哺乳動物のベータ・ディフェンシンを用いた、炎症性腸疾患の治療
本発明は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンを用いた、炎症性腸疾患の治療に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、配列表をコンピュータで読み取り可能な形式で含む。当該コンピュータで読み取り可能な形式は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの投与による、炎症性腸疾患の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒトのディフェンシン
多くの他の成分の中で、先天性免疫の重要な構成成分は、その各々が、かなりの選択性を示すが、共同で速やかに広範囲の細菌、ウィルス、及び真菌を死滅させることができる、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰの生物学的重要性は、天然においてそれらが偏在することによって強調され、そしてそれらは恐らく、全ての多細胞生物によって産生される。ヒトにおいて、重要なＡＭＰはディフェンシンである。ヒトのディフェンシンは、それらの３つの分子内システイン・ジスルフィド結合の形態に基づいて、α−及びβ−ディフェンシンへと分類され得る、小さいカチオン性ペプチドである。α−ディフェンシンは、好中性顆粒から最初に単離されたもの（ＨＮＰ１〜４）、及び小腸の陰窩中のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５及びＨＤ６）へとさらに細かく分類され得る。β−ディフェンシンは主に、皮膚、気管、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膵臓、及び乳腺を含む、種々の組織及び器官における上皮細胞によって産生される。β−ディフェンシン・ファミリーの最も特徴付けされたメンバーは、ｈＢＤ１〜３である。しかし、種々のバイオインフォマティクス・ツールを用いて、推定上のβ−ディフェンシン相同体をコードする約４０個のオープン・リーディング・フレームが、ヒトゲノム中でアノテートされた。ヒト・ディフェンシンの幾つかは、恒常的に産生されるが、他のものは、炎症性サイトカイン、又は外因性の微生物産生物によって誘導される。
【０００４】
ヒトのディフェンシン、及びそれらの直接的な抗微生物活性はまた、広い範囲の免疫調節性／代替性特性を有することが次第に明らかとなってきた。これらは、種々のケモカイン及びサイトカインの誘導、走化性及びアポトーシス活性、プロスタグランジンの誘導、ヒスタミン及びロイコトリエンの放出、補体の阻害、トール様受容体のシグナル伝達を通じた樹状細胞成熟の刺激、並びに好中球による病原体の一掃の刺激を含む。さらに、ヒトのディフェンシンはまた、創傷治癒、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成において役割を果たす。
【０００５】
ヒトのディフェンシンが、多くの感染性及び炎症性疾患において重要な役割を果たすことに関する証拠が増大している。ヒトのディフェンシンの過剰発現は通常、恐らく微生物成分又は内因性の炎症性サイトカインによる局所的誘導のために、炎症を起こした及び／又は感染した皮膚において観察される。乾癬において、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３は過剰に存在し、そして尋常性座瘡又は表在性毛嚢炎の患者の損傷性上皮において、ｈＢＤ２の上方制御が観察された。他方で、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の下方制御は、アトピー性皮膚炎に関連する。回腸のクローン病は、ＨＤ５及びＨＤ６の発現不足が関連しており、そして結腸におけるクローン病において、ｈＢＤ２〜４の発現は下方制御される。
【０００６】
サイトカイン
サイトカインは、細胞間シグナル伝達に関与し、並びに他の細胞の成長、分裂、及び機能に影響を及ぼす、高等真核生物からの小さな分泌ポリペプチドである。それらは、例えば対応する受容体経由で局所性又は全身性細胞間制御因子として作用する、強力な多面的ポリペプチドであり、したがって多くの生物学的過程、例えば免疫、炎症、及び造血において重要な役割を果たす。サイトカインは、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、マクロファージ／単球、及びリンパ球を含む、種々の細胞種によって産生される。
【０００７】
ＴＮＦ−αは、種々の病態生理学的過程に関与し、そして宿主防衛において保護的であり得るか、又は自己免疫において有害であり得るかのいずれかである。ＴＮＦ−αは、炎症応答を引き起こし且つ持続する重要なサイトカインの一つであり、そしてＴＮＦ−αの不活性化は、自己免疫疾患に関連する炎症性反応を下方制御するときに重要であることが証明されている。感染時において、ＴＮＦ−αはマクロファージによって多量に分泌され、そしてそれは、接着分子を産生する内皮細胞を刺激することによって、及び走化性のサイトカインであるケモカインを産生することによって、感染部位への好中球及びマクロファージの動員を媒介する。ＴＮＦ−αは、白血球及び他の炎症性細胞の活性化を促進し、そして傷害組織内における血管透過性の増大を促進する。ＴＮＦ−αは主に、マクロファージ、単球、及び樹状細胞で産生されるが、リンパ球様細胞、マスト細胞、内皮細胞、心筋細胞、脂肪組織、線維芽細胞、及び神経組織を含む、多くの種類の他の細胞種によっても産生される。
【０００８】
現時点における抗炎症剤は、ＴＮＦ−αに結合し、それにより、細胞表面上のＴＮＦ−α受容体へそれがシグナル伝達するのを防止することによって、ＴＮＦ−αの作用を阻害する。この種の阻害は、幾つかの深刻な副作用があり、そしてそれらの幾つかは、結核、敗血症、及び真菌感染のような感染であり、並びに癌発生の増大の可能性である。
【０００９】
ＩＬ−１０はまた、ヒトのサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として知られており、及び抗炎症性サイトカインとして、免疫調節において重要な役割を果たす。このサイトカインは、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマスト細胞を含む、幾つかの細胞種によって産生される。このサイトカインは、免疫調節及び炎症において多面的効果を有する。それは、炎症性サイトカイン、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞によって分泌されるサイトカイン、ＭＨＣクラスＩＩ Ａg、及び抗原提示細胞における副刺激分子の発現を下方制御する。ＩＬ−１０はまた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれるＴ細胞群によって分泌される。これらの細胞は、最初のＴ細胞の活性化を防止せず；むしろそれらは、持続的応答を阻害し、そして慢性及び潜在的損傷応答を防止する。末梢において、幾つかのＴ細胞が誘導されて、抗原及び、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−βのいずれかによってＴｒｅｇとなる。ＩＬ−１０によって誘導されるＴｒｅｇは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３−であり、そしてＴｒ１細胞と呼ばれる。これらの細胞は、ＩＬ−１０を分泌することによって、免疫応答を抑制する。近年の研究は、Ｔｈ１７細胞の同定において、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｒｅｇよりも、Ｔ細胞エフェクター・レパートリーのより大きな多様化を明らかにした。この下位個体群は、Ｔｈ１系（ｌｉｎｅａｇｅ）に起因すると以前は考えられてきた、幾つかの自己免疫疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。Ｔｈ１７によって分泌されるサイトカインはまた、ＩＬ−１０によって下方制御され、そしてＴＮＦの阻害は、Ｔｈ１７細胞を不活性化することによって乾癬を防止する。ＩＬ−１０の総合的な活性は抗炎症であり、そして幾つかの動物試験において、炎症及び損傷を防止することが示されているが、ＩＬ−１０の投与経路における困難性、及びその生物学的半減期のために、臨床におけるＩＬ−１０治療は、不十分なままである。
【００１０】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、由来のはっきりしない、慢性の、再発性腸疾患と定義される。ＩＢＤは、２つの異なる疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に関する。両方の疾患は、腸における炎症性応答の抑制されていない活性化に起因すると考えられる。この炎症カスケードは、炎症性サイトカインの作用、及びリンパ球サブセットの選択的活性化を通じて持続されると考えられる。ＩＢＤの患者において、腸の内部の裏の潰瘍及び炎症は、腹痛、下痢、及び直腸出血の症状をもたらす。潰瘍性大腸炎は大腸で生じるが、クローン病において、当該疾患は、胃腸管全体、並びに小腸及び大腸で起こり得る。大部分の患者において、ＩＢＤは、数か月〜数年の間続く症状を伴う、慢性疾患である。それは若年成人において最も一般的であるが、全ての年齢において生じ得る。それは世界中で見られるが、先進工業国、例えば米国、英国、及び北欧において最も一般的である。それはユダヤ系の人において特に一般的であり、そして罹患率に関して人種間の違いがある。ＩＢＤの臨床症状は、間欠性直腸出血、けいれん性の腹痛、体重減少及び下痢である。ＩＢＤの診断は、臨床症状、バリウム注腸の使用に基づくが、直接的可視化（Ｓ状結腸鏡検査、又は大腸内視鏡検査）が最も正確な検査である。長期化したＩＢＤは、結腸癌のリスク因子であり、そしてＩＢＤの治療は投薬療法、及び外科療法を伴い得る。
【００１１】
ＵＣを患う幾つかの患者は、直腸においてのみ疾患を有する（直腸炎）。ＵＣを患う他の患者は、直腸及び隣接する左結腸に限定された疾患を有する（直腸Ｓ状結腸炎）。さらに他の患者は、結腸全体のＵＣを有する（汎発性ＩＢＤ）。ＵＣの症状は、より広範囲の疾患（より広い部分の結腸に関連する疾患）に関して、一般的により深刻である。
【００１２】
直腸に限定された疾患（直腸炎）又は左結腸端に限定されたＵＣ（直腸Ｓ状結腸炎）を患う患者の予後は、全結腸ＵＣの患者よりも良い。経口薬又は浣腸剤を使用する短期間の定期的治療で十分であり得る。より広範囲の疾患を患う患者において、炎症を起こした腸からの欠血は、貧血を引き起こし得、そして鉄分補給治療、又は輸血を必要とし得る。まれではあるが、炎症が非常に深刻となる時に、結腸が大きなサイズに急に拡張され得る。この状態は、中毒性巨大結腸症と呼ばれる。中毒性巨大結腸症の患者は、発熱、腹痛及び腹部膨張、脱水症、並びに栄養失調を伴い、極めて症状が重い。患者が薬物療法で速やかに改善されなければ、結腸の破裂を防ぐために外科療法が通常必要となる。
【００１３】
クローン病は、胃腸管の全ての領域で生じ得る。この疾患と共に、炎症及び繊維症に起因する腸閉塞が、多くの患者で起こる。肉芽腫及び瘻の形成はクローン病において頻繁に起こる合併症である。疾患進行の結果は、経静脈栄養、外科手術、及び人工肛門形成術を含む。
【００１４】
ＩＢＤは、薬物療法で治療され得る。ＩＢＤを治療するために最も一般的に使用される薬物療法は、抗炎症性薬剤、例えばサリチル酸塩である。サリチル酸塩調製物は、軽度〜中等度の疾患を治療するときに有効である。それらはまた、当該薬物療法が長期に行われるとき、疾患フレア（ｆｌａｒｅ）の頻度を減少させることができる。サリチル酸塩の例は、スルファサラジン、オルサラジン、及びメサラミンを含む。これらの薬物の全ては、最大限の治療効果のために、高用量にて経口で投与される。これらの薬物は、副作用を伴わないわけではない。アザルフィジンは、高用量で投与されたときに、胃のむかつきを引き起こし得、及び稀な症例ではあるが、軽度の腎炎が幾つかのサリチル酸塩調製物において報告されている。
【００１５】
コルチコステロイドは、ＩＢＤの治療において、サリチル酸塩よりもより強力且つより即効性であるが、潜在的に存在する深刻な副作用が、より深刻な疾患を患う患者に対するコルチコステロイドの使用を制限する。コルチコステロイドの副作用は通常、長期使用において生じる。それらは、骨及び皮膚の薄化、感染、糖尿病、筋肉疲労、顔の丸形化、精神障害、及び稀な症例であるが、股関節の破壊を含む。
【００１６】
サリチル酸塩又はコルチコステロイドに応答しないＩＢＤ患者において、免疫系を抑制する薬剤が使用される。免疫抑制剤の例は、アザチオプリン及び６−メルカプトプリンを含む。この状況において使用される免疫抑制剤は、ＩＢＤの抑制に有用であり、及びコルチコステロイドの段階的な減少又は除去をもたらす。しかし、免疫抑制剤は、患者を免疫不全にし、及び多くの他の疾患に感受性とする。
【００１７】
十分に認識されたＩＢＤ試験モデルは、ＤＳＳ結腸炎マウスモデルであり、Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｖｏｌ． １３（４２），ｐｐ．５５８１−５５９３（２００７）；並びに、Ｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５９（１１），１０７３−１０８３（２００７）に記載されている。
【００１８】
明らかに、ＩＢＤを予防及び治療することができる薬剤の大きな必要性が存在する。
【００１９】
炎症性腸疾患を治療するためのヒト・ディフェンシンの使用
興味深いことに、小腸におけるクローン病は、パネート細胞におけるα−ディフェンシンＨＤ５、及びＨＤ６のレベルの減少に関連し、一方で結腸におけるクローン病は、β−ディフェンシンｈＢＤ２及びｈＢＤ３の産生の減少に関連している（Ｇｅｒｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｗｅｈｋａｍｐ ｅｔ ａｌ，２００５）。さらに、クローン病の発症における腸の微生物叢の関与が立証されている（Ｓｗｉｄｓｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて、これらの研究者は、活性なクローン病において、粘膜関連性及び侵襲性細菌の著しい増大が観察され、一方でこれらの細菌は、正常な小腸及び大腸には存在しないことを示した。これらの観察をまとめると、健常人において、腸の上皮バリアにおける適切なレベルのディフェンシンは、内腔細菌の組成及び数を抑制するように作用し、そしてそれらが粘膜に吸着し且つ侵入して、炎症を引き起こすのを防止するように作用するという仮説ができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。他方で、保護レベルの分泌ディフェンシンを産生する能力が不十分なヒトにおいて、抗微生物防御と内腔細菌との間のバランスがシフトされる。結果的にこれは、炎症状態を誘導する下部腸組織への細菌の侵襲を許容し、そしてクローン病へと進展し得る。
【００２０】
この過程に基づいて、国際公開第２００７／０８１４８６号は、炎症性腸疾患の治療における、幾つかのヒト・ディフェンシンの使用を開示している。発明者は、腸管腔における適切な場所でのそれらの放出を可能とする製剤で、クローン病患者に経口投与されたディフェンシンが、侵襲性細菌の数を減少させ、正常な上皮バリアへと回復させ、したがって炎症性疾患の重症度を減少させることを示唆した。
【発明の概要】
【００２１】
国際公開第２００７／０８１４８６号によれば、ディフェンシンの機能は、内腔における細菌を直接標的とし、且つ死滅させ、それらが上皮組織に侵入することを防止することである。すなわち、ディフェンシンの機能は、純粋に抗感染性化合物としてである。国際公開第２００７／０８１４８６号との関連で、非経口投与経路を用いるとｈｂＤ２が内腔細菌と遭遇しないため、非経口で投与されたｈｂＤ２がマウスにおけるＤＤＳ誘導性結腸炎の深刻度を減少させることができるということは、驚くべきことである。さらに我々は、ｈＢＤ２の効果が、ＰＢＭＣによって分泌される炎症性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−２３のレベルを減少させることであることを本明細書において示す。これらのサイトカインは、炎症性腸疾患を含む、多くの炎症性疾患において重要な役割を果たすことが知られている。抗微生物機能の他に、ディフェンシンは、広い範囲の免疫調節機能を有することが１０年以上知られている。しかし、ヒト・ディフェンシンの免疫調節特性に関する大多数の研究は、それらが第一に炎症性又は炎症促進性機能を有すると記載している（例えば、Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｏｗｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｌｅｈｒｅｒ，２００４を参照）。
