合成界面活性剤のための新規な脂質混合物
本発明は、合成界面活性剤のための新規な脂質混合物を提供する。特に、本発明は、合成界面活性剤の調製のために使用される一定量の多不飽和リン脂質を含有する特定の脂質混合物を提供する。該界面活性剤およびその製薬学的組成物は、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）のような界面活性剤欠乏症の処置のために有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
内因性肺性界面活性剤は、肺胞内膜の気−液界面における表面張力を低下して、末端呼気における虚脱から肺を防御している。界面活性剤欠乏症は、早産児では普通の障害であり、そして呼吸困難症候群（ＲＤＳ）を惹起するが、これは細く切り刻んだ哺乳動物の肺もしくは肺洗浄液の脂質抽出物である調製物により効果的に処置することができる。該調製物は、改変天然界面活性剤として知られていて、それらは主としてホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなリン脂質（ＰＬ）、ならびに疎水性の界面活性剤タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）からなる。
【０００２】
明白にするために、この特許明細書において引用されるＰＬのリストは、次のとおりである：
− ホスファチジルコリン：ＰＣ、
− ホスファチジルエタノールアミン：ＰＥ、
− ホスファチジルグリセロール：ＰＧ、
− ホスファチジルイノシトール：ＰＩ、
− ホスファチジルセリン：ＰＳ、
− スフィンゴミエリン：ＳＭ、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール：ＤＰＰＧとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルコリン：ＤＰＰＣとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にパルミトイル−オレイル−ホスファチジルグリセロール：ＰＯＰＧとして知られる１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にパルミトイル−オレイル−ホスファチジルコリン：ＰＯＰＣとして知られる１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にジオレイル−ホスファチジルグリセロール：ＤＯＰＧとして知られる１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にパルミトイル−リノレイル−ホスファチジルコリン：ＰＬＰＣとして知られる１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にステアロイル−アラキドノイル−ホスファチジルコリン（ＳＡＰＣ）として知られる１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− １−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン：ＤＰＰＥとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
− 一般にジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン：ＤＳＰＥとして知られる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルセリン：ＤＰＰＳとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン。
【０００３】
リン脂質のグリセロール部分は、主として長鎖脂肪酸（Ｃ１４−Ｃ２０）によりエステル化されており、これらは順に、飽和（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸）、モノ不飽和（例えば、オレイン酸）または多不飽和（例えば、リノール酸およびアラキドン酸）であってもよい。
【０００４】
特徴的な残基として中性もしくは双性イオン部分、例えばグリセロール（ＰＧ）、イノシトール（ＰＩ）およびセリン（ＰＳ）を含有するリン脂質は、酸性リン脂質として知られている。酸性リン脂質の他の例は、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧおよびＤＰＰＳである。
【０００５】
界面活性剤は、通常、気管を通して肺中への点滴注入によって水性懸濁液の形態において早産児に投与される。それらは、また、重い肺性不全症、例えば成人の呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を伴う種々の病に罹患した成人に投与されてもよい。
【０００６】
生物物理学的および薬理学的／治療学的見地から最適な性質を有するために、界面活性剤調製物は、気管内点滴注入による小容量の投与に際して肺胞レベルにおける最適な送達と分配特性をもつ水性媒質中の濃縮懸濁液の調製物を可能にするように、
ｉ）表面張力を効果的に低下させ；ｉｉ）良好な拡散速度を有し；ｉｉｉ）低い粘度を有すべきである。
【０００７】
表面張力を効果的に低下させる界面活性剤の能力ならびに他のパラメーター、例えば拡散速度は、いくつかの方法、例えば、非特許文献１に記述されるような「捕捉気泡（ｃａｐｔｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ）法」を用いてイン・ビトロで試験することができる。
【０００８】
界面活性剤調製物のもっとも重要な脂質成分の１つは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）であり、それは、圧縮中の気−液界面において単分子膜を形成し、多分、表面圧縮の間に相転移（凝固）を受け、それによって異なるサイズをもつ肺胞系を安定化するのである。
【０００９】
また、酸性リン脂質はＤＰＰＣの拡散を支援するので、それらは良好な活性を得るために卓越した重要性を有することが一般に認識されている。
【００１０】
他方、ＤＰＰＣのような高濃度の飽和ＰＬは、脂質懸濁液の他の性質、例えば、調製物の粘度に影響することがある。
【００１１】
小容量における濃縮懸濁液を調製することの可能性は、気管内点滴注入による低体重の新生児への界面活性剤の投与のために特に重要な特性である。
【００１２】
治療用途のために利用できる改変した天然の界面活性剤は、一般に２５〜５０ｍｇ／ｍｌを含有する濃度を有する。それらの１種「Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（Ｒ）」のみが、８０ｍｇ／ｍｌである比較的高濃度において利用することができる。
【００１３】
動物組織から得られる界面活性剤調製物は、どうしても、限定された量におけるそれらの利用性、製造と滅菌工程の複雑さおよび関連する製造費用のような若干の欠点を示す：結果として、多くの努力が合成界面活性剤を調製するためになされた。
【００１４】
Ｗｉｌｓｏｎ（非特許文献２）によれば、合成界面活性剤は：
天然の界面活性剤の脂質組成と機能を模倣するように製剤化される、単純には合成化合物、主としてリン脂質および他の脂質の混合物からなる界面活性剤タンパク質を欠いた「人工」界面活性剤；ならびに
動物から単離されるかまたは特許文献１に記述されるような組み換え技術を通して製造される界面活性剤タンパク質、あるいは特許文献２、特許文献３および特許文献４に記述されるような合成界面活性剤タンパク質類似体を添加された人工界面活性剤である「再構成」界面活性剤；
に区別される。
【００１５】
再構成界面活性剤の開発は、主に界面活性剤タンパク質類似体に焦点を当てられたが、脂質組成はほとんど注目されなかった。
【００１６】
開発下の合成界面活性剤の組成および脂質混合物濃度に関する多くの情報は利用できない。
【００１７】
第ＩＩＩ相、ピボタール（ｐｉｖｏｔａｌ）、遮蔽し、多国籍の、無作為の試行において、Ｓｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）５．８ｍｌ／ｋｇもしくは１７５ｍｇ／ｋｇが、ＲＤＳの予防においてその性質をＥｘｏｓｕｒｆ（Ｒ）に対して比較するために投与された（Ｍｏｙａ Ｆ．ｅｔ ａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎ．２６４３ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｍａｙ １−４，２００４）。これらの評価から、Ｓｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）は３０ｍｇ／ｍｌの濃度において投与されたことが推定できる。
【００１８】
またＫＬ４−Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔとしても報告されたＳｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）は、重量比で３：１におけるリン脂質ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）を有機溶媒中でパルミチン酸（ＰＡ）、リン脂質に対して１５重量％と混合することによって調製された合成ペプチド含有界面活性剤である。
【００１９】
先の研究において、それは、リン脂質濃度として表された２つの濃度：２６．６ｍｇ／ｍｌおよび３５ｍｇ／ｍｌにおいて利用された（非特許文献３）。
【００２０】
先行技術
先行技術において、人工および／または再構成界面活性剤の脂質組成に関するデータは、次の文献において報告されている。
【００２１】
Ｓｕｚｕｋｉら（非特許文献４）は、低分子量界面活性剤タンパク質および重量比で８０：２０のＤＰＰＣと１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）から構成されるリン脂質混合物から作成された界面活性剤のイン・ビトロおよびイン・ビボの性質を記述している。彼らは、不飽和リン脂質が、気−液界面において効果的な拡散を促進することを報告した、ＤＰＰＧは、小さいアポタンパク質と再組み合せされたＤＰＰＣ系では、不飽和ＰＧよりも優れていることが見い出された。
【００２２】
Ｎｏｔｔｅｒら（非特許文献５）では、ＤＰＰＣの再拡散特性に及ぼす脂質またはリン脂質、例えばジオレイル−ＰＣ、ＰＥ、コレステロール、短鎖飽和ＰＣ、脂肪酸およびグリセリドの効果が再考された。一般的結果は、ＤＰＰＣ単独に比べて亢進した劇的な再拡散を示した。本文では、ＤＰＰＣ：卵−ＰＧ７：３から作成された人工界面活性剤が文献において使用されたことがまた報告されている。
【００２３】
Ｄａｒｆｌｅｒ ＦＪ（非特許文献６）では、組織培養における使用に適当なタンパク質不含の脂質ミクロエマルションが精製した合成脂質から調製されて、無菌濾過できる均質な水溶性の安定な懸濁液が製造される。ミクロエマルションの組成は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の成長に及ぼす影響を観察して最適化された。表２で報告された調製したミクロエマルションはα−トコフェロールおよび少なくとも１６．３％の酢酸コレステロールを含有する。
【００２４】
Ｓｃｒｉｐｐｓの名における特許文献２および特許文献３は、ＳＰ−Ｂのポリペプチド類似体に対向される。この明細書では、脂質部分（界面活性剤組成物の、著者の注釈）は、好ましくは約５０〜約９０、より好ましくは約５０〜７５重量％ＤＰＰＣであり、残りの部分は不飽和のＰＣ、ＰＧ、トリアシルグリセロール、パルミチン酸、スフィンゴミエリンもしくはそれらの混合物であることが包括的に報告されているが、それにも拘わらず両出願の実施例では、重量でＤＰＰＣ：ＰＧ３：１（７５：２５）の混合物４または１０ｍｇ／ｍｌを含有する界面活性剤のサンプルがそれらのイン・ビトロの性質について調査された。イン・ビボの性質の研究では、ある場合にはパルミチン酸をさらに含有して、同じ混合物２０ｍｇ／ｍｌの濃度が使用された。
【００２５】
Ｃｏｃｈｒａｎｅら（非特許文献７）では、ＫＬ４のような単純なペプチドおよびＤＰＰＣとＰＧ３：１、ＤＰＰＣと１−パルミトイル−２−オレイルＰＧ（ＰＯＰＧ）３：１、ＤＰＰＣと１−パルミトイル−２−オレイルＰＣ（ＰＯＰＣ）３：１から作成されたＰＬのイン・ビトロでの機能が検討された。ＫＬ４は３％の濃度で試験されたが、他のペプチドは３〜５％の濃度で試験された。３：１の割合のＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ（モノ不飽和リン脂質）と１５％パルミチン酸の脂質混合物における３％ＫＬ４のイン・ビボの性質もまた試験された。著者らは、これらの単純なペプチドとＤＰＰＣ：ＰＯＰＧの組み合わせは、２７日齢の胎児ウサギおよび１３０日齢の胎児アカゲザルにおいて優れた界面活性剤を提供すると包括的に結論している。
