可視光細胞毒性発現能力の検定方法、及びその利用
【課題】被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定方法等を提供する。
【解決手段】哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞を回収し、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定し（第三工程）、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する（第四工程）。該検定方法の陽性対照としての、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用等も提供される。
【解決手段】哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞を回収し、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定し（第三工程）、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する（第四工程）。該検定方法の陽性対照としての、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用等も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光細胞毒性発現能力の検定方法、及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の物質等による毒性又は副作用発現の表現型の一つとして、光皮膚刺激性が知られている。光皮膚刺激性は、紫外線細胞毒性発現能力を有する物質が細胞に接触した後、太陽光を浴びることによって発現する毒性であり、太陽光の中の紫外線に起因することが知られている。
【０００３】
物質が有する紫外線によって皮膚刺激性が誘発される能力（紫外線細胞毒性発現能力）を評価する方法としては、例えば、細胞等を用いるインビトロの方法が知られている。インビトロの方法としては、被験物質を白血球に接触させて紫外線を照射する方法（特許文献１）や、被験物質を多糖類等の高分子化合物と共に紫外線照射し、該高分子化合物の光分解反応をもって評価する方法（特許文献２）が提案されている。
【０００４】
一方、紫外線ではなく可視光によって活性化される物質が見つかってきており、注目を集めている。可視光によって活性化される物質には、紫外線と同様に、可視光によって皮膚刺激性が誘発される能力（可視光細胞毒性発現能力）を有する物質（可視光細胞毒性発現物質）が存在すると考えられ、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を正しく評価し、検定する方法等が求められている。そのような検定方法等があれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定でき、その検定結果を用いて新規の可視光細胞毒性発現物質又は可視光細胞毒性発現能力を有さない物質（可視光皮膚刺激非誘発物質）を簡便に探索することが可能となる。
【特許文献１】特開平７−１９０９３６号公報
【特許文献２】特開２００１−９１５１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を正しく評価する方法は確立しておらず、効率的に可視光細胞毒性発現能力の検定を行なうことができない。さらに、可視光細胞毒性発現能力の検定に陽性対照として使用できる可視光細胞毒性発現物質も今までに殆んど知られていない。同様に、所望の新規可視光細胞毒性発現物質又は所望の新規可視光皮膚刺激非誘発物質を選抜する方法も確立しておらず、簡便に可視光細胞毒性発現物質を探索することができない。
【０００６】
本発明の目的は、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を検定する方法を提供し、同時に、該検定方法に用いることができる陽性対照物質、及び、該検定方法に用いることができる陽性対照試薬、該検定方法を用いる可視光細胞毒性発現物質の探索方法、該検定方法を用いる可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定する方法を開発すべく、哺乳動物由来の培養細胞を用いた可視光細胞毒性発現能力の評価系を構築することを試みた。その結果、被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、被験物質接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し、その生存する培養細胞の数量を測定することにより、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定することができることを見出した。さらに、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を見出した。さらに、該検定方法を用いて所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
請求項１記載の発明（以下、本発明検定方法と記すこともある。）は、下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程。
【０００９】
本発明は可視光細胞毒性発現能力の検定方法にかかり、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養した哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定し（第三工程）、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する（第四工程）。本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。
【００１０】
請求項２記載の発明は、可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１１】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、複数の波長においてエネルギー極大を有する分光分布を有する可視光を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００１２】
請求項３記載の発明は、前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１３】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、対照の哺乳動物由来の培養細胞を設定し、被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞の数量等の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞の数量等の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。尚、対照としては、例えば、陰性対照及び陽性対照の両方が適用可能である。
【００１４】
請求項４記載の発明は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１５】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。さらに、陽性対照の可視光細胞毒性発現物質が有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１６】
請求項５記載の発明は、前記可視光細胞毒性発現物質は、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンであることを特徴とする請求項４記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１７】
ベンゾ（ａ）ピレン（Benzo(a)pyrene、化学名：3,4-Benzpyrene、化学式：C20H12）は５個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。また、アクリジンイエロー（acridine yellow、化学名：2,8-diamino-3,7-dimethylacridine、化学式：C15H15N3、CAS：135-49-9）及びアクリジンオレンジ（Acridine orange、化学名：3,6-bis(dimethylamino)acridine、化学式：C17H19N3、CAS：65-61-2）はアクリジン骨格を持つ多環芳香族化合物である。また、プロフラビン（Proflavine、化学名：2,8-diaminoacridine、化学式：C13H11N3、CAS：1811-28-5）はアクリジン骨格を持つ多環芳香族化合物である。また、ジメチルベンゾアンスラセン（化学名：9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracene、化学式：C20H12）は４個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。そして、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを、陽性対照の哺乳動物由来の培養細胞に接触させる。かかる構成により、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１８】
請求項６記載の発明は、前記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１９】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法においては、第二工程の後（第三工程の前）に、「培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程」を１回以上繰り返した後、第三工程に供する。すなわち、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、被験物質を哺乳動物由来の培養細胞に反復接触させる。かかる構成により、高感度に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００２０】
請求項７記載の発明は、前記哺乳動物由来の培養細胞は、ヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ由来の初代培養細胞又は株化細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００２１】
かかる構成により、哺乳動物由来の培養細胞の取り扱いが容易となり、より簡便に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００２２】
請求項８記載の発明は、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００２３】
かかる構成により、より確実に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を発現させることができ、可視光細胞毒性発現能力の検定が容易となる。
【００２４】
請求項９記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用である。
