共役することができる、率が適合する流体１１４０Ｂを介して、基質１１１０Ｂと調和するように構成されることができる。いくつかの実施形態では、励起源１１４５Ｂは、単一周波数で、または本実施形態の場合、４８８ｎｍおよび５３２ｎｍ等の多重周波数で、作動することができる。
【００５８】
したがって、励起源１１４５Ｂからの光が、基質１１１０Ｂに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｂおよび基質１１１０Ｂの界面で励起される。表面プラズモンは表面に沿って伝播し、それ自体を電場として表す金属層１１１５Ｂの、表面上に結合される光線とみなすことができる。電場は、除去層１１２０Ｂおよび空孔１１２５Ｂ内へ延在し、金属表面から距離を取って急速に減衰する。電場の減衰に先駆けて、エネルギ移動帯は、図１Ｂの著しいエネルギ１４５の帯に類似して生成されることができる。このエネルギ移動帯内へ伝播されている色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）は、放射光１１５０Ｂの円錐体を形成するプラズモン結合発光によって、放射されることができる。
【００５９】
１１００Ｂのいくつかの実施形態では、除去コーティング１１２０Ｂは、内部全反射を支持しない、すなわち基質以上の率、すなわち、率が適合する流体１１４０Ｂと適合しない材料で実装されることができる。ＴＩＲが発生しないため、コーティングはより低くなることができるが、それが必要というわけではない。他の実施形態では、除去コーティング１１２０Ｂは、より少ない屈折率を有する材料で実装されることができる。材料は、当業者に既知であるような金属、または非透明材料であることができる。
【００６０】
図１１Ｃは、さらに別の実施形態による、別の例示的ＳＰＣＥシステム１１００Ｃを図示する。図１１Ｃに示すように、システム１１００Ｃは励起装置を含む。励起装置は、図１Ａおよび図３Ａに関して前に記載した通り、類似の材料で実装されることができる、基質１１１０Ｃを含むことができる。基質１１１０Ｃは、金属層１１１５Ｃと接触することができる。金属層１１１５Ｃは、本願の上記の通り、図１１Ｂの金属層１１１５Ｂに類似する材料で実装されることができる。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｃは、基質１１１０Ｃから率において著しい変化を有する、非金属材料であることができる。金属層１１１５Ｃおよび基質１１１０Ｃの界面は、ＳＰＣＥ励起のために使用されることができる。
【００６１】
スペーサ層１１２０Ｃは、金属層１１１５Ｃの片側に形成されることができる。スペーサ層１１２０Ｃは、１〜１００ｎｍ、および好ましくは５〜２５ｎｍ厚の範囲のＳｉＯ２で実装されることができる。金属コーティング１１２５Ｃは、スペーサ層１１２０Ｃの片側に形成されることができる。金属コーティング１１２５Ｃは、金、アルミニウム、チタン、または他の類似材料等の材料で実装されることができる。空孔１１３０Ｃは、金属コーティング１１２５Ｃ内に形成されることができ、流体１１４０Ｃ内の色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）１１３５Ｃは、空孔１１３０Ｃの底へ遊走できる、
したがって、励起源からの光が基質１１１０Ｃに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｃおよび基質１１１０Ｃの界面で励起される。表面プラズモンは、急速に減衰する空孔１１３０Ｃ内へ延在する、電磁場を生成することができる。エネルギ移動帯は、図１Ｂの著しいエネルギ１４５の帯に類似して、生成されることができる。このエネルギ移動帯内へ遊走した標識したヌクレオチド１１３５Ｃは、エネルギを与えられ、蛍光を発することができる。
【００６２】
さらに、厚い金属コーティング１１２５Ｃと色素の相互作用のおかげで、消光帯１１４５Ｃを生成することができる。消光帯１１４５Ｃは、略２０ｎｍであることができる。この帯内の任意の色素分子は、蛍光発色することを抑制される。
【００６３】
図１１Ｄは、ＳＰＣＥ用の逆クレッチマン励起システム１１００Ｄを図示する。バックグラウンドとして、逆クレッチマン（「ＲＫ」）は、ＳＰＣＥに対する従来のアプローチである。ＲＫでは、励起は試料側からであるが、放射は金属表面の他方側上で起こる。励起光は試料側に取り込まれる際、色素分子をその道に沿って励起する。表面から離れて多くの色素分子が存在し、金属が全ての光を遮断するのに十分なほど厚くないため、放射された光の一部は、金属表面を介して透過するだろう。これにより、高すぎるバックグラウンドが生じるであろう。さらに、励起光は、試料が表面近傍になる前に、試料を退色することができる。図１１Ｄに示す実施形態は、これらの問題を解決することができる。