【００２２】
したがって、非経口で投与されたｈＢＤ２が、ＩＢＤ患者の疾患の深刻度を減少させることができるはずであることは全く予想外のことである。第一に、非経口で投与されたとき、ｈＢＤ２は、腸内腔に到達して、当該疾患の誘導に関与する有害な細菌と接触することができない。さらに、大多数の公知文献に基づいて、血流に入ったディフェンシンは、本明細書において示された研究において観察されるような抗炎症性応答よりも、炎症性を誘導するであろうと当業者は予想し得る。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
ディフェンシン：本明細書における用語「ディフェンシン」は、抗微生物性ペプチドのディフェンシン類に属するものとして当業者によって認識されるポリペプチドのことである。ポリペプチドが本発明のディフェンシンであるか否か決定するために、無料で利用可能なＨＭＭＥＲソフトウェア・パッケージを使用することによって、アミノ酸配列が、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデル・プロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較され得る。
【００２４】
ＰＦＡＭディフェンシン・ファミリーは、例えばディフェンシン１、又は「哺乳動物のディフェンシン」（受入番号ＰＦ００３２３）、及びディフェンシン・２、又はディフェンシン・ベータ、又は「ベータ・ディフェンシン」（受入番号ＰＦ００７１１）を含む。
【００２５】
本発明のディフェンシンは、ベータ・ディフェンシン類に属する。ベータ・ディフェンシン由来のディフェンシンは、共通の構造的特徴、例えばシステインのパターンを有する。
【００２６】
本発明のディフェンシンの例は、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（ｈＢＤ２；配列番号４を参照）、及びマウス・ベータディフェンシン３（ｍＢＤ３；配列番号６を参照）を含む。
【００２７】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列の関連性を、パラメーター「同一性」で記載する。
【００２８】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００２９】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，同上；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，同上）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００３０】
単離されたポリペプチド：本明細書において使用される用語「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」は、源から単離される、バリアント又はポリペプチドのことである。一の態様において、当該バリアント又はポリペプチドは、当該ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される通り、少なくとも１％純粋、好ましくは少なくとも５％純粋、より好ましくは少なくとも１０％純粋、より好ましくは少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００３１】
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然又は組み換えに関連する他のポリペプチド材料を、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてより最も好ましくは最大０．５重量％含むポリペプチド調製物を示す。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、当該調製物中に存在する総ポリペプチド材料が少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で存在する。これは例えば、周知の組み換え法により、又は古典的な精製法により、当該ポリペプチドを精製することによって達成され得る。
【００３２】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン
本発明は、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎、及び／又はクローン病の治療における、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシンの医薬用途に関する。当該治療は、処置された組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少に好ましくは関連する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び／又は配列番号６のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４のバリアント（配列番号５）、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン３（配列番号６）から成る。さらにより好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、及び／又はヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）から成る。
【００３４】
別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）から成る。
【００３５】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、ヒト・ベータ・ディフェンシン４、及びマウス・ベータ・ディフェンシン３、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、及び機能的に等価なそのバリアントから成る。
【００３６】
本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。
【００３７】
本発明に関して、哺乳動物の（例えばヒトの）・ベータ・ディフェンシンの「機能的に等価なバリアント」は、炎症性腸疾患において、親の哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同じ効果を示す、修飾された哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンである。好ましくは、それはまた、ＴＮＦ−アルファ活性において、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同一の効果を示す。
【００３８】
本発明に従って、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンアミノ酸配列と比較して、１〜５個のアミノ酸修飾、好ましくは１〜４個のアミノ酸修飾、より好ましくは１〜３個のアミノ酸修飾、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸修飾、及び特に１個のアミノ酸修飾を含み得る。
【００３９】
本明細書において、用語「修飾」は、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの任意の化学修飾を意味する。１又は２以上の修飾は、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入、並びに１又は２以上のアミノ酸側鎖の交換；又は当該アミノ酸配列において類似の特性を有する非天然のアミノ酸の使用であり得る。特に、１又は２以上の修飾は、アミド化、例えばＣ末端のアミド化であり得る。
【００４０】
好ましくは、アミノ酸の修飾は小さい性質のものであり、そしてそれは、ポリペプチドのフォールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入；単一の欠失；小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；又は正味電荷を変更することによって精製を容易にする小規模な伸長、或いは別の機能のもの、例えばポリ−ヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインである。
【００４１】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群の内で存在する。特異的な活性を通常変更しないアミノ酸置換は、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４２】
２０個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換され得る。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾され、及び／又は１又は２以上の側鎖において標準的アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００４３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンにおける必須のアミノ酸は、当技術分野で既知の手順、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン走査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）に従って同定され得る。後者の技術において、単一のアラニンの変異は分子内における全ての残基に導入され、そして生じた変異分子は、生物学的活性（すなわち、炎症性腸疾患に対する活性及び／又はＴＮＦ−アルファ活性の抑制）を試験され、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。必須のアミノ酸の同一性は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測され得る。
【００４４】
単一の又は複数のアミノ酸の置換が、既知の方法の変異誘発、組み換え及び／又はシャッフリングを用いてなされ得、及び試験され得、その後、関連性スクリーニング手順、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に開示されたものが行われ得る。使用され得る他の方法は、エラー・プローンＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（ｒｅｇｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）を含む。
【００４５】
本発明のポリペプチドのＮ末端の伸長は好適には、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、特に３〜１５個のアミノ酸から成り得る。一の実施形態において、Ｎ末端ペプチドの伸長は、Ａｒｇ（Ｒ）を含まない。別の実施形態において、Ｎ末端の伸長は、以下にさらに定義されるｋｅｘ２又はｋｅｘ２様切断部位を含む。好ましい実施形態において、Ｎ末端伸長は、少なくとも２つのＧｌｕ（Ｅ）及び／又はＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基を含むペプチドであって、例えばＮ末端伸長は以下の配列の一つを含む：ＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ及びＤＤ。
【００４６】
方法、及び用途
ヒト・ベータ・ディフェンシン２は、１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された大腸炎モデルマウスにおいて、疾患パラメーターの深刻度を著しく減少させ；したがって、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病の治療のための医薬として、強力な活性を示すことが判明した。
【００４７】
本発明はしたがって、炎症性腸疾患の治療方法を提供し、当該治療は、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２を、医薬組成物の形態で、当該治療を必要とする対象へ非経口投与することを含む。非経口投与のための医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２がまた、提供され、及び、炎症性腸疾患の治療のための、非経口投与のための医薬、例えば医薬組成物の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２の使用がまた、提供される。治療は、存在する疾患又は障害の治療、及び疾患又は障害の予防（防止）を含む。
【００４８】
実施形態において、当該治療は、治療がなされた組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少をもたらし、好ましくはＴＮＦ−アルファ活性の減少、及びＩＬ−１０活性の増大をもたらす。
【００４９】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、経腸（例えば口腔、経口、経鼻、直腸）、非経口（例えば静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内）、又は局所（例えば、皮膚上、鼻腔内、若しくは気管内）を含む、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物で、治療において使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、持続放出インプラントの一部として投与され得る。
【００５０】
さらに他の実施形態において、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する好適な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得、その後に再水和される。
【００５１】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを含む医薬組成物は、従来法に従って、例えば混合、整粒、被覆、溶解、又は凍結乾燥工程によって製剤化され得る。
【００５２】
好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン、並びに医薬として許容される担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００５３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンは好ましくは、炎症性腸疾患における治療のために有効である量で、好ましくは患者において許容される毒性で、医薬組成物において使用される。かかる治療のために好適な投与量は当然、例えば、使用される本発明の化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式、並びに処置される健康状態の性質及び深刻度によって変化し得る。しかし一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足な結果のために、望ましい一日用量は、好ましくは約０．００１ｇ〜約１．５ｇ、より好ましくは約０．０１ｇ〜１．０ｇ；又は約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、１日に１回、２回、３回、又は４回の分割量で投与される。好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されているものと同様の投与様式で、同様の投与量で投与され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを、投与経路に依存して、単位剤形につき、約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上の量で含み得、そしてそれは、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇで、及びより好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇで含み得る。しかし、特定の実施形態において、上記のものより低い又は高い投与量が好ましいものであり得る。好適な濃度及び投与量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００５５】