【００２５】
本発明は、可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用にかかるものである。本発明によれば、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００２６】
請求項１０記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００２７】
本発明は陽性対照試薬にかかり、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とし、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に陽性対照試薬として使用される。本発明の陽性対照試薬を用いれば、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定における陽性対照の実験を簡便に行なうことができる。
【００２８】
請求項１１記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光細胞毒性発現物質の探索方法である。
【００２９】
本発明は可視光細胞毒性発現物質の探索方法にかかり、上記された可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光細胞毒性発現物質を簡便に探索することができる。
【００３０】
請求項１２記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法である。
【００３１】
本発明は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を提供することができる。
【００３３】
本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法によれば、所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００３５】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法は、下記工程（１）〜（４）、
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程、
を有する。
【００３６】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に使用される被験物質としては特に限定はなく、全ての化学物質が対象となるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等に適用される化学物質が被験物質として使用される。
【００３７】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法で使用される哺乳動物由来の培養細胞は、培養可能であれば特に制限はない。好ましい実施形態では、培養が容易なヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ等由来の初代培養細胞又は株化細胞が用いられる。
【００３８】
上記第一工程では、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる。哺乳動物由来の培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、５分間以上を、好ましくは３０分間以上１４日以内、より好ましくは１時間以上２４時間以内等を挙げることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
上記第一工程における被験物質接触時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％〜２０％程度等を挙げることができる。
上記第一工程における被験物質接触時の好ましい湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、より好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
【００３９】
哺乳動物由来の培養細胞に接触させる被験物質の濃度及び適用量については、特に限定はなく、被験物質の種類、予想される被験物質の可視光細胞毒性発現能力、第二工程での培養時間、第二工程での可視光照射時間等によって適宜決定すればよい。例えば、０．００１μＭ〜１０ｍＭ程度で、好ましくは０．０１μＭ〜５ｍＭ程度等を挙げることができる。
【００４０】
上記第一工程における接触系内での哺乳動物由来の培養細胞の密度としては、例えば、1×103cell／cm2〜1×105cell／cm2程度で、好ましくは3×103cell／cm2〜3×104cell／cm2程度等を挙げることができる。
【００４１】
上記第二工程では、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する。そして、被験物質が可視光細胞毒性発現能力を有する場合には、本工程でその可視光細胞毒性発現能力を発現させることができる。このとき、可視光を吸収する色素を含まない培養液を使用することが好ましい。
【００４２】
好ましい実施形態では、第一工程における接触開始後２時間以内、より好ましくは１時間以内、特に好ましくは実質的に直後（具体的には例えば、３０分間以内）に可視光の照射下で培養する。ちなみに、第一工程における接触開始後から第二工程における可視光の照射開始前までの期間において、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞は、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等の培養温度下でかつ可視光の非照射下で培養しておけばよい。また第一工程における被験物質の哺乳動物由来の培養細胞に対する１２時間以内の接触の後、当該培養細胞を洗浄・培地交換してから第二工程における可視光の照射に供することによって、細胞外にある被験物質の影響を排除し、第一工程において細胞内にとりこまれた被験物質の作用のみを評価することもできる。
上記第二工程における培養時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％〜２０％程度等を挙げることができる。
上記第二工程における培養時の湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、「可視光」は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光である。このような可視光の代表例としては、家庭用一般蛍光灯が発する光等を挙げることができる。すなわち、青色領域（４００ｎｍ付近）、緑色領域（５５０ｎｍ付近）及び桃色領域（６５０ｎｍ付近）においてエネルギー極大値を有する可視光等が挙げられる。
【００４４】
上記第二工程では、被験物質の「可視光照射下での接触時間」を調節することができる。即ち、培養時間及び可視光の照射時間を適宜設定することにより、所望の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。尚、可視光の照射は連続的又は間欠的に行なうことができる。可視光の照射を連続的に行なう場合には、培養時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、連続的な可視光照射の下で、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間培養することにより、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。一方、可視光の照射を間欠的に行なう場合には、可視光の照射時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、２４時間の培養期間中、最初の１２時間を可視光下で培養し、残りの１２時間を可視光を遮断した状態で培養することにより、１２時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。
そして、本工程における「可視光照射下での接触時間」は、例えば、３０分間以上を採用することができ、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、特に好ましくは２４時間以上である。また、哺乳動物由来の培養細胞の培養温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
【００４５】
尚、勿論、本発明検定方法における好ましい実施形態では、上記第一工程（即ち、薬剤との接触）と上記第二工程（即ち、可視光照射下での培養）とが同時に進行しながら実施してもよい。
【００４６】
好ましい実施形態では、上記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供してもよい。即ち、本実施形態では被験物質を反復接触させる。例えば、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる場合には、接触時間の進行は、当該培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去することにより止めることができるので、被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」とを繰り返すことにより、被験物質を蓄積させずに反復接触を行なうことができる。具体例を挙げると、第二工程で可視光の照射下で２４時間培養した時点で、培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに培養細胞に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第１サイクル）。可視光の照射下での培養２４時間経過時に、培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに培養細胞に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第２サイクル）。このサイクルを所望の回数だけ繰り返すことにより、反復接触を行なうことができる。一方、「洗浄・培地交換」を行なわずに被験物質を蓄積させながら反復接触させる方法も採用可能である。
【００４７】
好ましい実施形態では、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であり、より好ましくは５００〜１００００ルクスの範囲であり、特に好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。１５０ルクス以上の照射強度とすることにより、より確実に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を発現させることができる。
【００４８】