【００６４】
図１１Ｄに示すように、励起システム１１００Ｄは、金属層１１１５Ｄと調和する基質１１１０Ｄを含むことができる励起装置１１０５Ｄと、スペーサ層１１２０Ｄとを含むことができる。基質１１１０Ｄ、金属層１１１５Ｄ、およびスペーサ層１１２０Ｄは、図１１Ａ〜Ｃに関して前に記載したような、材料および技術で実装されることができる。いくつかの実施形態では、金属層１１１５Ｄは、基質１１１０Ｄからの率において著しい変化を有する、非金属材料であることができる。スペーサ層１１２０Ｄは、検体溶液１１２５Ｄと接触することができる。量子ドット１１３０Ｄは、スペーサ層１１２０Ｄに結合されることができる。明瞭さのため、量子ドットは記載されているが、貴金属ナノドット（コロイド粒子）等、他の吸収体が使用されることができ得ることは理解されるものとする。
【００６５】
基質１１１０Ｄの片方は、率が適合する流体１１３５Ｄと接触することができる。レンズ１１４０Ｄは、基質１１１０Ｄ上で、率が適合する流体１１３５Ｄを網羅することができる。レンズ１１４０Ｄは、不完全な球、半球、または他の類似する３次元形状として実装されてもよい。レンズ１１４０Ｄは、無収差状態にあるように構成されることができ、すなわち、レンズ１１４０Ｄは球面収差を防止する。レンズ１１４０Ｄはまた、一般的に反射または反射屈折のレンズとして、および特にシュワルツシルト対物として実装されてもよい。中央反射システムの１次の鏡を貫通する必要な空孔、および２次の鏡による掩蔽は、多くの画像処理システムにとって制限である一方で、それらはクレッチマンシステムにとっては制限ではない。それらは１次の鏡内の空孔、および２次の鏡による掩蔽を備えるが、誘発された発光は、２つの鏡システムによって完全に収集することができる管状パターン内へ放射されるため、それらは制限ではない。例示的な反射１１９０Ｄおよび反射屈折の１１９５Ｄレンズは、図１１Ｅに示されている。システム１１００Ｄはまた、１次の励起バックグラウンド放射を遮断するように構成される開口部１１４５Ｄと、収集センサ（図示せず）からの量子ドット１３３０Ｄからのプラズモン放射とを含むことができる。
【００６６】
励起源（図示せず）からの光線１１５０Ｄ（例えば、上方変換する蛍光体に対して波長４０５ｎｍ、または９８０ｎｍ）は、低バックグラウンドを有する小さな放射帯を産生する、量子ドット１１３０Ｄを励起することができる。励起光を、色素放射および吸光度から、スペクトル的に非常に除去するため、励起光線１１５０Ｄは、容易に光学的に選別されることができ、色素は１次の放射光を不十分ではあるが吸収し、それによって、色素の光分解を減少させる。コロイド粒子１１３０Ｄ近傍の色素から放射される光は、光１１５５Ｄの円錐体内にある、基質１１１０Ｄ側の狭い角分布で、放射されることができる。光１１５５Ｄの円錐体は、効率的に収集され、選別され、それから電荷結合検出器等のセンサによって検出されることができる。励起光線１１６０Ｄの一部は、基質側１１１０Ｄへ透過することができるが、この光は、容易に収集領域から、遮断されるか、選別されるか、または離れた方に向かうことができる。
図１１Ｇは、さらに別の実施形態による、別の例示的ＳＰＣＥシステム１１００Ｆを図示する。図１１Ｆに示すように、システム１１００Ｆは励起装置を含む。励起装置は、図１Ａおよび図３Ａに関して先に記載した通り、類似の材料で実装されることができる、基質１１１０Ｆを含むことができる。基質１１１０Ｆは、薄い金属層１１１５Ｆと接触することができる。金属層１１１５Ｆは、略２５〜５０ナノメートルの厚みを有し、本願上記の図１１Ｂの金属層１１１５Ｂに類似する材料で実装されることができる。第２の金属層１１２０Ｆは、金属層１１１５Ｆの上に堆積されることができる。第２の金属層１１２０Ｆは、略１００ｎｍの厚みであり、金属層１１１５Ｆまたは異なる金属に類似する材料で実装されることができる。第２の金属層１１２０Ｆの厚みは、一部表面プラズモンの共役を防止し、表面プラズモンを反射する。したがって、金属層１１１５Ｆおよび基質１１１０Ｆの界面は、ＳＰＣＥ励起のために使用されることができる。第１の金属は純粋であることができるか、または合金が提供するプラズモンは支持される。第２の層の追加により、表面プラズモンは支持されるべきではない（すなわち、同一金属より厚い層であることができるか、または異なる金属または合金であることができる）。
