可撓性ワクチンアセンブリおよびワクチン送達プラットフォーム
本明細書には、再アセンブリされたウイルス様粒子（ＶＬＰ）で作られたワクチンを作製するための種々の方法を記載される。第一に、ＶＬＰは、キャプシドに包まれた中間体集団に分解される。各キャプシドに包まれた中間体集団は、別個の集団を形成するために、例えば、特有のペプチド部分または核酸部分の化学結合を受ける。その後、予め決定された各々の量の、異なる集団由来のいくつか（１つ以上）の異なるキャプシドに包まれた中間体が混合され、そして結合され、異なるキャプシドに包まれた中間体から構成される、核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成する。その結果、再アセンブリされたＶＬＰは、１つより多いペプチドまたは核酸を提示する。核酸は、真核生物細胞において、足場単独として機能し得るか、または免疫調節タンパク質の発現について操作され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府の支持により、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって与えられた共同協定番号７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０４８の元でなされた。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、１つ以上のサブユニットから構成される、再アセンブリされたウイルスを含む、新規なワクチンプラットフォームに関し、各サブユニットは、遺伝融合またはインビトロ結合体化によって付加された、異なるペプチド部分または核酸部分を含み、その結果、各サブユニットは、標的治療剤を組み込む。本発明は、さらに、ＲＮＡ分子を、真核生物細胞中での送達および発現のためにインビトロでアセンブルするための方法に関する。特に、本発明は、真核生物細胞における送達および発現のために、ＲＮＡ分子をパッケージングするために必要な、タンパク質、分子、および核酸配列を提供する。本発明のパッケージされたＲＮＡ分子は、広範な真核生物細胞への送達が可能である。パッケージされたＲＮＡ分子はまた、特定の真核生物細胞に標的化され得る。本発明は、さらに、上記再アセンブリされたウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＲＮＡワクチンが、このウイルスまたはＶＬＰ構造へのペプチド融合物と、ＲＮＡのコードされたタンパク質との相乗作用によって、細胞免疫もしくは体液免疫のいずれか、または両方を同時に誘導するために使用される、送達プラットフォームを包含する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現在まで、ほとんどの従来のワクチンは、生存し弱毒化されたか、または不活性化された、病原体調製物全体を含んだ。これらの種類のワクチンの作製は、長期間の集中的な基礎研究および開発に対する必要性によって、制限されている。生存し弱毒化されたかまたは不活性化されたワクチンのための、信頼性のある製造技術および大規模化技術は、急に開発することがほとんど不可能である。従って、安全であり、強力であり、かつ広範に有用な、予期されない感染症の脅威に対するワクチンの製造に適切な技術の開発に対する必要性が存在する。植物ウイルス病原体キメラから開発されるワクチンは、多数の既知または出現する疾患の脅威を予防または処置するために使用され得るワクチンを、素早く生成する方法を提供し得る。
【０００４】
病原体および腫瘍細胞に対する免疫応答を制御することは、数十年間の間、免疫学、細胞生物学、および薬学的開発の焦点であった。免疫細胞の複雑さならびに病原体チャレンジに応答するサイトカイン発現のパターンおよび効果、ならびにワクチン投与について、多くのことが知られている。この研究の１つの主要な局面は、免疫応答の２つの主要な部門（主として細胞性であるＴｈ１応答、および優勢に体液性であるＴｈ２応答）の同定であった。これらの２つの型の免疫応答は、外来の抗原が免疫系にどのように提示されるか、発現細胞によってどのサイトカインが発現されるか、およびどの型の免疫細胞が活性化されるかに応じて、開始される。Ｔｈ１応答は、細胞傷害性免疫細胞機能、およびＴｈ２応答において観察されるものとは異なるサブタイプの中和抗体の産生を生じる。一方で、いくつかの病原体は、Ｔｈ２応答に感受性であり得、Ｔｈ１応答は、病原体と腫瘍細胞との両方に対する効果的な応答を開始するために重要である。しかし、病原体と腫瘍細胞との両方が、免疫監視を回避し、Ｔｈ１免疫に必須である機構を迂回するためのストラテジーを発達させた。
【０００５】
ワクチン開発における主要な目的は、宿主へのワクチン投与の際に、Ｔｈ２体液応答に加えて、Ｔｈ１型の免疫を方向付けることである。弱毒化ウシポックスウイルスを使用することによって、Ｊｅｎｎｅｒは、気づかずに、Ｔｈ１経路の強力な活性化を利用して、天然痘感染を予防した。彼の時代以来、ほとんどの病原体ワクチンは、殺傷または弱毒化され、このことは、一般に、病原体の罹病率およびウイルスの拡散の制御の、良好な成功を示した。しかし、最近のワクチン開発の２つの局面が、生ウイルスワクチンまたは弱毒化ウイルスワクチンに対する増殖の問題をもたらした。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するための、弱毒化ウイルスまたは殺傷されたウイルスの使用は、いくつかの理由により、実用的ではない。職業上の安全性の問題、弱毒化ウイルスの低い収量、およびウイルスの変異または漏出の脅威が、ワクチン開発と公共の受容との両方に対する、重大な欠点である。他の場合において、麻疹ウイルスおよびＲＳウイルス（ＲＳＶ）において観察されるように、予測不可能かつ重大な有害な事象が、ウイルス免疫全体に付随する。従って、多くの研究は、防御免疫に応答して宿主免疫によって一般的に標的化される、病原体のタンパク質またはペプチドからなる、「サブユニット」ワクチンに焦点を当てた（Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第３版、１９９９，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ）。不運なことに、タンパク質サブユニットワクチンは、単独では強力なＴｈ１応答をしばしばは惹起せず、そしてＤＮＡサブユニットワクチンは、しばしば、抗体を惹起しない。ほとんどの場合において、抗体とＣＴＬ応答との両方が、病因または疾患の進行の制御において、必要である。
【０００６】
２つの新たな型のワクチンが、現在のサブユニットワクチンの欠点を克服するために、作製された。非病原性ウイルスが、病原体の免疫原性サブユニットタンパク質をコードするように、遺伝的に改変され、これによって、ウイルス抗原提示に対して、Ｔｈ１免疫応答を利用する。強力なＴｈ１型免疫応答が、アデノウイルス、ワクシニア、鶏痘およびアルファウイルスの送達系を使用して、多くの病原体および自己抗原に対して実証された（ＷａｌｔｈｅｒおよびＳｔｅｉｎ．２０００ Ｄｒｕｇｓ ６０，２４９）。しかし、これらの「第一世代」のウイルス送達系は、ベクター免疫原性に起因する問題に遭遇し、これは、ブースター免疫におけるこれらの引き続く使用を予測した。ウイルスプライミングに続いてタンパク質またはＤＮＡによるブースティングのいずれかは、成功したが、このアプローチは、単一のワクチンに対して少なくとも２つの薬剤の製造を必要とする。これらのワクチンのための、ＤＮＡおよび／またはタンパク質の大規模な製造は、技術的問題と財政上の問題との両方に遭遇している。
【０００７】
第二のストラテジーは、ウイルスコートタンパク質の、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己アセンブリを利用し、これは、単独で、強力なＴｈ１抗原応答を刺激する（ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＬｏｗｙ．２００１ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１，５７１）。アレイ状のウイルスコートからアセンブリされるＶＬＰは、中和抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の両方を刺激する際に有効であることが示された。ウイルスコートタンパク質はまた、外部の溶媒に曝露された残基への融合（通常、遺伝融合による）を介する、抗原の効果的なキャリアである（Ｐｏｇｕｅら、２００２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏ Ｐａｔｈ ４０，３；Ｄａ Ｓｉｌｖａ．１９９９ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １，８２）。有望であるが、ＶＬＰ技術もまた、欠点を有する。製造がまた制限され、そしてしばしば、コートへの異種抗原の融合が、ＶＬＰの収量、溶解度を低下させ、または自己アセンブリを防止する。さらに、免疫クリアランス（ウイルスブースティング全体を制限する同じ機構）もまた、ＶＬＰの使用を制限する。明らかに、ワクチン送達のためのウイルス全体およびＶＬＰ技術の両方の制限を克服する、費用効果的なウイルスコート抗原送達系に対する必要性が存在する。この系の特性は、ウイルス様抗原提示を免疫系に、病原性なしに提示することを介して、Ｔｈ１応答をブースティングすること、抗原が融合するＶＬＰ骨格を回転させる可撓性、免疫原性の発生および制御、高い収率および低い費用の、全ての利点を含む。
【０００８】
本出願人および他の人は、植物ウイルス由来のコートタンパク質が、哺乳動物ウイルスコートの全ての免疫学的提示特性を有するが、病原性がないことを示した。多数のポジティブ（＋）鎖ＲＮＡ植物ウイルス（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ科の型メンバー）を含む）が、インビトロでクローニングされ、そして操作されて、植物において異種遺伝子産物を発現し、そしてそのビリオン表面において、生物学的に重要なペプチドを提示した。ＴＭＶビリオンの独特の特性は、それらが解離してモノマーを形成し、そしてＲＮＡ足場を使用して、ＶＬＰに自己アセンブリする能力である。外来エピトープを提示するように操作された植物コートタンパク質（ＴＭＶを含む）は、自己抗原（Ｓａｖｅｌｙｅｖａ Ｎ ２００１ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９ ７６０）と種々の病原体（Ｐｏｇｕｅら、２００２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏ Ｐａｔｈ ４０，３）との両方に対する機能的免疫を促進することが示された。
【０００９】
ウイルスゲノムＲＮＡ分子の、感染性粒子へのキャプシド化のために必須のものは、アセンブリ起点（ＯＡＳ）と称される配列エレメントの存在である。ＴＭＶ ＯＡＳは、ウイルスゲノムの３’末端から約１Ｋｂに位置し、そして３つのヘアピンステム−ループ構造を形成すると予測される、４４０のヌクレオチド配列からなる（ＴｕｒｎｅｒおよびＢｕｔｌｅｒ，１９８６）。ウイルスコートタンパク質ディスクは、最初、ウイルスアセンブリの間、ループ１に結合する。成熟アセンブリ起点転写体を使用するインビトロでのパッケージングアッセイは、ループ１を必須に含み、そして外来ＲＮＡ配列またはウイルスＲＮＡ配列のキャプシド化のために十分な、７５ヌクレオチドを規定した（Ｔｕｒｎｅｒら，１９８８）。インビトロでの再構築の研究は、感染した植物細胞由来のビリオン由来から得られた精製されたコートタンパク質がの調製、ＴＭＶ ＲＮＡとｐＨ７．０で螺旋構造にアセンブルされ得、ＲＮＡを含むＴＭＶ様ウイルス粒子のアセンブリを生じることを示した（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，１９５５）。さらに、ＯＡＳ配列を含み、ＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写された外来キメラＲＮＡ分子は、インビトロで偽ウイルス粒子にアセンブルされ得ることを示した（Ｓｌｅａｔら、１９８６）。
【００１０】
キャプシド化を受けやすいウイルスコートタンパク質のクローニングおよび配列決定は、これらの遺伝子の、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、細菌発現ベクターへの挿入をもたらした（Ｓｈｉｒｅら、１９９０）。しかし、組み換えＥ．ｃｏｌｉウイルスコートタンパク質とのインビトロでのアセンブリは、植物において産生されるネイティブのコートタンパク質と比較して、減少した再構築率を生じる（Ｓｈｉｒｅら、１９９０）。米国特許第５，４４３，９６９号は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの欠損を、ＴＭＶ−ＯＡＳを含むＲＮＡ配列を、インビトロではなくインビトロで、Ｅ．ｃｏｌｉにパッケージングすることによって、克服することを試みる。しかし、このキャプシドで包まれたウイルスベクターを、植物以外の宿主に導入することは、問題である。ＴＭＶコートタンパク質の、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアセチル化の欠乏は、キャップされないＲＮＡの、効率の低いキャプシド化を生じる。これらのＲＮＡは、キャップ構造の欠乏に起因して、真核生物細胞において、乏しく翻訳される。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＴＭＶ産物の収量は、非常に乏しく、そして商業的に実施可能ではない。
【００１１】
治療の目的で、既存の異常性を補正すること、または新たな機能を有する細胞を提供することのいずれかによる、遺伝物質の細胞内送達のプロセスは、遺伝子療法（ＤｒｅｗおよびＭａｒｔｉｎ，１９９９）およびＤＮＡ免疫の基礎である。実際的にいえば、核酸免疫技術は、新たな病原体に対する魅力的な前線防御を提示する：おそらく、迅速に応答するサブユニットワクチンのストラテジーにおける前線に匹敵し得る他の系は、存在しない。しかし、従来のＤＮＡワクチンは、多数の重大な欠点に悩まされ、このことは、この技術単独に対する信頼を分別のないものにする。最も重大なことには、効果的な免疫応答を刺激するために必要とされるＤＮＡの用量が非常に高く、大規模な免疫のために十分な量の製造が問題となることを暗に示す。ＤＮＡワクチンおよびＲＮＡワクチンは、一般に、良好なＴｈ１型細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進し得、このことは、非細胞障害性病原体の排除のために必須である。しかし、いくつか例外があるが、ＤＮＡワクチンによって誘導される抗体応答は、乏しい。従って、核酸ワクチンは、産生が非常に迅速であり得るという予測からは魅力的であるが、理想的には、最初のＤＮＡワクチン接種またはＲＮＡワクチン接種には、好ましくはタンパク質でのブースターワクチン接種が続き、効率的な抗体産生、および病原体チャレンジに対するより完全な保護を誘導するべきである。本発明は、新規かつ可撓性のあるワクチン送達プラットフォームを導入することによって、上記で生じた問題に取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、現在のＶＬＰ技術の制限に取り組むが、首尾よいＶＬＰ抗原足場のポジティブな特性の全てを保持する、いくつかの独特の解決法を含む。本出願人は、ＶＬＰワクチンを、適合可能な、予測可能な、安定な、そして規模の調節が可能な様式で作製するための方法を提供する。この研究は、非常に革新的であり、そして開発が継続中である。この方法は、多価ワクチンを作製する工程を包含し、ここで、異なるワクチンタンパク質部分が、単一のＶＬＰ構造の表面に融合され、多機能効果（免疫ペプチド（保護免疫を刺激するタンパク質エレメント）および宿主免疫応答を調節するか、または免疫細胞の効率的な認識もしくはプロセシングを容易にするかのいずれかのペプチドのアベイラビリティ）を与える。提唱されるワクチンはまた、二機能性であり、ここで、ＶＬＰのタンパク質エレメントは、ペプチド融合または一連の融合ありまたはなしで、改変されたＲＮＡ部分をキャプシドで包む。改変されたＲＮＡは、目的のｍＲＮＡを運び得、次いで、その保護されたＲＮＡは、核酸内容物を、タンパク質と一緒に、そのワクチンを取り込む免疫細胞に運ぶために使用され得る。ＲＮＡ構築物は、相乗的に働いて、インタクトな病原体または癌抗原（宿主の免疫応答を刺激するタンパク質、またはワクチンに対するＴｈ１型もしくはＴｈ２型の免疫応答のいずれかを調節するタンパク質）のいずれかをコードすることによって、強力な、持続性の免疫応答を生じる。この方法は、強力な産生可能性、改善された細胞取り込み、およびマルチエピトープ価を有することによって、他のＶＬＰに付随する問題を軽減する。構造的に類似であるが免疫学的には異なるＶＬＰキャリアを選択することによって、他のＶＬＰシステムにおいては働かないことが示されたプライム−ブーストストラテジーのために、コート骨格の回転を可能にする。
【００１３】
二機能性ＲＮＡによるワクチン接種が、いくつかの異なる利点を有するＤＮＡワクチン接種の代替法である。第１の例において、ＲＮＡベースのワクチンは、ゲノムに組み込まれもし得ないしゲノムを変形（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）させ得ないため、腫瘍形成を引き起こし得ることがほとんど考慮されない。第２に、安全な自己増幅ワクチンベクターとしてＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）由来のＲＮＡワクチンが送達され得る良好な証拠が存在する。アルファウイルスレプリコンは細胞に対して細胞溶解性であり、従って、ＲＮＡワクチンの複製は、本来一時的であり、自己排除される。アルファウイルスレコート「レプリコン」ワクチンは、産生される抗原量の増加およびウイルスｄｓＲＮＡ複製中間体の細胞内蓄積により誘導される炎症性サイトカインの産生量の増加の両方を伴う、強力な免疫応答（抗体応答および細胞媒介応答の両方）を引き起こす。これらの特徴は、効果的な免疫応答の誘導に必要とされる複製ＲＮＡの用量が、ＤＮＡ免疫により必要とされる用量よりも低いオーダーであることを示す。しかし、裸のＲＮＡワクチンに不随する主要な欠点は、すでに知れ渡っている核酸の不安定な性質であり；これは、多量免疫のためのＲＮＡワクチンの増幅を大きく制限している。
【００１４】
アルファウイルスレプリコンワクチンは、現在、インビボで転写され、アルファウイルス様粒子（レプリコン粒子）中にパッケージングされた裸のＲＮＡとしてか、またはサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）により駆動される感染性ｃＤＮＡを含むプラスミドとして送達される。レプリコン粒子は、レプリコンＲＮＡを細胞中に送達するためのビヒクルとして非常に有効であるが、生成は複雑、不十分、かつ不安定である。従って、アルファウイルスベースのＲＮＡワクチンを分解から保護するための、効果的なパッケージングおよびＲＮＡ安定化技術が必要とされる。２つの信頼できる選択肢が存在する：（１）感染性ｃＤＮＡプラスミドとして組み換えアルファウイルス構築物を送達すること；（２）ヌクレアーゼから保護され、良好な安定性および保存特性を有するようにインビボで転写されたアルファウイルスＲＮＡをパッケージングすること。後者の選択肢のアプローチを以下に示す。
【００１５】
本発明者らは、ＶＬＰキャリアとして、十分に特徴付けられている植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を用い、インビトロでＶＬＰ構造を種々の異種ＲＮＡ配列へと最構築するその独特の能力を利用する。
【００１６】
ＴＭＶコートの溶媒に曝された配列中にシステインを導入することにより、外来抗原エピトープをエキソビボで導入および融合し得る。インビトロ合成できないエピトープ配列は、遺伝的に、ＴＭＶコートタンパク質にインフレームに融合される。ＴＭＶ ＶＬＰは、インビトロ結合体由来であるかまたは遺伝子融合体から発現された、単一のエピトープ（一価）または異なるエピトープの集合（多価）で装飾されてインビトロで再構築される。
【００１７】
再構築の足場として、本発明は、ワクチン能を増強するタンパク質をコードするＲＮＡを用い、それによって、タンパク質および核酸の両方からの活性を駆動する二機能性抗原送達系を生成する。このＲＮＡはまた、翻訳を増強するためにアルファウイルスレプリコンを組み込み得る。アセンブリ源（ＯＡＳ）のループ１を含む７５ヌクレオチド配列の存在が、ＲＮＡ含有ＶＬＰを生成するためのＴＭＶコートタンパク質によるＲＮＡ分子のキャプシド形成に必須である。治療目的のタンパク質またはペプチドをコードする外来配列とこの７５ヌクレオチド配列を組み合わせることにより、ＲＮＡ分子は、ＴＭＶ様ＶＬＰの生成のための有効な足場として機能し得る。このＲＮＡは、そのワクチンに対する免疫応答の成功率を高め、病原に対する保護免疫もしくは治療免疫のいずれかの生成を補助し、または標的化された遺伝子の阻害のための阻害性ＲＮＡシグナル（ＲＮＡｉ）を送達する任意の数の免疫調節因子（例えば、ＩＬ４、ＩＬ１β、またはＩＦＮγ）をコードし得る。このＶＬＰストラテジーは、有効な標的免疫細胞に適用され、そしてＴｈ１型応答を刺激し得る。
【００１８】
Ｔｈ１型免疫応答を誘導するための重要な必要性は、プロセシングおよび抗原提示のためにＶＬＰを細胞中に移動させることである。既知の細胞を標的化するペプチドが同定されており（Ｓａｍｕｅｌ ０．，Ｓｈａｉ Ｙ．，２００１ Ｂｉｃｈｅｍ．４０，１３４０；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎら，２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５ ７２８０；Ｂｕｓｈｋｉｎ−Ｈａｒａｖら，１９９８ ＦＥＢＳ Ｌ．４２４ ２４３）、そして直接的な細胞侵入試験によってインビトロで、かつ標的抗原に対する免疫応答のタイプおよび速度を試験することにより増強された抗原提示についてインビボで試験され得る。標的化融合ペプチドは、ＴＭＶの細胞取り込みを増強する能力、ならびにインビトロおよびインビボでキャプシド形成ＲＮＡを送達する能力について試験され得る。
【００１９】
向上したワクチン接種のための一般的な方法は、アジュバントまたはＴ細胞の補助を刺激するための特定のＴヘルパーペプチドを同時投与することである。ＣｐＧ ＤＮＡは、適切なワクチンと共に同時投与された場合にＴｈ１型免疫応答を向上させる、容易に投与されるアジュバントであることが示されている（Ｋｒｉｅｇ．２０００ Ｖａｃｃｉｎｅ １９，６１８）。ほ皮下に（ｓ．ｃ．）投与されるが、一本鎖チオール化ＤＮＡワクチンもまた、ＳＰＤＰ結合化学を通じてタンパク質キャリアに融合され得る。また、いくつかのユニバーサルＴヘルパーペプチドが同定されている（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ａ．Ｂ．，１９９５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，１２６１；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ，１９８９ Ｅｕ．Ｊ．Ｉｍｍ．１９，２２３７；Ｂｏｒａｓｃｈｉ，１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１６８，６７５；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．ら，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９４ １０８３３）。病原体または自己抗原ペプチドまたはサブユニットワクチンと組み合わせたワクチン接種の後にＴｈ１型免疫を指向する免疫刺激ペプチド（通常はサイトカインフラグメント）もまた、同定されている（ＩＬ１β，Ｂｏｒａｓｃｈｉ，１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１６８，６７５）。ＴヘルパーまたはアジュバントペプチドまたはＣｐＧ ＤＮＡオリゴを含有するコート融合体は、同時に発現されるペプチドまたはキャプシド形成されたＲＮＡの免疫原性を増強するために使用される。
【００２０】
最後に、免疫系のどのアームがワクチン送達後に活性化されるかを決定する上で、サイトカインが重要な役割を果たしていることが十分に確立している。インターロイキン４（ＩＬ４）は、Ｔｈ２型免疫応答を指向するのに関連しており、そしてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、Ｔｈ１応答に対する重要な寄与因子である（ＳｐｅｌｌｂｅｒｇおよびＥｄｗａｒｄ．２００１ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３２，７６）。ＴＭＶ ＶＬＰへのキャプシド形成によりＩＬ４およびＩＦＮγのＲＮＡを細胞中に導入することにより、生成される免疫応答の型に影響を与えることが可能であり得る。本発明者らは、抗原に対する抗体アイソタイプ応答（Ｔｈ１型またはＴｈ２型の抗原提示を反映する）を試験し、かつ主に、Ｔｈ１型免疫の結果であるＣＴＬ応答を評価し得る。
【００２１】
細胞融合ペプチド、Ｔヘルプアジュバント、病原性抗原、腫瘍抗原、およびキャプシド形成サイトカインＲＮＡは、パピローマウイルスおよび黒色腫マウス疾患モデル由来の抗原と組み合わせて体系的に試験される。免疫原性モデルおよびチャレンジモデルは、単一ペプチドによるワクチン接種を超えるさらなる改善を確立し、かつＴｈ１またはＴｈ２免疫応答を生成するための最良のペプチド／ＲＮＡの組み合わせを規定する。
【００２２】
このような柔軟かつ効果的なワクチンプラットホームの利用可能性は、ヒトおよび家畜に対して非生存ワクチンを提供する（それによって、副作用を抑え効果を増大させる）機会を提供する。医学的実施の新たな展望（自己抵抗性を打破し弱い抗原に対する免疫応答を駆動するための適用を含む）は、開示されるワクチンプラットホームの相乗作用的かつ高い特異性の活性により開かれ得る。
【００２３】
本発明は、特定のウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））が複数のサブユニットに分解される方法に関する。各々のサブユニットは、遺伝的に融合されたペプチドを含むか、または予め決定されたエピトープ、ペプチドまたは、ヌクレオチドをそれに結合させるための結合反応に供される。複数のサブユニットは、この様式で処理されて複数のサブユニットグループを生成する（複数のウイルスワクチンのためのビルディングブロックを提供するために必要な多くのサブユニットグループについて、１つのサブユニットグループは予め決定されたペプチドに結合がそれに結合しており；別のサブユニットグループは第２のペプチドを有し；別のサブユニットは予め決定されたエピトープがそれに結合しており；そして別のサブユニットグループはヌクレオチドがそれに結合しているなど）。
【００２４】
代替のストラテジーは、内部リボソーム侵入を引き起こすことが公知の特定の配列を導入することによってこのような効果を開始するよう改変されたＴＭＶ ＲＮＡを用いることである。これらの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、哺乳動物細胞において多シストロン性ＲＮＡからの内部翻訳産生を引き起こすのに効果的である（Ｙａｎｇら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８９ ６３（４）：１６５１−６０）。全長遺伝子産物または免疫刺激性サイトカインあるいは他の種類の免疫調節タンパク質のいずれかをコードするＲＮＡとインフレームでＴＭＶゲノム中にＩＲＥＳを導入することで、そのタンパク質の翻訳が可能となる。これらのＩＲＥＳは非複製ＲＮＡに導入されるので、ＴＭＶおよびワクチン接種後に細胞に取り込まれる比例する転写物の量は、自己複製ＲＮＡ（例えば、アルファウイルスレプリコンによりコードされるもの）よりも低いと考えられるが、翻訳産物のレベルは、正確な応答を誘導するのに十分なはずである。
【００２５】
本発明は、予期せぬ病原への恐れに呼応して効果的なワクチン試薬を生成および供給するために米国を補助する技術的解決の研究および開発を含む。本出願人は、核酸ワクチンの生物防御適用を制限する問題；乏しい環境的安定性および高用量の必要性に特に取り組んでいる。これらの問題に取り組む上で、本発明者らは、ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスおよび核酸ワクチンを改善するための分子ツールセットを開発するためのバイオテクノロジーにおけるそれらの適用の分野において有している核心的知識を身に付けている。本出願人はまた、効果的な抗体応答を提供するタンパク質サブユニットワクチンを生成する能力を実証する。タンパク質サブユニットワクチンの生成は、本来、核酸ワクチンよりも遅く、そして実際、新規の病原体への恐れに遭遇した後の遅い期間にのみ利用可能である。しかし、本発明者らの非トランスジェニック植物ベースのワクチン発現プラットホーム（ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標））は、種々のタンパク質（ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ワクチン接種した個人における抗体の強力な誘導因子として知られている）を迅速に発現する能力を有する。本出願人は、最近、タバコ植物において１６種の異なるヒト治療ワクチンを生成するための改変されたＴＭＶ発現ベクターを使用し、そしてフェーズＩ臨床試験（ＢＢ−ＩＮＤ＃９２８３）において優れた安全性を示した。他の競合する技術と異なり、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）は、特別な発酵設備を必要とせず、そしてワクチンタンパク質を生成するための植物タンパク質産生機構を持たせる植物ウイルスＴＭＶの効果的、迅速なタンパク質生成ストラテジーを使用する。代表的な収集時期、摂取後は２１日未満である。同じウイルスが大スケール製造へのパイロット試験から使用されるので、検証と製造スケールアップとの間にほとんど移行時間がないかまたは全く移行時間がない。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を通じたワクチンの送達における遅れのほとんどは、植物の生長および抗原特異的精製プロトコルの確立の遅れである。この技術のこれらの局面は、植物由来ＶＬＰワクチンについての低い製造費を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（定義または略語）
本発明の理解を容易にするために、本明細書を全体を通じて使用される特定の用語を定義する：
「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を意味する。ＧＭ−ＣＳＦは、抗体産生機構を刺激することによって抗原の免疫原性を増加し得る。
【００２７】
「非ネイティブ」は、同じ種由来でも、同じ種から得られるものでないことを意味する。
【００２８】
「ネイティブ」は、同じ種に由来するか、または同じ種から得られることを意味する。
【００２９】
「ＩｇＧ」は、免疫グロブリンＧを意味する。
【００３０】
「遺伝子間配列」は、非コードＤＮＡ配列を意味し、ここで、ウイルスのオープンリーディングフレーム間に位置する、ウイルス複製起源が存在する。
【００３１】
「ＯＡＳ」は、アセンブリ配列の起源を意味する。アセンブリ配列の起源は、ウイルスコートタンパク質を有するＲＮＡ分子をウイルス粒子へとアセンブリするのに必要である。
【００３２】
「再構築されたタンパク質」は、複合タンパク質混合物由来のタンパク質の単離および水和された形態を意味する。
【００３３】
「ＩＬ４」は、インターロイキン４を意味し、免疫細胞、特に、Ｂ細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３４】
「ＩＬ１ｂ」は、インターロイキン１、βサブタイプを意味し、免疫細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３５】
「ＩＬ１ｂペプチド」は、Ｔ細胞を刺激し得るＩＬ１ｂの９アミノ酸区画を意味する。
【００３６】
「ＩＮＦγ」は、インターフェロン、γサブタイプを意味し、免疫細胞、特に、Ｔ細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３７】
「ＴＭＶ」は、タバコモザイクウイルスを意味する。
【００３８】
「ＶＬＰ」は、ウイルス様粒子を意味する。
【００３９】
「Ｔｈ１」は、Ｔヘルパー１型免疫応答を意味し、これは、抗体免疫および細胞免疫の両方によって特徴付けられる。
【００４０】
「Ｔｈ２」が、Ｔヘルパー２型免疫応答を意味し、これは、主に抗体免疫によって特徴付けられる。
【００４１】
「ＩＶＥ」は、インビトロでのキャプシドに包まれることを意味する。
【００４２】
「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味する。
【００４３】
「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味する。
【００４４】
「ＨＡ」は、インフルエンザヘマグルチニン由来のペプチド配列を意味する。
【００４５】
「Ｖ５」は、シミアンウイルス５由来のペプチド配列を意味する。
【００４６】
「ｍｙｃまたはＭｙｃ」は、ｍｙｃオンコジーン由来のペプチドを意味する。
【００４７】
「Ｎ」位置は、コートタンパク質のＮ末端位置における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００４８】
「Ｌ」位置は、コートタンパク質の細胞外ループ位置において、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００４９】
「ＧまたはＧＰＡＴ」は、コートタンパク質のＣ末端位置から４アミノ酸における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００５０】
「Ｃ」位置は、コートタンパク質のＣ末端位置における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００５１】
「Ｃｙｓ」は、アミノ酸のシステインを意味する。
【００５２】
「２０Ｓ」サブユニットは、密度勾配のある３４サブユニットコートタンパク質ディスクの沈降プロフィールを記載する。
【００５３】
「４Ｓ」サブユニットは、密度勾配のある４サブユニットコートの沈降プロフィールを記載し、これは、２０Ｓディスクの形成への中間体である。
【００５４】
「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、これは、タンパク質の分子量または質量をいう。
【００５５】
「ＴＥＭ」は、透過電子顕微鏡を意味する。
【００５６】
「ＲＴ」は、室温を意味する。
【００５７】
「４Ｃ」は、摂氏４度、または華氏０度付近を意味する。
【００５８】
「ＰＡＧＥ」が、ポリアクリルアミドアガロースゲル電気泳動を意味する。
【００５９】
「ＳＤＳ」は、ドデシル硫酸ナトリウム、界面活性剤を意味する。
【００６０】
「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール（分子量６０００〜８０００）を意味する。
【００６１】
「ＮａＣｌ」は、塩化ナトリウムまたは塩を意味する。
【００６２】
「ＤＥＡＥ」は、ジエチルアミノエチルを意味する、アニオン交換樹脂上で使用される分子である。
【００６３】
「ＰＯ４」は、ホスフェートを意味する。
【００６４】
「ｐｙｒｏ ＰＯ４」は、ピロリン酸を意味する。
【００６５】
「ＳＵ」は、サブユニットを意味する。
【００６６】
「ＣＲＰＶ」は、コットンテイルウサギパピローマウイルスを意味する。
【００６７】
「ＲＯＰＶ」は、ウサギ口腔パピローマウイルスを意味する。