【００２６】
Ｙｕら（非特許文献８）では、振動気泡（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ ｂｕｂｂｌｅ）技術が使用されて、１％ＳＰ−Ｂとの組み合わせて比率７：３ｗ／ｗにおいてＤＰＰＣと不飽和酸性ＰＬ、例えば卵−ＰＧ、ＰＯＰＧもしくは卵−ホスファチジン酸を含有する２成分リン脂質混合物の表面活性を研究した。
【００２７】
ＳＰ−Ｃのポリペプチド類似体に対向されたＢｙｋ Ｇｕｌｄｅｎの名における特許出願（特許文献１）では、リン脂質部分がＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ（もしくはＰＧ）および粘度を下げるための塩、例えば塩化ＣａもしくはＭｇもしくはＮａを含有してもよいことが包括的に報告されている。実施例では、ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：パルミチン酸７：３：０．２５＋ＣａＣｌ２の混合物が利用された。
【００２８】
Ｃｕｒｓｔｅｄｔら（９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｍａｙ ２２−２５，１９９４）は、ＣａＣｌ２の存在または不在下で、次の脂質混合物：ＤＰＰＣ：ＰＯＰＣ：ＤＯＰＧ５５：３５：１０（この場合、ＰＯＰＧとＤＯＰＧはモノ不飽和リン脂質である）；ＤＰＰＣ：ＰＧ７：３；ＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９と組み合わせたＳＰ−Ｃ類似体のイン・ビトロ活性に関して報告した。ＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９を含有する調製物は、他の脂質混合物よりも速やかな吸収速度と、より低い平衡表面張力を有した。
【００２９】
Ｋｒｉｌｌら（非特許文献９）は同じ結論に到達した；合成タンパク質Ｂフラグメント、ＤＰＰＣおよびＰＯＰＧから作成された界面活性剤組成物のイン・ビトロ特性を評価することを目的とした研究において、彼らは、パルミチン酸の存在が低い表面張力値を達成できるＤＰＰＣの安定な脂質薄膜を確立することに役立つことを示唆した。組成物中の比率の指示は報告されていない。
【００３０】
ＳＰ−Ｃ類似体ペプチドに対向した出願者名の特許文献４では、安定な脂質／リン脂質が、ＰＣ（好ましくはＤＰＰＣ）、ＰＧ、パルミチン酸、トリアシルグリセロール、スフィンゴミエリンからなる群から選ばれてもよいことが包括的に報告されている。実施例において、ＤＰＰＣ：ＰＧ７：３ｗ／ｗまたはＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９ｗ／ｗ／ｗとの組み合わせ物において特許請求されるペプチドの１種、例えばＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）から作成された界面活性剤調製物がイン・ビトロにおいて試験された。
【００３１】
Ｐａｌｍｂｌａｄら（非特許文献１０）では、特許文献４の同じデータが報告された。本文では、また、最適なイン・ビトロの特徴がＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）、ＳＰ−Ｂ、ＤＰＰＣおよびＰＧを含有する調製物（すなわち、この場合、パルミチン酸が脂質混合物から除かれた）から得られたことが述べられている。
【００３２】
Ｄｉｅｍｅｌら（非特許文献１１）は、ＳＰ−ＢおよびＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ８０：２０もしくはＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ８０：２０もしくはＤＰＰＣ：ＰＯＰＣ：ＤＰＰＧ６０：２０：２０から調製された界面活性剤混合物の構造的特性について報告した。
【００３３】
後者の混合物では、飽和（ＤＰＰＧ）およびモノ不飽和（ＰＯＰＣ）リン脂質が使用された。
【００３４】
特許文献５は、脂質酸化または微生物増殖に関連する症状を処置する方法に関し、そして抗酸化性または抗微生物性の肺界面活性剤タンパク質化合物、例えばタンパク質ＡおよびＤおよびそれらの誘導体の薬物学的に有効な量を含んでなる組成物を投与するという段階を含む。本文では、その発明による方法は、有機溶媒であってもよい担体、ホスファチジルコリン、コレステロールまたは界面活性剤リン脂質と組み合わせて該化合物を投与することを含むことが包括的に述べられている。実施例では、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロールおよび１−オレオイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（それぞれ、１：１：０．１５：０．１５，ｗ／ｗ）からなる界面活性剤脂質混合物が、脂質酸化を防止する肺界面活性剤タンパク質の能力をチェックする基質として使用された。この混合物において、卵−ＰＣおよびＤＰＰＣは、４３％の量で存在するが、一方、１−オレオイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールは、混合物の総重量に対してそれぞれ７％の量で存在する。
【００３５】
特許文献６は、肺界面活性剤を含んでなる肺界面活性剤組成物に向けられており、これは、−周囲温度において１０％ｗ／ｗの濃度で、０．９％ｗ／ｗ塩化ナトリウム中粉末または粒子として分散された場合−膨潤過程において、偏光顕微鏡による観察されるように約０．５分から約１２０分までの時間内に気−液−固界面において複屈折網もしくは細管を形成することができる。本文では、この発明による肺界面活性剤組成物は、リン脂質、例えば、飽和および不飽和のリン脂質またはそれらの混合物を含有することが包括的に述べられている。リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含んでもよい。
【００３６】
Ｅｖａｎｓら（非特許文献１２）は、ほとんどの完全に飽和したリン脂質の表面粘度は非常に高く、そしてある種の不飽和リン脂質のそれは非常に低いことを報告している。彼らはまた、コレステロールがＤＰＰＣのモノレアーにおいて表面粘度を低下させることを報告している。しかしながら、彼らは、薄膜圧縮の間に低い表面張力を効果的に低下させる能力を維持しながらその粘度を低下させるために、界面活性剤調製物の脂質混合物の組成をいかに調整するかは教示していない。
【００３７】
肺界面活性剤のための担体としての脂質混合物に関する先行技術のほとんどの文献では、ＰＧもしくはＰＯＰＧと組み合わせて７０重量％に等しいか、またはそれより高い飽和ＰＬ、特にＤＰＰＣの含量を含んでなる脂質組成物が、特に、低い値まで表面張力を減少されるために好適であるとして利用されているか、または示唆されている。
【００３８】
しかしながら、飽和ＰＬの比較的高い含量は、特に、濃縮された合成界面活性剤組成物、すなわち、約３０ｍｇ／ｍｌに等しいか、それより高い、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌより高い、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌより高い組成物が所望される場合、調製物の粘度を増加することによって流動学的性質に影響を与えるかも知れない。高い粘度は、事実、界面活性剤の拡散、それ故、肺の気管支肺胞部分へのその分配にネガティブな影響を与える（非特許文献１３）。さらに、許容できる粘度をもつ高含量の飽和ＰＬを含有する脂質混合物の濃縮した懸濁液を調製するためには、加熱と激しい撹拌という操作にたよることが必要である。
【００３９】
これらの欠点に鑑みて、良好なイン・ビトロおよびイン・ビボ特性の達成を可能にしつつ、投与に際して肺の気管支肺胞部分への送達と分配に好適な濃縮した界面活性剤調製物の粘度を低く維持できる、合成界面活性剤の調製において使用される脂質混合物を提供することは非常に得策であろう。
【特許文献１】ＷＯ９５／３２９９２
【特許文献２】ＷＯ８９／０６６５７
【特許文献３】ＷＯ９２／２２３１５
【特許文献４】ＷＯ００／４７６２３
【特許文献５】ＷＯ０２／０６３０１
【特許文献６】米国特許第２００２／００７２５４０号
【非特許文献１】Ｓｃｈｕｒｃｈ，Ｓ．，Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｈ．，Ｇｏｅｒｋｅ，Ｊ．，Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ，Ｈ．（１９８９）”Ａ ｃａｐｔｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６７：２３８９−２３９６
【非特許文献２】Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２００１，２，１４７９−１４９３．
【非特許文献３】Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｏｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９６，ｖｏｌ １５３，ｐｐ４０４−４１０
【非特許文献４】Ｅｕｒ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １９８６，６９，３３６−３４５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇｙ １９８７，１４，４３３−４７９
【非特許文献６】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１９９０，２６（８），７７９−８３
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，５６６−５６８
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９２，１１２６，２６−３４
【非特許文献９】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ ７１，４７−５９，１９９４
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９９，３３９，３８１−３８６
【非特許文献１１】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２，２７７，２１１７９−２１１８８
【非特許文献１２】Ｌｉｐｉｄｓ １５，５２４−５３５
【非特許文献１３】Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００２，２８２，Ｌ２７７−Ｌ２８４
【発明の開示】
【００４０】
本発明は、少なくとも９５重量％のリン脂質からなる合成界面活性剤を調製するための脂質混合物であって、該リン脂質が：
少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜６５重量％の間を占め、より好ましくは４５〜６０重量％の間を占める、特に、４５〜５５重量％の間を占める量で、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；
１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは２０〜４５重量％、特に、３０〜４０重量％の間を占める量で、多不飽和リン脂質；および
１０重量％以上、好ましくは１０〜３０重量％の間を占め、より好ましくは１５〜３０重量％の間を占める量で、飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質；
を含有し、
すべて上記の量が脂質混合物の総重量に対して計算され、
場合によっては、５重量％までの量における中性脂質をさらに含有する、脂質混合物に関する。
【００４１】
そのような組成を有する脂質混合物を使用することによって、良好なイン・ビトロ特性、すなわち、薄膜圧縮の間の低い表面張力および速い拡散速度、ならびに良好な生物学的活性を特徴とする界面活性剤調製物の製造が可能であることが実際に見い出された。未熟な新生児ウサギにおいて実施されたイン・ビボ実験は、本発明の脂質混合物の１種を含有する再構成した界面活性剤は、高い呼吸（干満、ｔｉｄａｌ）容量および肺気体（Ｌｕｎｇ Ｇａｓ）容量値を惹起することを実際に証明した。
【００４２】
特に、３０％以上の不飽和ＰＬおよび１０％以上の酸性リン脂質の量を含有する再構成界面活性剤が、より低い量を含有するそれらよりも肺気体容量値の見地からより良好な性能を惹起することが見い出された。
