反応基板製造方法及び反応基板製造装置
【課題】本発明は、短時間で安定した測定を行わせる。
【解決手段】本発明は、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却し、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により吐出し、試薬が固着した反応基板１を製造するようにしたことにより、試薬を含む液が氷結した状態でウェル１０に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができ、さらに予め試薬をウェル１０に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができ、かくして短時間で安定した測定を行わせることができる。
【解決手段】本発明は、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却し、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により吐出し、試薬が固着した反応基板１を製造するようにしたことにより、試薬を含む液が氷結した状態でウェル１０に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができ、さらに予め試薬をウェル１０に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができ、かくして短時間で安定した測定を行わせることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は反応基板製造方法及び反応基板製造装置に関し、例えば核酸を増幅する際に用いる反応基板を製造する場合に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸における特定の塩基配列領域を増幅する方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）や等温遺伝子増幅法であるＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法やＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法などがある。これらの増幅反応を行う装置では、増幅反応を行わせる場として複数の微小容器を有する反応基板が用いられる。
【０００３】
この反応基板は、マイクロマシン／ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）技術を用いて、プラスチック等の樹脂材やガラスからなる基板にエッチングやレーザ光などによって、複数の微小容器及び該微小容器を繋ぎ検体溶液及び試薬液を流す流路が形成される。
【０００４】
現行の反応基板は、検体溶液及び試薬液を別々に微小容器に注入する構造となっているものが殆どである。
【０００５】
これに対して反応基板における微小容器に試薬をパラフィンで密閉して固定しておき、反応させる際に熱を加えてパラフィンを溶かして検体と試薬を反応させるようになされたものが提案されている（例えば特許文献１参照）。
【０００６】
また特許文献１には、試薬が添加されたゲル状のゼラチンを微小容器に固定しておき、反応させる際に熱を加えてゼラチンをゾル化させてから検体と試薬を反応させるようになされたものも提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１３４２２７公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで上述した反応基板では、検体と試薬を反応させる際に、パラフィン又はゼラチンが微小容器内に溶けて存在しているため、反応に影響を与えたり、測定時のバックグラウンドノイズとなる可能性があり、安定した測定を行わせることができなくなるといった問題があった。
【０００９】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、短時間で安定した測定を行わせ得る反応基板製造方法及び反応基板製造装置を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため本発明においては、反応基板製造方法であって、試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却工程と、液を反応基板における反応場に液滴として吐出する吐出工程とを有する。
【００１１】
また本発明においては、反応基板製造装置であって、試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却部と、液を反応基板における反応場に液滴として吐出する資料注入部とを有する。
【００１２】
これにより、試薬を含む液が氷結した状態で試薬を反応場に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができると共に、予め試薬を反応場に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように本発明によれば、試薬を含む液が氷結した状態で試薬を反応場に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができると共に、予め試薬を反応場に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができ、かくして短時間で安定した測定を行わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】反応基板製造工程を示すフローチャートである。
【図２】反応基板における流路、反応場、流入口及び通気孔の形成を示す概略図である。
【図３】マイクロチップの構成を示す概略図である。
【図４】試薬配置装置の構成を示す概略図である。
【図５】試薬配置工程を示すフローチャートである。
【図６】吐出工程の説明に供する概略図である。
【図７】ＳＭＡＰ法における増幅対象領域の説明に供する概略図である。
【図８】ウィルスゲノムに対する２箇所の増幅対象領域の設定の説明に供する概略図である。
【図９】２本鎖ＤＮＡに対する増幅対象領域及び制限酵素の設定の説明に供する概略図である。
【図１０】測定装置の構成（１）を示す概略図である。
【図１１】測定装置の構成（２）を示す概略図である。
【図１２】増幅曲線及びネガティブコントロールのグラフを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
＜１．実施の形態＞
［１−１．反応基板製造］
［１−２．ＳＭＡＰ法による測定］
＜２．他の実施の形態＞
【００１６】
＜１．実施の形態＞
［１−１．反応基板製造］
［１−１−１．反応基板製造工程］
図１において反応基板製造工程の手順を示す。第１工程ＳＰ１では、図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、プラスチック等の樹脂材やガラスからなる反応基板１に、反応場とされる複数の容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが形成される。
【００１７】
これらウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂは、マイクロマシンによるエッチングやレーザ光照射などにより、反応基板１から不要部分が除去されて形成される。なお、説明の便宜上、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂをまとめて溝とも呼ぶ。
【００１８】
流路１１は、検体溶液が注入される流入口１２から複数のウェル１０までの入口側流路１１Ａと、該複数のウェル１０から通気孔１３までの出口側流路１１Ｂとからなる。
【００１９】
