卵母細胞の成熟のための妊娠特異的糖タンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙｓｐｅｃｉｆｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）の使用
哺乳動物の卵母細胞のインビトロでの成熟のためのＰＳＧの使用が、説明される。インビトロで成熟させた卵母細胞は、インビトロでの受精プロトコルに用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年９月３０日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６１４,７７３号（本明細書中で引用文献により組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に生殖生物学に関する。より詳細には、本発明は妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
卵母細胞のインビトロでの受精（ＩＶＦ）は、様々な形態の雌性及び雄性不妊を克服するのに用いられる広く実用的な医療技術であり、その結果不妊カップルに提供される。標準的なＩＶＦ処置は、卵母細胞の成熟を誘導する外因性ホルモンを用いた、女性患者の排卵誘発（ＣＯＨ）に基づいている。この処置は、典型的には、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト又は患者自身の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモンを抑制するアンタゴニストを投与することにより開始される。その後、外因性ゴナドトロピン（ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の注入へと続き、多数の排卵前卵胞への発達を確実にする。排卵の直前に、多数のインビボで成熟させた卵母細胞を卵巣から取り除く。単離した成熟卵母細胞はその後受精させ、発達した胚を４〜８細胞分裂期に子宮に戻す前に、典型的に３〜６日間培養する。
【０００４】
ＣＯＨ処置は、５組のカップルの約１組のカップルにおいて成功せず、多嚢胞卵巣障害の女性などの多くの女性には薦められていない。更に、ＣＯＨ処置において用いられる外因性ホルモン処理は、卵胞の発達及び卵胞の成熟を過剰に刺激し得る。ＣＯＨを受ける患者の一部は、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）に罹患し、これは重度の潜在的な致命的状態である。結果として、ＣＯＨを受ける女性は、毎日の卵巣の超音波検査及び血中ホルモン測定により厳密に観察されなければならない。
【０００５】
ＣＯＨを用いる標準的なＩＶＦ処置の制限により、様々な代替のプロトコルが提案されてきた。ＣＯＨプロトコルの危険性、副作用及び経済的不利益を軽減する１つの方法は、インビボでの卵母細胞の成熟が後に続く未熟細胞の回収に関連する。この方法においては、女性は刺激を受けず、又は軽減した刺激を受け、回収した卵母細胞をインビトロでのホルモン処理にかける。卵母細胞のインビトロでの成熟（ＩＶＭ）は、典型的には投与する外因性ホルモンの量を減少又は無くすことを可能にし、その結果議論された問題を軽減する。
【０００６】
ＩＶＦの成功にも関わらず、不妊処置の改善された方法に対する顕著な必要性が存在する。特に、インビトロで卵母細胞を成熟させる方法を開発する顕著な必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
当業界が必要としているものは、ＯＨＳＳの発生を軽減するＩＶＦプロトコルである。このプロトコルは、卵母細胞の成熟のために投与される外因性ホルモンの量を減少させ又は無くすはずである。本発明は、これらの必要性を満たす。
【０００８】
卵母細胞は、未熟卵母細胞を含んで成る組成物を調製することによりインビトロで成熟させることができる。その後、妊娠特異的糖タンパク質をその組成物に添加し、それにより卵母細胞の成熟を誘導することができる。成熟した卵母細胞は、成熟卵母細胞を精子と接触させることにより胚を産生するのに用いることができる。出産まで胚を保持することができる女性の子宮に、胚を移植することができる。妊娠特異的糖タンパク質は、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１であることができる。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＳＧがインビトロでの卵母細胞の成熟を誘導するという発見に関する。ＰＳＧを用いてインビトロでの卵母細胞の成熟を誘導することにより、ＩＶＦ処理プロトコルにおいて投与する外因性ホルモンの量を減少させることができる。
【００１０】
１．インビトロでの成熟
ＰＳＧは卵母細胞のインビトロでの成熟に用いることができる。
【００１１】
ａ．卵母細胞
卵母細胞が、発達の時期、例えば早期腔卵胞及び腔卵胞（これらに限定されない）にある間に、未熟卵母細胞を女性から取り除くことができる。
【００１２】
未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けていない女性から取り除くことができる。或いは、未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けた女性から取り除くことができる。女性には、ホルモン、例えばＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧ（これらに限定されない）を投与しておくことができる。ホルモンは、別のホルモンとの組み合わせにおいて、又は任意の順序で連続的に投与しておくことができる。
【００１３】