【００４３】
本発明の脂質混合物を含有する合成界面活性剤調製物は、有利には、５〜２０センチポアズ、好ましくは６〜１５センチポアズの間に含まれる、したがって投与に際して肺へのそれらの送達と分配に好適である低い粘度を特徴とする、リン脂質混合物３０ｍｇ／ｍｌに等しいか、それより高い、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌより高い、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌより高い８０ｍｇ／ｍｌまでの濃縮した水性懸濁液の調製を可能にする技術的特徴を有する。
【発明の詳細な説明】
【００４４】
本発明の脂質混合物および対応する合成界面活性剤調製物の特徴は、次の詳細な説明において記述されるであろう。
【００４５】
有利には、脂質混合物は、リン脂質の少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％からなる。リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜６５重量％含まれる、より好ましくは４５〜６０重量％含まれる、特に、４５〜５５重量％含まれる量で、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を含有する。
【００４６】
ＤＰＰＣは合成経路によって調製されても、または天然起源から得られてもよい。
【００４７】
有利には、リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは２０〜４５重量％、特に、３０〜４０重量％含まれる、多不飽和リン脂質の量を含有する。
【００４８】
多不飽和リン脂質としては、本発明者らは、先に定義されたようなリン脂質（ＰＬ）を意図し、ここでは、エステル化する脂肪酸残基の少なくとも１種は、脂肪族鎖中に１個の二重結合以上を含有する。典型的な多不飽和脂肪酸残基は、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸である。この種の多不飽和リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。
【００４９】
好適な多不飽和リン脂質は、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）および１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）である。
【００５０】
多不飽和リン脂質は、一般に、市販されており、そして合成経路によって調製されても、または天然起源、例えば、哺乳動物組織から得られてもよい。
【００５１】
本発明の１つの実施態様では、多不飽和リン脂質の起源としては、また、天然抽出物が使用できる。例えば、卵から単離されるホスファチジルエタノールアミン（卵−ＰＥ）または肝臓からの単離によって得られる多不飽和脂肪酸を含有するリン脂質混合物（肝−ＰＬ）もまた使用できる。卵−ＰＥは、種々のエステル化する酸、中でも、多不飽和のリノレン酸およびアラキドン酸を含有する。肝−ＰＬは、通常、約ＰＣ５０重量％、ＰＥ２５重量％、スフィンゴミエリン１０重量％、酸性リン脂質１５重量％の平均パーセント組成を有し、この場合、若干のＰＬ種は多不飽和酸によりエステル化される。当業者は、脂質混合物の最終組成が本発明の脂質混合物の要求を満たすような量において卵−ＰＥおよび／または肝−ＰＬを使用するであろう。
【００５２】
有利には、リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、１０重量％以上、好ましくは１０〜３０重量％含まれる、より好ましくは１５〜３０重量％含まれる量で飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質を含有する。
【００５３】
飽和酸性リン脂質としては、本発明者らは、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンのようなリン脂質を意図し、ここでは、エステル化する脂肪酸は飽和されており、一方、モノ不飽和酸性リン脂質については、本発明者らは、エステル化する脂肪酸の少なくとも１種がモノ不飽和であるものを意図する。飽和ＰＬの典型的な例は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）および１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ）である。モノ不飽和ＰＬの例は、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）および１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）である。好ましくは、本発明の脂質混合物における酸性リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）およびそれらの混合物である。
【００５４】
ＤＰＰＣ、多不飽和リン脂質および飽和またはモノ不飽和の酸性リン脂質の他に、本発明の脂質混合物のリン脂質フラクションは、エステル化する脂肪酸が飽和またはモノ不飽和である他のリン脂質を含有してもよい。該種類の典型的なリン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００５５】
有利には、本発明の脂質混合物において、飽和リン脂質と不飽和（モノ不飽和および多不飽和）リン脂質との比は重量で６５：３５〜４０：６０、好ましくは重量で５５：４５〜４５：５５含まれ、かつ酸性リン脂質と他のリン脂質との比は重量で１０：９０〜３０：７０、好ましくは重量で１５：８５〜２５：７５含まれる。
【００５６】
場合によっては、本発明の脂質混合物は、中性脂質の５重量％まで、好ましくは２重量％に等しいかまたはそれ未満の量において含有する。中性脂質は、トリアシルグリセロール、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸、例えばパルミチン酸を含む。
【００５７】
好適な中性脂質は、それが脂質混合物の粘度を低下させるのを助けるので、コレステロールである。
【００５８】
本発明の脂質混合物の例として、比４５：３０：１０：５：１０（重量で）におけるＤＰＰＣ：ＰＬＰＣ：ＳＡＰＣ：ＤＰＰＧ：ＰＯＰＧおよび比５０：４０：１０（重量で）におけるＤＰＰＣ：肝臓ＰＬ：ＰＯＰＧが使用された。
【００５９】
本発明の脂質混合物は、再構成界面活性剤の調製において特に有用である。
【００６０】
特定の実施態様では、本発明は、動物から単離されるか、またはＷＯ９５／３２９９２に記述されるような組み換え技術を通して製造される界面活性剤タンパク質、あるいはＷＯ８９／０６６５７、ＷＯ９２／２２３１５およびＷＯ００／４７６２３に記述されるような界面活性剤タンパク質ＳＰ−ＢもしくはＳＰ−Ｃの合成類似体またはそれらの混合物と組み合わせて、前記脂質混合物の１種を含んでなる再構成界面活性剤に関する。
【００６１】
タンパク質は、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｄまたはそれらの合成もしくは組み換え類似体から選ばれるいずれの界面活性剤タンパク質であってもよい。
【００６２】
また、本発明の再構成した界面活性剤は、界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｂの機能的代替物として、ポリミキシン、好ましくはポリミキシンＢを含んでもよい。
【００６３】
好ましくは、ＳＰ−Ｃの合成類似体として、１文字のアミノ酸コードによる一般式（Ｉ）のペプチドが利用できる：
ＦｅＧｆＩＰＺＺＰＶＨＬＫＲ（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄＧＡＬＬΩＧＬ （Ｉ）［式中、
Ｘは、Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ，Ｉ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、エステル結合を介して側鎖に結合されている１２〜２２個の炭素原子を含有するアシル基により、場合によっては置換されるＳであり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；ａは、１〜１９から、好ましくは１〜１１からの整数であり；
ｂは、１〜１９から、好ましくは１〜８からの整数であり；
ｃは、１〜２１から、好ましくは１〜５からの整数であり；
ｄは、０〜２０から、好ましくは１〜１１からの整数であり；
ｅは、０もしくは１であり；
ｆは、０もしくは１であり；
ｎは、０もしくは１であり；
ｍは、０もしくは１であり；
この場合、好ましくは：
− ｎ＋ｍ≧０；
− ｆ≧ｅ，
− （ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは、最大２２個のアミノ酸、好ましくは１０〜２２個のアミノ酸をもつ配列である］。
【００６４】
なおより好適には、式（ＩＩ）のペプチドの使用である：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＢＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬΩＧＬ （ＩＩ）
［式中、
Ｂは、Ｋ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；そしてこの場合、セリンは、例えばパルミトイルにより、場合によってはアシル化されてもよい］。
【００６５】
以下に報告される、非アシル化形態におけるペプチド（ＳＰ−Ｃ３３）は、本発明のもっとも好適なペプチドである：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬＭＧＬ
（ＳＰ−Ｃ３３）
該ペプチドはＷＯ００／４７６２３において報告された方法にしたがって調製することができる。
【００６６】
再構成界面活性剤における界面活性剤タンパク質またはペプチドの量は、総混合物の重量に対して０．１％〜５％、好ましくは０．５％〜３％、より好ましくは１％〜２％の範囲において変えられる。
【００６７】
特許請求される再構成界面活性剤は、脂質混合物の有機溶媒中の溶液をペプチドまたはタンパク質と混合し、続いて乾燥粉末が得られるまで調製物を乾燥することによって調製できる。
【００６８】
また、本発明は、界面活性剤欠乏症の治療処置の必要な被験者に投与するための、本発明の脂質混合物を含んでなる合成界面活性剤からなる製薬学的調合物に関する。
【００６９】
該製薬学的調合物は、気管内に、または水性媒質中の懸濁剤の形態において噴霧化によって、または適当な不活性噴射剤におけるエアゾル投与によって投与することができる。好ましくは、それらは、０．９％塩化ナトリウム水溶液中の懸濁剤として気管内に投与することができる。有利には、界面活性剤濃度（リン脂質含量として表される）は、３０ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ以上、なおより好ましくは５０〜８０ｍｇ／ｍｌの間である。
【００７０】
５０〜８０ｍｇ／ｍｌの間に含まれる界面活性剤濃度において、１００〜５００ｓ−１の範囲のせん断速度を適用して２５０℃で測定された界面活性剤の粘度は、有利には、２〜３０センチポアズ、好ましくは５〜２０センチポアズ、より好ましくは６〜１５センチポアズの間、更に好ましくは６〜１０センチポアズの間にさえ含まれる。
【００７１】
本発明の脂質混合物を含んでなる界面活性剤は、界面活性剤欠乏症のすべての症例の処置のため、典型的には、新産の呼吸困難症候群（ＮＲＤＳ）、成人における急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、胎便吸入症候群（ＭＡＳ）、数タイプの肺炎および気管支肺異形成の処置において使用することができる。
【００７２】
本発明の利点は、次の実施例によって具体的に説明される。
【実施例１】
【００７３】
再構成界面活性剤の調製
材料
リン脂質 １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）および肝臓からの単離によって得られるリン脂質混合物（肝−ＰＬ）が、脂質混合物を調製するために使用され、そして市販品から得られた。
【００７４】
ペプチドＳＰ−Ｃ３３はＷＯ００／４７６２３に報告される方法にしたがって合成された。
【００７５】
再構成界面活性剤の調製