入口側流路１１Ａのウェル１０側には、該入口側流路１１Ａの溝を狭くして検体溶液を流れ難くする疎水領域１４Ａが設けられ、また出口側流路１１Ｂのウェル１０側にも該出口側流路１１Ｂの溝を狭くして検体溶液を流れ難くする疎水領域１４Ｂが設けられる。
【００２０】
これにより、ウェル１０内の検体溶液及び試薬が入口側流路１１Ａ及び出口側流路１１Ｂを辿って他のウェル１０に流入することを防止することができる。
【００２１】
なお、疎水領域１４Ａ及び１４Ｂは、検体溶液を流れ難くする構造又はウェル１０に検体溶液が流入した後に該ウェル１０から検体溶液が流れなくなる構造であれば、溝を狭くする構成以外でもよい。
【００２２】
第２工程（試薬配置工程）ＳＰ２では、後述するように、試薬配置装置２０（図４）によって試薬配置工程の手順（図５）に従って複数のウェル１０に試薬がそれぞれ配置される。
【００２３】
第３工程ＳＰ３では、図３に示すように、反応基板１の溝が形成された面側に、該反応基板１の流入口１２及び通気孔１３に対向する位置に穴が開けられたシリコンコート３１及び蓋３２が接着され、マイクロチップ３０としてパッケージ化される。
【００２４】
［１−１−２．試薬配置装置の構成］
試薬配置装置２０は、図４に示すように、制御部２１が全体を統括制御するようになされており、基板搬送機構２２、冷却部２３、試薬導入・洗浄機構２４及び試薬注入部２５が適宜制御される。
【００２５】
制御部２１はＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）を含むコンピュータ構成でなり、主に駆動部２１Ａ及び温度調整部２１Ｂとして機能する。
【００２６】
基板搬送機構２２は、第１工程ＳＰ１で溝が形成された反応基板１を冷却部２３の上面に搬入する。また基板搬送機構２２は、冷却部２３の上面に載置された反応基板１を外部に搬出する。
【００２７】
冷却部２３は、反応基板１が載置される台と該台の上面に配される例えばペルチェ素子などの冷却素子とを含む構成とされ、温度調整部２１Ｂの制御に基づいて冷却素子により反応基板１を冷却する。
【００２８】
試薬導入・洗浄機構２４は、試薬が混合された液（以下、これを試薬液とも呼ぶ）を導入する位置（以下、これを導入位置とも呼ぶ）に試薬注入部２５を移動させて、該試薬注入部２５に試薬液を導入する。また試薬導入・洗浄機構２４は、試薬注入部２５を洗浄する位置（以下、これを洗浄位置とも呼ぶ）に移動させて、該試薬注入部２５を洗浄する。なお本実施の形態においては、試薬が混合される液が純水である場合について説明するが、例えば生理食塩水などの他の液が適応されていてもよい。
【００２９】
試薬注入部２５は、試薬液を液滴にして吐出する管状の供給口２５Ａが反応基板１における複数のウェル１０の数及び配置と一致するように複数設けられる。また試薬注入部２５は、試薬導入・洗浄機構２４により導入された試薬液を貯めておく保持部（図示せず）が設けられており、保持部に保持された試薬液を駆動部２１Ａの制御に基づいて供給口２５Ａを介して数ｐＬの液滴にしてウェル１０に吐出する。
【００３０】
試薬配置装置２０は、図5に示すように、第２工程ＳＰ２の搬入工程ＳＰ１１において、第１工程ＳＰ１で溝が形成された反応基板１を基板搬送機構２２により搬入して冷却部２３の上面に載置する。
【００３１】
試薬配置装置２０は次の冷却工程ＳＰ１２において、温度調整部２１Ｂの制御に基づいて冷却部２３の冷却素子により、試薬液が固体となる温度（以下、これを凝固温度とも呼ぶ）である０℃以下の例えば−２０℃程度に反応基板１を冷却する。
【００３２】
試薬配置装置２０は次の試薬液導入工程ＳＰ１３において、試薬導入・洗浄機構２４により試薬注入部２５を導入位置に移動し、該試薬注入部２５の保持部に試薬液を導入する。そして試薬配置装置２０は、試薬導入・洗浄機構２４により試薬液が導入された試薬注入部２５を反応基板１上に移動させる。
【００３３】
試薬配置装置２０は次の吐出工程ＳＰ１４において、図６に示すように、駆動部２１Ａの制御に基づいて試薬注入部２５の保持部に貯められた試薬液を供給口２５Ａを介して液滴にして反応基板１のウェル１０に吐出する。
【００３４】
供給口２５Ａから吐出された液滴は、数ｐＬであり反応基板１に対して熱容量が十分小さいため、該反応基板１のウェル１０に接触するとすぐに氷結して該ウェル１０に固着する。
【００３５】
試薬配置装置２０は次の判断工程ＳＰ１５において、すべての試薬がウェル１０に入れられたか否かを制御部２１により判断する。試薬配置装置２０は、他の試薬をウェル１０に入れる場合には次の洗浄工程ＳＰ１６において、試薬導入・洗浄機構２４により試薬注入部２５を洗浄位置に移動させ、該試薬注入部２５を洗浄する。
【００３６】
そして試薬配置装置２０は、試薬液導入工程ＳＰ１３に戻って次の試薬液を試薬注入部２５に導入し、吐出工程ＳＰ１４で該試薬液をウェル１０に液滴にして吐出する。このときウェル１０では、先に入れられた試薬液は氷結しているため、後に入れられた試薬液とは混合することなく、別々に氷結されて固着した状態となる。
【００３７】
試薬配置装置２０は判断工程ＳＰ１５ですべての試薬がウェル１０に入れられたと判断した場合には次の搬出工程ＳＰ１７において、基板搬送機構２２により反応基板１をマイクロチップ組立装置（図示せず）に搬出する。このとき試薬配置装置２０は、凝固温度以下に反応基板１を維持したままマイクロチップ組立装置に搬出する。
【００３８】
マイクロチップ組立装置は、凝固温度以下に反応基板１を維持したまま、第３工程ＳＰ３においてマイクロチップ３０を製造する。
【００３９】
このようにして製造されたマイクロチップ３０は所定の保管容器内で凝固温度以下に維持されたまま保管される。
【００４０】
［１−１−３．反応基板製造例（１）］
ここで後述するＳＭＡＰ法による測定に用いられる反応基板１を含むマイクロチップ３０の製造例について説明する。
【００４１】
ところでＳＭＡＰ法では、５種類のプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素などが試薬として用いられる。ＳＭＡＰ法では、図７に示すように、４種類のプライマー５１を用いてＤＮＡ５０における増幅対象とされる領域（以下、これを増幅対象領域とも呼ぶ）５０Ａを鋳型として中間体が生成され、該中間体が複製されていくことにより増幅対象領域５０Ａが増幅される。
【００４２】
ＳＭＡＰ法では、増幅対象領域５０Ａが存在しない状態でも導入されたプライマー部分が増幅されることをネガティブコントロールとして用いることから、増幅対象領域５０Ａの有無を判断するまでに余分な時間がかかってしまうことになる。
【００４３】
例えばウィルスゲノムを増幅対象とする場合、一般にウィルスゲノムは十分に長い。そこで、図８に示すように、ウィルスゲノム６０に対して例えば２箇所の増幅対象領域６０Ａ及び６０Ｂをそれぞれ鋳型として増幅させる２種類の異なるプライマー群（５種類のプライマーの組を２組）が固着された反応基板１を製造する。
【００４４】
試薬配置装置２０は、冷却部２３によって凝固温度以下に冷却された反応基板１に１組目のプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出してウェル１０に氷結固着させる。
【００４５】
次に試薬配置装置２０は、試薬注入部２５を試薬導入・洗浄機構２４により洗浄した後、１組目のプライマーを含む試薬液がウェル１０に氷結固着している状態で、２組目のプライマーを含む試薬液を試薬注入部２５から吐出して該ウェル１０に氷結固着させる。
【００４６】
このようにして２組のプライマーがそれぞれ含まれる試薬液がウェル１０に別々に氷結固着している状態の反応基板１にシリコンコート３１及び蓋３２が接着されてマイクロチップ３０が製造される。なお、説明の便宜上、このマイクロチップ３０を２組プライマーマイクロチップ１００とも呼ぶ。
【００４７】
［１−１−４．反応基板製造例（２）］