【００６８】
「ＨＰＶ」は、ヒトパピローマウイルスを意味する。
【００６９】
「ＯＶＡ」は、卵白アルブミンを意味する。
【００７０】
「ＧＪ」は、グリーンジュースまたは全体の植物ホモジネートを意味する。
【００７１】
「Ｓ１」は、分類された植物抽出上清を意味する。
【００７２】
「Ｓ２」は、ｐＨ７での再懸濁によってＳ１不溶性物質から誘導される上清を意味する。
【００７３】
「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味する。
【００７４】
「ＭＷ ＭＡＬＤＩ」は、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ質量分析による分子量質量決定を意味する。
【００７５】
「ｗ／ｖ」は、体積あたりの重量を意味する。
【００７６】
「ＯＤ」は、光学密度を意味する。
【００７７】
「ＤＤＴ」は、ジチオスレイトールを意味する。
【００７８】
「ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡを分解する偏在性の細胞酵素である。
【００７９】
「ＲＮＡｓｉｎ」は、市販のＲＮａｓｅインヒビターである。
【００８０】
「ＤＥＰＣ」は、ジエチルピロカーボネートであり、ＲＮＡｓｅ活性の化学的インヒビターである。
【００８１】
「Ｎａｂ」は、中和抗体を意味する。
【００８２】
「Ｌ１」は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質Ｌ１を意味する。
【００８３】
「Ｌ２」は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質Ｌ２を意味する。
【００８４】
「Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、およびＥ８」は、パピローマ早期遺伝子産物である。
【００８５】
「ＣＴＬ」は、細胞傷害性Ｔリンパ球を意味する。
【００８６】
「ＳＦＶ」は、セムリキ森林ウイルスを意味する。
【００８７】
「ＩＲＥＳ」は、内部リボソーム進入部位を意味し、これにより、ＲＮＡの中間部（または第１のＡＴＧにはないどこか）における翻訳の開始が可能となる。
【００８８】
「ＯＲＦ」は、翻訳される場合に、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡの機能的ユニット）を意味する。
【００８９】
「Ｂ１６」は、Ｂ１６と名付けられたマウス黒色腫腫瘍細胞を意味する。
【００９０】
「ＳＰＤＰ」 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
「ＢＣＡ」アッセイ ビシンコニン酸に基づくタンパク質アッセイ
本発明は、タンパク質の合計を比色検出および定量するための新規な方法に関する。
【００９１】
本発明は、ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を使用して複数のワクチンおよび医薬を構築する新規の方法に関する。広範な点で、本発明は、下記のように、図１〜６で一般的に示される様式で実行される。
【００９２】
本発明の説明は、一般的な点で初めに提供され、その後に、多くの生化学的手順を含むより詳細な説明が続く。
【００９３】
標準的な方法は、図１に示される化学結合プロセスによって、偽多価ワクチン生成物を生成し得る。ＶＬＰ粒子が、生成され（１）、そして単離される（Ｓ２）。個々の粒子は、多数の独立したＶＬＰの表面に別々に化学的に結合体化され（Ｓ３）、ＶＬＰの異なる集団を生成し、この各々は固有のペプチド付加体を示す。複数のペプチドが、同じＶＬＰ集団の表面上に同時に結合されて、固有のペプチドのランダムな分布を有するＶＬＰを生成し得ることを想定することが可能である。次いで、免疫粒子の異なる集団は、混合され（Ｓ４）、異なるペプチドが表面に共有結合したＶＬＰ粒子の集団を生成する（Ｐ１）。この生じた生成物は、その混合物中の異なるペプチドを示すが、各々は免疫細胞によって独立して占められ、そして免疫系を刺激するために独立して使用される。融合ペプチドの間には相乗作用がない。なぜなら、異なるペプチド（各々が独立して機能する）間には特殊な関連性がないからである。
【００９４】
記載される本発明は、図１で示された手順に従うタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の固有の特性を利用するが、有意な利点を有する新規の方法（図２）でもある。図１のボックスＳ５により現わされるように、ＴＭＶビリオンが、改善された化学結合体化を可能にする表面会合アミノ酸で構築される。これは、固有の表面会合システイン残基またはリジン残基の存在であり得るが、他の方法が用いられ得る。同時係属特許出願番号０９／９６２，５２７（２００１年９月２４日出願、表題ＰＲＯＳＥＳＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＶＩＴＡＭＩＮＥＳ ＡＮＤ ＳＵＧＡＲＳ ＦＲＯＭ ＰＬＡＮＴ ＳＯＵＲＣＥＳ）、ならびに関連の米国特許第６，３０３，７７９号、同第６，０３３，８９５号および同第６，０３７，４５６号（これら全てはＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａへと同一人に譲渡されている。これら全てはその全体が本明細書中で参考として援用される）において記載されるようにして、例えば、ＴＭＶの所望の株で感染され、次いで処理されたたタバコ植物を使用して、多量のＴＭＶが生成される（Ｓ６）。一旦、多量のＴＭＶが得られ得ると、以下により詳細に記載されるプロセスは、ＴＭＶを分裂させて、ボックスＳ７およびＳ８により表わされるように、多数のサブユニット（ＳＵ）または２０Ｓディスクを生成する。次いで、これらのサブユニットは、工程Ｓ９で分離されて、以下により詳細に記載されるように、複数のサブユニット（各々が別々に処理される）が形成される。工程Ｓ９によって表わされるように、各個のサブユニット群は、予め決定した成分（例えば、機能性ペプチド、エピトープ、タンパク質または核酸配列）をこのサブユニット群中のサブユニットに付加するために、以下により詳細に記載される様式で、結合体化反応に供される。工程Ｓ１０で表わされるように、複数のサブユニットの群が、ここで、１つのＶＬＰ構造に構築され、ここで各々のサブユニットは、これに結合した特定のエピトープ、ペプチド、タンパク質またはヌクレオチドを有する。ＴＭＶ ２０Ｓディスクは、天然では、再会合して、固有の配列（ＴＭＶ ｏｒｉ、すなわち、アセンブリ起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＯＡＳ）と呼ばれる）を含むＲＮＡ分子を取り巻くロッド形ビリオンを形成する。これは、多価ワクチンを生成し（Ｐ２）、このことは、単一の混合反応と等価ではない。多機能性ペプチドまたは核酸付加体が互いに物理的に結合することにより、これら各々は、ＶＬＰワクチンの細胞取り込み、免疫プロセシング、免疫系に提示される免疫ペプチドの数、および刺激された免疫応答の性質を相乗的に増大され得る。異なる未結合のＶＬＰ集団上ではなく同じＶＬＰ集団上での各ペプチド成分または核酸成分の同時提示は、ＶＬＰワクチンの効力を増大させ、かつ用量をさらに低下させると予測される。
【００９５】
本発明の方法におけるさらなる基本工程は、図２に示される。詳細には、工程Ｓ１０において、特定の組換えＲＮＡ配列が、ＴＭＶ ＶＬＰのアセンブリのための足場となるように選択される。工程１０で選択されたこの特定のＶＬＰサブユニットは、以下でより詳細に記載されるプロセスによって、再アセンブリＴＭＶを形成するように選択されたＲＮＡと組合わせられる。このＲＮＡは、構造的足場としてのみ働き得、ＴＭＶ ＲＮＡ自体のみを提示し得、新たなＶＬＰワクチンの構築ブロック以外のいかなる増大した機能も提供しない。しかし、ＴＭＶ ｏｒｉを含む組換えＲＮＡ（これもまたタンパク質をコードする）が、構築され得る（Ｓ１０）。一旦、ＶＬＰが免疫細胞に利用されると、ＴＭＶビリオンは固有の機能を有する。これは、リボソームによって優勢に結合され、そして同時翻訳機構によって分解する（Ｍｕｎｄｒｙら，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９９１ Ａｐｒ；７２（Ｐｔ４）：７６９−７７）。これは、このＲＮＡの効率的な翻訳を可能にし、その結果、コードされたタンパク質が、宿主免疫細胞内で産生される。このコードされたタンパク質は、標的化病原体または癌に対する体液性または細胞性のいずれかの免疫応答を刺激するインタクトな抗原であり得る。逆に、このＲＮＡは、免疫刺激タンパク質（免疫応答の振幅を増強する）または調節タンパク質（免疫応答の方向であるＴｈ１またはＴｈ２を保証する）をコードし得る。免疫応答の増強のために機能的であるコードされた核酸成分と組合わせて、免疫応答を刺激し、かつこの応答の効率および効果を促進するこのタンパク質エレメントの組み合わせにより、このワクチンは確実に二機能性になる。
【００９６】
ＲＮＡが「裸の」エレメントとして、または保護タンパク質コーティングでコードされていないエレメントとして、固有に不安定であることに注意すべきである。しかし、このＲＮＡは、核酸ワクチンにおけるＤＮＡを超える利点を有する。なぜなら、このＲＮＡは、免疫細胞内の所望の産物の翻訳を促進するが、分解され、そして免疫された宿主にＤＮＡ組換え事象および関連の腫瘍学的事象の危険性を与えないからである。ミリグラム（ｍｇ）量のＤＮＡがヒトにおける何らかの免疫応答に必要な場合、ＲＮＡ型またはＤＮＡ型の「裸の」、すなわちコートされていない核酸ワクチンは、非常に非効率的である。投与されたｍｇのワクチンのうち、数ピコグラム以下が免疫細胞によって利用される。このことは、高価な製造コストおよび処方コスト、および非常に非能率的な予測不可能な免疫応答を生じる。本発明により、重要な抗原または免疫促進タンパク質をコードする「裸の」ＲＮＡは、ＴＭＶのＶＬＰ構造内でコートされそして保護され得る。このようなコーティングは、ＲＮＡの安定性を増大し、そして送達効率を改善する。
【００９７】
ＶＬＰワクチンは、その表面に免疫ペプチドを付加するための化学的結合化にのみ依存するわけではない。従来技術は、免疫学的に関連したペプチドをＶＬＰの表面に遺伝子融合することによってＶＬＰワクチンを生成する方法を記載する。このプロセスは、図３に記載される。この場合、個々の（Ｓ１１）または複数の（Ｓ１４）ペプチドは、免疫ペプチドのタンパク質コード配列がｖｌｐ構造のタンパク質コード配列に融合される組換えＤＮＡ手順によって、ＶＬＰタンパク質の表面に融合される。各個のペプチドまたは複数のペプチドを提示するＶＬＰ構造は、精製され（Ｓ１１）、次いで、その特性について定性される（Ｓ１２）。多価ワクチンは、遺伝子融合によって、１つ以上のペプチドを提示する個々のＶＬＰ集団を混合すること（Ｓ１３）によって、または遺伝的手段によって、１つより多くのペプチドを提示するＶＬＰの単一の集団を単に使用することによってのいずれかで、構築される。これらの手順は、各々が固有の免疫ペプチドを提示する複数の別個のＶＬＰ集団から構成される多価ＶＬＰ免疫原を生成する（Ｐ３）。このアプローチは、非連結ペプチドの単一混合物によって予測され得る相乗活性がほとんど〜全くない、図１において生成されるワクチンの同じ制限に苦しむ。さらに、ＶＬＰワクチンは、核酸成分を欠き、単なる単機能的ワクチンである（免疫応答に対するタンパク質ベースのシグナルを提供するにすぎない）。
【００９８】
本発明は、確実に多価かつ多機能的なワクチンを誘導することによって、これらの困難性を克服する。ＴＭＶは、各々が固有の遺伝子融合物を有するＶＬＰの混合物を生成するために、図３で記載される同じ手順を受ける。しかし、この固有の特性は、図４に記載の手順を許容する。個々のＴＭＶビリオンは、遺伝的手段によって単一または複数のペプチドを用いて調製され得る（Ｓ１５）。各個のビリオンが単離され（Ｓ１５）、そして定性される。各ＴＭＶビリオンは、別々に分解され（Ｓ１６）、そして免疫ペプチドの固有のアレイを提示する２０Ｓディスクから構成されるＳＵが調製される（Ｓ１７）。次いで、この複数のＳＵは、ＴＭＶ ｏｒｉを含むＲＮＡの周りで配置されて、ＴＭＶ ＶＬＰを生成する（Ｓ１８）。実際に、最終生成物は、ＶＬＰの各々の表面上で複数の免疫ペプチドを同時に提示し（Ｐ４）、かつＶＬＰアセンブリのための足場および別個の免疫刺激因子の両方として機能するＲＮＡを含む、ＶＬＰワクチンである。このアプローチの利点は、この粒子が、ＶＬＰの表面に同時に提示される。複数の免疫ペプチド、免疫調節ペプチド、免疫刺激ペプチドまたは細胞取り込み促進ペプチドの点で多機能性であるという点で、上記と同じである。このことは、より効率的な細胞取り込み、用量の低下をもたらすプロセシングおよび免疫刺激、ならびに免疫保護の改善を可能にする。ＲＮＡは、再び、足場デバイスを越える必須の機能に寄与する。このＲＮＡは、インタクトな抗原、免疫調節、免疫刺激タンパク質をコードして、免疫応答をさらに増大し得る。このＲＮＡは、ＶＬＰ内で保護され、そしてＴＭＶ ＶＬＰの本来の機能によって、細胞翻訳装置に効率的に送達される。
【００９９】
上の記載は、本発明が機能する工程の基本的な枠組み、ならびに本発明に従うワクチンおよび薬学的製品を構築するためのプラットフォームの基本的な理解にすぎないことが理解されるべきである。図２および図４のフロー図に概説される工程は、図５および６に示される。図１〜４に概説される基本的枠組みに関して、２つのさらなる点に注意すべきである。第１に、これらの図は、種々のワクチン組成物が、別個のＶＬＰに提示されるか、または全てが１つのＶＬＰまたはビリオン上に再アセンブルされる３種の固有のエピトープを含むことを示す。三番目は、純粋に例示目的のために選択され、任意の数のエピトープが多価ワクチンを形成するために組換えられえることが理解されるべきである。第２に、ＶＬＰまたはビリオンの表面に提示される実体は、図３および４に示されるようなペプチドエピトープに限定される必要はない。この提示された実体はまた、化学融合により導入されたヌクレオチド、または化学融合もしくは遺伝子融合のいずれかによって導入された完全タンパク質であり得る。さらに、数および比の両方の点において、ヌクレオチド、ペプチドエピトープおよび完全タンパク質の全ての可能な組み合わせは、多価ワクチンの再アセンブリについて想定され得る。例えば、ペプチド１、ヌクレオチドＡおよび完全タンパク質Ｘ（これらの各々は、別個のビリオンまたはＶＬＰに提示される）が、図３のＰ３に類似した多価ＶＬＰワクチンを生成するために、組合わせられ得る。あるいは、各々がペプチド１、ヌクレオチドＡおよび完全タンパク質Ｘを提示する２０Ｓディスクの別個のプールが、インビトロで再アセンブルされて、図４のＰ４と類似した多価ワクチンを生成し、ここで全ての実体は、単一のＶＬＰまたはビリオン上に存在する。
【０１００】
以下は、一連の詳細な実施例であり、これらの実施例は、上記の一般的なフロー図を例示する。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１：ｐＨの関数としてのペプチドの融合物および可溶性）
ペプチド融合物を用いて成功する現在の業界基準は、４０〜５０％である。これを改善するために、一連の融合物を、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質上の複数の挿入位置において試験し、そして各融合物を複数の条件下で抽出して、ウイルス可溶性に対する融合位置の影響を決定した。この実施例は、組換えＴＭＶウイルスの単離（図４の工程Ｓ１５）に対する遺伝子融合位置の影響を記載する。
【０１０２】
図７は、Ｕ１コートタンパク質上の４つの異なる位置（Ｎ末端、Ｃ末端、表面ループ（Ｌ）、およびＣ末端から４アミノ酸（ＧＰＡＴ））で挿入された融合ＨＡについての結果を示す。切断およびウイルス可溶性の程度における明らかな差異が明らかであった。ｐＨ５で抽出した場合、約１００％のＨＡ ＧＰＡＴが、切断されて、野生型Ｕ１タンパク質の分子量に戻った。ｐＨ７での再抽出は、全長の収率を５０％まで改善した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ緩衝液中の組織抽出は、全長コート融合産物を生じ、このことは、切断がプロセシングの間に生じていることを示唆する。これはまた、Ｃ末端融合位置で生じるが、より小さい程度である。コート融合物のプロセシングは、部位特異的であるようである。なぜなら、Ｎ末端にこのエピトープを配置することが、全長産物を生じたからである。ループ位置でＨＡエピトープを用いると、ｐＨ５においてもｐＨ７においてもウイルスは回収されなかった；ＳＤＳＰＡＧＥ緩衝液粉砕（ｇｒｉｎｄ）は、ループ挿入物が発現されたが、不溶性産物を生じたことを示した。ペプチド切断の間に切断を示す融合物（例えば、ＨＡ ＧＰＡＴ）について、プロテアーゼインヒビターカクテルが、切断を減少または排除するために組み込まれ得る。あるいは、他のＮ．ｔａｂａｃｃｕｍ株が、減少したプロテアーゼ活性を有する宿主を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０１０３】
表１は、可溶性および相対回収に対するエピトープ位置の影響を、２つのさらなるモデルエピトープ融合物であるＶ５およびＭｙｃについてまとめる。Ｖ５エピトープＴＭＶ融合タンパク質、ＨＡエピトープＴＭＶ融合タンパク質およびｍｙｃエピトープＴＭＶ融合タンパク質を、ウェスタン分析によって、ペプチド特異的抗体に対する反応性について試験して、各融合ペプチドの招待および完全性を確認した（データは示さず）。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
（表１．３つの抗体結合エピトープの挿入部位による発現レベル）。
【０１０６】
３つのモデル誘導物を用いて発現の確認をした後で、その融合物リストを、再アセンブルした融合生成物に生物学的機能性を組み込むことを目的とした、パピローマウイルスの臨床的に関連するエピトープおよび黒色腫の臨床的に関連するエピトープならびに免疫刺激エピトープおよび細胞融合エピトープを含むように増殖させた。表２は、それらのエピトープ融合物についての可溶性の結果を要約する。試みた１８個の標的エピトープのうち、１５個を、可溶性生成物として首尾良く発現させた（８３％の成功率）。これは、４０％発現／可溶性という以前に産業スタンダードの２倍を示した。この改善は、２つの異なるｐＨ緩衝液用いる抽出と並行して実施した、挿入位置の回転に起因する。
【０１０７】
【表２−１】
【０１０８】
【表２−２】
【０１０９】
（表２） １８個のペプチドのうちの１５個が、Ｎ末端（Ｎ）、ＧＰＡＴ位置（Ｇ）、またはＣ末端位置（Ｃ）のいずれかで、ＴＭＶ Ｕ１コートとインフレームで発現された。葉穿孔粉砕物（約２００μｇの葉組織）からのｐＨ５抽出緩衝液またはｐＨ７抽出緩衝液のいずれかに可溶性であった融合物が、可溶性の欄に示される。首尾良くスケールアップ（＞５００ｇ葉組織）もした融合物もまた、示される。
【０１１０】
（実施例２．リンカーアミノ酸を改変することによる可溶性および蓄積の改善）
ＴＭＶへのエピトープの分子融合物は、時に、芳香族アミノ酸（例えば、Ｗ）または疎水性アミノ酸がそのペプチド中に存在する場合に、蓄積しない。例えば、マウス黒色腫抗原であるｐ１５ｅは、芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ）を含む。このペプチドは、Ｕ１コート上のＮ末端位置またはＣ末端位置上に導入された場合、ウイルスの不安定性を引き起こし、ＴＭＶ全身感染は、観察されなかった。本出願人は、ペプチド可溶性についてより支持する環境を生成するために、隣接アミノ酸は、親水性相互作用を増加するように付加され得、Ｗのようなアミノ酸がコートタンパク質の溶媒に露出した表面上に導入された場合に、ウイルスのアセンブリまたは安定性に対する負の影響を相殺すると理由付けた。アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は、荷電しているアミノ酸であり、これらを使用して、そのような方法が、ＴＭＶコートへのｐ１５ｅの不溶性融合をレスキューすることを示した（図８）。ｐ１５ｅペプチドに近接するＤＥの付加の前に、生成物の蓄積は観察されなかった（＊）。ｐ１５ｅへのＤＥの付加の後、生成物の蓄積が、明らかに見える（矢印）。他のアミノ酸（例えば、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ））を使用してもまた、ＴＭＶ蓄積に対するペプチド組成の負の影響を軽減し得る。ＴＭＶの発現レベルまたはアセンブリに対する負の影響を克服するに十分な隣接アミノ酸の数および型は、融合ペプチド特異的であり得、そして各ペプチドについて経験的に試験する必要があり得る。本実施例は、遺伝子融合物の単離を可能にするための緩和（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）配列の使用を示す（Ｓ１５、図４）。
【０１１１】
（実施例３．ＴＭＶ Ｕ１に対する化学結合エピトープ融合物）
遺伝子融合物のある特定のパーセント（７０〜８０％；実施例１参照）しか、多くの植物ウイルスについての機能的ＶＬＰ形成が可能ではない。多くの融合物は、蓄積せず、一方、他の融合物は、単に不溶性である。本発明は、Ｎ末端融合物または表面ループ融合物のいずれかとしてシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むコートタンパク質融合物の構築を包含する。ＴＭＶ Ｕ１への初期融合物およびＵ１ベクターにおける良好な発現を示す他のトバモウイルスコートタンパク質への初期融合物は、Ｎ融合物および表面ループ融合物として、グリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）またはＧＧＣＧＧから構成される（図９Ａ（１））。以前のＬＳＢＣ実験は、システイン残基が、ビリオン表面上で許容されること、および植物細胞質ゾルの還元条件下で、コートタンパク質サブユニット間または宿主タンパク質間で、ジスルフィド架橋が形成されないことを示した。表面に露出したＣｙｓ残基を含むコートタンパク質の生成は、ヘテロ二官能性化学架橋試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））を使用する結合体化を介する、ＴＭＶビリオンへのペプチド結合体化を可能にする。ＳＰＤＰは、遊離のスルフヒドリル基と、遊離アミン基（例えば、リジン（Ｋ）上で見出される遊離アミン基）との、中性ｐＨにおける穏やかな反応条件下でのカップリングを可能にする。ＳＰＤＰ融合免疫結合体は、インビボ投与において広範に使用されている。種々のトバモウイルスコートタンパク質（ＣＰ）の初期研究および比較生化学応答のために使用されるペプチドは、ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＫ）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫ）およびＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＫ）である。各々は、上記スルフヒドリル基への結合体化のためのＣ末端リジンを含むように、合成（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ）される。ペプチドに加えて、ＳＰＤＰを使用して、チオール化３’末端を使用して、免疫刺激一本鎖ＤＮＡ ＣｐＧポリヌクレオチドを、ＴＭＶビリオンに融合もし得る。代替的アプローチは、異なる反応性アミノ酸（例えば、リジン）をＴＭＶコートタンパク質の溶媒に露出した残基領域（図９Ａ（２））中に導入し、結合体化のためにＣ末端システインまたはＮ末端システインを含むペプチドを合成することである。
【０１１２】
最初に、ＳＰＤＰ結合体化を、分解していないシステイン含有ＴＭＶに対する反応性について試験する。架橋反応を、記載されるＳＰＤＰの短鎖形態、長鎖形態およびスルホ−ＮＨＳ形態（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓおよびその中の参考文献）を使用して、実行する。ペプチド−ＳＰＤＰ付加物を、システインＴＭＶ Ｕ１ウイルスと混合し、その後、そのウイルスとそのペプチドとの物理的会合を示すサイズシフトについて、１６時間後に分析する。その後、この手順を２０Ｓディスクに拡張する。代替アプローチは、グルタルアルデヒドを使用するより特異的でない化学結合体化ストラテジーを使用することであった。このＨＡペプチドを、グルタルアルデヒドの存在下で、ＴＭＶまたはＮ末端システインＴＭＶのいずれかと混合した。グルタルアルデヒドと４時間インキュベーションした後、ＨＡペプチド−ＴＭＶシステイン結合体が形成され、これは、クーマシーによって質量の増加として、そしてウェスタン分析によって見かけの分子量の増加として、眼に見えた（図９Ｂ）。そのような結合体は、野生型ＴＭＶ（溶媒に露出したシステインを含まない）をこの結合体化反応において使用した場合には、存在しなかった（データは示さない）。非特異的架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）による結合体化は、ウェスタンブロットにおいて明らかに眼に見えるのと同様に、より高分子量の凝集物をもたらす。より特異的な化学を有する他の結合体化試薬（例えば、ＳＰＤＰ、ＥＤＣ、または他のヘテロ二官能性リンカー）は、融合ペプチド化学に対する１対１コートまたは指向性コートを生成し、より制御された結合体化反応を生じる。
【０１１３】
代替的ストラテジーは、Ｎシステインコートを２０Ｓディスクにアセンブルさせ、これらのディスクを、機能性エピトープを保有する他のディスクと（すなわち、分子融合による）ＲＮＡ上に再アセンブリさせ、そして完全に再アセンブリした混合物を、ＳＰＤＰ会合ペプチドまたはＳＰＤＰ会合部分とともにインキュベートして、新規な機能性を付加することである。これは、そのＳＰＤＰ結合体化によって２０Ｓディスクが化学的に不活性になって他のディスクと再アセンブルできなくなる場合、または保有されるペプチドが再アセンブリを立体的に妨害する場合に、特に有用である。同様に、モノマーまたはマルチマーの再アセンブル後に種々の薬剤を付加する能力は、優れた有用性を有する。例えば、ｓｓＤＮＡ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）のＳＰＤＰ結合体化は、免疫調節の増強を可能にし、この増強は、単にそのＣｐＧをワクチンと混合するよりも大きい。このことは、より良好な効力および／またはその用量を減少する可能性をもたらし得る。本実施例は、工程Ｓ３（図１）およびＳ９（図２）、ならびに化学的および遺伝子的に結合したエピトープ合わせるための代替経路を提供することを、示す。
【０１１４】
（実施例４．ＴＭＶコートタンパク質融合物の電子顕微鏡法）
ウイルス構造に対する上記融合物の影響を決定するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を実施した（図１０）。野生型ＴＭＶロッド（ｒｏｄ）は、直径１８〜２０ｎｍ×３００ｎｍを有する。上記モデルペプチドＶ５およびＭｙｃのＮ末端エピトープ融合物は、野生型Ｕ１ウイルスと視覚的に類似し、その稈の直径も同様であった。このことは、上記融合が、正常なコートタンパク質再アセンブリをインビボで妨害しないこと、および上記融合物が、インビトロでの再アセンブリのための良好な候補を構成することを、示す。
【０１１５】
（実施例５．野生型ＴＭＶ Ｕ１の抽出および分配）
ＴＭＶ Ｕ１の抽出および処理は、上記の同一に譲渡された米国特許番号６，３０３，７７９、同第６，０３３，８９５および同第６，０３７，４５６（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）において広範に考察されている。その処理は、図１１Ａに要約される。簡単に述べると、秤量した感染組織を、２容量の冷却水（０．０４％ｗ／ｖメタ亜硫酸水素ナトリウムを含む）と合わせ、Ｗａｒｉｎｇブレンダーにおいて粉砕を実施する。そのホモジネートを、４層のチーズクロスに通して繊維を除去し、緑色ジュース（ＧＪ）を残す。そのＧＪのｐＨを、５．０に調整し、４７℃にて５分間加熱する。冷却した後、そのＧＪを遠心分離して、不溶物を沈殿させ、第１上清を得る。そのウイルスが残りのペレットＰ１中に分配する場合、そのペレットを水中に再懸濁し、ｐＨ７．０に調整する。遠心分離後、そのウイルスを第２上清中で回収し、最後のペレットＰ２を捨てる。そのウイルスを精製して濃縮するために、２回の連続選択沈殿を、第１上清処理ストリームおよび第２上清処理ストリームに対して実施する。このウイルスの沈殿を、４％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および４％ｗ／ｖ ＮａＣｌに対してこれらの上清を調整して３０〜６０分間冷却することによって、達成する。遠心分離後、このウイルスを、ペレットとして回収する。混入タンパク質は、この上清中に残る。この上清を捨てる。
【０１１６】
図１１Ｂおよび表３は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９から単離した野生型ＴＭＶ Ｕ１についての代表的結果を示す。そのＳＤＳゲルは、上記プロセスが、高純度の最終ウイルス調製物を生じることを明確に示す。ＢＳＡを標準物として使用して、そのコートタンパク質バンドを、濃度測定により定量し、このプロセスについての物質収支を、回収を決定するために実施する（表３）。このデータから、このウイルスの大部分が、Ｓ１プロセスストリームに分配し、ＰＥＧ沈殿の間に最小限しか喪失せず、総プロセス回収７６％が達成されたことが、明らかである。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
（表３） 感染Ｎ ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９植物からのＴＭＶ Ｕ１の単離についての物質収支。データは、図１１におけるゲルの濃度測定分析から、ＢＳＡ標準曲線を使用して生成した。
【０１１９】
（実施例６．ウイルスの抽出および分配に対するエピトープ融合物の影響）
実施例５に概説されるプロセスを、表２に列挙されるコートタンパク質融合物の選択のために使用した。物質収支を、総プロセス回収を決定することに加えて、Ｓ１プロセスストリームとＳ２プロセスストリームとの間のウイルスの分配を決定するために、実施した。各融合物の正体を、ＭＷ ＭＡＬＤＩによって確認した。これらの精製についての結果を、表４に要約する。この表から、処置の特徴は、エピトープ融合および位置に依存することが明らかである。抽出に関する物質収支は、９０〜１００％（例えば、ＨＰＶ ｅｐ２ Ｎ）〜１０％未満（例えば、Ｖ５Ｎ）の初期回収（Ｓ１プロセスストリーム＋Ｓ２プロセスストリーム）を生じた。Ｓ１ストリームとＳ２ストリームとの間の分配はまた、実質的に変化した。全体的回収はまた、０．５％〜７９％の範囲であった。このデータに基づいて、システインＮコートタンパク質融合物、Ｍｙｃ Ｎコートタンパク質融合物、およびＶ５Ｎコートタンパク質融合物を、最適化研究に進めて、全体的プロセス回収を改善する条件を決定した。この最適化は、実施例７および８に詳説される。この最適化は、遺伝子融合物を示すＴＭＶウイルスを単離するために使用し得るプロセス改変を示す（ステップＳ１５、図４）。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
（表４） 種々のコートタンパク質融合エピトープについてのウイルス分配および全体的プロセス回収。融合位置命名；Ｎ（Ｎ末端）；Ｃ（Ｃ末端）；ＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ配列に対してＮ末端側）。＃は、１回より多く単離された融合物についての精製実行回数を示す。
【０１２２】
（実施例７．ウイルスの抽出および分配に対する塩化ナトリウムの影響）
抽出緩衝液中に塩化ナトリウムを組み込むことを、ウイルス回収を改善してウイルス分配を変化させるための手段として試験した。ＧＥＮＥＷＡＲＥ感染したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を採集し、そのバイオマスを分割して、塩の存在下および非存在下における抽出の接戦（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）比較を実施した。その植物物質のうちの１／２を、０．０４％のメタ亜硫酸水素ナトリウムを含む冷却水中に抽出し、残りのバイオマスを、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（４％ｗ／ｖ ＮａＣｌおよび０．０４％メタ亜硫酸水素ナトリウムを含む）中に抽出した。実施例５に概説される手順に従って、処理を実施した。システインＮ ＴＭＶ融合物（図１２）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳ１画分とＳ２画分との比較は、塩の存在が、ウイルスをＳ１画分へと分配させることを明確に示す。このことは、都合が良い。なぜなら、このストリームから得られるウイルスは、代表的には、植物色素および不純物が混入することが少ないからである。また、図１１Ａから、Ｓ１分配が、Ｓ２分配よりも優先することが明らかである。なぜなら、Ｓ１分配は、処理工程の数を減少するからである。
【０１２３】
塩の存在下および非存在下での抽出物の物質的バランスは、表５に示される。システインＮについてのデータから、全体的なプロセス回収率が、塩の添加で実質的に改善されたことが明らかである；両方のプロセスで抽出された総ウイルスは、同一であるが、塩の非存在下でのウイルス喪失は、４％ ｗ／ｖ 塩化ナトリウムでわずか７％であることと比較すると、４４％であった（Ｐ２ペレットと関連したまま）。表５はまた、抽出の間のＭｙｃ Ｎコートタンパク質融合物およびＶ５Ｎコートタンパク質融合物の回収およびウイルス分離についてのデータを有する。塩化ナトリウムの利点もまた、明らかであり、このことは、このプロセス改変が一般的適用性を有することを示す。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
（表５ 感染したＮ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物からのマルチエピトープを示すウイルスの単離についての物質的バランス。データを、ＢＳＡ標準曲線を用いて、ＳＤＳゲルのデンシトメトリー分析から生成した。
【０１２６】
（実施例８ ウイルス沈殿物の塩およびＰＥＧ濃度の影響）
図１１に示されるように、Ｓ１またはＳ２プロセシングストリームのいずれかにおけるウイルスを、さらに精製し、一連の２つのＰＥＧ沈殿によって濃縮する。第１のＰＥＧ沈殿に関与するこのステップは、以下のフローダイアグラムに概説される（図１３）。このＳ１（またはＳ２）上清を４％ ｗ／ｖ ポリエチレングリコールおよび４％ ｗ／ｃ ＮａＣｌに調節する。その上清が既にＮａＣｌを含んでいる場合、固体のＰＥＧのみを添加し、攪拌しながら溶解し、サンプルを氷上で冷却する。沈澱したウイルスを遠心分離によってペレットにし、上清を廃棄する。次いで、ウイルス含有ペレットを、低イオン強度緩衝液中に再懸濁し、低速清澄遠心（ｌｏｗ ｓｐｅｅｄ ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ）を行う。これにより、いかなる残渣色素もペレットになり、夾雑植物タンパク質が凝集し、溶液中にウイルスが残る。次いで、この溶液を、４％ ｗ／ｖ ＰＥＧおよび４％ ｗ／ｖ ＮａＣｌに調節し、このプロセスを反復することによって、第２のＰＥＧ沈殿物にする。
【０１２７】