【００６７】
空孔１１３０Ｆは、流体１１４０Ｆ内の色素分子（例えば、標識したヌクレオチド）１１３５Ｆが、空孔１１３０Ｆの底へ遊走することができる、第２の金属層１１２０Ｆ内に形成されることはできる。空孔は任意の大きさであることができ、より小さな空孔が、より速い速度論に対してより高濃度を可能とする。大きさは、１０００ｎｍ未満、好ましくは２００ｎｍ未満、さらにより好ましくは、１００ｎｍ未満の場合がある。
【００６８】
従って、励起源からの光が基質１１１０Ｆに衝突する際、表面プラズモンは、金属層１１１５Ｆおよび基質１１１０Ｆの界面で励起される。表面プラズモンは、急速に減衰する空孔１１３０Ｆ内へ延在する、電場を生成することができる。このエネルギ移動帯内へ遊走されている、標識したヌクレオチド１１３５Ｆは、エネルギが与えられ、蛍光を発することができる。
【００６９】
さらに、消光１１４５Ｆの帯は、第２の金属層１１２０Ｆと色素の相互作用のおかげで、生成されることができる。消光１１４５Ｅの帯は、略２０ｎｍであることができる。この帯内の任意の色素分子は、蛍光を発するのを抑制される。
【００７０】
図１Ａおよび３Ａを参照すると、それぞれの光源（１３０および３３５）は、概して、選択された波長での励起エネルギの源として説明することができる。従来のシステムでは、光源は、図１２に描写する通り、共振器キャビティレーザであってもよい。図１２に示すように、共振器キャビティレーザ１２００は、高反射性の鏡１２０５を含む。キャビティ１２１０内では、レーザポンプ１２１５、例えば、アルゴンイオンレーザポンプは、出力カプラ１２２０を貫通して通過することができるまで、鏡１２０５の間で反射される、選択された波長を産生してもよい。
【００７１】
従来の共振器キャビティレーザは、弱点および不都合を有する。例えば、共振器キャビティレーザも外側のレーザ出力は、共振器キャビティの内側より、略１００倍少ない。したがって、さらなる実施形態は、概して、蛍光産生の増加に関する。より詳細には、実施形態は、キャビティの実質的な外側のビームの励起場振幅よりむしろ、フルオロフォアが、キャビティ内に存在するのに匹敵する励起場振幅に曝されるように、共振器キャビティと連通してフルオロフォアを置くことによって、光学過程を増強することができる。他の実施形態では、レーザ出力の効率的使用が、図１３に描写した通り、キャビティ鏡等の励起装置１３２０を使用することによって、シリカ基質上のレーザの波長より小さい寸法および高さを有する空孔を備える除去コーティング、または金属コーティングで実装される励起装置の、実施形態の空孔内に置かれる、フルオロフォアを励起している場合がある。
【００７２】
図１３は、本発明の実施形態による、システム１３００を図示する。図１３に示すように、システム１３００は、高反射性の鏡１３０５Ａ、および１３０５Ｂを含むことができる。光源１３１５は、共鳴性キャビティ１３１０の内部に設置されることができる。レーザ共鳴性キャビティ内部に位置付けられるのは、基質１３２０、例えば、図１に示す基質１０５であることができる。共鳴性ビームがキャビティ内を循環する間、エバネッセント波が、除去層の空孔を貫入するフルオロフォアを励起できるように、基質１０５は、例えば、ＴＩＲによって、除去層界面で光を効率的に反射するように構成されるべきである。厳密に言えば、ＴＩＲ表面が共振器の境界のうちの１つを備えるため、フルオロフォアはキャビティの外側にある。しかし、界面を越えてナノメートル延在する、キャビティ内ビームのエバネッセント成分がある。
【００７３】
図１４は、本発明の実施形態による、システム１４００を図示する。図１４に示すように、システム１４００は、外部レーザ１４１０を介する、励起装置１４２０上の発光団の励起を描写する。システム１４００は、高反射性の鏡１４０５を含むことができる。外部レーザ１４１０は、鏡１４０５によって画定される共鳴性キャビティ内へ向けられる選択される周波数で、干渉性光エネルギを産生してもよい。能動型キャビティ整合装置１４１４は、共鳴に必要なキャビティ長および整合を、確立し維持する。共鳴により、高い磁場をキャビティ内に築き上げることができる。励起装置１４２０の基質は、エバネッセント波が、除去コーティングの空孔内へ遊走する蛍光標識したｄＮＴＰを励起することができるように、共鳴性キャビティと効率的に調和するように構成されることができる。干渉性光エネルギの進路は、第２の高反射性の鏡１４０５Ｂを反射することができ、それから励起装置１４２０に向かって反射し返される場合もある。