上記第三工程では、第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する。回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値は、例えば、血球計算盤を用いる方法、セルカウンターによる方法、３Ｈチミジン等の放射性同位体を用いる方法（３Ｈチミジン等の放射性同位体を細胞培養液に加えてインキュベートするだけで、生細胞のみを測定する簡便な方法）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）法、ニュートラルレッド（ＮＲ）を用いる方法（赤色色素ニュートラルレッドが生細胞のリソゾームに取り込まれ蓄積する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、クリスタルバイオレット（ＣＲ）を用いる方法（クリスタルバイオレットが生細胞の細胞膜に入り込んで染色する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、テトラゾリウム塩を用いる方法（テトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるテトラゾリウム塩の量が多く、その結果生じるホルマザン量が生存細胞数とよく対応するために、生細胞のみを測定する簡便な方法）等の通常用いられる方法により測定すればよい。尚、被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」との繰り返し等により被験物質の反復接触を行なうときには、各サイクルで回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定することが好ましい。
【００４９】
上記第四工程では、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する。被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する際、対照を設定せずに第三工程の測定結果の絶対値で評価してもよいし、対照を設定し、その測定結果との比較で評価してもよい。
【００５０】
好ましい実施形態では、上記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する。ここで、「対照」には陰性対照及び陽性対照の両方が設定可能である。陰性対照の例としては、可視光を照射せずに培養する哺乳動物由来の培養細胞群、照射強度が弱い可視光の照射下で培養する哺乳動物由来の培養細胞群、可視光細胞毒性発現能力を有さないことが予め分かっている物質（例えば、溶媒のみ）を接触させる哺乳動物由来の培養細胞群、等が挙げられる。このような陰性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は可視光細胞毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。
【００５１】
さらに好ましい実施形態では、前記対照は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含む。陽性対照の例としては、可視光細胞毒性発現能力を有することが予め分かっている基準物質を接触させて、可視光の照射下で培養する哺乳動物由来の培養細胞群が挙げられる。このような陽性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は陽性対照で用いた基準物質よりも高い可視光細胞毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。さらに、当該基準物質の各濃度又は各適用量において同様に評価し、検定することにより、当該被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる。この際、陽性対照と上記の陰性対照とを併用して設定してもよい。また、陽性対照の回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照のそれよりも低いことをもって、可視光の照射が正しく行われ、試験が成立したことを示すこともできる。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを基準物質として陽性対照に用いる。ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【００５３】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。
【００５４】
本発明の陽性対照試薬の１つの様相は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有する。試薬の形状としては、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンをそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
【００５５】
本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜するものである。本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。例えば、上記の陰性対照を用いる場合には、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、陰性対照よりも回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照の50％以下の値となる被験物質を選抜すればよい。
【００５６】
一方、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセン等の陽性対照が用いられる場合には、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、陽性対照よりも回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陽性対照と同じ値である時の被験物質の濃度が陽性対照の濃度よりも低い被験物質を選抜することにより、陽性対照で用いられた基準物質よりも高い可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することができる。また、陽性対照が用いられる場合には、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を定量的に評価し、検定することもできる。具体的には、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセン等の基準物質の各濃度又は各適用量において、被験物質に対して同様に評価し、検定することにより、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる、そして、所望の可視光細胞毒性発現能力をする物質を選抜する。
【００５７】
本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜するものである。本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。尚、探索の対象となる被験物質は、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、蛋白質、ペプチド等が挙げられる。
【００５８】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に基づくシステム工程を有する装置によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定をより効率的に行なうことができ、所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質をより簡便に探索することもできる。また、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって得られた可視光皮膚刺激性に関する毒性情報を電子情報記録媒体に記録することにより、毒性情報を包含する有用な電子情報記録媒体を作製することができる。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
実施例１ （可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索：その１）
本実施例では、被験物質の単回接触、１０００ルクス照射によって可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索ができることを示した。さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、該検定方法、該探索方法における陽性対照として使用できることを示した。
【００６１】
ベンゾ（ａ）ピレン（和光純薬工業）をジメチルスホキシドに溶解し、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンイエロー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンオレンジ（和光純薬工業）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．００６ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。また、ジメチルベンゾアンスラセン（関東化学）をジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。
【００６２】
大日本製薬（株）から購入したチャイニーズハムスター肺由来の接着性培養細胞株ＣＨＬ／ＩＵを使用した。当該接着性培養細胞を０．０２％トリプシンで洗った後、培養液を加えてパスツールピペットを用いて浮遊させ、細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を培養液を用いて３×１０3個／ｍＬに調製し、これを６０ｍｍプラスチック製培養シャーレに５ｍＬずつ分注した。これを３７℃、５％CO2存在下で３日間培養することにより、細胞を接着させた。
【００６３】
培養液としては、イーグルMinimum Essential Medium（MEM培地(2)、日水製薬） ５００ｍＬに下記の成分が添加されたものが用いられた。
・Bovine Serum（LIFE TECHNOLOGIES, INC.） ５６ｍＬ
・３％グルタミン（和光純薬工業） ５ｍＬ
・１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業） ６ｍＬ
このようにして、本試験に用いる接着性培養細胞を調製した。
【００６４】
次に、上記で調製された試験液を、上記で調製された接着性培養細胞が付着した培養シャーレにそれぞれ５０μLずつ添加することにより、前記接着性培養細胞と前記被験物質とを接触させた。
【００６５】
各被験物質が適用された直後に、前記の接着性培養細胞が付着した培養シャーレを、可視光の照射・非照射と培養室内の温度調整とを精密制御できる専用培養装置にて、培養温度３６．０〜３７．０℃、湿度９５±５％ｒｈの条件で、家庭用一般蛍光灯による１０００ルクスの可視光の照射下で１日間培養した。一方、陰性対照として、ジメチルスルホキシド又は被験物質を添加して可視光を照射しない群、及びジメチルスルホキシドのみを添加して被験物質群と同様に可視光を照射した群を設定した。また、各群とも１枚以上の培養シャーレで構成した。
【００６６】
培養終了後、培養液を廃棄し、当該接着性培養細胞に0.04％トリプシン液５ｍＬを加えた。パスツールピペットを用いて当該接着性培養細胞をシャーレから剥離して細胞浮遊液を調製した。当該細胞浮遊液の細胞濃度を、コールターカウンター（ベックマン・コールター）を用いて測定した。
【００６７】