医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体及び／又は希釈剤は、生理食塩水及び滅菌水を含み、並びに場合により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含み得る。当該組成物はまた、丸剤、カプセル、顆粒、タブレット（被覆された、又は被覆されていない）、（注射可能）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散体（例えばアンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入製剤、粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態）として、製剤化され得る。当該製剤は、（哺乳動物のベータ・ディフェンシン、及び他の追加の活性成分に加えて、）担体、賦形剤、砕解剤、フロー・コンディショナー（ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）、糖類及び甘味剤、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、滑剤、並びに／又は当技術分野で既知の他の医薬用賦形剤を含み得る。当業者はさらに、好適な方法で、及び慣例に従って、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に記載された方法で、哺乳動物のベータ・ディフェンシンをさらに製剤化し得る。
【００５６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンは、単剤で、又は１、２若しくは３以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質を用いた併用療法で、及び／又は１若しくは２以上の医薬として許容される賦形剤と共に使用され得る。
【００５７】
イン・ビトロにおける合成
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を用いて、イン・ビトロにおける合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．などの自動合成機がある。合成機を用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ体）、例えばＤ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、側鎖が異なる長さ又は官能基を有するジアステレオマーなどと置換され得る。特定の配列及び製造方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。
【００５８】
結合のために好都合な官能基、例えば、アミドのための、又は置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などを含む種々のペプチド又はタンパク質に、化学結合が提供され得る。
【００５９】
必要に応じて、種々の基が、合成中又は発現中にペプチドへと導入され得、そしてそれらは、他の分子又は表面への結合を可能とする。したがって、システインは、チオエーテルを製造するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体と結合するために使用され得、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基はアミドなどを形成するために使用され得る。
【００６０】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、又はその機能的等価体はまた、組み換え合成の従来法に従って、単離され且つ精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、そして当該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティー・クロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製され得る。
【００６１】
本発明は、本発明の範囲を限定するものであるとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例
ｈＢＤ２の免疫調節効果に関する試験を通じて、ｈＢＤ２が、抗炎症性における大きな潜在力を有することが予想外にも観察された。
【００６３】
本明細書において、我々は、ｈＢＤ２が、マウスへデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＤＳ）を経口投与することによって誘導された炎症性腸疾患（結腸炎）の治療に大きな効果があることを示した。我々はまた、ｈＢＤ２が、ＴＮＦ−アルファに対する下方制御潜在力を有することを示した。
【００６４】
実施例１
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の産生
ｈＢＤ２を組み換えで産生した。ｈＢＤ２をコードする合成ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２．０）を、ｐＥＴ−３２（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。生じたプラスミドは、Ｎ末端チオレドキシン部位、その後にｈｉｓ−タグ、エンテロキナーゼ切断部位、及び最後にｈＢＤ２ペプチドを含む、翻訳用融合ペプチドをコードした。発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１へと形質転換した。
【００６５】
この株の一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ−グリセロールで１００倍に希釈し、そして３７℃にて約８のＯＤ６００となるように増殖させ、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導し、その後細胞を遠心分離で採取した。ｈｉｓ−タグされたｔｒｘ−ｈＢＤ２融合ペプチドを、標準的手順を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）上で精製した。ｈｉｓ−タグ精製された融合ペプチドをその後、エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＣａＣｌ2）中にて一晩透析し、そしてエンテロキナーゼで切断して成熟ｈＢＤ２を放出した。ｈＢＤ２ペプチドを、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ ｍａｔｒｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｈＢＤ２の正確な分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。
【００６６】
ｍＢＤ３（実施例７参照）の産生を、同一の手順を用いて行った。
【００６７】
ｈＢＤ２の適切なフォールディング及びジスルフィド架橋形態をその後、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分光法と連動したトリプシン消化を用いて確認した。
【００６８】
エンドトキシンを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって低ｐＨにて除去し、そしてエンドトキシンの含有量をＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＫＴＡ２）によって決定し、そして当該レベルは、当該アッセイの検出限界（０．０５ＥＵ／ｍｇ）未満であることが分かった。エンドトキシンアッセイの検出限界未満のレベルが、ＰＢＭＣを刺激することができないことを確定するために、非常に強力なリポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低レベルのこのＬＰＳ（０．０６ｎｇ／ｍｌ）は、検出可能なサイトカイン産生へとＰＢＭＣを刺激することができた。
【００６９】
実施例２
１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された結腸炎マウスモデル
以下の試験の目的は、マウスへデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与することによって誘導された、炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシン２の抗炎症活性を決定することであった。
【００７０】
Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３（４２），ｐｐ．５５８１−５５９３（２００７）；及び、Ｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５９（１１），１０７３−１０８３（２００７）に記載されている通り、ＤＳＳ結腸炎マウスモデルは、炎症性腸疾患の試験のための、十分に認識されているモデルである。
【００７１】
材料
試験品目
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）；上の実施例１を参照
メチルプレドニゾロン２１−ヘミサクシネート（「プレドニゾロン」）
ＰＢＳ緩衝液（ＧＩＢＣＯ）
【００７２】
実験動物
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ ｌｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を試験で使用した。これが、２％ＤＤＳの飲料水溶液を１０日間投与したときに、結腸の著しい炎症を引き起こすことが実証されている種及び性別であるためである。
【００７３】
識別
尾に書かれた数字及び文字コードで動物を識別した。さらに、動物の数及び性別、試験品目又は名前、投与量レベル、投与経路、処置期間、グルーブ番号、試験コード、及び試験監督者の名前を表示した、色コードされたカードによって各々のケージを識別した。
【００７４】
体重
試験開始日における動物の平均体重は２２．４±０．１６ｇであった。
【００７５】
順応（隔離所）
試験開始前最低７日間、主要な試験と同じ条件下に置いた。
【００７６】
収容
到着時、動物を分けて、ステンレス製の蓋を有するポリカーボネート製のケージ（Ｅ−Ｔｙｐｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，２５５×４０５×１９７ｍｍ）にランダムに収容した。
【００７７】
動物は、性別に従って、１ケージあたり５匹の動物のグループで収容され、動物の部屋内は、調節された温度（２２±２℃）、照明（１２／１２時間の光／暗闇）、空気圧、空気の入れ替え数、及び相対湿度（３０〜７０％）であった。
【００７８】
全てのケージは、敷物として床上におがくず（Ｌｉｇｎｏｃｅｌ３−４；Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｓｐａｉｎ）を有した。
【００７９】
食餌及び水
全てのマウスは、乾燥したペレット型の標準的齧歯動物用の食餌（Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ ２０１４；Ｈａｒｌａｎ ｌｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｓｐａｉｎ）を自由に食べることができた。
【００８０】
水はボトル中で自由に提供された。動物の部屋へのタップ水供給は、その組成を確認するために、及び可能のある汚染物質（化学物質及び微生物性のもの）を検出するために、定期的に分析された。
【００８１】
装置及び材料
装置
・動物はかり、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｏｄ．ＢＰ２１００
・外科的解剖装置
・Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｃ遠心分離機
・Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ顕微鏡
・Ｈｏｏｋ＆Ｔｕｃｋｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｒｏｔａｍｉｘｅｒ
・ＩＫＡ ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘホモジナイザー
・Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｏｄ．ＢＰ２２１Ｓ化学天秤
・ＥＬＩＳＡマイクロプレート・リーダーＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ
材料及び試薬：
・滅菌使い捨てシリンジ（１ｍｌ）
・滅菌Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ２５Ｇ輸液セット
・麻酔剤（ケタミン／キシラジン）
・局所麻酔用クリーム（ＥＭＬＡ，Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）
・デキストラン硫酸ナトリウム３０．０００〜５０．０００Ｄａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）
・中性緩衝ホルマリン（ＶＷＲ）
・ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）
・プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）
・マウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００８２】
実験手順
試験設計
動物を５つの実験グループへと分けた。各々のグループは、１０匹のオスから成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）、ｉ．ｖ．で処理
グループＢ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＣ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＤ：ｈＢＤ２（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＥ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
【００８３】
全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って、）最大で５匹のマウスを各々のケージに収容した。試験品目の投与に先立ち、全ての動物について、研究所に到着時に体重を測定した。
【００８４】
試験物質の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、滅菌針（２５Ｇ）を用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量５ｍｌ／ｋｇ体重でゆっくりとボーラス投与した。動物は、対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）の一回投与量を、毎日（２４時間毎に）、１０日間連続して受けた。
【００８５】
プレドニゾロンは、ｈＢＤ２と同一の投与計画で、１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、５ｍｌ／ｋｇ体重の投与体積で経口投与された。
【００８６】
実験手順
結腸炎の誘導
ＤＤＳ２％含有飲料水を７日間補給することによって、結腸炎をマウスで誘導した。
【００８７】
１日目に全てのマウスの体重を測定し、実験グループに従って印をつけた。各々のケージの飲料容器をＤＤＳ溶液で満たし、全ての容器の蓋が適切に取り付けられていること、及び過度に詰め込まれていないことを確認した。
【００８８】
