吸着表面を有する微小粒子、それを作製する方法、およびその使用
【課題】薬剤、特に、高度に感受性でありかつ処方するのが困難な薬物のための柔軟な送達系を提供すること。
【解決手段】吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；および界面活性剤、を含有する、微小粒子。この微小粒子はさらに、前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有してもよい。
【解決手段】吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；および界面活性剤、を含有する、微小粒子。この微小粒子はさらに、前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有してもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、１９９９年４月２日に出願された米国特許出願番号０９／２８５，８５５の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／２８５，８５５は、１９９８年７月２９日に出願された米国特許出願番号０９／１２４，５３３の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／１２４，５３３は、１９９８年１月２９日に出願された米国特許出願番号０９／０１５，６５２の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／０１５，６５２は、次には、１９９７年１月３０日に出願された米国仮出願番号６０／０３６，３１６、および１９９７年１２月１６日に出願された６０／０６９，７４９に関連し、米国特許法第１１９条（ｅ）（１）の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的に、薬学的組成物に関する。詳細には、本発明は、吸着表面を有する微小粒子、このような微小粒子を調製するための方法、およびそれらの使用に関する。さらに、本発明は、生分解性の微小粒子を含む組成物に関し、ここで生物学的に活性な薬剤（例えば、治療用ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗原、およびアジュバント）は、微小粒子の表面に吸着される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
粒子キャリアは、制御された、治療化合物の非経口的な送達を達成するために使用されてきた。このようなキャリアは、長期間にわたって送達系において活性薬剤を維持するために設計される。微小粒子キャリアの例には、ポリメチルメタクリレートポリマー由来の微小粒子、ならびにポリ（ラクチド）（例えば、特許文献１を参照のこと）、ＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（例えば、特許文献２を参照のこと）、ＰＥＧとして知られるポリエチレングリコール（例えば、特許文献３を参照のこと）由来の微小粒子が含まれる。ポリメチルメタクリレートポリマーは、非分解性であり、一方、ＰＬＧ粒子は、ランダムな非酵素的なエステル結合の加水分解によって、通常の代謝経路に沿って排出される乳酸およびグリコール酸に生分解する。
【０００４】
例えば、特許文献３は、鼻、経口、肺、および経口送達のための薬物送達系として、カプセル化された医薬を有するミクロスフェアの使用を記載する。種々のポリペプチド増殖因子を含む徐放性処方物もまた、記載されている。例えば、特許文献４、特許文献５、および特許文献６を参照のこと。
【０００５】
非特許文献１は、吸着したオリゴヌクレオチドを有するポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）から調製されるナノ粒子を記載する。
【０００６】
粒子キャリアはまた、適切な免疫応答を誘発するための試みにおいて吸着されたかまたは閉じ込められた抗原とともに使用されてきた。このようなキャリアは、免疫系に対する選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所的なリンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージによって食菌され得、そしてサイトカイン放出を通して抗原提示を増強し得る。例えば、１９９８年１月２９日に出願された、共有に係る、同時係属中の出願番号０９／０１５，６５２は、細胞媒介免疫応答を刺激するための、抗原を吸着させた微小粒子および抗原をカプセル化させた微小粒子の使用、ならびにその微小粒子を作製する方法を記載する。
【０００７】
例えば、共有に係る仮特許出願６０／０３６，３１６において、微小粒子を形成する方法が開示され、これは、ポリマーを有機溶媒と合わせる工程、次いで、エマルジョン安定化剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））を添加する工程、次いで、有機溶媒を蒸発させ、それによって微小粒子を形成する工程を包含する。この微小粒子の表面は、そのポリマーおよびその安定化剤を含む。次いで、高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、および抗原）が、これらの表面に吸着され得る。
【０００８】
カチオン性脂質に基づくエマルジョンは、遺伝子キャリアとして使用され得ることがまた示さている。例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３，７７３，９１９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７６７，６２８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４８，０９５号明細書
【特許文献４】国際公開第９４／１２１５８号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，１３４，１２２号明細書
【特許文献６】国際公開第９６／３７２１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆａｔｔａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：１３７−１４３（１９９８）
【非特許文献２】Ｙｉら、Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ；ａ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ，ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：６５３−６５４（１９９７）
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｉｎｔｒａ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２５：３４４−３４５（１９９８）
【非特許文献４】Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２６，＃５４３８（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗原吸着したＰＬＧ微小粒子は、他のより毒性の系よりも有意な利点を提供し、微小粒子表面への生物学的に活性な薬剤の吸着は、問題であり得る。例えば、荷電しているか、またはかさ高い生物学的に活性な薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、大きなポリペプチドなど）を、微小粒子表面に吸着させることは、しばしば困難か、または不可能である。従って、このような薬剤、特に、高度に感受性でありかつ処方するのが困難な薬物のための柔軟な送達系の必要性が、継続して存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明者らは、本明細書中において、広範な種々の高分子を吸着し得る吸着表面を有する微小粒子を形成する方法を発明した。この微小粒子は、ポリマーおよび界面活性剤の両方からなる。本発明の微小粒子は、現在利用可能な他の微小粒子よりも効率的にこのような高分子を吸着する。
【００１３】
この微小粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、ポリシアノアクリレートなど）から誘導され、そして界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤）とともに形成される。これらの界面活性剤は、組み合わせて使用され得る。さらに、本発明者らは、これらの微小粒子が、ＰＶＡのみを使用するプロセスによって形成される微小粒子と比較して、ウイルス抗原の吸着の改善をもたらし、そして、優れた免疫応答を提供することを発見した。ＰＶＡのみを用いて作製される微小粒子は、いくつかの高分子を吸着し得るが、他の界面活性剤を単独で、組み合わせて、またはＰＶＡと組み合わせて使用する本発明の微小粒子は、広範な種々の高分子を吸着する。従って、次いで、本発明は、主に、そのような微小粒子、ならびに、そのような微小粒子を作製するためのプロセス、およびその微小粒子を使用する方法に関する。
【００１４】
１つの実施態様において、本発明は、吸着表面を有する微小粒子に関し、ここでその微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、微小粒子表面に吸着される、選択した高分子（例えば、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、またはそれらの組合せなど）をさらに含むこのような微小粒子に関する。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、本発明の微小粒子に吸着した、選択した高分子、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、微小粒子組成物に関する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、生分解性ポリマーおよびイオン性界面活性剤を含有する微小粒子に関する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、吸着表面を有する微小表面を産生する方法に関し、この方法は以下の工程：
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有するポリマー溶液（ここでこのポリマーは、約１％〜約３０の濃度で、有機溶媒中に存在する）、
およびアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ここでこれらの界面活性剤は、０．００１〜１０の重量対重量の界面活性剤対ポリマーの比で存在して、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する）をポリマー溶液と合わせる工程；
（ｂ）このポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程；
（ｃ）有機溶媒を除去する工程；ならびに
（ｄ）微小粒子を回収する工程、
を包含する。
【００１９】
好ましくは、ポリマー／界面活性剤混合物は、有機溶媒を除去する前に乳化されてエマルジョンを形成する。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載した方法によって産生される微小粒子に関する。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、吸着された高分子を有する微小粒子を産生する方法に関し、以下の工程：
（ａ）ポリ（Ｄ，Ｌ−ポリラクチド−コ−グリコリド）を含有するポリマー溶液（ここでこのポリマーは、有機溶媒中で、約３％〜約１０％の濃度で存在する）；
および、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ここでこの界面活性剤は、０．００１〜１０の重量対重量の界面活性剤対ポリマーの比で存在して、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する）を合わせる工程；
（ｂ）このポリマー／界面活性剤混合液を分散させる工程；
（ｃ）このエマルジョンから溶媒を除去する工程；
（ｄ）微小粒子を回収する工程；ならびに
（ｅ）微小粒子の表面に高分子を吸着させる工程であって、ここでこの高分子は、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、およびそれらの組合せからなる群より選択される。好ましくは、ポリマー／界面活性剤混合物は、有機溶媒を除去する前に乳化されて、エマルジョンを形成する。別の実施態様において、本発明は、上記に記載の方法によって産生された吸着した高分子を有する微小粒子に関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、微小粒子の表面に吸着した高分子および薬学的に受容可能な賦形剤を有する、吸着微小粒子を合わせる工程を包含する、吸着微小粒子組成物を産生する方法に関する。
【００２３】
なお別の実施態様において、本発明は、上記の組成物を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、脊椎動物被験体に高分子を送達する方法に関する。
【００２４】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の微小粒子に吸着した選択された高分子の治療的有効量を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、脊椎動物被験体において細胞内免疫応答を誘発するための方法に関する。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、上記の微小粒子組成物の治療的有効量を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、免疫方法に関する。この組成物は、必要に応じて、結合していない高分子を含み得、そしてまた、必要に応じて、アジュバント（アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム）を含む）を含み得る。
【００２６】
好ましい実施態様において、微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）；より好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）；そして最も好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成される。
【００２７】
好ましい実施態様において、微小粒子は、疾患の診断における使用のためである。
【００２８】
好ましい実施態様において、微小粒子は、疾患の処置における使用のためである。
【００２９】
好ましい実施態様において、微小粒子は、ワクチンにおける使用のためである。
【００３０】
好ましい実施態様において、微小粒子は、免疫応答を惹起する際における使用のためである。
【００３１】
非消耗性の以前に記載された吸着微小粒子の各々はまた、必要に応じて、それらの中に閉じ込められた高分子を有し得る。
【００３２】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に想定される。
好適な実施形態によれば、本発明により、以下が提供される：
（項目１） 吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は、以下：
ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；および
界面活性剤、
を含有する、微小粒子。
（項目２） さらに、以下：
前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目１に記載の微小粒子。
（項目３） さらに、以下：
前記微小粒子内にカプセル化された第二の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素，転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第二の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目２に記載の微小粒子。
（項目４） 前記微小粒子がポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（αヒドロキシ酸）を含有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目５） 前記微小粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目６） 前記界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目７） 前記界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目８） 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目９） 前記第一の生物学的に活性な高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原からなる群より選択される抗原である、項目２〜８のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１０） 前記第一の生物学的に活性な高分子がｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドである、項目２〜９のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１１） 前記第二の生物学的に活性な高分子がアジュバントである、項目３〜１０のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１２） 前記アジュバントがアルミニウム塩である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１３） 項目１〜１２のいずれか１項に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目１４） 項目１〜１２のいずれか１項に記載の微小粒子を含有し、さらにアジュバントを含有する、微小粒子組成物。
（項目１５） 前記アジュバントがＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬおよびアルミニウム塩からなる群より選択されるメンバーである、項目１４に記載の微小粒子組成物。
（項目１６） 前記アジュバントがアルミニウム塩であって、該アルミニウム塩がリン酸アルミニウムである、項目１５に記載の微小粒子組成物。
（項目１７） 吸着表面を有する微小粒子を産生する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を分散させる工程であって、ここで、該ポリマー溶液が、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、ここで、該ポリマーが有機溶媒中の約１％〜約３０％の濃度で存在し、そして該界面活性剤が約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；および
該エマルジョンから該有機溶媒を除去する工程、
を包含する、方法。
（項目１８） 前記界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目２０） 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 前記界面活性剤が約０．０００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 前記界面活性剤が約０．００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３） 前記界面活性剤が約０．００５：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４） 前記微小粒子がポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（αヒドロキシ酸）を含有する、項目１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５） 前記微小粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記微小粒子が約３％〜約１０％の濃度で存在するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 吸着表面を有する微小粒子を産生する方法であって、該吸着表面には、生物学的に活性な高分子が吸着されており、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を乳化してエマルジョンを形成する工程であって、該ポリマー溶液は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、そして該ポリマーは、約１％〜約３０％の濃度で、有機溶媒中に存在し、そして該界面活性剤は、約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、該吸着表面を有する該微小粒子を形成する工程；ならびに
（ｃ）該微小粒子の表面に対して該高分子を吸着させる工程、
を包含する、方法。
（項目２８） 前記高分子が、医薬、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 前記高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原からなる群より選択される抗原である、項目２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０） 前記高分子が、ｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドである、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 前記界面活性剤が約０．０００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２） 前記界面活性剤が約０．００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３） 前記界面活性剤が約０．００５：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４） 項目１７〜３３のいずれか１項に記載の方法に従って作製された微小粒子。
（項目３５） 項目３４に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目３６） 吸着表面を有する微小粒子を含有する微小粒子組成物を産生する方法であって、該吸着表面には、生物学的に活性な高分子が吸着されており、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を乳化してエマルジョンを形成する工程であって、該ポリマー溶液は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、そして該ポリマーは、約１％〜約３０％の濃度で、有機溶媒中に存在し、そして該界面活性剤は、約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、該吸着表面を有する該微小粒子を形成する工程；
（ｃ）該微小粒子の表面に対して該高分子を吸着させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）からの該吸着された高分子を有する該微小粒子を薬学的に受容可能な賦形剤と合わせて該微小粒子組成物を形成する工程、
を包含する、方法。
（項目３７） 項目３６に記載の方法に従って作製された微小粒子組成物。
（項目３８） 脊椎動物被験体に治療上有効な量の高分子を送達する方法であって、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物を該脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３９） 疾患の診断のための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４０） 疾患の処置のための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４１） ワクチンのための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４２） 免疫応答を惹起するための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４３） 吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は以下：
生体分解性ポリマー；および
界面活性剤、
を含有する、微小粒子。
（項目４４） さらに、以下：
前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目４３に記載の微小粒子。
（項目４５） さらに、以下：
前記微小粒子内にカプセル化された第二の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素，転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第二の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目４４に記載の微小粒子。
（項目４６） 項目４４〜４５のいずれか１項に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目４７） 項目４６の記載の微小粒子を含有し、さらに、アジュバントを含有する、微小粒子組成物。
（項目４８） 疾患の診断のための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４９） 疾患の処置のための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目５０） ワクチンのための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目５１） 免疫応答を惹起するための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内にある、化学、高分子化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００３４】
本明細書中で引用される、すべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記に関わらず、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に指示しない限りは、複数形の言及を含む。従って、例えば、用語「微小粒子（ａ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、１つ以上の微小粒子をいう、などである。
【００３６】
（Ａ．定義）
本明細書において記載される際に、以下の用語が使用され、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「微小粒子」とは、直径約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子をいう。好ましくは、この微小粒子は、針およびキャピラリーをふさぐことなく、非経口投与または粘膜投与を可能にする直径のものである。微小粒子のサイズは、当該分野で周知の技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法、および／または走査電子顕微鏡法）によって容易に決定される。
【００３８】