上記で測定された被験物質群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表１に示した。
【００６８】
増殖率（％）＝｛被験物質群における細胞濃度｝×１００／｛陰性対照群（ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した群）における細胞濃度｝
【００６９】
表１から明らかなように、各濃度のベンゾ（ａ）ピレン、プロフラビン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、ジメチルベンゾアンスラセンにおいて、陰性対照と比較した増殖率は５０％以下の値となり、細胞毒性が発現していることが確認された。
【００７０】
さらに、被験物質を添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表２に示した。
【００７１】
表１と表２とを比較すると、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンのいずれも、可視光を照射した場合の方が可視光を照射しない場合よりも低い濃度で細胞毒性が発現していることが確認された。即ち、これらの化合物における可視光照射による細胞毒性の増強が明らかになった。
【００７２】
これは、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、１０００ルクス照射）によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光細胞毒性発現物質を探索できることが示された。
さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、本発明検定方法の陽性対照として使用できることも示された。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
実施例２ （可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索：その２）
本実施例では、被験物質の単回接触、６０００ルクス照射によって可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索ができることを示した。さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、該検定方法、該探索方法における陽性対照として使用できることを示した。
【００７６】
ベンゾ（ａ）ピレン（和光純薬工業）をジメチルスホキシドに溶解し、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンイエロー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンオレンジ（和光純薬工業）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．００８ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。また、ジメチルベンゾアンスラセン（関東化学）をジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。
【００７７】
大日本製薬（株）から購入したチャイニーズハムスター肺由来の接着性培養細胞株ＣＨＬ／ＩＵを使用した。当該接着性培養細胞を０．０２％トリプシンで洗った後、培養液を加えてパスツールピペットを用いて浮遊させ、細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を培養液を用いて３×１０3個／ｍＬに調製し、これを６０ｍｍプラスチック製培養シャーレに５ｍＬずつ分注した。これを３７℃、５％CO2存在下で３日間培養することにより、細胞を接着させた。
【００７８】
培養液としては、イーグルMinimum Essential Medium（MEM培地(2)、日水製薬） ５００ｍＬに下記の成分が添加されたものが用いられた。
・Bovine Serum（LIFE TECHNOLOGIES, INC.） ５６ｍＬ
・３％グルタミン（和光純薬工業） ５ｍＬ
・１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業） ６ｍＬ
このようにして、本試験に用いる接着性培養細胞を調製した。
【００７９】
次に、上記で調製された試験液を、上記で調製された接着性培養細胞が付着した培養シャーレにそれぞれ５０μLずつ添加することにより、前記接着性培養細胞と前記被験物質とを接触させた。
【００８０】
各被験物質が適用された直後に、前記の接着性培養細胞が付着した培養シャーレを、可視光の照射・非照射と培養室内の温度調整とを精密制御できる専用培養装置にて、培養温度３６．０〜３７．０℃、湿度９５±５％ｒｈの条件で、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光の照射下で２時間培養した。２時間の照射下培養の後、温度調整が精密に制御できる培養装置にて、可視光の非照射下で２２時間培養した。一方、陰性対照として、ジメチルスルホキシド又は被験物質を添加して可視光を照射しない群、及びジメチルスルホキシドのみを添加して被験物質群と同様に可視光を照射した群を設定した。また、各群とも１枚以上の培養シャーレで構成した。
【００８１】
培養終了後、培養液を廃棄し、当該接着性培養細胞に0.04％トリプシン液５ｍＬを加えた。パスツールピペットを用いて当該接着性培養細胞をシャーレから剥離して細胞浮遊液を調製した。当該細胞浮遊液の細胞濃度を、コールターカウンター（ベックマン・コールター）を用いて測定した。
【００８２】
上記で測定された被験物質群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表１に示した。
【００８３】
増殖率（％）＝｛被験物質群における細胞濃度｝×１００／｛陰性対照群（ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した群）における細胞濃度｝
【００８４】
表３から明らかなように、各濃度のベンゾ（ａ）ピレン、プロフラビン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、ジメチルベンゾアンスラセンにおいて、陰性対照と比較した増殖率は５０％以下の値となり、細胞毒性が発現していることが確認された。
【００８５】
さらに、被験物質を添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率果を表４に示した。
【００８６】
表３と表４とを比較すると、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンのいずれも、可視光を照射した場合の方が可視光を照射しない場合よりも低い濃度で細胞毒性が発現していることが確認された。即ち、これらの化合物における可視光照射による細胞毒性の増強が明らかになった。
【００８７】
これは、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、６０００ルクス照射）によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光細胞毒性発現物質を探索できることが示された。
さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、本検定方法の陽性対照として使用できることが示された。
【００８８】
【表３】
【００８９】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光細胞毒性発現能力の検定方法、及びその利用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の物質等による毒性又は副作用発現の表現型の一つとして、光皮膚刺激性が知られている。光皮膚刺激性は、紫外線細胞毒性発現能力を有する物質が細胞に接触した後、太陽光を浴びることによって発現する毒性であり、太陽光の中の紫外線に起因することが知られている。
【０００３】
物質が有する紫外線によって皮膚刺激性が誘発される能力（紫外線細胞毒性発現能力）を評価する方法としては、例えば、細胞等を用いるインビトロの方法が知られている。インビトロの方法としては、被験物質を白血球に接触させて紫外線を照射する方法（特許文献１）や、被験物質を多糖類等の高分子化合物と共に紫外線照射し、該高分子化合物の光分解反応をもって評価する方法（特許文献２）が提案されている。
【０００４】
一方、紫外線ではなく可視光によって活性化される物質が見つかってきており、注目を集めている。可視光によって活性化される物質には、紫外線と同様に、可視光によって皮膚刺激性が誘発される能力（可視光細胞毒性発現能力）を有する物質（可視光細胞毒性発現物質）が存在すると考えられ、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を正しく評価し、検定する方法等が求められている。そのような検定方法等があれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定でき、その検定結果を用いて新規の可視光細胞毒性発現物質又は可視光細胞毒性発現能力を有さない物質（可視光皮膚刺激非誘発物質）を簡便に探索することが可能となる。
【特許文献１】特開平７−１９０９３６号公報
【特許文献２】特開２００１−９１５１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を正しく評価する方法は確立しておらず、効率的に可視光細胞毒性発現能力の検定を行なうことができない。さらに、可視光細胞毒性発現能力の検定に陽性対照として使用できる可視光細胞毒性発現物質も今までに殆んど知られていない。同様に、所望の新規可視光細胞毒性発現物質又は所望の新規可視光皮膚刺激非誘発物質を選抜する方法も確立しておらず、簡便に可視光細胞毒性発現物質を探索することができない。
【０００６】
本発明の目的は、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を検定する方法を提供し、同時に、該検定方法に用いることができる陽性対照物質、及び、該検定方法に用いることができる陽性対照試薬、該検定方法を用いる可視光細胞毒性発現物質の探索方法、該検定方法を用いる可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、物質が有する可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定する方法を開発すべく、哺乳動物由来の培養細胞を用いた可視光細胞毒性発現能力の評価系を構築することを試みた。その結果、被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、被験物質接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し、その生存する培養細胞の数量を測定することにより、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を効率的に検定することができることを見出した。さらに、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を見出した。さらに、該検定方法を用いて所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索できることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