表６は、野生型ＴＭＶ Ｕ１および２つのコートタンパク質融合物（Ｍｙｃ ＮおよびＶ５Ｎ）についての２工程ＰＥＧ沈澱から得られる回収率を比較する。図１３に概説される標準的手順では、野生型Ｕ１と比較すると、両方のコートタンパク質融合物について乏しい回収率しか生じなかった。フローダイアグラムから、この喪失は、ＰＥＧによるウイルスの不完全な沈澱または清澄工程の間のウイルスのペレット化から生じうる。ＰＥＧ沈澱における各工程周辺の物質的バランスは、Ｍｙｃ Ｎ ４％ ｗ／ｖ ＰＥＧについては、ウイルスをペレットにするには不十分であり、大部分が上清中に残ったままであることが示された。この場合、ＰＥＧ濃度を８％ ｗ／ｖまで増大させことが必要でありこの改変は、６％〜６０％へと回収率を増大させた。Ｖ５Ｎについては、ウイルスの完全沈殿が４％ ｗ／ｖ ＰＥＧで達成されたが、そのウイルスは、清澄遠心の間に、溶液中には残らなかった。そのウイルス含有ペレットを１０ｍＭ ＮａＫＰＯ４（４％ ｗ／ｖ ＮａＣｌを含む）中に再懸濁することによって、ウイルスは可溶性のままであり、回収率は、１％未満から９５％まで増大した。これらの２つの実験は、ウイルス融合物がどの程度ウイルス特性に影響を与えうるかを示し、プロセシングの間にウイルス可溶性を維持する方法を提供する。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
（表６ ＴＭＶコートタンパク質融合物についてのＰＥＧ沈澱工程の最適化）
（実施例９：遊離コートタンパク質および２０Ｓディスクの生成）
この実施例は、より詳細に、工程Ｓ７およびＳ８（図２）ならびに工程Ｓ１６およびＳ１７（図４）を例示する。コートタンパク質を、Ｆｒａｅｎｋｅｌ Ｃｏｎｒａｔ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９５７，４，１−４）によって開発されたプロトコルの改変版を用いて、精製ウイルスから生成した。このプロトコルを図１４にまとめる。簡潔には、そのウイルスを２容量の氷酢酸と合わせ、４℃で１時間インキュベートし、ウイルスの解離およびＲＮＡの分解／沈澱が得られる。遠心分離をして分解したＲＮＡを除去した後に、酢酸を透析によって除去した。あるいは、限外濾過／ダイアフィルトレーションを使用して、透析の前に氷酢酸の大部分を除去しうる。透析すると、コートタンパク質は、その等電点で沈澱する。その沈澱したコートタンパク質を、遠心分離によって単離し、水に再懸濁した。ｐＨを８に調節することによって、コートタンパク質を再溶解し、最後の遠心に供して、全ての残りの凝集種を除去した。
【０１３０】
このプロセスは、多くの遊離コートタンパク質融合物を精製ウイルスから作製するために使用した。表７は、エピトープ融合物の選択（そのためにコートタンパク質が生成される）に対するプロセス回収率をまとめる。
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
（表７ エピトープ融合物の選択のための遊離コートタンパク質生成。融合物位置の指定；Ｎ、Ｎ末端；Ｃ、Ｃ末端）
コートタンパク質の量を、紫外線吸光度スペクトルによって評価した（Ｄｕｒｈａｍ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９７２，６７：２８９）。このスペクトルは、２８２ｎｍでの最大吸光度および２５１ｎｍでの最小吸光度、ならびに２．０と２．５との間の最大：最小の比を有するべきである。より低い比は、コートタンパク質調製物の残りのＲＮＡ夾雑物を示す。図１５Ａは、野生型ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質の代表的な吸光度スペクトルを示す。表８は、種々のエピトープ融合物を示す遊離コートタンパク質調製物の吸光度比をまとめる。最大：最小の比が予測より低かった場合（例えば、Ｍｙｃ Ｎ）、このコートタンパク質調製物を、陰イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥセファロース）で処理した。この夾雑するＲＮＡは、正に荷電した樹脂と強く会合する一方で、コートタンパク質の会合はより低く、よって、低塩化物イオン濃度でのコートタンパク質の選択的溶出が可能になる。このアプローチは、５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液によってＭｙｃ Ｎコートタンパク質を夾雑する残渣ＲＮＡから分離して、最大：最小吸光度比が２より大きいコートタンパク質調製物を生成することに成功してきた（図１５Ｂ〜Ｄ）。
【０１３３】
【表８】
【０１３４】
（表８ 種々のエピトープ融合物を示す遊離コートタンパク質の最大吸光度（２８２ｎｍ）：最小吸光度（２５１ｎｍ）の比。融合物位置指定；Ｎ、Ｎ末端；Ｃ、Ｃ末端）
再アセンブリ反応において使用する前に、そのコートタンパク質調製物を、３〜４コートタンパク質からなる４つのＳサブユニットから、２０個のＳディスクに変換する（図５を参照のこと）。このことは、使用前にコートタンパク質調製物を室温で、正確なｐＨおよびイオン強度条件下で２４〜４８時間インキュベートすることによって達成した。例えば、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質（０．１Ｍ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０中）を、１６時間かけて室温にて４℃から平衡化させ（２０〜２２℃）、最初のおよび平衡化したコート調製物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図１６に認められるように、室温でのインキュベーションは、二峰性分布を生じ、２０個のＳディスクの形成を生じた。
【０１３５】
（実施例１０：２０個のＳディスクからの野生型ＴＭＶビリオンの再アセンブリ）
この実施例は、実施例１１〜１３とともに、Ｐ４（図４）を生成するための、多価の二機能性ワクチンの生成のための方法（すなわち、工程Ｓ１８（図４））を例示する。ＴＭＶ再アセンブリのための標準的な条件は、野生型Ｕ１コートタンパク質および野生型ＴＭＶ ＲＮＡ足場について概説されている（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ，ＨおよびＳｉｎｇｅｒ，Ｂ（１９５９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，３３，３５９−３７０）。代表的には、０．１Ｍリン酸またはピロリン酸緩衝液（７．０〜７．５のｐＨが、２２：１のコートタンパク質：ＲＮＡの質量比で使用される）
ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質を、実施例９に記載されるように、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ変異系統ＭＤ６０９植物から単離した野生型ウイルスから生成した。野生型ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて同じウイルスから単離した。再アセンブリ反応を、９６ウェルプレート様式で、１１００μｇ／ｍｌのコートタンパク質濃度および５０μｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度において２００μｌ容量で行った。この反応系を、０．１Ｍリン酸またはピロリン酸（ｐＨ７．２）で緩衝化し、このコートタンパク質を、使用前に２日間にわたって室温にて予備インキュベートした。この予備インキュベーションにより、４個のＳサブユニットから２０個のＳディスク形成が生じる（図１６）。標準的条件に加えて、リボヌクレアーゼインヒビターＲＮａｓｉｎを、０．１Ｍ リン酸緩衝化反応系に加えることによっても試験した。この再アセンブリ反応を、３１０ｎｍでの吸光度の変化（これは、再アセンブリ生成物の平均長の増大に対応する）を経時的に測定することによって行った。
【０１３６】
図１７Ａは、再アセンブリ反応についてのＡ３１０ｎｍプロフィールを示す。野生型ウイルスコントロールは、モル濃度ＲＮＡ濃度は、再アセンブリ反応物の濃度に等しいようにした。リン酸の代わりにピロリン酸を使用することにより、再アセンブリの開始速度が改善され、ＯＤ最大は、ＴＭＶウイルスコントロールのものに相当した。リン酸緩衝化再アセンブリ反応については、最大ＯＤは、微量のウイルスより低かった（０．１２ＯＤ対０．１４ＯＤ）。アガロースゲル電気泳動（図１７Ｂ）による最終的な再アセンブリ反応におけるＲＮＡ完全性を評価することによって、ＲＮＡ分解がピロリン酸サンプルおよびリン酸サンプルの両方において、後者がより大きな程度で起こっていることが示された。従って、異なるリボヌクレアーゼインヒビターをコートタンパク質に添加することによって、試験した。リボヌクレアーゼインヒビター（さらなるＤＴＴありまたはなしのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、あるいはＳＵＰＥＲａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のいずれか）を、ＲＮＡ添加（０．２〜４Ｕ／μｌ）の３０分前に、コートタンパク質調製物に添加した。試験した全ての濃度のＳＵＰＥＲａｓｅは、効果的でなかったのに対し、ＲＮａｓｉｎは、ＲＮＡ分解を実質的に減少させた（図１７Ｂ）。その存在はまた、再アセンブリ反応について得られる最大ＯＤ３１０ｎｍを改善した（図１７Ａ）。
【０１３７】
異なる緩衝液の組み合わせの機能的重要性を決定するために、再アセンブリ反応物のアリコートを、局所的病変宿主アッセイによって分析した（表９）。この再アセンブリ反応物、裸のＲＮＡおよびウイルスコントロールを連続希釈し、研磨剤として使用されるカーボランダムをＮ．ｔｏｂａｃｕｍ「Ｘａｎｔｈｉ」ＮＮ植物の葉に塗布した。接種後５日間、病変の数を計数し、再アセンブリ反応における機能性ウイルスの力価の半定量的測定を提供した。
【０１３８】
【表９】
【０１３９】
（表９ 野生型Ｕ１コートタンパク質およびＴＭＶ ＲＮＡを用いた再アセンブリ反応についての局所的病変宿主アッセイデータ。Ｐ０４、０．１Ｍ リン酸緩衝化；ｐｙｒｏ ＰＯ４、０．１Ｍ ピロリン酸緩衝化；ＰＯ４ ＲＮａｓｉｎ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビターを含有する０．１Ｍ リン酸緩衝化）
等価なモル濃度のＲＮＡ濃度を含む再アセンブリ反応物に対して、遊離ＲＮＡの感染性を比較すると、ＲＮＡキャプシド化により感染性が改善されることが明らかに示される。再アセンブリ反応物内で、感染性における顕著な改善が、ＲＮＡ完全性およびＡ３１０ｎｍのＯＤ最大における改善に相関して、ＲＮａｓｉｎが存在した場合にリン酸緩衝液について明らかであった。ＲＮａｓｉｎでの観察された感染性は、ウイルスコントロールの感染性と匹敵した。ピロリン酸緩衝液はまた、加速された再アセンブリに起因して感染性を改善し、ＲＮＡの保護を補助した。
【０１４０】
（実施例１１ ＴＭＶ ＲＮＡ上へのコートタンパク質融合物の再構築）
この研究の中心的な目的は、多機能ＴＭＶに基づく再構築生成物の生成であり、これは、異なる機能を有するエピトープ（例えば、抗体またはＣＴＬ標的とともに細胞標的化または免疫調節配列）を示す。第１の工程として、ＴＭＶ ＲＮＡ上に再構築する種々のコートタンパク質融合物の能力が試験された。選択される融合は、ＥＬＤＫＷＡＳならびにＮ末端のＨＰＶ ｅｐ２およびＣ末端のＭｙｃであった。再構築反応を、９６ウェルプレート様式で、１１００μｇ／ｍｌのコートタンパク質濃度および５０μｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度で、２００μｌ容積で実行した。反応を０．１Ｍホスフェート（ｐＨ７．０）で緩衝化し、そしてコートタンパク質を、使用の前に室温で２日間プレインキュベートした。反応のサブセットにおいて、リボヌクレアーゼインヒビターＲＮａｓｉｎを組み込んだ。再構築反応に続いて、経時的に３１０ｎｍで吸光度の変化を測定し、これは、再構築生成物の平均の長さの増加に対応する。
【０１４１】
図１８Ａは、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合を含む再構築反応についてのＡ３１０ｎｍプロフィールを示す。反応混合物中のＲＮａｓｉｎの存在は、より高い最終ＯＤで改善された吸光度プロフィールを明らかに生じた。再構築反応のＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によって評価された（図１８Ｂ）。分解の程度がＵ１コートタンパク質を含む再構築反応よりも実質的に高いが、ＲＮａｓｉｎの存在は、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質再構築物におけるＲＮＡ分解の程度を減少しなかった。
【０１４２】
ＲＮＡプロフィールを伴うＡ３１０ｎｍ動力学は、ＲＮａｓｉｎが、再構築の間に形成された全長ロッドの割合を増加することを示唆する。これを確認するために、サンプルを電子顕微鏡によって分析した（図１９）。ＲＮＡの存在および非存在におけるコートタンパク質の画像を比較することは、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合物のＴＭＶ ＲＮＡ足場上への再構築が生じたことを示す。ＲＮａｓｉｎの影響を評価するために、正規化粒子サイズ分布（電子顕微鏡画像から得られる）を決定した。ＲＮａｓｉｎの存在とともに、全長（＞２７５ｎｍ）ロッドの５％から２０％の同時の増加とともに、０〜１００ｎｍの長さのロッドの減少が存在し、これは、Ａ３１０ｎｍ吸光度データと相関する。
【０１４３】
全長ロッドの減少は、おそらく全長ＲＮＡの減少したプールから生じた。これは、機能的、すなわち、感染性の再構築生成物の数を減少することが予期される。局所損傷宿主アッセイによる再構築生成物の分析は、この減少を確認し；ＲＮａｓｉｎを省くことは、９の因子によって観察される損傷の平均数を減少した（表１０）。
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
表１０ 複数のコートタンパク質融合物およびＴＭＶ ＲＮＡとの再構築反応についての局所損傷宿主アッセイデータ。ＰＯ４、緩衝された０．１Ｍリン酸塩；ＰＯ４ ＲＮａｓｉｎ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビターを有する緩衝化された０．１Ｍリン酸塩。全ての希釈は、１０−３であった。この希釈において、損傷は、遊離野生型ＲＮＡについて検出されなかった。Ｎ，Ｎ−末端融合；Ｃ，Ｃ末端融合。
【０１４６】
再構築反応はまた、ＲＮａｓｉｎの存在下または非存在下で、ＨＰＶ ｅｐ２およびＭｙｃコートタンパク質融合物を用いて実施した。ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合物と同様に、再構築の間、ＲＮａｓｉｎの存在は、より高い最終ＯＤおよび改善されたＲＮＡ完全性とともにＡ３１０ｎｍプロフィールを生じた。機能的な見地から、ＲＮａｓｉｎの存在下で生じた再構築生成物は、局所損傷宿主アッセイによるより高い活性を示した（表１０）。ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２について、損傷の平均数は、１５であり、ＲＮａｓｉｎが存在した場合、それぞれ６倍高かった。これらの感染性の研究は、溶媒に暴露されたエピトープを有するＴＭＶコートタンパク質が、機能性ＲＮＡを再構築し、そしてキャプシドに包まれる能力を明らかに示す。
【０１４７】
コートタンパク質調製物は、それらと関連する植物由来のリボヌクレアーゼ活性を有し、これは、再構築反応におけるＲＮａｓｉｎの包含によって部分的に軽減され得る。代替のアプローチはまた、開始ビリオン調製物と関連するリボヌクレアーゼ活性を減少するために使用され得、これからコートタンパク質調製物が作製される。ウイルス調製物は、ベントナイトで処理され得、このベントナイトは、リボヌクレアーゼ活性を阻害する（Ｊａｃｏｌｉ，Ｇ．，Ｒｏｎａｌｄ，Ｗ．，ａｎｄ Ｌａｖｋｕｌｉｃｈ，Ｌ．：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５１，１５５８，１９７３）。あるいは、ウイルス調製物は、０．０５％〜０．１％ｖ／ｖでジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理され得、これは、酵素部位でヒスチジン残基と特異的に反応することによって、ＲＮａｓｅを不活化する。残りのＤＥＰＣは、ＤＥＰＣが反応する第１級アミン基（例えば、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）を含む任意の緩衝液に対して広範囲に処置されたウイルスを透析することによって除去される。
【０１４８】
多価ＴＭＶベースのワクチンを作製するための再構築反応は、ＴＭＶ ＲＮＡ足場を使用して実施した。ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２コートタンパク質融合物を、１対１の比で対で組み合わせた。図２０は、２価キャプシド化についてのＡ３１０ｎｍ再構築動力学を、個々に使用したコートタンパク質融合物についての動力学と比較する。２価反応は、経時的に、吸光度の類似の上昇を示し、これは、再構築が２つの独立したコートタンパク質融合物の存在において効率的に存在したことを示す。機能的２価再構築ビリオンの作製について試験するために、局所損傷宿主アッセイを実行した（表１０）。一価構築物に匹敵する損傷数を得、機能的再構築生成物の存在を確認した。
【０１４９】
（実施例１２ 多価パピローマウイルス予防ワクチン）
（導入）
動物は、パピローマウイルス構造タンパク質（Ｌ１およびＬ２）のいずれかまたは両方でのワクチン接種によるパピローマウイルスでの感染に対して保護され得る（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ＤＭら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １８６：１６９−ｌ８２；Ｋｏｕｔｓｋｙ ＬＡら，２００２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４７：１６４５−５１）。パピローマウイルス感染に対する保護は、主に、特異的な体液性応答を必要とし、これは、構造タンパク質におけるエピトープに対するウイルス中和抗体（Ｎａｂ）の産生を生じる。構造タンパク質に対する細胞性免疫応答はまた、ワクチン誘導免疫に寄与し得る。Ｌ１、または非構造遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８の１つ以上を含む生の（ｌｉｖｅ）組換えウイルスおよびＤＮＡワクチンベクターは、ワクチン接種された動物において保護免疫を誘導し得る；これらの場合において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方が、検出される（Ｓｕｎｄａｒａｍ Ｐら，１９９７，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：６６４−７１；Ｍｏｏｒｅ ＲＡら Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２０：２２９９−３０１）。パピローマウイルス構造タンパク質に対する体液性応答は、パピローマ感染に対する保護免疫について必要かつ十分である（Ｅｍｂｅｒｓら，２００２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５）。ウイルスコードタンパク質に対する細胞性免疫応答は、保護性免疫応答のレベルおよび頑強さを増強するが、初期感染を妨げない（Ｔｏｂｅｒｙ ＴＷら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：１５３９−４７）。
【０１５０】
（２価または多価再構築ワクチン）
最も重要なパピローマウイルスＮａｂは、Ｌ１においてコンフォメーショナルなエピトープを結合し、そしてインタクトなウイルスのみまたは正確に構築されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を認識する。これらのＮａｂは、キャプシド表面上にある超可変性ループ中のエピトープを認識し、そして一般的に、密接に関連したパピローマウイルス型のみを中和する。Ｌ２のＮ末端領域における直線エピトープに結合する抗体はまた、ウイルス感染性を中和し得る。最も重要なことには、Ｌ２エピトープに対するＮａｂは、異なるウイルス株を交差中和する能力を示す（Ｅｍｂｅｒｓ ＭＥら，２００２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５；Ｋａｗａｎａ Ｙら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２３３１−２３３６；Ｋａｗａｎａ Ｋら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６１８８−６１９０；Ｋａｗａｎａ Ｋら，２００１，１４９６−１５０２；Ｒｏｄｅｎ ＲＢＳら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７０：２５４−２５７）。Ｅｍｂｅｒｓら（２００２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５）は、ウサギパピローマウイルスウサギ口腔パピローマウイルス（ＲＯＰＶ）およびワタオウサギ口腔パピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のＬ２タンパク質において線形エピトープを表すペプチドが、相同なウイルスでのチャレンジに対しては良好な保護免疫を誘導し得るが、異種ウイルスに対しては誘導し得ない。
【０１５１】
直線中和ウサギパピローマウイルスエピトープＣＲＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２；ＲＯＰＶ Ｌ２．１およびＲＯＰＶ Ｌ２．２（Ｅｍｂｅｒｓ ＭＥら，２００２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）を示す組換えＴＭＶ Ｕ１を構築した（表２）。各組換えウイルスは、高い力価の相同ウイルスを用いるチャレンジに対して動物を保護する中和抗体を誘導する。しかし、各ワクチンは、異種ウイルスを中和するのに十分な力価のＮａｂを誘導しないかもしれない。
【０１５２】
ＴＭＶ ＯＡＳを含む構造ＲＮＡ上に、少なくとも２つの異なるコートタンパク質（それぞれ異なるペプチドを示す）を構築することによって、ＣＲＰＶおよびＲＯＰＶの両方に対する保護性免疫を誘導する多価組換えワクチンを作製し得る。例えば、実施例９に記載される方法は、ＴＭＶ Ｕ１のＣ末端に対して近位の「ＧＰＡＴ」位置にＣＲＰＶ Ｌ２．１ペプチドを示す組換えＴＭＶビリオンから遊離コートタンパク質を単離するために使用し得る。同様に、遊離コートタンパク質は、ＴＭＶ Ｕ１のＣ末端に対して近位の「ＧＰＡＴ」でＲＯＰＶ Ｌ２．１ペプチドを示す組換えＴＭＶビリオンから単離され得る。野生型ＴＭＶ ＲＮＡ、または構築配列のＴＭＶ Ｕ１起源（ＯＡＳ）を含む組換えＲＮＡは、再構築された２価ワクチンが、実施例１０および１１に記載される方法に従って構築される足場として使用され得る。同様に、ワクチン接種した動物においてＮａｂを誘導する能力を有するペプチドを示すさらなる組換えＵ１コートタンパク質は、多価ワクチンウイルスまたはウイルス様粒子を作製するために、再構築反応内に組み込まれ得る。２価または多価ワクチンでワクチン接種される動物は、組換えワクチン分子に融合した種々のペプチド抗原を認識する抗体を産生する；これらの抗体は、ＣＲＰＶおよびＲＯＰＶの両方を中和し得る。従って、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギは、単一ワクチン部分でのワクチン接種後、２つの異なるウイルス種に対して感染を保護される。
【０１５３】
（多機能ワクチン：体液性免疫および細胞性免疫の誘導）
ＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２ペプチドと相同なヒトパピローマウイルス型１６Ｌ２の配列は、特異的なレセプターに結合し得、そして細胞表面への結合において、レセプター媒介機構によりこれらの配列に融合したタンパク質の細胞侵入を媒介し得る（Ｋａｗａｎａ Ｙら、２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２３３１−２３３６；Ｙａｎｇら、２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：３５３１−３５４１）。従って、これらの配列を示すビリオンおよび再構築されたウイルス様構造が、ウサギ細胞の表面に結合し得、細胞内への再構築されたウイルス構造の侵入を媒介することが予期される。構築されたウイルスまたはウイルス様粒子によって示されるＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２ペプチドの１つ以上で再構築された粒子のさらなる細胞融合機能は、形質導入された細胞の細胞質への機能性ＲＮＡペイロードの送達を可能にする。
【０１５４】
再集合されたウイルス構造の表面上に示されるＬ２ペプチドにより誘導される保護抗体媒介免疫を増加させるために、ＲＮＡ足場が、さらなる生物学的活性を有する。例えば、足場ＲＮＡは、自律性複製のために必要なセムリキ森林アルファウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ配列をコードする組換えＲＮＡ分子であり、ＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子は、ＳＦＶ由来の２６ＳＲＮＡプロモーターの制御下で発現され得、ＴＭＶ Ｕ１ ＯＡＳは、ＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子の下流に挿入される。この構築物が、図２２に示される。動物は、足場としてキャップされたＳＦＶ：：ＣＲＰＶＬ１：：ＯＡＳ ＲＮＡ分子を含む再集合されたウイルス構造で免疫化され、これらの構造は、足場ＲＮＡ上に集められる１つ以上のＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２エピトープを示す組換えＴＭＶコートタンパク質により保護される。組換えＴＭＶコートタンパク質は、いくつかの以下の重要な機能を実施する：（１）これらのタンパク質は、ヌクレアーゼ消化から組換えＳＦＶ ＲＮＡ分子を保護する；（２）これらのタンパク質は、マクロファージ、樹状細胞、および他の抗原呈示細胞により優先的に認識されかつ包み込まれるような粒子状の準結晶性構造を形成する；（３）特異的な細胞結合活性にも関わらず、これらのタンパク質は、細胞質に組換え粒子を送達する。
【０１５５】
一旦粒子が細胞質中にある場合、組換えＲＮＡ分子が翻訳され、そしてＲＮＡが、ＳＦＶ非構造タンパク質（ＮＳＰ）レプリカーゼ活性により媒介される複製の１つ以上の周期を経る。ＣＲＰＶ Ｌ１ ＲＮＡおよびＴＭＶ ＯＡＳをコードするサブゲノムＲＮＡが転写され、そしてＣＲＰＶ Ｌ１ ＲＮＡが、翻訳される。次いで、細胞内で発現されるＬ１タンパク質は、処理およびＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉを介してＴ細胞への呈示のために利用可能であり、それによりＬ１タンパク質に対する細胞免疫応答に刺激を与える。形質導入された細胞の細胞質に送達される組換えＳＦＶ ＲＮＡの複製は、ｄｓＲＮＡ誘導プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）のような病原体サーベイランスシグナル伝達分子を介する先天的な免疫応答を誘導し、その結果インターフェロンガンマのような炎症性サイトカインの分泌を生じる。これは、Ｌ１ ＯＲＦに対して誘導される特異的な細胞免疫応答を増大する。従って、構造タンパク質（Ｌ１およびＬ２）の両方に対する幅広い強固な免疫応答が、誘導される。これらの多機能性ワクチンでワクチン接種されたウサギは、ＣＲＰＶウイルスおよびＲＯＰＶウイルスの両方の病原体接種に対して保護される。
【０１５６】
機能的ＲＮＡを生成する代替的な方法は、ＩＲＥＳおよびＬ１についての配列をＴＭＶ ＲＮＡ中に挿入することであり、これはまた、コートタンパク質上のＬ２ペプチドエピトープの分子融合を発現する。この方法は、インビボでＲＮＡをキャプシドで包む利点を有し、そして細胞摂取メカニズムが遺伝子の転写を可能にする後まで分解からＲＮＡを保護するために再度キャプシドで包むことに依存しない。第３の戦略において、コートタンパク質はまた、Ｔヘルパーエピトープ、細胞融合エピトープ、アジュバンド、またはＥ７のような非構造タンパク質の全長遺伝子産物の結合のためのＮ末端システインを有する。
【０１５７】
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８を含む乳頭腫ウイルス非構造タンパク質は、ワクチン接種された動物における、保護的免疫または病変の後退および除去を媒介することが公知である（Ｈａｎ Ｒら、２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ ２６：４５８−６７；Ｈａｎ Ｒら、２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：９７１２−６）。上記と同じ様式で、保護免疫を媒介することが公知であり、ウイルス感染の後退または治癒を誘導し得る他の乳頭腫タンパク質をコードするｍＲＮＡまたは自律性複製ＲＮＡが、ウイルス構造中でキャプシドに包まれ得る（図２２）。
【０１５８】
（実施例１３ 多価黒色腫ワクチン）
腫瘍成長に対する良好な保護を刺激する黒色腫抗原は、代表的にＣＴＬエピトープとして特徴付けられる。ＣＴＬ応答は、免疫系に対するワクチン呈示の間の免疫刺激を包含する抗原呈示のための状況に高度に依存する。これは、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＮＦγのような免疫刺激サイトカイン、ＣｐＧオリゴのようなＴ細胞を特異的に活性化するアジュバント、またはＩｌ１ＢまたはＭＩＰ１ａまたはＩＰ１０のような免疫調節ペプチドもしくはタンパク質のいずれかについての必要性により特徴付けられ、ワクチンと共に送達され、またはワクチン産物に直接融合される。分子結合体または化学結合体のいずれかである、黒色腫ＣＴＬエピトープ融合体が、野生型ＴＭＶ ＲＮＡ上で再集合され、そしてペプチド特異的ＣＴＬ応答の適切な刺激について試験される。次いで、同じ黒色腫ＣＴＬエピトープ融合物が、ＴＭＶアセンブリ起点およびＩＦＮｇ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１ａまたはＩＰ １０についての哺乳動物翻訳可能コドンの両方を含むＲＮＡに再集合される。エピトープＴＭＶまたはエピトープＴＭＶ／ＩＦＮγ（例えば）でのワクチン接種後、ＣＴＬ応答のレベルが、測定され、かつ比較される。機能的ＲＮＡの翻訳は、免疫活性を生じるタンパク質を生成し、これによりＣＴＬ応答を増大する。
【０１５９】
あるいは、ＲＮＡは、より幅広い免疫範囲についての細胞免疫応答または体液免疫応答を刺激する第２の全長抗原をコードする。例えば、黒色腫腫瘍は、病原体接種された個体においてＣＴＬ応答および抗体応答の両方を生成するいくつかの特異的な抗原を発現する。マウス腫瘍において、このような抗原としては、ｐ１５ｅ、チロシナーゼ（ｔｒｙｒｏｓｉｎａｓｅ）およびＧＰ１００が挙げられる。いくつかのＣＴＬエピトープおよび抗体刺激ドメインが、各々の腫瘍特異的抗原について存在する。規定されたＣＴＬエピトープ（例えば、ｐ１５ｅ ＣＴＬエピトープ）が、ＴＭＶの表面上に融合され、そしてキャプシドで包まれたＲＮＡが、ｇｐ１００またはチロシナーゼコード配列の全体をコードする。ｐ１５ｅエピトープに対するＣＴＬ反応性が測定され、ＲＮＡによりコードされるｇｐ１００またはチロシナーゼエピトープに対するさらなる細胞反応性または体液反応性が、生じる遺伝子産物のＲＮＡ発現および活性を示す。
【０１６０】
細胞アッセイまたは体液アッセイは、ワクチンが免疫応答を刺激するレベルを指示する。免疫反応性を示す別の方法は、抗原をコードする腫瘍で動物に病原体接種するか、腫瘍成長の速度または腫瘍が引き起こす病的状態をモニタリングすることによる。このようなモデルは、黒色腫について存在し、そして黒色腫ワクチンの有効性の原型を作るのに広範に使用される。Ｂ１６黒色腫モデルは、ｐ１５ｅ、チロシナーゼ（ｔｒｙｏｓｉｎａｓｅ）およびｇｐ１００を発現し、そして腫瘍成長の速度を減少または除去するために、ワクチン接種後の効果的なＣＴＬ応答を必要とする。ＣＴＬエピトープ融合ワクチンでワクチン接種された動物は、腫瘍で病原体接種され、そして効果的な免疫応答は、コントロールと比較しての腫瘍成長の速度または罹病率を減少させる。ＴＭＶコートまたはＴＭＶコート融合物によりキャプシドに包まれる免疫刺激ＲＮＡまたは全長遺伝子産物のいずれかが有効な場合、腫瘍成長の速度は、タンパク質ワクチンのみと比較して減少し、または全体の罹病率が、減少する。これらの発見は、細胞応答データおよび体液応答データを裏付け、これらの応答は、腫瘍を減少または除くのに必要不可欠であると考えられる。
【０１６１】
乳頭腫ウイルス適用について上に記載されるように、機能的なキャプシドで包まれたＲＮＡは、ＴＭＶのアセンブリ起点を含む操作されたアルファウイルスのように自己複製し、またはＩＲＥＳを含み、ＴＭＶ ＲＮＡの内部部位から翻訳を刺激し得る（例として、図２２を参照のこと）。上にまた記載されるように、エピトープ融合物の組み合わせは、分子結合体方法または化学結合体方法のいずれかにより作製され得、そしてペプチドに限定される必要がない。ＤＮＡ配列および全てのタンパク質はまた、再集合されるＴＭＶまたはＮ末端システインをまたコードするＴＭＶコート融合物に追加され得る。
【０１６２】
（実施例１４ ＴＭＶコートタンパク質融合物の免疫原性）
（Ｖ５コート融合物およびＭｙｃ Ｕ１コート融合物への免疫原性：抗体エピトープへの応答）
コート融合ペプチドが適切な免疫を刺激し得ることを確かめるために、本発明者らは、マウスにおけるワクチンとして、公知の抗体結合特性を有する、ｍｙｃペプチド融合物およびＶ５ Ｕ１ペプチド融合物を試験し、次いで、抗ｍｙｃ抗体応答および抗Ｖ５抗体応答を探した。Ｖ５コート融合物およびｍｙｃ ＴＭＶ Ｕ１コート融合物が、目的の融合物の回収の為に最適化された抽出法により調製された。材料を、ＢＣＡタンパク質アッセイにより定量化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりペプチドの完全性についてそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度について評価した。次いで、１０μｇのＴＭＶタンパク質が、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに、２週間毎に３回注入される。第２のワクチン接種の後および第３のワクチン接種の後に、動物が、採血され、そして血清が、集められ、ＥＬＩＳＡによりペプチド特異的反応性について分析された。第３のワクチン接種の後の血清滴定の結果を、図２３に示し、これは２回のワクチン接種の後に観察されるレベルから高められる。
【０１６３】
この研究からの結果は、３つ全ての位置、Ｖ５およびｍｙｃペプチド融合物、ＴＭＶ Ｕ１コートが、アジュバントが与えられない場合でさえ、適切な抗ペプチド抗体応答を誘導し得ることを指示する。個々のマウスにおける変化した応答レベルは、サブユニットワクチンの代表的なものであり、そして他の抗原ワクチンについて観察された。全体にわたって、試験される各々のワクチン接種群における平均的応答は、最大応答レベルが各々の群において有意に異なった場合でさえ、ペプチド融合物の位置により有意には異ならなかった。興味深いことに、ＴＭＶキャリアへの応答は、一般に大きさにおいて抗ペプチド応答よりもより低かった（データは示さず）。注目すべきことに、これらのワクチンは、アジュバントなしで投与され、各々の群における高いレベルの応答が、ウイルスキャリアが抗原特異的である体液免疫刺激を提供し得ることを示す。
【０１６４】
（ＯｖａペプチドＵ１コート融合物についてのＣＴＬ応答アッセイ開発）
