本開示は、以前に記述された方法を用いて得られるアプタマーおよび光アプタマーよりも遅い解離速度定数を有するアプタマーおよび光アプタマーの同定および使用を記述する。具体的には、本開示は、組織学的または細胞学的試料内の１種類以上の標的に対する、遅い解離速度を有するアプタマーの同定および使用のための方法を記述する。そのアプタマーは、組織学的または細胞学的試料中の１種類以上の標的の局在、相対的密度、および存在または非存在を評価するために用いることができる。それに関してその試料が集められた所与の疾患状態に特異的な標的、および所与の疾患状態の診断に役立つ標的を選択してよい。そのアプタマーは、標的特異的シグナル部分を導入するために用いられてもよい。標的の同定に加え、そのアプタマーは様々な方法によるシグナルの生成を増幅するために用いることができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織または細胞試料における特定の疾患状態の診断のための方法であって、以下の：
ａ）組織または細胞試料を得て、前記の試料を複数の組織切片または細胞調製物に分割し；
ｂ）前記の組織切片または細胞調製物の１つを、前記の組織または細胞試料の内部に含有される１種類以上の標的に対する１種類以上のオフ速度が遅いアプタマーを含む溶液と接触させ；
ｃ）場合により、工程ｂ）で得られた結果を、第２の組織切片または細胞調製物を前記のオフ速度が遅いアプタマーを欠いた工程ｂ）におけるような溶液と接触させることにより調製された陰性対照と比較し；
ｄ）場合により、工程ｂ）で得られた結果を、その組織または細胞型および疾患状態に適した形態学的分析のために前記の第３の組織切片または細胞調製物を染色することにより調製された第３の組織切片または細胞調製物と比較し；そして
ｅ）前記の疾患状態を診断する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
組織または細胞試料中の標的に対するオフ速度が遅いアプタマーを同定するための方法であって、以下の：
（ａ）核酸の候補混合物を調製し；
（ｂ）前記の核酸の候補混合物を組織切片または細胞調製物と接触させ；ここで、その標的に対してその候補混合物と比較して増大した親和性を有する核酸がその標的に結合して核酸−標的複合体を形成し；
（ｃ）その核酸−標的複合体を遅いオフ速度の濃縮プロセスにさらし；
（ｄ）その候補混合物から核酸−標的複合体を分配し；
（ｅ）その核酸−標的複合体を解離させて未結合核酸を生成し；
（ｆ）その未結合核酸を増幅して増大された親和性でその標的に結合することができる配列が濃縮された核酸の混合物を得て；
（ｇ）（ｂ）〜（ｆ）を必要に応じて繰り返し；そして
（ｈ）前記の組織または細胞試料中の目的の標的に対する少なくとも１種類のアプタマーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
前記の組織切片または細胞調製物が、組織学または細胞学に関して用いられる方法により固定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記のオフ速度が遅いアプタマーが、約１５分〜約２４０分の標的からの解離速度（ｔ_１／２）を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記のアプタマーが、約１５分以上、約３０分以上、約６０分以上、約９０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上、約２１０分以上、および約２４０分以上の時間からなるグループから選択される標的からの解離速度（ｔ_１／２）を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記のアプタマーが検出可能部分を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記の検出可能部分が色素、量子ドット、放射標識、電気化学的官能基、酵素、酵素基質、リガンドおよび受容体からなるグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記のアプタマーが一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記のアプタマーがＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記のアプタマーが少なくとも１種類の化学修飾を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記の少なくとも１種類の化学修飾が、リボース位、デオキシリボース位、ホスフェート位、および塩基位から独立して選択される１個以上の部位における化学的置換である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記の少なくとも１種類の化学修飾が図１４において列挙されているグループから独立して選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記の少なくとも１種類の化学修飾が５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）および５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなるグループから独立して選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記の標的が特定の疾患状態または病気を示すマーカーであり、ここで組織試料または細胞調製物中の前記の標的の存在または非存在がその特定の疾患状態を診断する、またはその特定の疾患を処置するための療法計画の選択を容易にする、またはそれを継続するかどうかに関する決定を容易にする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記の標的が図８において列挙されているグループから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記の標的が前立腺特異的抗原、ＣＭＢＫ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＹＫＬ−４０、ＶＥＧＦ、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ２からなるグループから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記のオフ速度が遅いアプタマーが標的と共有結合を形成することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記のオフ速度が遅いアプタマーが光アプタマーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記の組織試料が上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、神経組織、血管組織、心臓組織、リンパ系組織、呼吸器管組織、尿管組織、内分泌系組織、腫瘍組織および生殖系組織からなるグループから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記の細胞試料が腹部および骨盤洗浄液、体腔液（胸膜性、腹膜性）、尿、胃／食道洗浄液、細針吸引液（ＦＮＡ）、乳汁、ＣＳＦ、嚢胞液、関節液、および気管支洗浄液からなるグループから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記の細胞試料が上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、神経組織、血管組織、心臓組織、リンパ系組織、呼吸器管組織、尿管組織、内分泌系組織、腫瘍組織および生殖系組織から培養されたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の遅いオフ速度の濃縮プロセスが核酸−標的複合体を含有する候補混合物を希釈することおよび核酸−標的複合体を含有する候補混合物に少なくとも１種類の競合剤を添加することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