【０００８】
請求項１記載の発明（以下、本発明検定方法と記すこともある。）は、下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程。
【０００９】
本発明は可視光細胞毒性発現能力の検定方法にかかり、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させ（第一工程）、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養し（第二工程）、第二工程で培養した哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定し（第三工程）、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する（第四工程）。本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。
【００１０】
請求項２記載の発明は、可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１１】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、複数の波長においてエネルギー極大を有する分光分布を有する可視光を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００１２】
請求項３記載の発明は、前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１３】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、対照の哺乳動物由来の培養細胞を設定し、被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞の数量等の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞の数量等の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。尚、対照としては、例えば、陰性対照及び陽性対照の両方が適用可能である。
【００１４】
請求項４記載の発明は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１５】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を用いる。かかる構成により、より正確かつ効率的に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。さらに、陽性対照の可視光細胞毒性発現物質が有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１６】
請求項５記載の発明は、前記可視光細胞毒性発現物質は、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンであることを特徴とする請求項４記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１７】
ベンゾ（ａ）ピレン（Benzo(a)pyrene、化学名：3,4-Benzpyrene、化学式：C20H12）は５個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。また、アクリジンイエロー（acridine yellow、化学名：2,8-diamino-3,7-dimethylacridine、化学式：C15H15N3、CAS：135-49-9）及びアクリジンオレンジ（Acridine orange、化学名：3,6-bis(dimethylamino)acridine、化学式：C17H19N3、CAS：65-61-2）はアクリジン骨格を持つ多環芳香族化合物である。また、プロフラビン（Proflavine、化学名：2,8-diaminoacridine、化学式：C13H11N3、CAS：1811-28-5）はアクリジン骨格を持つ多環芳香族化合物である。また、ジメチルベンゾアンスラセン（化学名：9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracene、化学式：C20H12）は４個のベンゼン環を持つ多環芳香族炭化水素である。ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。そして、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを、陽性対照の哺乳動物由来の培養細胞に接触させる。かかる構成により、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００１８】
請求項６記載の発明は、前記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００１９】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法においては、第二工程の後（第三工程の前）に、「培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程」を１回以上繰り返した後、第三工程に供する。すなわち、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法では、被験物質を哺乳動物由来の培養細胞に反復接触させる。かかる構成により、高感度に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００２０】
請求項７記載の発明は、前記哺乳動物由来の培養細胞は、ヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ由来の初代培養細胞又は株化細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００２１】
かかる構成により、哺乳動物由来の培養細胞の取り扱いが容易となり、より簡便に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定することができる。
【００２２】
請求項８記載の発明は、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法である。
【００２３】
かかる構成により、より確実に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を発現させることができ、可視光細胞毒性発現能力の検定が容易となる。
【００２４】
請求項９記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用である。
【００２５】
本発明は、可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用にかかるものである。本発明によれば、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが有する可視光細胞毒性発現能力との比較で、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することもできる。
【００２６】
請求項１０記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とする陽性対照試薬である。
【００２７】
本発明は陽性対照試薬にかかり、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とし、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に陽性対照試薬として使用される。本発明の陽性対照試薬を用いれば、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定における陽性対照の実験を簡便に行なうことができる。
【００２８】
請求項１１記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光細胞毒性発現物質の探索方法である。
【００２９】
本発明は可視光細胞毒性発現物質の探索方法にかかり、上記された可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光細胞毒性発現物質を簡便に探索することができる。
【００３０】
請求項１２記載の発明は、請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法である。
【００３１】
本発明は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法にかかり、上記された可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする。かかる構成により、所望の可視光皮膚刺激非誘発物質を簡便に探索することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を提供することができる。
【００３３】
本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法によれば、所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質の探索を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００３５】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法は、下記工程（１）〜（４）、
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程、
を有する。
【００３６】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に使用される被験物質としては特に限定はなく、全ての化学物質が対象となるが、例えば、化粧品、医薬品、食品等に適用される化学物質が被験物質として使用される。
【００３７】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法で使用される哺乳動物由来の培養細胞は、培養可能であれば特に制限はない。好ましい実施形態では、培養が容易なヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ等由来の初代培養細胞又は株化細胞が用いられる。
【００３８】
上記第一工程では、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる。哺乳動物由来の培養細胞と被験物質との接触時間として、例えば、５分間以上を、好ましくは３０分間以上１４日以内、より好ましくは１時間以上２４時間以内等を挙げることができる。当該接触系における保温温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
上記第一工程における被験物質接触時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％〜２０％程度等を挙げることができる。