ＳＭＡＰ法による測定に用いられるマイクロチップ３０の製造の別例について説明する。ところでＳＭＡＰ法では、一般的には６０℃で増幅反応を行わせるため、２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに乖離する温度としては低く、２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が低い。従って１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も低く、増幅開始までに時間がかかることになる。
【００４８】
そこで、図９に示すように、２本鎖ＤＮＡ７０における増幅対象領域７０Ａ以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素７１を、増幅対象領域７０Ａを増幅するためのプライマー７２と共に固着された反応基板１を製造する。
【００４９】
この場合、試薬配置装置２０は、冷却部２３によって凝固温度以下に冷却された反応基板１にプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出してウェル１０に氷結固着させる。
【００５０】
次に試薬配置装置２０は、試薬注入部２５を試薬導入・洗浄機構２４により洗浄した後、プライマーを含む試薬液がウェル１０に氷結固着している状態で、増幅対象領域以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出して該ウェル１０に氷結固着させる。
【００５１】
このようにしてプライマー及び制限酵素がそれぞれ含まれる試薬液がウェル１０に別々に氷結固着している状態の反応基板１にシリコンコート３１及び蓋３２が接着されてマイクロチップ３０が製造される。なお、説明の便宜上、このマイクロチップ３０を制限酵素入マイクロチップ２００とも呼ぶ。
【００５２】
［１−２．ＳＭＡＰ法による測定］
［１−２−１．測定装置］
図１０に示すように測定装置８０は、マイクロチップ格納部８１、温度制御部８２、励起光照射部８３、蛍光受光部８４及び増幅曲線描画部８５により構成される。
【００５３】
マイクロチップ格納部８１は、マイクロチップ３０が格納される空間を有し、マイクロチップ３０における各ウェル１０を加熱する過熱素子（図示せず）及び該ウェル１０の温度を測定する感温素子（図示せず）が設けられる。
【００５４】
マイクロチップ格納部８１には、上述した反応基板製造方法により製造された反応基板１を含むマイクロチップ３０に検体溶液が注入された後、該マイクロチップ３０が挿入される。
【００５５】
温度制御部８２は、感温素子を用いて所定間隔ごとにウェル１０の温度をセンシングし、該感温素子においてセンシングされる温度と、目標温度（６０℃）との差を求め、該差に応じて加熱素子に与えるべき電流又は電圧を可変する。これによりウェル１０の温度を目標温度に維持し得る。
【００５６】
励起光照射部８３は、レーザを含む構成とされ、図１１に示すように、ウェル１０に対してレーザ光を照射する。蛍光受光部８４は、受光素子を含む構成とされ、ウェル１０から発せられる蛍光を所定時間間隔ごとに受光し、受光した蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。
【００５７】
増幅曲線描画部８５は、蛍光受光部８４から所定間隔ごとに供給される蛍光強度に応じた増幅対象領域の増幅量を算出すると共に、時間に対する蛍光強度を示す増幅曲線を描画し、増幅対象領域の有無を判定する。
【００５８】
［１−２−２．２組プライマーマイクロチップを用いた増幅測定］
次に２組プライマーマイクロチップ１００を用いた増幅測定について説明する。具体的には、所定の保存容器で凝固温度以下に維持された２組プライマーマイクロチップ１００が測定開始直前に保存容器から取り出される。このとき２組プライマーマイクロチップ１００は常温の雰囲気に晒されるため、ウェル１０に氷結固着された試薬液が溶けて液体になる。
【００５９】
そして２組プライマーマイクロチップ１００には、注入口１３から検体溶液がすべてのウェル１０に行き渡るように注入される。因みに、注入口１３から注入された検体溶液が通気孔１４から出てきたのを確認することにより全てのウェル１０に検体溶液が注入したことを確認することができる。
【００６０】
測定装置８０は、ウェル１０に検体溶液が注入された２組プライマーマイクロチップ１００がマイクロチップ格納部８１に挿入された後、所定の開始命令を受けると、温度制御部８２により各ウェル１０が６０℃になるように加熱されてその温度を維持する。
【００６１】
測定装置８０は、励起光照射部８３から所定間隔ごとにウェル１０に対して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発せられた蛍光を蛍光受光部８４で受光して蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。
【００６２】
増幅曲線描画部８５は、時間に対する蛍光強度を示す増幅曲線を描画する。ここで２組プライマーマイクロチップ１００を用いて測定された増幅曲線及びネガティブコントロールと、１組のプライマーだけを用いて増幅対象領域が増幅された場合の増幅曲線及びネガティブコントロールとを図１２に示す。
【００６３】
図１２からも明らかなように、増幅対象領域の数を増加させることにより、増幅対象領域及びネガティブコントロールが共に増加する。しかしながら増幅対象領域の数を増加させることにより、ネガティブコントロールの増幅勾配に比べて増幅対象領域の増幅勾配が急になるので、結果として増幅対象領域の有無の判断を速めることができる。
【００６４】
［１−２−３．２組プライマーマイクロチップを用いた増幅測定］
次に制限酵素入マイクロチップ２００を用いた増幅測定について説明する。具体的には、所定の保存容器で凝固温度以下に維持された制限酵素入マイクロチップ２００が測定開始直前に保存容器から取り出される。このとき制限酵素入マイクロチップ２００は常温の雰囲気に晒されるため、ウェル１０に氷結固着された試薬液が溶けて液体になる。
【００６５】
そして制限酵素入マイクロチップ２００には、流入口１３から検体溶液がすべてのウェル１０に行き渡るように注入される。
【００６６】
測定装置８０は、ウェル１０に検体溶液が注入された制限酵素入マイクロチップ２００がマイクロチップ格納部８１に挿入された後、所定の開始命令を受けると、温度制御部８２により各ウェル１０が６０℃になるように加熱してその温度を維持する。
【００６７】
このとき増幅対象領域以外の塩基配列が制限酵素により切断され、増幅対象領域を含む塩基配列が短くなるので、この領域の２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が高くなる。従って増幅対象領域の１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も高くなり、増幅開始までの時間が短縮される。
【００６８】
測定装置８０は、励起光照射部８３から所定間隔ごとにウェル１０に対して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発せられた蛍光を蛍光受光部８４で受光して蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。増幅曲線描画部８５は、時間に対する増幅対象領域の増幅を示す増幅曲線を描画する。
【００６９】
従って測定装置８０は、増幅開始までの時間が短縮されていることにより、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７０】
［１−３．動作及び効果］
以上の構成において、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却する冷却工程と、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により液滴にして吐出する吐出工程とにより、試薬が固着した反応基板１を製造するようにした。
【００７１】
この反応基板１では、試薬を含む液滴が凝固温度以下に冷却された反応基板１に接触すると氷結するので、試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができる。これによりこの反応基板１を用いて例えば核酸増幅反応を行わせる際、試薬を劣化させることなく、またウェル１０にノイズの原因となる不純物が存在することなく、安定した測定を行わせることができる。