ワクチン接種したマウスにおける適切な体液応答を刺激する抗体−標的ペプチドの能力を試験することに加えて、本発明者らはまた、トリオボアルブミンタンパク質から得られるＣＴＬエピトープの能力を試験し、適切にＭＨＣ制限したマウスにおける細胞免疫を刺激した。２０μｇのＯｖａ−Ｎ融合物またはＯｖａ−Ｇ ＴＭＶ融合物を、マウスへアジュバントなしで２週間毎に４回投与し、次いで脾臓を、最後のワクチン接種の５日後にワクチン接種した動物から採取した。細胞を単離し、ゴルジ輸送インヒビターＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下で５時間の間、培地または培地プラスｏｖａペプチドで培養し、次いで細胞を、細胞内サイトカインＩＦＮガンマまたはＴＮＦアルファのＰＥ染色と共に、ＣＤ４ Ｔ細胞レセプターまたはＣＤ８ Ｔ細胞レセプターの表面発現に対してＦＩＴＣ結合した抗体で蛍光染色した。ｏｖａペプチドでの刺激が、ペプチドに特異的であるＴ細胞におけるこれらのサイトカインをアップレギュレートし、これは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞数における増加により測定される。５×１０５の事象が集められ、その約２０％は、Ｔ細胞である。
【０１６５】
ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方を、ＩＦＮγ（ガンマ）およびＴＮＦα（アルファ）の増加した細胞内発現についてモニタリングした。図２４に示されるとおり、５時間のペプチド刺激後、ＣＤ４陽細胞（ゲートで制御される事象の０．０８％〜０．１７％または１０〜２２細胞）、およびＣＤ８陽細胞（ゲートで制御される事象の０．０８％〜０．１３％または１１〜１７細胞；データは示さず）において、細胞内ＩＦＮガンマレベルが上昇し、これは、統計学的に有意な増加を表す。ＴＮＦアルファレベルは、ＣＤ４＋細胞において有意に上昇したが（０．０８％〜０．１３％）、ＣＤ８＋細胞において変化しなかった（０．１２％〜０．１０％；データは示さず）。
【０１６６】
アジュバントがワクチンと共に投与されなかったことを考慮すると、サイトカインレベルにおけるこれらの中程度の増加は、ワクチンが適切な細胞応答を刺激していることを示唆する。ワクチンと一緒でのアジュバントの投与、またはＴＭＶワクチンに対する免疫刺激ペプチドの融合は、活性化Ｔ細胞のパーセンテージを増加すると予期される。例えば、Ｔ細胞活性化アジュバント、一本鎖ＣｐＧ ＤＮＡオリゴ１７５８は、ｏｖａ系または他のＣＴＬ系における細胞応答を特異的に増大する。本発明者らの系について、ヌクレオチドが、ワクチンと混合され、またはＴＭＶ Ｕ１と直接融合される。他の系において、ＩＬ１ｂペプチドが、抗体応答およびＣＴＬ応答の両方を高めることが示されたが、これはＩＬ１ｂペプチドが、多価ワクチンにおいてのように、ｏｖａペプチドワクチンに物理的に結合する場合のみである。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、化学的融合を通じた多価ワクチンの生成のための標準的な方法を概略する流れ図である。
【図２】図２は、翻訳可能なＲＮＡ種を足場として使用することを通じて二機能性であり得る、化学的融合を通じた多価ＴＭＶベースのワクチンを生成するための方法を概略する流れ図である。
【図３】図３は、遺伝子融合を通じた多価ワクチンの生成のための標準的な方法を概略する流れ図である。
【図４】図４は、翻訳可能なＲＮＡ種を足場として使用することを通じて二機能性であり得る、遺伝子融合を通じた多価ＴＭＶベースのワクチンを生成するための方法を概略する流れ図である。
【図５】図５は、ＴＭＶビリオンジアセンブリおよびインビトロビリオン再アセンブリの提供であり、左から右に向かって：単一ＴＭＶビリオンの電子顕微鏡図；個々のＴＭＶコートタンパク質の空白詰めモデル（表面に曝されたＮ末端ドメイン（Ｎ）およびＣ末端ドメイン（Ｃ）ならびに表面に曝されたループ（ＳＬ）を略図配置した）；２０Ｓディスクサブユニットの空間詰めモデル；およびＲＮＡを取り囲む再構築されたＶＬＰ。
【図６】図６は、改変されたＴＭＶ ２０Ｓサブユニットに対する種々の生物学的機能の異種ペプチドのインビトロ結合体または分子融合体および生体活性ＲＮＡを取り囲む異種ポリマー（複数ペプチドディスプレイ）ＶＬＰの再構築の概略である。
【図７】図７は、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質における異なる挿入部位でのＴＭＶ−ＨＡペプチド融合体の発現レベルを示す。Ｎ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（種蒔き後２１日）に、中程度に研磨されたキャプシド形成ＲＮＡを摂取し、そして約２００μｇの組織を、感染の９〜１０日後に収集した。サンプルを、３００μｌの酢酸緩衝液（ｐＨ ５）中に挽き、そして不溶性物質を遠心分離によりペレット化した。１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で１００μｇの組織を粉砕することによって総植物タンパク質を収集した。可溶性の上清を除去し、次いで、ペレットを、最終ｐＨ抽出（ｐＨ ７）のために、２００μｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）中に再懸濁した。次いで、１０μｌの各サンプルを１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー中で染色し、そして写真撮影の前に脱色した。ＨＡＮは、約１９ｋＤに、ｐＨ５不溶性ｐＨ７可溶性コート融合体として蓄積する（矢印）。ＨＡループは発現されるが、不溶性である（総ＳＤＳ粉砕物中に存在するが、可溶性フラクション５〜７には存在しない）。ＨＡ ＧＰＡＴは、発現されｐＨ５で可溶性であるが切断され、そしてｐＨ７で部分的にのみ切断される。Ｈａ Ｃは発現されｐＨ５で不溶性でありｐＨ７で可溶性であり、微量の切断産物が見える。５：酢酸緩衝液（ｐＨ５）；７：Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）；Ｓ：ＳＤＳ ＰＡＧＥ緩衝液総組織粉砕物。
【図８】図８は、ｐｌ５ｅＴＭＶまたはｐｌ５ｅ ＤＥ ＴＭＶに感染した植物から、感染の兆候が明らかになった後、収集したＴＭＶタンパク質を示す。２０ｍｇの葉ディスク（ｌｅａｆ ｄｉｓｃ）を、酢酸緩衝液Ａ（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）／５ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、次に、不溶物質を、ｔｒｉｓ緩衝液Ｔ（５０ ｍＭ ＴＲＩＳ （ｐＨ ７． ５）／ １０ ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁し、そして物質を、総タンパク質分析のためにＳＤＳ ｐａｇｅ緩衝液Ｓ（７８ｍＭ ＴＲＩＳ（７．０）／１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム／０．０５％ ブロモフェニルブルー／６．２５％ グリセロール／１０％ β−メルカプトエタノール）中で処理した物質（全タンパク質についての分析）と比較した。次いで、物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクーマシー染色によって可視化した。コントロールは、Ｕ１（タバコモザイクウイルス株Ｕ１の野生型被膜タンパク質）である。Ｍ：タンパク質分子量標準物質。
【図９Ａ】図９Ａ（１）は、Ｎ末端システインＴＭＶ Ｕ１（配列番号１９）についての核酸組成およびアミノ酸組成を示す。あるいは、システインは、他のトバモウイルス被膜内および被膜タンパク質内の他の位置（６０ｓループ、Ｃ末端、読み過し位置）に組み込まれ得る。図９Ａ（２）は、Ｎ末端リジンＴＭＶ Ｕ１（配列番号２０）についての組成である。あるいは、リジンは、他のトバモウイルス被膜内および被膜タンパク質内の他の位置（６０ｓループ、Ｃ末端、読み過し位置）に組み込まれ得る。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴＭＶ被膜タンパク質を含むシステインへの、グルタルアルデヒドによる化学的結合を示す。１．０ｍｇのペプチドを、１．０ｍｇのＣｙｓｔ−Ｎ ＴＭＶ（Ｃ−Ｎ）と混合し（体積１ｍｌ中）、そして２０μｌサンプルを、Ｔ＝０で取り出した。このサンプルを、２０μｌの水および４０μｌの２×ＰＡＧＥ緩衝液に加え、そして直ちに煮沸した。（Ｔ＝０における水は、その濃度をグルタルアルデヒドを加えたＴ＝４の濃度と等しくする。）グルタルアルデヒドを、反応物に終濃度が１％になるように加えた（終量２ｍｌ）。反応物を、連続的に回転させながら、４時間室温で処理した。４時間後、サンプルを、Ｔ＝４時点について取り出し、同量の２×ＰＡＧＥ緩衝液を加えて、直ちに煮沸した。各時点についての８μｌ（２μｇペプチドおよび２μｇキャリア）を、ニトロセルロースへのウェスタントランスファーのためにゲル状にロードし、そして各時点についての１６μｌ（４μｇペプチドおよび４μｇキャリア）を、クーマシー染色のためにゲル状にロードした。
【図１０】図１０は、ＴＭＶ野生型およびｍｙｃまたはＶ５ Ｎ末端の融合ウイルスの遷移電子ミクログラフ（ＴＥＭ）画像である。ＴＭＶ、ＴＭＶ−ｍｙｃ−ＮまたはＴＭＶ−Ｖ５−Ｎを、４００−メッシュの、炭素コートした銅グリッド状に、２０〜８０μｇ／ｍｌでコートした。サンプルを、次いで、１％ リンタングステン酸でネガティブ染色し、そしてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ＴＥＭを３７，０００×倍率で使用して可視化するまで、室温で保存した。バーは、１３０ｎｍを表す。
【図１１】図１１（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１ウイルスの感染植物材料からの精製についての流れ図を示す。図１１（Ｂ）は、感染Ｎ ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９植物からのＴＭＶ Ｕ１の単離についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０−２０％ ｔｒｉｓ−グリシンゲル）である。ウイルスの大部分はＳ１上清に分配されたため、Ｓ２上清は処理しなかった。ＧＪは、グリーンジュース；Ｓ１は、上清Ｓ１； Ｓ１ ＰＥＧ１は、第１ＰＥＧ沈殿からのウイルスの懸濁物；Ｓ１ ＰＥＧ２は、第２ＰＥＧ沈殿からのウイルスの懸濁物である。
【図１２】図１２は、システインＮ被膜タンパク質融合体についてのＳ１処理流れとＳ２処理流れとの間に分配されるウイルスに対する、塩の効果を表すＳＤＳゲル（１０−２０％ ｔｒｉｓ−グリシンゲル）を示す。ＧＪは、最初のグリーンジュース；Ｓ１は、Ｓ１処理流れ；Ｓ２は、Ｓ２処理流れである。
【図１３】図１３は、ＴＭＶウイルスのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下における沈殿についての流れ図を示す。
【図１４】図１４は、ＴＭＶウイルスからの遊離の被膜タンパク質の産生についての流れ図を示す。
【図１５】図１５（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１被膜タンパク質（ｐＨ８．０）についての紫外線吸収スペクトルを示す。図１５（Ｂ）および図１５（Ｃ）は、Ｍｙｃ Ｎ被膜タンパク質をＤＥＡＥセファロースで処理して夾雑する残留ＲＮＡを除去し、ＤＥＡＥ樹脂処理前（Ｂ）と処理後（Ｃ）で紫外線吸収スペクトルを比較したもの。図１５（Ｄ）は、Ｍｙｃ Ｎ被膜タンパク質をＤＥＡＥセファロースで処理して夾雑する残留ＲＮＡを除去し、夾雑ＲＮＡを追跡するために行ったアガロースゲル電気泳動である。初期被膜（Ｌ）のＤＥＡＥ樹脂への結合後、被膜タンパク質を５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し（Ｅ５０）、ＲＮＡ非含有調製物を得た。樹脂からＲＮＡを溶出するために、５００ｍＭのＮａＣｌが必要だった（Ｅ５００）。ＦＴは、樹脂フロースルー液を表す。
【図１６】図１６（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１被膜タンパク質のクロマトグラム（室温でのインキュベーションの前および後に、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した）における変化を示す。図１６（Ａ）は、４℃で保存した被膜タンパク質のクロマトグラムプロフィールである。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００カラム（５μｍビーズ；穴のサイズ ３０ｎｍ）を使用し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。使用した緩衝液は、０．１Ｍリン酸緩衝液（４℃または室温（注入されたサンプルの温度に基づく）でｐＨ ７．０）であった。図１６（Ｂ）は、室温で１６時間の保存後の被膜タンパク質のクロマトグラムプロフィールである。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００カラム（５μｍビーズ；穴のサイズ ３０ｎｍ）を使用し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。使用した緩衝液は、０．１Ｍホスフェート（４℃または室温（注入されたサンプルの温度に基づく）でｐＨ ７．０）であった。
【図１７】図１７（Ａ）は、ウイルスＲＮＡおよびＵ１被膜タンパク質からのビリオン再構築（その後、３１０ｎｍでの溶液の濁りが増す）の動態学を示す。これは、平均ロッド長にほぼ比例する。その開始ＲＮＡと同モル濃度のＴＭＶウイルスを使用し、インビトロキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）における完全な再構築の吸光度を示した。（１）標準ＩＶＥ条件；０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）。（２） ＲＮａｓｉｎ（０．４Ｕ／μｌ）含有０．１Ｍホスフェート（ｐＨ ７．２）。（３）０．１ Ｍピロリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）。図１７（Ｂ）は、ＲＮＡ完全性を評価するための、最終アセンブリ反応物のアガロースゲル電気泳動である。ＲＮＡコントロールは、被膜タンパク質欠損ＲＮＡである；ＰＯ４は、リン酸緩衝化再アセンブリ反応物である；Ｐｙｒｏ ＰＯ４は、ピロリン酸緩衝化再アセンブリ反応物である；Ｐ０４ ＲＮａｓｉｎは、ＲＮａｓｉｎ含有リン酸緩衝化再アセンブリ反応物である。
【図１８】図１８（Ａ）は、ＲＮａｓｉｎ存在下および非存在下でのＥＬＤＫＷＡＳ被膜タンパク質融合による再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを、示す。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、再アセンブリ反応物中のＲＮＡと同モル濃度で存在する。図１８（Ｂ）は、開始５時間後の再アセンブリ反応物のアガロースゲル電気泳動である。再アセンブリ反応を、ＲＮａｓｉｎの存在下（＋）または非存在下（−）で行い、使用した被膜タンパク質を示した。再アセンブリ反応物中の濃度と同濃度で、ＲＮＡ単独をコントロールとして泳動した。
【図１９】図１９は、遷移電子検鏡（ＴＥＭ）で可視化した再アセンブリ反応の画像およびデータ分析を示す。サンプルを、１％リンタングステン酸でネガティブ染色し、乾燥させ、そしてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ＴＥＭを３７，０００×倍率で使用して可視化するまで、室温で保存した。（Ａ）被膜タンパク質コントロールサンプル（ＲＮＡ非存在）。（Ｂ）（Ａ）と同じ被膜タンパク質濃度で、ＴＭＶ ＲＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）存在下での再アセンブリ反応。画像は、ＲＮａｓｉｎ存在下で行った再アセンブリ反応についてのものである。スケールバーは２００ｎｍを表す。（Ｃ） ＥＬＤＫＷＡＳ被膜タンパク質融合体を用い、ＲＮａｓｉｎ存在下および非存在下で行った再アセンブリ反応についての基準化粒子サイズ分布の比較。ｎは、電子検鏡画像で係数したロッドの数を示す。
【図２０】図２０（Ａ）は、ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２タンパク質融合体を用い、全てＲＮａｓｉｎ存在下で行った分離再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを示す。野生型ＴＭＶを、足場として使用した。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、ＲＮＡと同じモル濃度で再アセンブリ反応物中に存在した。ＲＮＡ単独のコントロールもまた示すが、被膜タンパク質単独ならびにＨＰＶ ｅｐ２ウイルスおよびＭｙｃウイルスのコントロールは、明瞭さのために省略する。図２０（Ｂ）は、ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２被膜タンパク質融合体（対の組み合わせで用いる）を用いた二価再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを示す。全ての再アセンブリ反応は、ＲＮａｓｉｎ存在下で行い、野生型ＴＭＶＲＮＡを足場として使用した。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、ＲＮＡと同じモル濃度で再アセンブリ反応物中に存在した。ＲＮＡ単独のコントロールもまた示すが、被膜タンパク質単独ならびにＨＰＶ ｅｐ２ウイルスおよびＭｙｃウイルスのコントロールは、明瞭さのために省略する。
【図２１】図２１は、ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを示す。（Ａ）精製ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのスペクトルを示すＭＡＬＤＩ ＴＯＦ追跡。Ｍｅｔで切断されたタンパク質についての推定の配列重量は、１９３２０ Ｄａであり、観察された分子量と完全に一致する。（Ｂ）ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、タンパク質の純度が最終ウイルス調製物９７％以上であることを示す。
【図２２】図２２は、多価ＴＭＶベースのワクチンの再アセンブリの足場として使用され得、そのコードする遺伝子に起因して再構築ビリオンに二官能性を与える種々のＲＮＡ構築物を示す。（Ａ） 構造遺伝子または非構造遺伝子を含むＴＭＶ ＲＮＡ。（Ｂ）ＩＲＥＳ構造遺伝子またはＩＲＥＳ非構造遺伝子を含むＴＭＶ ＲＮＡ。（Ｃ）ＴＭＶ ＯＡＳおよび構造遺伝子または非構造遺伝子を含むαウイルスレプリコン。（Ｄ）構造遺伝子、非構造遺伝子または免疫調節遺伝子を有するＴＭＶ ＯＡＳおよびＯｍｅｇａを含むキメラｍＲＮＡ。（Ｅ） 構造遺伝子、非構造遺伝子または免疫調節遺伝子を有するＴＭＶ ＯＡＳを含むキメラｍＲＮＡ。例示の目的で、この図はＲＮＡ構築物中にＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子またはＣＲＰＶ Ｅ７遺伝子を示す。しかし、黒色腫関連遺伝子（例えば、ｐｌ５ｅ、ＧＰ１００または任意の他の構造遺伝子もしくは非構造遺伝子が、これらのＣＲＰＶ関連遺伝子と置き換わり得る。
【図２３】図２３は、ＴＭＶ被膜融合ワクチンに対する体液応答を、ペプチドに対するＥＬＩＳＡで測定して示す。血清を、ワクチン３後（ｐＶ３）１０日目に収集し、ｃ−ｍｙｃ−ＢＳＡ結合体または外来抗原（ＦＮＲ）Ｖ５融合体でコートしたＥＬＩＳＡプレート上で連続希釈した。プレートを、次いで抗マウスＨＲＰで反応させ、陽性を比色定量基質を使用して可視化し、そして統計学的ソフトウェアを使用して定量した。市販の陽性コントロールを、基準物質として用いた。
【図２４】図２４は、ＴＭＶ ｏｖａ Ｇワクチン接種に対する細胞性応答を、蛍光支持セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定して示す。ＴＭＶ ｏｖａ Ｇワクチン接種された動物から脾臓を収集し、そして次いで、１μｇ／ｍｌのｏｖａペプチドと共にブレフェルディンＡ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）存在下で５時間培養した。次いで細胞を固定し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体または抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、次いで再固定し、そして透過処理した。細胞を、次いで抗ＩＦＮ−ＰＥまたは抗ＴＮＦ−ＰＥと共にインキュベートし、次いでＰＥ染色およびＦＩＴＣ染色について、フローサイトメトリを使用して可視化した。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府の支持により、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって与えられた共同協定番号７０ＮＡＮＢ２Ｈ３０４８の元でなされた。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、１つ以上のサブユニットから構成される、再アセンブリされたウイルスを含む、新規なワクチンプラットフォームに関し、各サブユニットは、遺伝融合またはインビトロ結合体化によって付加された、異なるペプチド部分または核酸部分を含み、その結果、各サブユニットは、標的治療剤を組み込む。本発明は、さらに、ＲＮＡ分子を、真核生物細胞中での送達および発現のためにインビトロでアセンブルするための方法に関する。特に、本発明は、真核生物細胞における送達および発現のために、ＲＮＡ分子をパッケージングするために必要な、タンパク質、分子、および核酸配列を提供する。本発明のパッケージされたＲＮＡ分子は、広範な真核生物細胞への送達が可能である。パッケージされたＲＮＡ分子はまた、特定の真核生物細胞に標的化され得る。本発明は、さらに、上記再アセンブリされたウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＲＮＡワクチンが、このウイルスまたはＶＬＰ構造へのペプチド融合物と、ＲＮＡのコードされたタンパク質との相乗作用によって、細胞免疫もしくは体液免疫のいずれか、または両方を同時に誘導するために使用される、送達プラットフォームを包含する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
現在まで、ほとんどの従来のワクチンは、生存し弱毒化されたか、または不活性化された、病原体調製物全体を含んだ。これらの種類のワクチンの作製は、長期間の集中的な基礎研究および開発に対する必要性によって、制限されている。生存し弱毒化されたかまたは不活性化されたワクチンのための、信頼性のある製造技術および大規模化技術は、急に開発することがほとんど不可能である。従って、安全であり、強力であり、かつ広範に有用な、予期されない感染症の脅威に対するワクチンの製造に適切な技術の開発に対する必要性が存在する。植物ウイルス病原体キメラから開発されるワクチンは、多数の既知または出現する疾患の脅威を予防または処置するために使用され得るワクチンを、素早く生成する方法を提供し得る。
【０００４】
病原体および腫瘍細胞に対する免疫応答を制御することは、数十年間の間、免疫学、細胞生物学、および薬学的開発の焦点であった。免疫細胞の複雑さならびに病原体チャレンジに応答するサイトカイン発現のパターンおよび効果、ならびにワクチン投与について、多くのことが知られている。この研究の１つの主要な局面は、免疫応答の２つの主要な部門（主として細胞性であるＴｈ１応答、および優勢に体液性であるＴｈ２応答）の同定であった。これらの２つの型の免疫応答は、外来の抗原が免疫系にどのように提示されるか、発現細胞によってどのサイトカインが発現されるか、およびどの型の免疫細胞が活性化されるかに応じて、開始される。Ｔｈ１応答は、細胞傷害性免疫細胞機能、およびＴｈ２応答において観察されるものとは異なるサブタイプの中和抗体の産生を生じる。一方で、いくつかの病原体は、Ｔｈ２応答に感受性であり得、Ｔｈ１応答は、病原体と腫瘍細胞との両方に対する効果的な応答を開始するために重要である。しかし、病原体と腫瘍細胞との両方が、免疫監視を回避し、Ｔｈ１免疫に必須である機構を迂回するためのストラテジーを発達させた。
【０００５】
ワクチン開発における主要な目的は、宿主へのワクチン投与の際に、Ｔｈ２体液応答に加えて、Ｔｈ１型の免疫を方向付けることである。弱毒化ウシポックスウイルスを使用することによって、Ｊｅｎｎｅｒは、気づかずに、Ｔｈ１経路の強力な活性化を利用して、天然痘感染を予防した。彼の時代以来、ほとんどの病原体ワクチンは、殺傷または弱毒化され、このことは、一般に、病原体の罹病率およびウイルスの拡散の制御の、良好な成功を示した。しかし、最近のワクチン開発の２つの局面が、生ウイルスワクチンまたは弱毒化ウイルスワクチンに対する増殖の問題をもたらした。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するための、弱毒化ウイルスまたは殺傷されたウイルスの使用は、いくつかの理由により、実用的ではない。職業上の安全性の問題、弱毒化ウイルスの低い収量、およびウイルスの変異または漏出の脅威が、ワクチン開発と公共の受容との両方に対する、重大な欠点である。他の場合において、麻疹ウイルスおよびＲＳウイルス（ＲＳＶ）において観察されるように、予測不可能かつ重大な有害な事象が、ウイルス免疫全体に付随する。従って、多くの研究は、防御免疫に応答して宿主免疫によって一般的に標的化される、病原体のタンパク質またはペプチドからなる、「サブユニット」ワクチンに焦点を当てた（Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第３版、１９９９，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ）。不運なことに、タンパク質サブユニットワクチンは、単独では強力なＴｈ１応答をしばしばは惹起せず、そしてＤＮＡサブユニットワクチンは、しばしば、抗体を惹起しない。ほとんどの場合において、抗体とＣＴＬ応答との両方が、病因または疾患の進行の制御において、必要である。
【０００６】
２つの新たな型のワクチンが、現在のサブユニットワクチンの欠点を克服するために、作製された。非病原性ウイルスが、病原体の免疫原性サブユニットタンパク質をコードするように、遺伝的に改変され、これによって、ウイルス抗原提示に対して、Ｔｈ１免疫応答を利用する。強力なＴｈ１型免疫応答が、アデノウイルス、ワクシニア、鶏痘およびアルファウイルスの送達系を使用して、多くの病原体および自己抗原に対して実証された（ＷａｌｔｈｅｒおよびＳｔｅｉｎ．２０００ Ｄｒｕｇｓ ６０，２４９）。しかし、これらの「第一世代」のウイルス送達系は、ベクター免疫原性に起因する問題に遭遇し、これは、ブースター免疫におけるこれらの引き続く使用を予測した。ウイルスプライミングに続いてタンパク質またはＤＮＡによるブースティングのいずれかは、成功したが、このアプローチは、単一のワクチンに対して少なくとも２つの薬剤の製造を必要とする。これらのワクチンのための、ＤＮＡおよび／またはタンパク質の大規模な製造は、技術的問題と財政上の問題との両方に遭遇している。
【０００７】
第二のストラテジーは、ウイルスコートタンパク質の、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己アセンブリを利用し、これは、単独で、強力なＴｈ１抗原応答を刺激する（ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＬｏｗｙ．２００１ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１，５７１）。アレイ状のウイルスコートからアセンブリされるＶＬＰは、中和抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の両方を刺激する際に有効であることが示された。ウイルスコートタンパク質はまた、外部の溶媒に曝露された残基への融合（通常、遺伝融合による）を介する、抗原の効果的なキャリアである（Ｐｏｇｕｅら、２００２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏ Ｐａｔｈ ４０，３；Ｄａ Ｓｉｌｖａ．１９９９ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １，８２）。有望であるが、ＶＬＰ技術もまた、欠点を有する。製造がまた制限され、そしてしばしば、コートへの異種抗原の融合が、ＶＬＰの収量、溶解度を低下させ、または自己アセンブリを防止する。さらに、免疫クリアランス（ウイルスブースティング全体を制限する同じ機構）もまた、ＶＬＰの使用を制限する。明らかに、ワクチン送達のためのウイルス全体およびＶＬＰ技術の両方の制限を克服する、費用効果的なウイルスコート抗原送達系に対する必要性が存在する。この系の特性は、ウイルス様抗原提示を免疫系に、病原性なしに提示することを介して、Ｔｈ１応答をブースティングすること、抗原が融合するＶＬＰ骨格を回転させる可撓性、免疫原性の発生および制御、高い収率および低い費用の、全ての利点を含む。
【０００８】
本出願人および他の人は、植物ウイルス由来のコートタンパク質が、哺乳動物ウイルスコートの全ての免疫学的提示特性を有するが、病原性がないことを示した。多数のポジティブ（＋）鎖ＲＮＡ植物ウイルス（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ科の型メンバー）を含む）が、インビトロでクローニングされ、そして操作されて、植物において異種遺伝子産物を発現し、そしてそのビリオン表面において、生物学的に重要なペプチドを提示した。ＴＭＶビリオンの独特の特性は、それらが解離してモノマーを形成し、そしてＲＮＡ足場を使用して、ＶＬＰに自己アセンブリする能力である。外来エピトープを提示するように操作された植物コートタンパク質（ＴＭＶを含む）は、自己抗原（Ｓａｖｅｌｙｅｖａ Ｎ ２００１ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９ ７６０）と種々の病原体（Ｐｏｇｕｅら、２００２ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏ Ｐａｔｈ ４０，３）との両方に対する機能的免疫を促進することが示された。
【０００９】
ウイルスゲノムＲＮＡ分子の、感染性粒子へのキャプシド化のために必須のものは、アセンブリ起点（ＯＡＳ）と称される配列エレメントの存在である。ＴＭＶ ＯＡＳは、ウイルスゲノムの３’末端から約１Ｋｂに位置し、そして３つのヘアピンステム−ループ構造を形成すると予測される、４４０のヌクレオチド配列からなる（ＴｕｒｎｅｒおよびＢｕｔｌｅｒ，１９８６）。ウイルスコートタンパク質ディスクは、最初、ウイルスアセンブリの間、ループ１に結合する。成熟アセンブリ起点転写体を使用するインビトロでのパッケージングアッセイは、ループ１を必須に含み、そして外来ＲＮＡ配列またはウイルスＲＮＡ配列のキャプシド化のために十分な、７５ヌクレオチドを規定した（Ｔｕｒｎｅｒら，１９８８）。インビトロでの再構築の研究は、感染した植物細胞由来のビリオン由来から得られた精製されたコートタンパク質がの調製、ＴＭＶ ＲＮＡとｐＨ７．０で螺旋構造にアセンブルされ得、ＲＮＡを含むＴＭＶ様ウイルス粒子のアセンブリを生じることを示した（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷｉｌｌｉａｍｓ，１９５５）。さらに、ＯＡＳ配列を含み、ＳＰ６またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写された外来キメラＲＮＡ分子は、インビトロで偽ウイルス粒子にアセンブルされ得ることを示した（Ｓｌｅａｔら、１９８６）。
【００１０】
キャプシド化を受けやすいウイルスコートタンパク質のクローニングおよび配列決定は、これらの遺伝子の、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、細菌発現ベクターへの挿入をもたらした（Ｓｈｉｒｅら、１９９０）。しかし、組み換えＥ．ｃｏｌｉウイルスコートタンパク質とのインビトロでのアセンブリは、植物において産生されるネイティブのコートタンパク質と比較して、減少した再構築率を生じる（Ｓｈｉｒｅら、１９９０）。米国特許第５，４４３，９６９号は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの欠損を、ＴＭＶ−ＯＡＳを含むＲＮＡ配列を、インビトロではなくインビトロで、Ｅ．ｃｏｌｉにパッケージングすることによって、克服することを試みる。しかし、このキャプシドで包まれたウイルスベクターを、植物以外の宿主に導入することは、問題である。ＴＭＶコートタンパク質の、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアセチル化の欠乏は、キャップされないＲＮＡの、効率の低いキャプシド化を生じる。これらのＲＮＡは、キャップ構造の欠乏に起因して、真核生物細胞において、乏しく翻訳される。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えＴＭＶ産物の収量は、非常に乏しく、そして商業的に実施可能ではない。
【００１１】
治療の目的で、既存の異常性を補正すること、または新たな機能を有する細胞を提供することのいずれかによる、遺伝物質の細胞内送達のプロセスは、遺伝子療法（ＤｒｅｗおよびＭａｒｔｉｎ，１９９９）およびＤＮＡ免疫の基礎である。実際的にいえば、核酸免疫技術は、新たな病原体に対する魅力的な前線防御を提示する：おそらく、迅速に応答するサブユニットワクチンのストラテジーにおける前線に匹敵し得る他の系は、存在しない。しかし、従来のＤＮＡワクチンは、多数の重大な欠点に悩まされ、このことは、この技術単独に対する信頼を分別のないものにする。最も重大なことには、効果的な免疫応答を刺激するために必要とされるＤＮＡの用量が非常に高く、大規模な免疫のために十分な量の製造が問題となることを暗に示す。ＤＮＡワクチンおよびＲＮＡワクチンは、一般に、良好なＴｈ１型細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進し得、このことは、非細胞障害性病原体の排除のために必須である。しかし、いくつか例外があるが、ＤＮＡワクチンによって誘導される抗体応答は、乏しい。従って、核酸ワクチンは、産生が非常に迅速であり得るという予測からは魅力的であるが、理想的には、最初のＤＮＡワクチン接種またはＲＮＡワクチン接種には、好ましくはタンパク質でのブースターワクチン接種が続き、効率的な抗体産生、および病原体チャレンジに対するより完全な保護を誘導するべきである。本発明は、新規かつ可撓性のあるワクチン送達プラットフォームを導入することによって、上記で生じた問題に取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、現在のＶＬＰ技術の制限に取り組むが、首尾よいＶＬＰ抗原足場のポジティブな特性の全てを保持する、いくつかの独特の解決法を含む。本出願人は、ＶＬＰワクチンを、適合可能な、予測可能な、安定な、そして規模の調節が可能な様式で作製するための方法を提供する。この研究は、非常に革新的であり、そして開発が継続中である。この方法は、多価ワクチンを作製する工程を包含し、ここで、異なるワクチンタンパク質部分が、単一のＶＬＰ構造の表面に融合され、多機能効果（免疫ペプチド（保護免疫を刺激するタンパク質エレメント）および宿主免疫応答を調節するか、または免疫細胞の効率的な認識もしくはプロセシングを容易にするかのいずれかのペプチドのアベイラビリティ）を与える。提唱されるワクチンはまた、二機能性であり、ここで、ＶＬＰのタンパク質エレメントは、ペプチド融合または一連の融合ありまたはなしで、改変されたＲＮＡ部分をキャプシドで包む。改変されたＲＮＡは、目的のｍＲＮＡを運び得、次いで、その保護されたＲＮＡは、核酸内容物を、タンパク質と一緒に、そのワクチンを取り込む免疫細胞に運ぶために使用され得る。ＲＮＡ構築物は、相乗的に働いて、インタクトな病原体または癌抗原（宿主の免疫応答を刺激するタンパク質、またはワクチンに対するＴｈ１型もしくはＴｈ２型の免疫応答のいずれかを調節するタンパク質）のいずれかをコードすることによって、強力な、持続性の免疫応答を生じる。この方法は、強力な産生可能性、改善された細胞取り込み、およびマルチエピトープ価を有することによって、他のＶＬＰに付随する問題を軽減する。構造的に類似であるが免疫学的には異なるＶＬＰキャリアを選択することによって、他のＶＬＰシステムにおいては働かないことが示されたプライム−ブーストストラテジーのために、コート骨格の回転を可能にする。