本明細書中における使用のための微小粒子は、滅菌可能であり、非毒性であり、そして生分解性である物質から形成される。このような物質には、限定することなく、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられる。好ましくは、本発明での使用のための微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）由来、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドもしくはグリコール酸のコポリマー（例えば、Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマー由来である。この微小粒子は、種々のポリマー性の出発物質のいずれかから誘導され得る。この物質は、種々の分子量を有し、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比、を有し、これらの選択は、大部分選択可能な問題であり、同時投与される高分子に部分的に依存する。これらのパラメーターは、以下でより十分に議論される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」とは、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）およびエマルジョン安定化剤を含む。アニオン性界面活性剤には、ＳＤＳ、ＳＬＳ、硫酸化脂肪アルコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤には、セトリミド（ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロマイド）、ＤＯＴＡＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤には、ソルビタンエステル、ポリソルビン酸、ポリオキシエチル化グリコールモノエステル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポロキサマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「正味の正電荷」は、微小粒子の表面上の電荷が、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子の表面上の電荷より正であることを意味する。同様に、本明細書で用いられる「正味の負電荷」は、微小粒子の表面上の電荷が、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子の表面上の電荷より負であることを意味する。正味の電荷は、カチオン性またはアニオン性界面活性剤を用いて作製された微小粒子のζ電位（界面動電位としてもまた知られる）を、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子と比較することにより評価され得る。従って、「正味の正電荷」を有する微小粒子表面は、ＰＶＡを用いて作製された微小粒子の表面のζ電位より大きなζ電位を有し、そして「正味の負電荷」を有する微小粒子は、ＰＶＡを用いて作製された微小粒子の表面のζ電位より小さなζ電位を有する。明らかなように、本発明の微小粒子の正味の電荷は、対応するＰＶＡ微小粒子のζ電位に対して算出される。
【００４１】
本明細書で用いる用語「ζ電位」は、すべての固体と液体の界面を横切って存在する電位、すなわち、荷電したコロイド粒子を取り囲むイオンの拡散層を横切る電位をいう。ζ電位は、電気泳動の移動度、すなわち、測定される物質と接触して配置された荷電電極の間をたどるコロイド粒子の速度から、当該部分野で周知の技法を用いて算出され得る。
【００４２】
本明細書で用いる用語「高分子」は、制限されずに、医薬品、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路中の中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをいう。本発明との使用のための特定の高分子は、以下により詳細に記載される。
【００４３】
用語「医薬品」は、以下でより詳細に論議される、抗生物質、抗ウイルス剤、増殖因子、ホルモンなどのような生物学的に活性な化合物をいう。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」は、生物学的に活性な（例えば、免疫原性または治療）タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子である。このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質に依存して、例えば、このポリヌクレオチドが抗原をコードする場合、ポリヌクレオチドは、１０程度の少ないヌクレオチドを含み得る。さらに、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖配列の両方を含み得、そして限定されないが、ウイルスからのｃＤＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ、ウイルスからのゲノムＲＮＡおよびＤＮＡ配列（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡウルイスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ、および特に合成ＤＮＡ配列をいう。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含み、かつ核酸分子が、治療または抗原性タンパク質をコードする限り、ネイティブ配列に対する、欠失、付加および置換のような改変（本質的にほぼ保存的）を含む配列を示す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異によるような偶発的であり得る。
【００４５】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そしてこの産物の最小長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどがこの定義内に含まれる。完全長タンパク質およびそのフラグメントの両方がこの定義に包含される。この用語はまた、タンパク質が、免疫応答を惹起する能力を維持するか、またはこのタンパク質が投与される被験体に対する治療効果を有する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（本質的にほぼ保存的）のような改変もまた含む。
【００４６】
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激し得る１つ以上のエピトープを含み、この抗原が本発明に従って提示されるとき、細胞抗原特異的免疫応答、または体液性抗体応答を生じる分子を意味する。抗原は、それ自身で、または別の分子と組み合わせて存在するとき、細胞性または体液性応答を惹起し得る。通常、エピトープは、約３〜１５の間、一般に約５〜１５のアミノ酸を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ中のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。例えば、直線状のエピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチドを同時に合成すること（これらのペプチドはタンパク質分子の部分に対応する）、およびこれらのペプチドをなお支持体に付着しているまま、これらペプチドを抗体と反応させることにより決定され得る。このような技法は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４、７０８、８７１；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載される（すべてはそれらの全体が参考として援用される）。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的構造を決定することにより容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前述を参照のこと。
【００４７】
本明細書で用いる用語「抗原」は、サブユニット抗原、すなわち抗原が自然状態では会合している完全な生物から分離および別個である抗原、および殺傷、弱毒または不活性化細菌、ウイルス、寄生体またはその他の微生物の両方を示す。抗イディオタイプ抗体、そのフラグメント、および抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）のような抗体はまた、本明細書で用いられるような抗原の定義の下に含ます得る。同様に、遺伝子治療および核酸免疫化適用におけるような、インビボで、治療または免疫原性タンパク質、または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書で抗原の定義内に含まれる。
【００４８】
さらに、本発明の目的には、抗原は、任意のいくつかの公知のウイルス、細菌、寄生体およびカビ、ならびに任意の種々の腫瘍抗原に由来し得る。さらに、本発明の目的には、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する、欠失、付加および置換のような改変（本質的にほぼ保存的）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるような意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異によるような偶発的であり得る。
【００４９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的には、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、その一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／またはその他の白血球細胞により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と会合して存在し、そして細胞の表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物で感染した細胞の溶解を補助して誘導しかつ促進する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルバーＴ細胞は、この機能を補助して促進し、そしてそれらの表面上にＭＨＣ分子と会合するペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異的エフェクター細胞の活性を集めるために作用する。「細胞免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来の白血球を含むその他の白血球細胞により産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００５０】
免疫原性組成物のような組成物、または細胞免疫応答を惹起するワクチンは、細胞表面で、ＭＨＣ分子と会合する抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞媒介免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞、またはその近傍を指向する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が生成され、免疫化宿主の将来の保護を可能にし得る。
【００５１】
特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによるか、感作された被験体中の抗原に特異的であるＴリンパ球についてアッセイすることによるような、多くのアッセイにより測定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００５２】
従って、本明細書で用いられるように、免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を惹起し得る。それ故、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原（単数または複数）に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するため、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するように働き得、免疫化宿主に保護を提供する。このような応答は、当該分野で周知の標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００５３】
微小粒子に吸着された選択抗原を含む組成物は、それが、微小粒子と会合することなく送達されたときに、等量の抗原によって惹起される免疫応答より大きい免疫応答を惹起する能力を所有するとき、「増大した免疫応答」を果たす。従って、組成物は、「増大した免疫原性」を果たし得る。何故なら、抗原は、微小粒子への吸着のため、より強力に免疫原性であるからであるか、またはより低用量の抗原が、それが投与される被験体における免疫応答を達成するために必要であるからである。このような増大した免疫原性は、微小粒子／抗原組成物、および抗原コントロールを動物に投与すること、ならびに当該分野で周知の、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的なアッセイを用いることにより、この２つに対する抗体力価を比較することにより測定され得る。
【００５４】
本明細書で提供されるように、高分子／微小粒子の、用語「有効量」または「薬学的に有効な量」は、免疫学的応答、および対応する治療効果のような所望の応答を提供するために、非毒性であるが十分な量、または治療タンパク質の送達の場合には、以下に規定されるように被験体の処置を行うに十分な量の高分子／微小粒子をいう。以下に指摘されるように、正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般状態、処置される状態の重篤度、および目的の特定の高分子、投与の様式などに依存して、被験体により変動し得る。任意の個々の事例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて当業者により決定され得る。
【００５５】
「脊椎動物被験体」は、ｃｏｒｄａｔａ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを意味し、制限されずに、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマおよびヒトのような哺乳動物；イヌおよびネコのような家畜動物；ならびにヒヨコを含む雄鳥および雌鳥、七面鳥およびその他のキジ類の鳥のような、家禽、野生および狩猟鳥を含む鳥類を含む。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体動物および新生動物の両方を含むことが意図される。
【００５６】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、生物学的でないか、またはそうでなければ所望されない材料を意味し、すなわち、この材料は、任意の所望されない生物学的影響を引き起こさないか、またはそれが含まれる組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用することなく、微小粒子処方物とともに、個体に投与され得る。
【００５７】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲にあるｐＨ」は、約７．２〜８．０を含む範囲、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲にあるｐＨを意味する。
【００５８】
本明細書で用いられる「処置」は、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な除去のいずれもをいう。処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）に実施され得る。
【００５９】
（Ｂ．一般的方法）
本発明は、本発明のＰＬＡおよびＰＬＧ微小粒子が、生物学的に活性な高分子を効率的に吸着するという発見に基づく。さらに、これらの微小粒子は、ＰＶＡで調製された微小粒子より容易に、荷電および／またはかさ高い高分子を含む、より多種の分子を吸収する。従って、本発明の高分子／微小粒子は、広範な種類の疾患を処置、予防および／または診断するために、生物学的に活性な成分を送達するための送達系として用い得る。
【００６０】
本発明は、広範な種類の高分子を送達するために用い得、制限されないで、抗生物質および抗ウイルス剤、非ステロイド抗炎症性薬物、鎮痛剤、血管拡張薬、循環器薬物、向精神剤、神経安定薬、抗うつ薬、抗パーキンソン薬物、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学療法剤、抗腫瘍剤および増殖因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、ＦＧＦを含むがこれらに限定されない）、ワクチンにおける使用のための、治療または免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質およびそれらのエピトープをコードするポリヌクレオチド、ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン、ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、生殖腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、シソルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、マガイニン、マストパランス（ｍａｓｔｏｐａｒａｎｓ）、デルマセプシン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、システミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）、ニューロメディン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）、ニューロテンシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セクレチン、チモシン、などを含むホルモン、酵素、転写または翻訳メディエーター、代謝経路中の中間体、（インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、およびγインターフェロンを含む種々のサイトカインのいずれかのような）免疫モジュレーター、抗原、ならびにアジュバントのような医薬品を含む。
【００６１】
好適な実施態様では、上記高分子は抗原である。本発明の特定の利点は、吸着された抗原をともなう微小粒子が脊椎動物被験体で細胞媒介免疫応答を生成する能力である。本発明の抗原／微小粒子が選択された抗原に対する細胞媒介性免疫応答を惹起する能力は、広範な種類の病原体による感染に対する強力なツールを提供する。従って、本発明の抗原／微小粒子は、ワクチン組成物中に取り込まれ得る。
【００６２】
従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書に記載のシステムは、例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子との発現された抗原の会合を提供し、その結果、目的の抗原に応答するインビボ細胞免疫応答が、ＣＴＬの産生を刺激し、この抗原の将来の認識を可能するようにマウントされ得る。さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を惹起し得る。従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性免疫応答が所望される任意の高分子、好ましくは、抗体，Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞障害性エピトープを誘導し得るウイルス病原体由来の抗原、を用いた使用を見出す。このような抗原は、制限されないで、ヒトおよび動物ウイルスによりコードされる抗原を含み、そして構造または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００６３】
本発明の微小粒子は、通常、貧弱な免疫応答を惹起する細胞内ウイルスに対する免疫化に特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリーからの広範な種類のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための使用を見出し、このタンパク質には、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨのような、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来のタンパク質；ＣＭＶ ｇＢおよびｇＨを含む、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原が挙げられる。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総説は、Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｌａｇ １９９０）１２５〜１６９頁；種々のＨＳＶ−１がコードするタンパク質の論議は、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１〜１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＢおよびｇＤタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の論議は、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の同定は、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１；ならびにＶＺＶの総説は、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。
【００６４】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む、ウイルスの肝炎ファミリーからの抗原もまた、本明細書に記載の技法において首尾良く用いられ得る。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法のように公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、Ｅ１（Ｅとしてもまた公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳ１としてもまた公知）およびＮ−末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）を含むいくつかのウイルスタンパク質をコードする（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の論議は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８を参照のこと）。これらタンパク質の各々、およびその抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法において使用を見出し得る。
【００６５】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本発明の組成物および方法において好都合に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ、およびプレ表面配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前はｐｒｅ−Ｓと呼ばれた）、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書中で用途を見出す。例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｃｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、１５９〜１７６頁、ＨＢＶ構造の考察について；米国特許第４，７２２，８４０号、第５，０９８，７０４号、第５，３２４，５１３号（その全体が参考として本明細書中に援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６６】
他のウイルス由来の抗原もまた、本願発明の組成物および方法における用途を見出す。このような抗原としては、限定なく、とりわけ以下の科のウイルスのメンバー由来のタンパク質が挙げられる：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラボドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）など）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる）であり、分離株ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN由来の抗原を含むが、これらに限定されない）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4；ＨＩＶ−２；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００６７】
より詳細には、上記のＨＩＶ分離株（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）のいずれかに由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質が公知であり、そして報告され（例えば、Ｍｙｅｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと（種々のＨＩＶ分離株のエンベロープ配列の比較について））、そしてこれらの分離株のいずれかに由来の抗原は、本方法において用途を見出す。さらに、本発明は、種々のＨＩＶ分離株のいずれかに由来の他の免疫原性タンパク質（種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む）に等しく適用し得る。
【００６８】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。詳細には、エンベロープ糖タンパク質であるインフルエンザＡのＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成するために特に関心が高い。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプは、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、これらの分離株のいずれかに由来のタンパク質もまた、本明細書中に記載の組成物および方法において使用され得る。
【００６９】
本明細書中に記載の組成物および方法はまた、種々の細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、脳髄膜、および他の病原状態を引き起こす生物（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）に由来の抗原）を伴う用途を見出す。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂ由来の抗原の例は、以下の共同所有する特許出願に開示される：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６５５；ＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３；および米国仮特許出願第６０／０８３，７５３号；第６０／０９４，８６９号；第６０／０９８，９９４号；第６０／１０３，７４９号；第６０／１０３，７９４号；第６０／１０３，７９６号；および第６０／１２１，５２８号。寄生生物抗原の例は、マラリア病およびライム病を引き起こす生物に由来する抗原を包含する。
【００７０】
本発明は、広範な種々の高分子を送達するために、従って多数の疾患の処置、予防、および／または診断するために使用され得ることが、容易に明らかである。別の実施態様では、本発明の高分子／微小粒子組成物は、部位特異的標的化送達のために使用され得る。例えば、高分子／微小粒子組成物の静脈投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環、または骨髄を標的化するために使用され得る。
【００７１】
吸着微小粒子の表面への高分子の吸着は、任意の結合−相互作用機構を介して生じる。このような機構としては、イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、および親水性／疎水性相互作用を介する結合を包含するが、これらに限定されない。当業者は、吸着される高分子のタイプに適切な界面活性剤を容易に選択し得る。
【００７２】
例えば、荷電された界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で製造された微小粒子は、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する微小粒子を生じ得る。この微小粒子は、広範な種々の分子を吸着し得る。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなアニオン性界面活性剤を用いて製造された微小粒子（すなわち、ＳＤＳ−ＰＬＧ微小粒子）は、正に荷電された抗原（例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）のようなカチオン性界面活性剤を用いて製造された微小粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微小粒子）は、負に荷電された高分子（例えば、ＤＮＡ）を吸着する。吸着される高分子が正電荷および負電荷の領域を有する場合、カチオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤のいずれかが適切であり得る。