クロロホルム／メタノール９８：２（ｖ／ｖ）中に溶解された脂質を、それぞれ、比４５：３０：１０：５：１０および比５０：４０：１０（重量で）における割合ＤＰＰＣ：ＰＬＰＣ：ＳＡＰＣ：ＤＰＰＧ：ＰＯＰＧおよびＤＰＰＣ：肝臓ＰＬ：ＰＯＰＧにおいて混合して、本発明の教示にしたがう脂質混合物（脂質混合物ＡおよびＢ）を得た。対応する再構成界面活性剤調製物（界面活性剤ＡおよびＢ）は、脂質混合物にＳＰ−Ｃ３３を２重量％の量で添加することによって調製した。界面活性剤Ａを窒素下で蒸発させ、そしてそれぞれ、１０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度において１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ中に再懸濁し、一方、界面活性剤Ｂを８０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度において再懸濁した。
【００７６】
界面活性剤Ｂの肝−ＰＬのリン脂質組成は、次ぎのように特性決定される：ホスファチジルコリン（ＰＣ）５０％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）２５％、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１０％、酸性リン脂質１５％。
【実施例２】
【００７７】
イン・ビトロ活性
表面の性質を、捕捉（ｃａｔｉｖｅ）気泡サーファクトメーターにおいて測定した。チャンバーをスクロース溶液で満たし、界面活性剤Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを注入した；次いで、空気１０μｌを吹き込んで気泡を生成した。気−液界面における表面張力を、薄膜吸着と、続く準静的循環領域圧縮（ｃｙｃｌｉｃ ａｒｅａ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）の間の気泡の形状から測定した。
【００７８】
界面活性剤Ａは、最小表面張力に達するのに要する表面領域圧縮に関して良好な性能を例証した。
【実施例３】
【００７９】
界面活性剤Ａのイン・ビボ活性
満期前（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ）のウサギ胎児（ｎ＝３４）を帝王切開によって妊娠２７日齢（満期＝３１日）において取り上げた。取り上げた時点で、動物を腹腔内ナトリウムペントバルビタール（０．１ｍｌ：６ｍｇ／ｍｌ）により麻酔し、気管切開し、腹腔内臭化パンクロニウム（０．１〜０．１５ｍｌ：０．２ｍｇ／ｍｌ）により麻痺させ、そして３７℃において血量計装置において維持した。それらを、１００％酸素を送る改変Ｓｅｒｖｏ−Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒを用いて並列に機械的に換気した。界面活性剤の点滴注入後、ピークの圧力を始めに１分間３５ｃｍＨ２Ｏに上げて、肺における界面活性剤の分配を容易にし、次いで、２５ｃｍＨ２Ｏに低下させた。次に、動物をピーク圧２５ｃｍＨ２Ｏにより１５分間換気し、これを５分間２０ｃｍＨ２Ｏ、さらに５分間１５ｃｍＨ２Ｏまで下げ、次いで、再び、５分間２５ｃｍＨ２Ｏに上げた。呼吸（ｔｉｄａｌ）容量を血量計ボックスに接続された呼吸速度描写器（ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈｏｇｒａｐｈ）により記録した。
【００８０】
頻度は１分当たり４０であり、吸気：呼気の時間比は１：１であった。ポジティブな末端呼気圧は適用されなかった。
【００８１】
未熟な新生ウサギはに任意に抜き取られて誕生時に界面活性剤Ａ（８０ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌ／ｋｇ体重を気管カニューレを通して受けた。対照動物では、気道中に物質を注入されなかった。全動物は３０分間換気された。
【００８２】
呼吸容量（ＶＴ）は、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １９９１，４，３６４−３７０に記述されるように血量計装置を用いて測定し、そして末端−呼気（ｅｎｄ−ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ）肺気体容量（ＬＧＶ）を、肺容量と肺湿潤重量との間の差異から評価した（Ｓｃｈｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ Ｍｉｋｒｏｓｃｏｐｉｅ １９７０，２６，５７）。
【００８３】
これらの実験において、界面活性剤Ａは高い呼吸容量を示すことが観察された。また、肺気体容量値は顕著に増加した。
【実施例４】
【００８４】
界面活性剤Ｂのイン・ビボ活性
界面活性剤Ｂ（８０ｍｇ／ｍｌ）および市販品の改変した天然界面活性剤（Ｃｕｒｏｓｕｒｆ）（８０ｍｇ／ｍｌ）を、実施例３の同じ動物モデルにおいて呼吸容量および肺気体容量について比較した：本発明により調製された再構成界面活性剤Ｂは、改変した天然界面活性剤に匹敵する活性を示した。
【技術分野】
【０００１】
内因性肺性界面活性剤は、肺胞内膜の気−液界面における表面張力を低下して、末端呼気における虚脱から肺を防御している。界面活性剤欠乏症は、早産児では普通の障害であり、そして呼吸困難症候群（ＲＤＳ）を惹起するが、これは細く切り刻んだ哺乳動物の肺もしくは肺洗浄液の脂質抽出物である調製物により効果的に処置することができる。該調製物は、改変天然界面活性剤として知られていて、それらは主としてホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなリン脂質（ＰＬ）、ならびに疎水性の界面活性剤タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）からなる。
【０００２】
明白にするために、この特許明細書において引用されるＰＬのリストは、次のとおりである：
− ホスファチジルコリン：ＰＣ、
− ホスファチジルエタノールアミン：ＰＥ、
− ホスファチジルグリセロール：ＰＧ、
− ホスファチジルイノシトール：ＰＩ、
− ホスファチジルセリン：ＰＳ、
− スフィンゴミエリン：ＳＭ、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール：ＤＰＰＧとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルコリン：ＤＰＰＣとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にパルミトイル−オレイル−ホスファチジルグリセロール：ＰＯＰＧとして知られる１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にパルミトイル−オレイル−ホスファチジルコリン：ＰＯＰＣとして知られる１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にジオレイル−ホスファチジルグリセロール：ＤＯＰＧとして知られる１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、
− 一般にパルミトイル−リノレイル−ホスファチジルコリン：ＰＬＰＣとして知られる１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− 一般にステアロイル−アラキドノイル−ホスファチジルコリン（ＳＡＰＣ）として知られる１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、
− １−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン：ＤＰＰＥとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
− 一般にジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン：ＤＳＰＥとして知られる１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
− 一般にジパルミトイル−ホスファチジルセリン：ＤＰＰＳとして知られる１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン。
【０００３】
リン脂質のグリセロール部分は、主として長鎖脂肪酸（Ｃ１４−Ｃ２０）によりエステル化されており、これらは順に、飽和（例えば、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸）、モノ不飽和（例えば、オレイン酸）または多不飽和（例えば、リノール酸およびアラキドン酸）であってもよい。
【０００４】
特徴的な残基として中性もしくは双性イオン部分、例えばグリセロール（ＰＧ）、イノシトール（ＰＩ）およびセリン（ＰＳ）を含有するリン脂質は、酸性リン脂質として知られている。酸性リン脂質の他の例は、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧおよびＤＰＰＳである。
【０００５】
界面活性剤は、通常、気管を通して肺中への点滴注入によって水性懸濁液の形態において早産児に投与される。それらは、また、重い肺性不全症、例えば成人の呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）を伴う種々の病に罹患した成人に投与されてもよい。
【０００６】
生物物理学的および薬理学的／治療学的見地から最適な性質を有するために、界面活性剤調製物は、気管内点滴注入による小容量の投与に際して肺胞レベルにおける最適な送達と分配特性をもつ水性媒質中の濃縮懸濁液の調製物を可能にするように、
ｉ）表面張力を効果的に低下させ；ｉｉ）良好な拡散速度を有し；ｉｉｉ）低い粘度を有すべきである。
【０００７】
表面張力を効果的に低下させる界面活性剤の能力ならびに他のパラメーター、例えば拡散速度は、いくつかの方法、例えば、非特許文献１に記述されるような「捕捉気泡（ｃａｐｔｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ）法」を用いてイン・ビトロで試験することができる。
【０００８】
界面活性剤調製物のもっとも重要な脂質成分の１つは、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）であり、それは、圧縮中の気−液界面において単分子膜を形成し、多分、表面圧縮の間に相転移（凝固）を受け、それによって異なるサイズをもつ肺胞系を安定化するのである。
【０００９】
また、酸性リン脂質はＤＰＰＣの拡散を支援するので、それらは良好な活性を得るために卓越した重要性を有することが一般に認識されている。
【００１０】
他方、ＤＰＰＣのような高濃度の飽和ＰＬは、脂質懸濁液の他の性質、例えば、調製物の粘度に影響することがある。
【００１１】
小容量における濃縮懸濁液を調製することの可能性は、気管内点滴注入による低体重の新生児への界面活性剤の投与のために特に重要な特性である。
【００１２】
治療用途のために利用できる改変した天然の界面活性剤は、一般に２５〜５０ｍｇ／ｍｌを含有する濃度を有する。それらの１種「Ｃｕｒｏｓｕｒｆ（Ｒ）」のみが、８０ｍｇ／ｍｌである比較的高濃度において利用することができる。
【００１３】
動物組織から得られる界面活性剤調製物は、どうしても、限定された量におけるそれらの利用性、製造と滅菌工程の複雑さおよび関連する製造費用のような若干の欠点を示す：結果として、多くの努力が合成界面活性剤を調製するためになされた。
【００１４】
Ｗｉｌｓｏｎ（非特許文献２）によれば、合成界面活性剤は：
天然の界面活性剤の脂質組成と機能を模倣するように製剤化される、単純には合成化合物、主としてリン脂質および他の脂質の混合物からなる界面活性剤タンパク質を欠いた「人工」界面活性剤；ならびに
動物から単離されるかまたは特許文献１に記述されるような組み換え技術を通して製造される界面活性剤タンパク質、あるいは特許文献２、特許文献３および特許文献４に記述されるような合成界面活性剤タンパク質類似体を添加された人工界面活性剤である「再構成」界面活性剤；
に区別される。
【００１５】
再構成界面活性剤の開発は、主に界面活性剤タンパク質類似体に焦点を当てられたが、脂質組成はほとんど注目されなかった。
【００１６】
開発下の合成界面活性剤の組成および脂質混合物濃度に関する多くの情報は利用できない。
【００１７】
第ＩＩＩ相、ピボタール（ｐｉｖｏｔａｌ）、遮蔽し、多国籍の、無作為の試行において、Ｓｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）５．８ｍｌ／ｋｇもしくは１７５ｍｇ／ｋｇが、ＲＤＳの予防においてその性質をＥｘｏｓｕｒｆ（Ｒ）に対して比較するために投与された（Ｍｏｙａ Ｆ．ｅｔ ａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｎ．２６４３ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ａｃａｄｅｍｙ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｍａｙ １−４，２００４）。これらの評価から、Ｓｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）は３０ｍｇ／ｍｌの濃度において投与されたことが推定できる。