【００１３】
二機能性ＲＮＡによるワクチン接種が、いくつかの異なる利点を有するＤＮＡワクチン接種の代替法である。第１の例において、ＲＮＡベースのワクチンは、ゲノムに組み込まれもし得ないしゲノムを変形（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）させ得ないため、腫瘍形成を引き起こし得ることがほとんど考慮されない。第２に、安全な自己増幅ワクチンベクターとしてＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）由来のＲＮＡワクチンが送達され得る良好な証拠が存在する。アルファウイルスレプリコンは細胞に対して細胞溶解性であり、従って、ＲＮＡワクチンの複製は、本来一時的であり、自己排除される。アルファウイルスレコート「レプリコン」ワクチンは、産生される抗原量の増加およびウイルスｄｓＲＮＡ複製中間体の細胞内蓄積により誘導される炎症性サイトカインの産生量の増加の両方を伴う、強力な免疫応答（抗体応答および細胞媒介応答の両方）を引き起こす。これらの特徴は、効果的な免疫応答の誘導に必要とされる複製ＲＮＡの用量が、ＤＮＡ免疫により必要とされる用量よりも低いオーダーであることを示す。しかし、裸のＲＮＡワクチンに不随する主要な欠点は、すでに知れ渡っている核酸の不安定な性質であり；これは、多量免疫のためのＲＮＡワクチンの増幅を大きく制限している。
【００１４】
アルファウイルスレプリコンワクチンは、現在、インビボで転写され、アルファウイルス様粒子（レプリコン粒子）中にパッケージングされた裸のＲＮＡとしてか、またはサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）により駆動される感染性ｃＤＮＡを含むプラスミドとして送達される。レプリコン粒子は、レプリコンＲＮＡを細胞中に送達するためのビヒクルとして非常に有効であるが、生成は複雑、不十分、かつ不安定である。従って、アルファウイルスベースのＲＮＡワクチンを分解から保護するための、効果的なパッケージングおよびＲＮＡ安定化技術が必要とされる。２つの信頼できる選択肢が存在する：（１）感染性ｃＤＮＡプラスミドとして組み換えアルファウイルス構築物を送達すること；（２）ヌクレアーゼから保護され、良好な安定性および保存特性を有するようにインビボで転写されたアルファウイルスＲＮＡをパッケージングすること。後者の選択肢のアプローチを以下に示す。
【００１５】
本発明者らは、ＶＬＰキャリアとして、十分に特徴付けられている植物ウイルスであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を用い、インビトロでＶＬＰ構造を種々の異種ＲＮＡ配列へと最構築するその独特の能力を利用する。
【００１６】
ＴＭＶコートの溶媒に曝された配列中にシステインを導入することにより、外来抗原エピトープをエキソビボで導入および融合し得る。インビトロ合成できないエピトープ配列は、遺伝的に、ＴＭＶコートタンパク質にインフレームに融合される。ＴＭＶ ＶＬＰは、インビトロ結合体由来であるかまたは遺伝子融合体から発現された、単一のエピトープ（一価）または異なるエピトープの集合（多価）で装飾されてインビトロで再構築される。
【００１７】
再構築の足場として、本発明は、ワクチン能を増強するタンパク質をコードするＲＮＡを用い、それによって、タンパク質および核酸の両方からの活性を駆動する二機能性抗原送達系を生成する。このＲＮＡはまた、翻訳を増強するためにアルファウイルスレプリコンを組み込み得る。アセンブリ源（ＯＡＳ）のループ１を含む７５ヌクレオチド配列の存在が、ＲＮＡ含有ＶＬＰを生成するためのＴＭＶコートタンパク質によるＲＮＡ分子のキャプシド形成に必須である。治療目的のタンパク質またはペプチドをコードする外来配列とこの７５ヌクレオチド配列を組み合わせることにより、ＲＮＡ分子は、ＴＭＶ様ＶＬＰの生成のための有効な足場として機能し得る。このＲＮＡは、そのワクチンに対する免疫応答の成功率を高め、病原に対する保護免疫もしくは治療免疫のいずれかの生成を補助し、または標的化された遺伝子の阻害のための阻害性ＲＮＡシグナル（ＲＮＡｉ）を送達する任意の数の免疫調節因子（例えば、ＩＬ４、ＩＬ１β、またはＩＦＮγ）をコードし得る。このＶＬＰストラテジーは、有効な標的免疫細胞に適用され、そしてＴｈ１型応答を刺激し得る。
【００１８】
Ｔｈ１型免疫応答を誘導するための重要な必要性は、プロセシングおよび抗原提示のためにＶＬＰを細胞中に移動させることである。既知の細胞を標的化するペプチドが同定されており（Ｓａｍｕｅｌ ０．，Ｓｈａｉ Ｙ．，２００１ Ｂｉｃｈｅｍ．４０，１３４０；Ｍａｇｎｕｓｓｏｎら，２００１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５ ７２８０；Ｂｕｓｈｋｉｎ−Ｈａｒａｖら，１９９８ ＦＥＢＳ Ｌ．４２４ ２４３）、そして直接的な細胞侵入試験によってインビトロで、かつ標的抗原に対する免疫応答のタイプおよび速度を試験することにより増強された抗原提示についてインビボで試験され得る。標的化融合ペプチドは、ＴＭＶの細胞取り込みを増強する能力、ならびにインビトロおよびインビボでキャプシド形成ＲＮＡを送達する能力について試験され得る。
【００１９】
向上したワクチン接種のための一般的な方法は、アジュバントまたはＴ細胞の補助を刺激するための特定のＴヘルパーペプチドを同時投与することである。ＣｐＧ ＤＮＡは、適切なワクチンと共に同時投与された場合にＴｈ１型免疫応答を向上させる、容易に投与されるアジュバントであることが示されている（Ｋｒｉｅｇ．２０００ Ｖａｃｃｉｎｅ １９，６１８）。ほ皮下に（ｓ．ｃ．）投与されるが、一本鎖チオール化ＤＮＡワクチンもまた、ＳＰＤＰ結合化学を通じてタンパク質キャリアに融合され得る。また、いくつかのユニバーサルＴヘルパーペプチドが同定されている（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ａ．Ｂ．，１９９５ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，１２６１；Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ，１９８９ Ｅｕ．Ｊ．Ｉｍｍ．１９，２２３７；Ｂｏｒａｓｃｈｉ，１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１６８，６７５；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇ．ら，１９９７ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９４ １０８３３）。病原体または自己抗原ペプチドまたはサブユニットワクチンと組み合わせたワクチン接種の後にＴｈ１型免疫を指向する免疫刺激ペプチド（通常はサイトカインフラグメント）もまた、同定されている（ＩＬ１β，Ｂｏｒａｓｃｈｉ，１９８８ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１６８，６７５）。ＴヘルパーまたはアジュバントペプチドまたはＣｐＧ ＤＮＡオリゴを含有するコート融合体は、同時に発現されるペプチドまたはキャプシド形成されたＲＮＡの免疫原性を増強するために使用される。
【００２０】
最後に、免疫系のどのアームがワクチン送達後に活性化されるかを決定する上で、サイトカインが重要な役割を果たしていることが十分に確立している。インターロイキン４（ＩＬ４）は、Ｔｈ２型免疫応答を指向するのに関連しており、そしてインターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、Ｔｈ１応答に対する重要な寄与因子である（ＳｐｅｌｌｂｅｒｇおよびＥｄｗａｒｄ．２００１ Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ３２，７６）。ＴＭＶ ＶＬＰへのキャプシド形成によりＩＬ４およびＩＦＮγのＲＮＡを細胞中に導入することにより、生成される免疫応答の型に影響を与えることが可能であり得る。本発明者らは、抗原に対する抗体アイソタイプ応答（Ｔｈ１型またはＴｈ２型の抗原提示を反映する）を試験し、かつ主に、Ｔｈ１型免疫の結果であるＣＴＬ応答を評価し得る。
【００２１】
細胞融合ペプチド、Ｔヘルプアジュバント、病原性抗原、腫瘍抗原、およびキャプシド形成サイトカインＲＮＡは、パピローマウイルスおよび黒色腫マウス疾患モデル由来の抗原と組み合わせて体系的に試験される。免疫原性モデルおよびチャレンジモデルは、単一ペプチドによるワクチン接種を超えるさらなる改善を確立し、かつＴｈ１またはＴｈ２免疫応答を生成するための最良のペプチド／ＲＮＡの組み合わせを規定する。
【００２２】
このような柔軟かつ効果的なワクチンプラットホームの利用可能性は、ヒトおよび家畜に対して非生存ワクチンを提供する（それによって、副作用を抑え効果を増大させる）機会を提供する。医学的実施の新たな展望（自己抵抗性を打破し弱い抗原に対する免疫応答を駆動するための適用を含む）は、開示されるワクチンプラットホームの相乗作用的かつ高い特異性の活性により開かれ得る。
【００２３】
本発明は、特定のウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））が複数のサブユニットに分解される方法に関する。各々のサブユニットは、遺伝的に融合されたペプチドを含むか、または予め決定されたエピトープ、ペプチドまたは、ヌクレオチドをそれに結合させるための結合反応に供される。複数のサブユニットは、この様式で処理されて複数のサブユニットグループを生成する（複数のウイルスワクチンのためのビルディングブロックを提供するために必要な多くのサブユニットグループについて、１つのサブユニットグループは予め決定されたペプチドに結合がそれに結合しており；別のサブユニットグループは第２のペプチドを有し；別のサブユニットは予め決定されたエピトープがそれに結合しており；そして別のサブユニットグループはヌクレオチドがそれに結合しているなど）。
【００２４】
代替のストラテジーは、内部リボソーム侵入を引き起こすことが公知の特定の配列を導入することによってこのような効果を開始するよう改変されたＴＭＶ ＲＮＡを用いることである。これらの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、哺乳動物細胞において多シストロン性ＲＮＡからの内部翻訳産生を引き起こすのに効果的である（Ｙａｎｇら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８９ ６３（４）：１６５１−６０）。全長遺伝子産物または免疫刺激性サイトカインあるいは他の種類の免疫調節タンパク質のいずれかをコードするＲＮＡとインフレームでＴＭＶゲノム中にＩＲＥＳを導入することで、そのタンパク質の翻訳が可能となる。これらのＩＲＥＳは非複製ＲＮＡに導入されるので、ＴＭＶおよびワクチン接種後に細胞に取り込まれる比例する転写物の量は、自己複製ＲＮＡ（例えば、アルファウイルスレプリコンによりコードされるもの）よりも低いと考えられるが、翻訳産物のレベルは、正確な応答を誘導するのに十分なはずである。
【００２５】
本発明は、予期せぬ病原への恐れに呼応して効果的なワクチン試薬を生成および供給するために米国を補助する技術的解決の研究および開発を含む。本出願人は、核酸ワクチンの生物防御適用を制限する問題；乏しい環境的安定性および高用量の必要性に特に取り組んでいる。これらの問題に取り組む上で、本発明者らは、ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスおよび核酸ワクチンを改善するための分子ツールセットを開発するためのバイオテクノロジーにおけるそれらの適用の分野において有している核心的知識を身に付けている。本出願人はまた、効果的な抗体応答を提供するタンパク質サブユニットワクチンを生成する能力を実証する。タンパク質サブユニットワクチンの生成は、本来、核酸ワクチンよりも遅く、そして実際、新規の病原体への恐れに遭遇した後の遅い期間にのみ利用可能である。しかし、本発明者らの非トランスジェニック植物ベースのワクチン発現プラットホーム（ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標））は、種々のタンパク質（ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（ワクチン接種した個人における抗体の強力な誘導因子として知られている）を迅速に発現する能力を有する。本出願人は、最近、タバコ植物において１６種の異なるヒト治療ワクチンを生成するための改変されたＴＭＶ発現ベクターを使用し、そしてフェーズＩ臨床試験（ＢＢ−ＩＮＤ＃９２８３）において優れた安全性を示した。他の競合する技術と異なり、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）は、特別な発酵設備を必要とせず、そしてワクチンタンパク質を生成するための植物タンパク質産生機構を持たせる植物ウイルスＴＭＶの効果的、迅速なタンパク質生成ストラテジーを使用する。代表的な収集時期、摂取後は２１日未満である。同じウイルスが大スケール製造へのパイロット試験から使用されるので、検証と製造スケールアップとの間にほとんど移行時間がないかまたは全く移行時間がない。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）技術を通じたワクチンの送達における遅れのほとんどは、植物の生長および抗原特異的精製プロトコルの確立の遅れである。この技術のこれらの局面は、植物由来ＶＬＰワクチンについての低い製造費を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（定義または略語）
本発明の理解を容易にするために、本明細書を全体を通じて使用される特定の用語を定義する：
「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を意味する。ＧＭ−ＣＳＦは、抗体産生機構を刺激することによって抗原の免疫原性を増加し得る。
【００２７】
「非ネイティブ」は、同じ種由来でも、同じ種から得られるものでないことを意味する。
【００２８】
「ネイティブ」は、同じ種に由来するか、または同じ種から得られることを意味する。
【００２９】
「ＩｇＧ」は、免疫グロブリンＧを意味する。
【００３０】
「遺伝子間配列」は、非コードＤＮＡ配列を意味し、ここで、ウイルスのオープンリーディングフレーム間に位置する、ウイルス複製起源が存在する。
【００３１】
「ＯＡＳ」は、アセンブリ配列の起源を意味する。アセンブリ配列の起源は、ウイルスコートタンパク質を有するＲＮＡ分子をウイルス粒子へとアセンブリするのに必要である。
【００３２】
「再構築されたタンパク質」は、複合タンパク質混合物由来のタンパク質の単離および水和された形態を意味する。
【００３３】
「ＩＬ４」は、インターロイキン４を意味し、免疫細胞、特に、Ｂ細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３４】
「ＩＬ１ｂ」は、インターロイキン１、βサブタイプを意味し、免疫細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３５】
「ＩＬ１ｂペプチド」は、Ｔ細胞を刺激し得るＩＬ１ｂの９アミノ酸区画を意味する。
【００３６】
「ＩＮＦγ」は、インターフェロン、γサブタイプを意味し、免疫細胞、特に、Ｔ細胞を活性化するサイトカインを意味する。
【００３７】
「ＴＭＶ」は、タバコモザイクウイルスを意味する。
【００３８】
「ＶＬＰ」は、ウイルス様粒子を意味する。
【００３９】
「Ｔｈ１」は、Ｔヘルパー１型免疫応答を意味し、これは、抗体免疫および細胞免疫の両方によって特徴付けられる。
【００４０】
「Ｔｈ２」が、Ｔヘルパー２型免疫応答を意味し、これは、主に抗体免疫によって特徴付けられる。
【００４１】
「ＩＶＥ」は、インビトロでのキャプシドに包まれることを意味する。
【００４２】
「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味する。
【００４３】
「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味する。
【００４４】
「ＨＡ」は、インフルエンザヘマグルチニン由来のペプチド配列を意味する。
【００４５】
「Ｖ５」は、シミアンウイルス５由来のペプチド配列を意味する。
【００４６】
「ｍｙｃまたはＭｙｃ」は、ｍｙｃオンコジーン由来のペプチドを意味する。
【００４７】
「Ｎ」位置は、コートタンパク質のＮ末端位置における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００４８】
「Ｌ」位置は、コートタンパク質の細胞外ループ位置において、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００４９】
「ＧまたはＧＰＡＴ」は、コートタンパク質のＣ末端位置から４アミノ酸における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００５０】
「Ｃ」位置は、コートタンパク質のＣ末端位置における、ペプチドまたは修飾が挿入される位置を意味する。
【００５１】
「Ｃｙｓ」は、アミノ酸のシステインを意味する。
【００５２】
「２０Ｓ」サブユニットは、密度勾配のある３４サブユニットコートタンパク質ディスクの沈降プロフィールを記載する。
【００５３】
「４Ｓ」サブユニットは、密度勾配のある４サブユニットコートの沈降プロフィールを記載し、これは、２０Ｓディスクの形成への中間体である。
【００５４】
「ｋＤａ」は、キロダルトンを意味し、これは、タンパク質の分子量または質量をいう。
【００５５】
「ＴＥＭ」は、透過電子顕微鏡を意味する。
【００５６】
「ＲＴ」は、室温を意味する。
【００５７】
「４Ｃ」は、摂氏４度、または華氏０度付近を意味する。
【００５８】
「ＰＡＧＥ」が、ポリアクリルアミドアガロースゲル電気泳動を意味する。
【００５９】
「ＳＤＳ」は、ドデシル硫酸ナトリウム、界面活性剤を意味する。
【００６０】
「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコール（分子量６０００〜８０００）を意味する。
【００６１】
「ＮａＣｌ」は、塩化ナトリウムまたは塩を意味する。
【００６２】
「ＤＥＡＥ」は、ジエチルアミノエチルを意味する、アニオン交換樹脂上で使用される分子である。
【００６３】
「ＰＯ４」は、ホスフェートを意味する。
【００６４】
「ｐｙｒｏ ＰＯ４」は、ピロリン酸を意味する。
【００６５】
「ＳＵ」は、サブユニットを意味する。
【００６６】
「ＣＲＰＶ」は、コットンテイルウサギパピローマウイルスを意味する。
【００６７】
「ＲＯＰＶ」は、ウサギ口腔パピローマウイルスを意味する。
【００６８】
「ＨＰＶ」は、ヒトパピローマウイルスを意味する。
【００６９】
「ＯＶＡ」は、卵白アルブミンを意味する。
【００７０】
「ＧＪ」は、グリーンジュースまたは全体の植物ホモジネートを意味する。
【００７１】
「Ｓ１」は、分類された植物抽出上清を意味する。
【００７２】
「Ｓ２」は、ｐＨ７での再懸濁によってＳ１不溶性物質から誘導される上清を意味する。
【００７３】
「ＢＳＡ」は、ウシ血清アルブミンを意味する。
【００７４】
「ＭＷ ＭＡＬＤＩ」は、Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ質量分析による分子量質量決定を意味する。
【００７５】
「ｗ／ｖ」は、体積あたりの重量を意味する。
【００７６】
「ＯＤ」は、光学密度を意味する。
【００７７】
「ＤＤＴ」は、ジチオスレイトールを意味する。
【００７８】
「ＲＮＡｓｅ」は、ＲＮＡを分解する偏在性の細胞酵素である。
【００７９】
「ＲＮＡｓｉｎ」は、市販のＲＮａｓｅインヒビターである。
【００８０】
「ＤＥＰＣ」は、ジエチルピロカーボネートであり、ＲＮＡｓｅ活性の化学的インヒビターである。
【００８１】
「Ｎａｂ」は、中和抗体を意味する。
【００８２】
「Ｌ１」は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質Ｌ１を意味する。
【００８３】
「Ｌ２」は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質Ｌ２を意味する。
【００８４】
「Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、およびＥ８」は、パピローマ早期遺伝子産物である。
【００８５】
「ＣＴＬ」は、細胞傷害性Ｔリンパ球を意味する。
【００８６】
「ＳＦＶ」は、セムリキ森林ウイルスを意味する。
【００８７】
「ＩＲＥＳ」は、内部リボソーム進入部位を意味し、これにより、ＲＮＡの中間部（または第１のＡＴＧにはないどこか）における翻訳の開始が可能となる。
【００８８】
「ＯＲＦ」は、翻訳される場合に、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡの機能的ユニット）を意味する。
【００８９】
「Ｂ１６」は、Ｂ１６と名付けられたマウス黒色腫腫瘍細胞を意味する。
【００９０】
「ＳＰＤＰ」 Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
「ＢＣＡ」アッセイ ビシンコニン酸に基づくタンパク質アッセイ
本発明は、タンパク質の合計を比色検出および定量するための新規な方法に関する。
【００９１】
本発明は、ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を使用して複数のワクチンおよび医薬を構築する新規の方法に関する。広範な点で、本発明は、下記のように、図１〜６で一般的に示される様式で実行される。
【００９２】
本発明の説明は、一般的な点で初めに提供され、その後に、多くの生化学的手順を含むより詳細な説明が続く。
【００９３】
標準的な方法は、図１に示される化学結合プロセスによって、偽多価ワクチン生成物を生成し得る。ＶＬＰ粒子が、生成され（１）、そして単離される（Ｓ２）。個々の粒子は、多数の独立したＶＬＰの表面に別々に化学的に結合体化され（Ｓ３）、ＶＬＰの異なる集団を生成し、この各々は固有のペプチド付加体を示す。複数のペプチドが、同じＶＬＰ集団の表面上に同時に結合されて、固有のペプチドのランダムな分布を有するＶＬＰを生成し得ることを想定することが可能である。次いで、免疫粒子の異なる集団は、混合され（Ｓ４）、異なるペプチドが表面に共有結合したＶＬＰ粒子の集団を生成する（Ｐ１）。この生じた生成物は、その混合物中の異なるペプチドを示すが、各々は免疫細胞によって独立して占められ、そして免疫系を刺激するために独立して使用される。融合ペプチドの間には相乗作用がない。なぜなら、異なるペプチド（各々が独立して機能する）間には特殊な関連性がないからである。
【００９４】
記載される本発明は、図１で示された手順に従うタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の固有の特性を利用するが、有意な利点を有する新規の方法（図２）でもある。図１のボックスＳ５により現わされるように、ＴＭＶビリオンが、改善された化学結合体化を可能にする表面会合アミノ酸で構築される。これは、固有の表面会合システイン残基またはリジン残基の存在であり得るが、他の方法が用いられ得る。同時係属特許出願番号０９／９６２，５２７（２００１年９月２４日出願、表題ＰＲＯＳＥＳＳ ＦＯＲ ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＹＩＮＧ ＶＩＴＡＭＩＮＥＳ ＡＮＤ ＳＵＧＡＲＳ ＦＲＯＭ ＰＬＡＮＴ ＳＯＵＲＣＥＳ）、ならびに関連の米国特許第６，３０３，７７９号、同第６，０３３，８９５号および同第６，０３７，４５６号（これら全てはＬａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｖａｃａｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａへと同一人に譲渡されている。これら全てはその全体が本明細書中で参考として援用される）において記載されるようにして、例えば、ＴＭＶの所望の株で感染され、次いで処理されたたタバコ植物を使用して、多量のＴＭＶが生成される（Ｓ６）。一旦、多量のＴＭＶが得られ得ると、以下により詳細に記載されるプロセスは、ＴＭＶを分裂させて、ボックスＳ７およびＳ８により表わされるように、多数のサブユニット（ＳＵ）または２０Ｓディスクを生成する。次いで、これらのサブユニットは、工程Ｓ９で分離されて、以下により詳細に記載されるように、複数のサブユニット（各々が別々に処理される）が形成される。工程Ｓ９によって表わされるように、各個のサブユニット群は、予め決定した成分（例えば、機能性ペプチド、エピトープ、タンパク質または核酸配列）をこのサブユニット群中のサブユニットに付加するために、以下により詳細に記載される様式で、結合体化反応に供される。工程Ｓ１０で表わされるように、複数のサブユニットの群が、ここで、１つのＶＬＰ構造に構築され、ここで各々のサブユニットは、これに結合した特定のエピトープ、ペプチド、タンパク質またはヌクレオチドを有する。ＴＭＶ ２０Ｓディスクは、天然では、再会合して、固有の配列（ＴＭＶ ｏｒｉ、すなわち、アセンブリ起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＯＡＳ）と呼ばれる）を含むＲＮＡ分子を取り巻くロッド形ビリオンを形成する。これは、多価ワクチンを生成し（Ｐ２）、このことは、単一の混合反応と等価ではない。多機能性ペプチドまたは核酸付加体が互いに物理的に結合することにより、これら各々は、ＶＬＰワクチンの細胞取り込み、免疫プロセシング、免疫系に提示される免疫ペプチドの数、および刺激された免疫応答の性質を相乗的に増大され得る。異なる未結合のＶＬＰ集団上ではなく同じＶＬＰ集団上での各ペプチド成分または核酸成分の同時提示は、ＶＬＰワクチンの効力を増大させ、かつ用量をさらに低下させると予測される。
【００９５】
本発明の方法におけるさらなる基本工程は、図２に示される。詳細には、工程Ｓ１０において、特定の組換えＲＮＡ配列が、ＴＭＶ ＶＬＰのアセンブリのための足場となるように選択される。工程１０で選択されたこの特定のＶＬＰサブユニットは、以下でより詳細に記載されるプロセスによって、再アセンブリＴＭＶを形成するように選択されたＲＮＡと組合わせられる。このＲＮＡは、構造的足場としてのみ働き得、ＴＭＶ ＲＮＡ自体のみを提示し得、新たなＶＬＰワクチンの構築ブロック以外のいかなる増大した機能も提供しない。しかし、ＴＭＶ ｏｒｉを含む組換えＲＮＡ（これもまたタンパク質をコードする）が、構築され得る（Ｓ１０）。一旦、ＶＬＰが免疫細胞に利用されると、ＴＭＶビリオンは固有の機能を有する。これは、リボソームによって優勢に結合され、そして同時翻訳機構によって分解する（Ｍｕｎｄｒｙら，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９９１ Ａｐｒ；７２（Ｐｔ４）：７６９−７７）。これは、このＲＮＡの効率的な翻訳を可能にし、その結果、コードされたタンパク質が、宿主免疫細胞内で産生される。このコードされたタンパク質は、標的化病原体または癌に対する体液性または細胞性のいずれかの免疫応答を刺激するインタクトな抗原であり得る。逆に、このＲＮＡは、免疫刺激タンパク質（免疫応答の振幅を増強する）または調節タンパク質（免疫応答の方向であるＴｈ１またはＴｈ２を保証する）をコードし得る。免疫応答の増強のために機能的であるコードされた核酸成分と組合わせて、免疫応答を刺激し、かつこの応答の効率および効果を促進するこのタンパク質エレメントの組み合わせにより、このワクチンは確実に二機能性になる。
【００９６】
ＲＮＡが「裸の」エレメントとして、または保護タンパク質コーティングでコードされていないエレメントとして、固有に不安定であることに注意すべきである。しかし、このＲＮＡは、核酸ワクチンにおけるＤＮＡを超える利点を有する。なぜなら、このＲＮＡは、免疫細胞内の所望の産物の翻訳を促進するが、分解され、そして免疫された宿主にＤＮＡ組換え事象および関連の腫瘍学的事象の危険性を与えないからである。ミリグラム（ｍｇ）量のＤＮＡがヒトにおける何らかの免疫応答に必要な場合、ＲＮＡ型またはＤＮＡ型の「裸の」、すなわちコートされていない核酸ワクチンは、非常に非効率的である。投与されたｍｇのワクチンのうち、数ピコグラム以下が免疫細胞によって利用される。このことは、高価な製造コストおよび処方コスト、および非常に非能率的な予測不可能な免疫応答を生じる。本発明により、重要な抗原または免疫促進タンパク質をコードする「裸の」ＲＮＡは、ＴＭＶのＶＬＰ構造内でコートされそして保護され得る。このようなコーティングは、ＲＮＡの安定性を増大し、そして送達効率を改善する。
【００９７】
ＶＬＰワクチンは、その表面に免疫ペプチドを付加するための化学的結合化にのみ依存するわけではない。従来技術は、免疫学的に関連したペプチドをＶＬＰの表面に遺伝子融合することによってＶＬＰワクチンを生成する方法を記載する。このプロセスは、図３に記載される。この場合、個々の（Ｓ１１）または複数の（Ｓ１４）ペプチドは、免疫ペプチドのタンパク質コード配列がｖｌｐ構造のタンパク質コード配列に融合される組換えＤＮＡ手順によって、ＶＬＰタンパク質の表面に融合される。各個のペプチドまたは複数のペプチドを提示するＶＬＰ構造は、精製され（Ｓ１１）、次いで、その特性について定性される（Ｓ１２）。多価ワクチンは、遺伝子融合によって、１つ以上のペプチドを提示する個々のＶＬＰ集団を混合すること（Ｓ１３）によって、または遺伝的手段によって、１つより多くのペプチドを提示するＶＬＰの単一の集団を単に使用することによってのいずれかで、構築される。これらの手順は、各々が固有の免疫ペプチドを提示する複数の別個のＶＬＰ集団から構成される多価ＶＬＰ免疫原を生成する（Ｐ３）。このアプローチは、非連結ペプチドの単一混合物によって予測され得る相乗活性がほとんど〜全くない、図１において生成されるワクチンの同じ制限に苦しむ。さらに、ＶＬＰワクチンは、核酸成分を欠き、単なる単機能的ワクチンである（免疫応答に対するタンパク質ベースのシグナルを提供するにすぎない）。
【００９８】
本発明は、確実に多価かつ多機能的なワクチンを誘導することによって、これらの困難性を克服する。ＴＭＶは、各々が固有の遺伝子融合物を有するＶＬＰの混合物を生成するために、図３で記載される同じ手順を受ける。しかし、この固有の特性は、図４に記載の手順を許容する。個々のＴＭＶビリオンは、遺伝的手段によって単一または複数のペプチドを用いて調製され得る（Ｓ１５）。各個のビリオンが単離され（Ｓ１５）、そして定性される。各ＴＭＶビリオンは、別々に分解され（Ｓ１６）、そして免疫ペプチドの固有のアレイを提示する２０Ｓディスクから構成されるＳＵが調製される（Ｓ１７）。次いで、この複数のＳＵは、ＴＭＶ ｏｒｉを含むＲＮＡの周りで配置されて、ＴＭＶ ＶＬＰを生成する（Ｓ１８）。実際に、最終生成物は、ＶＬＰの各々の表面上で複数の免疫ペプチドを同時に提示し（Ｐ４）、かつＶＬＰアセンブリのための足場および別個の免疫刺激因子の両方として機能するＲＮＡを含む、ＶＬＰワクチンである。このアプローチの利点は、この粒子が、ＶＬＰの表面に同時に提示される。複数の免疫ペプチド、免疫調節ペプチド、免疫刺激ペプチドまたは細胞取り込み促進ペプチドの点で多機能性であるという点で、上記と同じである。このことは、より効率的な細胞取り込み、用量の低下をもたらすプロセシングおよび免疫刺激、ならびに免疫保護の改善を可能にする。ＲＮＡは、再び、足場デバイスを越える必須の機能に寄与する。このＲＮＡは、インタクトな抗原、免疫調節、免疫刺激タンパク質をコードして、免疫応答をさらに増大し得る。このＲＮＡは、ＶＬＰ内で保護され、そしてＴＭＶ ＶＬＰの本来の機能によって、細胞翻訳装置に効率的に送達される。
【００９９】
上の記載は、本発明が機能する工程の基本的な枠組み、ならびに本発明に従うワクチンおよび薬学的製品を構築するためのプラットフォームの基本的な理解にすぎないことが理解されるべきである。図２および図４のフロー図に概説される工程は、図５および６に示される。図１〜４に概説される基本的枠組みに関して、２つのさらなる点に注意すべきである。第１に、これらの図は、種々のワクチン組成物が、別個のＶＬＰに提示されるか、または全てが１つのＶＬＰまたはビリオン上に再アセンブルされる３種の固有のエピトープを含むことを示す。三番目は、純粋に例示目的のために選択され、任意の数のエピトープが多価ワクチンを形成するために組換えられえることが理解されるべきである。第２に、ＶＬＰまたはビリオンの表面に提示される実体は、図３および４に示されるようなペプチドエピトープに限定される必要はない。この提示された実体はまた、化学融合により導入されたヌクレオチド、または化学融合もしくは遺伝子融合のいずれかによって導入された完全タンパク質であり得る。さらに、数および比の両方の点において、ヌクレオチド、ペプチドエピトープおよび完全タンパク質の全ての可能な組み合わせは、多価ワクチンの再アセンブリについて想定され得る。例えば、ペプチド１、ヌクレオチドＡおよび完全タンパク質Ｘ（これらの各々は、別個のビリオンまたはＶＬＰに提示される）が、図３のＰ３に類似した多価ＶＬＰワクチンを生成するために、組合わせられ得る。あるいは、各々がペプチド１、ヌクレオチドＡおよび完全タンパク質Ｘを提示する２０Ｓディスクの別個のプールが、インビトロで再アセンブルされて、図４のＰ４と類似した多価ワクチンを生成し、ここで全ての実体は、単一のＶＬＰまたはビリオン上に存在する。
【０１００】
以下は、一連の詳細な実施例であり、これらの実施例は、上記の一般的なフロー図を例示する。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１：ｐＨの関数としてのペプチドの融合物および可溶性）
ペプチド融合物を用いて成功する現在の業界基準は、４０〜５０％である。これを改善するために、一連の融合物を、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質上の複数の挿入位置において試験し、そして各融合物を複数の条件下で抽出して、ウイルス可溶性に対する融合位置の影響を決定した。この実施例は、組換えＴＭＶウイルスの単離（図４の工程Ｓ１５）に対する遺伝子融合位置の影響を記載する。
【０１０２】
図７は、Ｕ１コートタンパク質上の４つの異なる位置（Ｎ末端、Ｃ末端、表面ループ（Ｌ）、およびＣ末端から４アミノ酸（ＧＰＡＴ））で挿入された融合ＨＡについての結果を示す。切断およびウイルス可溶性の程度における明らかな差異が明らかであった。ｐＨ５で抽出した場合、約１００％のＨＡ ＧＰＡＴが、切断されて、野生型Ｕ１タンパク質の分子量に戻った。ｐＨ７での再抽出は、全長の収率を５０％まで改善した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ緩衝液中の組織抽出は、全長コート融合産物を生じ、このことは、切断がプロセシングの間に生じていることを示唆する。これはまた、Ｃ末端融合位置で生じるが、より小さい程度である。コート融合物のプロセシングは、部位特異的であるようである。なぜなら、Ｎ末端にこのエピトープを配置することが、全長産物を生じたからである。ループ位置でＨＡエピトープを用いると、ｐＨ５においてもｐＨ７においてもウイルスは回収されなかった；ＳＤＳＰＡＧＥ緩衝液粉砕（ｇｒｉｎｄ）は、ループ挿入物が発現されたが、不溶性産物を生じたことを示した。ペプチド切断の間に切断を示す融合物（例えば、ＨＡ ＧＰＡＴ）について、プロテアーゼインヒビターカクテルが、切断を減少または排除するために組み込まれ得る。あるいは、他のＮ．ｔａｂａｃｃｕｍ株が、減少したプロテアーゼ活性を有する宿主を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０１０３】