【００７３】
本発明と共に使用するための微小粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ．から容易に商業的に入手可能である。例えば、本明細書中の微小粒子を形成するために有用なポリマーは、ポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；ならびにポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ともに、本明細書中で「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中では「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と称される）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーに由来のポリマーを包含する。本明細書中の使用のための特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所定の用途のための適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについては、適切な分子量は、約２０００〜５０００の桁であり得る。ＰＬＧについては、適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲であり、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００である。
【００７４】
ＰＬＧのようなコポリマーを用いて微小粒子を形成する場合、種々のラクチド：グリコリド比が本明細書中で用途を見出し、そしてこの比は大いに設計事項であり、同時投与される高分子、および所望の分解率に一部依存する。例えば、５０：５０ＰＬＧポリマー（５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含む）は、迅速に再吸収するコポリマーを提供するが、一方、７５：２５ ＰＬＧは、より緩慢に分解し、そして８５：１５および９０：１０ではさらにより緩慢である。これは、ラクチド成分の増加に起因する。ラクチド：グリコリドの適切な比は、問題の抗原および障害の性質に基づいて当業者によって容易に決定されることが、容易に明らかである。さらに、種々のラクチド：グリコリド比を伴う微小粒子の混合物が、所定の高分子について所望の放出速度論を達成するため、および一次免疫応答および二次免疫応答の両方を提供するために、本明細書中で用途を見出す。本発明の微小粒子の分解率はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶性のような要因によって制御され得る。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を伴うＰＬＧコポリマーは、多数の供給源から商業的に容易に入手可能である。このような供給源としては、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬが挙げられる。これらのポリマーはまた、当該分野で周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載の技術）を用いて、乳酸成分の単純な縮合によって合成され得る。
【００７５】
高分子／微小粒子は、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかを用いて調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載の技術）が、この微小粒子を作製するために本明細書中で使用され得る。これらの技術は、ポリマー溶液の小滴からなる一次エマルジョンの形成を包含する。これは、続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続した水相と混合される。
【００７６】
あるいは、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレーションシステムは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２により記載のように微小粒子を形成するために使用され得る。本技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、塩化ジメチル（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と組み合わされる。ポリマーは、有機溶媒中、約１〜３０％溶液、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、および最も好ましくは約４％溶液中に提供される。このポリマー溶液が、例えば、ホモジナイザーを用いて乳化される。必要に応じて、次いで、エマルジョンが、大量のエマルジョン安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、およびカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤）の水溶液と組み合わされる。エマルジョンは、１つより多くのエマルジョン安定剤および／または界面活性剤と組み合わされ得る（例えば、ＰＶＡおよび界面活性剤の組み合わせ）。特定の高分子は、安定剤および／または界面活性剤の組み合わせを有する微小粒子に、より容易に吸着し得る。エマルジョン安定剤が使用される場合、代表的には約２〜１５％溶液、より代表的には約４〜１０％溶液で提供される。一般に、約０．００００１：１から約０．１：１の範囲の界面活性剤：ポリマー重量比が使用され、より好ましくは、約０．０００１：１から約０．０１：１、より好ましくは約０．００１：１から約０．０１：１、およびさらにより好ましくは約０．００５：１から約０．０１：１である。次いで、混合物はホモジナイズされて、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成する。有機溶媒は、次いでエバポレートされる。
【００７７】
処方パラメーターは、０．０５μｍ（５０ｎｍ）の桁の小さな微小粒子から５０μｍまたはさらに大きいより大きな微小粒子の調製を可能にするように操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、攪拌の減少は、内部相の体積の増大につれて、より大きな微小粒子を生じる。小さな粒子は、高い濃度のエマルジョン安定剤を有する低い水性相体積により生成される。
【００７８】
微小粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーション（例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ、第２版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載のような）；空気懸濁コーティング技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）（Ｈａｌｌら（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、Ｖｏｌ．２、１３３〜１５４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＤｅａｓｙ、Ｐ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載のような）；およびイオンゲル化（例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８０）２１０：９０８−９１０により記載のような）を用いて形成される。
【００７９】
粒子サイズは、例えば、レーザー光散乱によって、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを取り込むスペクトロメーターを用いて、決定され得る。一般には、粒子サイズは室温で決定され、そして粒子直径についての平均値を得るための問題のサンプルの複数回分析（例えば、５〜１０回）を包含する。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて容易に決定される。
【００８０】
調製後、微小粒子は、そのままで貯蔵され得るか、または将来の使用のために凍結乾燥され得る。高分子を微小粒子に吸着するために、微小粒子調製物は、目的の高分子と単に混合され、そして得られた処方物は、使用する前に再度凍結乾燥され得る。一般に、高分子が微小粒子に添加されて、約０．０００１：１から約０．２５：１、好ましくは、約０．００１：１から０．１、より好ましくは約０．０１から０．０５の高分子：微小粒子の重量比を有する吸着された高分子を有する微小粒子を生成する。微小粒子の高分子含量は、標準的な技術を使用して容易に決定され得る。
【００８１】
本発明の微小粒子は、その上に吸着された高分子を有すると同様に、その中に閉じ込められたまたはカプセル化された高分子を有する。従って、例えば、当業者は、本発明に従って、その上に吸着されたタンパク質を伴うカプセル化されたアジュバントを有する微小粒子、またはその上に吸着されたアジュバントを有するカプセル化されたタンパク質を有する微小粒子を調製し得る。
【００８２】
高分子で吸着された微小粒子が一旦生成されると、それらは、上記のように、広範な種々の障害を処置、予防、および／または診断するために、薬学的組成物またはワクチンに処方される。組成物は、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦型剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を包含する。さらに、付属物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、事実上、薬学的に受容可能であり、そして所望のｐＨ（すなわち、生理学的範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する任意の溶液であり得る。緩衝溶液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。
【００８３】
アジュバントは、薬学的組成物の有効性を増強するために使用され得る。アジュバントは、本発明の微小粒子と同時に、例えば、同じ組成物中でまたは別個の組成物中で、投与され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の微小粒子組成物の前にまたは引き続いて投与され得る。別の実施態様では、そのアジュバント（例えば、免疫学的アジュバント）は、微小粒子中にカプセル化され得る。アジュバント（例えば、任意の高分子）は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを使用して、微小粒子内でカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、アジュバントは、任意の高分子について上述したように微小粒子上で吸着され得る。
【００８４】
免疫学的アジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を有するまたは有さない）、（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、５％スクアラン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％Ｓｐａｎ８５（種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を必要に応じて含むが、これらは特に必要とされない）（Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用するサブミクロン粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦ（１０％スクアラン（Ｓｑｕａｌａｎｅ）、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）（サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズ化されるか、またはボルテックスされるかのいずれかで、より大きな粒子サイズのエマルジョンを生成する）、および（ｃ）ＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（２％スクアラン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）（本明細書中で使用するための適切なサブミクロン水中油エマルジョンについてのさらなる考察について、共同所有する米国特許出願第０９／０１５，７３６号（１９９８年１月２９日出願）を参照のこと）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））が使用され得るか、またはそれから生成され得る粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、Ｉｌ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、など；（６）細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ））の解毒変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（６３位の野生型アミノ酸がリジンに置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（７２位の野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９位の野生型アミノ酸がセリンに置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９位の野生型アミノ酸がリジンに、そして１２９位の野生型アミノ酸がグリシンに置換されている）（例えば、国際公開ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（７）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）；ならびに（８）組成物の有効性を増強するために免疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９が好ましい。
【００８５】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
アジュバントのさらなる例のために、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ、Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５を参照のこと）。
【００８７】
この組成物は、目的の高分子の「治療上有効な量」を含む。すなわち、症状を予防、減弱、排除または診断するために、被験体に十分な応答を生じさせる量の高分子／微小粒子がこの組成物に含まれる。正確な量は、以下に依存して必然的に変化する：（他にも因子はあるが）、処置される被験体；処置される被験体の年齢および全身状態；処置される状態の重篤度；免疫学的応答の場合には、被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望されるタンパク質の程度および選択される特定の抗原ならびにその投与の形態。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療上有効な量」は、慣用的なトライアルを通して決定され得る比較的広範な範囲におさまる。たとえば、本発明の目的のためには、高分子がポリヌクレオチドである場合、有効用量は、代表的に１用量あたり送達される高分子の約１ｎｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約１０ｎｇ〜約１μｇ、そして最も好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲であり；高分子が抗原である場合は、代表的に１用量あたり送達される高分子の約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲である。
【００８８】
一旦処方されれば、本発明の組成物は、非経口的に、例えば、注射により投与され得る。この組成物は、皮下に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内にのいずれかで注射され得る。投与の他の形態としては、経鼻投与、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであってもよい。複数用量スケジュールは、投与の初回の経過が、治療応答を維持および／または増強するように選択された、１〜１０の別個の用量、その後引き続く時間間隔で与えられる他の用量、例えば、第２の用量については１〜４ヶ月、そして必要であれば数ヶ月後の引き続く用量を伴い得るスケジュールである。この投薬レジメンはまた、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、そして医師の判定に依存する。
【００８９】
さらに、疾患の防御が所望される場合、目的の病原での初回感染の前にワクチン中の高分子が一般的に投与される。処置（例えば、症状または再発の減少）が所望される場合、高分子は、一般に初回感染に続いて投与される。
【００９０】
（Ｃ．実験）
以下は、本発明を実行するための特定の実施態様の実施例である。本実施例は、例示の目的のためにのみ提供されるものであり、そしていかなる手段でも本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００９１】
用いる数値（例えば、量、温度など）について精度を保証する努力がなされているが、当然ながらある程度の実験誤差および偏差は許容されるべきである。
【実施例】
【００９２】
（実施例１）
（エマルジョン安定剤としてＰＶＡを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子（例えば、高分子を吸着または閉じ込めていない）を以下のようにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を用いて作製した。用いた溶液は以下である：（１）ジクロロメタン中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１０％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ＩＣＮ）。
【００９３】
詳細には、１０ｍｌのポリマー溶液と１．０ｍｌの蒸留水を組み合わせること、および１０ｍｍのプローブでのＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズすることにより、水／油（ｗ／ｏ）エマルジョンを形成し、微小粒子を作製した。このｗ／ｏエマルジョンを４０ｍｌの１０％ＰＶＡ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、水／油／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続け、微小粒子を形成した。形成した微小粒子を４回遠心分離することで水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９４】
（実施例２）
（ＣＴＡＢを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子を以下のようにＣＴＡＢを用いて生成した。用いた溶液は以下である：
（１）ジメチルクロライド中の４％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００９５】
詳細には、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水を合わせること、および１０ｍｍのプローブを備えるＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズして、ｗ／ｏエマルジョンを形成することにより、微小粒子を作製した。このｗ／ｏエマルジョンを５０ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズし、水／油／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続け、微小粒子を形成した。次いで、形成した微小粒子を３８μメッシュを通して濾過し、４回遠心分離することで水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９６】
（実施例３）
（ＳＤＳを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子を以下のようにＳＤＳを用いて生成した。用いた溶液は以下である：
（１）ジメチルクロライド中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００９７】
詳細には、１２．５ｍｌのポリマー溶液と５０ｍｌのＳＤＳ溶液を合わせること、および１０ｍｍのプローブを備えるＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズすることにより、この微小粒子を作製した。このエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続けた。形成した微小粒子を３８μメッシュを通して濾過し、４回遠心分離することで水で洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９８】
（実施例４）
（ブランク微小粒子へのタンパク質の吸着）
以下のように、微小粒子にタンパク質を吸着させた。
【００９９】
（Ａ．ｐ５５ｇａｇの１％および３％の理論的負荷）
１％および３％の理論的負荷を獲得するために、実施例３で生成した５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微小粒子をＮａｌｇｅｎｅ遠心分離管に入れ、そしてｐ５５ｇａｇタンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素を有する、１０ｍｌの２５ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ９を添加した：（ａ）１％理論負荷のために、１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌ ｐ５５ｇａｇ溶液を用いた；そして（ｂ）３％理論負荷のために、１０ｍｌの１５０μｇ／ｍｌ ｐ５５ｇａｇ溶液を用いた。この溶液を室温で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、この微小粒子を遠心分離し、そして上清を、ビシンコニン（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）アッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりｇａｇ濃度についてアッセイして、吸着した量を決定した。この微小粒子を１０ｍｌのホウ酸／６Ｍ尿素緩衝液で２回、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。
【０１００】
（Ｂ．ＨＣＶコア抗原の１％理論負荷）
１％理論負荷を獲得するために、５０ｍｇの凍結乾燥ブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微小粒子をＮａｌｇｅｎｅ遠心分離管に入れ、そしてモノマー性ＨＣＶコアタンパク質（１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌＨＣＶコアタンパク質溶液；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素を有する、１０ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．５を添加した。この混合物を室温で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、この微小粒子を遠心分離し、そして上清を、ビシンコニンアッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりＨＣＶ濃度についてアッセイし、吸着した量を決定した。この微小粒子を３０ｍｌのクエン酸／６Ｍ尿素緩衝液で２回、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。
【０１０１】
（実施例５）
（微小粒子の吸着効率）
実施例４からの吸着したタンパク質と凍結乾燥された微小粒子を、以下のように塩基加水分解を用いて総吸着タンパク質について分析した。１０ｍｇの凍結乾燥した吸着粒子を５％ＳＤＳを有する２ｍｌ ０．２Ｎ ＮａＯＨ中で４時間、加水分解し、中和し、そして１：１０に希釈し、そしてＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてタンパク質含量について分析した。表１に示すように、ＣＴＡＢおよびＳＤＳのような界面活性剤で調製した改変された表面を有する微小粒子は、両方とも、ＰＶＡのみを用いて作製した微小粒子よりもより効率的にタンパク質を吸着した。
【０１０２】
【表１】
（実施例６）
（Ａ．ｇａｇ吸着微小粒子の免疫原性）
実施例４に記載のように、ＰＶＡまたはＳＤＳを用いて生成したｇａｇ吸着微小粒子ならびにｐ５５ｇａｇ単独を、関連する微小粒子（陰性コントロールとして）およびワクシニアｇａｇ−ｐｏｌコントロール（陽性コントロールとして）を伴わずに、マウスに筋肉内投与した。この動物を７日および１４日でブースト（追加免疫）した。投与した総用量を表２および３に示す。最終免疫後２週間で脾臓を収集し、そしてＤｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：８５７８〜８５８３に記載のようにＣＴＬ活性をアッセイした。
【０１０３】
リンパ球培養物を以下のように調製した。免疫マウスからの脾臓細胞（ｓｃ）を１ウェルあたり５×１０6細胞で２４ウェルシャーレ中で培養した。これらの細胞のうち、１×１０6を、合成エピトープペプチド形態ＨＩＶ−１SF2タンパク質で１０μＭの濃度で３７℃で１時間、感作させ、洗浄し、そして残りの４×１０6の未処置のｓｃとともに、熱非働化ウシ胎仔血清、５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、抗生物質および５％インターロイキン２（Ｒａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を補充した２ｍｌの培養培地［５０％ＲＰＭＩ １６４０ および５０％α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）］中で、同時培養した。３日目および５日目に１ｍｌの新鮮培養培地を細胞に供給し、そして６日目に細胞傷害性をアッセイした。
【０１０４】
細胞傷害性細胞アッセイを以下のように実施した。51ＣＶ放出アッセイにおいて用いたＳｖＢＡＬＢ（Ｈ−２d）（ＳｖＢ）標識細胞およびＭＣ５７（Ｈ−２b）標的細胞は、クラスＩＭＨＣ分子を発現するがクラスＩＩＭＨＣ分子は発現しない。約１×１０6の標的細胞を５０μＣｉ（１Ｃｉ＝３７Ｇｂｑ）の51Ｃｒおよび合成ＨＩＶ−１ペプチド（１ｍＭ）を含有する２００μｌの培地中で６０分間インキュベートし、そして３回洗浄した。エフェクター（Ｅ）細胞を、９６ウェル丸底組織培養プレート中で、５×１０3標的（Ｔ）細胞とともに種々のＥ／Ｔ比で、２００μｌの培養培地中で、４時間培養した。二連のウェルからの平均ｃｐｍを用いて51Ｃｒ解離の特異比を算出した。
【０１０５】
表２および３に示すように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子は、ワクシニアコントロールに匹敵する活性を有し、そしてＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。詳細には、表２に示すように、ｐ５５ｇａｇタンパク質は、１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの濃度で不活性であった。さらに、表３に示すように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物は、ＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。このことは、タンパク質がＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５タンパク質処方物およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物に比べて、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物において、微小粒子により効率的に吸着されたことを示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
【表３】
（実施例７）
（改変された表面を有するｐＣＭＶｇｐ１２０ＤＮＡ−吸着微小粒子の調製）