【００７４】
図１５Ａ〜Ｄは、共振器キャビティ励起装置１５００の種々の実施形態を描写する。図１５Ａ〜Ｃに示すように、基質１５０５は、水性発光検体１５１０と調和することができる。界面は、ＴＩＲ界面１５２５を構成することができる。１５１５の共振器キャビティは、高反射性の鏡１５２０およびＴＩＲ界面１５２５によって結合される。光の進路１５３０は、基質１５０５への光線の種々の角度を表す。明瞭さのため、空孔またはウェルは省略されている。注目すべきは、ウェルは実際の装置で省略されてもよく、図１５Ａ〜Ｄに描写される装置はさらに機能するであろうことである。例えば、界面の流体側に混成配列のパターン形成をし、共鳴性キャビティ増強を使用することができ得る。いくつかの実施形態では、基質は、少なくとも１片の反射材料を意味することができる。図１５Ａ〜Ｄに示す実施形態に対して、１片のガラスが描写される。好ましくは、プリズムまたはレンズと光学的に接触するガラスの非常に薄い層を有し、薄い層の片側に接触する流体を有するであろう。
【００７５】
図１５Ａは、図１６Ａ〜Ｂにより詳細に描写されるブルースター角で、光線がプリズムに入る共振器キャビティを描写する。図１６Ａ〜Ｂは、ＴＩＲを惹起する角度を示す、例示的共振器キャビティ励起装置１６００を図示する。図１６Ａに示すように、励起装置１６００の断面は、単一空孔１６１５を含む。励起装置の基質１６０５は、シリカ（ｎ＝１．４５７）で実装されることができ、除去コーティング１６１０は、ＭｇＦ２（ｎ＝１．３７７）で実装される。レーザ光は、使用される色素に適切である、任意の入手可能な色であることができる。例えば、４８８ｎｍまたは６３２ｎｍが、通常入手可能なレーザ色である。多重レーザは、独立してか、または同時にかのいずれかで使用されることができる。
【００７６】
基質１６０５内では、光の進路１６２５は、臨界角（ブルースター角）５５．５３度で接近し、大気から基質１６０５へのゼロ反射通過を成し遂げることができる。光の進路１６２５は、臨界角以上で空孔１６１５に接近し、ＴＩＲ界面１６２０で誘起する。本実施形態に対しては、臨界角は、６３３ｎｍの光に対して７１．２６であるが、入射の角度はより大きい場合もある。反射された光は、同じ角度で出ることができるが入射の角度、光の波長、および／または材料により、偏向することができる。
【００７７】
図１６Ａに描写する通り、基質１６０５の側壁の角度は、界面から、基質１６０５と除去コーティング１６１０との間が１０５度である。
【００７８】
図１６Ｂは、光の進路１６２５が臨界角以上で空孔１６１５に接近し、ＴＩＲを誘起する、共振器キャビティ励起装置１６００を描写する。本実施形態に対しては、臨界角は、入射から７２．５７８度である。反射された光は、同じ角度で出ることができるが、入射の角度、光の波長、および／または材料により、偏向することができる。
【００７９】
図１５Ｂに転じると、この図は、共振器キャビティの高反射性の鏡１５２０が、光線１５２５を垂直入射に向ける、共鳴性キャビティ励起装置の別の実施形態を描写する。図１５Ｃに転じると、この図は、共振器キャビティ励起装置１５００のさらに別の実施形態を描写する。基質１５０５は、半球であるように構成されることができる。高反射性の鏡１５２０は、光線１５２５を基質１５０５に垂直入射で入らせるように位置付けられる。
【００８０】
図１５Ｄは、共振器キャビティ励起装置１５００のさらに別の実施形態を描写する。本実施形態では、複数のキャビティ１５５０〜１５６５を形成することができる。各キャビティは、選択された波長でレーザを支持することができる。したがって、本実施形態に対しては、４つの異なる波長を、検出の際に使用することができる。キャビティがいくつでも、本発明の範囲を逸脱することなく、支持することができることは、当業者には容易に明らかとなるはずである。
【００８１】
図１７は、さらに別の実施形態による、システム１７００を図示する。図１７に示すように、励起装置は、シリカ材料で実装される基質１７０５と、アルミニウムで実装される除去コーティング１７１０とを含むことができる。空孔１７１２は、除去コーティング１７１０内に形成され、色素溶液１７１４と相互作用することができる。基質１７０５は、プリズム表面１７１５ＡＢを有するように構成されることができる。システム１７００はまた、高反射性の鏡１７２０ＡＢを含むこともできる。