未熟卵母細胞は、超音波検査及び吸引を含む（これらに限定されない）方法により、女性から取り除くことができる。未熟卵母細胞は、単離の後に凍結保存し、インビトロでの成熟の時期に解凍することができる。
【００１４】
ｂ．成熟
単離した未熟卵母細胞は、ＰＳＧを含んで成る培地中でインキュベートすることができる。培地は、任意の生理学的に許容される培地、例えばＴＣＭ １９９、αＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ Ｆ１０（これらに限定されない）であることができる。培地は、任意に１又は複数の因子、例えばＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、自己加熱不活性化血清及び卵胞液（これらに限定されない）を更に含んで成ることができる。
【００１５】
未熟卵母細胞は、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６又は７２時間（これらに限定されない）、約３７℃〜約３９℃（これらに限定されない）で、培地中でインキュベートすることができる。卵母細胞は、顕微鏡下での卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）、卵丘拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、中期ＩＩプレート形成（Ｍｉｌ）、又は極体押し出し（これらに限定されない）の外観検査を含む方法によって、証明したように成熟が起こるまで、卵母細胞をインキュベートすることができる。
【００１６】
ｃ．胚産生
成熟卵母細胞は、インビトロで精子と共にインキュベートし、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍａｒｔｉｎ Ｌｄｕｎｅｔｚ Ｌｔｄ．， Ｌｏｎｄｏｎ）（この内容は、引用文献により本明細書中に組み込まれる。）に記載されている標準的なインビトロでの受精を用いて哺乳動物の胚を産生することができる。胚は、出産まで胚を保持することができる女性の子宮に移植することができる。
【００１７】
２．妊娠特異的糖タンパク質
ＰＳＧは、妊娠の成功に必須であり得る妊娠した女性の血清の主な要素を構成する。ＰＳＧ遺伝子は、１１の高度に保存されたメンバーのファミリーを含んで成る。ＰＳＧは母体循環系に放出され、妊娠の進行とともに濃度が増大し、出産においては４００μｇ／ｍｌの濃度まで達する。ＰＳＧが女性による妊娠の保持以外の機能を有するという事実は、胎児肝臓、唾液腺、睾丸及び骨髄細胞に存在するＰＳＧｍＲＮＡにより証明される。
【００１８】
成熟を誘導するのに用いられるＰＳＧは、インビトロでの卵母細胞の成熟を誘導する任意のＰＳＧ、例えばヒトＰＳＧであることができる。ヒトＰＳＧは、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１であることができる。ＰＳＧは、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１のアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、又は変異型或いはそれらの組み合わせであることができる。アナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ又は変異型は、ＰＳＧ、例えばＰＳＧ５と、少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％の配列の同一性を有することができる。ＰＳＧフラグメントは、Ｉｇ可変様ドメインを含んで成ることができる。ＰＳＧフラグメントは、シグナルペプチドを含んで成ることができない。
【００１９】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「アナログ」という用語は、１つ以上の非標準的なアミノ酸又は従来のアミノ酸の組からの他の構造的な変異型を含んでなるペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「誘導体」という用語は、一次構造（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）以外が異なるペプチド又はポリペプチドを意味する。例として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の１つの形態）されることにより異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種系における発現により、グリコシル化パターンが存在し得る。少なくとも１つの生物学的活性が保持されるならば、これらのペプチド又はポリペプチドは誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ末端又はＣ末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と結合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基により他のペプチド、ポリペプチド又は化学物質に結合したペプチド又はポリペプチド、及び当業界で理解される更なる修飾型があげられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「フラグメント」という用語は、約８〜５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸長であることができる。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「ホモログ」という用語は、共通の進化的先祖を共有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「変異型」という用語は、アミノ酸の挿入、欠損、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の目的に関して、「生物学的活性」としては、特異的抗体により結合される能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明は、以下の非限定的な実施例により説明される複数の側面を有する。