ｇｐ１２０をコードする吸着プラスミドＤＮＡを有する微小粒子を以下のように調製した。実施例１および２に記載の様に調製した、１ｍｌ用量の２０ｍｇのブランク微小粒子をｐＣＭＶｇｐ１２０ＤＮＡの漸増濃度とともに４℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、この微小粒子を遠心分離し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、そして一晩、凍結乾燥した。この微小粒子を実施例５に記載の様に加水分解し、吸着したＤＮＡの量についてＡ260ｎｍで分析した。
【０１０８】
表４は、ＰＬＧ−ＰＶＡ微小粒子およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子の負荷効率を提示する。この表に示されるように、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子は、対応するＰＬＧ−ＰＶＡ粒子よりも効率的に吸着する。
【０１０９】
【表４】
（実施例８）
（ＨＣＶ−Ｅ２吸着）
微小粒子を、ＰＶＡ、およびいくつかの異なる界面活性剤を使用して、先の実施例に記載のように調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ２タンパク質を、以下のようにこれらの微小粒子の表面上に吸着させた：０．２ｍｇ／ｍｌのＥ２を、２０ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量０．５ｍｌ中、０．５％ ｗ／ｗのＥ２／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表５に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１０】
【表５】
（実施例９）
（ｇｐ１２０タンパク質の吸着）
先の実施例に記載のように、ＰＶＡを使用して微小粒子を調製した。また、以下のように、オレイン酸Ｎａ、アニオン性界面活性剤を使用して、微小粒子を調製した：ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、内部水相として１．６７ｍｌの３０ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ ６）、溶媒（油相）として１６．７ｍｌの、ジクロロメタン中６％のポリマーＲＧ５０５ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、および外部水相として６６．８ｍｌの０．４％オレイン酸Ｎａを用いて、調製した。これらの微小粒子を、「オレイン酸Ｎａ−ＰＬＧ（ｗ／ｏ／ｗ）」として、以下の表６に示す。さらに、微小粒子を、水中油処方物中のオレイン酸Ｎａを使用して調製し、そしてこれらの微小粒子を、「オレイン酸Ｎａ−ＰＬＧ（ｏ／ｗ）」として、以下の表６に示す。ｇｐ１２０タンパク質を、以下のように、この調製した微小粒子の表面上に吸着させた：０．３８８ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、約２０ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量０．８ｍｌ中、約１．４％ ｗ／ｗのｇｐ１２０／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表６に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１１】
【表６】
（実施例１０）
（リステリア溶解素（Ｌｙｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）タンパク質の吸着）
先の実施例に記載のように、ＰＶＡおよびＣＴＡＢを使用して微小粒子を調製した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のリステリア溶解素タンパク質（ＬＬＯ）を、以下のように、この微小粒子の表面上に吸着させた：１．０ｍｇ／ｍｌのＬＬＯを、１００ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量５ｍｌ中、１％ ｗ／ｗのＬＬＯ／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表７に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１２】
【表７】
（実施例１１）
（アジュバントとしてのアルミニウム塩の効果）
ｐ５５ｇａｇＤＮＡ吸着ＰＬＧ微小粒子を、上記のように、ＣＴＡＢを使用して調製した。この微小粒子を、２つの濃度でマウスに筋肉内注射し、そしてコントロールとして、ＤＮＡ単独を、同じ２つの濃度で注射した。さらに、１つの試行において、５０μｇのリン酸アルミニウムを、注射するＣＴＡＢ組成物に添加した。各処方物を、１０匹のマウスに注射した。このマウスを、２８日後にブーストした。この２回目の免疫化の２週間後、血清を収集し、そして各血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を、標準誤差とともに測定した。この結果を、表８（線形値およびｌｏｇ値の両方として表される）に要約する。各数値は、１０匹のマウスから得られた結果の平均である。
【０１１３】
【表８】
これらの結果を統計的に比較するために、以下のものについて、Ｐ値を生成した：ＤＮＡ−ＣＴＡＢ対ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ（Ｐ値＝０．００１７）；ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ対ＤＮＡ単独（Ｐ値＜０．０００１）；およびＤＮＡ−ＣＴＡＢ（１０μｇ）対ＤＮＡ単独（１０μｇ）（Ｐ値＜０．０００１）。これらのＰ値は、表８中の値の統計的有意性を確証する。
【０１１４】
（実施例１２）
（ζ電位の測定）
ζ電位の測定を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ３３１１６のＤＥＬＳＡ ４４０ＳＸゼータサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）上で実行した。このシステムを、Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＥＭＰ ＳＬ７（ポリスチレンラテックスビーズの水性懸濁液））の移動度スタンダードを使用して較正する。サンプルセルを滅菌水でリンスした後、サンプルをサンプルセルに添加した。次いで、カウンターを、最も低い値にビームを合わせることによって０に設定した。電流を、対照について０．７ｍＡおよびこのサンプルについて２０Ｖに設定した。４つ全てのビームからの検出レベルをチェックし、次いでこのサンプルを、ソフトウェアから「ｒｕｎ」を選択することによって作動させ、周波数測定を読取った。ビームを２０Ｈｚ間隔にするべきである。次いで、各サンプルについての平均ζ電位を読取った。
【０１１５】
本発明のいくつかの微小粒子処方物についての測定を読取った。結果を表９に示す。この結果が示すように、微小粒子表面への高分子の吸着は、微小粒子のζ電位を変化させる。
【０１１６】
【表９】
（実施例１３）
（カプセル化または吸着された高分子を含む微小粒子）
（Ａ）ＰＬＧ微小粒子を、ＲＧ５０５ＰＬＧおよびＰＶＡを使用し、そしてアジュバントＬＴＫ６３をカプセル化して調製した。１００ｍｇの微小粒子を、４００μｇ／ｍｌのｐ２４ｇａｇタンパク質を含む５ｍｌ ＰＢＳと共にインキュベートした。次いで、この混合物を、室温で一晩、振動させながらインキュベートし、２０ｍｌ ＰＢＳで２回および水で１回、遠心分離によって洗浄し、次いで、凍結乾燥させた。塩基の加水分解および中和後、吸着タンパク質％およびカプセル化アジュバント％を測定した；その結果を、表１０に示す。
【０１１７】
（Ｂ）ＰＬＧ微小粒子を、以下のように、ＳＤＳおよびＲＧ５０５ＰＬＧを使用し、そしてアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドをカプセル化して調製した：ＤＣＭ中、５ｍｌの６％ＲＧ５０５ポリマーを、０．５ｍｌの、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ中、５ｍｇ／ｍｌのＣｐＧで乳化して、ｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを、２０ｍｌの１％ ＳＤＳに添加し、次いで乳化して、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。微小粒子を、一晩の溶媒エバポレーションによって形成し、次いで、洗浄し、遠心分離し、そして凍結乾燥させた。１０ｍｇのＣｐＧカプセル化微小粒子を、１ｍｌのＤＣＭ中に溶解させた。０．５ｍｌの水を添加して、このオリゴヌクレオチドを抽出し、次いで、この混合物を遠心分離して、そしてその水相を、移動相としてＰＢＳを用いる、サイズ排除カラム上に注入した。１０ｍｇのプラセボ微小粒子を、１００μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合し、そして上記のように、ＤＣＭで抽出し、スタンダードとしてこのカラム上で泳動させた。この捕捉された粒子中に存在するＣｐＧオリゴヌクレオチドの量を、スタンダードに対して算出した。
【０１１８】
ｐ５５ｇａｇを、以下のように、ＣｐＧカプセル化微小粒子上に吸着させた：５０ｍｇの凍結乾燥したＣｐＧカプセル化微小粒子を、５ｍｌの、１４０μｇのｐ５５ｇａｇタンパク質を含む、６Ｍ尿素を含む２５ｍＭホウ酸（ｐＨ ９）と共に一晩インキュベートした。この混合物を、室温で一晩、振動させながらインキュベートし、２０ｍｌのホウ酸緩衝液／６Ｍ 尿素で２回、および水で２回洗浄し、次いで凍結乾燥させた。
【０１１９】
１０ｍｇのＣｐＧカプセル化／ｐ５５ｇａｇ吸着微小粒子を、塩基加水分解し、そして捕捉微小粒子％および吸着微小粒子％を測定した。他に示されない限り、この標的化された負荷は１．０％であった。この結果を、表１０に示す。
【０１２０】
【表１０】
（実施例１４）
（吸着した２つの高分子を有する微小粒子）
（Ａ）本発明に従って、２つ以上の高分子を、両方の高分子を吸着した微小粒子を含む組成物中で投与し得るか、または２つ以上の別個の微小粒子（各々が単一の高分子を吸着している）を含む組成物中で投与し得る。例えば、微小粒子を、以下のように、Ｅ２ポリペプチドおよびアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドの両方を吸着するように調製した：ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを、以前に記載されるように調製した。凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、生理食塩水中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ Ｅ２とともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振動し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌの通常の生理食塩水で２回洗浄し、そしてペレットを、室温で４時間、２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧを含有するＴＥ緩衝液中の１ｍｌのＣｐＧ溶液中に再懸濁した。最終的な懸濁液を、遠心分離によってＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。吸着したＣｐＧおよびＥ２を有する１０ｍｇの微小粒子を塩基性加水分解し、そしてタンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、そして上清中に残存するＣｐＧの量をＨＰＬＣによってアッセイして、微小粒子上に吸着したＣｐＧの量を測定した。この結果を表１１に表し、これは、両方の高分子についての陽性吸着を実証する。
【０１２１】
（Ｂ）微小粒子を、本発明に従って調製した。一部を使用してＥ２ポリペプチドを吸着させ、一方別の部分を使用してアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドを吸着させた。ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを、以前に記載されるように調製した。凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、生理食塩水中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ Ｅ２とともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振盪し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌの通常の生理食塩水で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。別に、凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、ＴＥ緩衝液中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧとともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振動し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌのＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。吸着した微小粒子のパーセントの測定の結果を、表１１に表す。
【０１２２】
【表１１】
（実施例１５）
（界面活性剤およびＰＶＡの組合せを使用して形成された微小粒子）
以下の手順を使用して、２つの界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（ＰＶＡおよび界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ））を含む微小粒子を形成した：ＤＣＭ中で１０ｍｌの５％ ＰＬＧポリマーおよび０．２％の界面活性剤ＤＯＴＡＰを、１２、０００ｒｐｍで３分間、１０ｍｌの滅菌水とともに乳化して、一次ｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを、４０ｍｌの０．８％ ＰＶＡに添加し、そして３分間乳化して、二次ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成し、このエマルジョンを、一晩攪拌して溶媒をエバポレートし、そして微小粒子を形成させた。この微小粒子を滅菌水中で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、本発明に従う高分子の吸着のために準備ができている。
【０１２３】
同じ手順を利用して、ＰＶＡおよび界面活性剤ＤＤＡの組合せを含む微小粒子を形成した。
【０１２４】
（実施例１６）
（吸着したｐ５５ ＤＮＡを有する微小粒子の免疫原性）
微小粒子を、界面活性剤ＣＴＡＢまたはＤＤＡを使用する、以前の実施例のように形成した。ｐ５５ ＤＮＡをこの微小粒子に吸着し、そして免疫原性を、以前の実施例に記載された手順を使用して評価した。この結果を、以下の表１２に要約する。
【０１２５】
【表１２】
（実施例１７）
（吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微小粒子を使用するインビボルシフェラーゼ発現）
微小粒子を、ＰＬＧおよび界面活性剤ＣＴＡＢを使用する上記の手順を使用して形成した。ルシフェラーゼＤＮＡを、以前に記載した方法を使用してこの微小粒子上に吸着させた。５μｇ用量のルシフェラーゼＤＮＡを使用するインビトロルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼＤＮＡ単独（１２４８ｐｇ）および微小粒子上に吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微小粒子（２２５０ｐｇ）を使用して測定した。インビボルシフェラーゼ発現を、以下のように、投与後１日目および１４日目において筋肉中で測定した：２つの群のマウス（ｎ＝５）を、各々、５０μｇのルシフェラーゼプラスミドまたは５０μｇのＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ルシフェラーゼＤＮＡ微小粒子のいずれかで注射した。両群のマウスに、２本の脚の前頸骨（ＴＡ）筋において筋肉内に注射した。２つの群における各マウス由来の両方のＴＡ筋を、１日目および１４日目のいずれかで収集し、そして−８０℃フリーザー中に保存した。この筋肉を、ドライアイス上で乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉末化筋肉を、０．５ｍｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ緩衝液を含有するエッペンドルフチューブ中に収集した。このサンプルを、室温で１５分間ボルテックスした。３回の凍結／融解後、このサンプルを、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。各時点での各マウスのＴＡ筋の上清をプールし、そしてこのサンプルの２０μｌを、ＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用して、ルシフェラーゼ発現のための増大したフラッシュ下でアッセイした。
【０１２６】
ルシフェラーゼ測定を、化学ルミネッセンスアッセイを使用して実施した。１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する緩衝液を、調製した。１０ｍｇ／ｍｌでのルシフェラーゼ酵素ストック（Ｐｒｏｍｅｇａ）を基準物として使用し、５００ｐｇ／２０μｌの濃度に希釈した。この基準物を、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ ２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）下へ連続的に１：２に希釈して、標準曲線を作製した。２０μｌのブランクおよびサンプルもまたこのプレート上に置き、そして連続的に１：２に希釈した。このプレートを、１ウェルあたり１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を注入したＭＬ３０００に置いた。増大したフラッシュ下において、相対光単位を、各サンプルについて測定した。
【０１２７】
この結果を、以下の表１３において表にする。
【０１２８】
【表１３】
（実施例１８）
（閉じ込められた抗原を有する微小粒子の免疫原性に対する、吸着された抗原を有する微小粒子の免疫原性）
微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。次いで、Ｅ２タンパク質を、上記のようにこの微小粒子上に吸着させた。微小粒子をまた、上記のように、Ｅ２をこの微小粒子上に吸着させるのではなくこの微小粒子中に閉じ込めるように調製した。この微小粒子を、各々の型の微小粒子を用いる１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体を誘導する能力について評価した。各マウス由来の血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物の群について平均した。標準誤差（ＳＥ）もまた算出した。ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ（有意レベル５％）を、ｐ＝０．０００６で測定した。この結果を、以下の表１４に示す：この結果は、本発明の吸着された微小粒子を使用して体液性免疫応答が優位に誘導されることを明確に実証する。
【０１２９】
【表１４】
（実施例１９）
（その上にスレオニンを吸着したＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を有する微小粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ１Ｅ２タンパク質を、この微小粒子上に吸着させた。この粒子を使用して、アジュバントミョウバンを用いてかまたは用いないで、１０μｇまたは１００μｇのタンパク質のいずれかを提供するために算出した微小粒子の用量でマウスを免疫した。相乗平均力価を測定し、そしてこの結果を以下の表１５に示す。
【０１３０】
【表１５】
この結果が示すように、微小粒子上に吸着したタンパク質を有する微小粒子は、１０μｇ用量で優位な免疫応答を生じる。このことは、この微小粒子が、遊離のＤＮＡがこのような応答を生じ得ない低用量において免疫応答を誘発することに有用であるという利点を有することを実証する。
【０１３１】
（実施例２０）
（吸着されたｐ２４ｇａｇタンパク質を有する微小粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＰＶＡ微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。次いで、タンパク質ｐ２４ｇａｇを、上記のようにこの微小粒子上に吸着させた。この微小粒子を、１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ２ａ抗体を誘導する能力について評価した。２回目の免疫の２週間後（２ｗｐ２）および３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）のマウスから収集した血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物の群について平均した。平均誤差（ＳＥ）もまた算出した。結果を以下の表１６に示す。この結果は、本発明の吸着した微小粒子を使用して体液性免疫応答が優位に誘導されることを明確に実証する。
【０１３２】
【表１６】
（実施例２１）
（ｐ５５ ｇａｇタンパク質および種々のアジュバントのＩＭ免疫）
ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、ＰＬＧ／ＳＤＳ微小粒子、およびＰＬＧ／ＰＶＡ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。遊離の可溶性ｐ５５ ｇａｇを提供することに対する、微小粒子上に吸着させた抗原ｐ５５ ｇａｇタンパク質でマウスを免疫することの異なる効果を分析するため、そして同じく他の微小粒子上に吸着させるか、または遊離の可溶性形態で提供されるアジュバントＣｐＧ（ＣｐＧモチーフを有する２０塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチド）を有することの効果を決定するために、８つの群の微小粒子を作製した。この異なる群を、以下のように調製した。
【０１３３】
群１は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した可溶性ｐ５５ ｇａｇタンパク質（２Ｍ尿素を有するｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で、２ｍｇ／ｍｌで酵母において生成された、組換えＨＩＶ ｐ５５タンパク質）を使用した。
【０１３４】
群２は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０１３５】
群３は、遊離ＣｐＧと混合した吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０１３６】
群４は、吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を、アジュバントなしで使用した。
【０１３７】
群５は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、粒子中に閉じ込められたｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＰＶＡ粒子を使用した。
【０１３８】
群６は、コントロールであり、抗原を使用せず、そして可溶性ＣｐＧを使用した。
【０１３９】
群７は、別のコントロールであり、可溶性ｐ５５ ｇａｇタンパク質を使用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０１４０】
群８は、別のコントロールであり、ｇａｇ遺伝子を発現するワクシニアウイルス（ｖｖ ｇａｇ）を単独で使用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０１４１】
各群について、１０匹のマウスを、群８を除いて（群８は、１０×１０7ｐｆｕの投薬量で使用した）ｐ５５ ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量が各々２５μｇ（その群に存在する場合）になるように、十分な量の微小粒子または遊離分子で免疫した。免疫経路は、群８を除いてＩＭであった（群８は、ＩＰであった）。免疫後、血清の抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測定した。その結果を以下の表１７において明らかにする、ＣＴＬによる標的の溶解もまた各群で測定した。その結果を以下の表１８において明らかにする。
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
【表１８】
（実施例２２）
（ｐ５５ ＤＮＡの吸着 対 閉じ込め）
吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、および微小粒子中に閉じ込められたｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。マウスのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を、１回目の免疫の４週間後（４ｗｐ１）、および２回目の免疫の２、４、６、１３、および１５週間後（それぞれ、２ｗｐ２、４ｗｐ２、６ｗｐ２、１３ｗｐ２、および１５ｗｐ２）に、先の実施例において記載されたように実施した。以下の表１９に示される結果は、閉じ込められたｐ５５および遊離ｐ５５の両方に優る吸着微小粒子の明白な利点を実証する。
【０１４４】
【表１９】
（実施例２３）
（モルモットにおける免疫応答の微小粒子誘導）
吸着ｇｐ１２０ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子を、先の実施例において上記のように形成した。他のサンプルは、以下の表２０に示される通りである。そしてこれは、リン酸アルミニウムを伴うかまたは伴わない微小粒子、リン酸アルミニウムを伴うかまたは伴わない遊離の可溶性ｇｐ１２０のコントロール、およびｇｐ１２０ ＤＮＡによってコードされるＭＦ５９タンパク質を含む。モルモットのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を、先の実施例において記載のように実施した。この結果を、以下の表２０に示す。
【０１４５】
【表２０】
（実施例２４）
（ｐ５５ ＤＮＡ吸着微小粒子での鼻腔内（ＩＮ）免疫）
吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、および吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＤＡ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。２５または１００μｇでのマウスのＩＮ免疫、抗体の誘導（血清の収集および分析）、およびＣＴＬ誘導を、１回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ１、４ｗｐ１）、２回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ２、４ｗｐ２）、ならびに３回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ３、４ｗｐ３）に、先の実施例において記載のように実施した。コントロールは、可溶性ｐ５５ ＤＮＡ単独での免疫、または１０μｇのコレラ毒素での免疫を含んだ。抗体誘導についての結果を表２１に示す。そしてＣＴＬによる溶解についての結果（４回目の免疫の４週間後）を、以下の表２２に示す。
【０１４６】
【表２１】
【０１４７】
【表２２】
本発明の好ましい実施態様が幾分詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明白な改変がなされ得ることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、１９９９年４月２日に出願された米国特許出願番号０９／２８５，８５５の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／２８５，８５５は、１９９８年７月２９日に出願された米国特許出願番号０９／１２４，５３３の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／１２４，５３３は、１９９８年１月２９日に出願された米国特許出願番号０９／０１５，６５２の一部継続出願であり、米国特許法第１２０条の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。米国特許出願番号０９／０１５，６５２は、次には、１９９７年１月３０日に出願された米国仮出願番号６０／０３６，３１６、および１９９７年１２月１６日に出願された６０／０６９，７４９に関連し、米国特許法第１１９条（ｅ）（１）の下でそこから優先権が主張され、そしてこの出願はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的に、薬学的組成物に関する。詳細には、本発明は、吸着表面を有する微小粒子、このような微小粒子を調製するための方法、およびそれらの使用に関する。さらに、本発明は、生分解性の微小粒子を含む組成物に関し、ここで生物学的に活性な薬剤（例えば、治療用ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗原、およびアジュバント）は、微小粒子の表面に吸着される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