【００８２】
励起の間、入力レーザは、選択された波長で、入力カプラ（図示せず）を貫通して高反射性の鏡１７２０Ａを介し、干渉性光エネルギ１７２５を放射することができる。高反射性の鏡１７２０Ａからの干渉性光エネルギ１７２５は、固定プリズム１７１５Ａの側に向かって透過されることができる。干渉性光エネルギ１７２５はまた、高反射性の鏡１７２０Ｂへ向けられ、プリズム表面１７１５Ｂの他方側に向かって反射されることができる。プリズム表面１７１５Ｂは、光を空孔１７１２に向かって反射するように構成されることができる。
【００８３】
さらに別の実施形態は、光ファイバを使用し、図１８に描写される。図１８に示すように、システム１８００は、１つ以上の光ファイバ１８１０の下方へ光を放つ、励起装置１８０５を含む。検出領域１８１５は、一部のファイバ１８１０の上に生成されてもよい。ファイバ上のコーティングは、ファイバの表面のエバネッセント波を誘起するように設計されることができる。検出領域１８１５では、小さな空孔（図示せず）はファイバのコーティング１８１０が、除去コーティングとして機能するように、コーティング内に置かれてもよい。光ファイバ１８１０の走行は、ＴＩＲを保存するのに十分大きなループ１８２０を含むことができる。
【００８４】
本発明を、その例示的実施形態を参照の上、説明してきた一方で、当業者は、真の精神および範囲を逸脱ことなく、記載の実施形態に対する種々の修正を行うことができるであろう。本願で使用される用語および説明は、図示の手段として記載されており、制限を意味しない。特に、方法が例によって説明されているが、方法のステップは、図示の通りまたは同時ではなく、異なる順序で実行されてもよい。当業者は、続く請求項およびそれらに同等するものに定義される精神ならびに範囲内で、これらおよび他の変形が可能であることを認識するであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体の分析のためのシステムであって、
基質と、
該基質に接触するように構成された流体試料と、
該基質に結合している無機吸収体によって、蛍光標識した分子にエネルギを与えるように構成された励起光源と、
該蛍光標識した分子を検出するように構成された検出器と
を備える、システム。
【請求項２】
前記無機吸収体は量子ドットである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記無機吸収体は上方変換する蛍光体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記励起光源は、内部反射によって誘起されるエバネッセント波を誘起する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記基質および前記流体試料は、それぞれもう一方とは異なる屈折率を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記無機吸収体は、第１の波長でエネルギ移動帯を生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
標識部分と、
色素標識したヌクレオチドと、
酵素であって、該酵素の１つの末端は、該標識部分に付着しており、該酵素の第２の末端は、該色素標識したヌクレオチドに付着している、酵素と
をさらに備える、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
第２の無機吸収体をさらに備え、該第２の無機吸収体は、第２の波長で第２のエネルギ移動帯を生成するように構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１および第２のエネルギ移動帯は、少なくとも３つの励起波長を生成する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第２の無機吸収体は、前記酵素の末端によって、前記色素標識したヌクレオチドに付着する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
金属層で被覆される透明基質と、
該金属層に堆積される除去コーティングと、
該除去コーティングの空孔内へ、拡散するように構成される蛍光標識した分子と、
該除去コーティングの基質側で、プラズモン結合発光を産生するように構成される励起光源と