【実施例】
【００２５】
実施例１
マウス卵丘−卵母細胞複合体の単離
ＰＭＳＧ（５ＩＵ／雌性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ３６７２２２）は、７〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（３５トータル；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を準備するのに用いた。マウスは、進行性の低酸素血症により４８時間後に屠殺した。アルコール（７０％）を、動物の腹部領域に適用してその部分を消毒し、毛による試料の汚染も減少させた。腹部切開を行い、腹腔を露出させた。卵管に接続した卵巣を、子宮角及び内臓脂肪症から取り除いた。卵巣／卵管試料を、３ｍｌのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ １１４１５−０６４）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６０００−０４４）を含む１５ｍｌチューブ（１０／チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３００５２）に置いた。卵巣／卵管試料を３７℃で保持した。
【００２６】
その後、卵巣／卵管試料をペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ ３５３００４、６０×１５ｍｍ）に移した。１ｍｌのツベルクリン注射器に取り付けた一組のハサミと針（２７ゲージ）を用いて、実体顕微鏡（サーモプレート加熱ステージを有するＮｉｋｏｎ ＳＭ２−８００）下で、卵巣及び卵管を脂肪パッドから取り除き、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。ＣＯＣを針による各卵巣の機械的破裂により回収し、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。
【００２７】
実施例２
マウス卵丘−卵母細胞複合体のインビトロでの卵丘拡張におけるＰＳＧ５の効果
同種細胞質を有する卵丘−無傷卵母細胞を、低倍率（２０〜３０×）の実体顕微鏡を用いて、実施例１に記載のとおりに調製したＣＯＣから選択し、マウス（ｍｏｕｔｈ）ガラスピペットを用いて、ウエルミネラルオイルあたりに９０μｌの培地（１０％ ＦＣＳを含むαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ３２５７１−０３６）及びＰｅｎＳｔｒｅｐ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１４０−１２２））を含む９６−ウエルプレート（２／ウエル）に移した。ＣＯＣを９６−ウエルプレートに添加する前に、プレート中の培地を、空気中に５％のＣＯ2を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１時間事前に平衡化した。
【００２８】
ＰＳＧ５を、各ウエルの最終体積が１００μｌとなるように、各ウエルに１０μｌの体積で添加した。各プレートは、４つのウエルの「ネガティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）及び４つのウエルの「ポジティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳとＥＧＦ（５ ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｅ−９６４４））を含んでいた。１つの試験あたり２つのプレート（重複）を用いて、１つの試験タンパク質あたり２つのウエルを提供した。試験における１：５０の最終希釈のために試験プレートにタンパク質を添加する前に、ＩＶＭ培地（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）にタンパク質を１：５で希釈した。
【００２９】
処理したＣＯＣを含むプレートを、空気中に５％のＣＯ2を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１８時間インキュベートした。その後、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡を用いて各ＣＯＣを視覚的に検査し、卵丘細胞によるムコイド細胞外マトリクス（卵丘拡張の指標）の形成を同定した。卵丘拡張の割合を、各処理群において用いた全部のＣＯＣと比較した、拡張した卵丘の数として規定した。
【００３０】
ＰＳＧ５は、最初の試験において、６０％のＣＯＣの拡張を誘導した。その後、ＣＯＣ拡張におけるＰＳＧ５の効果を、再確認試験において再試験した。それはＰＳＧ５が試験した１００％のＣＯＣにおいて拡張を誘導することを示した。
【００３１】
最初の試験及び再確認試験の両方において、ネガティブコントロール（ＥＧＦを含まない）又はポジティブコントロール（ＥＧＦを含む）のプレートは、それぞれ常に０％又は１００％の拡張であった（データは示さない）。
【００３２】
実施例３
ＰＳＧ５の用量反応試験