粒子キャリアは、制御された、治療化合物の非経口的な送達を達成するために使用されてきた。このようなキャリアは、長期間にわたって送達系において活性薬剤を維持するために設計される。微小粒子キャリアの例には、ポリメチルメタクリレートポリマー由来の微小粒子、ならびにポリ（ラクチド）（例えば、特許文献１を参照のこと）、ＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（例えば、特許文献２を参照のこと）、ＰＥＧとして知られるポリエチレングリコール（例えば、特許文献３を参照のこと）由来の微小粒子が含まれる。ポリメチルメタクリレートポリマーは、非分解性であり、一方、ＰＬＧ粒子は、ランダムな非酵素的なエステル結合の加水分解によって、通常の代謝経路に沿って排出される乳酸およびグリコール酸に生分解する。
【０００４】
例えば、特許文献３は、鼻、経口、肺、および経口送達のための薬物送達系として、カプセル化された医薬を有するミクロスフェアの使用を記載する。種々のポリペプチド増殖因子を含む徐放性処方物もまた、記載されている。例えば、特許文献４、特許文献５、および特許文献６を参照のこと。
【０００５】
非特許文献１は、吸着したオリゴヌクレオチドを有するポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）から調製されるナノ粒子を記載する。
【０００６】
粒子キャリアはまた、適切な免疫応答を誘発するための試みにおいて吸着されたかまたは閉じ込められた抗原とともに使用されてきた。このようなキャリアは、免疫系に対する選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所的なリンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージによって食菌され得、そしてサイトカイン放出を通して抗原提示を増強し得る。例えば、１９９８年１月２９日に出願された、共有に係る、同時係属中の出願番号０９／０１５，６５２は、細胞媒介免疫応答を刺激するための、抗原を吸着させた微小粒子および抗原をカプセル化させた微小粒子の使用、ならびにその微小粒子を作製する方法を記載する。
【０００７】
例えば、共有に係る仮特許出願６０／０３６，３１６において、微小粒子を形成する方法が開示され、これは、ポリマーを有機溶媒と合わせる工程、次いで、エマルジョン安定化剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））を添加する工程、次いで、有機溶媒を蒸発させ、それによって微小粒子を形成する工程を包含する。この微小粒子の表面は、そのポリマーおよびその安定化剤を含む。次いで、高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、および抗原）が、これらの表面に吸着され得る。
【０００８】
カチオン性脂質に基づくエマルジョンは、遺伝子キャリアとして使用され得ることがまた示さている。例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３，７７３，９１９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７６７，６２８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４８，０９５号明細書
【特許文献４】国際公開第９４／１２１５８号パンフレット
【特許文献５】米国特許第５，１３４，１２２号明細書
【特許文献６】国際公開第９６／３７２１６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆａｔｔａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：１３７−１４３（１９９８）
【非特許文献２】Ｙｉら、Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ；ａ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ，ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：６５３−６５４（１９９７）
【非特許文献３】Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｉｎｔｒａ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２５：３４４−３４５（１９９８）
【非特許文献４】Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２６，＃５４３８（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗原吸着したＰＬＧ微小粒子は、他のより毒性の系よりも有意な利点を提供し、微小粒子表面への生物学的に活性な薬剤の吸着は、問題であり得る。例えば、荷電しているか、またはかさ高い生物学的に活性な薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、大きなポリペプチドなど）を、微小粒子表面に吸着させることは、しばしば困難か、または不可能である。従って、このような薬剤、特に、高度に感受性でありかつ処方するのが困難な薬物のための柔軟な送達系の必要性が、継続して存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明者らは、本明細書中において、広範な種々の高分子を吸着し得る吸着表面を有する微小粒子を形成する方法を発明した。この微小粒子は、ポリマーおよび界面活性剤の両方からなる。本発明の微小粒子は、現在利用可能な他の微小粒子よりも効率的にこのような高分子を吸着する。
【００１３】
この微小粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、ポリシアノアクリレートなど）から誘導され、そして界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤）とともに形成される。これらの界面活性剤は、組み合わせて使用され得る。さらに、本発明者らは、これらの微小粒子が、ＰＶＡのみを使用するプロセスによって形成される微小粒子と比較して、ウイルス抗原の吸着の改善をもたらし、そして、優れた免疫応答を提供することを発見した。ＰＶＡのみを用いて作製される微小粒子は、いくつかの高分子を吸着し得るが、他の界面活性剤を単独で、組み合わせて、またはＰＶＡと組み合わせて使用する本発明の微小粒子は、広範な種々の高分子を吸着する。従って、次いで、本発明は、主に、そのような微小粒子、ならびに、そのような微小粒子を作製するためのプロセス、およびその微小粒子を使用する方法に関する。
【００１４】
１つの実施態様において、本発明は、吸着表面を有する微小粒子に関し、ここでその微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含む。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、微小粒子表面に吸着される、選択した高分子（例えば、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、またはそれらの組合せなど）をさらに含むこのような微小粒子に関する。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、本発明の微小粒子に吸着した、選択した高分子、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、微小粒子組成物に関する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、生分解性ポリマーおよびイオン性界面活性剤を含有する微小粒子に関する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、吸着表面を有する微小表面を産生する方法に関し、この方法は以下の工程：
（ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有するポリマー溶液（ここでこのポリマーは、約１％〜約３０の濃度で、有機溶媒中に存在する）、
およびアニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ここでこれらの界面活性剤は、０．００１〜１０の重量対重量の界面活性剤対ポリマーの比で存在して、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する）をポリマー溶液と合わせる工程；
（ｂ）このポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程；
（ｃ）有機溶媒を除去する工程；ならびに
（ｄ）微小粒子を回収する工程、
を包含する。
【００１９】
好ましくは、ポリマー／界面活性剤混合物は、有機溶媒を除去する前に乳化されてエマルジョンを形成する。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載した方法によって産生される微小粒子に関する。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、吸着された高分子を有する微小粒子を産生する方法に関し、以下の工程：
（ａ）ポリ（Ｄ，Ｌ−ポリラクチド−コ−グリコリド）を含有するポリマー溶液（ここでこのポリマーは、有機溶媒中で、約３％〜約１０％の濃度で存在する）；
および、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（ここでこの界面活性剤は、０．００１〜１０の重量対重量の界面活性剤対ポリマーの比で存在して、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する）を合わせる工程；
（ｂ）このポリマー／界面活性剤混合液を分散させる工程；
（ｃ）このエマルジョンから溶媒を除去する工程；
（ｄ）微小粒子を回収する工程；ならびに
（ｅ）微小粒子の表面に高分子を吸着させる工程であって、ここでこの高分子は、医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、およびそれらの組合せからなる群より選択される。好ましくは、ポリマー／界面活性剤混合物は、有機溶媒を除去する前に乳化されて、エマルジョンを形成する。別の実施態様において、本発明は、上記に記載の方法によって産生された吸着した高分子を有する微小粒子に関する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、微小粒子の表面に吸着した高分子および薬学的に受容可能な賦形剤を有する、吸着微小粒子を合わせる工程を包含する、吸着微小粒子組成物を産生する方法に関する。
【００２３】
なお別の実施態様において、本発明は、上記の組成物を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、脊椎動物被験体に高分子を送達する方法に関する。
【００２４】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の微小粒子に吸着した選択された高分子の治療的有効量を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、脊椎動物被験体において細胞内免疫応答を誘発するための方法に関する。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、上記の微小粒子組成物の治療的有効量を、脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、免疫方法に関する。この組成物は、必要に応じて、結合していない高分子を含み得、そしてまた、必要に応じて、アジュバント（アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム）を含む）を含み得る。
【００２６】
好ましい実施態様において、微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）；より好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）；そして最も好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成される。
【００２７】
好ましい実施態様において、微小粒子は、疾患の診断における使用のためである。
【００２８】
好ましい実施態様において、微小粒子は、疾患の処置における使用のためである。
【００２９】
好ましい実施態様において、微小粒子は、ワクチンにおける使用のためである。
【００３０】
好ましい実施態様において、微小粒子は、免疫応答を惹起する際における使用のためである。
【００３１】
非消耗性の以前に記載された吸着微小粒子の各々はまた、必要に応じて、それらの中に閉じ込められた高分子を有し得る。
【００３２】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮して、当業者に容易に想定される。
好適な実施形態によれば、本発明により、以下が提供される：
（項目１） 吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は、以下：
ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマー；および
界面活性剤、
を含有する、微小粒子。
（項目２） さらに、以下：
前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目１に記載の微小粒子。
（項目３） さらに、以下：
前記微小粒子内にカプセル化された第二の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素，転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第二の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目２に記載の微小粒子。
（項目４） 前記微小粒子がポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（αヒドロキシ酸）を含有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目５） 前記微小粒子がポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目６） 前記界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目７） 前記界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目８） 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目１〜５のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目９） 前記第一の生物学的に活性な高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原からなる群より選択される抗原である、項目２〜８のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１０） 前記第一の生物学的に活性な高分子がｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドである、項目２〜９のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１１） 前記第二の生物学的に活性な高分子がアジュバントである、項目３〜１０のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１２） 前記アジュバントがアルミニウム塩である、項目１〜１１のいずれか１項に記載の微小粒子。
（項目１３） 項目１〜１２のいずれか１項に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目１４） 項目１〜１２のいずれか１項に記載の微小粒子を含有し、さらにアジュバントを含有する、微小粒子組成物。
（項目１５） 前記アジュバントがＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬおよびアルミニウム塩からなる群より選択されるメンバーである、項目１４に記載の微小粒子組成物。
（項目１６） 前記アジュバントがアルミニウム塩であって、該アルミニウム塩がリン酸アルミニウムである、項目１５に記載の微小粒子組成物。
（項目１７） 吸着表面を有する微小粒子を産生する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を分散させる工程であって、ここで、該ポリマー溶液が、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、ここで、該ポリマーが有機溶媒中の約１％〜約３０％の濃度で存在し、そして該界面活性剤が約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；および
該エマルジョンから該有機溶媒を除去する工程、
を包含する、方法。
（項目１８） 前記界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記界面活性剤がカチオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目２０） 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 前記界面活性剤が約０．０００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 前記界面活性剤が約０．００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３） 前記界面活性剤が約０．００５：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４） 前記微小粒子がポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択されるポリ（αヒドロキシ酸）を含有する、項目１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５） 前記微小粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記微小粒子が約３％〜約１０％の濃度で存在するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含有する、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 吸着表面を有する微小粒子を産生する方法であって、該吸着表面には、生物学的に活性な高分子が吸着されており、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を乳化してエマルジョンを形成する工程であって、該ポリマー溶液は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、そして該ポリマーは、約１％〜約３０％の濃度で、有機溶媒中に存在し、そして該界面活性剤は、約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、該吸着表面を有する該微小粒子を形成する工程；ならびに
（ｃ）該微小粒子の表面に対して該高分子を吸着させる工程、
を包含する、方法。
（項目２８） 前記高分子が、医薬、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 前記高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原からなる群より選択される抗原である、項目２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０） 前記高分子が、ｇｐ１２０をコードするポリヌクレオチドである、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 前記界面活性剤が約０．０００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２） 前記界面活性剤が約０．００１：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３） 前記界面活性剤が約０．００５：１〜約０．０１：１の重量対重量での界面活性剤対ポリマー比で存在する、項目２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４） 項目１７〜３３のいずれか１項に記載の方法に従って作製された微小粒子。
（項目３５） 項目３４に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目３６） 吸着表面を有する微小粒子を含有する微小粒子組成物を産生する方法であって、該吸着表面には、生物学的に活性な高分子が吸着されており、該方法は以下の工程：
（ａ）ポリマー溶液および界面活性剤の混合物を乳化してエマルジョンを形成する工程であって、該ポリマー溶液は、ポリ（αヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択されるポリマーを含有し、そして該ポリマーは、約１％〜約３０％の濃度で、有機溶媒中に存在し、そして該界面活性剤は、約０．００００１：１〜約０．１：１の重量対重量の界面活性剤対ポリマー比で該混合物中に存在する、工程；
（ｂ）該エマルジョンから該有機溶媒を除去して、該吸着表面を有する該微小粒子を形成する工程；
（ｃ）該微小粒子の表面に対して該高分子を吸着させる工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）からの該吸着された高分子を有する該微小粒子を薬学的に受容可能な賦形剤と合わせて該微小粒子組成物を形成する工程、
を包含する、方法。
（項目３７） 項目３６に記載の方法に従って作製された微小粒子組成物。
（項目３８） 脊椎動物被験体に治療上有効な量の高分子を送達する方法であって、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物を該脊椎動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３９） 疾患の診断のための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４０） 疾患の処置のための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４１） ワクチンのための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４２） 免疫応答を惹起するための、項目１３〜１６、３５または３７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４３） 吸着表面を有する微小粒子であって、該微小粒子は以下：
生体分解性ポリマー；および
界面活性剤、
を含有する、微小粒子。
（項目４４） さらに、以下：
前記微小粒子の表面に吸着した第一の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第一の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第一の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目４３に記載の微小粒子。
（項目４５） さらに、以下：
前記微小粒子内にカプセル化された第二の生物学的に活性な高分子であって、ここで、該第二の生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、医薬、ホルモン、酵素，転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、およびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、第二の生物学的に活性な高分子を含有する、
項目４４に記載の微小粒子。
（項目４６） 項目４４〜４５のいずれか１項に記載の微小粒子および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、微小粒子組成物。
（項目４７） 項目４６の記載の微小粒子を含有し、さらに、アジュバントを含有する、微小粒子組成物。
（項目４８） 疾患の診断のための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目４９） 疾患の処置のための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目５０） ワクチンのための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
（項目５１） 免疫応答を惹起するための、項目４６〜４７のいずれか１項に記載の微小粒子組成物の使用。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内にある、化学、高分子化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，１９９６）を参照のこと。
【００３４】
本明細書中で引用される、すべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記に関わらず、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。
【００３５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に指示しない限りは、複数形の言及を含む。従って、例えば、用語「微小粒子（ａ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」とは、１つ以上の微小粒子をいう、などである。
【００３６】
（Ａ．定義）
本明細書において記載される際に、以下の用語が使用され、そして以下に示すように定義されることが意図される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「微小粒子」とは、直径約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子をいう。好ましくは、この微小粒子は、針およびキャピラリーをふさぐことなく、非経口投与または粘膜投与を可能にする直径のものである。微小粒子のサイズは、当該分野で周知の技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法、および／または走査電子顕微鏡法）によって容易に決定される。
【００３８】
本明細書中における使用のための微小粒子は、滅菌可能であり、非毒性であり、そして生分解性である物質から形成される。このような物質には、限定することなく、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシアノアクリレートが挙げられる。好ましくは、本発明での使用のための微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）由来、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドもしくはグリコール酸のコポリマー（例えば、Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマー由来である。この微小粒子は、種々のポリマー性の出発物質のいずれかから誘導され得る。この物質は、種々の分子量を有し、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比、を有し、これらの選択は、大部分選択可能な問題であり、同時投与される高分子に部分的に依存する。これらのパラメーターは、以下でより十分に議論される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」とは、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）およびエマルジョン安定化剤を含む。アニオン性界面活性剤には、ＳＤＳ、ＳＬＳ、硫酸化脂肪アルコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤には、セトリミド（ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロマイド）、ＤＯＴＡＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤には、ソルビタンエステル、ポリソルビン酸、ポリオキシエチル化グリコールモノエステル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポロキサマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「正味の正電荷」は、微小粒子の表面上の電荷が、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子の表面上の電荷より正であることを意味する。同様に、本明細書で用いられる「正味の負電荷」は、微小粒子の表面上の電荷が、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子の表面上の電荷より負であることを意味する。正味の電荷は、カチオン性またはアニオン性界面活性剤を用いて作製された微小粒子のζ電位（界面動電位としてもまた知られる）を、ＰＶＡを用いて作製された対応する微小粒子と比較することにより評価され得る。従って、「正味の正電荷」を有する微小粒子表面は、ＰＶＡを用いて作製された微小粒子の表面のζ電位より大きなζ電位を有し、そして「正味の負電荷」を有する微小粒子は、ＰＶＡを用いて作製された微小粒子の表面のζ電位より小さなζ電位を有する。明らかなように、本発明の微小粒子の正味の電荷は、対応するＰＶＡ微小粒子のζ電位に対して算出される。