を備える、検体の分析のためのシステム。
【請求項１２】
前記除去コーティングは、前記基質の材料より高い屈折率の材料で実装される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プラズモン結合発光は、前記除去コーティング内の空孔に、エネルギ移動帯を形成する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
放射光の円錐体は、前記エネルギ移動帯に入る前記蛍光標識した分子に反応して、形成される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
ルミネセンス検出システムであって、該システムは、共鳴性光キャビティを備え、発光団の放射は、該共鳴性光キャビティの境界に確立されるエバネッセント励起によって、誘発される、システム。
【請求項１６】
前記共鳴性光キャビティは、
選択された波長で、光を産生するように構成される励起光源と、
基質と、
複数の鏡であって、１つの鏡は、光を該励起光源から、該光を第２の鏡へ反射する基質へ、反射および屈折させるように位置付けられ、該第２の鏡は、入射光のように実質的に反対方向に、該光を反射し再配向する、複数の鏡と
をさらに備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
選択された波長で光を産生するように構成される励起光源と、
内部全反射界面と、
複数の鏡であって、前記共鳴性光キャビティは、該複数の鏡および該内部全反射界面によって境界される、複数の鏡と
をさらに備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記励起光源からの光は、ブルースター角で前記共鳴性光キャビティに入り、内部全反射を誘起する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記励起光源からの光は、垂直入射で前記共鳴性光キャビティに入る、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
複数の光源であって、各源は、選択された波長で、関連する光を産生するように構成される、光源と、
複数の内部全反射界面と、
複数のサブセットの鏡からさらに成る複数の鏡であって、各サブセットの鏡は光源と関連する、複数の鏡と
をさらに備え、複数の共鳴性キャビティが形成され、各共鳴性キャビティは、関連するサブセットの鏡、および関連する内部全反射界面によって境界され、関連する光源からの光を供給される、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１】
検体の分析のためのシステムであって、
基質と、
該基質に接触するように構成された流体試料と、
該基質に結合している無機吸収体によって、蛍光標識した分子にエネルギを与えるように構成された励起光源と、
該蛍光標識した分子を検出するように構成された検出器と
を備える、システム。
【請求項２】
前記無機吸収体は量子ドットである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記無機吸収体は上方変換する蛍光体である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記励起光源は、内部反射によって誘起されるエバネッセント波を誘起する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記基質および前記流体試料は、それぞれもう一方とは異なる屈折率を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記無機吸収体は、第１の波長でエネルギ移動帯を生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
標識部分と、
色素標識したヌクレオチドと、
酵素であって、該酵素の１つの末端は、該標識部分に付着しており、該酵素の第２の末端は、該色素標識したヌクレオチドに付着している、酵素と
をさらに備える、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