【００７２】
また反応基板１には測定に必要とされる試薬が予め固着されているため、検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。従って試薬配置装置２０により製造された反応基板１を含むマイクロチップ３０を用いて測定する場合、検体溶液をマイクロチップ３０に注入させるだけでよく、試薬液を別途注入させる場合と比して短時間で測定させることができる。
【００７３】
また複数種類の試薬液をウェル１０に固着させたい場合、それぞれの試薬液を別々にウェル１０に吐出することにより、該複数種類の試薬液が混合することなく別々に氷結されて固着する。
【００７４】
したがって反応基板１では、複数種類の試薬液が混合することにより試薬同士が反応してしまうことを未然に防止することができると共に、複数種類の試薬液をそれぞれ別々にウェル１０に導入する場合に比して短時間で測定を開始させることができる。
【００７５】
また、増幅対象領域における異なる複数の領域をそれぞれ増幅するプライマー群を含む試薬液を別々にウェル１０に吐出して氷結固着させた反応基板１を製造するようにした。
【００７６】
この反応基板１を用いて増幅対象領域の有無を判定する場合、ネガティブコントロールの増幅勾配に比べて増幅対象領域の増幅勾配が急になるので、結果として検出速度を速めることができる。従って測定装置８０は、この反応基板１を用いた場合、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７７】
さらに、増幅対象領域を増幅するためのプライマーを含む試薬液と、２本鎖ＤＮＡにおける増幅対象領域以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素を含む試薬液とを別々にウェル１０に吐出して氷結固着させた反応基板１を製造するようにした。
【００７８】
この反応基板１を用いてＳＭＡＰ法による増幅対象領域の有無を判定する場合、増幅対象領域以外の塩基配列が制限酵素により切断され、増幅対象領域を含む塩基配列が短くなるので、この領域の２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が高くなる。従って増幅対象領域の１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も高くなり、増幅開始までの時間が短縮されるので、測定装置８０は、この反応基板１を用いた場合、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７９】
以上の構成によれば、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却し、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により吐出し、試薬が固着した反応基板１を製造するようにした。
【００８０】
これにより、試薬を含む液が氷結した状態でウェル１０に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができる。また、予め試薬をウェル１０に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。かくして、短時間で安定した測定を行わせることができる。
【００８１】
＜２．他の実施の形態＞
上述の実施の形態では、増幅対象領域のＤＮＡ断片を増幅させる試薬との反応場として複数のウェル１０が反応基板１に形成される場合について述べた。しかしながら反応場の用途は、増幅対象領域のＤＮＡ断片を増幅させる試薬との反応に限定されるものではない。
【００８２】
例えば、検出対象のＤＮＡ断片を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応、あるいは、検出対象の抗体等のタンパク質を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応、または、検出対象の糖鎖を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応に用いることができる。
【００８３】
上述した実施の形態においては、複数のウェル１０が反応基板１に形成されるような場合について述べた。本発明はこれに限らず、エッペンドルフチューブのように１つの反応場を有する容器に試薬液を固定するような場合においても基板製造工程における第２工程（試薬配置工程）ＳＰ２が適応できる。
【００８４】
上述の実施の形態では、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが反応基板１にマイクロマシンによって形成されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、シート状のフィルムを複数枚張り合わせて、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが設けられた反応基板を製造するようにしてもよい。
【００８５】
上述した実施の形態においては、ウィルスゲノムの有無を判定するために、２箇所に増幅対象領域を設定し、該２箇所の増幅対象領域を増幅するための試薬液が固着された反応基板１を含む２組プライマーマイクロチップ１００を製造するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、所定のＤＮＡの有無を判定するために、該ＤＮＡにおける複数箇所に増幅対象領域を設定し、該複数箇所の増幅対象領域を増幅するための試薬液が固着された反応基板１を含むマイクロチップ３０を製造するようにしてもよい。
【００８６】
上述の実施の形態では、核酸増幅装置として、いわゆるＳＭＡＰ法による測定装置８０が適用されたが、リアルタイムＰＣＲ装置が適用されてもよく、また、増幅量を定量せずに増幅反応を行うＰＣＲ装置が適用されてもよい。また、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法又はＩＣＡＮ法などように等温で核酸増幅する方法を適用し、リアルタイム増幅量を検出するようにしてもよい。
【００８７】
上述した実施の形態においては、冷却部として冷却部２３、試薬注入部として試薬注入部２５によって本発明の反応基板製造装置としての反応基板製造装置８０を構成するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる冷却部、試薬注入部によって反応基板製造装置を構成するようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【００８９】
１……反応基板、１０……ウェル、１１……流路、１２……流入口、１３……通気孔、１４Ａ、１４Ｂ……疎水領域、２０……試薬配置装置、２１……制御部、２１Ａ……駆動部、２１Ｂ……温度調整部、２２……基板搬送機構、２３……冷却部、２４……試薬導入・洗浄機構、２５……試薬注入部、３０……マイクロチップ、３１……シリコンコート、３２……蓋、８０……測定装置、８１……マイクロチップ格納部、８２……温度制御部、８３……励起光照射部、８４……蛍光受光部、８５……増幅曲線描画部。
【技術分野】
【０００１】
本発明は反応基板製造方法及び反応基板製造装置に関し、例えば核酸を増幅する際に用いる反応基板を製造する場合に適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸における特定の塩基配列領域を増幅する方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）や等温遺伝子増幅法であるＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法やＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法などがある。これらの増幅反応を行う装置では、増幅反応を行わせる場として複数の微小容器を有する反応基板が用いられる。