実施例２に記載した最初及び再確認試験からの結果に基づいて、用量反応試験をＰＳＧ５に関して実施した。１つのウエルあたりに４〜５個のＣＯＣを含む３つのウエルが各タンパク質濃度に対して指定されたことを除いて、実施例２に記載の方法と類似の方法において用量反応試験を実施した。特定のタンパク質（試験に添加する前に希釈しないものがあった）の濃度に依存して、試験タンパク質の希釈を行い、１：１０の最終濃度とした。
【００３３】
ＰＳＧ５の用量反応試験の結果を、図１に示す。Ｏｒｉｇｉｎ ７ ＳＲ３ ｖ７．０４７５ （Ｂ４７５）を用いた試験は、ＰＳＧ５による卵丘拡張のＥＣ50が０．６４ｎｇ／ｍｌであったことを示す。
【００３４】
この記載は、上述の代表的な実施態様に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、示唆した濃度のＰＳＧ５で処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年９月３０日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６１４,７７３号（本明細書中で引用文献により組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に生殖生物学に関する。より詳細には、本発明は妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
卵母細胞のインビトロでの受精（ＩＶＦ）は、様々な形態の雌性及び雄性不妊を克服するのに用いられる広く実用的な医療技術であり、その結果不妊カップルに提供される。標準的なＩＶＦ処置は、卵母細胞の成熟を誘導する外因性ホルモンを用いた、女性患者の排卵誘発（ＣＯＨ）に基づいている。この処置は、典型的には、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト又は患者自身の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモンを抑制するアンタゴニストを投与することにより開始される。その後、外因性ゴナドトロピン（ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の注入へと続き、多数の排卵前卵胞への発達を確実にする。排卵の直前に、多数のインビボで成熟させた卵母細胞を卵巣から取り除く。単離した成熟卵母細胞はその後受精させ、発達した胚を４〜８細胞分裂期に子宮に戻す前に、典型的に３〜６日間培養する。
【０００４】
ＣＯＨ処置は、５組のカップルの約１組のカップルにおいて成功せず、多嚢胞卵巣障害の女性などの多くの女性には薦められていない。更に、ＣＯＨ処置において用いられる外因性ホルモン処理は、卵胞の発達及び卵胞の成熟を過剰に刺激し得る。ＣＯＨを受ける患者の一部は、卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）に罹患し、これは重度の潜在的な致命的状態である。結果として、ＣＯＨを受ける女性は、毎日の卵巣の超音波検査及び血中ホルモン測定により厳密に観察されなければならない。
【０００５】
ＣＯＨを用いる標準的なＩＶＦ処置の制限により、様々な代替のプロトコルが提案されてきた。ＣＯＨプロトコルの危険性、副作用及び経済的不利益を軽減する１つの方法は、インビボでの卵母細胞の成熟が後に続く未熟細胞の回収に関連する。この方法においては、女性は刺激を受けず、又は軽減した刺激を受け、回収した卵母細胞をインビトロでのホルモン処理にかける。卵母細胞のインビトロでの成熟（ＩＶＭ）は、典型的には投与する外因性ホルモンの量を減少又は無くすことを可能にし、その結果議論された問題を軽減する。
【０００６】
ＩＶＦの成功にも関わらず、不妊処置の改善された方法に対する顕著な必要性が存在する。特に、インビトロで卵母細胞を成熟させる方法を開発する顕著な必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
当業界が必要としているものは、ＯＨＳＳの発生を軽減するＩＶＦプロトコルである。このプロトコルは、卵母細胞の成熟のために投与される外因性ホルモンの量を減少させ又は無くすはずである。本発明は、これらの必要性を満たす。
【０００８】
卵母細胞は、未熟卵母細胞を含んで成る組成物を調製することによりインビトロで成熟させることができる。その後、妊娠特異的糖タンパク質をその組成物に添加し、それにより卵母細胞の成熟を誘導することができる。成熟した卵母細胞は、成熟卵母細胞を精子と接触させることにより胚を産生するのに用いることができる。出産まで胚を保持することができる女性の子宮に、胚を移植することができる。妊娠特異的糖タンパク質は、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１であることができる。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＳＧがインビトロでの卵母細胞の成熟を誘導するという発見に関する。ＰＳＧを用いてインビトロでの卵母細胞の成熟を誘導することにより、ＩＶＦ処理プロトコルにおいて投与する外因性ホルモンの量を減少させることができる。
【００１０】
１．インビトロでの成熟
ＰＳＧは卵母細胞のインビトロでの成熟に用いることができる。
【００１１】
ａ．卵母細胞
卵母細胞が、発達の時期、例えば早期腔卵胞及び腔卵胞（これらに限定されない）にある間に、未熟卵母細胞を女性から取り除くことができる。
【００１２】
未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けていない女性から取り除くことができる。或いは、未熟卵母細胞は、外因性ホルモン治療を受けた女性から取り除くことができる。女性には、ホルモン、例えばＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧ（これらに限定されない）を投与しておくことができる。ホルモンは、別のホルモンとの組み合わせにおいて、又は任意の順序で連続的に投与しておくことができる。