上記第一工程における被験物質接触時の好ましい湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、より好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
【００３９】
哺乳動物由来の培養細胞に接触させる被験物質の濃度及び適用量については、特に限定はなく、被験物質の種類、予想される被験物質の可視光細胞毒性発現能力、第二工程での培養時間、第二工程での可視光照射時間等によって適宜決定すればよい。例えば、０．００１μＭ〜１０ｍＭ程度で、好ましくは０．０１μＭ〜５ｍＭ程度等を挙げることができる。
【００４０】
上記第一工程における接触系内での哺乳動物由来の培養細胞の密度としては、例えば、1×103cell／cm2〜1×105cell／cm2程度で、好ましくは3×103cell／cm2〜3×104cell／cm2程度等を挙げることができる。
【００４１】
上記第二工程では、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する。そして、被験物質が可視光細胞毒性発現能力を有する場合には、本工程でその可視光細胞毒性発現能力を発現させることができる。このとき、可視光を吸収する色素を含まない培養液を使用することが好ましい。
【００４２】
好ましい実施形態では、第一工程における接触開始後２時間以内、より好ましくは１時間以内、特に好ましくは実質的に直後（具体的には例えば、３０分間以内）に可視光の照射下で培養する。ちなみに、第一工程における接触開始後から第二工程における可視光の照射開始前までの期間において、第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞は、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等の培養温度下でかつ可視光の非照射下で培養しておけばよい。また第一工程における被験物質の哺乳動物由来の培養細胞に対する１２時間以内の接触の後、当該培養細胞を洗浄・培地交換してから第二工程における可視光の照射に供することによって、細胞外にある被験物質の影響を排除し、第一工程において細胞内にとりこまれた被験物質の作用のみを評価することもできる。
上記第二工程における培養時の炭酸ガス濃度としては、例えば、０％〜２０％程度等を挙げることができる。
上記第二工程における培養時の湿度としては、例えば、９５±５％ｒｈ程度、好ましくは１００％ｒｈ程度等を挙げることができる。
【００４３】
好ましい実施形態では、「可視光」は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光である。このような可視光の代表例としては、家庭用一般蛍光灯が発する光等を挙げることができる。すなわち、青色領域（４００ｎｍ付近）、緑色領域（５５０ｎｍ付近）及び桃色領域（６５０ｎｍ付近）においてエネルギー極大値を有する可視光等が挙げられる。
【００４４】
上記第二工程では、被験物質の「可視光照射下での接触時間」を調節することができる。即ち、培養時間及び可視光の照射時間を適宜設定することにより、所望の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。尚、可視光の照射は連続的又は間欠的に行なうことができる。可視光の照射を連続的に行なう場合には、培養時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、連続的な可視光照射の下で、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間培養することにより、１時間、１２時間、２４時間又は４８時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。一方、可視光の照射を間欠的に行なう場合には、可視光の照射時間が「可視光照射下での接触時間」に相当する。例えば、２４時間の培養期間中、最初の１２時間を可視光下で培養し、残りの１２時間を可視光を遮断した状態で培養することにより、１２時間の「可視光照射下での接触時間」を実現することができる。
そして、本工程における「可視光照射下での接触時間」は、例えば、３０分間以上を採用することができ、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、特に好ましくは２４時間以上である。また、哺乳動物由来の培養細胞の培養温度としては、例えば、１５℃〜４２℃程度を、好ましくは３５℃〜４２℃程度、より好ましくは３５℃〜３７℃程度、特に好ましくは３７℃程度等を挙げることができる。
【００４５】
尚、勿論、本発明検定方法における好ましい実施形態では、上記第一工程（即ち、薬剤との接触）と上記第二工程（即ち、可視光照射下での培養）とが同時に進行しながら実施してもよい。
【００４６】
好ましい実施形態では、上記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供してもよい。即ち、本実施形態では被験物質を反復接触させる。例えば、哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる場合には、接触時間の進行は、当該培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去することにより止めることができるので、被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」とを繰り返すことにより、被験物質を蓄積させずに反復接触を行なうことができる。具体例を挙げると、第二工程で可視光の照射下で２４時間培養した時点で、培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに培養細胞に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第１サイクル）。可視光の照射下での培養２４時間経過時に、培養細胞を洗浄・培地交換して被験物質を除去する。その後ただちに培養細胞に被験物質を接触させ、可視光の照射下で再び２４時間培養する（第２サイクル）。このサイクルを所望の回数だけ繰り返すことにより、反復接触を行なうことができる。一方、「洗浄・培地交換」を行なわずに被験物質を蓄積させながら反復接触させる方法も採用可能である。
【００４７】
好ましい実施形態では、可視光の照射強度が１５０ルクス以上であり、より好ましくは５００〜１００００ルクスの範囲であり、特に好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。１５０ルクス以上の照射強度とすることにより、より確実に被験物質の可視光細胞毒性発現能力を発現させることができる。
【００４８】
上記第三工程では、第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する。回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値は、例えば、血球計算盤を用いる方法、セルカウンターによる方法、３Ｈチミジン等の放射性同位体を用いる方法（３Ｈチミジン等の放射性同位体を細胞培養液に加えてインキュベートするだけで、生細胞のみを測定する簡便な方法）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）法、ニュートラルレッド（ＮＲ）を用いる方法（赤色色素ニュートラルレッドが生細胞のリソゾームに取り込まれ蓄積する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、クリスタルバイオレット（ＣＲ）を用いる方法（クリスタルバイオレットが生細胞の細胞膜に入り込んで染色する性質を利用した方法で、生細胞のみを測定する簡便な方法）、テトラゾリウム塩を用いる方法（テトラゾリウム塩が細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素の基質であり、生存能の高い細胞ほど還元されるテトラゾリウム塩の量が多く、その結果生じるホルマザン量が生存細胞数とよく対応するために、生細胞のみを測定する簡便な方法）等の通常用いられる方法により測定すればよい。尚、被験物質の「接触」と「洗浄・培地交換」との繰り返し等により被験物質の反復接触を行なうときには、各サイクルで回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定することが好ましい。
【００４９】
上記第四工程では、第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する。被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する際、対照を設定せずに第三工程の測定結果の絶対値で評価してもよいし、対照を設定し、その測定結果との比較で評価してもよい。
【００５０】
好ましい実施形態では、上記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価する。ここで、「対照」には陰性対照及び陽性対照の両方が設定可能である。陰性対照の例としては、可視光を照射せずに培養する哺乳動物由来の培養細胞群、照射強度が弱い可視光の照射下で培養する哺乳動物由来の培養細胞群、可視光細胞毒性発現能力を有さないことが予め分かっている物質（例えば、溶媒のみ）を接触させる哺乳動物由来の培養細胞群、等が挙げられる。このような陰性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は可視光細胞毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。
【００５１】
さらに好ましい実施形態では、前記対照は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含む。陽性対照の例としては、可視光細胞毒性発現能力を有することが予め分かっている基準物質を接触させて、可視光の照射下で培養する哺乳動物由来の培養細胞群が挙げられる。このような陽性対照を用いる場合には、以下のような検定が可能となる。すなわち、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の方が低い場合には、当該被験物質は陽性対照で用いた基準物質よりも高い可視光細胞毒性発現能力を有すると評価し、検定することもできる。さらに、当該基準物質の各濃度又は各適用量において同様に評価し、検定することにより、当該被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる。この際、陽性対照と上記の陰性対照とを併用して設定してもよい。また、陽性対照の回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照のそれよりも低いことをもって、可視光の照射が正しく行われ、試験が成立したことを示すこともできる。
【００５２】
さらに好ましい実施形態では、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを基準物質として陽性対照に用いる。ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することは、本発明者らによって初めて明らかにされた。
【００５３】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。さらに、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの陽性対照としての使用も、本発明の１つである。