【００４１】
本明細書で用いる用語「ζ電位」は、すべての固体と液体の界面を横切って存在する電位、すなわち、荷電したコロイド粒子を取り囲むイオンの拡散層を横切る電位をいう。ζ電位は、電気泳動の移動度、すなわち、測定される物質と接触して配置された荷電電極の間をたどるコロイド粒子の速度から、当該部分野で周知の技法を用いて算出され得る。
【００４２】
本明細書で用いる用語「高分子」は、制限されずに、医薬品、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路中の中間体、免疫モジュレーター、抗原、アジュバント、またはそれらの組み合わせをいう。本発明との使用のための特定の高分子は、以下により詳細に記載される。
【００４３】
用語「医薬品」は、以下でより詳細に論議される、抗生物質、抗ウイルス剤、増殖因子、ホルモンなどのような生物学的に活性な化合物をいう。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」は、生物学的に活性な（例えば、免疫原性または治療）タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子である。このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの性質に依存して、例えば、このポリヌクレオチドが抗原をコードする場合、ポリヌクレオチドは、１０程度の少ないヌクレオチドを含み得る。さらに、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖配列の両方を含み得、そして限定されないが、ウイルスからのｃＤＮＡ、原核生物ｍＲＮＡまたは真核生物ｍＲＮＡ、ウイルスからのゲノムＲＮＡおよびＤＮＡ配列（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡウルイスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ、および特に合成ＤＮＡ配列をいう。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含み、かつ核酸分子が、治療または抗原性タンパク質をコードする限り、ネイティブ配列に対する、欠失、付加および置換のような改変（本質的にほぼ保存的）を含む配列を示す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異によるような偶発的であり得る。
【００４５】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい、そしてこの産物の最小長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどがこの定義内に含まれる。完全長タンパク質およびそのフラグメントの両方がこの定義に包含される。この用語はまた、タンパク質が、免疫応答を惹起する能力を維持するか、またはこのタンパク質が投与される被験体に対する治療効果を有する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（本質的にほぼ保存的）のような改変もまた含む。
【００４６】
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激し得る１つ以上のエピトープを含み、この抗原が本発明に従って提示されるとき、細胞抗原特異的免疫応答、または体液性抗体応答を生じる分子を意味する。抗原は、それ自身で、または別の分子と組み合わせて存在するとき、細胞性または体液性応答を惹起し得る。通常、エピトープは、約３〜１５の間、一般に約５〜１５のアミノ酸を含む。所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ中のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。例えば、直線状のエピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチドを同時に合成すること（これらのペプチドはタンパク質分子の部分に対応する）、およびこれらのペプチドをなお支持体に付着しているまま、これらペプチドを抗体と反応させることにより決定され得る。このような技法は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４、７０８、８７１；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載される（すべてはそれらの全体が参考として援用される）。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的構造を決定することにより容易に同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前述を参照のこと。
【００４７】
本明細書で用いる用語「抗原」は、サブユニット抗原、すなわち抗原が自然状態では会合している完全な生物から分離および別個である抗原、および殺傷、弱毒または不活性化細菌、ウイルス、寄生体またはその他の微生物の両方を示す。抗イディオタイプ抗体、そのフラグメント、および抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）のような抗体はまた、本明細書で用いられるような抗原の定義の下に含ます得る。同様に、遺伝子治療および核酸免疫化適用におけるような、インビボで、治療または免疫原性タンパク質、または抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書で抗原の定義内に含まれる。
【００４８】
さらに、本発明の目的には、抗原は、任意のいくつかの公知のウイルス、細菌、寄生体およびカビ、ならびに任意の種々の腫瘍抗原に由来し得る。さらに、本発明の目的には、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を惹起する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する、欠失、付加および置換のような改変（本質的にほぼ保存的）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるような意図的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異によるような偶発的であり得る。
【００４９】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生である。本発明の目的には、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、その一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／またはその他の白血球細胞により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と会合して存在し、そして細胞の表面上に発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物で感染した細胞の溶解を補助して誘導しかつ促進する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルバーＴ細胞は、この機能を補助して促進し、そしてそれらの表面上にＭＨＣ分子と会合するペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異的エフェクター細胞の活性を集めるために作用する。「細胞免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来の白血球を含むその他の白血球細胞により産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００５０】
免疫原性組成物のような組成物、または細胞免疫応答を惹起するワクチンは、細胞表面で、ＭＨＣ分子と会合する抗原の提示によって脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞媒介免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞、またはその近傍を指向する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が生成され、免疫化宿主の将来の保護を可能にし得る。
【００５１】
特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによるか、感作された被験体中の抗原に特異的であるＴリンパ球についてアッセイすることによるような、多くのアッセイにより測定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００５２】
従って、本明細書で用いられるように、免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を惹起し得る。それ故、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原（単数または複数）に対して特異的なサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するため、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するように働き得、免疫化宿主に保護を提供する。このような応答は、当該分野で周知の標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００５３】
微小粒子に吸着された選択抗原を含む組成物は、それが、微小粒子と会合することなく送達されたときに、等量の抗原によって惹起される免疫応答より大きい免疫応答を惹起する能力を所有するとき、「増大した免疫応答」を果たす。従って、組成物は、「増大した免疫原性」を果たし得る。何故なら、抗原は、微小粒子への吸着のため、より強力に免疫原性であるからであるか、またはより低用量の抗原が、それが投与される被験体における免疫応答を達成するために必要であるからである。このような増大した免疫原性は、微小粒子／抗原組成物、および抗原コントロールを動物に投与すること、ならびに当該分野で周知の、ラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的なアッセイを用いることにより、この２つに対する抗体力価を比較することにより測定され得る。
【００５４】
本明細書で提供されるように、高分子／微小粒子の、用語「有効量」または「薬学的に有効な量」は、免疫学的応答、および対応する治療効果のような所望の応答を提供するために、非毒性であるが十分な量、または治療タンパク質の送達の場合には、以下に規定されるように被験体の処置を行うに十分な量の高分子／微小粒子をいう。以下に指摘されるように、正確な必要量は、被験体の種、年齢、および一般状態、処置される状態の重篤度、および目的の特定の高分子、投与の様式などに依存して、被験体により変動し得る。任意の個々の事例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて当業者により決定され得る。
【００５５】
「脊椎動物被験体」は、ｃｏｒｄａｔａ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを意味し、制限されずに、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマおよびヒトのような哺乳動物；イヌおよびネコのような家畜動物；ならびにヒヨコを含む雄鳥および雌鳥、七面鳥およびその他のキジ類の鳥のような、家禽、野生および狩猟鳥を含む鳥類を含む。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体動物および新生動物の両方を含むことが意図される。
【００５６】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、生物学的でないか、またはそうでなければ所望されない材料を意味し、すなわち、この材料は、任意の所望されない生物学的影響を引き起こさないか、またはそれが含まれる組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用することなく、微小粒子処方物とともに、個体に投与され得る。
【００５７】
「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲にあるｐＨ」は、約７．２〜８．０を含む範囲、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲にあるｐＨを意味する。
【００５８】
本明細書で用いられる「処置」は、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または除去、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な除去のいずれもをいう。処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）に実施され得る。
【００５９】
（Ｂ．一般的方法）
本発明は、本発明のＰＬＡおよびＰＬＧ微小粒子が、生物学的に活性な高分子を効率的に吸着するという発見に基づく。さらに、これらの微小粒子は、ＰＶＡで調製された微小粒子より容易に、荷電および／またはかさ高い高分子を含む、より多種の分子を吸収する。従って、本発明の高分子／微小粒子は、広範な種類の疾患を処置、予防および／または診断するために、生物学的に活性な成分を送達するための送達系として用い得る。
【００６０】
本発明は、広範な種類の高分子を送達するために用い得、制限されないで、抗生物質および抗ウイルス剤、非ステロイド抗炎症性薬物、鎮痛剤、血管拡張薬、循環器薬物、向精神剤、神経安定薬、抗うつ薬、抗パーキンソン薬物、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学療法剤、抗腫瘍剤および増殖因子（ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、ＦＧＦを含むがこれらに限定されない）、ワクチンにおける使用のための、治療または免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質およびそれらのエピトープをコードするポリヌクレオチド、ペプチドホルモン（例えば、インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソマトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン、ＡＮＰ、ＦＳＨ、ＬＨ、ＰＳＨおよびｈＣＧ）、生殖腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、エストロゲンおよびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシストキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、シソルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、マガイニン、マストパランス（ｍａｓｔｏｐａｒａｎｓ）、デルマセプシン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）、システミン（ｓｙｓｔｅｍｉｎ）、ニューロメディン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）、ニューロテンシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セクレチン、チモシン、などを含むホルモン、酵素、転写または翻訳メディエーター、代謝経路中の中間体、（インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、およびγインターフェロンを含む種々のサイトカインのいずれかのような）免疫モジュレーター、抗原、ならびにアジュバントのような医薬品を含む。
【００６１】
好適な実施態様では、上記高分子は抗原である。本発明の特定の利点は、吸着された抗原をともなう微小粒子が脊椎動物被験体で細胞媒介免疫応答を生成する能力である。本発明の抗原／微小粒子が選択された抗原に対する細胞媒介性免疫応答を惹起する能力は、広範な種類の病原体による感染に対する強力なツールを提供する。従って、本発明の抗原／微小粒子は、ワクチン組成物中に取り込まれ得る。
【００６２】
従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書に記載のシステムは、例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子との発現された抗原の会合を提供し、その結果、目的の抗原に応答するインビボ細胞免疫応答が、ＣＴＬの産生を刺激し、この抗原の将来の認識を可能するようにマウントされ得る。さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を惹起し得る。従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性免疫応答が所望される任意の高分子、好ましくは、抗体，Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞障害性エピトープを誘導し得るウイルス病原体由来の抗原、を用いた使用を見出す。このような抗原は、制限されないで、ヒトおよび動物ウイルスによりコードされる抗原を含み、そして構造または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００６３】
本発明の微小粒子は、通常、貧弱な免疫応答を惹起する細胞内ウイルスに対する免疫化に特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリーからの広範な種類のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための使用を見出し、このタンパク質には、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨのような、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来のタンパク質；ＣＭＶ ｇＢおよびｇＨを含む、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原が挙げられる。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総説は、Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｌａｇ １９９０）１２５〜１６９頁；種々のＨＳＶ−１がコードするタンパク質の論議は、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１〜１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＢおよびｇＤタンパク質およびそれらをコードする遺伝子の論議は、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の同定は、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１；ならびにＶＺＶの総説は、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。
【００６４】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Δ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む、ウイルスの肝炎ファミリーからの抗原もまた、本明細書に記載の技法において首尾良く用いられ得る。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法のように公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、Ｅ１（Ｅとしてもまた公知）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳ１としてもまた公知）およびＮ−末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）を含むいくつかのウイルスタンパク質をコードする（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の論議は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８を参照のこと）。これらタンパク質の各々、およびその抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法において使用を見出し得る。
【００６５】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本発明の組成物および方法において好都合に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ、およびプレ表面配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前はｐｒｅ−Ｓと呼ばれた）、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書中で用途を見出す。例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｃｅ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ、Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、１５９〜１７６頁、ＨＢＶ構造の考察について；米国特許第４，７２２，８４０号、第５，０９８，７０４号、第５，３２４，５１３号（その全体が参考として本明細書中に援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６６】
他のウイルス由来の抗原もまた、本願発明の組成物および方法における用途を見出す。このような抗原としては、限定なく、とりわけ以下の科のウイルスのメンバー由来のタンパク質が挙げられる：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラボドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）など）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−Ｉ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる）であり、分離株ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN由来の抗原を含むが、これらに限定されない）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4；ＨＩＶ−２；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００６７】
より詳細には、上記のＨＩＶ分離株（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）のいずれかに由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質が公知であり、そして報告され（例えば、Ｍｙｅｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと（種々のＨＩＶ分離株のエンベロープ配列の比較について））、そしてこれらの分離株のいずれかに由来の抗原は、本方法において用途を見出す。さらに、本発明は、種々のＨＩＶ分離株のいずれかに由来の他の免疫原性タンパク質（種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む）に等しく適用し得る。
【００６８】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。詳細には、エンベロープ糖タンパク質であるインフルエンザＡのＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生成するために特に関心が高い。インフルエンザＡの多数のＨＡサブタイプは、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、これらの分離株のいずれかに由来のタンパク質もまた、本明細書中に記載の組成物および方法において使用され得る。
【００６９】
本明細書中に記載の組成物および方法はまた、種々の細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、脳髄膜、および他の病原状態を引き起こす生物（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ型（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）に由来の抗原）を伴う用途を見出す。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂ由来の抗原の例は、以下の共同所有する特許出願に開示される：ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６５５；ＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３；および米国仮特許出願第６０／０８３，７５３号；第６０／０９４，８６９号；第６０／０９８，９９４号；第６０／１０３，７４９号；第６０／１０３，７９４号；第６０／１０３，７９６号；および第６０／１２１，５２８号。寄生生物抗原の例は、マラリア病およびライム病を引き起こす生物に由来する抗原を包含する。
【００７０】
本発明は、広範な種々の高分子を送達するために、従って多数の疾患の処置、予防、および／または診断するために使用され得ることが、容易に明らかである。別の実施態様では、本発明の高分子／微小粒子組成物は、部位特異的標的化送達のために使用され得る。例えば、高分子／微小粒子組成物の静脈投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環、または骨髄を標的化するために使用され得る。
【００７１】
吸着微小粒子の表面への高分子の吸着は、任意の結合−相互作用機構を介して生じる。このような機構としては、イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、および親水性／疎水性相互作用を介する結合を包含するが、これらに限定されない。当業者は、吸着される高分子のタイプに適切な界面活性剤を容易に選択し得る。
【００７２】
例えば、荷電された界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で製造された微小粒子は、正味の負電荷または正味の正電荷を有する表面を有する微小粒子を生じ得る。この微小粒子は、広範な種々の分子を吸着し得る。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなアニオン性界面活性剤を用いて製造された微小粒子（すなわち、ＳＤＳ−ＰＬＧ微小粒子）は、正に荷電された抗原（例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）のようなカチオン性界面活性剤を用いて製造された微小粒子（すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微小粒子）は、負に荷電された高分子（例えば、ＤＮＡ）を吸着する。吸着される高分子が正電荷および負電荷の領域を有する場合、カチオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤のいずれかが適切であり得る。