３日目に容器中に残存する溶液を空にし、そして再度新鮮なＤＳＳ溶液で満たした。この手順を５日目に再び繰り返した。
【００８９】
８日目に、残存する溶液を捨て、そしてオートクレーブされた水と置換した。２日経過後の１０日目に、動物を屠殺した。
【００９０】
臨床的評価（疾患活動性インデックス）
以下のパラメーターに従って、０〜４の範囲で、有効な臨床疾患活性インデックス（ＤＡＩ）の計算を行い、ＤＳＳ処理された動物の毎日の臨床的評価を行った：便の硬さ、直腸出血の存在、又は不在、及び体重減少：
【００９１】
【表１】
【００９２】
体重減少を、元の体重（１日目）と各々の実験日（２日目〜１０日目）における体重との間のパーセント差としてとして計算した。
【００９３】
下痢の外観は、肛門に着いた粘液/糞便物質として定義された。直腸出血は、目に見える血／粘液、又は直腸全体の出血を含む、下痢として定義された。各々の日における、ＤＡＩの最大スコアは１２である。
【００９４】
血液採取
試験期間中における２つの離れた時期：１日目と５日目において、２つの血液試料を各々の動物から得た。血液試料を各々の時期において、試験品目の投与後２時間で、伏在静脈の穿刺によってＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ−３００ミクロチューブに採った。この血液採取法は、麻酔剤又は鎮痛剤を必要とせず、そして動物に最小限のストレスを与える（Ｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、試験の最終日において、試験品目投与後２時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。
【００９５】
血液試料を凝固し、その後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして血清を−８０℃で貯蔵のために凍結した。
【００９６】
安楽死及び結腸試料の回収
１０日目において、コントロール・ビヒクル、ｈＢＤ２又はプレドニゾロンの最後の投与後２時間で、動物を過剰量の麻酔剤で殺した。それらの結腸を取り除き、そして盲腸の除去後、それらの長さ及び重量を測定した。
【００９７】
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、そして以下のスコアリング・システムに従う、その後の組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）のために、中性緩衝ホルマリンで保存した：
【００９８】
【表２】
【００９９】
結腸組織試料におけるＴＮＦ−アルファ濃度の決定
結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）含有ＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、その後のＴＮＦ−α濃度の決定のために、−２０℃で貯蔵した。
【０１００】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表１．１日目〜１０日目における疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの経過。所定の日におけるコントロール（ビヒクル）グループからの有意差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
組織学評価
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を行い、そして上記のスコアリング・システムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。
【０１０３】
結腸組織試料におけるＴＮＦ−α濃度の決定
結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）含有ＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、その後のＴＮＦ−α濃度の決定のために、−２０℃で貯蔵した。
【０１０４】
表３．組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のＴＮＦ−α濃度。コントロール（ビヒクル）グループからの組織学スコアにおける差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
統計学的分析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカル・ワリス検定、及び多重比較を可能とするためのＤｕｎ事後検定によって評価した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。
【０１０７】
結論
試験された最低投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）のｈＢＤ２は、ＤＤＳ投与によって誘導された疾患活動性インデックスにおける増加を、７日目（１．４４±０．３８試験品目ｖｓ．４．１±０．６９ビヒクル；ｐ＜０．０１）、８日目（２．１１±０．２試験品目ｖｓ．５．９±１．２６ビヒクル；ｐ＜０．０５）、９日目（３．８９±０．３５試験品目ｖｓ．８．９±１．０２ビヒクル；ｐ＜０．０１）及び１０日目（６．４４±０．８５試験品目ｖｓ．１０．９±０．６２試験品目；ｐ＜０．０５）において、有意に減少させることを実証した。
【０１０８】
ｈＢＤ２の中等度の投与量（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で連続１０日間処置することにより、疾患活動性インデックス・スコアが明らかに減少したが、これは１０日目においてのみ有意であった（６．４４±１．０８試験品目ｖｓ．１０．９±０．６２ビヒクル；ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
１０日目における疾患活動性インデックスで得られた結果と同様に、各々の動物の近位結腸の組織学分析は、ｈＢＤ２の低用量での処理によって、組織学的損傷スコアが非常に有意に減少することを明らかとした（２．２２±０．４３試験品目ｖｓ．４．２±０．２５ビヒクル；ｐ＜０．０１）。さらに、組織学的損傷の有意な減少はまた、中等度用量のｈＢＤ２、高用量のｈＢＤ２、及びプレドニゾロンを用いた場合に観察された（各々、２．８９±０．３５；２．８９±０．３９及び２．８±０．５；ｐ＜０．０５）。対照的に、遠位結腸において、組織学的損傷の明らかな減少が低用量のｈＢＤ２、中等度用量のｈＢＤ２、及びプレドニゾロンで処理された動物で観察されたが、これは統計学的に有意ではなかった。高用量のｈＢＤ２で処理された動物において、減少は観察されなかった。同様に、低用量、及び中等度用量のｈＢＤ２を用いた処理により、結腸のＴＮＦ−アルファレベルが明らかに減少したが、この明らかな減少は統計的に有意ではなかった。
【０１１０】
本試験で得られた結果は、１０日間の処理期間後、マウスにおいて誘導されたＤＤＳ結腸炎モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性を実証している。しかし、この抗炎症活性は、より低用量のｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ／日ｉ．ｖ．）が使用されたときにより顕著であり、そして本試験で使用された最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日ｉ．ｖ．）まで、投与量を増大するにつれて徐々に失われるように思われる。さらに、ｈＢＤ２の最低用量の抗炎症効果は、１ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．でのプレドニゾロンにおける効果と同等か、又はそれよりもさらに大きい（例えば組織学スコア）。
【０１１１】
実施例３
１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された結腸炎マウスモデル
基本的に実施例２に記載された通りに、実施例３を行った。違いを以下に示す。
【０１１２】
体重
試験開始日における動物の平均体重は１９．７４±０．０９ｇ（平均±ＳＥＭ）であった。
【０１１３】
試験設計
動物を５つの実験グループへと分けた。各々のグループは、１０匹のオスから成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）、ｉ．ｖ．で処理
グループＢ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＣ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＤ：ｈＢＤ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＥ：ｈＢＤ２（０．００１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＦ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．＋ｓ．ｃ．）で処理−１日２回
グループＧ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−２日毎
グループＨ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
グループＪ：メチルプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
【０１１４】
全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って、）最大で５匹のマウスを各々のケージに収容した。試験化合物及びレファレンス化合物の投与に先立ち、全ての動物は、研究所に到着時に体重を測定された。
【０１１５】
試験品目の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、滅菌針（２５Ｇ）を用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量５ｍｌ／ｋｇ体重でゆっくりと（１５秒かけて）ボーラス投与した。
【０１１６】
グループＡ〜Ｅの動物は、対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）の一回投与量を、毎日（２４時間毎に）、１０日間連続して受けた。
【０１１７】
グループＦの動物は、対応する試験品目の一回投与量をｉ．ｖ．で、及び別の投与量を（ｉ．ｖ．投与後１２時間で）ｓ．ｃ．で、１０日間連続して受けた。
【０１１８】
グループＧの動物は、対応する試験品目の一回投与量を２日毎に、１０日間連続して受けた。
【０１１９】
メチルプレドニゾロンは、１ｍｇ／ｋｇ（グループＨ）及び１０ｍｇ／ｋｇ（グループＪ）の投与量で、５ｍｌ／ｋｇ体重の投与体積で、１日１回、１０日間連続して経口投与された。
【０１２０】
血液採取
試験の最終日において、試験品目投与後２時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。
【０１２１】
血液試料を凝固し、その後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして得られた血清をその後の分析のために−８０℃で凍結した。
【０１２２】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表４．１日目〜１０日目における疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの経過。所定の日におけるコントロール（ビヒクル）グループからの有意差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。６日目〜１０日目を次のページに示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
組織学評価
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を行い、そして上記のスコアリング・システムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。
【０１２６】
表５．組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のＴＮＦ−α濃度。コントロール（ビヒクル）グループの値からの組織学スコアにおける差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
統計学的分析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカル・ワリス検定、及び多重比較のためのＤｕｎ事後検定によって評価した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。上の表において、対応するコントロール（ビヒクル）グループに対する有意差を*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１として表示する。
【０１２９】
結果
本試験の目的は、マウスへのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＤＳ、２％）経口投与によって誘導された炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性を決定することであった。
【０１３０】
本試験において得られた結果は、１０日間の処置期間後、マウスにおいて誘導されたＤＤＳ結腸炎モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性をさらに実証している。
【０１３１】
この抗炎症活性は、１日２回（１２時間毎）の、静脈内投与及び皮下投与の両方で、０．１ｍｇ／ｋｇの投与量での、ｈＢＤ２の投与後においてより顕著であり得る。さらに、このｈＢＤ２の投与量で観察された抗炎症効果は、プレドニゾロンを１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与したときの効果と同等又はさらに大きかった（疾患活動性インデックス及び組織学的スコアの両方）。
【０１３２】
実施例４
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の抗炎症活性
ヒトＰＢＭＣ培養中において、ｈＢＤ２を用いた処置が、ＬＰＳ、ＬＴＡ又はペプチドグリカン刺激された培養のサイトカイン・プロファイルにおいて大きな影響を有することが観察された。ｈＢＤ２が炎症性サイトカイン、並びに、ケモカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＩＬ−８を誘導することができることは以前に観察されている（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｂｏｎｉｏｔｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６）。
【０１３３】
本明細書において我々は、ｈＢＤ２が２つの炎症性サイトカイン、ＴＮＦ及びＩＬ−１βに対する下方制御潜在力を有することを、そしてｈＢＤ２がまた、リポポリ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた炎症性刺激時において、ＩＬ−１０を誘導することを示した。ＩＬ−１０は、潜在的な抗炎症性サイトカインであり、したがって、ｈＢＤ２のもたらす効果は抗炎症性である。これは、ヒトＰＢＭＣ、単球細胞株、及び樹状細胞株（ｄｅｎｄｒｉｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）において観察された。
【０１３４】
ｈＢＤ２は、実施例１に記載された通りに調製された。
【０１３５】
ＰＢＭＣの単離及び刺激