【０００３】
この反応基板は、マイクロマシン／ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）技術を用いて、プラスチック等の樹脂材やガラスからなる基板にエッチングやレーザ光などによって、複数の微小容器及び該微小容器を繋ぎ検体溶液及び試薬液を流す流路が形成される。
【０００４】
現行の反応基板は、検体溶液及び試薬液を別々に微小容器に注入する構造となっているものが殆どである。
【０００５】
これに対して反応基板における微小容器に試薬をパラフィンで密閉して固定しておき、反応させる際に熱を加えてパラフィンを溶かして検体と試薬を反応させるようになされたものが提案されている（例えば特許文献１参照）。
【０００６】
また特許文献１には、試薬が添加されたゲル状のゼラチンを微小容器に固定しておき、反応させる際に熱を加えてゼラチンをゾル化させてから検体と試薬を反応させるようになされたものも提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１３４２２７公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで上述した反応基板では、検体と試薬を反応させる際に、パラフィン又はゼラチンが微小容器内に溶けて存在しているため、反応に影響を与えたり、測定時のバックグラウンドノイズとなる可能性があり、安定した測定を行わせることができなくなるといった問題があった。
【０００９】
本発明は以上の点を考慮してなされたもので、短時間で安定した測定を行わせ得る反応基板製造方法及び反応基板製造装置を提案しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するため本発明においては、反応基板製造方法であって、試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却工程と、液を反応基板における反応場に液滴として吐出する吐出工程とを有する。
【００１１】
また本発明においては、反応基板製造装置であって、試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却部と、液を反応基板における反応場に液滴として吐出する資料注入部とを有する。
【００１２】
これにより、試薬を含む液が氷結した状態で試薬を反応場に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができると共に、予め試薬を反応場に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように本発明によれば、試薬を含む液が氷結した状態で試薬を反応場に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができると共に、予め試薬を反応場に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができ、かくして短時間で安定した測定を行わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】反応基板製造工程を示すフローチャートである。
【図２】反応基板における流路、反応場、流入口及び通気孔の形成を示す概略図である。
【図３】マイクロチップの構成を示す概略図である。
【図４】試薬配置装置の構成を示す概略図である。
【図５】試薬配置工程を示すフローチャートである。
【図６】吐出工程の説明に供する概略図である。
【図７】ＳＭＡＰ法における増幅対象領域の説明に供する概略図である。
【図８】ウィルスゲノムに対する２箇所の増幅対象領域の設定の説明に供する概略図である。
【図９】２本鎖ＤＮＡに対する増幅対象領域及び制限酵素の設定の説明に供する概略図である。
【図１０】測定装置の構成（１）を示す概略図である。
【図１１】測定装置の構成（２）を示す概略図である。
【図１２】増幅曲線及びネガティブコントロールのグラフを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための形態について説明する。なお、説明は以下の順序とする。
＜１．実施の形態＞
［１−１．反応基板製造］
［１−２．ＳＭＡＰ法による測定］
＜２．他の実施の形態＞
【００１６】
＜１．実施の形態＞
［１−１．反応基板製造］
［１−１−１．反応基板製造工程］
図１において反応基板製造工程の手順を示す。第１工程ＳＰ１では、図２（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、プラスチック等の樹脂材やガラスからなる反応基板１に、反応場とされる複数の容器（以下、これをウェルとも呼ぶ）１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが形成される。
【００１７】
これらウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂは、マイクロマシンによるエッチングやレーザ光照射などにより、反応基板１から不要部分が除去されて形成される。なお、説明の便宜上、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂをまとめて溝とも呼ぶ。
【００１８】
流路１１は、検体溶液が注入される流入口１２から複数のウェル１０までの入口側流路１１Ａと、該複数のウェル１０から通気孔１３までの出口側流路１１Ｂとからなる。
【００１９】
入口側流路１１Ａのウェル１０側には、該入口側流路１１Ａの溝を狭くして検体溶液を流れ難くする疎水領域１４Ａが設けられ、また出口側流路１１Ｂのウェル１０側にも該出口側流路１１Ｂの溝を狭くして検体溶液を流れ難くする疎水領域１４Ｂが設けられる。
【００２０】
これにより、ウェル１０内の検体溶液及び試薬が入口側流路１１Ａ及び出口側流路１１Ｂを辿って他のウェル１０に流入することを防止することができる。
【００２１】
なお、疎水領域１４Ａ及び１４Ｂは、検体溶液を流れ難くする構造又はウェル１０に検体溶液が流入した後に該ウェル１０から検体溶液が流れなくなる構造であれば、溝を狭くする構成以外でもよい。
【００２２】
第２工程（試薬配置工程）ＳＰ２では、後述するように、試薬配置装置２０（図４）によって試薬配置工程の手順（図５）に従って複数のウェル１０に試薬がそれぞれ配置される。
【００２３】
第３工程ＳＰ３では、図３に示すように、反応基板１の溝が形成された面側に、該反応基板１の流入口１２及び通気孔１３に対向する位置に穴が開けられたシリコンコート３１及び蓋３２が接着され、マイクロチップ３０としてパッケージ化される。
【００２４】
［１−１−２．試薬配置装置の構成］
試薬配置装置２０は、図４に示すように、制御部２１が全体を統括制御するようになされており、基板搬送機構２２、冷却部２３、試薬導入・洗浄機構２４及び試薬注入部２５が適宜制御される。
【００２５】
制御部２１はＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）を含むコンピュータ構成でなり、主に駆動部２１Ａ及び温度調整部２１Ｂとして機能する。
【００２６】
基板搬送機構２２は、第１工程ＳＰ１で溝が形成された反応基板１を冷却部２３の上面に搬入する。また基板搬送機構２２は、冷却部２３の上面に載置された反応基板１を外部に搬出する。
【００２７】
冷却部２３は、反応基板１が載置される台と該台の上面に配される例えばペルチェ素子などの冷却素子とを含む構成とされ、温度調整部２１Ｂの制御に基づいて冷却素子により反応基板１を冷却する。
【００２８】