組織学的または細胞学的標本中の１種類以上の目的の標的を検出するための方法であって、以下の：
（ａ）組織または細胞標本を得て；
（ｂ）その標本の切片を固定することにより、組織または細胞標本を調製し；
（ｃ）その固定された組織または細胞切片を脱水し；
（ｄ）その脱水された組織または細胞切片を透徹し；
（ｅ）その透徹された組織または細胞切片を顕微鏡スライドに固定化し；
（ｆ）その固定化された組織または細胞切片を洗浄し；
（ｇ）その洗浄された組織または細胞切片をブロッキングし；
（ｈ）工程（ｆ）で得られたブロッキングされた組織または細胞切片を、前記の１種類以上の目的の標的に対するオフ速度が遅いアプタマーと接触させ、そして
（ｉ）前記のオフ速度が遅いアプタマーを、前記の１種類以上の目的の標的の存在または非存在を示すものとして検出する
ことを含む、前記方法。
【請求項２６】
工程（ｅ）と（ｆ）の間に抗原修復プロセスが含まれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｅ）と（ｆ）の間に浸透化工程が含まれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｅ）と（ｆ）の間にさらに以下の：
（ｉ）前記の固定化された組織または細胞切片を１種類以上の形態学的染色剤で染色し；
（ｉｉ）前記の染色された組織または細胞切片を顕微鏡検査して形態学的構造を評価し；そして
（ｉｉｉ）組織または細胞切片を脱染する
ことを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｅ）と（ｉ）の間に浸透化工程が含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｇ）と（ｈ）の間にさらに再水和工程が含まれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｈ）と（ｉ）の間で速度論的負荷が導入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記の速度論的負荷が競合剤の添加、アプタマーの希釈、または希釈および競合剤の添加の組み合わせからなるグループから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
オフ速度が遅いアプタマーを含む組織学または細胞学試薬であって、前記のアプタマーが約１５分以上の解離半減期（ｔ_１／２）を有する、前記試薬。
【請求項３４】
前記のアプタマーが約１５分〜約２４０分の解離半減期（ｔ_１／２）を有する、請求項３３に記載の試薬。
【請求項３５】
前記のアプタマーが約１５分以上、約３０分以上、約６０分以上、約９０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上、約２１０分以上、および約２４０分以上の時間からなるグループから選択される解離半減期（ｔ_１／２）を有する、請求項３３に記載の試薬。
【請求項３６】
組織切片または細胞調製物中の標的に対する標識されたオフ速度が遅いアプタマーを含む、迅速な組織学または細胞学染色試薬であって、前記のアプタマーが約１５分以上の解離半減期（ｔ_１／２）を有する、前記試薬。
【請求項３７】
前記のアプタマーが約１５分以内に特異的な標的の染色を達成する、請求項３６に記載の試薬。
【請求項３８】
前記のアプタマーが約１０分以内、約５分以内、および約１分以内からなるグループから選択される時間で特異的な標的の染色を達成する、請求項３７に記載の試薬。
【請求項３９】
前記のアプタマーが、術中設定における異常な、または疾患にかかった組織の診断のための凍結組織切片または細胞調製物の迅速な染色に関する有用性を有する、請求項３６に記載の試薬。
【請求項４０】
特定の疾患状態を示す標的に対して選択および生成されたアプタマーであって、その標的が組織学的または細胞学的標本中に含有されており、さらに、前記のアプタマーがオフ速度が遅いアプタマーであり、前記のアプタマーが約１５分以上の解離半減期（ｔ_１／２）を有する、前記アプタマー。
【請求項４１】
前記のアプタマーが約１５分〜約２４０分の解離半減期（ｔ_１／２）
を有する、請求項４０に記載のアプタマー。
【請求項４２】
前記のアプタマーが約１５分以上、約３０分以上、約６０分以上、約９０分以上、約１２０分以上、約１５０分以上、約１８０分以上、約２１０分以上、および約２４０分以上の時間からなるグループから選択される解離半減期（ｔ_１／２）を有する、請求項４１に記載のアプタマー。
【請求項４３】
以下のもの：
（ａ）１種類以上の目的の組織学的または細胞学的標的に特異的な１種類以上のアプタマー；
（ｂ）１種類以上の固体支持体；
（ｃ）１種類以上の分配試薬；
（ｄ）親和性複合体からのアプタマーの遊離のための１種類以上の試薬；
を含むキット。
【請求項４４】
さらに染色試薬を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
さらに前記の１種類以上のアプタマー中の切断可能部分を切断するための試薬を含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
さらに速度論的負荷における使用のための試薬を含む、請求項４３に記載のキット。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１０Ｅ】

【図１０Ｆ】

【図１１】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１６】

【図４】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図８Ｄ】

【図８Ｅ】

【図９】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１５】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【公表番号】特表２０１２−５３２６１２（Ｐ２０１２−５３２６１２Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９７６５（Ｐ２０１２−５１９７６５）
【出願日】平成２２年７月９日（２０１０．７．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４１５４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００６０７５
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（５１００１６２５４）ソマロジック・インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】