（デンマークの関連倫理委員会から認定されている）健常者から末梢血を採取した。ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内のＦｉｃｏｌｌ密度遠心にかけた。血漿を個々のドナーの上清から回収し、そしてそれが培養培地（自家培養培地）中２％で使用されるまで、氷上で保存した。単離されたＰＢＭＣを自家培養培地中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり２５５．０００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、それ単体で、或いは、０．６ｎｇ／ｍｌ若しくは２０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）のＬＰＳ、１．２５μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来，Ｓｉｇｍａ Ｌ３２６５）、又は４０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来，Ｓｉｇｍａ ７７１４０）と共に用いて、同一ドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。刺激のために使用される濃度は、実験初期に３人の異なるドナーにおいて最適化され、ＬＰＳに関しては、２つの異なる濃度が使用されて、調節可能なサイトカインレベル上にあることを確実なものとした。幾つかの実験において、デキサメサゾン及びインドメタシンを、単剤で、及び炎症性サイトカインの下方制御のコントロールとしてのＬＰＳ又はＬＴＡを共に用いてＰＢＭＣを処置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。全ての実験において生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定し、そして幾つかの場合においてはＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造業者の使用説明に従って測定し、そして幾つかの実験において、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって細胞数をカウントすることによって判断した。
【０１３６】
ＭＵＴＺ−３の培養及び刺激
ヒト骨髄性白血病由来の細胞株ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ａ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｍ４５２６）中で維持し、２０％［ｖ／ｖ］ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ６１７８）、及び４０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１５−ＧＭ−０５０）を追加した。これらの前駆細胞は以下に示す単球細胞株中に存在し、そしてこれらの単球を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、単剤で、又はＬＰＳ若しくはＬＴＡと共に用いて刺激した。
【０１３７】
樹状細胞の分化
樹状細胞株を生じさせるために、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈｌＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ヒト骨髄性白血病細胞株ＭＵＴＺ−３（１×１０5細胞／ｍｌ）を、７日間かけて分化させて未熟ＤＣとした。２〜３日毎に培地を交換した。分化された細胞株を、ＬＰＳ又はＬＴＡのいずれかを用いて、ｈＢＤ２の存在下で及び不在下でさらに刺激して、樹状細胞におけるｈＢＤ２の効果を調べた。
【０１３８】
サイトカインの測定
上清中におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーター上で、ヒト炎症サイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、製造業者の使用説明（ＢＤ）に従って測定した。以下のサイトカインを測定した：ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６。幾つかの実験において、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）によって、製造業者の使用説明に従って、サイトカインを測定した。
【０１３９】
データ分析
代表的結果が示されるように、全ての実験を少なくとも２回行った。得られたデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現した。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメサゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって統計的有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で有意であると見なされた。
【０１４０】
結果
ＬＰＳ及びＬＴＡで、処理された及び無処理のヒトＰＢＭＣで、ｈＢＤ２の効果を試験した（表６、７及び８）。ｈＢＤ２を用いた処理により、全３つの試験された濃度に関して、刺激された培養においてＴＮＦの有意な下方制御がなされ（表６）、当該下方制御は、０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに関して、及びＬＴＡに関して用量依存的であった。ＩＬ−１βに関して、主に最高用量で下方制御が観察された（表７）。興味深いことに、ＩＬ−１０は有意に且つ用量依存的に上方制御された（表８）。炎症性サイトカインの下方制御、及び抗炎症性サイトカインの誘導は、ｈＢＤ２の非常に強い抗炎症潜在力を示す。ｈＢＤ２の抗炎症効果が細胞毒性効果によるものであることを排除するために、生存率を２つの異なるアッセイで測定した。ｈＢＤ２は、細胞において細胞毒性を有さず、観察される効果は、細胞増殖をもたらす、ＬＰＳ又はＬＴＡの刺激による刺激効果であることが、表９及び１０において見られる。したがって、ｈＢＤ２は、これらの細胞において細胞毒性効果を有さない。
【０１４１】
表１１、１２及び１３において、別のドナーからの上清は、フローサイトメトリーによるサイトメトリック・ビーズ・アッセイの代わりに、ＥＬＩＳＡによって、サイトカインに関して分析され、同一のことが観察されたが、アッセイの感度がより低く、そして検出限界が非常により高いため、当該効果が有意なものではなかった。
【０１４２】
さらに別のＴｏｌｌ様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカンで刺激されたＰＢＭＣにおけるｈＢＤ２の効果が調べられた（表１４及び１５）。同一のことが観察された：ＴＮＦは用量依存的に下方制御され、そしてＩＬ−１０は用量依存的に誘導された。
【０１４３】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンを、アッセイにおいて試験した。当該化合物が毒性ではなく、且つ培地への溶解性のために達成可能な濃度であるように、濃度は選択された。ＬＴＡを用いた刺激後にのみ、インドメタシンはＴＮＦを阻害したが（表１６）、デキサメタゾンは、ＴＮＦ産生を効果的に下方制御し、同一のことがＩＬ−１βに関して観察された（表１８）。インドメタシンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害剤であり、軽度〜中等度の痛みを治療するために使用される非ステロイド系抗炎症剤であり、関節炎症状を緩和するために有用であり、並びにデキサメタゾンは炎症性疾患の治療において第一に使用される合成グルココルチコイドであり、そしてそれは、非常に低用量で、炎症性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有し（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９８）、そしてそれを我々は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βに関しても観察した。ｈＢＤ２は、２つの抗炎症性化合物と同じくらい、またはそれらよりも効果的であった。
【０１４４】
表１９及び２０において、単球細胞株、及び樹状細胞においてＴＮＦを下方制御する、ｈＢＤ２の効果が示され、同じことがＰＢＭＣに関して観察された。ＩＬ−１０はまた、ｈＢＤ２且つＬＰＳ、又はｈＢＤ２且つＬＴＡで刺激された樹状細胞に関して誘導された（結果は示さず）。
【０１４５】
ＬＰＳ又はＬＴＡへのｈＢＤ２の結合がＴＮＦ及びＩＬ−１βの下方制御を引き起こすことを排除するために、合成リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２−ＴＬＲ１リガンド），ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｔｌｒｔ−ｐｍｓ）を用いたＰＭＢＣの刺激に対するｈＢＤ２の効果を試験した。このリガンドを用いた刺激後においても、ｈＢＤ２は下方制御することができ、このことは、ＬＰＳ又はＬＴＡの中和が、観察される効果に関与しないことを示している（結果は示さず）。さらに、ＴＮＦ−α及びＩＬ−αを含有するサイトカイン・カクテル、並びにｈＢＤ２を用いた樹状細胞の刺激は、サイトカイン・カクテル単体を用いた刺激と比較して、ＩＬ−１β、及びＩＬ−８、及びＩＬ−６の下方制御効果を有した。ＴＮＦ−αを用いた刺激のために、ＴＮＦに対する効果を明白に分析することができなかった（結果を示さず）。
【０１４６】
表６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロール（太字）と比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
表７．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１４９】
【表９】
【０１５０】
表８．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，*ｐ＜０．５、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１５１】
【表１０】
【０１５２】
表９．ＭＴＳアッセイによって測定された、刺激の２４時間後におけるＰＢＭＣ生存率。横列中、異なる下付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１５３】
【表１１】
【０１５４】
表１０．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって測定されたＰＢＭＣ生存率、５人の異なるドナーからの、５つの実験からの、１つの代表的実験。横列中異なる上付き文字を有する値、及び縦列中異なる上付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１５５】
【表１２】
【０１５６】
表１１．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−アルファ分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１ｎｇ／ｍｌ、*ｐ＜０．０５、各々のコントロールと比較；**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１５７】
【表１３】
【０１５８】
表１２．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０３ｎｇ／ｍｌ。
【０１５９】
【表１４】
【０１６０】
表１３．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１６ｎｇ／ｍｌ、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１６１】
【表１５】
【０１６２】
表１４．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６３】
【表１６】
【０１６４】
表１５．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６５】
【表１７】
【０１６６】
表１６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又はＴＮＦ阻害のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６７】
【表１８】
【０１６８】
表１７．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に増加した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６９】
【表１９】
【０１７０】
表１８．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７１】
【表２０】
【０１７２】
表１９．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト単球細胞株（ＭＵＴＺ−３）の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較してｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７３】
【表２１】
【０１７４】
表２０．（成熟ＤＣを生じさせるために）ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、未成熟樹状細胞の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０５、***各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７５】
【表２２】
【０１７６】
実施例５
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの抗炎症活性
基本的に実施例４に記載された通りに実施例５を行った。下の表に示した通り、化合物ｒｈＢＤ２は組み換えｈＢＤ２であり、そしてそれは実施例４において使用されたｈＢＤ２と同一である。
【０１７７】
下の表に示した通り、化合物ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントは、化学合成を用いて調製され、そしてＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．から得た。
【０１７８】
組み換えｈＢＤ２（ｒｈＢＤ２）のアミノ酸配列は、化学合成により調製されたｈＢＤ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１７９】
下の表で示されたｈＢＤ４バリアントは、ｈＢＤ４のアミノ酸３〜３９から成り、そして当該アミノ酸の配列は配列番号５に示した通りである。
【０１８０】
各々の表において、全ての試料は同一のドナーで試験された。ＳＤは標準偏差を意味する。
【０１８１】
結果
表２１．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８２】
【表２３】
【０１８３】
表２２．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８４】
【表２４】
【０１８５】
表２３．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８６】
【表２５】
【０１８７】
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの効果を、ＬＰＳで処置された及び処置されていないヒトＰＢＭＣで試験した（表２１、２２及び２３）。比較のために、ｒｈＢＤ２を各々の設定に含めた。
【０１８８】
全てのディフェンシンに関して、ＴＮＦは下方制御された。ＩＬ−１β分泌の減少は、ＴＮＦと同等であったが、ＴＮＦほど顕著ではなかった。ｈＢＤ２及びｈＢＤ４バリアントに関して、ＩＬ−１０の分泌は、有意に且つ用量依存的に上昇した。
【０１８９】
ｈＢＤ３は１０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌで試験され、並びにｈＢＤ４バリアントは４０μｇ／ｍｌで試験された；しかし、これらの濃度においていずれの分子も毒性であったために、毒性効果と抗炎症性効果とを区別することができなかった。
【０１９０】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブが当該設定中に含まれた。
【０１９１】
結論
全ての試験されたヒト・ベータ・ディフェンシンは、抗炎症潜在力を示した。
【０１９２】
実施例６
ヒトの単球由来樹状細胞及びヒトＰＢＭＣの、ＩＬ−２３の減少