試薬導入・洗浄機構２４は、試薬が混合された液（以下、これを試薬液とも呼ぶ）を導入する位置（以下、これを導入位置とも呼ぶ）に試薬注入部２５を移動させて、該試薬注入部２５に試薬液を導入する。また試薬導入・洗浄機構２４は、試薬注入部２５を洗浄する位置（以下、これを洗浄位置とも呼ぶ）に移動させて、該試薬注入部２５を洗浄する。なお本実施の形態においては、試薬が混合される液が純水である場合について説明するが、例えば生理食塩水などの他の液が適応されていてもよい。
【００２９】
試薬注入部２５は、試薬液を液滴にして吐出する管状の供給口２５Ａが反応基板１における複数のウェル１０の数及び配置と一致するように複数設けられる。また試薬注入部２５は、試薬導入・洗浄機構２４により導入された試薬液を貯めておく保持部（図示せず）が設けられており、保持部に保持された試薬液を駆動部２１Ａの制御に基づいて供給口２５Ａを介して数ｐＬの液滴にしてウェル１０に吐出する。
【００３０】
試薬配置装置２０は、図5に示すように、第２工程ＳＰ２の搬入工程ＳＰ１１において、第１工程ＳＰ１で溝が形成された反応基板１を基板搬送機構２２により搬入して冷却部２３の上面に載置する。
【００３１】
試薬配置装置２０は次の冷却工程ＳＰ１２において、温度調整部２１Ｂの制御に基づいて冷却部２３の冷却素子により、試薬液が固体となる温度（以下、これを凝固温度とも呼ぶ）である０℃以下の例えば−２０℃程度に反応基板１を冷却する。
【００３２】
試薬配置装置２０は次の試薬液導入工程ＳＰ１３において、試薬導入・洗浄機構２４により試薬注入部２５を導入位置に移動し、該試薬注入部２５の保持部に試薬液を導入する。そして試薬配置装置２０は、試薬導入・洗浄機構２４により試薬液が導入された試薬注入部２５を反応基板１上に移動させる。
【００３３】
試薬配置装置２０は次の吐出工程ＳＰ１４において、図６に示すように、駆動部２１Ａの制御に基づいて試薬注入部２５の保持部に貯められた試薬液を供給口２５Ａを介して液滴にして反応基板１のウェル１０に吐出する。
【００３４】
供給口２５Ａから吐出された液滴は、数ｐＬであり反応基板１に対して熱容量が十分小さいため、該反応基板１のウェル１０に接触するとすぐに氷結して該ウェル１０に固着する。
【００３５】
試薬配置装置２０は次の判断工程ＳＰ１５において、すべての試薬がウェル１０に入れられたか否かを制御部２１により判断する。試薬配置装置２０は、他の試薬をウェル１０に入れる場合には次の洗浄工程ＳＰ１６において、試薬導入・洗浄機構２４により試薬注入部２５を洗浄位置に移動させ、該試薬注入部２５を洗浄する。
【００３６】
そして試薬配置装置２０は、試薬液導入工程ＳＰ１３に戻って次の試薬液を試薬注入部２５に導入し、吐出工程ＳＰ１４で該試薬液をウェル１０に液滴にして吐出する。このときウェル１０では、先に入れられた試薬液は氷結しているため、後に入れられた試薬液とは混合することなく、別々に氷結されて固着した状態となる。
【００３７】
試薬配置装置２０は判断工程ＳＰ１５ですべての試薬がウェル１０に入れられたと判断した場合には次の搬出工程ＳＰ１７において、基板搬送機構２２により反応基板１をマイクロチップ組立装置（図示せず）に搬出する。このとき試薬配置装置２０は、凝固温度以下に反応基板１を維持したままマイクロチップ組立装置に搬出する。
【００３８】
マイクロチップ組立装置は、凝固温度以下に反応基板１を維持したまま、第３工程ＳＰ３においてマイクロチップ３０を製造する。
【００３９】
このようにして製造されたマイクロチップ３０は所定の保管容器内で凝固温度以下に維持されたまま保管される。
【００４０】
［１−１−３．反応基板製造例（１）］
ここで後述するＳＭＡＰ法による測定に用いられる反応基板１を含むマイクロチップ３０の製造例について説明する。
【００４１】
ところでＳＭＡＰ法では、５種類のプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素などが試薬として用いられる。ＳＭＡＰ法では、図７に示すように、４種類のプライマー５１を用いてＤＮＡ５０における増幅対象とされる領域（以下、これを増幅対象領域とも呼ぶ）５０Ａを鋳型として中間体が生成され、該中間体が複製されていくことにより増幅対象領域５０Ａが増幅される。
【００４２】
ＳＭＡＰ法では、増幅対象領域５０Ａが存在しない状態でも導入されたプライマー部分が増幅されることをネガティブコントロールとして用いることから、増幅対象領域５０Ａの有無を判断するまでに余分な時間がかかってしまうことになる。
【００４３】
例えばウィルスゲノムを増幅対象とする場合、一般にウィルスゲノムは十分に長い。そこで、図８に示すように、ウィルスゲノム６０に対して例えば２箇所の増幅対象領域６０Ａ及び６０Ｂをそれぞれ鋳型として増幅させる２種類の異なるプライマー群（５種類のプライマーの組を２組）が固着された反応基板１を製造する。
【００４４】
試薬配置装置２０は、冷却部２３によって凝固温度以下に冷却された反応基板１に１組目のプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出してウェル１０に氷結固着させる。
【００４５】
次に試薬配置装置２０は、試薬注入部２５を試薬導入・洗浄機構２４により洗浄した後、１組目のプライマーを含む試薬液がウェル１０に氷結固着している状態で、２組目のプライマーを含む試薬液を試薬注入部２５から吐出して該ウェル１０に氷結固着させる。
【００４６】
このようにして２組のプライマーがそれぞれ含まれる試薬液がウェル１０に別々に氷結固着している状態の反応基板１にシリコンコート３１及び蓋３２が接着されてマイクロチップ３０が製造される。なお、説明の便宜上、このマイクロチップ３０を２組プライマーマイクロチップ１００とも呼ぶ。
【００４７】
［１−１−４．反応基板製造例（２）］
ＳＭＡＰ法による測定に用いられるマイクロチップ３０の製造の別例について説明する。ところでＳＭＡＰ法では、一般的には６０℃で増幅反応を行わせるため、２本鎖ＤＮＡが１本鎖ＤＮＡに乖離する温度としては低く、２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が低い。従って１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も低く、増幅開始までに時間がかかることになる。
【００４８】
そこで、図９に示すように、２本鎖ＤＮＡ７０における増幅対象領域７０Ａ以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素７１を、増幅対象領域７０Ａを増幅するためのプライマー７２と共に固着された反応基板１を製造する。
【００４９】
この場合、試薬配置装置２０は、冷却部２３によって凝固温度以下に冷却された反応基板１にプライマー、酵素、ｄＮＴＰ及び蛍光色素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出してウェル１０に氷結固着させる。
【００５０】
次に試薬配置装置２０は、試薬注入部２５を試薬導入・洗浄機構２４により洗浄した後、プライマーを含む試薬液がウェル１０に氷結固着している状態で、増幅対象領域以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素を含む試薬液を試薬注入部２５から吐出して該ウェル１０に氷結固着させる。
【００５１】
このようにしてプライマー及び制限酵素がそれぞれ含まれる試薬液がウェル１０に別々に氷結固着している状態の反応基板１にシリコンコート３１及び蓋３２が接着されてマイクロチップ３０が製造される。なお、説明の便宜上、このマイクロチップ３０を制限酵素入マイクロチップ２００とも呼ぶ。
【００５２】
［１−２．ＳＭＡＰ法による測定］
［１−２−１．測定装置］
図１０に示すように測定装置８０は、マイクロチップ格納部８１、温度制御部８２、励起光照射部８３、蛍光受光部８４及び増幅曲線描画部８５により構成される。
【００５３】
マイクロチップ格納部８１は、マイクロチップ３０が格納される空間を有し、マイクロチップ３０における各ウェル１０を加熱する過熱素子（図示せず）及び該ウェル１０の温度を測定する感温素子（図示せず）が設けられる。
【００５４】
マイクロチップ格納部８１には、上述した反応基板製造方法により製造された反応基板１を含むマイクロチップ３０に検体溶液が注入された後、該マイクロチップ３０が挿入される。