【００１３】
未熟卵母細胞は、超音波検査及び吸引を含む（これらに限定されない）方法により、女性から取り除くことができる。未熟卵母細胞は、単離の後に凍結保存し、インビトロでの成熟の時期に解凍することができる。
【００１４】
ｂ．成熟
単離した未熟卵母細胞は、ＰＳＧを含んで成る培地中でインキュベートすることができる。培地は、任意の生理学的に許容される培地、例えばＴＣＭ １９９、αＭＥＭ及びＨａｍ’ｓ Ｆ１０（これらに限定されない）であることができる。培地は、任意に１又は複数の因子、例えばＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、自己加熱不活性化血清及び卵胞液（これらに限定されない）を更に含んで成ることができる。
【００１５】
未熟卵母細胞は、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６又は７２時間（これらに限定されない）、約３７℃〜約３９℃（これらに限定されない）で、培地中でインキュベートすることができる。卵母細胞は、顕微鏡下での卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）、卵丘拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、中期ＩＩプレート形成（Ｍｉｌ）、又は極体押し出し（これらに限定されない）の外観検査を含む方法によって、証明したように成熟が起こるまで、卵母細胞をインキュベートすることができる。
【００１６】
ｃ．胚産生
成熟卵母細胞は、インビトロで精子と共にインキュベートし、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｍａｒｔｉｎ Ｌｄｕｎｅｔｚ Ｌｔｄ．， Ｌｏｎｄｏｎ）（この内容は、引用文献により本明細書中に組み込まれる。）に記載されている標準的なインビトロでの受精を用いて哺乳動物の胚を産生することができる。胚は、出産まで胚を保持することができる女性の子宮に移植することができる。
【００１７】
２．妊娠特異的糖タンパク質
ＰＳＧは、妊娠の成功に必須であり得る妊娠した女性の血清の主な要素を構成する。ＰＳＧ遺伝子は、１１の高度に保存されたメンバーのファミリーを含んで成る。ＰＳＧは母体循環系に放出され、妊娠の進行とともに濃度が増大し、出産においては４００μｇ／ｍｌの濃度まで達する。ＰＳＧが女性による妊娠の保持以外の機能を有するという事実は、胎児肝臓、唾液腺、睾丸及び骨髄細胞に存在するＰＳＧｍＲＮＡにより証明される。
【００１８】
成熟を誘導するのに用いられるＰＳＧは、インビトロでの卵母細胞の成熟を誘導する任意のＰＳＧ、例えばヒトＰＳＧであることができる。ヒトＰＳＧは、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１であることができる。ＰＳＧは、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０又はＰＳＧ１１のアナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ、又は変異型或いはそれらの組み合わせであることができる。アナログ、誘導体、フラグメント、ホモログ又は変異型は、ＰＳＧ、例えばＰＳＧ５と、少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％の配列の同一性を有することができる。ＰＳＧフラグメントは、Ｉｇ可変様ドメインを含んで成ることができる。ＰＳＧフラグメントは、シグナルペプチドを含んで成ることができない。
【００１９】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「アナログ」という用語は、１つ以上の非標準的なアミノ酸又は従来のアミノ酸の組からの他の構造的な変異型を含んでなるペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「誘導体」という用語は、一次構造（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）以外が異なるペプチド又はポリペプチドを意味する。例として、誘導体は、グリコシル化（翻訳後修飾の１つの形態）されることにより異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種系における発現により、グリコシル化パターンが存在し得る。少なくとも１つの生物学的活性が保持されるならば、これらのペプチド又はポリペプチドは誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ末端又はＣ末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と結合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基により他のペプチド、ポリペプチド又は化学物質に結合したペプチド又はポリペプチド、及び当業界で理解される更なる修飾型があげられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「フラグメント」という用語は、約８〜５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸長であることができる。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「ホモログ」という用語は、共通の進化的先祖を共有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、ＰＳＧとの関連で用いる場合には、「変異型」という用語は、アミノ酸の挿入、欠損、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の目的に関して、「生物学的活性」としては、特異的抗体により結合される能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明は、以下の非限定的な実施例により説明される複数の側面を有する。