【００５４】
本発明の陽性対照試薬の１つの様相は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有する。試薬の形状としては、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンをそのまま用いてもよいし、溶媒に溶かして溶液状としてもよい。さらに、適宜の基剤に含有又は分散させた形状でもよい。
【００５５】
本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜するものである。本発明の可視光細胞毒性発現物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。例えば、上記の陰性対照を用いる場合には、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陰性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、陰性対照よりも回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陰性対照の50％以下の値となる被験物質を選抜すればよい。
【００５６】
一方、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセン等の陽性対照が用いられる場合には、被験物質における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果と、陽性対照における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較する。そして、陽性対照よりも回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が統計学的に有意に低い被験物質を選抜するか、又は、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値が陽性対照と同じ値である時の被験物質の濃度が陽性対照の濃度よりも低い被験物質を選抜することにより、陽性対照で用いられた基準物質よりも高い可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することができる。また、陽性対照が用いられる場合には、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を定量的に評価し、検定することもできる。具体的には、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセン等の基準物質の各濃度又は各適用量において、被験物質に対して同様に評価し、検定することにより、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を定量的に評価し、検定することができる、そして、所望の可視光細胞毒性発現能力をする物質を選抜する。
【００５７】
本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法は、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜するものである。本発明の可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法においても、上記した本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法と同様の実施形態をとることができる。尚、探索の対象となる被験物質は、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質であれば何でもよく、例えば、低分子化合物、蛋白質、ペプチド等が挙げられる。
【００５８】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に基づくシステム工程を有する装置によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定をより効率的に行なうことができ、所望の可視光細胞毒性発現物質又は可視光皮膚刺激非誘発物質をより簡便に探索することもできる。また、本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって得られた可視光皮膚刺激性に関する毒性情報を電子情報記録媒体に記録することにより、毒性情報を包含する有用な電子情報記録媒体を作製することができる。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
実施例１ （可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索：その１）
本実施例では、被験物質の単回接触、１０００ルクス照射によって可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索ができることを示した。さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、該検定方法、該探索方法における陽性対照として使用できることを示した。
【００６１】
ベンゾ（ａ）ピレン（和光純薬工業）をジメチルスホキシドに溶解し、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンイエロー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンオレンジ（和光純薬工業）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．００６ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。また、ジメチルベンゾアンスラセン（関東化学）をジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。
【００６２】
大日本製薬（株）から購入したチャイニーズハムスター肺由来の接着性培養細胞株ＣＨＬ／ＩＵを使用した。当該接着性培養細胞を０．０２％トリプシンで洗った後、培養液を加えてパスツールピペットを用いて浮遊させ、細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を培養液を用いて３×１０3個／ｍＬに調製し、これを６０ｍｍプラスチック製培養シャーレに５ｍＬずつ分注した。これを３７℃、５％CO2存在下で３日間培養することにより、細胞を接着させた。
【００６３】
培養液としては、イーグルMinimum Essential Medium（MEM培地(2)、日水製薬） ５００ｍＬに下記の成分が添加されたものが用いられた。
・Bovine Serum（LIFE TECHNOLOGIES, INC.） ５６ｍＬ
・３％グルタミン（和光純薬工業） ５ｍＬ
・１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業） ６ｍＬ
このようにして、本試験に用いる接着性培養細胞を調製した。
【００６４】
次に、上記で調製された試験液を、上記で調製された接着性培養細胞が付着した培養シャーレにそれぞれ５０μLずつ添加することにより、前記接着性培養細胞と前記被験物質とを接触させた。
【００６５】
各被験物質が適用された直後に、前記の接着性培養細胞が付着した培養シャーレを、可視光の照射・非照射と培養室内の温度調整とを精密制御できる専用培養装置にて、培養温度３６．０〜３７．０℃、湿度９５±５％ｒｈの条件で、家庭用一般蛍光灯による１０００ルクスの可視光の照射下で１日間培養した。一方、陰性対照として、ジメチルスルホキシド又は被験物質を添加して可視光を照射しない群、及びジメチルスルホキシドのみを添加して被験物質群と同様に可視光を照射した群を設定した。また、各群とも１枚以上の培養シャーレで構成した。
【００６６】
培養終了後、培養液を廃棄し、当該接着性培養細胞に0.04％トリプシン液５ｍＬを加えた。パスツールピペットを用いて当該接着性培養細胞をシャーレから剥離して細胞浮遊液を調製した。当該細胞浮遊液の細胞濃度を、コールターカウンター（ベックマン・コールター）を用いて測定した。
【００６７】
上記で測定された被験物質群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表１に示した。
【００６８】
増殖率（％）＝｛被験物質群における細胞濃度｝×１００／｛陰性対照群（ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した群）における細胞濃度｝
【００６９】
表１から明らかなように、各濃度のベンゾ（ａ）ピレン、プロフラビン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、ジメチルベンゾアンスラセンにおいて、陰性対照と比較した増殖率は５０％以下の値となり、細胞毒性が発現していることが確認された。
【００７０】
さらに、被験物質を添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表２に示した。
【００７１】
表１と表２とを比較すると、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンのいずれも、可視光を照射した場合の方が可視光を照射しない場合よりも低い濃度で細胞毒性が発現していることが確認された。即ち、これらの化合物における可視光照射による細胞毒性の増強が明らかになった。
【００７２】
これは、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、１０００ルクス照射）によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光細胞毒性発現物質を探索できることが示された。
さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、本発明検定方法の陽性対照として使用できることも示された。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
実施例２ （可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索：その２）
本実施例では、被験物質の単回接触、６０００ルクス照射によって可視光細胞毒性発現能力の検定及び可視光細胞毒性発現物質の探索ができることを示した。さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、該検定方法、該探索方法における陽性対照として使用できることを示した。
【００７６】
ベンゾ（ａ）ピレン（和光純薬工業）をジメチルスホキシドに溶解し、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンイエロー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。アクリジンオレンジ（和光純薬工業）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。プロフラビン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）をジメチルスルホキシドに溶解し、０．００８ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。また、ジメチルベンゾアンスラセン（関東化学）をジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍｇ／ｍＬの濃度からなる試験液を調製した。