【００５５】
温度制御部８２は、感温素子を用いて所定間隔ごとにウェル１０の温度をセンシングし、該感温素子においてセンシングされる温度と、目標温度（６０℃）との差を求め、該差に応じて加熱素子に与えるべき電流又は電圧を可変する。これによりウェル１０の温度を目標温度に維持し得る。
【００５６】
励起光照射部８３は、レーザを含む構成とされ、図１１に示すように、ウェル１０に対してレーザ光を照射する。蛍光受光部８４は、受光素子を含む構成とされ、ウェル１０から発せられる蛍光を所定時間間隔ごとに受光し、受光した蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。
【００５７】
増幅曲線描画部８５は、蛍光受光部８４から所定間隔ごとに供給される蛍光強度に応じた増幅対象領域の増幅量を算出すると共に、時間に対する蛍光強度を示す増幅曲線を描画し、増幅対象領域の有無を判定する。
【００５８】
［１−２−２．２組プライマーマイクロチップを用いた増幅測定］
次に２組プライマーマイクロチップ１００を用いた増幅測定について説明する。具体的には、所定の保存容器で凝固温度以下に維持された２組プライマーマイクロチップ１００が測定開始直前に保存容器から取り出される。このとき２組プライマーマイクロチップ１００は常温の雰囲気に晒されるため、ウェル１０に氷結固着された試薬液が溶けて液体になる。
【００５９】
そして２組プライマーマイクロチップ１００には、注入口１３から検体溶液がすべてのウェル１０に行き渡るように注入される。因みに、注入口１３から注入された検体溶液が通気孔１４から出てきたのを確認することにより全てのウェル１０に検体溶液が注入したことを確認することができる。
【００６０】
測定装置８０は、ウェル１０に検体溶液が注入された２組プライマーマイクロチップ１００がマイクロチップ格納部８１に挿入された後、所定の開始命令を受けると、温度制御部８２により各ウェル１０が６０℃になるように加熱されてその温度を維持する。
【００６１】
測定装置８０は、励起光照射部８３から所定間隔ごとにウェル１０に対して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発せられた蛍光を蛍光受光部８４で受光して蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。
【００６２】
増幅曲線描画部８５は、時間に対する蛍光強度を示す増幅曲線を描画する。ここで２組プライマーマイクロチップ１００を用いて測定された増幅曲線及びネガティブコントロールと、１組のプライマーだけを用いて増幅対象領域が増幅された場合の増幅曲線及びネガティブコントロールとを図１２に示す。
【００６３】
図１２からも明らかなように、増幅対象領域の数を増加させることにより、増幅対象領域及びネガティブコントロールが共に増加する。しかしながら増幅対象領域の数を増加させることにより、ネガティブコントロールの増幅勾配に比べて増幅対象領域の増幅勾配が急になるので、結果として増幅対象領域の有無の判断を速めることができる。
【００６４】
［１−２−３．２組プライマーマイクロチップを用いた増幅測定］
次に制限酵素入マイクロチップ２００を用いた増幅測定について説明する。具体的には、所定の保存容器で凝固温度以下に維持された制限酵素入マイクロチップ２００が測定開始直前に保存容器から取り出される。このとき制限酵素入マイクロチップ２００は常温の雰囲気に晒されるため、ウェル１０に氷結固着された試薬液が溶けて液体になる。
【００６５】
そして制限酵素入マイクロチップ２００には、流入口１３から検体溶液がすべてのウェル１０に行き渡るように注入される。
【００６６】
測定装置８０は、ウェル１０に検体溶液が注入された制限酵素入マイクロチップ２００がマイクロチップ格納部８１に挿入された後、所定の開始命令を受けると、温度制御部８２により各ウェル１０が６０℃になるように加熱してその温度を維持する。
【００６７】
このとき増幅対象領域以外の塩基配列が制限酵素により切断され、増幅対象領域を含む塩基配列が短くなるので、この領域の２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が高くなる。従って増幅対象領域の１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も高くなり、増幅開始までの時間が短縮される。
【００６８】
測定装置８０は、励起光照射部８３から所定間隔ごとにウェル１０に対して励起光を照射し、該励起光によって励起されて発せられた蛍光を蛍光受光部８４で受光して蛍光強度を増幅曲線描画部８５に送出する。増幅曲線描画部８５は、時間に対する増幅対象領域の増幅を示す増幅曲線を描画する。
【００６９】
従って測定装置８０は、増幅開始までの時間が短縮されていることにより、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７０】
［１−３．動作及び効果］
以上の構成において、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却する冷却工程と、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により液滴にして吐出する吐出工程とにより、試薬が固着した反応基板１を製造するようにした。
【００７１】
この反応基板１では、試薬を含む液滴が凝固温度以下に冷却された反応基板１に接触すると氷結するので、試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができる。これによりこの反応基板１を用いて例えば核酸増幅反応を行わせる際、試薬を劣化させることなく、またウェル１０にノイズの原因となる不純物が存在することなく、安定した測定を行わせることができる。
【００７２】
また反応基板１には測定に必要とされる試薬が予め固着されているため、検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。従って試薬配置装置２０により製造された反応基板１を含むマイクロチップ３０を用いて測定する場合、検体溶液をマイクロチップ３０に注入させるだけでよく、試薬液を別途注入させる場合と比して短時間で測定させることができる。
【００７３】
また複数種類の試薬液をウェル１０に固着させたい場合、それぞれの試薬液を別々にウェル１０に吐出することにより、該複数種類の試薬液が混合することなく別々に氷結されて固着する。
【００７４】
したがって反応基板１では、複数種類の試薬液が混合することにより試薬同士が反応してしまうことを未然に防止することができると共に、複数種類の試薬液をそれぞれ別々にウェル１０に導入する場合に比して短時間で測定を開始させることができる。
【００７５】
また、増幅対象領域における異なる複数の領域をそれぞれ増幅するプライマー群を含む試薬液を別々にウェル１０に吐出して氷結固着させた反応基板１を製造するようにした。
【００７６】
この反応基板１を用いて増幅対象領域の有無を判定する場合、ネガティブコントロールの増幅勾配に比べて増幅対象領域の増幅勾配が急になるので、結果として検出速度を速めることができる。従って測定装置８０は、この反応基板１を用いた場合、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７７】
さらに、増幅対象領域を増幅するためのプライマーを含む試薬液と、２本鎖ＤＮＡにおける増幅対象領域以外の塩基配列を認識して切断する制限酵素を含む試薬液とを別々にウェル１０に吐出して氷結固着させた反応基板１を製造するようにした。
【００７８】
この反応基板１を用いてＳＭＡＰ法による増幅対象領域の有無を判定する場合、増幅対象領域以外の塩基配列が制限酵素により切断され、増幅対象領域を含む塩基配列が短くなるので、この領域の２本鎖ＤＮＡが乖離する確率が高くなる。従って増幅対象領域の１本鎖ＤＮＡにプライマーが結合する確率も高くなり、増幅開始までの時間が短縮されるので、測定装置８０は、この反応基板１を用いた場合、増幅対象領域の有無を短時間で判定することができる。