実施例６は、ヒトＰＢＭＣに関して基本的に実施例４で記載された通りに行われた；しかし、読み出しはＴＮＦ、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１０の代わりにＩＬ−２３であった。さらに、ヒトの単球由来樹状細胞におけるｒｈＢＤ２の効果が同様に調べられた。
【０１９３】
単球由来樹状細胞（ＤＣ）の生成
ＤＣは、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．によって初めに記載された改良手順に従って調製された。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントをかけた遠心分離によって、健常なドナーの軟膜から精製された。製造業者の使用指示に従った、マグネティックビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による、ＣＤ１４＋細胞の正の選択によって、単球をＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＲＰＭＩ／２％ヒトＡＢ血清、組換え型ヒト顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中で６日間、６ウェルプレート中で培養し、２日後、及び５日後に培地／サイトカインを再補充した。培養６日後、未熟ＤＣを９６ウェルプレート中で１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再度培養し、そしてさらに２４時間、カクテル、及び／又はｈＢＤ２で、処置されなかったか、又は処置された。ｈＢＤ２を４つの濃度で、４通りで試験した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む炎症性カクテルを用いて、ｈＢＤ２は、炎症性フェノタイプへのｈＤＣ成熟を抑制するその能力を分析された。デキサメタゾンを加え、２０時間後に当該カクテルを、臨床的抗炎症活性を有することが証明されている化合物のためのポジティブ・コントロールとして加えた。ｈＢＤ２とのインキュベーションを行い、４時間後にカクテルを加えた。
【０１９４】
サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培養上清を回収し、−８０℃で保存した。製造業者の手順（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、市販の抗体及びスタンダードを用いた標準的サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２３の量を測定した。
【０１９５】
ＭＴＴアッセイ
ビヒクル、カクテル、又はｈＢＤ２を用いた処置によって任意の細胞が大幅に影響を受けるか否かを評価するために、４８時間後の細胞の生存の測定において、ＭＴＴ系細胞増殖決定キットを使用し、製造業者の手順（Ｓｉｇｍａ）に従って行った。
【０１９６】
統計学的分析
全ての実験は少なくとも２回行われ、代表的な結果を示す。示されたデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現された。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。差はｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【０１９７】
結果
表２４．培地（未刺激）、又はＬＰＳ及びＩＦＮ−γのいずれかで刺激され、培地（未処置）、ｈＢＤ２、又はデキサメタゾンのいずれかで処置された、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞の上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）、Ｎ＝４、３人の内１人の代表的ドナー。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。ｎｄ：検出されず（検出限界未満）。
【０１９８】
【表２６】
【０１９９】
表２５．培地（コントロール）、０．６ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、又は５μｇ／ｍｌ ＬＴＡのいずれかで刺激され、ｈＢＤ２、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処置された、ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較事後検定によって未処置細胞と比較。
【０２００】
【表２７】
【０２０１】
表２４に示された通り、ｈＢＤ２は、有意に且つ用量依存的に、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞からのＩＬ−２３分泌を抑制した。
【０２０２】
ヒトＰＢＭＣに関して、ＩＬ−２３分泌はまた、有意に抑制された（表２５）。これらの細胞において、逆の用量依存性が存在し、そしてそれは、より低用量のｈＢＤ２を試験したとき、鐘形の用量−反応阻害曲線であることが分かった（データを示さず）。
【０２０３】
これは、ＩＬ−２３分泌の抑制によって、ｈＢＤ２が慢性自己免疫状態の抑制効果を有し、したがってＩＬ−２３が、炎症性応答において重要な役割を果たすことを示している。Ｔｈ１７細胞は、それらの生存及び増殖に関して、ＩＬ−２３に依存しており、そしてＴｈ１７細胞は、幾つかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。
【０２０４】
実施例７
マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を用いた、ＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌の減少
実施例７は基本的に、ヒトＰＢＭＣに関して、実施例４に記載された通りに行われた。実施例１においてｈＢＤ２の産生のために使用された手順と同一のものを使用して、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を調製した。ｍＢＤ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される。マウスＰＢＭＣを、以下に記載した通りに調製した。
【０２０５】
マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び刺激
マウス末梢血単核細胞を、１０匹のＮＭＲＩマウスの血液から単離した。要約すれば、ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内でＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。血漿を上清から回収し、そして廃棄された。単離されたＰＢＭＣを培養培地（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，４２４０１）ｗ／１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに１％ Ｌ−グルタミン）中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり１５５．５００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２又はｍＢＤ３（マウス・ベータ・ディフェンシン３）を；それ単体で、又は、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）と共に用いて、同一のドナーからのＰＢＭＣを刺激した。ＬＰＳ刺激をした及びしていない培地へ、デキサメサゾンを３．５ｎｇ／ｍｌ加えた。３７℃で２４時間インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０２０６】
ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターにおける製造業者の使用説明に従って、マウス炎症サイトメトリック・ビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、上清におけるサイトカインの産生を測定した。
【０２０７】
上清を回収後、生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定した。
【０２０８】
結果
表２６．ＬＰＳを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料を同一のドナーで試験された。２人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０２０９】
【表２８】
【０２１０】
表２７．ＬＰＳを用いた、ｍＢＤ３を用いた及び用いない処置後における、マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。２匹のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０２１１】
【表２９】
【０２１２】
表２６に示された通り、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）は、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を、ｈＢＤ２及びデキサメタゾンと同程度まで下方制御した。ｍＤＢ３はまた、マウスＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を下方制御した（表２７）。
【０２１３】
したがってこの設定において、ｍＢＤ３は、すぐれた抗炎症活性を示した。
【０２１４】
【表３０】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、配列表をコンピュータで読み取り可能な形式で含む。当該コンピュータで読み取り可能な形式は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの投与による、炎症性腸疾患の予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒトのディフェンシン
多くの他の成分の中で、先天性免疫の重要な構成成分は、その各々が、かなりの選択性を示すが、共同で速やかに広範囲の細菌、ウィルス、及び真菌を死滅させることができる、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰの生物学的重要性は、天然においてそれらが偏在することによって強調され、そしてそれらは恐らく、全ての多細胞生物によって産生される。ヒトにおいて、重要なＡＭＰはディフェンシンである。ヒトのディフェンシンは、それらの３つの分子内システイン・ジスルフィド結合の形態に基づいて、α−及びβ−ディフェンシンへと分類され得る、小さいカチオン性ペプチドである。α−ディフェンシンは、好中性顆粒から最初に単離されたもの（ＨＮＰ１〜４）、及び小腸の陰窩中のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５及びＨＤ６）へとさらに細かく分類され得る。β−ディフェンシンは主に、皮膚、気管、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膵臓、及び乳腺を含む、種々の組織及び器官における上皮細胞によって産生される。β−ディフェンシン・ファミリーの最も特徴付けされたメンバーは、ｈＢＤ１〜３である。しかし、種々のバイオインフォマティクス・ツールを用いて、推定上のβ−ディフェンシン相同体をコードする約４０個のオープン・リーディング・フレームが、ヒトゲノム中でアノテートされた。ヒト・ディフェンシンの幾つかは、恒常的に産生されるが、他のものは、炎症性サイトカイン、又は外因性の微生物産生物によって誘導される。
【０００４】
ヒトのディフェンシン、及びそれらの直接的な抗微生物活性はまた、広い範囲の免疫調節性／代替性特性を有することが次第に明らかとなってきた。これらは、種々のケモカイン及びサイトカインの誘導、走化性及びアポトーシス活性、プロスタグランジンの誘導、ヒスタミン及びロイコトリエンの放出、補体の阻害、トール様受容体のシグナル伝達を通じた樹状細胞成熟の刺激、並びに好中球による病原体の一掃の刺激を含む。さらに、ヒトのディフェンシンはまた、創傷治癒、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成において役割を果たす。
【０００５】
ヒトのディフェンシンが、多くの感染性及び炎症性疾患において重要な役割を果たすことに関する証拠が増大している。ヒトのディフェンシンの過剰発現は通常、恐らく微生物成分又は内因性の炎症性サイトカインによる局所的誘導のために、炎症を起こした及び／又は感染した皮膚において観察される。乾癬において、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３は過剰に存在し、そして尋常性座瘡又は表在性毛嚢炎の患者の損傷性上皮において、ｈＢＤ２の上方制御が観察された。他方で、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の下方制御は、アトピー性皮膚炎に関連する。回腸のクローン病は、ＨＤ５及びＨＤ６の発現不足が関連しており、そして結腸におけるクローン病において、ｈＢＤ２〜４の発現は下方制御される。
【０００６】
サイトカイン
サイトカインは、細胞間シグナル伝達に関与し、並びに他の細胞の成長、分裂、及び機能に影響を及ぼす、高等真核生物からの小さな分泌ポリペプチドである。それらは、例えば対応する受容体経由で局所性又は全身性細胞間制御因子として作用する、強力な多面的ポリペプチドであり、したがって多くの生物学的過程、例えば免疫、炎症、及び造血において重要な役割を果たす。サイトカインは、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、マクロファージ／単球、及びリンパ球を含む、種々の細胞種によって産生される。
【０００７】
ＴＮＦ−αは、種々の病態生理学的過程に関与し、そして宿主防衛において保護的であり得るか、又は自己免疫において有害であり得るかのいずれかである。ＴＮＦ−αは、炎症応答を引き起こし且つ持続する重要なサイトカインの一つであり、そしてＴＮＦ−αの不活性化は、自己免疫疾患に関連する炎症性反応を下方制御するときに重要であることが証明されている。感染時において、ＴＮＦ−αはマクロファージによって多量に分泌され、そしてそれは、接着分子を産生する内皮細胞を刺激することによって、及び走化性のサイトカインであるケモカインを産生することによって、感染部位への好中球及びマクロファージの動員を媒介する。ＴＮＦ−αは、白血球及び他の炎症性細胞の活性化を促進し、そして傷害組織内における血管透過性の増大を促進する。ＴＮＦ−αは主に、マクロファージ、単球、及び樹状細胞で産生されるが、リンパ球様細胞、マスト細胞、内皮細胞、心筋細胞、脂肪組織、線維芽細胞、及び神経組織を含む、多くの種類の他の細胞種によっても産生される。
【０００８】
現時点における抗炎症剤は、ＴＮＦ−αに結合し、それにより、細胞表面上のＴＮＦ−α受容体へそれがシグナル伝達するのを防止することによって、ＴＮＦ−αの作用を阻害する。この種の阻害は、幾つかの深刻な副作用があり、そしてそれらの幾つかは、結核、敗血症、及び真菌感染のような感染であり、並びに癌発生の増大の可能性である。
【０００９】