表１は、可溶性および相対回収に対するエピトープ位置の影響を、２つのさらなるモデルエピトープ融合物であるＶ５およびＭｙｃについてまとめる。Ｖ５エピトープＴＭＶ融合タンパク質、ＨＡエピトープＴＭＶ融合タンパク質およびｍｙｃエピトープＴＭＶ融合タンパク質を、ウェスタン分析によって、ペプチド特異的抗体に対する反応性について試験して、各融合ペプチドの招待および完全性を確認した（データは示さず）。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
（表１．３つの抗体結合エピトープの挿入部位による発現レベル）。
【０１０６】
３つのモデル誘導物を用いて発現の確認をした後で、その融合物リストを、再アセンブルした融合生成物に生物学的機能性を組み込むことを目的とした、パピローマウイルスの臨床的に関連するエピトープおよび黒色腫の臨床的に関連するエピトープならびに免疫刺激エピトープおよび細胞融合エピトープを含むように増殖させた。表２は、それらのエピトープ融合物についての可溶性の結果を要約する。試みた１８個の標的エピトープのうち、１５個を、可溶性生成物として首尾良く発現させた（８３％の成功率）。これは、４０％発現／可溶性という以前に産業スタンダードの２倍を示した。この改善は、２つの異なるｐＨ緩衝液用いる抽出と並行して実施した、挿入位置の回転に起因する。
【０１０７】
【表２−１】
【０１０８】
【表２−２】
【０１０９】
（表２） １８個のペプチドのうちの１５個が、Ｎ末端（Ｎ）、ＧＰＡＴ位置（Ｇ）、またはＣ末端位置（Ｃ）のいずれかで、ＴＭＶ Ｕ１コートとインフレームで発現された。葉穿孔粉砕物（約２００μｇの葉組織）からのｐＨ５抽出緩衝液またはｐＨ７抽出緩衝液のいずれかに可溶性であった融合物が、可溶性の欄に示される。首尾良くスケールアップ（＞５００ｇ葉組織）もした融合物もまた、示される。
【０１１０】
（実施例２．リンカーアミノ酸を改変することによる可溶性および蓄積の改善）
ＴＭＶへのエピトープの分子融合物は、時に、芳香族アミノ酸（例えば、Ｗ）または疎水性アミノ酸がそのペプチド中に存在する場合に、蓄積しない。例えば、マウス黒色腫抗原であるｐ１５ｅは、芳香族アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ）を含む。このペプチドは、Ｕ１コート上のＮ末端位置またはＣ末端位置上に導入された場合、ウイルスの不安定性を引き起こし、ＴＭＶ全身感染は、観察されなかった。本出願人は、ペプチド可溶性についてより支持する環境を生成するために、隣接アミノ酸は、親水性相互作用を増加するように付加され得、Ｗのようなアミノ酸がコートタンパク質の溶媒に露出した表面上に導入された場合に、ウイルスのアセンブリまたは安定性に対する負の影響を相殺すると理由付けた。アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は、荷電しているアミノ酸であり、これらを使用して、そのような方法が、ＴＭＶコートへのｐ１５ｅの不溶性融合をレスキューすることを示した（図８）。ｐ１５ｅペプチドに近接するＤＥの付加の前に、生成物の蓄積は観察されなかった（＊）。ｐ１５ｅへのＤＥの付加の後、生成物の蓄積が、明らかに見える（矢印）。他のアミノ酸（例えば、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ））を使用してもまた、ＴＭＶ蓄積に対するペプチド組成の負の影響を軽減し得る。ＴＭＶの発現レベルまたはアセンブリに対する負の影響を克服するに十分な隣接アミノ酸の数および型は、融合ペプチド特異的であり得、そして各ペプチドについて経験的に試験する必要があり得る。本実施例は、遺伝子融合物の単離を可能にするための緩和（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）配列の使用を示す（Ｓ１５、図４）。
【０１１１】
（実施例３．ＴＭＶ Ｕ１に対する化学結合エピトープ融合物）
遺伝子融合物のある特定のパーセント（７０〜８０％；実施例１参照）しか、多くの植物ウイルスについての機能的ＶＬＰ形成が可能ではない。多くの融合物は、蓄積せず、一方、他の融合物は、単に不溶性である。本発明は、Ｎ末端融合物または表面ループ融合物のいずれかとしてシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むコートタンパク質融合物の構築を包含する。ＴＭＶ Ｕ１への初期融合物およびＵ１ベクターにおける良好な発現を示す他のトバモウイルスコートタンパク質への初期融合物は、Ｎ融合物および表面ループ融合物として、グリシン−システイン−グリシン（ＧＣＧ）またはＧＧＣＧＧから構成される（図９Ａ（１））。以前のＬＳＢＣ実験は、システイン残基が、ビリオン表面上で許容されること、および植物細胞質ゾルの還元条件下で、コートタンパク質サブユニット間または宿主タンパク質間で、ジスルフィド架橋が形成されないことを示した。表面に露出したＣｙｓ残基を含むコートタンパク質の生成は、ヘテロ二官能性化学架橋試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））を使用する結合体化を介する、ＴＭＶビリオンへのペプチド結合体化を可能にする。ＳＰＤＰは、遊離のスルフヒドリル基と、遊離アミン基（例えば、リジン（Ｋ）上で見出される遊離アミン基）との、中性ｐＨにおける穏やかな反応条件下でのカップリングを可能にする。ＳＰＤＰ融合免疫結合体は、インビボ投与において広範に使用されている。種々のトバモウイルスコートタンパク質（ＣＰ）の初期研究および比較生化学応答のために使用されるペプチドは、ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＫ）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＫ）およびＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＫ）である。各々は、上記スルフヒドリル基への結合体化のためのＣ末端リジンを含むように、合成（Ｓｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ）される。ペプチドに加えて、ＳＰＤＰを使用して、チオール化３’末端を使用して、免疫刺激一本鎖ＤＮＡ ＣｐＧポリヌクレオチドを、ＴＭＶビリオンに融合もし得る。代替的アプローチは、異なる反応性アミノ酸（例えば、リジン）をＴＭＶコートタンパク質の溶媒に露出した残基領域（図９Ａ（２））中に導入し、結合体化のためにＣ末端システインまたはＮ末端システインを含むペプチドを合成することである。
【０１１２】
最初に、ＳＰＤＰ結合体化を、分解していないシステイン含有ＴＭＶに対する反応性について試験する。架橋反応を、記載されるＳＰＤＰの短鎖形態、長鎖形態およびスルホ−ＮＨＳ形態（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９６ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓおよびその中の参考文献）を使用して、実行する。ペプチド−ＳＰＤＰ付加物を、システインＴＭＶ Ｕ１ウイルスと混合し、その後、そのウイルスとそのペプチドとの物理的会合を示すサイズシフトについて、１６時間後に分析する。その後、この手順を２０Ｓディスクに拡張する。代替アプローチは、グルタルアルデヒドを使用するより特異的でない化学結合体化ストラテジーを使用することであった。このＨＡペプチドを、グルタルアルデヒドの存在下で、ＴＭＶまたはＮ末端システインＴＭＶのいずれかと混合した。グルタルアルデヒドと４時間インキュベーションした後、ＨＡペプチド−ＴＭＶシステイン結合体が形成され、これは、クーマシーによって質量の増加として、そしてウェスタン分析によって見かけの分子量の増加として、眼に見えた（図９Ｂ）。そのような結合体は、野生型ＴＭＶ（溶媒に露出したシステインを含まない）をこの結合体化反応において使用した場合には、存在しなかった（データは示さない）。非特異的架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）による結合体化は、ウェスタンブロットにおいて明らかに眼に見えるのと同様に、より高分子量の凝集物をもたらす。より特異的な化学を有する他の結合体化試薬（例えば、ＳＰＤＰ、ＥＤＣ、または他のヘテロ二官能性リンカー）は、融合ペプチド化学に対する１対１コートまたは指向性コートを生成し、より制御された結合体化反応を生じる。
【０１１３】
代替的ストラテジーは、Ｎシステインコートを２０Ｓディスクにアセンブルさせ、これらのディスクを、機能性エピトープを保有する他のディスクと（すなわち、分子融合による）ＲＮＡ上に再アセンブリさせ、そして完全に再アセンブリした混合物を、ＳＰＤＰ会合ペプチドまたはＳＰＤＰ会合部分とともにインキュベートして、新規な機能性を付加することである。これは、そのＳＰＤＰ結合体化によって２０Ｓディスクが化学的に不活性になって他のディスクと再アセンブルできなくなる場合、または保有されるペプチドが再アセンブリを立体的に妨害する場合に、特に有用である。同様に、モノマーまたはマルチマーの再アセンブル後に種々の薬剤を付加する能力は、優れた有用性を有する。例えば、ｓｓＤＮＡ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）のＳＰＤＰ結合体化は、免疫調節の増強を可能にし、この増強は、単にそのＣｐＧをワクチンと混合するよりも大きい。このことは、より良好な効力および／またはその用量を減少する可能性をもたらし得る。本実施例は、工程Ｓ３（図１）およびＳ９（図２）、ならびに化学的および遺伝子的に結合したエピトープ合わせるための代替経路を提供することを、示す。
【０１１４】
（実施例４．ＴＭＶコートタンパク質融合物の電子顕微鏡法）
ウイルス構造に対する上記融合物の影響を決定するために、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を実施した（図１０）。野生型ＴＭＶロッド（ｒｏｄ）は、直径１８〜２０ｎｍ×３００ｎｍを有する。上記モデルペプチドＶ５およびＭｙｃのＮ末端エピトープ融合物は、野生型Ｕ１ウイルスと視覚的に類似し、その稈の直径も同様であった。このことは、上記融合が、正常なコートタンパク質再アセンブリをインビボで妨害しないこと、および上記融合物が、インビトロでの再アセンブリのための良好な候補を構成することを、示す。
【０１１５】
（実施例５．野生型ＴＭＶ Ｕ１の抽出および分配）
ＴＭＶ Ｕ１の抽出および処理は、上記の同一に譲渡された米国特許番号６，３０３，７７９、同第６，０３３，８９５および同第６，０３７，４５６（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）において広範に考察されている。その処理は、図１１Ａに要約される。簡単に述べると、秤量した感染組織を、２容量の冷却水（０．０４％ｗ／ｖメタ亜硫酸水素ナトリウムを含む）と合わせ、Ｗａｒｉｎｇブレンダーにおいて粉砕を実施する。そのホモジネートを、４層のチーズクロスに通して繊維を除去し、緑色ジュース（ＧＪ）を残す。そのＧＪのｐＨを、５．０に調整し、４７℃にて５分間加熱する。冷却した後、そのＧＪを遠心分離して、不溶物を沈殿させ、第１上清を得る。そのウイルスが残りのペレットＰ１中に分配する場合、そのペレットを水中に再懸濁し、ｐＨ７．０に調整する。遠心分離後、そのウイルスを第２上清中で回収し、最後のペレットＰ２を捨てる。そのウイルスを精製して濃縮するために、２回の連続選択沈殿を、第１上清処理ストリームおよび第２上清処理ストリームに対して実施する。このウイルスの沈殿を、４％ｗ／ｖポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および４％ｗ／ｖ ＮａＣｌに対してこれらの上清を調整して３０〜６０分間冷却することによって、達成する。遠心分離後、このウイルスを、ペレットとして回収する。混入タンパク質は、この上清中に残る。この上清を捨てる。
【０１１６】
図１１Ｂおよび表３は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９から単離した野生型ＴＭＶ Ｕ１についての代表的結果を示す。そのＳＤＳゲルは、上記プロセスが、高純度の最終ウイルス調製物を生じることを明確に示す。ＢＳＡを標準物として使用して、そのコートタンパク質バンドを、濃度測定により定量し、このプロセスについての物質収支を、回収を決定するために実施する（表３）。このデータから、このウイルスの大部分が、Ｓ１プロセスストリームに分配し、ＰＥＧ沈殿の間に最小限しか喪失せず、総プロセス回収７６％が達成されたことが、明らかである。
【０１１７】
【表３】
【０１１８】
（表３） 感染Ｎ ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９植物からのＴＭＶ Ｕ１の単離についての物質収支。データは、図１１におけるゲルの濃度測定分析から、ＢＳＡ標準曲線を使用して生成した。
【０１１９】
（実施例６．ウイルスの抽出および分配に対するエピトープ融合物の影響）
実施例５に概説されるプロセスを、表２に列挙されるコートタンパク質融合物の選択のために使用した。物質収支を、総プロセス回収を決定することに加えて、Ｓ１プロセスストリームとＳ２プロセスストリームとの間のウイルスの分配を決定するために、実施した。各融合物の正体を、ＭＷ ＭＡＬＤＩによって確認した。これらの精製についての結果を、表４に要約する。この表から、処置の特徴は、エピトープ融合および位置に依存することが明らかである。抽出に関する物質収支は、９０〜１００％（例えば、ＨＰＶ ｅｐ２ Ｎ）〜１０％未満（例えば、Ｖ５Ｎ）の初期回収（Ｓ１プロセスストリーム＋Ｓ２プロセスストリーム）を生じた。Ｓ１ストリームとＳ２ストリームとの間の分配はまた、実質的に変化した。全体的回収はまた、０．５％〜７９％の範囲であった。このデータに基づいて、システインＮコートタンパク質融合物、Ｍｙｃ Ｎコートタンパク質融合物、およびＶ５Ｎコートタンパク質融合物を、最適化研究に進めて、全体的プロセス回収を改善する条件を決定した。この最適化は、実施例７および８に詳説される。この最適化は、遺伝子融合物を示すＴＭＶウイルスを単離するために使用し得るプロセス改変を示す（ステップＳ１５、図４）。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
（表４） 種々のコートタンパク質融合エピトープについてのウイルス分配および全体的プロセス回収。融合位置命名；Ｎ（Ｎ末端）；Ｃ（Ｃ末端）；ＧＰＡＴ（ＧＰＡＴ配列に対してＮ末端側）。＃は、１回より多く単離された融合物についての精製実行回数を示す。
【０１２２】
（実施例７．ウイルスの抽出および分配に対する塩化ナトリウムの影響）
抽出緩衝液中に塩化ナトリウムを組み込むことを、ウイルス回収を改善してウイルス分配を変化させるための手段として試験した。ＧＥＮＥＷＡＲＥ感染したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を採集し、そのバイオマスを分割して、塩の存在下および非存在下における抽出の接戦（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ）比較を実施した。その植物物質のうちの１／２を、０．０４％のメタ亜硫酸水素ナトリウムを含む冷却水中に抽出し、残りのバイオマスを、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（４％ｗ／ｖ ＮａＣｌおよび０．０４％メタ亜硫酸水素ナトリウムを含む）中に抽出した。実施例５に概説される手順に従って、処理を実施した。システインＮ ＴＭＶ融合物（図１２）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳ１画分とＳ２画分との比較は、塩の存在が、ウイルスをＳ１画分へと分配させることを明確に示す。このことは、都合が良い。なぜなら、このストリームから得られるウイルスは、代表的には、植物色素および不純物が混入することが少ないからである。また、図１１Ａから、Ｓ１分配が、Ｓ２分配よりも優先することが明らかである。なぜなら、Ｓ１分配は、処理工程の数を減少するからである。
【０１２３】
塩の存在下および非存在下での抽出物の物質的バランスは、表５に示される。システインＮについてのデータから、全体的なプロセス回収率が、塩の添加で実質的に改善されたことが明らかである；両方のプロセスで抽出された総ウイルスは、同一であるが、塩の非存在下でのウイルス喪失は、４％ ｗ／ｖ 塩化ナトリウムでわずか７％であることと比較すると、４４％であった（Ｐ２ペレットと関連したまま）。表５はまた、抽出の間のＭｙｃ Ｎコートタンパク質融合物およびＶ５Ｎコートタンパク質融合物の回収およびウイルス分離についてのデータを有する。塩化ナトリウムの利点もまた、明らかであり、このことは、このプロセス改変が一般的適用性を有することを示す。
【０１２４】
【表５】
【０１２５】
（表５ 感染したＮ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物からのマルチエピトープを示すウイルスの単離についての物質的バランス。データを、ＢＳＡ標準曲線を用いて、ＳＤＳゲルのデンシトメトリー分析から生成した。
【０１２６】
（実施例８ ウイルス沈殿物の塩およびＰＥＧ濃度の影響）
図１１に示されるように、Ｓ１またはＳ２プロセシングストリームのいずれかにおけるウイルスを、さらに精製し、一連の２つのＰＥＧ沈殿によって濃縮する。第１のＰＥＧ沈殿に関与するこのステップは、以下のフローダイアグラムに概説される（図１３）。このＳ１（またはＳ２）上清を４％ ｗ／ｖ ポリエチレングリコールおよび４％ ｗ／ｃ ＮａＣｌに調節する。その上清が既にＮａＣｌを含んでいる場合、固体のＰＥＧのみを添加し、攪拌しながら溶解し、サンプルを氷上で冷却する。沈澱したウイルスを遠心分離によってペレットにし、上清を廃棄する。次いで、ウイルス含有ペレットを、低イオン強度緩衝液中に再懸濁し、低速清澄遠心（ｌｏｗ ｓｐｅｅｄ ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ）を行う。これにより、いかなる残渣色素もペレットになり、夾雑植物タンパク質が凝集し、溶液中にウイルスが残る。次いで、この溶液を、４％ ｗ／ｖ ＰＥＧおよび４％ ｗ／ｖ ＮａＣｌに調節し、このプロセスを反復することによって、第２のＰＥＧ沈殿物にする。
【０１２７】
表６は、野生型ＴＭＶ Ｕ１および２つのコートタンパク質融合物（Ｍｙｃ ＮおよびＶ５Ｎ）についての２工程ＰＥＧ沈澱から得られる回収率を比較する。図１３に概説される標準的手順では、野生型Ｕ１と比較すると、両方のコートタンパク質融合物について乏しい回収率しか生じなかった。フローダイアグラムから、この喪失は、ＰＥＧによるウイルスの不完全な沈澱または清澄工程の間のウイルスのペレット化から生じうる。ＰＥＧ沈澱における各工程周辺の物質的バランスは、Ｍｙｃ Ｎ ４％ ｗ／ｖ ＰＥＧについては、ウイルスをペレットにするには不十分であり、大部分が上清中に残ったままであることが示された。この場合、ＰＥＧ濃度を８％ ｗ／ｖまで増大させことが必要でありこの改変は、６％〜６０％へと回収率を増大させた。Ｖ５Ｎについては、ウイルスの完全沈殿が４％ ｗ／ｖ ＰＥＧで達成されたが、そのウイルスは、清澄遠心の間に、溶液中には残らなかった。そのウイルス含有ペレットを１０ｍＭ ＮａＫＰＯ４（４％ ｗ／ｖ ＮａＣｌを含む）中に再懸濁することによって、ウイルスは可溶性のままであり、回収率は、１％未満から９５％まで増大した。これらの２つの実験は、ウイルス融合物がどの程度ウイルス特性に影響を与えうるかを示し、プロセシングの間にウイルス可溶性を維持する方法を提供する。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
（表６ ＴＭＶコートタンパク質融合物についてのＰＥＧ沈澱工程の最適化）
（実施例９：遊離コートタンパク質および２０Ｓディスクの生成）
この実施例は、より詳細に、工程Ｓ７およびＳ８（図２）ならびに工程Ｓ１６およびＳ１７（図４）を例示する。コートタンパク質を、Ｆｒａｅｎｋｅｌ Ｃｏｎｒａｔ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９５７，４，１−４）によって開発されたプロトコルの改変版を用いて、精製ウイルスから生成した。このプロトコルを図１４にまとめる。簡潔には、そのウイルスを２容量の氷酢酸と合わせ、４℃で１時間インキュベートし、ウイルスの解離およびＲＮＡの分解／沈澱が得られる。遠心分離をして分解したＲＮＡを除去した後に、酢酸を透析によって除去した。あるいは、限外濾過／ダイアフィルトレーションを使用して、透析の前に氷酢酸の大部分を除去しうる。透析すると、コートタンパク質は、その等電点で沈澱する。その沈澱したコートタンパク質を、遠心分離によって単離し、水に再懸濁した。ｐＨを８に調節することによって、コートタンパク質を再溶解し、最後の遠心に供して、全ての残りの凝集種を除去した。
【０１３０】
このプロセスは、多くの遊離コートタンパク質融合物を精製ウイルスから作製するために使用した。表７は、エピトープ融合物の選択（そのためにコートタンパク質が生成される）に対するプロセス回収率をまとめる。
【０１３１】
【表７】
【０１３２】
（表７ エピトープ融合物の選択のための遊離コートタンパク質生成。融合物位置の指定；Ｎ、Ｎ末端；Ｃ、Ｃ末端）
コートタンパク質の量を、紫外線吸光度スペクトルによって評価した（Ｄｕｒｈａｍ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９７２，６７：２８９）。このスペクトルは、２８２ｎｍでの最大吸光度および２５１ｎｍでの最小吸光度、ならびに２．０と２．５との間の最大：最小の比を有するべきである。より低い比は、コートタンパク質調製物の残りのＲＮＡ夾雑物を示す。図１５Ａは、野生型ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質の代表的な吸光度スペクトルを示す。表８は、種々のエピトープ融合物を示す遊離コートタンパク質調製物の吸光度比をまとめる。最大：最小の比が予測より低かった場合（例えば、Ｍｙｃ Ｎ）、このコートタンパク質調製物を、陰イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥセファロース）で処理した。この夾雑するＲＮＡは、正に荷電した樹脂と強く会合する一方で、コートタンパク質の会合はより低く、よって、低塩化物イオン濃度でのコートタンパク質の選択的溶出が可能になる。このアプローチは、５０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液によってＭｙｃ Ｎコートタンパク質を夾雑する残渣ＲＮＡから分離して、最大：最小吸光度比が２より大きいコートタンパク質調製物を生成することに成功してきた（図１５Ｂ〜Ｄ）。
【０１３３】
【表８】
【０１３４】
（表８ 種々のエピトープ融合物を示す遊離コートタンパク質の最大吸光度（２８２ｎｍ）：最小吸光度（２５１ｎｍ）の比。融合物位置指定；Ｎ、Ｎ末端；Ｃ、Ｃ末端）
再アセンブリ反応において使用する前に、そのコートタンパク質調製物を、３〜４コートタンパク質からなる４つのＳサブユニットから、２０個のＳディスクに変換する（図５を参照のこと）。このことは、使用前にコートタンパク質調製物を室温で、正確なｐＨおよびイオン強度条件下で２４〜４８時間インキュベートすることによって達成した。例えば、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質（０．１Ｍ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０中）を、１６時間かけて室温にて４℃から平衡化させ（２０〜２２℃）、最初のおよび平衡化したコート調製物をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。図１６に認められるように、室温でのインキュベーションは、二峰性分布を生じ、２０個のＳディスクの形成を生じた。
【０１３５】
（実施例１０：２０個のＳディスクからの野生型ＴＭＶビリオンの再アセンブリ）
この実施例は、実施例１１〜１３とともに、Ｐ４（図４）を生成するための、多価の二機能性ワクチンの生成のための方法（すなわち、工程Ｓ１８（図４））を例示する。ＴＭＶ再アセンブリのための標準的な条件は、野生型Ｕ１コートタンパク質および野生型ＴＭＶ ＲＮＡ足場について概説されている（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ，ＨおよびＳｉｎｇｅｒ，Ｂ（１９５９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，３３，３５９−３７０）。代表的には、０．１Ｍリン酸またはピロリン酸緩衝液（７．０〜７．５のｐＨが、２２：１のコートタンパク質：ＲＮＡの質量比で使用される）
ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質を、実施例９に記載されるように、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ変異系統ＭＤ６０９植物から単離した野生型ウイルスから生成した。野生型ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて同じウイルスから単離した。再アセンブリ反応を、９６ウェルプレート様式で、１１００μｇ／ｍｌのコートタンパク質濃度および５０μｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度において２００μｌ容量で行った。この反応系を、０．１Ｍリン酸またはピロリン酸（ｐＨ７．２）で緩衝化し、このコートタンパク質を、使用前に２日間にわたって室温にて予備インキュベートした。この予備インキュベーションにより、４個のＳサブユニットから２０個のＳディスク形成が生じる（図１６）。標準的条件に加えて、リボヌクレアーゼインヒビターＲＮａｓｉｎを、０．１Ｍ リン酸緩衝化反応系に加えることによっても試験した。この再アセンブリ反応を、３１０ｎｍでの吸光度の変化（これは、再アセンブリ生成物の平均長の増大に対応する）を経時的に測定することによって行った。
【０１３６】
図１７Ａは、再アセンブリ反応についてのＡ３１０ｎｍプロフィールを示す。野生型ウイルスコントロールは、モル濃度ＲＮＡ濃度は、再アセンブリ反応物の濃度に等しいようにした。リン酸の代わりにピロリン酸を使用することにより、再アセンブリの開始速度が改善され、ＯＤ最大は、ＴＭＶウイルスコントロールのものに相当した。リン酸緩衝化再アセンブリ反応については、最大ＯＤは、微量のウイルスより低かった（０．１２ＯＤ対０．１４ＯＤ）。アガロースゲル電気泳動（図１７Ｂ）による最終的な再アセンブリ反応におけるＲＮＡ完全性を評価することによって、ＲＮＡ分解がピロリン酸サンプルおよびリン酸サンプルの両方において、後者がより大きな程度で起こっていることが示された。従って、異なるリボヌクレアーゼインヒビターをコートタンパク質に添加することによって、試験した。リボヌクレアーゼインヒビター（さらなるＤＴＴありまたはなしのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、あるいはＳＵＰＥＲａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のいずれか）を、ＲＮＡ添加（０．２〜４Ｕ／μｌ）の３０分前に、コートタンパク質調製物に添加した。試験した全ての濃度のＳＵＰＥＲａｓｅは、効果的でなかったのに対し、ＲＮａｓｉｎは、ＲＮＡ分解を実質的に減少させた（図１７Ｂ）。その存在はまた、再アセンブリ反応について得られる最大ＯＤ３１０ｎｍを改善した（図１７Ａ）。
【０１３７】
異なる緩衝液の組み合わせの機能的重要性を決定するために、再アセンブリ反応物のアリコートを、局所的病変宿主アッセイによって分析した（表９）。この再アセンブリ反応物、裸のＲＮＡおよびウイルスコントロールを連続希釈し、研磨剤として使用されるカーボランダムをＮ．ｔｏｂａｃｕｍ「Ｘａｎｔｈｉ」ＮＮ植物の葉に塗布した。接種後５日間、病変の数を計数し、再アセンブリ反応における機能性ウイルスの力価の半定量的測定を提供した。
【０１３８】
【表９】
【０１３９】
（表９ 野生型Ｕ１コートタンパク質およびＴＭＶ ＲＮＡを用いた再アセンブリ反応についての局所的病変宿主アッセイデータ。Ｐ０４、０．１Ｍ リン酸緩衝化；ｐｙｒｏ ＰＯ４、０．１Ｍ ピロリン酸緩衝化；ＰＯ４ ＲＮａｓｉｎ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビターを含有する０．１Ｍ リン酸緩衝化）
等価なモル濃度のＲＮＡ濃度を含む再アセンブリ反応物に対して、遊離ＲＮＡの感染性を比較すると、ＲＮＡキャプシド化により感染性が改善されることが明らかに示される。再アセンブリ反応物内で、感染性における顕著な改善が、ＲＮＡ完全性およびＡ３１０ｎｍのＯＤ最大における改善に相関して、ＲＮａｓｉｎが存在した場合にリン酸緩衝液について明らかであった。ＲＮａｓｉｎでの観察された感染性は、ウイルスコントロールの感染性と匹敵した。ピロリン酸緩衝液はまた、加速された再アセンブリに起因して感染性を改善し、ＲＮＡの保護を補助した。
【０１４０】
（実施例１１ ＴＭＶ ＲＮＡ上へのコートタンパク質融合物の再構築）
この研究の中心的な目的は、多機能ＴＭＶに基づく再構築生成物の生成であり、これは、異なる機能を有するエピトープ（例えば、抗体またはＣＴＬ標的とともに細胞標的化または免疫調節配列）を示す。第１の工程として、ＴＭＶ ＲＮＡ上に再構築する種々のコートタンパク質融合物の能力が試験された。選択される融合は、ＥＬＤＫＷＡＳならびにＮ末端のＨＰＶ ｅｐ２およびＣ末端のＭｙｃであった。再構築反応を、９６ウェルプレート様式で、１１００μｇ／ｍｌのコートタンパク質濃度および５０μｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度で、２００μｌ容積で実行した。反応を０．１Ｍホスフェート（ｐＨ７．０）で緩衝化し、そしてコートタンパク質を、使用の前に室温で２日間プレインキュベートした。反応のサブセットにおいて、リボヌクレアーゼインヒビターＲＮａｓｉｎを組み込んだ。再構築反応に続いて、経時的に３１０ｎｍで吸光度の変化を測定し、これは、再構築生成物の平均の長さの増加に対応する。
【０１４１】
図１８Ａは、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合を含む再構築反応についてのＡ３１０ｎｍプロフィールを示す。反応混合物中のＲＮａｓｉｎの存在は、より高い最終ＯＤで改善された吸光度プロフィールを明らかに生じた。再構築反応のＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によって評価された（図１８Ｂ）。分解の程度がＵ１コートタンパク質を含む再構築反応よりも実質的に高いが、ＲＮａｓｉｎの存在は、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質再構築物におけるＲＮＡ分解の程度を減少しなかった。
【０１４２】
ＲＮＡプロフィールを伴うＡ３１０ｎｍ動力学は、ＲＮａｓｉｎが、再構築の間に形成された全長ロッドの割合を増加することを示唆する。これを確認するために、サンプルを電子顕微鏡によって分析した（図１９）。ＲＮＡの存在および非存在におけるコートタンパク質の画像を比較することは、ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合物のＴＭＶ ＲＮＡ足場上への再構築が生じたことを示す。ＲＮａｓｉｎの影響を評価するために、正規化粒子サイズ分布（電子顕微鏡画像から得られる）を決定した。ＲＮａｓｉｎの存在とともに、全長（＞２７５ｎｍ）ロッドの５％から２０％の同時の増加とともに、０〜１００ｎｍの長さのロッドの減少が存在し、これは、Ａ３１０ｎｍ吸光度データと相関する。
【０１４３】
全長ロッドの減少は、おそらく全長ＲＮＡの減少したプールから生じた。これは、機能的、すなわち、感染性の再構築生成物の数を減少することが予期される。局所損傷宿主アッセイによる再構築生成物の分析は、この減少を確認し；ＲＮａｓｉｎを省くことは、９の因子によって観察される損傷の平均数を減少した（表１０）。
【０１４４】
【表１０】
【０１４５】
表１０ 複数のコートタンパク質融合物およびＴＭＶ ＲＮＡとの再構築反応についての局所損傷宿主アッセイデータ。ＰＯ４、緩衝された０．１Ｍリン酸塩；ＰＯ４ ＲＮａｓｉｎ、０．４Ｕ／μｌ ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビターを有する緩衝化された０．１Ｍリン酸塩。全ての希釈は、１０−３であった。この希釈において、損傷は、遊離野生型ＲＮＡについて検出されなかった。Ｎ，Ｎ−末端融合；Ｃ，Ｃ末端融合。
【０１４６】
再構築反応はまた、ＲＮａｓｉｎの存在下または非存在下で、ＨＰＶ ｅｐ２およびＭｙｃコートタンパク質融合物を用いて実施した。ＥＬＤＫＷＡＳコートタンパク質融合物と同様に、再構築の間、ＲＮａｓｉｎの存在は、より高い最終ＯＤおよび改善されたＲＮＡ完全性とともにＡ３１０ｎｍプロフィールを生じた。機能的な見地から、ＲＮａｓｉｎの存在下で生じた再構築生成物は、局所損傷宿主アッセイによるより高い活性を示した（表１０）。ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２について、損傷の平均数は、１５であり、ＲＮａｓｉｎが存在した場合、それぞれ６倍高かった。これらの感染性の研究は、溶媒に暴露されたエピトープを有するＴＭＶコートタンパク質が、機能性ＲＮＡを再構築し、そしてキャプシドに包まれる能力を明らかに示す。
【０１４７】
コートタンパク質調製物は、それらと関連する植物由来のリボヌクレアーゼ活性を有し、これは、再構築反応におけるＲＮａｓｉｎの包含によって部分的に軽減され得る。代替のアプローチはまた、開始ビリオン調製物と関連するリボヌクレアーゼ活性を減少するために使用され得、これからコートタンパク質調製物が作製される。ウイルス調製物は、ベントナイトで処理され得、このベントナイトは、リボヌクレアーゼ活性を阻害する（Ｊａｃｏｌｉ，Ｇ．，Ｒｏｎａｌｄ，Ｗ．，ａｎｄ Ｌａｖｋｕｌｉｃｈ，Ｌ．：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ，Ｃａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５１，１５５８，１９７３）。あるいは、ウイルス調製物は、０．０５％〜０．１％ｖ／ｖでジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理され得、これは、酵素部位でヒスチジン残基と特異的に反応することによって、ＲＮａｓｅを不活化する。残りのＤＥＰＣは、ＤＥＰＣが反応する第１級アミン基（例えば、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）を含む任意の緩衝液に対して広範囲に処置されたウイルスを透析することによって除去される。
【０１４８】
多価ＴＭＶベースのワクチンを作製するための再構築反応は、ＴＭＶ ＲＮＡ足場を使用して実施した。ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２コートタンパク質融合物を、１対１の比で対で組み合わせた。図２０は、２価キャプシド化についてのＡ３１０ｎｍ再構築動力学を、個々に使用したコートタンパク質融合物についての動力学と比較する。２価反応は、経時的に、吸光度の類似の上昇を示し、これは、再構築が２つの独立したコートタンパク質融合物の存在において効率的に存在したことを示す。機能的２価再構築ビリオンの作製について試験するために、局所損傷宿主アッセイを実行した（表１０）。一価構築物に匹敵する損傷数を得、機能的再構築生成物の存在を確認した。