【００７９】
以上の構成によれば、ウェル１０を有する反応基板１を凝固温度以下に冷却し、該反応基板１のウェル１０に試薬を含む液を試薬注入部２５により吐出し、試薬が固着した反応基板１を製造するようにした。
【００８０】
これにより、試薬を含む液が氷結した状態でウェル１０に固着させることができるので、ノイズの原因となる不純物が混在することなく、また試薬を乾燥させることなく安定した状態で固定させておくことができる。また、予め試薬をウェル１０に固着させているので検体溶液を注入させるだけで測定を開始させることができる。かくして、短時間で安定した測定を行わせることができる。
【００８１】
＜２．他の実施の形態＞
上述の実施の形態では、増幅対象領域のＤＮＡ断片を増幅させる試薬との反応場として複数のウェル１０が反応基板１に形成される場合について述べた。しかしながら反応場の用途は、増幅対象領域のＤＮＡ断片を増幅させる試薬との反応に限定されるものではない。
【００８２】
例えば、検出対象のＤＮＡ断片を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応、あるいは、検出対象の抗体等のタンパク質を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応、または、検出対象の糖鎖を選択的に結合する性質をもつ試薬との反応に用いることができる。
【００８３】
上述した実施の形態においては、複数のウェル１０が反応基板１に形成されるような場合について述べた。本発明はこれに限らず、エッペンドルフチューブのように１つの反応場を有する容器に試薬液を固定するような場合においても基板製造工程における第２工程（試薬配置工程）ＳＰ２が適応できる。
【００８４】
上述の実施の形態では、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが反応基板１にマイクロマシンによって形成されるようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、シート状のフィルムを複数枚張り合わせて、ウェル１０、流路１１、流入口１２、通気孔１３及び疎水領域１４Ａ、１４Ｂが設けられた反応基板を製造するようにしてもよい。
【００８５】
上述した実施の形態においては、ウィルスゲノムの有無を判定するために、２箇所に増幅対象領域を設定し、該２箇所の増幅対象領域を増幅するための試薬液が固着された反応基板１を含む２組プライマーマイクロチップ１００を製造するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、所定のＤＮＡの有無を判定するために、該ＤＮＡにおける複数箇所に増幅対象領域を設定し、該複数箇所の増幅対象領域を増幅するための試薬液が固着された反応基板１を含むマイクロチップ３０を製造するようにしてもよい。
【００８６】
上述の実施の形態では、核酸増幅装置として、いわゆるＳＭＡＰ法による測定装置８０が適用されたが、リアルタイムＰＣＲ装置が適用されてもよく、また、増幅量を定量せずに増幅反応を行うＰＣＲ装置が適用されてもよい。また、例えばＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法又はＩＣＡＮ法などように等温で核酸増幅する方法を適用し、リアルタイム増幅量を検出するようにしてもよい。
【００８７】
上述した実施の形態においては、冷却部として冷却部２３、試薬注入部として試薬注入部２５によって本発明の反応基板製造装置としての反応基板製造装置８０を構成するようにした場合について述べた。本発明はこれに限らず、その他種々の構成でなる冷却部、試薬注入部によって反応基板製造装置を構成するようにしても良い。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、生物実験、医薬の創製又は患者の経過観察などのバイオ産業上において利用可能である。
【符号の説明】
【００８９】
１……反応基板、１０……ウェル、１１……流路、１２……流入口、１３……通気孔、１４Ａ、１４Ｂ……疎水領域、２０……試薬配置装置、２１……制御部、２１Ａ……駆動部、２１Ｂ……温度調整部、２２……基板搬送機構、２３……冷却部、２４……試薬導入・洗浄機構、２５……試薬注入部、３０……マイクロチップ、３１……シリコンコート、３２……蓋、８０……測定装置、８１……マイクロチップ格納部、８２……温度制御部、８３……励起光照射部、８４……蛍光受光部、８５……増幅曲線描画部。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却工程と、
上記液を上記反応基板における反応場に吐出する吐出工程と
を有する反応基板製造方法。
【請求項２】
吐出工程では、
吐出された液が上記反応場で凝固した後、他の試薬が混ぜられた液を上記反応場に吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項３】
吐出工程では、
上記反応基板の熱容量より十分小さい液滴を吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項４】
吐出工程では、
2本鎖ＤＮＡにおける増幅対象とされる領域をＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法により増幅するための試薬が混ぜられた液、及び該領域以外の２本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素が混ぜられた液を別々に吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項５】
試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却部と、
上記液を上記反応基板における反応場に吐出する試薬注入部と
を有する反応基板製造装置。
【請求項１】
試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却工程と、
上記液を上記反応基板における反応場に吐出する吐出工程と
を有する反応基板製造方法。
【請求項２】
吐出工程では、
吐出された液が上記反応場で凝固した後、他の試薬が混ぜられた液を上記反応場に吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項３】
吐出工程では、
上記反応基板の熱容量より十分小さい液滴を吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項４】
吐出工程では、
2本鎖ＤＮＡにおける増幅対象とされる領域をＳＭＡＰ（Smart Amplification Process）法により増幅するための試薬が混ぜられた液、及び該領域以外の２本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素が混ぜられた液を別々に吐出する
請求項１に記載の反応基板製造方法。
【請求項５】
試薬が混ぜられた液が固体になる温度以下に反応基板を冷やす冷却部と、
上記液を上記反応基板における反応場に吐出する試薬注入部と
を有する反応基板製造装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１３９６４１（Ｐ２０１１−１３９６４１Ａ）
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７６１（Ｐ２０１０−７６１）
【出願日】平成２２年１月５日（２０１０．１．５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月５日（２０１０．１．５）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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