受精を促進するための組成物
【課題】高い確率で哺乳動物の卵子受精を行うことを可能とする組成物の提供。
【解決手段】哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなる組成物が開示される。
【解決手段】哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなる組成物が開示される。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物における妊娠の促進および不妊治療に関するものであり、より詳細には、受精を促進するための組成物に関するものである。
【０００２】
背景技術
アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、血圧や細胞外容量の調節に関わるレニン−アンギオテンシン系（Renin-Angiotensin System; RAS）の一部として広く知られている。レニンは血中のアンギオテンシノーゲンに作用し、アンギオテンシンＩ（１−１０）（ＡＩ）を遊離する。ＡＩは血管内皮細胞膜にあるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩＩ（１−８）（ＡＩＩ）に変換される。一方で、ＡＣＥ２の作用により、ＡＩはアンギオテンシン（１−９）に変換され、ＡＩＩはアンギオテンシン（１−７）に変換される。ＡＩＩは強力な血管収縮作用を有し、この作用により血圧を上昇させる。また、ＡＩＩは副腎にも作用してアルドステロンの生成・分泌を促進させ、血圧を上昇させる。この作用を標的として、ＡＣＥ阻害剤やアンギオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＢ）が高血圧や心臓病の治療薬として用いられている。ＡＣＥ阻害剤は、ＡＣＥを阻害し、ＡＣＥ２の作用を優勢とするため、ＡＩＩの存在量よりも血管拡張をもたらすアンギオテンシン（１−７）の存在量が多くなり、結果として血圧が降下する。
【０００３】
レニン−アンギオテンシン系の生殖能への関与が、最近いくつか報告されている。アンギオテンシンＩＩは、精子の運動性の向上ならびに受精能の獲得を刺激することが知られている（特許文献１：国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット；特許文献２：国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット；特許文献３：国際公開第９５／３２７２５号パンフレット；非特許文献１：Regul Pept, 3; 67(2), 131-5 (1996)；非特許文献２：Journal of Reproduction and Fertility, 120, 135-142 (2000)）。
【０００４】
国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット（特許文献１）では、アンギオテンシンＩＩを添加した培地中において、精子添加の７５分後に５５．２％もの卵細胞を受精させている。コントロールの未添加区では卵細胞の１９．５％しか受精しなかったことから、アンギオテンシンＩＩによって有意に精子運動性が向上し、高い確率で受精卵を得られることが証明されている。国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット（特許文献２）では、フィブロネクチンを精子運動性低下に伴う非受精能獲得状態での精子の保存添加物として用い、アンギオテンシンＩＩを精子運動性の強化による受精能獲得に用いることができると報告している。国際公開第９５／３２７２５号パンフレット（特許文献３）では、アンギオテンシンＩＩは、ヒト精子の運動力および線形運動速度も増加させると報告されている。
【０００５】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）については、精巣型ＡＣＥが生殖に関与していることが報告されている（非特許文献３：Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 2552-2557 (1998)）。この報告では、精巣型ＡＣＥをノックアウトしたｓｔｓｔノックアウトマウスにおいて、精子数、精子運動性、先体反応などには問題はないが、出産数の極端な低下および精子の透明帯へ結合能の低下が報告され、さらにはｓｔｓｔ精子が雌生殖器官（卵管）へほとんど到達出来なかったと報告されている。さらに、２００５年には、精巣型ＡＣＥがグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質遊離活性（ＧＰＩアーゼ活性）を有し、ＴＥＳＰ５およびＰＨ−２０などのＧＰＩアンカー型タンパク質を精子細胞表面から遊離させることが報告されている。さらに、ＡＣＥノックアウトマウスの精子については透明帯への結合不全による雄性不妊が知られているが、この精子をペプチダーゼ不活性型ＡＣＥで処理したところ、受精能が回復したことが報告されている。このことからＡＣＥはin vivoでＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を有し、受精の際に重要な役割を果たしていることが示された（非特許文献４：Nature medicine, 11, 160-166 (2005)；特許文献４：国際公開第２００４／０３９３９６号パンフレット）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／３２７２５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０３９３９６号パンフレット
【非特許文献１】Regul Pept, 3; 67(2), 131-5 (1996)
【非特許文献２】Journal of Reproduction and Fertility, 120, 135-142 (2000)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 2552-2557 (1998)
【非特許文献４】Nature medicine, 11, 160-166 (2005)
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、哺乳動物精子の卵子透明帯への結合ならびに受精にＡＣＥ２活性が関与すること、さらには、ＡＣＥ２活性の阻害により受精を促進させることが可能となることを見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、高い確率で哺乳動物の卵子受精を行うことを可能とする組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
そして、本発明による組成物は、哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなるものである。
【００１０】
本発明によれば、哺乳動物の卵子受精を高い確率で行うことができる。これにより、不妊症、特に雄性不妊の病態を有する哺乳動物において、妊娠の確率を増加させることが可能となる。また、本発明によれば、凍結保存精子を用いた卵子受精も可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
哺乳動物の精子は、精巣で形成され、精巣上体を通過する間に運動性を獲得し、成熟する。精子は雌性生殖路内で卵母細胞を受精させるために必要な先体反応と受精能獲得とよばれる成熟変化を遂げる。先体反応は脊椎動物および無脊椎動物に広く見られる現象であり、一方で、受精能獲得は哺乳動物のみに見られる現象である。先体反応とは、精子頭部の先体内に含まれる各種の加水分解酵素が放出され、これら酵素の作用により卵丘細胞の遊離ならびに透明帯への結合を可能とする現象である。
【００１２】
本明細書では、ＡＣＥ２を過剰発現するマウスにおいて、産仔数の極端な低下と体外受精率の低下、さらには卵子透明帯への結合能の低下が見出されている。さらに、本明細書では、ＡＣＥ２阻害剤を用いることにより、ＡＣＥ２を過剰発現するマウスおよび通常のマウスからの精子、ならびに通常は低受精率を示す凍結処理を施したマウス精子のいずれを用いた場合にも、これら精子の卵子透明帯への結合能および体外受精率が改善されることが実証されている。
【００１３】
従って、本発明の一つの態様によれば、哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物が提供され、該組成物はＡＣＥ２阻害剤を含んでなる。さらに、本発明の他の態様によれば、哺乳動物の卵子受精を促進するための薬剤の製造における、ＡＣＥ２阻害剤の使用が提供される。これらの組成物および薬剤は、不妊症、特に雄性不妊の治療用医薬組成物または治療薬としても使用することができる。