第２の無機吸収体をさらに備え、該第２の無機吸収体は、第２の波長で第２のエネルギ移動帯を生成するように構成される、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記第１および第２のエネルギ移動帯は、少なくとも３つの励起波長を生成する、請求項７に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第２の無機吸収体は、前記酵素の末端によって、前記色素標識したヌクレオチドに付着する、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
金属層で被覆される透明基質と、
該金属層に堆積される除去コーティングと、
該除去コーティングの空孔内へ、拡散するように構成される蛍光標識した分子と、
該除去コーティングの基質側で、プラズモン結合発光を産生するように構成される励起光源と
を備える、検体の分析のためのシステム。
【請求項１２】
前記除去コーティングは、前記基質の材料より高い屈折率の材料で実装される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プラズモン結合発光は、前記除去コーティング内の空孔に、エネルギ移動帯を形成する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
放射光の円錐体は、前記エネルギ移動帯に入る前記蛍光標識した分子に反応して、形成される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
ルミネセンス検出システムであって、該システムは、共鳴性光キャビティを備え、発光団の放射は、該共鳴性光キャビティの境界に確立されるエバネッセント励起によって、誘発される、システム。
【請求項１６】
前記共鳴性光キャビティは、
選択された波長で、光を産生するように構成される励起光源と、
基質と、
複数の鏡であって、１つの鏡は、光を該励起光源から、該光を第２の鏡へ反射する基質へ、反射および屈折させるように位置付けられ、該第２の鏡は、入射光のように実質的に反対方向に、該光を反射し再配向する、複数の鏡と
をさらに備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
選択された波長で光を産生するように構成される励起光源と、
内部全反射界面と、
複数の鏡であって、前記共鳴性光キャビティは、該複数の鏡および該内部全反射界面によって境界される、複数の鏡と
をさらに備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記励起光源からの光は、ブルースター角で前記共鳴性光キャビティに入り、内部全反射を誘起する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記励起光源からの光は、垂直入射で前記共鳴性光キャビティに入る、請求項１７に記載のシステム。
【請求項２０】
複数の光源であって、各源は、選択された波長で、関連する光を産生するように構成される、光源と、
複数の内部全反射界面と、
複数のサブセットの鏡からさらに成る複数の鏡であって、各サブセットの鏡は光源と関連する、複数の鏡と
をさらに備え、複数の共鳴性キャビティが形成され、各共鳴性キャビティは、関連するサブセットの鏡、および関連する内部全反射界面によって境界され、関連する光源からの光を供給される、請求項１５に記載のシステム。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００９−５３７１４８（Ｐ２００９−５３７１４８Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１２１８（Ｐ２００９−５１１２１８）
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９０２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７０６０
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１６日（２００７．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９０２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７０６０
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]