本発明は、相同ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリーを作製するための組成物および方法、ならびに天然で多様化されたポリペプチドバリアントを同定するための前記ライブラリーの使用を提供する。本発明は、１つまたはいくつかの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、天然供給源から捕捉された対応するＣＤＲのコレクションにより置き換えられた合成抗体断片のコレクションを作製するための組成物および方法も提供する。本発明は、さらに、元のポリペプチドコード配列を改変する必要なく、合成または天然起源の多様化された配列を挿入することにより、ポリペプチドの部分を多様化するための組成物および方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
【請求項２】
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
【請求項３】
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
【請求項４】
（ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
（ｂ）前記哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、
（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、
（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、哺乳動物種からの前記ＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、非ヒト種からの前記ＣＤＲ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記非ヒト種が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ（ｅ）と、ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ（ｆ）とをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
【請求項２４】
（ａ）別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）および第４フレームワーク領域（ＦＲ４）を含み、前記ＦＲ１の領域およびＦＲ２の領域は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）を間に有し、前記ＦＲ２の領域およびＦＲ３の領域は、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を間に有し、前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも２つのＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
（ｂ）前記免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてＩＩｓ型制限酵素認識部位を含むステップと、
（ｃ）前記ＣＤＲ３の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ（ａ）の前記スタッファー核酸配列を、ステップ（ａ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位と結合するＩＩｓ型制限酵素を用いて消化するステップと、
（ｄ）前記ＦＲ３の領域およびＦＲ４の領域が、前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ（ａ）および（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ（ｃ）の前記ＣＤＲ３の領域またはＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ（ｃ）の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）が、前記免疫した非ヒト哺乳動物からの前記ＣＤＲ３配列を、ＩＩｓ型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のＣＤＲ３配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト哺乳動物からのＣＤＲ Ｈ３配列を、ＦｏｋＩ ＩＩｓ制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）の前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、異なるＩＩｓ型制限酵素により認識される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＩｓ型制限酵素認識部位が、ＢｓｍＢＩ認識部位、ＢｓａＩ認識部位、ＦｏｋＩ認識部位またはそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｈ３）配列をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ＣＤＲ３配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ Ｌ３）配列をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ＶＨ１−２、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−２３およびＶＨ５−５１から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＫ１−３３、ＶＫ１−３９、ＶＫ３−１１、ＶＫ３−１５およびＶＫ３−２０から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、ＶＬ１−４４およびＶＬ１−５１から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも１つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｄ）の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸の前記ライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ（ｅ）と、ステップ（ｅ）の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ（ｆ）とをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項４０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８−１】

【図８−２】

【図８−３】

【図８−４】

【図８−５】

【図８−６】

【図８−７】

【図８−８】

【図８−９】

【図８−１０】

【図８−１１】

【図８−１２】

【図８−１３】

【図８−１４】

【図８−１５】

【図８−１６】

【図８−１７】

【図８−１８】

【図８−１９】

【図８−２０】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図１５】

【公表番号】特表２０１２−５２７２４６（Ｐ２０１２−５２７２４６Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１２０４０（Ｐ２０１２−５１２０４０）
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５６１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３５５５８
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０６１９８５６２）
【Ｆターム（参考）】