【００１４】
本発明において機能阻害の標的とする「アンギオテンシン変換酵素２」または「ＡＣＥ２」は、本発明の対象とする哺乳動物に由来するアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）とすることができる。ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０２１８０４）に示されるヒト由来ＡＣＥ２の配列が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物についても、ヒト由来ＡＣＥ２に対応する同様の遺伝子およびタンパク質を利用することが可能である。例えば、マウス由来ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０２７２８６）に示される。
【００１５】
本発明の対象とする哺乳動物は、ヒトであってもよいし、非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、家畜動物、ペット動物、実験用動物、野生動物などが挙げられ、より具体的には、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、サル等が挙げられる。特に、本発明は、パンダなどの絶滅危惧種、その他の希少動物にも適用可能である。
【００１６】
本発明の対象とする哺乳動物個体（雄性動物および雌性動物のペア）は、好ましくは雄性動物の精子中でＡＣＥ２が過剰発現している個体（ペア）とされる。精子中におけるＡＣＥ２の過剰発現は当技術分野において公知の方法によって検出することができ、例えば、雄性動物から得られた精子サンプルにおけるＡＣＥ２の発現量を測定し、その発現量が正常な精子のものよりも多い場合に、その精子サンプルにおけるＡＣＥ２の過剰発現が検出される。ＡＣＥ２の発現量は、例えば、ＡＣＥ２のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を指標として測定することができる。ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列については上述した通りであり、当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法を用いてＡＣＥ２遺伝子の発現量を測定することができる。比較対照となる正常な精子としては、同種の動物の異なる個体からの正常な精子が用いられる。また、異なる複数の個体からの正常な精子についてＡＣＥ２遺伝子の発現量を測定し、その平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な精子における発現量のデータから、平均値＋標準偏差などの適正値を設定しておき、被験精子の発現量がその適正値よりも高い場合にＡＣＥ２遺伝子の過剰発現があるものと判断してもよい。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は薬物などの小分子とされる。このような小分子は、ＡＣＥ２の阻害活性を指標として、当技術分野において公知の方法によりスクリーニングすることによって得ることができる。ＡＣＥ２の阻害活性は、例えば、候補化合物の存在下でＡＣＥ２とアンギオテンシンＩ（１−１０）を反応させて生成するアンギオテンシン（１−９）を定量し、その定量値が、候補化合物の不在下で得られる定量値よりも低いことを確認することにより確認することができる。あるいは、ＡＣＥ２の阻害活性は、候補化合物の存在下でＡＣＥ２とアンギオテンシンＩＩ（１−８）を反応させて生成するアンギオテンシン（１−７）を定量し、その定量値が、候補化合物の不在下で得られる定量値よりも低いことを確認することにより確認することができる。ＡＣＥ２阻害活性を有する小分子としては、例えば、ＤＸ６００（PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）として市販されているペプチド（Ac-Gly-Asp-Tyr-Ser-His-Cys-Ser-Pro-Leu-Arg-Tyr-Tyr-Pro-Trp-Trp-Lys-Cys-Thr-Tyr-Pro-Asp-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-NH2：配列番号５）が好適に用いられる。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２タンパク質に特異的に結合する抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。このような抗体のＡＣＥ２の阻害活性は、上述のように、当技術分野において公知の方法により確認することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子とされる。アンチセンス法は、特定の遺伝子の発現を抑制するための周知の技術である。一つの具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥ２遺伝子の５’コード領域の配列に基づいて設計された、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡとされる。他の具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥ２遺伝子の転写に関与する領域の配列に相補的となるように設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとされる。このようなアンチセンス核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＥ２遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子とされる。本明細書において、「ｓｉＲＮＡ核酸分子」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ｓｉＲＮＡ核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を抑制することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９〜２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、より長いヌクレオチド配列を含んでなる。このようなｓｉＲＮＡ核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＥ２遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。さらに、前記ｓｉＲＮＡ核酸分子は、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000）。
【００２１】
本明細書では、上述のように、精子におけるＡＣＥ２活性を阻害することにより、該精子の授精能が増強され、卵子の受精率が増加することが実証されている。従って、本発明の他の態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤を用いることによる、哺乳動物の精子の授精能を増強する方法、ならびに人工授精および体外受精のための方法が提供される。
【００２２】
さらに、本明細書では、上述のように、凍結保存されていた精子を用いた場合においても、精子におけるＡＣＥ２活性を阻害することにより卵子の受精率が増加することが実証されている。従って、上記の方法において用いられる精子は、凍結保存されていた精子であってもよい。これは本発明の特に望ましい利点であり、よって、凍結保存精子を用いる上記の方法は本発明の好ましい実施態様を構成する。凍結保存精子を用いる場合には、使用前にこれを融解させればよい。
【００２３】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物の精子の授精能を増強する方法であって、該精子を、本発明による組成物とともにインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。インキュベーションに用いられる培地は、精子の培養に一般的に用いられる培地であってよく、例えば、ＨＴＦ培地が挙げられる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、培地中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を培地に添加することができる。インキュベーションの温度条件は、精子の培養に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。インキュベーションの時間は特に制限されないが、好ましくは１．５時間以上とされる。