【００７７】
大日本製薬（株）から購入したチャイニーズハムスター肺由来の接着性培養細胞株ＣＨＬ／ＩＵを使用した。当該接着性培養細胞を０．０２％トリプシンで洗った後、培養液を加えてパスツールピペットを用いて浮遊させ、細胞懸濁液として回収した。回収された細胞懸濁液を培養液を用いて３×１０3個／ｍＬに調製し、これを６０ｍｍプラスチック製培養シャーレに５ｍＬずつ分注した。これを３７℃、５％CO2存在下で３日間培養することにより、細胞を接着させた。
【００７８】
培養液としては、イーグルMinimum Essential Medium（MEM培地(2)、日水製薬） ５００ｍＬに下記の成分が添加されたものが用いられた。
・Bovine Serum（LIFE TECHNOLOGIES, INC.） ５６ｍＬ
・３％グルタミン（和光純薬工業） ５ｍＬ
・１０％炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業） ６ｍＬ
このようにして、本試験に用いる接着性培養細胞を調製した。
【００７９】
次に、上記で調製された試験液を、上記で調製された接着性培養細胞が付着した培養シャーレにそれぞれ５０μLずつ添加することにより、前記接着性培養細胞と前記被験物質とを接触させた。
【００８０】
各被験物質が適用された直後に、前記の接着性培養細胞が付着した培養シャーレを、可視光の照射・非照射と培養室内の温度調整とを精密制御できる専用培養装置にて、培養温度３６．０〜３７．０℃、湿度９５±５％ｒｈの条件で、家庭用一般蛍光灯による６０００ルクスの可視光の照射下で２時間培養した。２時間の照射下培養の後、温度調整が精密に制御できる培養装置にて、可視光の非照射下で２２時間培養した。一方、陰性対照として、ジメチルスルホキシド又は被験物質を添加して可視光を照射しない群、及びジメチルスルホキシドのみを添加して被験物質群と同様に可視光を照射した群を設定した。また、各群とも１枚以上の培養シャーレで構成した。
【００８１】
培養終了後、培養液を廃棄し、当該接着性培養細胞に0.04％トリプシン液５ｍＬを加えた。パスツールピペットを用いて当該接着性培養細胞をシャーレから剥離して細胞浮遊液を調製した。当該細胞浮遊液の細胞濃度を、コールターカウンター（ベックマン・コールター）を用いて測定した。
【００８２】
上記で測定された被験物質群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率を表１に示した。
【００８３】
増殖率（％）＝｛被験物質群における細胞濃度｝×１００／｛陰性対照群（ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射した群）における細胞濃度｝
【００８４】
表３から明らかなように、各濃度のベンゾ（ａ）ピレン、プロフラビン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、ジメチルベンゾアンスラセンにおいて、陰性対照と比較した増殖率は５０％以下の値となり、細胞毒性が発現していることが確認された。
【００８５】
さらに、被験物質を添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度を、ジメチルスルホキシドのみを添加して可視光を照射しなかった陰性対照群の細胞濃度に対する百分率で表した増殖率果を表４に示した。
【００８６】
表３と表４とを比較すると、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンのいずれも、可視光を照射した場合の方が可視光を照射しない場合よりも低い濃度で細胞毒性が発現していることが確認された。即ち、これらの化合物における可視光照射による細胞毒性の増強が明らかになった。
【００８７】
これは、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが可視光細胞毒性発現能力を有することを示しており、本発明者らが初めて見出した知見である。
以上より、本実施例の手順（単回接触、６０００ルクス照射）によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定でき、かつ、被験物質の中から可視光細胞毒性発現物質を探索できることが示された。
さらに、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンが、本検定方法の陽性対照として使用できることが示された。
【００８８】
【表３】
【００８９】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によれば、被験物質の可視光細胞毒性発現能力の検定を効率的に行なうことができる。さらに、本発明では、該検定方法に陽性対照として用いることができる可視光細胞毒性発現物質を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞を回収し、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程。
【請求項２】
可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項３】
前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項４】
前記対照は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項５】
前記可視光細胞毒性発現物質は、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンであることを特徴とする請求項４記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項６】
前記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項７】
前記哺乳動物由来の培養細胞は、ヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ由来の初代培養細胞又は株化細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項８】
可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光細胞毒性発現物質の探索方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法。
【請求項１】
下記工程（１）〜（４）を有することを特徴とする可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
（１）哺乳動物由来の培養細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程で被験物質を接触させた哺乳動物由来の培養細胞を、第一工程における接触開始後１２時間以内に可視光の照射下で培養する第二工程、
（３）第二工程で培養された哺乳動物由来の培養細胞を回収し、回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値を測定する第三工程、
（４）第三工程の測定結果によって被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価し、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定する第四工程。
【請求項２】
可視光は、複数の波長においてエネルギー極大値を有する分光分布を有する可視光であることを特徴とする請求項１記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項３】
前記第四工程において、前記第三工程の測定結果と、対照の哺乳動物由来の培養細胞における回収された生存する培養細胞の数量若しくはそれに相関関係を有する指標値の測定結果とを比較し、その差異に基づいて被験物質の可視光細胞毒性発現能力の有無又はその程度を評価することを特徴とする請求項１又は２記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項４】
前記対照は、哺乳動物由来の培養細胞に既知の可視光細胞毒性発現物質を接触させた陽性対照を含むことを特徴とする請求項３記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項５】
前記可視光細胞毒性発現物質は、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンであることを特徴とする請求項４記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項６】
前記第二工程の後、培養された哺乳動物由来の培養細胞に再び被験物質を接触させ、被験物質接触開始後１２時間以内に該哺乳動物由来の培養細胞を可視光の照射下で再び培養する工程、を１回以上繰り返した後、第三工程に供することを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項７】
前記哺乳動物由来の培養細胞は、ヒト、モルモット、ラット、マウス、チャイニーズハムスター又はウサギ由来の初代培養細胞又は株化細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項８】
可視光の照射強度が１５０ルクス以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法のための、陽性対照としてのベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンの使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法に用いるための陽性対照試薬であって、ベンゾ（ａ）ピレン、アクリジンイエロー、アクリジンオレンジ、プロフラビン又はジメチルベンゾアンスラセンを含有することを特徴とする陽性対照試薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有する物質を選抜することを特徴とする可視光細胞毒性発現物質の探索方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかの請求項記載の可視光細胞毒性発現能力の検定方法によって、被験物質の可視光細胞毒性発現能力を検定し、所望の可視光細胞毒性発現能力を有さない物質を選抜することを特徴とする可視光皮膚刺激非誘発物質の探索方法。
【公開番号】特開２００７−１４３４６５（Ｐ２００７−１４３４６５Ａ）
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３４１６１４（Ｐ２００５−３４１６１４）
【出願日】平成１７年１１月２８日（２００５．１１．２８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月１４日（２００７．６．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２８日（２００５．１１．２８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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