【０１４９】
（実施例１２ 多価パピローマウイルス予防ワクチン）
（導入）
動物は、パピローマウイルス構造タンパク質（Ｌ１およびＬ２）のいずれかまたは両方でのワクチン接種によるパピローマウイルスでの感染に対して保護され得る（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ＤＭら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １８６：１６９−ｌ８２；Ｋｏｕｔｓｋｙ ＬＡら，２００２，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４７：１６４５−５１）。パピローマウイルス感染に対する保護は、主に、特異的な体液性応答を必要とし、これは、構造タンパク質におけるエピトープに対するウイルス中和抗体（Ｎａｂ）の産生を生じる。構造タンパク質に対する細胞性免疫応答はまた、ワクチン誘導免疫に寄与し得る。Ｌ１、または非構造遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８の１つ以上を含む生の（ｌｉｖｅ）組換えウイルスおよびＤＮＡワクチンベクターは、ワクチン接種された動物において保護免疫を誘導し得る；これらの場合において、細胞性免疫応答および体液性免疫応答の両方が、検出される（Ｓｕｎｄａｒａｍ Ｐら，１９９７，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：６６４−７１；Ｍｏｏｒｅ ＲＡら Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２０：２２９９−３０１）。パピローマウイルス構造タンパク質に対する体液性応答は、パピローマ感染に対する保護免疫について必要かつ十分である（Ｅｍｂｅｒｓら，２００２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５）。ウイルスコードタンパク質に対する細胞性免疫応答は、保護性免疫応答のレベルおよび頑強さを増強するが、初期感染を妨げない（Ｔｏｂｅｒｙ ＴＷら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：１５３９−４７）。
【０１５０】
（２価または多価再構築ワクチン）
最も重要なパピローマウイルスＮａｂは、Ｌ１においてコンフォメーショナルなエピトープを結合し、そしてインタクトなウイルスのみまたは正確に構築されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を認識する。これらのＮａｂは、キャプシド表面上にある超可変性ループ中のエピトープを認識し、そして一般的に、密接に関連したパピローマウイルス型のみを中和する。Ｌ２のＮ末端領域における直線エピトープに結合する抗体はまた、ウイルス感染性を中和し得る。最も重要なことには、Ｌ２エピトープに対するＮａｂは、異なるウイルス株を交差中和する能力を示す（Ｅｍｂｅｒｓ ＭＥら，２００２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５；Ｋａｗａｎａ Ｙら，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２３３１−２３３６；Ｋａｗａｎａ Ｋら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：６１８８−６１９０；Ｋａｗａｎａ Ｋら，２００１，１４９６−１５０２；Ｒｏｄｅｎ ＲＢＳら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７０：２５４−２５７）。Ｅｍｂｅｒｓら（２００２；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：９７９８−９８０５）は、ウサギパピローマウイルスウサギ口腔パピローマウイルス（ＲＯＰＶ）およびワタオウサギ口腔パピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のＬ２タンパク質において線形エピトープを表すペプチドが、相同なウイルスでのチャレンジに対しては良好な保護免疫を誘導し得るが、異種ウイルスに対しては誘導し得ない。
【０１５１】
直線中和ウサギパピローマウイルスエピトープＣＲＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２；ＲＯＰＶ Ｌ２．１およびＲＯＰＶ Ｌ２．２（Ｅｍｂｅｒｓ ＭＥら，２００２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）を示す組換えＴＭＶ Ｕ１を構築した（表２）。各組換えウイルスは、高い力価の相同ウイルスを用いるチャレンジに対して動物を保護する中和抗体を誘導する。しかし、各ワクチンは、異種ウイルスを中和するのに十分な力価のＮａｂを誘導しないかもしれない。
【０１５２】
ＴＭＶ ＯＡＳを含む構造ＲＮＡ上に、少なくとも２つの異なるコートタンパク質（それぞれ異なるペプチドを示す）を構築することによって、ＣＲＰＶおよびＲＯＰＶの両方に対する保護性免疫を誘導する多価組換えワクチンを作製し得る。例えば、実施例９に記載される方法は、ＴＭＶ Ｕ１のＣ末端に対して近位の「ＧＰＡＴ」位置にＣＲＰＶ Ｌ２．１ペプチドを示す組換えＴＭＶビリオンから遊離コートタンパク質を単離するために使用し得る。同様に、遊離コートタンパク質は、ＴＭＶ Ｕ１のＣ末端に対して近位の「ＧＰＡＴ」でＲＯＰＶ Ｌ２．１ペプチドを示す組換えＴＭＶビリオンから単離され得る。野生型ＴＭＶ ＲＮＡ、または構築配列のＴＭＶ Ｕ１起源（ＯＡＳ）を含む組換えＲＮＡは、再構築された２価ワクチンが、実施例１０および１１に記載される方法に従って構築される足場として使用され得る。同様に、ワクチン接種した動物においてＮａｂを誘導する能力を有するペプチドを示すさらなる組換えＵ１コートタンパク質は、多価ワクチンウイルスまたはウイルス様粒子を作製するために、再構築反応内に組み込まれ得る。２価または多価ワクチンでワクチン接種される動物は、組換えワクチン分子に融合した種々のペプチド抗原を認識する抗体を産生する；これらの抗体は、ＣＲＰＶおよびＲＯＰＶの両方を中和し得る。従って、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギは、単一ワクチン部分でのワクチン接種後、２つの異なるウイルス種に対して感染を保護される。
【０１５３】
（多機能ワクチン：体液性免疫および細胞性免疫の誘導）
ＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２ペプチドと相同なヒトパピローマウイルス型１６Ｌ２の配列は、特異的なレセプターに結合し得、そして細胞表面への結合において、レセプター媒介機構によりこれらの配列に融合したタンパク質の細胞侵入を媒介し得る（Ｋａｗａｎａ Ｙら、２００１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５：２３３１−２３３６；Ｙａｎｇら、２００３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：３５３１−３５４１）。従って、これらの配列を示すビリオンおよび再構築されたウイルス様構造が、ウサギ細胞の表面に結合し得、細胞内への再構築されたウイルス構造の侵入を媒介することが予期される。構築されたウイルスまたはウイルス様粒子によって示されるＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２ペプチドの１つ以上で再構築された粒子のさらなる細胞融合機能は、形質導入された細胞の細胞質への機能性ＲＮＡペイロードの送達を可能にする。
【０１５４】
再集合されたウイルス構造の表面上に示されるＬ２ペプチドにより誘導される保護抗体媒介免疫を増加させるために、ＲＮＡ足場が、さらなる生物学的活性を有する。例えば、足場ＲＮＡは、自律性複製のために必要なセムリキ森林アルファウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ配列をコードする組換えＲＮＡ分子であり、ＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子は、ＳＦＶ由来の２６ＳＲＮＡプロモーターの制御下で発現され得、ＴＭＶ Ｕ１ ＯＡＳは、ＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子の下流に挿入される。この構築物が、図２２に示される。動物は、足場としてキャップされたＳＦＶ：：ＣＲＰＶＬ１：：ＯＡＳ ＲＮＡ分子を含む再集合されたウイルス構造で免疫化され、これらの構造は、足場ＲＮＡ上に集められる１つ以上のＣＲＰＶ Ｌ２．１、ＲＯＰＶ Ｌ２．１；ＣＲＰＶ Ｌ２．２およびＣＲＰＶ Ｌ２．２エピトープを示す組換えＴＭＶコートタンパク質により保護される。組換えＴＭＶコートタンパク質は、いくつかの以下の重要な機能を実施する：（１）これらのタンパク質は、ヌクレアーゼ消化から組換えＳＦＶ ＲＮＡ分子を保護する；（２）これらのタンパク質は、マクロファージ、樹状細胞、および他の抗原呈示細胞により優先的に認識されかつ包み込まれるような粒子状の準結晶性構造を形成する；（３）特異的な細胞結合活性にも関わらず、これらのタンパク質は、細胞質に組換え粒子を送達する。
【０１５５】
一旦粒子が細胞質中にある場合、組換えＲＮＡ分子が翻訳され、そしてＲＮＡが、ＳＦＶ非構造タンパク質（ＮＳＰ）レプリカーゼ活性により媒介される複製の１つ以上の周期を経る。ＣＲＰＶ Ｌ１ ＲＮＡおよびＴＭＶ ＯＡＳをコードするサブゲノムＲＮＡが転写され、そしてＣＲＰＶ Ｌ１ ＲＮＡが、翻訳される。次いで、細胞内で発現されるＬ１タンパク質は、処理およびＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉを介してＴ細胞への呈示のために利用可能であり、それによりＬ１タンパク質に対する細胞免疫応答に刺激を与える。形質導入された細胞の細胞質に送達される組換えＳＦＶ ＲＮＡの複製は、ｄｓＲＮＡ誘導プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）のような病原体サーベイランスシグナル伝達分子を介する先天的な免疫応答を誘導し、その結果インターフェロンガンマのような炎症性サイトカインの分泌を生じる。これは、Ｌ１ ＯＲＦに対して誘導される特異的な細胞免疫応答を増大する。従って、構造タンパク質（Ｌ１およびＬ２）の両方に対する幅広い強固な免疫応答が、誘導される。これらの多機能性ワクチンでワクチン接種されたウサギは、ＣＲＰＶウイルスおよびＲＯＰＶウイルスの両方の病原体接種に対して保護される。
【０１５６】
機能的ＲＮＡを生成する代替的な方法は、ＩＲＥＳおよびＬ１についての配列をＴＭＶ ＲＮＡ中に挿入することであり、これはまた、コートタンパク質上のＬ２ペプチドエピトープの分子融合を発現する。この方法は、インビボでＲＮＡをキャプシドで包む利点を有し、そして細胞摂取メカニズムが遺伝子の転写を可能にする後まで分解からＲＮＡを保護するために再度キャプシドで包むことに依存しない。第３の戦略において、コートタンパク質はまた、Ｔヘルパーエピトープ、細胞融合エピトープ、アジュバンド、またはＥ７のような非構造タンパク質の全長遺伝子産物の結合のためのＮ末端システインを有する。
【０１５７】
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７およびＥ８を含む乳頭腫ウイルス非構造タンパク質は、ワクチン接種された動物における、保護的免疫または病変の後退および除去を媒介することが公知である（Ｈａｎ Ｒら、２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ ２６：４５８−６７；Ｈａｎ Ｒら、２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：９７１２−６）。上記と同じ様式で、保護免疫を媒介することが公知であり、ウイルス感染の後退または治癒を誘導し得る他の乳頭腫タンパク質をコードするｍＲＮＡまたは自律性複製ＲＮＡが、ウイルス構造中でキャプシドに包まれ得る（図２２）。
【０１５８】
（実施例１３ 多価黒色腫ワクチン）
腫瘍成長に対する良好な保護を刺激する黒色腫抗原は、代表的にＣＴＬエピトープとして特徴付けられる。ＣＴＬ応答は、免疫系に対するワクチン呈示の間の免疫刺激を包含する抗原呈示のための状況に高度に依存する。これは、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＮＦγのような免疫刺激サイトカイン、ＣｐＧオリゴのようなＴ細胞を特異的に活性化するアジュバント、またはＩｌ１ＢまたはＭＩＰ１ａまたはＩＰ１０のような免疫調節ペプチドもしくはタンパク質のいずれかについての必要性により特徴付けられ、ワクチンと共に送達され、またはワクチン産物に直接融合される。分子結合体または化学結合体のいずれかである、黒色腫ＣＴＬエピトープ融合体が、野生型ＴＭＶ ＲＮＡ上で再集合され、そしてペプチド特異的ＣＴＬ応答の適切な刺激について試験される。次いで、同じ黒色腫ＣＴＬエピトープ融合物が、ＴＭＶアセンブリ起点およびＩＦＮｇ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１ａまたはＩＰ １０についての哺乳動物翻訳可能コドンの両方を含むＲＮＡに再集合される。エピトープＴＭＶまたはエピトープＴＭＶ／ＩＦＮγ（例えば）でのワクチン接種後、ＣＴＬ応答のレベルが、測定され、かつ比較される。機能的ＲＮＡの翻訳は、免疫活性を生じるタンパク質を生成し、これによりＣＴＬ応答を増大する。
【０１５９】
あるいは、ＲＮＡは、より幅広い免疫範囲についての細胞免疫応答または体液免疫応答を刺激する第２の全長抗原をコードする。例えば、黒色腫腫瘍は、病原体接種された個体においてＣＴＬ応答および抗体応答の両方を生成するいくつかの特異的な抗原を発現する。マウス腫瘍において、このような抗原としては、ｐ１５ｅ、チロシナーゼ（ｔｒｙｒｏｓｉｎａｓｅ）およびＧＰ１００が挙げられる。いくつかのＣＴＬエピトープおよび抗体刺激ドメインが、各々の腫瘍特異的抗原について存在する。規定されたＣＴＬエピトープ（例えば、ｐ１５ｅ ＣＴＬエピトープ）が、ＴＭＶの表面上に融合され、そしてキャプシドで包まれたＲＮＡが、ｇｐ１００またはチロシナーゼコード配列の全体をコードする。ｐ１５ｅエピトープに対するＣＴＬ反応性が測定され、ＲＮＡによりコードされるｇｐ１００またはチロシナーゼエピトープに対するさらなる細胞反応性または体液反応性が、生じる遺伝子産物のＲＮＡ発現および活性を示す。
【０１６０】
細胞アッセイまたは体液アッセイは、ワクチンが免疫応答を刺激するレベルを指示する。免疫反応性を示す別の方法は、抗原をコードする腫瘍で動物に病原体接種するか、腫瘍成長の速度または腫瘍が引き起こす病的状態をモニタリングすることによる。このようなモデルは、黒色腫について存在し、そして黒色腫ワクチンの有効性の原型を作るのに広範に使用される。Ｂ１６黒色腫モデルは、ｐ１５ｅ、チロシナーゼ（ｔｒｙｏｓｉｎａｓｅ）およびｇｐ１００を発現し、そして腫瘍成長の速度を減少または除去するために、ワクチン接種後の効果的なＣＴＬ応答を必要とする。ＣＴＬエピトープ融合ワクチンでワクチン接種された動物は、腫瘍で病原体接種され、そして効果的な免疫応答は、コントロールと比較しての腫瘍成長の速度または罹病率を減少させる。ＴＭＶコートまたはＴＭＶコート融合物によりキャプシドに包まれる免疫刺激ＲＮＡまたは全長遺伝子産物のいずれかが有効な場合、腫瘍成長の速度は、タンパク質ワクチンのみと比較して減少し、または全体の罹病率が、減少する。これらの発見は、細胞応答データおよび体液応答データを裏付け、これらの応答は、腫瘍を減少または除くのに必要不可欠であると考えられる。
【０１６１】
乳頭腫ウイルス適用について上に記載されるように、機能的なキャプシドで包まれたＲＮＡは、ＴＭＶのアセンブリ起点を含む操作されたアルファウイルスのように自己複製し、またはＩＲＥＳを含み、ＴＭＶ ＲＮＡの内部部位から翻訳を刺激し得る（例として、図２２を参照のこと）。上にまた記載されるように、エピトープ融合物の組み合わせは、分子結合体方法または化学結合体方法のいずれかにより作製され得、そしてペプチドに限定される必要がない。ＤＮＡ配列および全てのタンパク質はまた、再集合されるＴＭＶまたはＮ末端システインをまたコードするＴＭＶコート融合物に追加され得る。
【０１６２】
（実施例１４ ＴＭＶコートタンパク質融合物の免疫原性）
（Ｖ５コート融合物およびＭｙｃ Ｕ１コート融合物への免疫原性：抗体エピトープへの応答）
コート融合ペプチドが適切な免疫を刺激し得ることを確かめるために、本発明者らは、マウスにおけるワクチンとして、公知の抗体結合特性を有する、ｍｙｃペプチド融合物およびＶ５ Ｕ１ペプチド融合物を試験し、次いで、抗ｍｙｃ抗体応答および抗Ｖ５抗体応答を探した。Ｖ５コート融合物およびｍｙｃ ＴＭＶ Ｕ１コート融合物が、目的の融合物の回収の為に最適化された抽出法により調製された。材料を、ＢＣＡタンパク質アッセイにより定量化し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりペプチドの完全性についてそしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度について評価した。次いで、１０μｇのＴＭＶタンパク質が、Ｂａｌｂ−Ｃマウスに、２週間毎に３回注入される。第２のワクチン接種の後および第３のワクチン接種の後に、動物が、採血され、そして血清が、集められ、ＥＬＩＳＡによりペプチド特異的反応性について分析された。第３のワクチン接種の後の血清滴定の結果を、図２３に示し、これは２回のワクチン接種の後に観察されるレベルから高められる。
【０１６３】
この研究からの結果は、３つ全ての位置、Ｖ５およびｍｙｃペプチド融合物、ＴＭＶ Ｕ１コートが、アジュバントが与えられない場合でさえ、適切な抗ペプチド抗体応答を誘導し得ることを指示する。個々のマウスにおける変化した応答レベルは、サブユニットワクチンの代表的なものであり、そして他の抗原ワクチンについて観察された。全体にわたって、試験される各々のワクチン接種群における平均的応答は、最大応答レベルが各々の群において有意に異なった場合でさえ、ペプチド融合物の位置により有意には異ならなかった。興味深いことに、ＴＭＶキャリアへの応答は、一般に大きさにおいて抗ペプチド応答よりもより低かった（データは示さず）。注目すべきことに、これらのワクチンは、アジュバントなしで投与され、各々の群における高いレベルの応答が、ウイルスキャリアが抗原特異的である体液免疫刺激を提供し得ることを示す。
【０１６４】
（ＯｖａペプチドＵ１コート融合物についてのＣＴＬ応答アッセイ開発）
ワクチン接種したマウスにおける適切な体液応答を刺激する抗体−標的ペプチドの能力を試験することに加えて、本発明者らはまた、トリオボアルブミンタンパク質から得られるＣＴＬエピトープの能力を試験し、適切にＭＨＣ制限したマウスにおける細胞免疫を刺激した。２０μｇのＯｖａ−Ｎ融合物またはＯｖａ−Ｇ ＴＭＶ融合物を、マウスへアジュバントなしで２週間毎に４回投与し、次いで脾臓を、最後のワクチン接種の５日後にワクチン接種した動物から採取した。細胞を単離し、ゴルジ輸送インヒビターＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下で５時間の間、培地または培地プラスｏｖａペプチドで培養し、次いで細胞を、細胞内サイトカインＩＦＮガンマまたはＴＮＦアルファのＰＥ染色と共に、ＣＤ４ Ｔ細胞レセプターまたはＣＤ８ Ｔ細胞レセプターの表面発現に対してＦＩＴＣ結合した抗体で蛍光染色した。ｏｖａペプチドでの刺激が、ペプチドに特異的であるＴ細胞におけるこれらのサイトカインをアップレギュレートし、これは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞数における増加により測定される。５×１０５の事象が集められ、その約２０％は、Ｔ細胞である。
【０１６５】
ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方を、ＩＦＮγ（ガンマ）およびＴＮＦα（アルファ）の増加した細胞内発現についてモニタリングした。図２４に示されるとおり、５時間のペプチド刺激後、ＣＤ４陽細胞（ゲートで制御される事象の０．０８％〜０．１７％または１０〜２２細胞）、およびＣＤ８陽細胞（ゲートで制御される事象の０．０８％〜０．１３％または１１〜１７細胞；データは示さず）において、細胞内ＩＦＮガンマレベルが上昇し、これは、統計学的に有意な増加を表す。ＴＮＦアルファレベルは、ＣＤ４＋細胞において有意に上昇したが（０．０８％〜０．１３％）、ＣＤ８＋細胞において変化しなかった（０．１２％〜０．１０％；データは示さず）。
【０１６６】
アジュバントがワクチンと共に投与されなかったことを考慮すると、サイトカインレベルにおけるこれらの中程度の増加は、ワクチンが適切な細胞応答を刺激していることを示唆する。ワクチンと一緒でのアジュバントの投与、またはＴＭＶワクチンに対する免疫刺激ペプチドの融合は、活性化Ｔ細胞のパーセンテージを増加すると予期される。例えば、Ｔ細胞活性化アジュバント、一本鎖ＣｐＧ ＤＮＡオリゴ１７５８は、ｏｖａ系または他のＣＴＬ系における細胞応答を特異的に増大する。本発明者らの系について、ヌクレオチドが、ワクチンと混合され、またはＴＭＶ Ｕ１と直接融合される。他の系において、ＩＬ１ｂペプチドが、抗体応答およびＣＴＬ応答の両方を高めることが示されたが、これはＩＬ１ｂペプチドが、多価ワクチンにおいてのように、ｏｖａペプチドワクチンに物理的に結合する場合のみである。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、化学的融合を通じた多価ワクチンの生成のための標準的な方法を概略する流れ図である。
【図２】図２は、翻訳可能なＲＮＡ種を足場として使用することを通じて二機能性であり得る、化学的融合を通じた多価ＴＭＶベースのワクチンを生成するための方法を概略する流れ図である。
【図３】図３は、遺伝子融合を通じた多価ワクチンの生成のための標準的な方法を概略する流れ図である。
【図４】図４は、翻訳可能なＲＮＡ種を足場として使用することを通じて二機能性であり得る、遺伝子融合を通じた多価ＴＭＶベースのワクチンを生成するための方法を概略する流れ図である。
【図５】図５は、ＴＭＶビリオンジアセンブリおよびインビトロビリオン再アセンブリの提供であり、左から右に向かって：単一ＴＭＶビリオンの電子顕微鏡図；個々のＴＭＶコートタンパク質の空白詰めモデル（表面に曝されたＮ末端ドメイン（Ｎ）およびＣ末端ドメイン（Ｃ）ならびに表面に曝されたループ（ＳＬ）を略図配置した）；２０Ｓディスクサブユニットの空間詰めモデル；およびＲＮＡを取り囲む再構築されたＶＬＰ。
【図６】図６は、改変されたＴＭＶ ２０Ｓサブユニットに対する種々の生物学的機能の異種ペプチドのインビトロ結合体または分子融合体および生体活性ＲＮＡを取り囲む異種ポリマー（複数ペプチドディスプレイ）ＶＬＰの再構築の概略である。
【図７】図７は、ＴＭＶ Ｕ１コートタンパク質における異なる挿入部位でのＴＭＶ−ＨＡペプチド融合体の発現レベルを示す。Ｎ．Ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物（種蒔き後２１日）に、中程度に研磨されたキャプシド形成ＲＮＡを摂取し、そして約２００μｇの組織を、感染の９〜１０日後に収集した。サンプルを、３００μｌの酢酸緩衝液（ｐＨ ５）中に挽き、そして不溶性物質を遠心分離によりペレット化した。１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で１００μｇの組織を粉砕することによって総植物タンパク質を収集した。可溶性の上清を除去し、次いで、ペレットを、最終ｐＨ抽出（ｐＨ ７）のために、２００μｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）中に再懸濁した。次いで、１０μｌの各サンプルを１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブリリアントブルー中で染色し、そして写真撮影の前に脱色した。ＨＡＮは、約１９ｋＤに、ｐＨ５不溶性ｐＨ７可溶性コート融合体として蓄積する（矢印）。ＨＡループは発現されるが、不溶性である（総ＳＤＳ粉砕物中に存在するが、可溶性フラクション５〜７には存在しない）。ＨＡ ＧＰＡＴは、発現されｐＨ５で可溶性であるが切断され、そしてｐＨ７で部分的にのみ切断される。Ｈａ Ｃは発現されｐＨ５で不溶性でありｐＨ７で可溶性であり、微量の切断産物が見える。５：酢酸緩衝液（ｐＨ５）；７：Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７）；Ｓ：ＳＤＳ ＰＡＧＥ緩衝液総組織粉砕物。
【図８】図８は、ｐｌ５ｅＴＭＶまたはｐｌ５ｅ ＤＥ ＴＭＶに感染した植物から、感染の兆候が明らかになった後、収集したＴＭＶタンパク質を示す。２０ｍｇの葉ディスク（ｌｅａｆ ｄｉｓｃ）を、酢酸緩衝液Ａ（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）／５ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、次に、不溶物質を、ｔｒｉｓ緩衝液Ｔ（５０ ｍＭ ＴＲＩＳ （ｐＨ ７． ５）／ １０ ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁し、そして物質を、総タンパク質分析のためにＳＤＳ ｐａｇｅ緩衝液Ｓ（７８ｍＭ ＴＲＩＳ（７．０）／１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム／０．０５％ ブロモフェニルブルー／６．２５％ グリセロール／１０％ β−メルカプトエタノール）中で処理した物質（全タンパク質についての分析）と比較した。次いで、物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクーマシー染色によって可視化した。コントロールは、Ｕ１（タバコモザイクウイルス株Ｕ１の野生型被膜タンパク質）である。Ｍ：タンパク質分子量標準物質。
【図９Ａ】図９Ａ（１）は、Ｎ末端システインＴＭＶ Ｕ１（配列番号１９）についての核酸組成およびアミノ酸組成を示す。あるいは、システインは、他のトバモウイルス被膜内および被膜タンパク質内の他の位置（６０ｓループ、Ｃ末端、読み過し位置）に組み込まれ得る。図９Ａ（２）は、Ｎ末端リジンＴＭＶ Ｕ１（配列番号２０）についての組成である。あるいは、リジンは、他のトバモウイルス被膜内および被膜タンパク質内の他の位置（６０ｓループ、Ｃ末端、読み過し位置）に組み込まれ得る。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＴＭＶ被膜タンパク質を含むシステインへの、グルタルアルデヒドによる化学的結合を示す。１．０ｍｇのペプチドを、１．０ｍｇのＣｙｓｔ−Ｎ ＴＭＶ（Ｃ−Ｎ）と混合し（体積１ｍｌ中）、そして２０μｌサンプルを、Ｔ＝０で取り出した。このサンプルを、２０μｌの水および４０μｌの２×ＰＡＧＥ緩衝液に加え、そして直ちに煮沸した。（Ｔ＝０における水は、その濃度をグルタルアルデヒドを加えたＴ＝４の濃度と等しくする。）グルタルアルデヒドを、反応物に終濃度が１％になるように加えた（終量２ｍｌ）。反応物を、連続的に回転させながら、４時間室温で処理した。４時間後、サンプルを、Ｔ＝４時点について取り出し、同量の２×ＰＡＧＥ緩衝液を加えて、直ちに煮沸した。各時点についての８μｌ（２μｇペプチドおよび２μｇキャリア）を、ニトロセルロースへのウェスタントランスファーのためにゲル状にロードし、そして各時点についての１６μｌ（４μｇペプチドおよび４μｇキャリア）を、クーマシー染色のためにゲル状にロードした。
【図１０】図１０は、ＴＭＶ野生型およびｍｙｃまたはＶ５ Ｎ末端の融合ウイルスの遷移電子ミクログラフ（ＴＥＭ）画像である。ＴＭＶ、ＴＭＶ−ｍｙｃ−ＮまたはＴＭＶ−Ｖ５−Ｎを、４００−メッシュの、炭素コートした銅グリッド状に、２０〜８０μｇ／ｍｌでコートした。サンプルを、次いで、１％ リンタングステン酸でネガティブ染色し、そしてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ＴＥＭを３７，０００×倍率で使用して可視化するまで、室温で保存した。バーは、１３０ｎｍを表す。
【図１１】図１１（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１ウイルスの感染植物材料からの精製についての流れ図を示す。図１１（Ｂ）は、感染Ｎ ｔａｂａｃｕｍ ＭＤ６０９植物からのＴＭＶ Ｕ１の単離についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１０−２０％ ｔｒｉｓ−グリシンゲル）である。ウイルスの大部分はＳ１上清に分配されたため、Ｓ２上清は処理しなかった。ＧＪは、グリーンジュース；Ｓ１は、上清Ｓ１； Ｓ１ ＰＥＧ１は、第１ＰＥＧ沈殿からのウイルスの懸濁物；Ｓ１ ＰＥＧ２は、第２ＰＥＧ沈殿からのウイルスの懸濁物である。
【図１２】図１２は、システインＮ被膜タンパク質融合体についてのＳ１処理流れとＳ２処理流れとの間に分配されるウイルスに対する、塩の効果を表すＳＤＳゲル（１０−２０％ ｔｒｉｓ−グリシンゲル）を示す。ＧＪは、最初のグリーンジュース；Ｓ１は、Ｓ１処理流れ；Ｓ２は、Ｓ２処理流れである。
【図１３】図１３は、ＴＭＶウイルスのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）存在下における沈殿についての流れ図を示す。
【図１４】図１４は、ＴＭＶウイルスからの遊離の被膜タンパク質の産生についての流れ図を示す。
【図１５】図１５（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１被膜タンパク質（ｐＨ８．０）についての紫外線吸収スペクトルを示す。図１５（Ｂ）および図１５（Ｃ）は、Ｍｙｃ Ｎ被膜タンパク質をＤＥＡＥセファロースで処理して夾雑する残留ＲＮＡを除去し、ＤＥＡＥ樹脂処理前（Ｂ）と処理後（Ｃ）で紫外線吸収スペクトルを比較したもの。図１５（Ｄ）は、Ｍｙｃ Ｎ被膜タンパク質をＤＥＡＥセファロースで処理して夾雑する残留ＲＮＡを除去し、夾雑ＲＮＡを追跡するために行ったアガロースゲル電気泳動である。初期被膜（Ｌ）のＤＥＡＥ樹脂への結合後、被膜タンパク質を５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し（Ｅ５０）、ＲＮＡ非含有調製物を得た。樹脂からＲＮＡを溶出するために、５００ｍＭのＮａＣｌが必要だった（Ｅ５００）。ＦＴは、樹脂フロースルー液を表す。
【図１６】図１６（Ａ）は、ＴＭＶ Ｕ１被膜タンパク質のクロマトグラム（室温でのインキュベーションの前および後に、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析した）における変化を示す。図１６（Ａ）は、４℃で保存した被膜タンパク質のクロマトグラムプロフィールである。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００カラム（５μｍビーズ；穴のサイズ ３０ｎｍ）を使用し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。使用した緩衝液は、０．１Ｍリン酸緩衝液（４℃または室温（注入されたサンプルの温度に基づく）でｐＨ ７．０）であった。図１６（Ｂ）は、室温で１６時間の保存後の被膜タンパク質のクロマトグラムプロフィールである。ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ−３００カラム（５μｍビーズ；穴のサイズ ３０ｎｍ）を使用し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。使用した緩衝液は、０．１Ｍホスフェート（４℃または室温（注入されたサンプルの温度に基づく）でｐＨ ７．０）であった。
【図１７】図１７（Ａ）は、ウイルスＲＮＡおよびＵ１被膜タンパク質からのビリオン再構築（その後、３１０ｎｍでの溶液の濁りが増す）の動態学を示す。これは、平均ロッド長にほぼ比例する。その開始ＲＮＡと同モル濃度のＴＭＶウイルスを使用し、インビトロキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）における完全な再構築の吸光度を示した。（１）標準ＩＶＥ条件；０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）。（２） ＲＮａｓｉｎ（０．４Ｕ／μｌ）含有０．１Ｍホスフェート（ｐＨ ７．２）。（３）０．１ Ｍピロリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．２）。図１７（Ｂ）は、ＲＮＡ完全性を評価するための、最終アセンブリ反応物のアガロースゲル電気泳動である。ＲＮＡコントロールは、被膜タンパク質欠損ＲＮＡである；ＰＯ４は、リン酸緩衝化再アセンブリ反応物である；Ｐｙｒｏ ＰＯ４は、ピロリン酸緩衝化再アセンブリ反応物である；Ｐ０４ ＲＮａｓｉｎは、ＲＮａｓｉｎ含有リン酸緩衝化再アセンブリ反応物である。
【図１８】図１８（Ａ）は、ＲＮａｓｉｎ存在下および非存在下でのＥＬＤＫＷＡＳ被膜タンパク質融合による再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを、示す。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、再アセンブリ反応物中のＲＮＡと同モル濃度で存在する。図１８（Ｂ）は、開始５時間後の再アセンブリ反応物のアガロースゲル電気泳動である。再アセンブリ反応を、ＲＮａｓｉｎの存在下（＋）または非存在下（−）で行い、使用した被膜タンパク質を示した。再アセンブリ反応物中の濃度と同濃度で、ＲＮＡ単独をコントロールとして泳動した。
【図１９】図１９は、遷移電子検鏡（ＴＥＭ）で可視化した再アセンブリ反応の画像およびデータ分析を示す。サンプルを、１％リンタングステン酸でネガティブ染色し、乾燥させ、そしてＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ＴＥＭを３７，０００×倍率で使用して可視化するまで、室温で保存した。（Ａ）被膜タンパク質コントロールサンプル（ＲＮＡ非存在）。（Ｂ）（Ａ）と同じ被膜タンパク質濃度で、ＴＭＶ ＲＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）存在下での再アセンブリ反応。画像は、ＲＮａｓｉｎ存在下で行った再アセンブリ反応についてのものである。スケールバーは２００ｎｍを表す。（Ｃ） ＥＬＤＫＷＡＳ被膜タンパク質融合体を用い、ＲＮａｓｉｎ存在下および非存在下で行った再アセンブリ反応についての基準化粒子サイズ分布の比較。ｎは、電子検鏡画像で係数したロッドの数を示す。
【図２０】図２０（Ａ）は、ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２タンパク質融合体を用い、全てＲＮａｓｉｎ存在下で行った分離再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを示す。野生型ＴＭＶを、足場として使用した。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、ＲＮＡと同じモル濃度で再アセンブリ反応物中に存在した。ＲＮＡ単独のコントロールもまた示すが、被膜タンパク質単独ならびにＨＰＶ ｅｐ２ウイルスおよびＭｙｃウイルスのコントロールは、明瞭さのために省略する。図２０（Ｂ）は、ＥＬＤＫＷＡＳ、ＭｙｃおよびＨＰＶ ｅｐ２被膜タンパク質融合体（対の組み合わせで用いる）を用いた二価再アセンブリ反応（ＩＶＥ）についてのＡ３１０ｎｍ動態学プロフィールを示す。全ての再アセンブリ反応は、ＲＮａｓｉｎ存在下で行い、野生型ＴＭＶＲＮＡを足場として使用した。ＥＬＤＫＷＡＳウイルスコントロールは、ＲＮＡと同じモル濃度で再アセンブリ反応物中に存在した。ＲＮＡ単独のコントロールもまた示すが、被膜タンパク質単独ならびにＨＰＶ ｅｐ２ウイルスおよびＭｙｃウイルスのコントロールは、明瞭さのために省略する。