ＩＬ−１０はまた、ヒトのサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として知られており、及び抗炎症性サイトカインとして、免疫調節において重要な役割を果たす。このサイトカインは、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及びマスト細胞を含む、幾つかの細胞種によって産生される。このサイトカインは、免疫調節及び炎症において多面的効果を有する。それは、炎症性サイトカイン、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞によって分泌されるサイトカイン、ＭＨＣクラスＩＩ Ａg、及び抗原提示細胞における副刺激分子の発現を下方制御する。ＩＬ−１０はまた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と呼ばれるＴ細胞群によって分泌される。これらの細胞は、最初のＴ細胞の活性化を防止せず；むしろそれらは、持続的応答を阻害し、そして慢性及び潜在的損傷応答を防止する。末梢において、幾つかのＴ細胞が誘導されて、抗原及び、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−βのいずれかによってＴｒｅｇとなる。ＩＬ−１０によって誘導されるＴｒｅｇは、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３−であり、そしてＴｒ１細胞と呼ばれる。これらの細胞は、ＩＬ−１０を分泌することによって、免疫応答を抑制する。近年の研究は、Ｔｈ１７細胞の同定において、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｒｅｇよりも、Ｔ細胞エフェクター・レパートリーのより大きな多様化を明らかにした。この下位個体群は、Ｔｈ１系（ｌｉｎｅａｇｅ）に起因すると以前は考えられてきた、幾つかの自己免疫疾患、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。Ｔｈ１７によって分泌されるサイトカインはまた、ＩＬ−１０によって下方制御され、そしてＴＮＦの阻害は、Ｔｈ１７細胞を不活性化することによって乾癬を防止する。ＩＬ−１０の総合的な活性は抗炎症であり、そして幾つかの動物試験において、炎症及び損傷を防止することが示されているが、ＩＬ−１０の投与経路における困難性、及びその生物学的半減期のために、臨床におけるＩＬ−１０治療は、不十分なままである。
【００１０】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、由来のはっきりしない、慢性の、再発性腸疾患と定義される。ＩＢＤは、２つの異なる疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に関する。両方の疾患は、腸における炎症性応答の抑制されていない活性化に起因すると考えられる。この炎症カスケードは、炎症性サイトカインの作用、及びリンパ球サブセットの選択的活性化を通じて持続されると考えられる。ＩＢＤの患者において、腸の内部の裏の潰瘍及び炎症は、腹痛、下痢、及び直腸出血の症状をもたらす。潰瘍性大腸炎は大腸で生じるが、クローン病において、当該疾患は、胃腸管全体、並びに小腸及び大腸で起こり得る。大部分の患者において、ＩＢＤは、数か月〜数年の間続く症状を伴う、慢性疾患である。それは若年成人において最も一般的であるが、全ての年齢において生じ得る。それは世界中で見られるが、先進工業国、例えば米国、英国、及び北欧において最も一般的である。それはユダヤ系の人において特に一般的であり、そして罹患率に関して人種間の違いがある。ＩＢＤの臨床症状は、間欠性直腸出血、けいれん性の腹痛、体重減少及び下痢である。ＩＢＤの診断は、臨床症状、バリウム注腸の使用に基づくが、直接的可視化（Ｓ状結腸鏡検査、又は大腸内視鏡検査）が最も正確な検査である。長期化したＩＢＤは、結腸癌のリスク因子であり、そしてＩＢＤの治療は投薬療法、及び外科療法を伴い得る。
【００１１】
ＵＣを患う幾つかの患者は、直腸においてのみ疾患を有する（直腸炎）。ＵＣを患う他の患者は、直腸及び隣接する左結腸に限定された疾患を有する（直腸Ｓ状結腸炎）。さらに他の患者は、結腸全体のＵＣを有する（汎発性ＩＢＤ）。ＵＣの症状は、より広範囲の疾患（より広い部分の結腸に関連する疾患）に関して、一般的により深刻である。
【００１２】
直腸に限定された疾患（直腸炎）又は左結腸端に限定されたＵＣ（直腸Ｓ状結腸炎）を患う患者の予後は、全結腸ＵＣの患者よりも良い。経口薬又は浣腸剤を使用する短期間の定期的治療で十分であり得る。より広範囲の疾患を患う患者において、炎症を起こした腸からの欠血は、貧血を引き起こし得、そして鉄分補給治療、又は輸血を必要とし得る。まれではあるが、炎症が非常に深刻となる時に、結腸が大きなサイズに急に拡張され得る。この状態は、中毒性巨大結腸症と呼ばれる。中毒性巨大結腸症の患者は、発熱、腹痛及び腹部膨張、脱水症、並びに栄養失調を伴い、極めて症状が重い。患者が薬物療法で速やかに改善されなければ、結腸の破裂を防ぐために外科療法が通常必要となる。
【００１３】
クローン病は、胃腸管の全ての領域で生じ得る。この疾患と共に、炎症及び繊維症に起因する腸閉塞が、多くの患者で起こる。肉芽腫及び瘻の形成はクローン病において頻繁に起こる合併症である。疾患進行の結果は、経静脈栄養、外科手術、及び人工肛門形成術を含む。
【００１４】
ＩＢＤは、薬物療法で治療され得る。ＩＢＤを治療するために最も一般的に使用される薬物療法は、抗炎症性薬剤、例えばサリチル酸塩である。サリチル酸塩調製物は、軽度〜中等度の疾患を治療するときに有効である。それらはまた、当該薬物療法が長期に行われるとき、疾患フレア（ｆｌａｒｅ）の頻度を減少させることができる。サリチル酸塩の例は、スルファサラジン、オルサラジン、及びメサラミンを含む。これらの薬物の全ては、最大限の治療効果のために、高用量にて経口で投与される。これらの薬物は、副作用を伴わないわけではない。アザルフィジンは、高用量で投与されたときに、胃のむかつきを引き起こし得、及び稀な症例ではあるが、軽度の腎炎が幾つかのサリチル酸塩調製物において報告されている。
【００１５】
コルチコステロイドは、ＩＢＤの治療において、サリチル酸塩よりもより強力且つより即効性であるが、潜在的に存在する深刻な副作用が、より深刻な疾患を患う患者に対するコルチコステロイドの使用を制限する。コルチコステロイドの副作用は通常、長期使用において生じる。それらは、骨及び皮膚の薄化、感染、糖尿病、筋肉疲労、顔の丸形化、精神障害、及び稀な症例であるが、股関節の破壊を含む。
【００１６】
サリチル酸塩又はコルチコステロイドに応答しないＩＢＤ患者において、免疫系を抑制する薬剤が使用される。免疫抑制剤の例は、アザチオプリン及び６−メルカプトプリンを含む。この状況において使用される免疫抑制剤は、ＩＢＤの抑制に有用であり、及びコルチコステロイドの段階的な減少又は除去をもたらす。しかし、免疫抑制剤は、患者を免疫不全にし、及び多くの他の疾患に感受性とする。
【００１７】
十分に認識されたＩＢＤ試験モデルは、ＤＳＳ結腸炎マウスモデルであり、Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｖｏｌ． １３（４２），ｐｐ．５５８１−５５９３（２００７）；並びに、Ｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５９（１１），１０７３−１０８３（２００７）に記載されている。
【００１８】
明らかに、ＩＢＤを予防及び治療することができる薬剤の大きな必要性が存在する。
【００１９】
炎症性腸疾患を治療するためのヒト・ディフェンシンの使用
興味深いことに、小腸におけるクローン病は、パネート細胞におけるα−ディフェンシンＨＤ５、及びＨＤ６のレベルの減少に関連し、一方で結腸におけるクローン病は、β−ディフェンシンｈＢＤ２及びｈＢＤ３の産生の減少に関連している（Ｇｅｒｓｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｗｅｈｋａｍｐ ｅｔ ａｌ，２００５）。さらに、クローン病の発症における腸の微生物叢の関与が立証されている（Ｓｗｉｄｓｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて、これらの研究者は、活性なクローン病において、粘膜関連性及び侵襲性細菌の著しい増大が観察され、一方でこれらの細菌は、正常な小腸及び大腸には存在しないことを示した。これらの観察をまとめると、健常人において、腸の上皮バリアにおける適切なレベルのディフェンシンは、内腔細菌の組成及び数を抑制するように作用し、そしてそれらが粘膜に吸着し且つ侵入して、炎症を引き起こすのを防止するように作用するという仮説ができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。他方で、保護レベルの分泌ディフェンシンを産生する能力が不十分なヒトにおいて、抗微生物防御と内腔細菌との間のバランスがシフトされる。結果的にこれは、炎症状態を誘導する下部腸組織への細菌の侵襲を許容し、そしてクローン病へと進展し得る。
【００２０】
この過程に基づいて、国際公開第２００７／０８１４８６号は、炎症性腸疾患の治療における、幾つかのヒト・ディフェンシンの使用を開示している。発明者は、腸管腔における適切な場所でのそれらの放出を可能とする製剤で、クローン病患者に経口投与されたディフェンシンが、侵襲性細菌の数を減少させ、正常な上皮バリアへと回復させ、したがって炎症性疾患の重症度を減少させることを示唆した。
【発明の概要】
【００２１】
国際公開第２００７／０８１４８６号によれば、ディフェンシンの機能は、内腔における細菌を直接標的とし、且つ死滅させ、それらが上皮組織に侵入することを防止することである。すなわち、ディフェンシンの機能は、純粋に抗感染性化合物としてである。国際公開第２００７／０８１４８６号との関連で、非経口投与経路を用いるとｈｂＤ２が内腔細菌と遭遇しないため、非経口で投与されたｈｂＤ２がマウスにおけるＤＤＳ誘導性結腸炎の深刻度を減少させることができるということは、驚くべきことである。さらに我々は、ｈＢＤ２の効果が、ＰＢＭＣによって分泌される炎症性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−２３のレベルを減少させることであることを本明細書において示す。これらのサイトカインは、炎症性腸疾患を含む、多くの炎症性疾患において重要な役割を果たすことが知られている。抗微生物機能の他に、ディフェンシンは、広い範囲の免疫調節機能を有することが１０年以上知られている。しかし、ヒト・ディフェンシンの免疫調節特性に関する大多数の研究は、それらが第一に炎症性又は炎症促進性機能を有すると記載している（例えば、Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｏｗｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｌｅｈｒｅｒ，２００４を参照）。
【００２２】
したがって、非経口で投与されたｈＢＤ２が、ＩＢＤ患者の疾患の深刻度を減少させることができるはずであることは全く予想外のことである。第一に、非経口で投与されたとき、ｈＢＤ２は、腸内腔に到達して、当該疾患の誘導に関与する有害な細菌と接触することができない。さらに、大多数の公知文献に基づいて、血流に入ったディフェンシンは、本明細書において示された研究において観察されるような抗炎症性応答よりも、炎症性を誘導するであろうと当業者は予想し得る。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
ディフェンシン：本明細書における用語「ディフェンシン」は、抗微生物性ペプチドのディフェンシン類に属するものとして当業者によって認識されるポリペプチドのことである。ポリペプチドが本発明のディフェンシンであるか否か決定するために、無料で利用可能なＨＭＭＥＲソフトウェア・パッケージを使用することによって、アミノ酸配列が、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデル・プロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較され得る。
【００２４】
ＰＦＡＭディフェンシン・ファミリーは、例えばディフェンシン１、又は「哺乳動物のディフェンシン」（受入番号ＰＦ００３２３）、及びディフェンシン・２、又はディフェンシン・ベータ、又は「ベータ・ディフェンシン」（受入番号ＰＦ００７１１）を含む。
【００２５】
本発明のディフェンシンは、ベータ・ディフェンシン類に属する。ベータ・ディフェンシン由来のディフェンシンは、共通の構造的特徴、例えばシステインのパターンを有する。
【００２６】
本発明のディフェンシンの例は、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（ｈＢＤ２；配列番号４を参照）、及びマウス・ベータディフェンシン３（ｍＢＤ３；配列番号６を参照）を含む。
【００２７】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列の関連性を、パラメーター「同一性」で記載する。
【００２８】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００２９】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，同上；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，同上）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００３０】
単離されたポリペプチド：本明細書において使用される用語「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」は、源から単離される、バリアント又はポリペプチドのことである。一の態様において、当該バリアント又はポリペプチドは、当該ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される通り、少なくとも１％純粋、好ましくは少なくとも５％純粋、より好ましくは少なくとも１０％純粋、より好ましくは少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００３１】
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然又は組み換えに関連する他のポリペプチド材料を、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてより最も好ましくは最大０．５重量％含むポリペプチド調製物を示す。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、当該調製物中に存在する総ポリペプチド材料が少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で存在する。これは例えば、周知の組み換え法により、又は古典的な精製法により、当該ポリペプチドを精製することによって達成され得る。
【００３２】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン
本発明は、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎、及び／又はクローン病の治療における、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシンの医薬用途に関する。当該治療は、処置された組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少に好ましくは関連する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
一の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び／又は配列番号６のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４のバリアント（配列番号５）、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン３（配列番号６）から成る。さらにより好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、及び／又はヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）から成る。
【００３４】
別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）から成る。
【００３５】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、ヒト・ベータ・ディフェンシン４、及びマウス・ベータ・ディフェンシン３、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、及び機能的に等価なそのバリアントから成る。
【００３６】
本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。
【００３７】
本発明に関して、哺乳動物の（例えばヒトの）・ベータ・ディフェンシンの「機能的に等価なバリアント」は、炎症性腸疾患において、親の哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同じ効果を示す、修飾された哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンである。好ましくは、それはまた、ＴＮＦ−アルファ活性において、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同一の効果を示す。