【００１８】
またＫＬ４−Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔとしても報告されたＳｕｒｆａｘｉｎ（Ｒ）は、重量比で３：１におけるリン脂質ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）および１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）を有機溶媒中でパルミチン酸（ＰＡ）、リン脂質に対して１５重量％と混合することによって調製された合成ペプチド含有界面活性剤である。
【００１９】
先の研究において、それは、リン脂質濃度として表された２つの濃度：２６．６ｍｇ／ｍｌおよび３５ｍｇ／ｍｌにおいて利用された（非特許文献３）。
【００２０】
先行技術
先行技術において、人工および／または再構成界面活性剤の脂質組成に関するデータは、次の文献において報告されている。
【００２１】
Ｓｕｚｕｋｉら（非特許文献４）は、低分子量界面活性剤タンパク質および重量比で８０：２０のＤＰＰＣと１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）から構成されるリン脂質混合物から作成された界面活性剤のイン・ビトロおよびイン・ビボの性質を記述している。彼らは、不飽和リン脂質が、気−液界面において効果的な拡散を促進することを報告した、ＤＰＰＧは、小さいアポタンパク質と再組み合せされたＤＰＰＣ系では、不飽和ＰＧよりも優れていることが見い出された。
【００２２】
Ｎｏｔｔｅｒら（非特許文献５）では、ＤＰＰＣの再拡散特性に及ぼす脂質またはリン脂質、例えばジオレイル−ＰＣ、ＰＥ、コレステロール、短鎖飽和ＰＣ、脂肪酸およびグリセリドの効果が再考された。一般的結果は、ＤＰＰＣ単独に比べて亢進した劇的な再拡散を示した。本文では、ＤＰＰＣ：卵−ＰＧ７：３から作成された人工界面活性剤が文献において使用されたことがまた報告されている。
【００２３】
Ｄａｒｆｌｅｒ ＦＪ（非特許文献６）では、組織培養における使用に適当なタンパク質不含の脂質ミクロエマルションが精製した合成脂質から調製されて、無菌濾過できる均質な水溶性の安定な懸濁液が製造される。ミクロエマルションの組成は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の成長に及ぼす影響を観察して最適化された。表２で報告された調製したミクロエマルションはα−トコフェロールおよび少なくとも１６．３％の酢酸コレステロールを含有する。
【００２４】
Ｓｃｒｉｐｐｓの名における特許文献２および特許文献３は、ＳＰ−Ｂのポリペプチド類似体に対向される。この明細書では、脂質部分（界面活性剤組成物の、著者の注釈）は、好ましくは約５０〜約９０、より好ましくは約５０〜７５重量％ＤＰＰＣであり、残りの部分は不飽和のＰＣ、ＰＧ、トリアシルグリセロール、パルミチン酸、スフィンゴミエリンもしくはそれらの混合物であることが包括的に報告されているが、それにも拘わらず両出願の実施例では、重量でＤＰＰＣ：ＰＧ３：１（７５：２５）の混合物４または１０ｍｇ／ｍｌを含有する界面活性剤のサンプルがそれらのイン・ビトロの性質について調査された。イン・ビボの性質の研究では、ある場合にはパルミチン酸をさらに含有して、同じ混合物２０ｍｇ／ｍｌの濃度が使用された。
【００２５】
Ｃｏｃｈｒａｎｅら（非特許文献７）では、ＫＬ４のような単純なペプチドおよびＤＰＰＣとＰＧ３：１、ＤＰＰＣと１−パルミトイル−２−オレイルＰＧ（ＰＯＰＧ）３：１、ＤＰＰＣと１−パルミトイル−２−オレイルＰＣ（ＰＯＰＣ）３：１から作成されたＰＬのイン・ビトロでの機能が検討された。ＫＬ４は３％の濃度で試験されたが、他のペプチドは３〜５％の濃度で試験された。３：１の割合のＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ（モノ不飽和リン脂質）と１５％パルミチン酸の脂質混合物における３％ＫＬ４のイン・ビボの性質もまた試験された。著者らは、これらの単純なペプチドとＤＰＰＣ：ＰＯＰＧの組み合わせは、２７日齢の胎児ウサギおよび１３０日齢の胎児アカゲザルにおいて優れた界面活性剤を提供すると包括的に結論している。
【００２６】
Ｙｕら（非特許文献８）では、振動気泡（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ ｂｕｂｂｌｅ）技術が使用されて、１％ＳＰ−Ｂとの組み合わせて比率７：３ｗ／ｗにおいてＤＰＰＣと不飽和酸性ＰＬ、例えば卵−ＰＧ、ＰＯＰＧもしくは卵−ホスファチジン酸を含有する２成分リン脂質混合物の表面活性を研究した。
【００２７】
ＳＰ−Ｃのポリペプチド類似体に対向されたＢｙｋ Ｇｕｌｄｅｎの名における特許出願（特許文献１）では、リン脂質部分がＤＰＰＣ、ＰＯＰＧ（もしくはＰＧ）および粘度を下げるための塩、例えば塩化ＣａもしくはＭｇもしくはＮａを含有してもよいことが包括的に報告されている。実施例では、ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：パルミチン酸７：３：０．２５＋ＣａＣｌ２の混合物が利用された。
【００２８】
Ｃｕｒｓｔｅｄｔら（９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｍａｙ ２２−２５，１９９４）は、ＣａＣｌ２の存在または不在下で、次の脂質混合物：ＤＰＰＣ：ＰＯＰＣ：ＤＯＰＧ５５：３５：１０（この場合、ＰＯＰＧとＤＯＰＧはモノ不飽和リン脂質である）；ＤＰＰＣ：ＰＧ７：３；ＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９と組み合わせたＳＰ−Ｃ類似体のイン・ビトロ活性に関して報告した。ＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９を含有する調製物は、他の脂質混合物よりも速やかな吸収速度と、より低い平衡表面張力を有した。
【００２９】
Ｋｒｉｌｌら（非特許文献９）は同じ結論に到達した；合成タンパク質Ｂフラグメント、ＤＰＰＣおよびＰＯＰＧから作成された界面活性剤組成物のイン・ビトロ特性を評価することを目的とした研究において、彼らは、パルミチン酸の存在が低い表面張力値を達成できるＤＰＰＣの安定な脂質薄膜を確立することに役立つことを示唆した。組成物中の比率の指示は報告されていない。
【００３０】
ＳＰ−Ｃ類似体ペプチドに対向した出願者名の特許文献４では、安定な脂質／リン脂質が、ＰＣ（好ましくはＤＰＰＣ）、ＰＧ、パルミチン酸、トリアシルグリセロール、スフィンゴミエリンからなる群から選ばれてもよいことが包括的に報告されている。実施例において、ＤＰＰＣ：ＰＧ７：３ｗ／ｗまたはＤＰＰＣ：ＰＧ：パルミチン酸６８：２２：９ｗ／ｗ／ｗとの組み合わせ物において特許請求されるペプチドの１種、例えばＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）から作成された界面活性剤調製物がイン・ビトロにおいて試験された。
【００３１】
Ｐａｌｍｂｌａｄら（非特許文献１０）では、特許文献４の同じデータが報告された。本文では、また、最適なイン・ビトロの特徴がＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）、ＳＰ−Ｂ、ＤＰＰＣおよびＰＧを含有する調製物（すなわち、この場合、パルミチン酸が脂質混合物から除かれた）から得られたことが述べられている。
【００３２】
Ｄｉｅｍｅｌら（非特許文献１１）は、ＳＰ−ＢおよびＤＰＰＣ：ＤＰＰＧ８０：２０もしくはＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ８０：２０もしくはＤＰＰＣ：ＰＯＰＣ：ＤＰＰＧ６０：２０：２０から調製された界面活性剤混合物の構造的特性について報告した。
【００３３】
後者の混合物では、飽和（ＤＰＰＧ）およびモノ不飽和（ＰＯＰＣ）リン脂質が使用された。
【００３４】
特許文献５は、脂質酸化または微生物増殖に関連する症状を処置する方法に関し、そして抗酸化性または抗微生物性の肺界面活性剤タンパク質化合物、例えばタンパク質ＡおよびＤおよびそれらの誘導体の薬物学的に有効な量を含んでなる組成物を投与するという段階を含む。本文では、その発明による方法は、有機溶媒であってもよい担体、ホスファチジルコリン、コレステロールまたは界面活性剤リン脂質と組み合わせて該化合物を投与することを含むことが包括的に述べられている。実施例では、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロールおよび１−オレオイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（それぞれ、１：１：０．１５：０．１５，ｗ／ｗ）からなる界面活性剤脂質混合物が、脂質酸化を防止する肺界面活性剤タンパク質の能力をチェックする基質として使用された。この混合物において、卵−ＰＣおよびＤＰＰＣは、４３％の量で存在するが、一方、１−オレオイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンおよびコレステロールは、混合物の総重量に対してそれぞれ７％の量で存在する。
【００３５】
特許文献６は、肺界面活性剤を含んでなる肺界面活性剤組成物に向けられており、これは、−周囲温度において１０％ｗ／ｗの濃度で、０．９％ｗ／ｗ塩化ナトリウム中粉末または粒子として分散された場合−膨潤過程において、偏光顕微鏡による観察されるように約０．５分から約１２０分までの時間内に気−液−固界面において複屈折網もしくは細管を形成することができる。本文では、この発明による肺界面活性剤組成物は、リン脂質、例えば、飽和および不飽和のリン脂質またはそれらの混合物を含有することが包括的に述べられている。リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含んでもよい。
【００３６】
Ｅｖａｎｓら（非特許文献１２）は、ほとんどの完全に飽和したリン脂質の表面粘度は非常に高く、そしてある種の不飽和リン脂質のそれは非常に低いことを報告している。彼らはまた、コレステロールがＤＰＰＣのモノレアーにおいて表面粘度を低下させることを報告している。しかしながら、彼らは、薄膜圧縮の間に低い表面張力を効果的に低下させる能力を維持しながらその粘度を低下させるために、界面活性剤調製物の脂質混合物の組成をいかに調整するかは教示していない。
【００３７】
肺界面活性剤のための担体としての脂質混合物に関する先行技術のほとんどの文献では、ＰＧもしくはＰＯＰＧと組み合わせて７０重量％に等しいか、またはそれより高い飽和ＰＬ、特にＤＰＰＣの含量を含んでなる脂質組成物が、特に、低い値まで表面張力を減少されるために好適であるとして利用されているか、または示唆されている。
【００３８】
しかしながら、飽和ＰＬの比較的高い含量は、特に、濃縮された合成界面活性剤組成物、すなわち、約３０ｍｇ／ｍｌに等しいか、それより高い、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌより高い、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌより高い組成物が所望される場合、調製物の粘度を増加することによって流動学的性質に影響を与えるかも知れない。高い粘度は、事実、界面活性剤の拡散、それ故、肺の気管支肺胞部分へのその分配にネガティブな影響を与える（非特許文献１３）。さらに、許容できる粘度をもつ高含量の飽和ＰＬを含有する脂質混合物の濃縮した懸濁液を調製するためには、加熱と激しい撹拌という操作にたよることが必要である。
【００３９】
これらの欠点に鑑みて、良好なイン・ビトロおよびイン・ビボ特性の達成を可能にしつつ、投与に際して肺の気管支肺胞部分への送達と分配に好適な濃縮した界面活性剤調製物の粘度を低く維持できる、合成界面活性剤の調製において使用される脂質混合物を提供することは非常に得策であろう。
【特許文献１】ＷＯ９５／３２９９２
【特許文献２】ＷＯ８９／０６６５７
【特許文献３】ＷＯ９２／２２３１５
【特許文献４】ＷＯ００／４７６２３
【特許文献５】ＷＯ０２／０６３０１
【特許文献６】米国特許第２００２／００７２５４０号