【００２４】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物の卵子をin vitroで受精させる方法であって、本発明による組成物の存在下において、精子と卵子を接触させる工程を含んでなる方法が提供される。精子と卵子の接触は適切な培地中で行ってもよい。この目的に用いられる培地は、体外受精用の培地として一般的に用いられる培地であってよく、例えば、ＨＴＦ培地が挙げられる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、培地中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を培地に添加することができる。精子と卵子を接触させるときの温度条件は、体外受精に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。精子と卵子を接触させる時間は体外受精に一般的に必要とされる時間であればよく、特に制限されないが、好ましくは６〜７時間とされる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のin vitro受精法は、上述の精子と卵子を接触させる工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる。このインキュベーション工程は、上記の精子の授精能を増強する方法について記載した通りに行うことができる。
【００２６】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物（例えば非ヒト哺乳動物）の卵子をin vivoで受精させる方法であって、雄性動物からの精子を、本発明による組成物とともに、排卵期にある雌性動物の子宮内に注入する工程を含んでなる方法が提供される。注入される精子としては、適切な液体中に保持されているものを用いてもよい。この目的に用いられる液体は、人工授精用の媒体として一般的に用いられるものであればよい。その場合には、精子を保持している液体中に本発明による組成物を添加し、得られる混合液を子宮内に注入することができる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、精子液中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を液体に添加することができる。注入される精子または精子液の温度は、人工授精に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のin vivo受精法は、上述の精子を子宮内に注入する工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる。このインキュベーション工程は、上記の精子の授精能を増強する方法について記載した通りに行うことができる。
【００２８】
本発明による組成物は、交尾の前に、対象となる哺乳動物の雌性個体の子宮口または子宮内部に塗布することもできる。従って、本発明の他の態様によれば、哺乳動物（例えば非ヒト哺乳動物）の卵子がin vivoで受精する確率を増加させる方法であって、交尾前に、本発明による組成物を、雌性動物の子宮の入口または内部に塗布する工程を含んでなる方法が提供される。
【００２９】
子宮の入口または内部に塗布するための本発明による組成物は、当業者であれば適宜製造することができる。また、組成物中のＡＣＥ２阻害剤を精子に十分に作用させるためには、本発明による組成物は、クリーム、ゼリーまたはペッサリーの形態とすることが好ましい。このような形態の組成物を製造するために用いられる担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、医薬上許容される各種材料から、当業者により適宜選択される。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３１】
以下の実験において、雄マウスとしては、C57BL/6 Crマウス（日本ＳＬＣ）、およびラットclara cell-10kDa protein遺伝子プロモーターの制御下にヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）を発現するrCC10-hACE2トランスジェニックマウス（以下「rCC10-hACE2 Tgマウス」または「ＡＣＥ２トランスジェニックマウス」という。）を使用した。このrCC10-hACE2 Tgマウスに含まれるヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）の発現カセットは図１に示される構造を有し、その全配列は配列番号６に示される通りである。配列番号６に示されるヌクレオチド配列において、第８〜２３９５番残基はラットＣＣ１０プロモーターの配列であり、第２４１２〜４８２９番残基はヒトＡＣＥ２のコード配列であり、第４８３８〜５３７５番残基はウサギβ−グロビンポリＡシグナル配列である。雌マウスとしては、C57BL/6 Crマウス（日本ＳＬＣ）およびICRマウス（日本ＳＬＣ）を使用した。
【００３２】
実施例１：ＡＣＥ２活性の産仔率への影響
成熟rCC10-hACE2 Tg雄マウスと成熟C57BL/6雌マウスの５ペアを、各ペアごとに同一ケージで飼育し、出産した産仔数をカウントした。コントロールとして、成熟C57BL/6雄マウスと成熟C57BL/6雌マウスのペアも同様に飼育し、出産した産仔数をカウントした。結果を下記の表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
rCC10-hACE2 Tg雄マウスの交配による産仔数は3.1±1.2匹であり、C57BL/6雄マウスによる6.9±1.8匹と比較して有意に低い値を示した（Ｐ＜０．０００１）。よって、ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウスによる産仔数は顕著に少ないことが明らかとなった。
【００３５】
実施例２：ＡＣＥ２活性の精子−卵結合への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、精子を採取した。採取した精子は、２５０μｌの精子前培養培地（ＨＴＦ培地）中で、少なくとも１時間半、前培養した。
【００３６】
卵細胞は、過排卵処置を施した成熟雌マウスの卵管膨大部より採取し、卵丘細胞を除去するために１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む１００μｌのＨＴＦ培地中に導入した。
【００３７】
上記の精子前培養培地ならびに卵細胞用のＨＴＦ培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、およびこれを添加していない培地を用いた。
【００３８】
卵丘細胞を除去した卵細胞に、培養した精子を５×１０４精子／ｍｌずつ添加し、２〜２．５時間培養した。培養後、卵細胞より一回り大きい硝子キャピラリーを用い、卵細胞を洗浄し、２％ホルマリンで固定した。精子−卵結合能測定は、倒立顕微鏡下で固定した卵細胞を観察し、卵細胞の透明帯に結合している精子の数をカウントすることにより行った。結果を下記の表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
添加剤を添加しない未処理区では、rCC10-hACE2 Tgマウス精子の卵透明帯への結合能は、C57BL/6マウス精子と比較して顕著に低い値を示した。C57BL/6マウス精子の透明帯結合能は、ＡＣＥ２阻害剤の添加により増加した。また、rCC10-hACE2 Tgマウス精子の透明帯結合能はＡＣＥ２阻害剤により増加しており、その測定値はC57BL/6マウス精子により得られる測定値に匹敵するものであった。
【００４１】
以上の結果から、rCC10-hACE2 Tgマウス（ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウス）およびC57BL/6雄マウスの双方について、各マウスからの精子の透明体結合能がＡＣＥ２の阻害により増強されることが明らかとなった。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２過剰発現の有無にかかわらず、精子−卵透明帯の結合を促進することが明らかとなった。