【図２１】図２１は、ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥデータを示す。（Ａ）精製ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのスペクトルを示すＭＡＬＤＩ ＴＯＦ追跡。Ｍｅｔで切断されたタンパク質についての推定の配列重量は、１９３２０ Ｄａであり、観察された分子量と完全に一致する。（Ｂ）ＣＲＰＶ ２．１被膜タンパク質融合体についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、タンパク質の純度が最終ウイルス調製物９７％以上であることを示す。
【図２２】図２２は、多価ＴＭＶベースのワクチンの再アセンブリの足場として使用され得、そのコードする遺伝子に起因して再構築ビリオンに二官能性を与える種々のＲＮＡ構築物を示す。（Ａ） 構造遺伝子または非構造遺伝子を含むＴＭＶ ＲＮＡ。（Ｂ）ＩＲＥＳ構造遺伝子またはＩＲＥＳ非構造遺伝子を含むＴＭＶ ＲＮＡ。（Ｃ）ＴＭＶ ＯＡＳおよび構造遺伝子または非構造遺伝子を含むαウイルスレプリコン。（Ｄ）構造遺伝子、非構造遺伝子または免疫調節遺伝子を有するＴＭＶ ＯＡＳおよびＯｍｅｇａを含むキメラｍＲＮＡ。（Ｅ） 構造遺伝子、非構造遺伝子または免疫調節遺伝子を有するＴＭＶ ＯＡＳを含むキメラｍＲＮＡ。例示の目的で、この図はＲＮＡ構築物中にＣＲＰＶ Ｌ１遺伝子またはＣＲＰＶ Ｅ７遺伝子を示す。しかし、黒色腫関連遺伝子（例えば、ｐｌ５ｅ、ＧＰ１００または任意の他の構造遺伝子もしくは非構造遺伝子が、これらのＣＲＰＶ関連遺伝子と置き換わり得る。
【図２３】図２３は、ＴＭＶ被膜融合ワクチンに対する体液応答を、ペプチドに対するＥＬＩＳＡで測定して示す。血清を、ワクチン３後（ｐＶ３）１０日目に収集し、ｃ−ｍｙｃ−ＢＳＡ結合体または外来抗原（ＦＮＲ）Ｖ５融合体でコートしたＥＬＩＳＡプレート上で連続希釈した。プレートを、次いで抗マウスＨＲＰで反応させ、陽性を比色定量基質を使用して可視化し、そして統計学的ソフトウェアを使用して定量した。市販の陽性コントロールを、基準物質として用いた。
【図２４】図２４は、ＴＭＶ ｏｖａ Ｇワクチン接種に対する細胞性応答を、蛍光支持セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定して示す。ＴＭＶ ｏｖａ Ｇワクチン接種された動物から脾臓を収集し、そして次いで、１μｇ／ｍｌのｏｖａペプチドと共にブレフェルディンＡ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）存在下で５時間培養した。次いで細胞を固定し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体または抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、次いで再固定し、そして透過処理した。細胞を、次いで抗ＩＦＮ−ＰＥまたは抗ＴＮＦ−ＰＥと共にインキュベートし、次いでＰＥ染色およびＦＩＴＣ染色について、フローサイトメトリを使用して可視化した。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞で発現し得る遺伝子をコードするＲＮＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＴＭＶウイルスを分解する工程；
ｂ）キャプシドに包まれた中間体（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）（２０Ｓディスク）集団の１つ以上の群を形成する工程；
ｃ）キャプシドに包まれた中間体（２０Ｓディスク）の１つ以上の群の一部分を混合する工程；
ｄ）１つ以上のキャプシドに包まれた中間体（２０Ｓディスク）のインタクトなＶＬＰを形成し、該中間体は、遺伝子をコードするＲＮＡを囲み、配列の再配置が哺乳動物細胞における翻訳および遺伝子発現、ならびにＶＬＰ構造によって哺乳動物細胞または組織に送達するためのＲＮＡの安定化を可能にする、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
多重の異なる組成の、ペプチドまたはタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）遺伝子融合を介して異なるペプチドまたはタンパク質を各々提示する、別個のウイルスまたはＶＬＰ集団を分解する工程；
ｂ）異なるペプチドまたはタンパク質を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程；
ｃ）異なる集団由来のキャプシドで包まれた中間体を混合する工程；
ｄ）異なるキャプシドで包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成する工程であって、その結果、該ＶＬＰが１つ以上のペプチドまたはタンパク質を提示する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、以下：
前記ＶＬＰは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、該粒子は、多重の異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含み；
前記分解工程において、前記別個のウイルスまたはＶＬＰ集団がＴＭＶ集団であり；そして
前記第一の形成工程、混合工程、および第二の形成工程において、前記キャプシドに包まれた中間体集団が、２０Ｓディスクである、方法。
【請求項４】
多重の異なる組成のペプチド、タンパク質または核酸部分を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）遺伝子融合によって提供される化学結合のための表面残基を有するウイルスまたはＶＬＰ集団を分解する工程；
ｂ）キャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程；
ｃ）いくつかの別個のキャプシドに包まれた中間体集団の各々に対して、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｄ）核酸足場の存在下において、異なる集団由来のキャプシドに包まれた中間体を混合する工程；
ｅ）異なるキャプシドに包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成する工程であって、その結果、該ＶＬＰは、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはそれらの組み合わせのような、１つより多い部分を提示する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
１つ以上の、提示された異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含むＴＭＶウイルスを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）以下を有するＴＭＶ発現ベクターを構築する工程であって：
ｉ）哺乳動物細胞における発現のための遺伝子であって、該遺伝子は、ＴＭＶ３０ｋＤａ移動タンパク質内に存在する内部リボソーム開始配列（ＩＲＥＳ）の３’下流に配置されるか、または３０ｋＤａ移動タンパク質遺伝子の３’下流に別個に配置されている、遺伝子；
ｉｉ）哺乳動物における発現のための遺伝子の下流にある非ネイティブサブゲノムプロモーターから発現されるコートタンパク質；
ｉｉｉ）遺伝子融合によって提供される、ペプチド配列、タンパク質および／または化学結合のための表面残基の発現のための遺伝子融合のいずれかを有するコートタンパク質；
ｂ）ペプチド、タンパク質および／または表面残基を発現する該ＴＭＶウイルスを精製する工程；
ｃ）特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合を、精製されたＴＭＶウイルスにもたらす工程；
ｄ） 該ＲＮＡ発現構築物の安定化および哺乳動物の細胞または組織への送達のために、遺伝子融合ペプチドおよび／または化学融合ペプチドを有するＴＭＶウイルスを使用する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
多重の異なる組成のペプチド、タンパク質または核酸を含むＴＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）別個のＴＭＶ集団を分解する工程であって、該集団の各々は、遺伝子融合によって提供された化学結合のための特有の残基を有する、工程；
ｂ）該別個のＴＭＶ集団からキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスク集団を形成する工程；
ｃ）該キャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクの別個の集団に、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｄ）核酸足場の存在下において、異なる集団に由来する少なくとも２つの異なるキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクを混合する工程；
ｅ）少なくとも２つ異なるキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクから構成される核酸コアを囲むインタクトなＴＭＶ ＶＬＰを形成し、その結果、該ＶＬＰは、１つより多い部分を提示する工程であって、該１つより多い部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはそれらのいくつかの組み合わせである、工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項７に記載の方法であって、各々異なる集団に由来する、多重の異なるキャプシドに包まれた中間体を混合する工程が、前記形成工程において、前記ＶＬＰが、多数の部分を提示するように混合され、該多数の部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはこれらの部分のいくつかの組み合わせである、方法。
【請求項８】
前記形成工程において、前記ＶＬＰが、少なくとも３つのペプチド、タンパク質または核酸を提示する、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
プロセスによって提示される、多重の異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）別個のＶＬＰ集団を分解する工程であって、該集団の各々は、異なるペプチドまたはタンパク質を遺伝子融合によって各々提示する工程；
ｂ）遺伝子融合によって提供される化学結合のための表面残基を有する別個のＶＬＰ集団を分解する工程；
ｃ）以下のようなキャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程：
ｉ）別個のペプチドまたはタンパク質を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団および
ｉｉ）化学結合のための表面残基を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団
ｄ）化学結合のための表面残基を提示する該キャプシドに包まれた中間体の別個の集団に、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｅ）遺伝子融合によってペプチドまたはタンパク質を提示するか、あるいは化学結合によってペプチド、タンパク質または核酸を提示する別個の集団由来のキャプシドに包まれた中間体を混合する工程；
ｆ）異なるキャプシドに包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成し、その結果、該ＶＬＰが、１つより多い部分を提示し、該１つより多い部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはこれらの部分のいくつかの組み合わせである、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記ＶＬＰがＴＭＶウイルスであり、該キャプシドに包まれた中間体が２０Ｓディスクである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
化学結合のための前記残基を提示する前記キャプシドに包まれた中間体への、特有のペプチドおよび／または核酸部分の前記化学結合が、核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰの形成後に実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、２つ以上の生物に免疫応答を誘導する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１３】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、１つ以上のエピトープに対する免疫応答を宿主に誘導する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１４】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、宿主における促進された細胞取り込みを示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１５】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、宿主細胞におけるそれらの免疫刺激機能または調節機能を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成される多価のＶＬＰを構築するための足場として機能する核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰが、以下の機能：
体液性免疫応答の誘導、
細胞性免疫応答の誘導、または
宿主免疫応答の刺激または調節
の１つ以上についての遺伝子を含む核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰが、以下：
インタクトなウイルス抗原または一部分のウイルス抗原、
インタクトな細菌抗原または一部分の細菌抗原、
インタクトなマイコプラズム抗原または一部分のマイコプラズム抗原、
インタクトな真核生物病原抗原または一部分の真核生物病原抗原、および
サイトカイン、
ケモカイン、ならびに
ケモカイン、サイトカインまたは宿主免疫応答を調節し得る細胞レセプター部分
の１つ以上についての遺伝子を含む核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰは、前記表面上に提示される前記部分および／または前記核酸コアに関連する機能性によって、ワクチン、抗アレルギー医薬、診断剤またはコンビナトリアル化学薬剤としての機能を必要とされる特徴を有する、ＶＬＰ。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰは、以下：
ＲＮＡ部分であって、以下の群：
哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子を含むＴＭＶ発現ベクター；
哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子の上流に内部リボソーム開始配列（ＩＲＥＳ）を含むＴＭＶ発現ベクター；
アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
ＴＭＶωＲＮＡリーダー、アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
αウイルスレプリコンのアセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
ルビウイルスレプリコンのアセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
該アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）を含むノダウイルスレプリコンおよび哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；ならびに
該アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）を含むフラビウイルスレプリコンおよび哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子、
由来のいずれか１つを含む、ＶＬＰ。
【請求項２１】
特異的な化学結合反応を強めるための、タバコモザイクウイルスビリオンの表面上に対になってないシステイン残基を提示される表面を含むＶＬＰであって、ＴＭＶコートタンパク質のＮ、Ｃまたは表面に露出されたループにおいて、対になっていないシステイン残基の遺伝子発現によって構築される、ＶＬＰ。
【請求項２２】
特異的な化学結合反応を強めるための、タバコモザイクウイルスビリオンの表面上にリジン残基を提示される表面を含むＶＬＰであって、ＴＭＶコートタンパク質のＮ、Ｃまたは表面に露出されたループに、リジン残基の遺伝子発現によって構築される、ＶＬＰ。
【請求項２３】
ペプチド融合物またはタンパク質全体を提示するＴＭＶまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）提示されるエピトープに依存して、１％〜１０％の経験的に決定された濃度で、Ｓ１またはＳ２の上清を含むウイルスにＰＥＧを添加する工程；
ｂ）すでにＳ１またはＳ２の上清に存在していない場合、４％ ｗ／ｖまで塩を添加する工程；
ｃ）３０分間〜１時間にわたって４℃にて上清を冷やす工程
ｄ）遠心分離によって沈殿されたウイルスを回収する工程；および
ｃ）純度を高めるために、該ウイルスを再懸濁し、該プロセスを繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
以下：
ＴＭＶコートタンパク質に遺伝的に融合され、かつコート融合蓄積および／もしくは感染された植物宿主からの抽出を改善するために導入されたさらなる荷電アミノ酸に隣接される、目的のペプチドまたはタンパク質
を含む、コートタンパク質融合物。
【請求項２５】
前記コートタンパク質融合物が、配列番号２２を含む、請求項２４に記載のコートタンパク質融合物。
【請求項１】
真核生物細胞で発現し得る遺伝子をコードするＲＮＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）ＴＭＶウイルスを分解する工程；
ｂ）キャプシドに包まれた中間体（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）（２０Ｓディスク）集団の１つ以上の群を形成する工程；
ｃ）キャプシドに包まれた中間体（２０Ｓディスク）の１つ以上の群の一部分を混合する工程；
ｄ）１つ以上のキャプシドに包まれた中間体（２０Ｓディスク）のインタクトなＶＬＰを形成し、該中間体は、遺伝子をコードするＲＮＡを囲み、配列の再配置が哺乳動物細胞における翻訳および遺伝子発現、ならびにＶＬＰ構造によって哺乳動物細胞または組織に送達するためのＲＮＡの安定化を可能にする、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
多重の異なる組成の、ペプチドまたはタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）遺伝子融合を介して異なるペプチドまたはタンパク質を各々提示する、別個のウイルスまたはＶＬＰ集団を分解する工程；
ｂ）異なるペプチドまたはタンパク質を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程；
ｃ）異なる集団由来のキャプシドで包まれた中間体を混合する工程；
ｄ）異なるキャプシドで包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成する工程であって、その結果、該ＶＬＰが１つ以上のペプチドまたはタンパク質を提示する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、以下：
前記ＶＬＰは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、該粒子は、多重の異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含み；
前記分解工程において、前記別個のウイルスまたはＶＬＰ集団がＴＭＶ集団であり；そして
前記第一の形成工程、混合工程、および第二の形成工程において、前記キャプシドに包まれた中間体集団が、２０Ｓディスクである、方法。
【請求項４】
多重の異なる組成のペプチド、タンパク質または核酸部分を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）遺伝子融合によって提供される化学結合のための表面残基を有するウイルスまたはＶＬＰ集団を分解する工程；
ｂ）キャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程；
ｃ）いくつかの別個のキャプシドに包まれた中間体集団の各々に対して、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｄ）核酸足場の存在下において、異なる集団由来のキャプシドに包まれた中間体を混合する工程；
ｅ）異なるキャプシドに包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成する工程であって、その結果、該ＶＬＰは、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはそれらの組み合わせのような、１つより多い部分を提示する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
１つ以上の、提示された異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含むＴＭＶウイルスを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）以下を有するＴＭＶ発現ベクターを構築する工程であって：
ｉ）哺乳動物細胞における発現のための遺伝子であって、該遺伝子は、ＴＭＶ３０ｋＤａ移動タンパク質内に存在する内部リボソーム開始配列（ＩＲＥＳ）の３’下流に配置されるか、または３０ｋＤａ移動タンパク質遺伝子の３’下流に別個に配置されている、遺伝子；
ｉｉ）哺乳動物における発現のための遺伝子の下流にある非ネイティブサブゲノムプロモーターから発現されるコートタンパク質；
ｉｉｉ）遺伝子融合によって提供される、ペプチド配列、タンパク質および／または化学結合のための表面残基の発現のための遺伝子融合のいずれかを有するコートタンパク質；
ｂ）ペプチド、タンパク質および／または表面残基を発現する該ＴＭＶウイルスを精製する工程；
ｃ）特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合を、精製されたＴＭＶウイルスにもたらす工程；
ｄ） 該ＲＮＡ発現構築物の安定化および哺乳動物の細胞または組織への送達のために、遺伝子融合ペプチドおよび／または化学融合ペプチドを有するＴＭＶウイルスを使用する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
多重の異なる組成のペプチド、タンパク質または核酸を含むＴＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）別個のＴＭＶ集団を分解する工程であって、該集団の各々は、遺伝子融合によって提供された化学結合のための特有の残基を有する、工程；
ｂ）該別個のＴＭＶ集団からキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスク集団を形成する工程；
ｃ）該キャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクの別個の集団に、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｄ）核酸足場の存在下において、異なる集団に由来する少なくとも２つの異なるキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクを混合する工程；
ｅ）少なくとも２つ異なるキャプシドに包まれた中間体２０Ｓディスクから構成される核酸コアを囲むインタクトなＴＭＶ ＶＬＰを形成し、その結果、該ＶＬＰは、１つより多い部分を提示する工程であって、該１つより多い部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはそれらのいくつかの組み合わせである、工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項７に記載の方法であって、各々異なる集団に由来する、多重の異なるキャプシドに包まれた中間体を混合する工程が、前記形成工程において、前記ＶＬＰが、多数の部分を提示するように混合され、該多数の部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはこれらの部分のいくつかの組み合わせである、方法。
【請求項８】
前記形成工程において、前記ＶＬＰが、少なくとも３つのペプチド、タンパク質または核酸を提示する、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
プロセスによって提示される、多重の異なる組成のペプチドまたはタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）別個のＶＬＰ集団を分解する工程であって、該集団の各々は、異なるペプチドまたはタンパク質を遺伝子融合によって各々提示する工程；
ｂ）遺伝子融合によって提供される化学結合のための表面残基を有する別個のＶＬＰ集団を分解する工程；
ｃ）以下のようなキャプシドに包まれた中間体集団を形成する工程：
ｉ）別個のペプチドまたはタンパク質を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団および
ｉｉ）化学結合のための表面残基を各々提示するキャプシドに包まれた中間体集団
ｄ）化学結合のための表面残基を提示する該キャプシドに包まれた中間体の別個の集団に、特有のペプチド、タンパク質または核酸部分の化学結合をもたらす工程；
ｅ）遺伝子融合によってペプチドまたはタンパク質を提示するか、あるいは化学結合によってペプチド、タンパク質または核酸を提示する別個の集団由来のキャプシドに包まれた中間体を混合する工程；
ｆ）異なるキャプシドに包まれた中間体から構成される核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰを形成し、その結果、該ＶＬＰが、１つより多い部分を提示し、該１つより多い部分は、ペプチド、タンパク質または核酸、あるいはこれらの部分のいくつかの組み合わせである、工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前記ＶＬＰがＴＭＶウイルスであり、該キャプシドに包まれた中間体が２０Ｓディスクである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
化学結合のための前記残基を提示する前記キャプシドに包まれた中間体への、特有のペプチドおよび／または核酸部分の前記化学結合が、核酸コアを囲むインタクトなＶＬＰの形成後に実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、２つ以上の生物に免疫応答を誘導する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１３】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、１つ以上のエピトープに対する免疫応答を宿主に誘導する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１４】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、宿主における促進された細胞取り込みを示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１５】
前記多重の異なるペプチド、タンパク質または核酸部分が、前記ＶＬＰ上に提示され、その結果、該ＶＬＰが、宿主細胞におけるそれらの免疫刺激機能または調節機能を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＶＬＰ。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって生成される多価のＶＬＰを構築するための足場として機能する核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰが、以下の機能：
体液性免疫応答の誘導、
細胞性免疫応答の誘導、または
宿主免疫応答の刺激または調節
の１つ以上についての遺伝子を含む核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰが、以下：
インタクトなウイルス抗原または一部分のウイルス抗原、
インタクトな細菌抗原または一部分の細菌抗原、
インタクトなマイコプラズム抗原または一部分のマイコプラズム抗原、
インタクトな真核生物病原抗原または一部分の真核生物病原抗原、および
サイトカイン、
ケモカイン、ならびに
ケモカイン、サイトカインまたは宿主免疫応答を調節し得る細胞レセプター部分
の１つ以上についての遺伝子を含む核酸部分を含む、ＶＬＰ。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰは、前記表面上に提示される前記部分および／または前記核酸コアに関連する機能性によって、ワクチン、抗アレルギー医薬、診断剤またはコンビナトリアル化学薬剤としての機能を必要とされる特徴を有する、ＶＬＰ。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって作製されるＶＬＰであって、該ＶＬＰは、以下：
ＲＮＡ部分であって、以下の群：
哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子を含むＴＭＶ発現ベクター；
哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子の上流に内部リボソーム開始配列（ＩＲＥＳ）を含むＴＭＶ発現ベクター；
アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
ＴＭＶωＲＮＡリーダー、アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
αウイルスレプリコンのアセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
ルビウイルスレプリコンのアセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）および哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；
該アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）を含むノダウイルスレプリコンおよび哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子；ならびに
該アセンブリのＴＭＶ起源（ＯＡＳ）を含むフラビウイルスレプリコンおよび哺乳動物細胞における発現を介して宿主免疫応答を誘導または調節するための遺伝子、
由来のいずれか１つを含む、ＶＬＰ。
【請求項２１】
特異的な化学結合反応を強めるための、タバコモザイクウイルスビリオンの表面上に対になってないシステイン残基を提示される表面を含むＶＬＰであって、ＴＭＶコートタンパク質のＮ、Ｃまたは表面に露出されたループにおいて、対になっていないシステイン残基の遺伝子発現によって構築される、ＶＬＰ。
【請求項２２】
特異的な化学結合反応を強めるための、タバコモザイクウイルスビリオンの表面上にリジン残基を提示される表面を含むＶＬＰであって、ＴＭＶコートタンパク質のＮ、Ｃまたは表面に露出されたループに、リジン残基の遺伝子発現によって構築される、ＶＬＰ。
【請求項２３】
ペプチド融合物またはタンパク質全体を提示するＴＭＶまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）提示されるエピトープに依存して、１％〜１０％の経験的に決定された濃度で、Ｓ１またはＳ２の上清を含むウイルスにＰＥＧを添加する工程；
ｂ）すでにＳ１またはＳ２の上清に存在していない場合、４％ ｗ／ｖまで塩を添加する工程；
ｃ）３０分間〜１時間にわたって４℃にて上清を冷やす工程
ｄ）遠心分離によって沈殿されたウイルスを回収する工程；および
ｃ）純度を高めるために、該ウイルスを再懸濁し、該プロセスを繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
以下：
ＴＭＶコートタンパク質に遺伝的に融合され、かつコート融合蓄積および／もしくは感染された植物宿主からの抽出を改善するために導入されたさらなる荷電アミノ酸に隣接される、目的のペプチドまたはタンパク質
を含む、コートタンパク質融合物。
【請求項２５】
前記コートタンパク質融合物が、配列番号２２を含む、請求項２４に記載のコートタンパク質融合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２００６−５０７８００（Ｐ２００６−５０７８００Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１０７２６（Ｐ２００４−５１０７２６）
【出願日】平成１５年６月６日（２００３．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０３６０５
【国際公開日】平成１５年１２月１８日（２００３．１２．１８）
【出願人】（５０１２８０６００）ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＲＧＥ ＳＣＡＬＥ ＢＩＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月６日（２００３．６．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０１８２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０３６０５
【国際公開日】平成１５年１２月１８日（２００３．１２．１８）
【出願人】（５０１２８０６００）ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＲＧＥ ＳＣＡＬＥ ＢＩＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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