【実施例】
【００２５】
実施例１
マウス卵丘−卵母細胞複合体の単離
ＰＭＳＧ（５ＩＵ／雌性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ３６７２２２）は、７〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（３５トータル；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を準備するのに用いた。マウスは、進行性の低酸素血症により４８時間後に屠殺した。アルコール（７０％）を、動物の腹部領域に適用してその部分を消毒し、毛による試料の汚染も減少させた。腹部切開を行い、腹腔を露出させた。卵管に接続した卵巣を、子宮角及び内臓脂肪症から取り除いた。卵巣／卵管試料を、３ｍｌのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ １１４１５−０６４）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １６０００−０４４）を含む１５ｍｌチューブ（１０／チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３００５２）に置いた。卵巣／卵管試料を３７℃で保持した。
【００２６】
その後、卵巣／卵管試料をペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ ３５３００４、６０×１５ｍｍ）に移した。１ｍｌのツベルクリン注射器に取り付けた一組のハサミと針（２７ゲージ）を用いて、実体顕微鏡（サーモプレート加熱ステージを有するＮｉｋｏｎ ＳＭ２−８００）下で、卵巣及び卵管を脂肪パッドから取り除き、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。ＣＯＣを針による各卵巣の機械的破裂により回収し、２〜３ｍｌの新鮮な培地（Ｌ−１５＋１０％ ＦＣＳ）で満たした新しいペトリ皿に置いた。
【００２７】
実施例２
マウス卵丘−卵母細胞複合体のインビトロでの卵丘拡張におけるＰＳＧ５の効果
同種細胞質を有する卵丘−無傷卵母細胞を、低倍率（２０〜３０×）の実体顕微鏡を用いて、実施例１に記載のとおりに調製したＣＯＣから選択し、マウス（ｍｏｕｔｈ）ガラスピペットを用いて、ウエルミネラルオイルあたりに９０μｌの培地（１０％ ＦＣＳを含むαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ３２５７１−０３６）及びＰｅｎＳｔｒｅｐ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１４０−１２２））を含む９６−ウエルプレート（２／ウエル）に移した。ＣＯＣを９６−ウエルプレートに添加する前に、プレート中の培地を、空気中に５％のＣＯ2を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１時間事前に平衡化した。
【００２８】
ＰＳＧ５を、各ウエルの最終体積が１００μｌとなるように、各ウエルに１０μｌの体積で添加した。各プレートは、４つのウエルの「ネガティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）及び４つのウエルの「ポジティブコントロール」（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳとＥＧＦ（５ ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｅ−９６４４））を含んでいた。１つの試験あたり２つのプレート（重複）を用いて、１つの試験タンパク質あたり２つのウエルを提供した。試験における１：５０の最終希釈のために試験プレートにタンパク質を添加する前に、ＩＶＭ培地（αＭＥＭと１０％ ＦＣＳ）にタンパク質を１：５で希釈した。
【００２９】
処理したＣＯＣを含むプレートを、空気中に５％のＣＯ2を含む加湿したインキュベーター中で３７℃において１８時間インキュベートした。その後、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡を用いて各ＣＯＣを視覚的に検査し、卵丘細胞によるムコイド細胞外マトリクス（卵丘拡張の指標）の形成を同定した。卵丘拡張の割合を、各処理群において用いた全部のＣＯＣと比較した、拡張した卵丘の数として規定した。
【００３０】
ＰＳＧ５は、最初の試験において、６０％のＣＯＣの拡張を誘導した。その後、ＣＯＣ拡張におけるＰＳＧ５の効果を、再確認試験において再試験した。それはＰＳＧ５が試験した１００％のＣＯＣにおいて拡張を誘導することを示した。
【００３１】
最初の試験及び再確認試験の両方において、ネガティブコントロール（ＥＧＦを含まない）又はポジティブコントロール（ＥＧＦを含む）のプレートは、それぞれ常に０％又は１００％の拡張であった（データは示さない）。
【００３２】
実施例３
ＰＳＧ５の用量反応試験
実施例２に記載した最初及び再確認試験からの結果に基づいて、用量反応試験をＰＳＧ５に関して実施した。１つのウエルあたりに４〜５個のＣＯＣを含む３つのウエルが各タンパク質濃度に対して指定されたことを除いて、実施例２に記載の方法と類似の方法において用量反応試験を実施した。特定のタンパク質（試験に添加する前に希釈しないものがあった）の濃度に依存して、試験タンパク質の希釈を行い、１：１０の最終濃度とした。