【００４２】
実施例３：ＡＣＥ２活性の精子−卵融合への影響
実施例２と同様の方法で卵細胞から卵丘細胞を除き、その後、酸性耐ロード液中で卵細胞の透明帯を除去した。得られた卵細胞をＨＴＦ培地中に導入し、培養した精子を５×１０４精子／ｍｌずつ添加し、６〜７時間培養した。培養後、卵細胞より一回り大きい硝子キャピラリーを用い、卵細胞を洗浄し、２％ホルマリンで固定した。精子−卵融合能測定は、倒立顕微鏡下で固定した卵細胞を観察し、卵細胞中に２つ以上の核を観察することによって行なった。結果を下記の表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
C57BL/6マウス精子およびrCC10-hACE2 Tgマウス精子の双方ともが、９５％以上という高い融合率を示した。よって、rCC10-hACE2 Tgマウス精子は正常な卵細胞融合能を有し、従って、ＡＣＥ２は精子の卵細胞膜への融合には関与しないことが明らかとなった。
【００４５】
実施例４：ＡＣＥ２活性の体外受精率への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、精子を採取した。採取した精子は、２５０μｌの精子前培養培地（ＨＴＦ培地）中で、少なくとも１時間半、前培養した。
【００４６】
卵細胞は、過排卵処置を施した成熟C57BL/6雌マウスの卵管膨大部より採取し、２００μｌの受精培地（ＨＴＦ培地）中に導入した。
【００４７】
上記の精子前培養培地ならびに受精培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、およびこれを添加していない培地を用いた。
【００４８】
培養した精子を１×１０５精子／ｍｌ精子ずつ上記の受精培地に添加した。精子添加の６〜７時間後に受精卵をＨＴＦ培地中で洗浄し、翌日までＨＴＦ培地中で培養した。翌日、２細胞期胚をカウントすることにより、受精率を算出した。結果を下記の表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
以上の結果から、rCC10-hACE2 Tgマウス（ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウス）およびC57BL/6雄マウスの双方について、各マウスからの精子による受精率が、ＡＣＥ２の阻害により増加することが明らかとなった。この傾向は、rCC10-hACE2 Tgマウスの精子について特に顕著であった。よって、ＡＣＥ２阻害剤は体外受精率を増加させ、特にＡＣＥ２を過剰発現する雄性動物からの精子による体外受精率を顕著に増加させることが明らかとなった。
【００５１】
実施例５：ＡＣＥ２活性の凍結保存精子−卵結合への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、これを用いて精子の凍結保存および融解を行った。凍結工程ではまず、１対の精巣上体尾部をR18S3精子保存液１００μｌ中で細切し、室温に３分間静置した後、得られる精子懸濁液を１０μｌずつ取り、０．２５ｍｌストローへ充填し、該ストローの両端をポリシーラーで封入した。続いて精子凍結用フロートにストローを入れ、液体窒素気相下に１５分間静置した後、液体窒素中に浸漬した。融解は、液体窒素タンクから取り出した精子ストローを３７℃温水中に１５分間静置することによって行った。
【００５２】
次に、実施例２に記載の手順に従って、融解した精子の卵結合能を調べた。結果を下記の表５に示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】
凍結・融解処理したC57BL/6マウス精子の卵透明帯への結合は、ＡＣＥ２阻害剤を添加しない未処理区と比較して、ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００）処理区において顕著に増加していた（Ｐ＜０．０００１）。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、凍結処理していない新鮮精子だけでなく、凍結保存精子の卵透明帯結合能を増強することが明らかとなった。
【００５５】
実施例６：凍結保存精子による体外受精率へのＡＣＥ２活性の影響
複数系統のマウスに由来する凍結保存精子を、実施例５に記載の手順による凍結・融解処理によって調製した。
【００５６】
未受精卵子は、実施例４と同様に、過排卵処置した雌のC57BL/6マウスの卵管膨大部から採取し、受精培地（ＨＴＦ培地）９０μｌ中に導入した。
【００５７】
次いで、融解精子懸濁液１０μｌを、精子前培養培地（ＨＴＦ培地）９０μｌ中に移し、６０分間前培養後、その１０μｌを未受精卵子を含むＨＴＦドロップに導入した。
【００５８】
なお、上記の精子前培養培地ならびに受精培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、ならびにこれを添加していない培地を用いた。受精率の算出は、実施例４と同様に、２細胞期胚をカウントすることによって行った。結果を下記の表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
凍結・融解処理した２系統のマウス精子による体外受精率は、ＡＣＥ２阻害剤を添加しない未処理区と比較して、ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００）処理区において増加していた。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、凍結処理していない新鮮精子だけでなく、凍結保存精子の受精率を増加させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、rCC10-hACE2トランスジェニックマウスに含まれるヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）の発現カセットの模式図である。
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物における妊娠の促進および不妊治療に関するものであり、より詳細には、受精を促進するための組成物に関するものである。
【０００２】
背景技術
アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、血圧や細胞外容量の調節に関わるレニン−アンギオテンシン系（Renin-Angiotensin System; RAS）の一部として広く知られている。レニンは血中のアンギオテンシノーゲンに作用し、アンギオテンシンＩ（１−１０）（ＡＩ）を遊離する。ＡＩは血管内皮細胞膜にあるアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によりアンギオテンシンＩＩ（１−８）（ＡＩＩ）に変換される。一方で、ＡＣＥ２の作用により、ＡＩはアンギオテンシン（１−９）に変換され、ＡＩＩはアンギオテンシン（１−７）に変換される。ＡＩＩは強力な血管収縮作用を有し、この作用により血圧を上昇させる。また、ＡＩＩは副腎にも作用してアルドステロンの生成・分泌を促進させ、血圧を上昇させる。この作用を標的として、ＡＣＥ阻害剤やアンギオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＢ）が高血圧や心臓病の治療薬として用いられている。ＡＣＥ阻害剤は、ＡＣＥを阻害し、ＡＣＥ２の作用を優勢とするため、ＡＩＩの存在量よりも血管拡張をもたらすアンギオテンシン（１−７）の存在量が多くなり、結果として血圧が降下する。
【０００３】
レニン−アンギオテンシン系の生殖能への関与が、最近いくつか報告されている。アンギオテンシンＩＩは、精子の運動性の向上ならびに受精能の獲得を刺激することが知られている（特許文献１：国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット；特許文献２：国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット；特許文献３：国際公開第９５／３２７２５号パンフレット；非特許文献１：Regul Pept, 3; 67(2), 131-5 (1996)；非特許文献２：Journal of Reproduction and Fertility, 120, 135-142 (2000)）。
【０００４】