【非特許文献１】Ｓｃｈｕｒｃｈ，Ｓ．，Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｈ．，Ｇｏｅｒｋｅ，Ｊ．，Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ，Ｈ．（１９８９）”Ａ ｃａｐｔｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｌｕｎｇ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６７：２３８９−２３９６
【非特許文献２】Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２００１，２，１４７９−１４９３．
【非特許文献３】Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｏｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９６，ｖｏｌ １５３，ｐｐ４０４−４１０
【非特許文献４】Ｅｕｒ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １９８６，６９，３３６−３４５
【非特許文献５】Ｃｌｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇｙ １９８７，１４，４３３−４７９
【非特許文献６】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１９９０，２６（８），７７９−８３
【非特許文献７】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，５６６−５６８
【非特許文献８】Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １９９２，１１２６，２６−３４
【非特許文献９】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ ７１，４７−５９，１９９４
【非特許文献１０】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９９９，３３９，３８１−３８６
【非特許文献１１】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２，２７７，２１１７９−２１１８８
【非特許文献１２】Ｌｉｐｉｄｓ １５，５２４−５３５
【非特許文献１３】Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００２，２８２，Ｌ２７７−Ｌ２８４
【発明の開示】
【００４０】
本発明は、少なくとも９５重量％のリン脂質からなる合成界面活性剤を調製するための脂質混合物であって、該リン脂質が：
少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜６５重量％の間を占め、より好ましくは４５〜６０重量％の間を占める、特に、４５〜５５重量％の間を占める量で、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；
１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは２０〜４５重量％、特に、３０〜４０重量％の間を占める量で、多不飽和リン脂質；および
１０重量％以上、好ましくは１０〜３０重量％の間を占め、より好ましくは１５〜３０重量％の間を占める量で、飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質；
を含有し、
すべて上記の量が脂質混合物の総重量に対して計算され、
場合によっては、５重量％までの量における中性脂質をさらに含有する、脂質混合物に関する。
【００４１】
そのような組成を有する脂質混合物を使用することによって、良好なイン・ビトロ特性、すなわち、薄膜圧縮の間の低い表面張力および速い拡散速度、ならびに良好な生物学的活性を特徴とする界面活性剤調製物の製造が可能であることが実際に見い出された。未熟な新生児ウサギにおいて実施されたイン・ビボ実験は、本発明の脂質混合物の１種を含有する再構成した界面活性剤は、高い呼吸（干満、ｔｉｄａｌ）容量および肺気体（Ｌｕｎｇ Ｇａｓ）容量値を惹起することを実際に証明した。
【００４２】
特に、３０％以上の不飽和ＰＬおよび１０％以上の酸性リン脂質の量を含有する再構成界面活性剤が、より低い量を含有するそれらよりも肺気体容量値の見地からより良好な性能を惹起することが見い出された。
【００４３】
本発明の脂質混合物を含有する合成界面活性剤調製物は、有利には、５〜２０センチポアズ、好ましくは６〜１５センチポアズの間に含まれる、したがって投与に際して肺へのそれらの送達と分配に好適である低い粘度を特徴とする、リン脂質混合物３０ｍｇ／ｍｌに等しいか、それより高い、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌより高い、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌより高い８０ｍｇ／ｍｌまでの濃縮した水性懸濁液の調製を可能にする技術的特徴を有する。
【発明の詳細な説明】
【００４４】
本発明の脂質混合物および対応する合成界面活性剤調製物の特徴は、次の詳細な説明において記述されるであろう。
【００４５】
有利には、脂質混合物は、リン脂質の少なくとも９５重量％、好ましくは少なくとも９８重量％からなる。リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、少なくとも４０重量％、好ましくは４０〜６５重量％含まれる、より好ましくは４５〜６０重量％含まれる、特に、４５〜５５重量％含まれる量で、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を含有する。
【００４６】
ＤＰＰＣは合成経路によって調製されても、または天然起源から得られてもよい。
【００４７】
有利には、リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは２０〜４５重量％、特に、３０〜４０重量％含まれる、多不飽和リン脂質の量を含有する。
【００４８】
多不飽和リン脂質としては、本発明者らは、先に定義されたようなリン脂質（ＰＬ）を意図し、ここでは、エステル化する脂肪酸残基の少なくとも１種は、脂肪族鎖中に１個の二重結合以上を含有する。典型的な多不飽和脂肪酸残基は、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸である。この種の多不飽和リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。
【００４９】
好適な多不飽和リン脂質は、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）および１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）である。
【００５０】
多不飽和リン脂質は、一般に、市販されており、そして合成経路によって調製されても、または天然起源、例えば、哺乳動物組織から得られてもよい。
【００５１】
本発明の１つの実施態様では、多不飽和リン脂質の起源としては、また、天然抽出物が使用できる。例えば、卵から単離されるホスファチジルエタノールアミン（卵−ＰＥ）または肝臓からの単離によって得られる多不飽和脂肪酸を含有するリン脂質混合物（肝−ＰＬ）もまた使用できる。卵−ＰＥは、種々のエステル化する酸、中でも、多不飽和のリノレン酸およびアラキドン酸を含有する。肝−ＰＬは、通常、約ＰＣ５０重量％、ＰＥ２５重量％、スフィンゴミエリン１０重量％、酸性リン脂質１５重量％の平均パーセント組成を有し、この場合、若干のＰＬ種は多不飽和酸によりエステル化される。当業者は、脂質混合物の最終組成が本発明の脂質混合物の要求を満たすような量において卵−ＰＥおよび／または肝−ＰＬを使用するであろう。
【００５２】
有利には、リン脂質フラクションは、脂質混合物の総重量に対して計算される、１０重量％以上、好ましくは１０〜３０重量％含まれる、より好ましくは１５〜３０重量％含まれる量で飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質を含有する。
【００５３】
飽和酸性リン脂質としては、本発明者らは、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンのようなリン脂質を意図し、ここでは、エステル化する脂肪酸は飽和されており、一方、モノ不飽和酸性リン脂質については、本発明者らは、エステル化する脂肪酸の少なくとも１種がモノ不飽和であるものを意図する。飽和ＰＬの典型的な例は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）および１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ）である。モノ不飽和ＰＬの例は、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）および１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）である。好ましくは、本発明の脂質混合物における酸性リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）およびそれらの混合物である。
【００５４】
ＤＰＰＣ、多不飽和リン脂質および飽和またはモノ不飽和の酸性リン脂質の他に、本発明の脂質混合物のリン脂質フラクションは、エステル化する脂肪酸が飽和またはモノ不飽和である他のリン脂質を含有してもよい。該種類の典型的なリン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００５５】
有利には、本発明の脂質混合物において、飽和リン脂質と不飽和（モノ不飽和および多不飽和）リン脂質との比は重量で６５：３５〜４０：６０、好ましくは重量で５５：４５〜４５：５５含まれ、かつ酸性リン脂質と他のリン脂質との比は重量で１０：９０〜３０：７０、好ましくは重量で１５：８５〜２５：７５含まれる。
【００５６】
場合によっては、本発明の脂質混合物は、中性脂質の５重量％まで、好ましくは２重量％に等しいかまたはそれ未満の量において含有する。中性脂質は、トリアシルグリセロール、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸、例えばパルミチン酸を含む。
【００５７】
好適な中性脂質は、それが脂質混合物の粘度を低下させるのを助けるので、コレステロールである。
【００５８】
本発明の脂質混合物の例として、比４５：３０：１０：５：１０（重量で）におけるＤＰＰＣ：ＰＬＰＣ：ＳＡＰＣ：ＤＰＰＧ：ＰＯＰＧおよび比５０：４０：１０（重量で）におけるＤＰＰＣ：肝臓ＰＬ：ＰＯＰＧが使用された。
【００５９】
本発明の脂質混合物は、再構成界面活性剤の調製において特に有用である。
【００６０】
特定の実施態様では、本発明は、動物から単離されるか、またはＷＯ９５／３２９９２に記述されるような組み換え技術を通して製造される界面活性剤タンパク質、あるいはＷＯ８９／０６６５７、ＷＯ９２／２２３１５およびＷＯ００／４７６２３に記述されるような界面活性剤タンパク質ＳＰ−ＢもしくはＳＰ−Ｃの合成類似体またはそれらの混合物と組み合わせて、前記脂質混合物の１種を含んでなる再構成界面活性剤に関する。
【００６１】
タンパク質は、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｄまたはそれらの合成もしくは組み換え類似体から選ばれるいずれの界面活性剤タンパク質であってもよい。
【００６２】
また、本発明の再構成した界面活性剤は、界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｂの機能的代替物として、ポリミキシン、好ましくはポリミキシンＢを含んでもよい。
【００６３】
好ましくは、ＳＰ−Ｃの合成類似体として、１文字のアミノ酸コードによる一般式（Ｉ）のペプチドが利用できる：
ＦｅＧｆＩＰＺＺＰＶＨＬＫＲ（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄＧＡＬＬΩＧＬ （Ｉ）［式中、
Ｘは、Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ，Ｉ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、エステル結合を介して側鎖に結合されている１２〜２２個の炭素原子を含有するアシル基により、場合によっては置換されるＳであり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；ａは、１〜１９から、好ましくは１〜１１からの整数であり；