【００７３】
本発明と共に使用するための微小粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ．から容易に商業的に入手可能である。例えば、本明細書中の微小粒子を形成するために有用なポリマーは、ポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；ならびにポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ともに、本明細書中で「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中では「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と称される）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーに由来のポリマーを包含する。本明細書中の使用のための特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所定の用途のための適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについては、適切な分子量は、約２０００〜５０００の桁であり得る。ＰＬＧについては、適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲であり、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００である。
【００７４】
ＰＬＧのようなコポリマーを用いて微小粒子を形成する場合、種々のラクチド：グリコリド比が本明細書中で用途を見出し、そしてこの比は大いに設計事項であり、同時投与される高分子、および所望の分解率に一部依存する。例えば、５０：５０ＰＬＧポリマー（５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含む）は、迅速に再吸収するコポリマーを提供するが、一方、７５：２５ ＰＬＧは、より緩慢に分解し、そして８５：１５および９０：１０ではさらにより緩慢である。これは、ラクチド成分の増加に起因する。ラクチド：グリコリドの適切な比は、問題の抗原および障害の性質に基づいて当業者によって容易に決定されることが、容易に明らかである。さらに、種々のラクチド：グリコリド比を伴う微小粒子の混合物が、所定の高分子について所望の放出速度論を達成するため、および一次免疫応答および二次免疫応答の両方を提供するために、本明細書中で用途を見出す。本発明の微小粒子の分解率はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶性のような要因によって制御され得る。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を伴うＰＬＧコポリマーは、多数の供給源から商業的に容易に入手可能である。このような供給源としては、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬが挙げられる。これらのポリマーはまた、当該分野で周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載の技術）を用いて、乳酸成分の単純な縮合によって合成され得る。
【００７５】
高分子／微小粒子は、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかを用いて調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載の技術）が、この微小粒子を作製するために本明細書中で使用され得る。これらの技術は、ポリマー溶液の小滴からなる一次エマルジョンの形成を包含する。これは、続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続した水相と混合される。
【００７６】
あるいは、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレーションシステムは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２により記載のように微小粒子を形成するために使用され得る。本技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、塩化ジメチル（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と組み合わされる。ポリマーは、有機溶媒中、約１〜３０％溶液、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、および最も好ましくは約４％溶液中に提供される。このポリマー溶液が、例えば、ホモジナイザーを用いて乳化される。必要に応じて、次いで、エマルジョンが、大量のエマルジョン安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、およびカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤）の水溶液と組み合わされる。エマルジョンは、１つより多くのエマルジョン安定剤および／または界面活性剤と組み合わされ得る（例えば、ＰＶＡおよび界面活性剤の組み合わせ）。特定の高分子は、安定剤および／または界面活性剤の組み合わせを有する微小粒子に、より容易に吸着し得る。エマルジョン安定剤が使用される場合、代表的には約２〜１５％溶液、より代表的には約４〜１０％溶液で提供される。一般に、約０．００００１：１から約０．１：１の範囲の界面活性剤：ポリマー重量比が使用され、より好ましくは、約０．０００１：１から約０．０１：１、より好ましくは約０．００１：１から約０．０１：１、およびさらにより好ましくは約０．００５：１から約０．０１：１である。次いで、混合物はホモジナイズされて、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成する。有機溶媒は、次いでエバポレートされる。
【００７７】
処方パラメーターは、０．０５μｍ（５０ｎｍ）の桁の小さな微小粒子から５０μｍまたはさらに大きいより大きな微小粒子の調製を可能にするように操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、攪拌の減少は、内部相の体積の増大につれて、より大きな微小粒子を生じる。小さな粒子は、高い濃度のエマルジョン安定剤を有する低い水性相体積により生成される。
【００７８】
微小粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーション（例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ、第２版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載のような）；空気懸濁コーティング技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）（Ｈａｌｌら（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、Ｖｏｌ．２、１３３〜１５４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＤｅａｓｙ、Ｐ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載のような）；およびイオンゲル化（例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８０）２１０：９０８−９１０により記載のような）を用いて形成される。
【００７９】
粒子サイズは、例えば、レーザー光散乱によって、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを取り込むスペクトロメーターを用いて、決定され得る。一般には、粒子サイズは室温で決定され、そして粒子直径についての平均値を得るための問題のサンプルの複数回分析（例えば、５〜１０回）を包含する。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて容易に決定される。
【００８０】
調製後、微小粒子は、そのままで貯蔵され得るか、または将来の使用のために凍結乾燥され得る。高分子を微小粒子に吸着するために、微小粒子調製物は、目的の高分子と単に混合され、そして得られた処方物は、使用する前に再度凍結乾燥され得る。一般に、高分子が微小粒子に添加されて、約０．０００１：１から約０．２５：１、好ましくは、約０．００１：１から０．１、より好ましくは約０．０１から０．０５の高分子：微小粒子の重量比を有する吸着された高分子を有する微小粒子を生成する。微小粒子の高分子含量は、標準的な技術を使用して容易に決定され得る。
【００８１】
本発明の微小粒子は、その上に吸着された高分子を有すると同様に、その中に閉じ込められたまたはカプセル化された高分子を有する。従って、例えば、当業者は、本発明に従って、その上に吸着されたタンパク質を伴うカプセル化されたアジュバントを有する微小粒子、またはその上に吸着されたアジュバントを有するカプセル化されたタンパク質を有する微小粒子を調製し得る。
【００８２】
高分子で吸着された微小粒子が一旦生成されると、それらは、上記のように、広範な種々の障害を処置、予防、および／または診断するために、薬学的組成物またはワクチンに処方される。組成物は、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦型剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を包含する。さらに、付属物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など）は、このようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、事実上、薬学的に受容可能であり、そして所望のｐＨ（すなわち、生理学的範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する任意の溶液であり得る。緩衝溶液の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などが挙げられる。
【００８３】
アジュバントは、薬学的組成物の有効性を増強するために使用され得る。アジュバントは、本発明の微小粒子と同時に、例えば、同じ組成物中でまたは別個の組成物中で、投与され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の微小粒子組成物の前にまたは引き続いて投与され得る。別の実施態様では、そのアジュバント（例えば、免疫学的アジュバント）は、微小粒子中にカプセル化され得る。アジュバント（例えば、任意の高分子）は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを使用して、微小粒子内でカプセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照のこと。あるいは、アジュバントは、任意の高分子について上述したように微小粒子上で吸着され得る。
【００８４】
免疫学的アジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を有するまたは有さない）、（例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、５％スクアラン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％Ｓｐａｎ８５（種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を必要に応じて含むが、これらは特に必要とされない）（Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用するサブミクロン粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦ（１０％スクアラン（Ｓｑｕａｌａｎｅ）、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）（サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズ化されるか、またはボルテックスされるかのいずれかで、より大きな粒子サイズのエマルジョンを生成する）、および（ｃ）ＲｉｂｉTMアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（２％スクアラン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）（本明細書中で使用するための適切なサブミクロン水中油エマルジョンについてのさらなる考察について、共同所有する米国特許出願第０９／０１５，７３６号（１９９８年１月２９日出願）を参照のこと）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））が使用され得るか、またはそれから生成され得る粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、Ｉｌ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、など；（６）細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ））の解毒変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（６３位の野生型アミノ酸がリジンに置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（７２位の野生型アミノ酸がアルギニンに置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（１０９位の野生型アミノ酸がセリンに置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（９位の野生型アミノ酸がリジンに、そして１２９位の野生型アミノ酸がグリシンに置換されている）（例えば、国際公開ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（７）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）；ならびに（８）組成物の有効性を増強するために免疫刺激剤として作用する他の物質。ミョウバンおよびＭＦ５９が好ましい。
【００８５】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
アジュバントのさらなる例のために、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ、Ｍ．Ｊ．編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９５を参照のこと）。
【００８７】
この組成物は、目的の高分子の「治療上有効な量」を含む。すなわち、症状を予防、減弱、排除または診断するために、被験体に十分な応答を生じさせる量の高分子／微小粒子がこの組成物に含まれる。正確な量は、以下に依存して必然的に変化する：（他にも因子はあるが）、処置される被験体；処置される被験体の年齢および全身状態；処置される状態の重篤度；免疫学的応答の場合には、被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望されるタンパク質の程度および選択される特定の抗原ならびにその投与の形態。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療上有効な量」は、慣用的なトライアルを通して決定され得る比較的広範な範囲におさまる。たとえば、本発明の目的のためには、高分子がポリヌクレオチドである場合、有効用量は、代表的に１用量あたり送達される高分子の約１ｎｇ〜約１ｍｇ、より好ましくは約１０ｎｇ〜約１μｇ、そして最も好ましくは約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲であり；高分子が抗原である場合は、代表的に１用量あたり送達される高分子の約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲である。
【００８８】
一旦処方されれば、本発明の組成物は、非経口的に、例えば、注射により投与され得る。この組成物は、皮下に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内にのいずれかで注射され得る。投与の他の形態としては、経鼻投与、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであってもよい。複数用量スケジュールは、投与の初回の経過が、治療応答を維持および／または増強するように選択された、１〜１０の別個の用量、その後引き続く時間間隔で与えられる他の用量、例えば、第２の用量については１〜４ヶ月、そして必要であれば数ヶ月後の引き続く用量を伴い得るスケジュールである。この投薬レジメンはまた、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、そして医師の判定に依存する。
【００８９】
さらに、疾患の防御が所望される場合、目的の病原での初回感染の前にワクチン中の高分子が一般的に投与される。処置（例えば、症状または再発の減少）が所望される場合、高分子は、一般に初回感染に続いて投与される。
【００９０】
（Ｃ．実験）
以下は、本発明を実行するための特定の実施態様の実施例である。本実施例は、例示の目的のためにのみ提供されるものであり、そしていかなる手段でも本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００９１】
用いる数値（例えば、量、温度など）について精度を保証する努力がなされているが、当然ながらある程度の実験誤差および偏差は許容されるべきである。
【実施例】
【００９２】
（実施例１）
（エマルジョン安定剤としてＰＶＡを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子（例えば、高分子を吸着または閉じ込めていない）を以下のようにポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を用いて作製した。用いた溶液は以下である：（１）ジクロロメタン中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１０％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ＩＣＮ）。
【００９３】
詳細には、１０ｍｌのポリマー溶液と１．０ｍｌの蒸留水を組み合わせること、および１０ｍｍのプローブでのＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズすることにより、水／油（ｗ／ｏ）エマルジョンを形成し、微小粒子を作製した。このｗ／ｏエマルジョンを４０ｍｌの１０％ＰＶＡ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、水／油／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続け、微小粒子を形成した。形成した微小粒子を４回遠心分離することで水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９４】
（実施例２）
（ＣＴＡＢを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子を以下のようにＣＴＡＢを用いて生成した。用いた溶液は以下である：
（１）ジメチルクロライド中の４％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００９５】
詳細には、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水を合わせること、および１０ｍｍのプローブを備えるＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズして、ｗ／ｏエマルジョンを形成することにより、微小粒子を作製した。このｗ／ｏエマルジョンを５０ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズし、水／油／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続け、微小粒子を形成した。次いで、形成した微小粒子を３８μメッシュを通して濾過し、４回遠心分離することで水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９６】
（実施例３）
（ＳＤＳを用いるブランク微小粒子の調製）
ブランク微小粒子を以下のようにＳＤＳを用いて生成した。用いた溶液は以下である：
（１）ジメチルクロライド中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
（２）水中の１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【００９７】
詳細には、１２．５ｍｌのポリマー溶液と５０ｍｌのＳＤＳ溶液を合わせること、および１０ｍｍのプローブを備えるＯｍｎｉベンチトップホモジナイザーを１０Ｋ ｒｐｍで３分間用いてホモジナイズすることにより、この微小粒子を作製した。このエマルジョンを溶媒エバポレーションのために一晩撹拌し続けた。形成した微小粒子を３８μメッシュを通して濾過し、４回遠心分離することで水で洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、後の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器中でサイズ選別した。
【００９８】
（実施例４）
（ブランク微小粒子へのタンパク質の吸着）
以下のように、微小粒子にタンパク質を吸着させた。
【００９９】
（Ａ．ｐ５５ｇａｇの１％および３％の理論的負荷）
１％および３％の理論的負荷を獲得するために、実施例３で生成した５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微小粒子をＮａｌｇｅｎｅ遠心分離管に入れ、そしてｐ５５ｇａｇタンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素を有する、１０ｍｌの２５ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ９を添加した：（ａ）１％理論負荷のために、１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌ ｐ５５ｇａｇ溶液を用いた；そして（ｂ）３％理論負荷のために、１０ｍｌの１５０μｇ／ｍｌ ｐ５５ｇａｇ溶液を用いた。この溶液を室温で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、この微小粒子を遠心分離し、そして上清を、ビシンコニン（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）アッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりｇａｇ濃度についてアッセイして、吸着した量を決定した。この微小粒子を１０ｍｌのホウ酸／６Ｍ尿素緩衝液で２回、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。
【０１００】
（Ｂ．ＨＣＶコア抗原の１％理論負荷）
１％理論負荷を獲得するために、５０ｍｇの凍結乾燥ブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微小粒子をＮａｌｇｅｎｅ遠心分離管に入れ、そしてモノマー性ＨＣＶコアタンパク質（１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌＨＣＶコアタンパク質溶液；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素を有する、１０ｍｌの３０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．５を添加した。この混合物を室温で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、この微小粒子を遠心分離し、そして上清を、ビシンコニンアッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によりＨＣＶ濃度についてアッセイし、吸着した量を決定した。この微小粒子を３０ｍｌのクエン酸／６Ｍ尿素緩衝液で２回、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして後の使用のために凍結乾燥した。
【０１０１】
（実施例５）
（微小粒子の吸着効率）
実施例４からの吸着したタンパク質と凍結乾燥された微小粒子を、以下のように塩基加水分解を用いて総吸着タンパク質について分析した。１０ｍｇの凍結乾燥した吸着粒子を５％ＳＤＳを有する２ｍｌ ０．２Ｎ ＮａＯＨ中で４時間、加水分解し、中和し、そして１：１０に希釈し、そしてＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてタンパク質含量について分析した。表１に示すように、ＣＴＡＢおよびＳＤＳのような界面活性剤で調製した改変された表面を有する微小粒子は、両方とも、ＰＶＡのみを用いて作製した微小粒子よりもより効率的にタンパク質を吸着した。
【０１０２】
【表１】
（実施例６）
（Ａ．ｇａｇ吸着微小粒子の免疫原性）
実施例４に記載のように、ＰＶＡまたはＳＤＳを用いて生成したｇａｇ吸着微小粒子ならびにｐ５５ｇａｇ単独を、関連する微小粒子（陰性コントロールとして）およびワクシニアｇａｇ−ｐｏｌコントロール（陽性コントロールとして）を伴わずに、マウスに筋肉内投与した。この動物を７日および１４日でブースト（追加免疫）した。投与した総用量を表２および３に示す。最終免疫後２週間で脾臓を収集し、そしてＤｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：８５７８〜８５８３に記載のようにＣＴＬ活性をアッセイした。
【０１０３】
リンパ球培養物を以下のように調製した。免疫マウスからの脾臓細胞（ｓｃ）を１ウェルあたり５×１０6細胞で２４ウェルシャーレ中で培養した。これらの細胞のうち、１×１０6を、合成エピトープペプチド形態ＨＩＶ−１SF2タンパク質で１０μＭの濃度で３７℃で１時間、感作させ、洗浄し、そして残りの４×１０6の未処置のｓｃとともに、熱非働化ウシ胎仔血清、５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、抗生物質および５％インターロイキン２（Ｒａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍ，Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を補充した２ｍｌの培養培地［５０％ＲＰＭＩ １６４０ および５０％α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）］中で、同時培養した。３日目および５日目に１ｍｌの新鮮培養培地を細胞に供給し、そして６日目に細胞傷害性をアッセイした。
【０１０４】
細胞傷害性細胞アッセイを以下のように実施した。51ＣＶ放出アッセイにおいて用いたＳｖＢＡＬＢ（Ｈ−２d）（ＳｖＢ）標識細胞およびＭＣ５７（Ｈ−２b）標的細胞は、クラスＩＭＨＣ分子を発現するがクラスＩＩＭＨＣ分子は発現しない。約１×１０6の標的細胞を５０μＣｉ（１Ｃｉ＝３７Ｇｂｑ）の51Ｃｒおよび合成ＨＩＶ−１ペプチド（１ｍＭ）を含有する２００μｌの培地中で６０分間インキュベートし、そして３回洗浄した。エフェクター（Ｅ）細胞を、９６ウェル丸底組織培養プレート中で、５×１０3標的（Ｔ）細胞とともに種々のＥ／Ｔ比で、２００μｌの培養培地中で、４時間培養した。二連のウェルからの平均ｃｐｍを用いて51Ｃｒ解離の特異比を算出した。
【０１０５】
表２および３に示すように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子は、ワクシニアコントロールに匹敵する活性を有し、そしてＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。詳細には、表２に示すように、ｐ５５ｇａｇタンパク質は、１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇの濃度で不活性であった。さらに、表３に示すように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物は、ＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５微小粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。このことは、タンパク質がＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５タンパク質処方物およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物に比べて、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物において、微小粒子により効率的に吸着されたことを示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