国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット（特許文献１）では、アンギオテンシンＩＩを添加した培地中において、精子添加の７５分後に５５．２％もの卵細胞を受精させている。コントロールの未添加区では卵細胞の１９．５％しか受精しなかったことから、アンギオテンシンＩＩによって有意に精子運動性が向上し、高い確率で受精卵を得られることが証明されている。国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット（特許文献２）では、フィブロネクチンを精子運動性低下に伴う非受精能獲得状態での精子の保存添加物として用い、アンギオテンシンＩＩを精子運動性の強化による受精能獲得に用いることができると報告している。国際公開第９５／３２７２５号パンフレット（特許文献３）では、アンギオテンシンＩＩは、ヒト精子の運動力および線形運動速度も増加させると報告されている。
【０００５】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）については、精巣型ＡＣＥが生殖に関与していることが報告されている（非特許文献３：Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 2552-2557 (1998)）。この報告では、精巣型ＡＣＥをノックアウトしたｓｔｓｔノックアウトマウスにおいて、精子数、精子運動性、先体反応などには問題はないが、出産数の極端な低下および精子の透明帯へ結合能の低下が報告され、さらにはｓｔｓｔ精子が雌生殖器官（卵管）へほとんど到達出来なかったと報告されている。さらに、２００５年には、精巣型ＡＣＥがグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質遊離活性（ＧＰＩアーゼ活性）を有し、ＴＥＳＰ５およびＰＨ−２０などのＧＰＩアンカー型タンパク質を精子細胞表面から遊離させることが報告されている。さらに、ＡＣＥノックアウトマウスの精子については透明帯への結合不全による雄性不妊が知られているが、この精子をペプチダーゼ不活性型ＡＣＥで処理したところ、受精能が回復したことが報告されている。このことからＡＣＥはin vivoでＧＰＩアンカー型タンパク質遊離活性を有し、受精の際に重要な役割を果たしていることが示された（非特許文献４：Nature medicine, 11, 160-166 (2005)；特許文献４：国際公開第２００４／０３９３９６号パンフレット）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０１／０１３９３２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０５１４１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／３２７２５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０３９３９６号パンフレット
【非特許文献１】Regul Pept, 3; 67(2), 131-5 (1996)
【非特許文献２】Journal of Reproduction and Fertility, 120, 135-142 (2000)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95: 2552-2557 (1998)
【非特許文献４】Nature medicine, 11, 160-166 (2005)
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、哺乳動物精子の卵子透明帯への結合ならびに受精にＡＣＥ２活性が関与すること、さらには、ＡＣＥ２活性の阻害により受精を促進させることが可能となることを見出した。本発明は、これら知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、高い確率で哺乳動物の卵子受精を行うことを可能とする組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
そして、本発明による組成物は、哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなるものである。
【００１０】
本発明によれば、哺乳動物の卵子受精を高い確率で行うことができる。これにより、不妊症、特に雄性不妊の病態を有する哺乳動物において、妊娠の確率を増加させることが可能となる。また、本発明によれば、凍結保存精子を用いた卵子受精も可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１１】
哺乳動物の精子は、精巣で形成され、精巣上体を通過する間に運動性を獲得し、成熟する。精子は雌性生殖路内で卵母細胞を受精させるために必要な先体反応と受精能獲得とよばれる成熟変化を遂げる。先体反応は脊椎動物および無脊椎動物に広く見られる現象であり、一方で、受精能獲得は哺乳動物のみに見られる現象である。先体反応とは、精子頭部の先体内に含まれる各種の加水分解酵素が放出され、これら酵素の作用により卵丘細胞の遊離ならびに透明帯への結合を可能とする現象である。
【００１２】
本明細書では、ＡＣＥ２を過剰発現するマウスにおいて、産仔数の極端な低下と体外受精率の低下、さらには卵子透明帯への結合能の低下が見出されている。さらに、本明細書では、ＡＣＥ２阻害剤を用いることにより、ＡＣＥ２を過剰発現するマウスおよび通常のマウスからの精子、ならびに通常は低受精率を示す凍結処理を施したマウス精子のいずれを用いた場合にも、これら精子の卵子透明帯への結合能および体外受精率が改善されることが実証されている。
【００１３】
従って、本発明の一つの態様によれば、哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物が提供され、該組成物はＡＣＥ２阻害剤を含んでなる。さらに、本発明の他の態様によれば、哺乳動物の卵子受精を促進するための薬剤の製造における、ＡＣＥ２阻害剤の使用が提供される。これらの組成物および薬剤は、不妊症、特に雄性不妊の治療用医薬組成物または治療薬としても使用することができる。
【００１４】
本発明において機能阻害の標的とする「アンギオテンシン変換酵素２」または「ＡＣＥ２」は、本発明の対象とする哺乳動物に由来するアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）とすることができる。ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は当技術分野において周知であり、例えば、配列番号１および配列番号２（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０２１８０４）に示されるヒト由来ＡＣＥ２の配列が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物についても、ヒト由来ＡＣＥ２に対応する同様の遺伝子およびタンパク質を利用することが可能である。例えば、マウス由来ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号３および配列番号４（ＮＣＢＩアクセス番号：ＮＭ＿０２７２８６）に示される。
【００１５】
本発明の対象とする哺乳動物は、ヒトであってもよいし、非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、家畜動物、ペット動物、実験用動物、野生動物などが挙げられ、より具体的には、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、サル等が挙げられる。特に、本発明は、パンダなどの絶滅危惧種、その他の希少動物にも適用可能である。
【００１６】