ｂは、１〜１９から、好ましくは１〜８からの整数であり；
ｃは、１〜２１から、好ましくは１〜５からの整数であり；
ｄは、０〜２０から、好ましくは１〜１１からの整数であり；
ｅは、０もしくは１であり；
ｆは、０もしくは１であり；
ｎは、０もしくは１であり；
ｍは、０もしくは１であり；
この場合、好ましくは：
− ｎ＋ｍ≧０；
− ｆ≧ｅ，
− （ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは、最大２２個のアミノ酸、好ましくは１０〜２２個のアミノ酸をもつ配列である］。
【００６４】
なおより好適には、式（ＩＩ）のペプチドの使用である：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＢＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬΩＧＬ （ＩＩ）
［式中、
Ｂは、Ｋ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；そしてこの場合、セリンは、例えばパルミトイルにより、場合によってはアシル化されてもよい］。
【００６５】
以下に報告される、非アシル化形態におけるペプチド（ＳＰ−Ｃ３３）は、本発明のもっとも好適なペプチドである：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬＭＧＬ
（ＳＰ−Ｃ３３）
該ペプチドはＷＯ００／４７６２３において報告された方法にしたがって調製することができる。
【００６６】
再構成界面活性剤における界面活性剤タンパク質またはペプチドの量は、総混合物の重量に対して０．１％〜５％、好ましくは０．５％〜３％、より好ましくは１％〜２％の範囲において変えられる。
【００６７】
特許請求される再構成界面活性剤は、脂質混合物の有機溶媒中の溶液をペプチドまたはタンパク質と混合し、続いて乾燥粉末が得られるまで調製物を乾燥することによって調製できる。
【００６８】
また、本発明は、界面活性剤欠乏症の治療処置の必要な被験者に投与するための、本発明の脂質混合物を含んでなる合成界面活性剤からなる製薬学的調合物に関する。
【００６９】
該製薬学的調合物は、気管内に、または水性媒質中の懸濁剤の形態において噴霧化によって、または適当な不活性噴射剤におけるエアゾル投与によって投与することができる。好ましくは、それらは、０．９％塩化ナトリウム水溶液中の懸濁剤として気管内に投与することができる。有利には、界面活性剤濃度（リン脂質含量として表される）は、３０ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは４０ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ以上、なおより好ましくは５０〜８０ｍｇ／ｍｌの間である。
【００７０】
５０〜８０ｍｇ／ｍｌの間に含まれる界面活性剤濃度において、１００〜５００ｓ−１の範囲のせん断速度を適用して２５０℃で測定された界面活性剤の粘度は、有利には、２〜３０センチポアズ、好ましくは５〜２０センチポアズ、より好ましくは６〜１５センチポアズの間、更に好ましくは６〜１０センチポアズの間にさえ含まれる。
【００７１】
本発明の脂質混合物を含んでなる界面活性剤は、界面活性剤欠乏症のすべての症例の処置のため、典型的には、新産の呼吸困難症候群（ＮＲＤＳ）、成人における急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、胎便吸入症候群（ＭＡＳ）、数タイプの肺炎および気管支肺異形成の処置において使用することができる。
【００７２】
本発明の利点は、次の実施例によって具体的に説明される。
【実施例１】
【００７３】
再構成界面活性剤の調製
材料
リン脂質 １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）および肝臓からの単離によって得られるリン脂質混合物（肝−ＰＬ）が、脂質混合物を調製するために使用され、そして市販品から得られた。
【００７４】
ペプチドＳＰ−Ｃ３３はＷＯ００／４７６２３に報告される方法にしたがって合成された。
【００７５】
再構成界面活性剤の調製
クロロホルム／メタノール９８：２（ｖ／ｖ）中に溶解された脂質を、それぞれ、比４５：３０：１０：５：１０および比５０：４０：１０（重量で）における割合ＤＰＰＣ：ＰＬＰＣ：ＳＡＰＣ：ＤＰＰＧ：ＰＯＰＧおよびＤＰＰＣ：肝臓ＰＬ：ＰＯＰＧにおいて混合して、本発明の教示にしたがう脂質混合物（脂質混合物ＡおよびＢ）を得た。対応する再構成界面活性剤調製物（界面活性剤ＡおよびＢ）は、脂質混合物にＳＰ−Ｃ３３を２重量％の量で添加することによって調製した。界面活性剤Ａを窒素下で蒸発させ、そしてそれぞれ、１０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度において１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ中に再懸濁し、一方、界面活性剤Ｂを８０ｍｇ／ｍｌの脂質濃度において再懸濁した。
【００７６】
界面活性剤Ｂの肝−ＰＬのリン脂質組成は、次ぎのように特性決定される：ホスファチジルコリン（ＰＣ）５０％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）２５％、スフィンゴミエリン（ＳＭ）１０％、酸性リン脂質１５％。
【実施例２】
【００７７】
イン・ビトロ活性
表面の性質を、捕捉（ｃａｔｉｖｅ）気泡サーファクトメーターにおいて測定した。チャンバーをスクロース溶液で満たし、界面活性剤Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを注入した；次いで、空気１０μｌを吹き込んで気泡を生成した。気−液界面における表面張力を、薄膜吸着と、続く準静的循環領域圧縮（ｃｙｃｌｉｃ ａｒｅａ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）の間の気泡の形状から測定した。
【００７８】
界面活性剤Ａは、最小表面張力に達するのに要する表面領域圧縮に関して良好な性能を例証した。
【実施例３】
【００７９】
界面活性剤Ａのイン・ビボ活性
満期前（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ）のウサギ胎児（ｎ＝３４）を帝王切開によって妊娠２７日齢（満期＝３１日）において取り上げた。取り上げた時点で、動物を腹腔内ナトリウムペントバルビタール（０．１ｍｌ：６ｍｇ／ｍｌ）により麻酔し、気管切開し、腹腔内臭化パンクロニウム（０．１〜０．１５ｍｌ：０．２ｍｇ／ｍｌ）により麻痺させ、そして３７℃において血量計装置において維持した。それらを、１００％酸素を送る改変Ｓｅｒｖｏ−Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒを用いて並列に機械的に換気した。界面活性剤の点滴注入後、ピークの圧力を始めに１分間３５ｃｍＨ２Ｏに上げて、肺における界面活性剤の分配を容易にし、次いで、２５ｃｍＨ２Ｏに低下させた。次に、動物をピーク圧２５ｃｍＨ２Ｏにより１５分間換気し、これを５分間２０ｃｍＨ２Ｏ、さらに５分間１５ｃｍＨ２Ｏまで下げ、次いで、再び、５分間２５ｃｍＨ２Ｏに上げた。呼吸（ｔｉｄａｌ）容量を血量計ボックスに接続された呼吸速度描写器（ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈｏｇｒａｐｈ）により記録した。
【００８０】
頻度は１分当たり４０であり、吸気：呼気の時間比は１：１であった。ポジティブな末端呼気圧は適用されなかった。
【００８１】
未熟な新生ウサギはに任意に抜き取られて誕生時に界面活性剤Ａ（８０ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌ／ｋｇ体重を気管カニューレを通して受けた。対照動物では、気道中に物質を注入されなかった。全動物は３０分間換気された。
【００８２】
呼吸容量（ＶＴ）は、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ １９９１，４，３６４−３７０に記述されるように血量計装置を用いて測定し、そして末端−呼気（ｅｎｄ−ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ）肺気体容量（ＬＧＶ）を、肺容量と肺湿潤重量との間の差異から評価した（Ｓｃｈｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ Ｍｉｋｒｏｓｃｏｐｉｅ １９７０，２６，５７）。
【００８３】
これらの実験において、界面活性剤Ａは高い呼吸容量を示すことが観察された。また、肺気体容量値は顕著に増加した。
【実施例４】
【００８４】
界面活性剤Ｂのイン・ビボ活性
界面活性剤Ｂ（８０ｍｇ／ｍｌ）および市販品の改変した天然界面活性剤（Ｃｕｒｏｓｕｒｆ）（８０ｍｇ／ｍｌ）を、実施例３の同じ動物モデルにおいて呼吸容量および肺気体容量について比較した：本発明により調製された再構成界面活性剤Ｂは、改変した天然界面活性剤に匹敵する活性を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成界面活性剤を調製するための脂質混合物であって、該脂質混合物が、主として：
少なくとも９５重量％のリン脂質からなり、該リン脂質が：
少なくとも４０重量％の量で１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；
１０重量％より多い量で多不飽和リン脂質；および
１０重量％より多い量で飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質；
を含有し、
すべて上記の量が脂質混合物の総重量に対して計算されている、脂質混合物。
【請求項２】
脂質混合物の総重量に対して５重量％までの量で中性脂質をさらに含有する、請求項１に記載の脂質混合物。
【請求項３】
中性脂質が、トリアシルグリセロール、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸の群から選ばれる、請求項２に記載の脂質混合物。
【請求項４】
ＤＰＰＣの量が４０〜６５重量％の間を占める、請求項１〜３に記載の脂質混合物。
【請求項５】
ＤＰＰＣの量が４５〜５５重量％の間を占める、請求項４に記載の脂質混合物。
【請求項６】
多不飽和リン脂質の量が２０重量％を越える、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項７】
多不飽和リン脂質の量が３０〜４０重量％の間を占める、請求項６に記載の脂質混合物。
【請求項８】
酸性リン脂質の量が１５〜３０重量％の間を占める、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項９】
多不飽和リン脂質が、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）および１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）、卵から単離されるホスファチジルエタノールアミン（卵−ＰＥ）または肝臓からの単離によって得られるリン脂質混合物（肝−ＰＬ）の群から選ばれる、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項１０】
酸性リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ）の群から選ばれる、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項１１】
酸性リン脂質が、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧおよびそれらの混合物から選ばれる、請求項１０に記載の脂質混合物。
【請求項１２】
飽和リン脂質と不飽和（モノ不飽和および多不飽和）リン脂質との比が、重量で６５：３５〜４０：６０の間にある、請求項１〜１１に記載の脂質混合物。
【請求項１３】
酸性リン脂質と他のリン脂質との比が、重量で１０：９０〜３０：７０の間にある、請求項１〜１１に記載の脂質混合物。
【請求項１４】
ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｄ、それらの合成または組み換え類似体から選ばれる１種以上の界面活性剤タンパク質と組み合わせて請求項１〜１３の脂質混合物を含んでなる再構成界面活性剤。
【請求項１５】
界面活性剤タンパク質が、総混合物の重量で約０．１％〜５％の量において存在する、請求項１４に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１６】