【００３３】
ＰＳＧ５の用量反応試験の結果を、図１に示す。Ｏｒｉｇｉｎ ７ ＳＲ３ ｖ７．０４７５ （Ｂ４７５）を用いた試験は、ＰＳＧ５による卵丘拡張のＥＣ50が０．６４ｎｇ／ｍｌであったことを示す。
【００３４】
この記載は、上述の代表的な実施態様に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、示唆した濃度のＰＳＧ５で処理した後の、拡張した卵丘−卵母細胞複合体の割合を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）未熟卵母細胞を調製すること；及び
（ｂ）卵母細胞を妊娠特異的糖タンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と接触させること、
を含んで成る、インビトロで卵母細胞を成熟させる方法。
【請求項２】
妊娠特異的糖タンパク質が、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０及びＰＳＧ１１から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
妊娠特異的糖タンパク質が、ＰＳＧ５又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けていない女性に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けた女性に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
女性が、ＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるホルモンを投与された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、自己加熱不活性化血清及び卵胞液から成る群から選択される因子を含んで成る培地中で未熟卵母細胞が調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法により産生された成熟卵母細胞。
【請求項９】
卵母細胞が請求項１に記載の方法により産生される、成熟卵母細胞を精子を用いて処理することを含んで成る、インビトロで胚を産生する方法。
【請求項１０】
成熟卵母細胞を精子で処理することを含んで成る方法により胚が産生され、卵母細胞が請求項１に記載の方法により産生される、インビトロでの受精を必要とする胚を移植することを含んで成る、インビトロでの受精の方法。
【請求項１】
（ａ）未熟卵母細胞を調製すること；及び
（ｂ）卵母細胞を妊娠特異的糖タンパク質（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）と接触させること、
を含んで成る、インビトロで卵母細胞を成熟させる方法。
【請求項２】
妊娠特異的糖タンパク質が、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、ＰＳＧ１０及びＰＳＧ１１から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
妊娠特異的糖タンパク質が、ＰＳＧ５又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けていない女性に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
未熟卵母細胞が、外部ホルモン治療を受けた女性に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
女性が、ＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるホルモンを投与された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、自己加熱不活性化血清及び卵胞液から成る群から選択される因子を含んで成る培地中で未熟卵母細胞が調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法により産生された成熟卵母細胞。
【請求項９】
卵母細胞が請求項１に記載の方法により産生される、成熟卵母細胞を精子を用いて処理することを含んで成る、インビトロで胚を産生する方法。
【請求項１０】
成熟卵母細胞を精子で処理することを含んで成る方法により胚が産生され、卵母細胞が請求項１に記載の方法により産生される、インビトロでの受精を必要とする胚を移植することを含んで成る、インビトロでの受精の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００８−５１４２３９（Ｐ２００８−５１４２３９Ａ）
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３４８３５（Ｐ２００７−５３４８３５）
【出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３５３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３９６０４
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３５３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３９６０４
【国際公開日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
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