本発明の対象とする哺乳動物個体（雄性動物および雌性動物のペア）は、好ましくは雄性動物の精子中でＡＣＥ２が過剰発現している個体（ペア）とされる。精子中におけるＡＣＥ２の過剰発現は当技術分野において公知の方法によって検出することができ、例えば、雄性動物から得られた精子サンプルにおけるＡＣＥ２の発現量を測定し、その発現量が正常な精子のものよりも多い場合に、その精子サンプルにおけるＡＣＥ２の過剰発現が検出される。ＡＣＥ２の発現量は、例えば、ＡＣＥ２のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を指標として測定することができる。ＡＣＥ２遺伝子の配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列については上述した通りであり、当業者であれば、これらの配列を参照することにより、標準的な方法を用いてＡＣＥ２遺伝子の発現量を測定することができる。比較対照となる正常な精子としては、同種の動物の異なる個体からの正常な精子が用いられる。また、異なる複数の個体からの正常な精子についてＡＣＥ２遺伝子の発現量を測定し、その平均値を比較対照としてもよい。さらに、予め測定された複数の正常な精子における発現量のデータから、平均値＋標準偏差などの適正値を設定しておき、被験精子の発現量がその適正値よりも高い場合にＡＣＥ２遺伝子の過剰発現があるものと判断してもよい。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は薬物などの小分子とされる。このような小分子は、ＡＣＥ２の阻害活性を指標として、当技術分野において公知の方法によりスクリーニングすることによって得ることができる。ＡＣＥ２の阻害活性は、例えば、候補化合物の存在下でＡＣＥ２とアンギオテンシンＩ（１−１０）を反応させて生成するアンギオテンシン（１−９）を定量し、その定量値が、候補化合物の不在下で得られる定量値よりも低いことを確認することにより確認することができる。あるいは、ＡＣＥ２の阻害活性は、候補化合物の存在下でＡＣＥ２とアンギオテンシンＩＩ（１−８）を反応させて生成するアンギオテンシン（１−７）を定量し、その定量値が、候補化合物の不在下で得られる定量値よりも低いことを確認することにより確認することができる。ＡＣＥ２阻害活性を有する小分子としては、例えば、ＤＸ６００（PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）として市販されているペプチド（Ac-Gly-Asp-Tyr-Ser-His-Cys-Ser-Pro-Leu-Arg-Tyr-Tyr-Pro-Trp-Trp-Lys-Cys-Thr-Tyr-Pro-Asp-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-NH2：配列番号５）が好適に用いられる。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２タンパク質に特異的に結合する抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。このような抗体のＡＣＥ２の阻害活性は、上述のように、当技術分野において公知の方法により確認することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子とされる。アンチセンス法は、特定の遺伝子の発現を抑制するための周知の技術である。一つの具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥ２遺伝子の５’コード領域の配列に基づいて設計された、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡとされる。他の具体例では、前記アンチセンス核酸分子は、ＡＣＥ２遺伝子の転写に関与する領域の配列に相補的となるように設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドとされる。このようなアンチセンス核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＥ２遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子とされる。本明細書において、「ｓｉＲＮＡ核酸分子」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ｓｉＲＮＡ核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を抑制することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９〜２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、より長いヌクレオチド配列を含んでなる。このようなｓｉＲＮＡ核酸分子は、配列番号１に示されるようなＡＣＥ２遺伝子の配列に基づいて、容易に設計することができる。さらに、前記ｓｉＲＮＡ核酸分子は、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000）。
【００２１】
本明細書では、上述のように、精子におけるＡＣＥ２活性を阻害することにより、該精子の授精能が増強され、卵子の受精率が増加することが実証されている。従って、本発明の他の態様によれば、ＡＣＥ２阻害剤を用いることによる、哺乳動物の精子の授精能を増強する方法、ならびに人工授精および体外受精のための方法が提供される。
【００２２】
さらに、本明細書では、上述のように、凍結保存されていた精子を用いた場合においても、精子におけるＡＣＥ２活性を阻害することにより卵子の受精率が増加することが実証されている。従って、上記の方法において用いられる精子は、凍結保存されていた精子であってもよい。これは本発明の特に望ましい利点であり、よって、凍結保存精子を用いる上記の方法は本発明の好ましい実施態様を構成する。凍結保存精子を用いる場合には、使用前にこれを融解させればよい。
【００２３】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物の精子の授精能を増強する方法であって、該精子を、本発明による組成物とともにインキュベートする工程を含んでなる方法が提供される。インキュベーションに用いられる培地は、精子の培養に一般的に用いられる培地であってよく、例えば、ＨＴＦ培地が挙げられる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、培地中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を培地に添加することができる。インキュベーションの温度条件は、精子の培養に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。インキュベーションの時間は特に制限されないが、好ましくは１．５時間以上とされる。
【００２４】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物の卵子をin vitroで受精させる方法であって、本発明による組成物の存在下において、精子と卵子を接触させる工程を含んでなる方法が提供される。精子と卵子の接触は適切な培地中で行ってもよい。この目的に用いられる培地は、体外受精用の培地として一般的に用いられる培地であってよく、例えば、ＨＴＦ培地が挙げられる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、培地中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を培地に添加することができる。精子と卵子を接触させるときの温度条件は、体外受精に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。精子と卵子を接触させる時間は体外受精に一般的に必要とされる時間であればよく、特に制限されないが、好ましくは６〜７時間とされる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のin vitro受精法は、上述の精子と卵子を接触させる工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる。このインキュベーション工程は、上記の精子の授精能を増強する方法について記載した通りに行うことができる。
【００２６】
本発明の一つの実施態様によれば、哺乳動物（例えば非ヒト哺乳動物）の卵子をin vivoで受精させる方法であって、雄性動物からの精子を、本発明による組成物とともに、排卵期にある雌性動物の子宮内に注入する工程を含んでなる方法が提供される。注入される精子としては、適切な液体中に保持されているものを用いてもよい。この目的に用いられる液体は、人工授精用の媒体として一般的に用いられるものであればよい。その場合には、精子を保持している液体中に本発明による組成物を添加し、得られる混合液を子宮内に注入することができる。本発明による組成物の使用量は特に制限されるものではなく、組成物中に含まれるＡＣＥ２阻害剤の性質（例えば阻害活性および哺乳動物に対する毒性）に応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、ＡＣＥ２阻害剤がＤＸ６００などの小分子である場合には、精子液中におけるＡＣＥ２阻害剤の濃度が０．１〜１０．０μＭ、より好ましくは０．５〜５．０μＭ、最も好ましくは約１．０μＭとなるように、本発明による組成物を液体に添加することができる。注入される精子または精子液の温度は、人工授精に一般的に用いられる温度であればよく、例えば、その哺乳動物の平均的な体温またはこれに近い温度とすることができる。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記のin vivo受精法は、上述の精子を子宮内に注入する工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる。このインキュベーション工程は、上記の精子の授精能を増強する方法について記載した通りに行うことができる。