【表３】
（実施例７）
（改変された表面を有するｐＣＭＶｇｐ１２０ＤＮＡ−吸着微小粒子の調製）
ｇｐ１２０をコードする吸着プラスミドＤＮＡを有する微小粒子を以下のように調製した。実施例１および２に記載の様に調製した、１ｍｌ用量の２０ｍｇのブランク微小粒子をｐＣＭＶｇｐ１２０ＤＮＡの漸増濃度とともに４℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、この微小粒子を遠心分離し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、そして一晩、凍結乾燥した。この微小粒子を実施例５に記載の様に加水分解し、吸着したＤＮＡの量についてＡ260ｎｍで分析した。
【０１０８】
表４は、ＰＬＧ−ＰＶＡ微小粒子およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子の負荷効率を提示する。この表に示されるように、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子は、対応するＰＬＧ−ＰＶＡ粒子よりも効率的に吸着する。
【０１０９】
【表４】
（実施例８）
（ＨＣＶ−Ｅ２吸着）
微小粒子を、ＰＶＡ、およびいくつかの異なる界面活性剤を使用して、先の実施例に記載のように調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ２タンパク質を、以下のようにこれらの微小粒子の表面上に吸着させた：０．２ｍｇ／ｍｌのＥ２を、２０ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量０．５ｍｌ中、０．５％ ｗ／ｗのＥ２／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表５に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１０】
【表５】
（実施例９）
（ｇｐ１２０タンパク質の吸着）
先の実施例に記載のように、ＰＶＡを使用して微小粒子を調製した。また、以下のように、オレイン酸Ｎａ、アニオン性界面活性剤を使用して、微小粒子を調製した：ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、内部水相として１．６７ｍｌの３０ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ ６）、溶媒（油相）として１６．７ｍｌの、ジクロロメタン中６％のポリマーＲＧ５０５ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、および外部水相として６６．８ｍｌの０．４％オレイン酸Ｎａを用いて、調製した。これらの微小粒子を、「オレイン酸Ｎａ−ＰＬＧ（ｗ／ｏ／ｗ）」として、以下の表６に示す。さらに、微小粒子を、水中油処方物中のオレイン酸Ｎａを使用して調製し、そしてこれらの微小粒子を、「オレイン酸Ｎａ−ＰＬＧ（ｏ／ｗ）」として、以下の表６に示す。ｇｐ１２０タンパク質を、以下のように、この調製した微小粒子の表面上に吸着させた：０．３８８ｍｇ／ｍｌのタンパク質を、約２０ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量０．８ｍｌ中、約１．４％ ｗ／ｗのｇｐ１２０／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表６に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１１】
【表６】
（実施例１０）
（リステリア溶解素（Ｌｙｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）タンパク質の吸着）
先の実施例に記載のように、ＰＶＡおよびＣＴＡＢを使用して微小粒子を調製した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のリステリア溶解素タンパク質（ＬＬＯ）を、以下のように、この微小粒子の表面上に吸着させた：１．０ｍｇ／ｍｌのＬＬＯを、１００ｍｇの、ＰＢＳ中の微小粒子に添加し、全容量５ｍｌ中、１％ ｗ／ｗのＬＬＯ／ＰＬＧの溶液を形成させた。この溶液を、３７℃で、１．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。この上清を収集し、次いで、ｍｉｃｒｏＢＣＡによってタンパク質含量を測定した。この結果を、表７に示す。この結果は、本発明の微小粒子による高分子の優れた吸着を確証する。
【０１１２】
【表７】
（実施例１１）
（アジュバントとしてのアルミニウム塩の効果）
ｐ５５ｇａｇＤＮＡ吸着ＰＬＧ微小粒子を、上記のように、ＣＴＡＢを使用して調製した。この微小粒子を、２つの濃度でマウスに筋肉内注射し、そしてコントロールとして、ＤＮＡ単独を、同じ２つの濃度で注射した。さらに、１つの試行において、５０μｇのリン酸アルミニウムを、注射するＣＴＡＢ組成物に添加した。各処方物を、１０匹のマウスに注射した。このマウスを、２８日後にブーストした。この２回目の免疫化の２週間後、血清を収集し、そして各血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を、標準誤差とともに測定した。この結果を、表８（線形値およびｌｏｇ値の両方として表される）に要約する。各数値は、１０匹のマウスから得られた結果の平均である。
【０１１３】
【表８】
これらの結果を統計的に比較するために、以下のものについて、Ｐ値を生成した：ＤＮＡ−ＣＴＡＢ対ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ（Ｐ値＝０．００１７）；ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ対ＤＮＡ単独（Ｐ値＜０．０００１）；およびＤＮＡ−ＣＴＡＢ（１０μｇ）対ＤＮＡ単独（１０μｇ）（Ｐ値＜０．０００１）。これらのＰ値は、表８中の値の統計的有意性を確証する。
【０１１４】
（実施例１２）
（ζ電位の測定）
ζ電位の測定を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ３３１１６のＤＥＬＳＡ ４４０ＳＸゼータサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）上で実行した。このシステムを、Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＥＭＰ ＳＬ７（ポリスチレンラテックスビーズの水性懸濁液））の移動度スタンダードを使用して較正する。サンプルセルを滅菌水でリンスした後、サンプルをサンプルセルに添加した。次いで、カウンターを、最も低い値にビームを合わせることによって０に設定した。電流を、対照について０．７ｍＡおよびこのサンプルについて２０Ｖに設定した。４つ全てのビームからの検出レベルをチェックし、次いでこのサンプルを、ソフトウェアから「ｒｕｎ」を選択することによって作動させ、周波数測定を読取った。ビームを２０Ｈｚ間隔にするべきである。次いで、各サンプルについての平均ζ電位を読取った。
【０１１５】
本発明のいくつかの微小粒子処方物についての測定を読取った。結果を表９に示す。この結果が示すように、微小粒子表面への高分子の吸着は、微小粒子のζ電位を変化させる。
【０１１６】
【表９】
（実施例１３）
（カプセル化または吸着された高分子を含む微小粒子）
（Ａ）ＰＬＧ微小粒子を、ＲＧ５０５ＰＬＧおよびＰＶＡを使用し、そしてアジュバントＬＴＫ６３をカプセル化して調製した。１００ｍｇの微小粒子を、４００μｇ／ｍｌのｐ２４ｇａｇタンパク質を含む５ｍｌ ＰＢＳと共にインキュベートした。次いで、この混合物を、室温で一晩、振動させながらインキュベートし、２０ｍｌ ＰＢＳで２回および水で１回、遠心分離によって洗浄し、次いで、凍結乾燥させた。塩基の加水分解および中和後、吸着タンパク質％およびカプセル化アジュバント％を測定した；その結果を、表１０に示す。
【０１１７】
（Ｂ）ＰＬＧ微小粒子を、以下のように、ＳＤＳおよびＲＧ５０５ＰＬＧを使用し、そしてアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドをカプセル化して調製した：ＤＣＭ中、５ｍｌの６％ＲＧ５０５ポリマーを、０．５ｍｌの、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ中、５ｍｇ／ｍｌのＣｐＧで乳化して、ｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを、２０ｍｌの１％ ＳＤＳに添加し、次いで乳化して、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。微小粒子を、一晩の溶媒エバポレーションによって形成し、次いで、洗浄し、遠心分離し、そして凍結乾燥させた。１０ｍｇのＣｐＧカプセル化微小粒子を、１ｍｌのＤＣＭ中に溶解させた。０．５ｍｌの水を添加して、このオリゴヌクレオチドを抽出し、次いで、この混合物を遠心分離して、そしてその水相を、移動相としてＰＢＳを用いる、サイズ排除カラム上に注入した。１０ｍｇのプラセボ微小粒子を、１００μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合し、そして上記のように、ＤＣＭで抽出し、スタンダードとしてこのカラム上で泳動させた。この捕捉された粒子中に存在するＣｐＧオリゴヌクレオチドの量を、スタンダードに対して算出した。
【０１１８】
ｐ５５ｇａｇを、以下のように、ＣｐＧカプセル化微小粒子上に吸着させた：５０ｍｇの凍結乾燥したＣｐＧカプセル化微小粒子を、５ｍｌの、１４０μｇのｐ５５ｇａｇタンパク質を含む、６Ｍ尿素を含む２５ｍＭホウ酸（ｐＨ ９）と共に一晩インキュベートした。この混合物を、室温で一晩、振動させながらインキュベートし、２０ｍｌのホウ酸緩衝液／６Ｍ 尿素で２回、および水で２回洗浄し、次いで凍結乾燥させた。
【０１１９】
１０ｍｇのＣｐＧカプセル化／ｐ５５ｇａｇ吸着微小粒子を、塩基加水分解し、そして捕捉微小粒子％および吸着微小粒子％を測定した。他に示されない限り、この標的化された負荷は１．０％であった。この結果を、表１０に示す。
【０１２０】
【表１０】
（実施例１４）
（吸着した２つの高分子を有する微小粒子）
（Ａ）本発明に従って、２つ以上の高分子を、両方の高分子を吸着した微小粒子を含む組成物中で投与し得るか、または２つ以上の別個の微小粒子（各々が単一の高分子を吸着している）を含む組成物中で投与し得る。例えば、微小粒子を、以下のように、Ｅ２ポリペプチドおよびアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドの両方を吸着するように調製した：ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを、以前に記載されるように調製した。凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、生理食塩水中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ Ｅ２とともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振動し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌの通常の生理食塩水で２回洗浄し、そしてペレットを、室温で４時間、２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧを含有するＴＥ緩衝液中の１ｍｌのＣｐＧ溶液中に再懸濁した。最終的な懸濁液を、遠心分離によってＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。吸着したＣｐＧおよびＥ２を有する１０ｍｇの微小粒子を塩基性加水分解し、そしてタンパク質濃度をＢＣＡによって決定し、そして上清中に残存するＣｐＧの量をＨＰＬＣによってアッセイして、微小粒子上に吸着したＣｐＧの量を測定した。この結果を表１１に表し、これは、両方の高分子についての陽性吸着を実証する。
【０１２１】
（Ｂ）微小粒子を、本発明に従って調製した。一部を使用してＥ２ポリペプチドを吸着させ、一方別の部分を使用してアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドを吸着させた。ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを、以前に記載されるように調製した。凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、生理食塩水中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ Ｅ２とともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振盪し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌの通常の生理食塩水で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。別に、凍結乾燥した２０ｍｇの微小粒子を、ＴＥ緩衝液中で１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ ＣｐＧとともに４時間インキュベートした。この混合物を、室温で４時間振動し、１０，０００Ｇでの遠心分離によって２０ｍｌのＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで凍結乾燥した。吸着した微小粒子のパーセントの測定の結果を、表１１に表す。
【０１２２】
【表１１】
（実施例１５）
（界面活性剤およびＰＶＡの組合せを使用して形成された微小粒子）
以下の手順を使用して、２つの界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（ＰＶＡおよび界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ））を含む微小粒子を形成した：ＤＣＭ中で１０ｍｌの５％ ＰＬＧポリマーおよび０．２％の界面活性剤ＤＯＴＡＰを、１２、０００ｒｐｍで３分間、１０ｍｌの滅菌水とともに乳化して、一次ｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを、４０ｍｌの０．８％ ＰＶＡに添加し、そして３分間乳化して、二次ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成し、このエマルジョンを、一晩攪拌して溶媒をエバポレートし、そして微小粒子を形成させた。この微小粒子を滅菌水中で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微小粒子を、本発明に従う高分子の吸着のために準備ができている。
【０１２３】
同じ手順を利用して、ＰＶＡおよび界面活性剤ＤＤＡの組合せを含む微小粒子を形成した。
【０１２４】
（実施例１６）
（吸着したｐ５５ ＤＮＡを有する微小粒子の免疫原性）
微小粒子を、界面活性剤ＣＴＡＢまたはＤＤＡを使用する、以前の実施例のように形成した。ｐ５５ ＤＮＡをこの微小粒子に吸着し、そして免疫原性を、以前の実施例に記載された手順を使用して評価した。この結果を、以下の表１２に要約する。
【０１２５】
【表１２】
（実施例１７）
（吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微小粒子を使用するインビボルシフェラーゼ発現）
微小粒子を、ＰＬＧおよび界面活性剤ＣＴＡＢを使用する上記の手順を使用して形成した。ルシフェラーゼＤＮＡを、以前に記載した方法を使用してこの微小粒子上に吸着させた。５μｇ用量のルシフェラーゼＤＮＡを使用するインビトロルシフェラーゼ発現を、ルシフェラーゼＤＮＡ単独（１２４８ｐｇ）および微小粒子上に吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微小粒子（２２５０ｐｇ）を使用して測定した。インビボルシフェラーゼ発現を、以下のように、投与後１日目および１４日目において筋肉中で測定した：２つの群のマウス（ｎ＝５）を、各々、５０μｇのルシフェラーゼプラスミドまたは５０μｇのＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ルシフェラーゼＤＮＡ微小粒子のいずれかで注射した。両群のマウスに、２本の脚の前頸骨（ＴＡ）筋において筋肉内に注射した。２つの群における各マウス由来の両方のＴＡ筋を、１日目および１４日目のいずれかで収集し、そして−８０℃フリーザー中に保存した。この筋肉を、ドライアイス上で乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉末化筋肉を、０．５ｍｌの１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ緩衝液を含有するエッペンドルフチューブ中に収集した。このサンプルを、室温で１５分間ボルテックスした。３回の凍結／融解後、このサンプルを、１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。各時点での各マウスのＴＡ筋の上清をプールし、そしてこのサンプルの２０μｌを、ＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用して、ルシフェラーゼ発現のための増大したフラッシュ下でアッセイした。
【０１２６】
ルシフェラーゼ測定を、化学ルミネッセンスアッセイを使用して実施した。１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する緩衝液を、調製した。１０ｍｇ／ｍｌでのルシフェラーゼ酵素ストック（Ｐｒｏｍｅｇａ）を基準物として使用し、５００ｐｇ／２０μｌの濃度に希釈した。この基準物を、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ ２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）下へ連続的に１：２に希釈して、標準曲線を作製した。２０μｌのブランクおよびサンプルもまたこのプレート上に置き、そして連続的に１：２に希釈した。このプレートを、１ウェルあたり１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を注入したＭＬ３０００に置いた。増大したフラッシュ下において、相対光単位を、各サンプルについて測定した。
【０１２７】
この結果を、以下の表１３において表にする。
【０１２８】
【表１３】
（実施例１８）
（閉じ込められた抗原を有する微小粒子の免疫原性に対する、吸着された抗原を有する微小粒子の免疫原性）
微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。次いで、Ｅ２タンパク質を、上記のようにこの微小粒子上に吸着させた。微小粒子をまた、上記のように、Ｅ２をこの微小粒子上に吸着させるのではなくこの微小粒子中に閉じ込めるように調製した。この微小粒子を、各々の型の微小粒子を用いる１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体を誘導する能力について評価した。各マウス由来の血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物の群について平均した。標準誤差（ＳＥ）もまた算出した。ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ（有意レベル５％）を、ｐ＝０．０００６で測定した。この結果を、以下の表１４に示す：この結果は、本発明の吸着された微小粒子を使用して体液性免疫応答が優位に誘導されることを明確に実証する。
【０１２９】
【表１４】
（実施例１９）
（その上にスレオニンを吸着したＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を有する微小粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ１Ｅ２タンパク質を、この微小粒子上に吸着させた。この粒子を使用して、アジュバントミョウバンを用いてかまたは用いないで、１０μｇまたは１００μｇのタンパク質のいずれかを提供するために算出した微小粒子の用量でマウスを免疫した。相乗平均力価を測定し、そしてこの結果を以下の表１５に示す。
【０１３０】
【表１５】
この結果が示すように、微小粒子上に吸着したタンパク質を有する微小粒子は、１０μｇ用量で優位な免疫応答を生じる。このことは、この微小粒子が、遊離のＤＮＡがこのような応答を生じ得ない低用量において免疫応答を誘発することに有用であるという利点を有することを実証する。
【０１３１】
（実施例２０）
（吸着されたｐ２４ｇａｇタンパク質を有する微小粒子の免疫原性）
ＰＬＧ−ＰＶＡ微小粒子を、以前の実施例において議論された手順を使用して調製した。次いで、タンパク質ｐ２４ｇａｇを、上記のようにこの微小粒子上に吸着させた。この微小粒子を、１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ２ａ抗体を誘導する能力について評価した。２回目の免疫の２週間後（２ｗｐ２）および３回目の免疫の２週間後（２ｗｐ３）のマウスから収集した血清の相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物の群について平均した。平均誤差（ＳＥ）もまた算出した。結果を以下の表１６に示す。この結果は、本発明の吸着した微小粒子を使用して体液性免疫応答が優位に誘導されることを明確に実証する。
【０１３２】
【表１６】
（実施例２１）
（ｐ５５ ｇａｇタンパク質および種々のアジュバントのＩＭ免疫）
ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、ＰＬＧ／ＳＤＳ微小粒子、およびＰＬＧ／ＰＶＡ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。遊離の可溶性ｐ５５ ｇａｇを提供することに対する、微小粒子上に吸着させた抗原ｐ５５ ｇａｇタンパク質でマウスを免疫することの異なる効果を分析するため、そして同じく他の微小粒子上に吸着させるか、または遊離の可溶性形態で提供されるアジュバントＣｐＧ（ＣｐＧモチーフを有する２０塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチド）を有することの効果を決定するために、８つの群の微小粒子を作製した。この異なる群を、以下のように調製した。
【０１３３】
群１は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した可溶性ｐ５５ ｇａｇタンパク質（２Ｍ尿素を有するｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で、２ｍｇ／ｍｌで酵母において生成された、組換えＨＩＶ ｐ５５タンパク質）を使用した。
【０１３４】
群２は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０１３５】
群３は、遊離ＣｐＧと混合した吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０１３６】
群４は、吸着ｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を、アジュバントなしで使用した。
【０１３７】
群５は、吸着ＣｐＧを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、粒子中に閉じ込められたｐ５５ ｇａｇを有するＰＬＧ／ＰＶＡ粒子を使用した。
【０１３８】
群６は、コントロールであり、抗原を使用せず、そして可溶性ＣｐＧを使用した。
【０１３９】
群７は、別のコントロールであり、可溶性ｐ５５ ｇａｇタンパク質を使用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０１４０】
群８は、別のコントロールであり、ｇａｇ遺伝子を発現するワクシニアウイルス（ｖｖ ｇａｇ）を単独で使用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０１４１】
各群について、１０匹のマウスを、群８を除いて（群８は、１０×１０7ｐｆｕの投薬量で使用した）ｐ５５ ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量が各々２５μｇ（その群に存在する場合）になるように、十分な量の微小粒子または遊離分子で免疫した。免疫経路は、群８を除いてＩＭであった（群８は、ＩＰであった）。免疫後、血清の抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測定した。その結果を以下の表１７において明らかにする、ＣＴＬによる標的の溶解もまた各群で測定した。その結果を以下の表１８において明らかにする。
【０１４２】
【表１７】
【０１４３】
【表１８】
（実施例２２）
（ｐ５５ ＤＮＡの吸着 対 閉じ込め）
吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、および微小粒子中に閉じ込められたｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。マウスのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を、１回目の免疫の４週間後（４ｗｐ１）、および２回目の免疫の２、４、６、１３、および１５週間後（それぞれ、２ｗｐ２、４ｗｐ２、６ｗｐ２、１３ｗｐ２、および１５ｗｐ２）に、先の実施例において記載されたように実施した。以下の表１９に示される結果は、閉じ込められたｐ５５および遊離ｐ５５の両方に優る吸着微小粒子の明白な利点を実証する。
【０１４４】
【表１９】
（実施例２３）
（モルモットにおける免疫応答の微小粒子誘導）
吸着ｇｐ１２０ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子を、先の実施例において上記のように形成した。他のサンプルは、以下の表２０に示される通りである。そしてこれは、リン酸アルミニウムを伴うかまたは伴わない微小粒子、リン酸アルミニウムを伴うかまたは伴わない遊離の可溶性ｇｐ１２０のコントロール、およびｇｐ１２０ ＤＮＡによってコードされるＭＦ５９タンパク質を含む。モルモットのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を、先の実施例において記載のように実施した。この結果を、以下の表２０に示す。
【０１４５】
【表２０】
（実施例２４）
（ｐ５５ ＤＮＡ吸着微小粒子での鼻腔内（ＩＮ）免疫）
吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子、および吸着ｐ５５ ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＤＡ微小粒子を、先の実施例において上記されたように形成した。２５または１００μｇでのマウスのＩＮ免疫、抗体の誘導（血清の収集および分析）、およびＣＴＬ誘導を、１回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ１、４ｗｐ１）、２回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ２、４ｗｐ２）、ならびに３回目の免疫の２および４週間後（２ｗｐ３、４ｗｐ３）に、先の実施例において記載のように実施した。コントロールは、可溶性ｐ５５ ＤＮＡ単独での免疫、または１０μｇのコレラ毒素での免疫を含んだ。抗体誘導についての結果を表２１に示す。そしてＣＴＬによる溶解についての結果（４回目の免疫の４週間後）を、以下の表２２に示す。
【０１４６】
【表２１】
【０１４７】
【表２２】
本発明の好ましい実施態様が幾分詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明白な改変がなされ得ることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【公開番号】特開２０１０−１６８３９２（Ｐ２０１０−１６８３９２Ａ）
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５８４９１（Ｐ２０１０−５８４９１）
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【分割の表示】特願２０００−５６１９７９（Ｐ２０００−５６１９７９）の分割
【原出願日】平成１１年７月２９日（１９９９．７．２９）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月５日（２０１０．８．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１５日（２０１０．３．１５）
【分割の表示】特願２０００−５６１９７９（Ｐ２０００−５６１９７９）の分割
【原出願日】平成１１年７月２９日（１９９９．７．２９）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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