界面活性剤タンパク質が、アミノ酸の１文字コードによる一般式（Ｉ）：
ＦｅＧｆＩＰＺＺＰＶＨＬＫＲ（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄＧＡＬＬΩＧＬ （Ｉ）のＳＰ−Ｃの合成または組み換え類似体であって、
Ｘは、Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ，Ｉ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、エステル結合を介して側鎖に結合されている１２〜２２個の炭素原子を含有するアシル基により、場合によっては置換されていてもよいＳであり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，Ｌ、ｎＬからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
ａは、１〜１９からの整数であり；
ｂは、１〜１９からの整数であり；
ｃは、１〜２１からの整数であり；
ｄは、０〜２０からの整数であり；
ｅは、０もしくは１であり；
ｆは、０もしくは１であり；
ｎは、０もしくは１であり；
ｍは、０もしくは１であり；
この場合、
− ｎ＋ｍ≧０；
− ｆ＞ｅ，
− （ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは、最大２２個のアミノ酸、好ましくは１０〜２２個のアミノ酸をもつ配列であることを特徴とする、ＳＰ−Ｃの類似体である、請求項１４および１５に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１７】
ＳＰ−Ｃ類似体が、式（ＩＩ）：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＢＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬΩＧＬ （ＩＩ）
［式中、
Ｂは、Ｋ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；そしてこの場合、セリンは、例えばパルミトイルにより、場合によってはアシル化されてもよい］
を有する、請求項１６に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１８】
ＳＰ−Ｃ類似体が、次のアミノ酸組成：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬＭＧＬ
を有する、請求項１７に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１９】
請求項１４〜１８の再構成界面活性剤を含んでなる、製薬学的調合物。
【請求項２０】
界面活性剤濃度（リン脂質含量として表される）が３０ｍｇ／ｍｌ以上である０．９％塩化ナトリウム水溶液中の懸濁剤の形態における請求項１９に記載の製薬学的調合物。
【請求項２１】
界面活性剤濃度が４０ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項２０に記載の製薬学的調合物。
【請求項２２】
界面活性剤濃度が５０ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項２１に記載の製薬学的調合物。
【請求項２３】
界面活性剤濃度が５０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌの間に含まれる、請求項２２に記載の製薬学的調合物。
【請求項２４】
５〜２０センチポアズの間に含まれる粘度を特徴とする、請求項１９〜２３に記載の製薬学的調合物。
【請求項２５】
６〜１５センチポアズの間に含まれる粘度を特徴とする、請求項２４に記載の製薬学的調合物。
【請求項１】
合成界面活性剤を調製するための脂質混合物であって、該脂質混合物が、主として：
少なくとも９５重量％のリン脂質からなり、該リン脂質が：
少なくとも４０重量％の量で１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；
１０重量％より多い量で多不飽和リン脂質；および
１０重量％より多い量で飽和またはモノ不飽和酸性リン脂質；
を含有し、
すべて上記の量が脂質混合物の総重量に対して計算されている、脂質混合物。
【請求項２】
脂質混合物の総重量に対して５重量％までの量で中性脂質をさらに含有する、請求項１に記載の脂質混合物。
【請求項３】
中性脂質が、トリアシルグリセロール、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸の群から選ばれる、請求項２に記載の脂質混合物。
【請求項４】
ＤＰＰＣの量が４０〜６５重量％の間を占める、請求項１〜３に記載の脂質混合物。
【請求項５】
ＤＰＰＣの量が４５〜５５重量％の間を占める、請求項４に記載の脂質混合物。
【請求項６】
多不飽和リン脂質の量が２０重量％を越える、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項７】
多不飽和リン脂質の量が３０〜４０重量％の間を占める、請求項６に記載の脂質混合物。
【請求項８】
酸性リン脂質の量が１５〜３０重量％の間を占める、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項９】
多不飽和リン脂質が、１−パルミトイル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＡＰＣ）および１−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＳＡＰＣ）、卵から単離されるホスファチジルエタノールアミン（卵−ＰＥ）または肝臓からの単離によって得られるリン脂質混合物（肝−ＰＬ）の群から選ばれる、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項１０】
酸性リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＰＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＤＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＰＰＳ）の群から選ばれる、先行請求項のいずれかに記載の脂質混合物。
【請求項１１】
酸性リン脂質が、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＧおよびそれらの混合物から選ばれる、請求項１０に記載の脂質混合物。
【請求項１２】
飽和リン脂質と不飽和（モノ不飽和および多不飽和）リン脂質との比が、重量で６５：３５〜４０：６０の間にある、請求項１〜１１に記載の脂質混合物。
【請求項１３】
酸性リン脂質と他のリン脂質との比が、重量で１０：９０〜３０：７０の間にある、請求項１〜１１に記載の脂質混合物。
【請求項１４】
ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｄ、それらの合成または組み換え類似体から選ばれる１種以上の界面活性剤タンパク質と組み合わせて請求項１〜１３の脂質混合物を含んでなる再構成界面活性剤。
【請求項１５】
界面活性剤タンパク質が、総混合物の重量で約０．１％〜５％の量において存在する、請求項１４に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１６】
界面活性剤タンパク質が、アミノ酸の１文字コードによる一般式（Ｉ）：
ＦｅＧｆＩＰＺＺＰＶＨＬＫＲ（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄＧＡＬＬΩＧＬ （Ｉ）のＳＰ−Ｃの合成または組み換え類似体であって、
Ｘは、Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ，Ｉ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、エステル結合を介して側鎖に結合されている１２〜２２個の炭素原子を含有するアシル基により、場合によっては置換されていてもよいＳであり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，Ｌ、ｎＬからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
ａは、１〜１９からの整数であり；
ｂは、１〜１９からの整数であり；
ｃは、１〜２１からの整数であり；
ｄは、０〜２０からの整数であり；
ｅは、０もしくは１であり；
ｆは、０もしくは１であり；
ｎは、０もしくは１であり；
ｍは、０もしくは１であり；
この場合、
− ｎ＋ｍ≧０；
− ｆ＞ｅ，
− （ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは、最大２２個のアミノ酸、好ましくは１０〜２２個のアミノ酸をもつ配列であることを特徴とする、ＳＰ−Ｃの類似体である、請求項１４および１５に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１７】
ＳＰ−Ｃ類似体が、式（ＩＩ）：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＢＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬΩＧＬ （ＩＩ）
［式中、
Ｂは、Ｋ，Ｗ，Ｆ，Ｙおよびオルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ωは、Ｍ，Ｉ，ＬおよびｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；そしてこの場合、セリンは、例えばパルミトイルにより、場合によってはアシル化されてもよい］
を有する、請求項１６に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１８】
ＳＰ−Ｃ類似体が、次のアミノ酸組成：
ＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＩＬＬＬＩＬＧＡＬＬＭＧＬ
を有する、請求項１７に記載の再構成界面活性剤。
【請求項１９】
請求項１４〜１８の再構成界面活性剤を含んでなる、製薬学的調合物。
【請求項２０】
界面活性剤濃度（リン脂質含量として表される）が３０ｍｇ／ｍｌ以上である０．９％塩化ナトリウム水溶液中の懸濁剤の形態における請求項１９に記載の製薬学的調合物。
【請求項２１】
界面活性剤濃度が４０ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項２０に記載の製薬学的調合物。
【請求項２２】
界面活性剤濃度が５０ｍｇ／ｍｌ以上である、請求項２１に記載の製薬学的調合物。
【請求項２３】
界面活性剤濃度が５０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌの間に含まれる、請求項２２に記載の製薬学的調合物。
【請求項２４】
５〜２０センチポアズの間に含まれる粘度を特徴とする、請求項１９〜２３に記載の製薬学的調合物。
【請求項２５】
６〜１５センチポアズの間に含まれる粘度を特徴とする、請求項２４に記載の製薬学的調合物。
【公表番号】特表２００７−５００１９９（Ｐ２００７−５００１９９Ａ）
【公表日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２９９２８（Ｐ２００６−５２９９２８）
【出願日】平成１６年５月２６日（２００４．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０５７２６
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５９１０９５４６５）キエシ・フアルマチエウテイチ・ソチエタ・ペル・アチオニ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月２６日（２００４．５．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００５６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０５７２６
【国際公開日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（５９１０９５４６５）キエシ・フアルマチエウテイチ・ソチエタ・ペル・アチオニ (12)
【Ｆターム（参考）】
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