【００２８】
本発明による組成物は、交尾の前に、対象となる哺乳動物の雌性個体の子宮口または子宮内部に塗布することもできる。従って、本発明の他の態様によれば、哺乳動物（例えば非ヒト哺乳動物）の卵子がin vivoで受精する確率を増加させる方法であって、交尾前に、本発明による組成物を、雌性動物の子宮の入口または内部に塗布する工程を含んでなる方法が提供される。
【００２９】
子宮の入口または内部に塗布するための本発明による組成物は、当業者であれば適宜製造することができる。また、組成物中のＡＣＥ２阻害剤を精子に十分に作用させるためには、本発明による組成物は、クリーム、ゼリーまたはペッサリーの形態とすることが好ましい。このような形態の組成物を製造するために用いられる担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、医薬上許容される各種材料から、当業者により適宜選択される。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００３１】
以下の実験において、雄マウスとしては、C57BL/6 Crマウス（日本ＳＬＣ）、およびラットclara cell-10kDa protein遺伝子プロモーターの制御下にヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）を発現するrCC10-hACE2トランスジェニックマウス（以下「rCC10-hACE2 Tgマウス」または「ＡＣＥ２トランスジェニックマウス」という。）を使用した。このrCC10-hACE2 Tgマウスに含まれるヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）の発現カセットは図１に示される構造を有し、その全配列は配列番号６に示される通りである。配列番号６に示されるヌクレオチド配列において、第８〜２３９５番残基はラットＣＣ１０プロモーターの配列であり、第２４１２〜４８２９番残基はヒトＡＣＥ２のコード配列であり、第４８３８〜５３７５番残基はウサギβ−グロビンポリＡシグナル配列である。雌マウスとしては、C57BL/6 Crマウス（日本ＳＬＣ）およびICRマウス（日本ＳＬＣ）を使用した。
【００３２】
実施例１：ＡＣＥ２活性の産仔率への影響
成熟rCC10-hACE2 Tg雄マウスと成熟C57BL/6雌マウスの５ペアを、各ペアごとに同一ケージで飼育し、出産した産仔数をカウントした。コントロールとして、成熟C57BL/6雄マウスと成熟C57BL/6雌マウスのペアも同様に飼育し、出産した産仔数をカウントした。結果を下記の表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
rCC10-hACE2 Tg雄マウスの交配による産仔数は3.1±1.2匹であり、C57BL/6雄マウスによる6.9±1.8匹と比較して有意に低い値を示した（Ｐ＜０．０００１）。よって、ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウスによる産仔数は顕著に少ないことが明らかとなった。
【００３５】
実施例２：ＡＣＥ２活性の精子−卵結合への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、精子を採取した。採取した精子は、２５０μｌの精子前培養培地（ＨＴＦ培地）中で、少なくとも１時間半、前培養した。
【００３６】
卵細胞は、過排卵処置を施した成熟雌マウスの卵管膨大部より採取し、卵丘細胞を除去するために１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Sigma）を含む１００μｌのＨＴＦ培地中に導入した。
【００３７】
上記の精子前培養培地ならびに卵細胞用のＨＴＦ培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、およびこれを添加していない培地を用いた。
【００３８】
卵丘細胞を除去した卵細胞に、培養した精子を５×１０４精子／ｍｌずつ添加し、２〜２．５時間培養した。培養後、卵細胞より一回り大きい硝子キャピラリーを用い、卵細胞を洗浄し、２％ホルマリンで固定した。精子−卵結合能測定は、倒立顕微鏡下で固定した卵細胞を観察し、卵細胞の透明帯に結合している精子の数をカウントすることにより行った。結果を下記の表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
添加剤を添加しない未処理区では、rCC10-hACE2 Tgマウス精子の卵透明帯への結合能は、C57BL/6マウス精子と比較して顕著に低い値を示した。C57BL/6マウス精子の透明帯結合能は、ＡＣＥ２阻害剤の添加により増加した。また、rCC10-hACE2 Tgマウス精子の透明帯結合能はＡＣＥ２阻害剤により増加しており、その測定値はC57BL/6マウス精子により得られる測定値に匹敵するものであった。
【００４１】
以上の結果から、rCC10-hACE2 Tgマウス（ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウス）およびC57BL/6雄マウスの双方について、各マウスからの精子の透明体結合能がＡＣＥ２の阻害により増強されることが明らかとなった。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、ＡＣＥ２過剰発現の有無にかかわらず、精子−卵透明帯の結合を促進することが明らかとなった。
【００４２】
実施例３：ＡＣＥ２活性の精子−卵融合への影響
実施例２と同様の方法で卵細胞から卵丘細胞を除き、その後、酸性耐ロード液中で卵細胞の透明帯を除去した。得られた卵細胞をＨＴＦ培地中に導入し、培養した精子を５×１０４精子／ｍｌずつ添加し、６〜７時間培養した。培養後、卵細胞より一回り大きい硝子キャピラリーを用い、卵細胞を洗浄し、２％ホルマリンで固定した。精子−卵融合能測定は、倒立顕微鏡下で固定した卵細胞を観察し、卵細胞中に２つ以上の核を観察することによって行なった。結果を下記の表３に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
C57BL/6マウス精子およびrCC10-hACE2 Tgマウス精子の双方ともが、９５％以上という高い融合率を示した。よって、rCC10-hACE2 Tgマウス精子は正常な卵細胞融合能を有し、従って、ＡＣＥ２は精子の卵細胞膜への融合には関与しないことが明らかとなった。
【００４５】
実施例４：ＡＣＥ２活性の体外受精率への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、精子を採取した。採取した精子は、２５０μｌの精子前培養培地（ＨＴＦ培地）中で、少なくとも１時間半、前培養した。
【００４６】
卵細胞は、過排卵処置を施した成熟C57BL/6雌マウスの卵管膨大部より採取し、２００μｌの受精培地（ＨＴＦ培地）中に導入した。
【００４７】
上記の精子前培養培地ならびに受精培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、およびこれを添加していない培地を用いた。
【００４８】
培養した精子を１×１０５精子／ｍｌ精子ずつ上記の受精培地に添加した。精子添加の６〜７時間後に受精卵をＨＴＦ培地中で洗浄し、翌日までＨＴＦ培地中で培養した。翌日、２細胞期胚をカウントすることにより、受精率を算出した。結果を下記の表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
以上の結果から、rCC10-hACE2 Tgマウス（ＡＣＥ２を過剰発現する雄マウス）およびC57BL/6雄マウスの双方について、各マウスからの精子による受精率が、ＡＣＥ２の阻害により増加することが明らかとなった。この傾向は、rCC10-hACE2 Tgマウスの精子について特に顕著であった。よって、ＡＣＥ２阻害剤は体外受精率を増加させ、特にＡＣＥ２を過剰発現する雄性動物からの精子による体外受精率を顕著に増加させることが明らかとなった。
【００５１】
実施例５：ＡＣＥ２活性の凍結保存精子−卵結合への影響
成熟雄マウスから精巣上体尾部を摘出し、これを用いて精子の凍結保存および融解を行った。凍結工程ではまず、１対の精巣上体尾部をR18S3精子保存液１００μｌ中で細切し、室温に３分間静置した後、得られる精子懸濁液を１０μｌずつ取り、０．２５ｍｌストローへ充填し、該ストローの両端をポリシーラーで封入した。続いて精子凍結用フロートにストローを入れ、液体窒素気相下に１５分間静置した後、液体窒素中に浸漬した。融解は、液体窒素タンクから取り出した精子ストローを３７℃温水中に１５分間静置することによって行った。
【００５２】
次に、実施例２に記載の手順に従って、融解した精子の卵結合能を調べた。結果を下記の表５に示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】
凍結・融解処理したC57BL/6マウス精子の卵透明帯への結合は、ＡＣＥ２阻害剤を添加しない未処理区と比較して、ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００）処理区において顕著に増加していた（Ｐ＜０．０００１）。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、凍結処理していない新鮮精子だけでなく、凍結保存精子の卵透明帯結合能を増強することが明らかとなった。
【００５５】
実施例６：凍結保存精子による体外受精率へのＡＣＥ２活性の影響
複数系統のマウスに由来する凍結保存精子を、実施例５に記載の手順による凍結・融解処理によって調製した。
【００５６】
未受精卵子は、実施例４と同様に、過排卵処置した雌のC57BL/6マウスの卵管膨大部から採取し、受精培地（ＨＴＦ培地）９０μｌ中に導入した。
【００５７】
次いで、融解精子懸濁液１０μｌを、精子前培養培地（ＨＴＦ培地）９０μｌ中に移し、６０分間前培養後、その１０μｌを未受精卵子を含むＨＴＦドロップに導入した。
【００５８】
なお、上記の精子前培養培地ならびに受精培地としては、１．０μＭ ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００；PHOENIX PHARMACEUTICAL, INC.）を添加した培地、ならびにこれを添加していない培地を用いた。受精率の算出は、実施例４と同様に、２細胞期胚をカウントすることによって行った。結果を下記の表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
凍結・融解処理した２系統のマウス精子による体外受精率は、ＡＣＥ２阻害剤を添加しない未処理区と比較して、ＡＣＥ２阻害剤（ＤＸ６００）処理区において増加していた。よって、ＡＣＥ２阻害剤は、凍結処理していない新鮮精子だけでなく、凍結保存精子の受精率を増加させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、rCC10-hACE2トランスジェニックマウスに含まれるヒトアンギオテンシン変換酵素（ｈＡＣＥ２）の発現カセットの模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなる、組成物。
【請求項２】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が小分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子、または該ｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物の精子の授精能を増強する方法であって、該精子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物とともにインキュベートする工程を含んでなる、方法。
【請求項７】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の卵子をin vitroで受精させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の存在下において、精子と卵子を接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
精子と卵子を接触させる工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物の卵子をin vivoで受精させる方法であって、雄性動物からの精子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物とともに、排卵期にある雌性動物の子宮内に注入する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
精子を子宮内に注入する工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物の卵子がin vivoで受精する確率を増加させる方法であって、交尾前に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を、雌性動物の子宮の入口または内部に塗布する工程を含んでなる、方法。
【請求項１】
哺乳動物の卵子受精を促進するための組成物であって、アンギオテンシン変換酵素２阻害剤を含んでなる、組成物。
【請求項２】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が小分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸分子である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
アンギオテンシン変換酵素２阻害剤が、アンギオテンシン変換酵素２遺伝子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ核酸分子、または該ｓｉＲＮＡ核酸分子を発現するベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物の精子の授精能を増強する方法であって、該精子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物とともにインキュベートする工程を含んでなる、方法。
【請求項７】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の卵子をin vitroで受精させる方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の存在下において、精子と卵子を接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
精子と卵子を接触させる工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
非ヒト哺乳動物の卵子をin vivoで受精させる方法であって、雄性動物からの精子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物とともに、排卵期にある雌性動物の子宮内に注入する工程を含んでなる、方法。
【請求項１２】
精子を子宮内に注入する工程の前に、該精子を前記組成物とともにインキュベートする工程をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記精子が凍結保存されていた精子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非ヒト哺乳動物の卵子がin vivoで受精する確率を増加させる方法であって、交尾前に、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を、雌性動物の子宮の入口または内部に塗布する工程を含んでなる、方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１５０１６２（Ｐ２０１０−１５０１６２Ａ）
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２８１０５（Ｐ２００８−３２８１０５）
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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