【００３８】
本発明に従って、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンアミノ酸配列と比較して、１〜５個のアミノ酸修飾、好ましくは１〜４個のアミノ酸修飾、より好ましくは１〜３個のアミノ酸修飾、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸修飾、及び特に１個のアミノ酸修飾を含み得る。
【００３９】
本明細書において、用語「修飾」は、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの任意の化学修飾を意味する。１又は２以上の修飾は、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入、並びに１又は２以上のアミノ酸側鎖の交換；又は当該アミノ酸配列において類似の特性を有する非天然のアミノ酸の使用であり得る。特に、１又は２以上の修飾は、アミド化、例えばＣ末端のアミド化であり得る。
【００４０】
好ましくは、アミノ酸の修飾は小さい性質のものであり、そしてそれは、ポリペプチドのフォールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入；単一の欠失；小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；又は正味電荷を変更することによって精製を容易にする小規模な伸長、或いは別の機能のもの、例えばポリ−ヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインである。
【００４１】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群の内で存在する。特異的な活性を通常変更しないアミノ酸置換は、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００４２】
２０個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換され得る。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾され、及び／又は１又は２以上の側鎖において標準的アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００４３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンにおける必須のアミノ酸は、当技術分野で既知の手順、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン走査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）に従って同定され得る。後者の技術において、単一のアラニンの変異は分子内における全ての残基に導入され、そして生じた変異分子は、生物学的活性（すなわち、炎症性腸疾患に対する活性及び／又はＴＮＦ−アルファ活性の抑制）を試験され、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。必須のアミノ酸の同一性は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測され得る。
【００４４】
単一の又は複数のアミノ酸の置換が、既知の方法の変異誘発、組み換え及び／又はシャッフリングを用いてなされ得、及び試験され得、その後、関連性スクリーニング手順、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に開示されたものが行われ得る。使用され得る他の方法は、エラー・プローンＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（ｒｅｇｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）を含む。
【００４５】
本発明のポリペプチドのＮ末端の伸長は好適には、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、特に３〜１５個のアミノ酸から成り得る。一の実施形態において、Ｎ末端ペプチドの伸長は、Ａｒｇ（Ｒ）を含まない。別の実施形態において、Ｎ末端の伸長は、以下にさらに定義されるｋｅｘ２又はｋｅｘ２様切断部位を含む。好ましい実施形態において、Ｎ末端伸長は、少なくとも２つのＧｌｕ（Ｅ）及び／又はＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基を含むペプチドであって、例えばＮ末端伸長は以下の配列の一つを含む：ＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ及びＤＤ。
【００４６】
方法、及び用途
ヒト・ベータ・ディフェンシン２は、１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された大腸炎モデルマウスにおいて、疾患パラメーターの深刻度を著しく減少させ；したがって、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎及びクローン病の治療のための医薬として、強力な活性を示すことが判明した。
【００４７】
本発明はしたがって、炎症性腸疾患の治療方法を提供し、当該治療は、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２を、医薬組成物の形態で、当該治療を必要とする対象へ非経口投与することを含む。非経口投与のための医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２がまた、提供され、及び、炎症性腸疾患の治療のための、非経口投与のための医薬、例えば医薬組成物の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン２の使用がまた、提供される。治療は、存在する疾患又は障害の治療、及び疾患又は障害の予防（防止）を含む。
【００４８】
実施形態において、当該治療は、治療がなされた組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少をもたらし、好ましくはＴＮＦ−アルファ活性の減少、及びＩＬ−１０活性の増大をもたらす。
【００４９】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、経腸（例えば口腔、経口、経鼻、直腸）、非経口（例えば静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内）、又は局所（例えば、皮膚上、鼻腔内、若しくは気管内）を含む、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物で、治療において使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、持続放出インプラントの一部として投与され得る。
【００５０】
さらに他の実施形態において、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する好適な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得、その後に再水和される。
【００５１】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを含む医薬組成物は、従来法に従って、例えば混合、整粒、被覆、溶解、又は凍結乾燥工程によって製剤化され得る。
【００５２】
好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン、並びに医薬として許容される担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００５３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンは好ましくは、炎症性腸疾患における治療のために有効である量で、好ましくは患者において許容される毒性で、医薬組成物において使用される。かかる治療のために好適な投与量は当然、例えば、使用される本発明の化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式、並びに処置される健康状態の性質及び深刻度によって変化し得る。しかし一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足な結果のために、望ましい一日用量は、好ましくは約０．００１ｇ〜約１．５ｇ、より好ましくは約０．０１ｇ〜１．０ｇ；又は約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、１日に１回、２回、３回、又は４回の分割量で投与される。好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されているものと同様の投与様式で、同様の投与量で投与され得る。
【００５４】
特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを、投与経路に依存して、単位剤形につき、約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上の量で含み得、そしてそれは、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇで、及びより好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇで含み得る。しかし、特定の実施形態において、上記のものより低い又は高い投与量が好ましいものであり得る。好適な濃度及び投与量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００５５】
医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体及び／又は希釈剤は、生理食塩水及び滅菌水を含み、並びに場合により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含み得る。当該組成物はまた、丸剤、カプセル、顆粒、タブレット（被覆された、又は被覆されていない）、（注射可能）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散体（例えばアンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入製剤、粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態）として、製剤化され得る。当該製剤は、（哺乳動物のベータ・ディフェンシン、及び他の追加の活性成分に加えて、）担体、賦形剤、砕解剤、フロー・コンディショナー（ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）、糖類及び甘味剤、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、滑剤、並びに／又は当技術分野で既知の他の医薬用賦形剤を含み得る。当業者はさらに、好適な方法で、及び慣例に従って、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に記載された方法で、哺乳動物のベータ・ディフェンシンをさらに製剤化し得る。
【００５６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンは、単剤で、又は１、２若しくは３以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質を用いた併用療法で、及び／又は１若しくは２以上の医薬として許容される賦形剤と共に使用され得る。
【００５７】
イン・ビトロにおける合成
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を用いて、イン・ビトロにおける合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．などの自動合成機がある。合成機を用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ体）、例えばＤ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、側鎖が異なる長さ又は官能基を有するジアステレオマーなどと置換され得る。特定の配列及び製造方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。
【００５８】
結合のために好都合な官能基、例えば、アミドのための、又は置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などを含む種々のペプチド又はタンパク質に、化学結合が提供され得る。
【００５９】
必要に応じて、種々の基が、合成中又は発現中にペプチドへと導入され得、そしてそれらは、他の分子又は表面への結合を可能とする。したがって、システインは、チオエーテルを製造するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体と結合するために使用され得、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基はアミドなどを形成するために使用され得る。
【００６０】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン、又はその機能的等価体はまた、組み換え合成の従来法に従って、単離され且つ精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、そして当該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティー・クロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製され得る。
【００６１】
本発明は、本発明の範囲を限定するものであるとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６２】
実施例
ｈＢＤ２の免疫調節効果に関する試験を通じて、ｈＢＤ２が、抗炎症性における大きな潜在力を有することが予想外にも観察された。
【００６３】
本明細書において、我々は、ｈＢＤ２が、マウスへデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＤＳ）を経口投与することによって誘導された炎症性腸疾患（結腸炎）の治療に大きな効果があることを示した。我々はまた、ｈＢＤ２が、ＴＮＦ−アルファに対する下方制御潜在力を有することを示した。
【００６４】
実施例１
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の産生
ｈＢＤ２を組み換えで産生した。ｈＢＤ２をコードする合成ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２．０）を、ｐＥＴ−３２（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。生じたプラスミドは、Ｎ末端チオレドキシン部位、その後にｈｉｓ−タグ、エンテロキナーゼ切断部位、及び最後にｈＢＤ２ペプチドを含む、翻訳用融合ペプチドをコードした。発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１へと形質転換した。
【００６５】
この株の一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ−グリセロールで１００倍に希釈し、そして３７℃にて約８のＯＤ６００となるように増殖させ、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導し、その後細胞を遠心分離で採取した。ｈｉｓ−タグされたｔｒｘ−ｈＢＤ２融合ペプチドを、標準的手順を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）上で精製した。ｈｉｓ−タグ精製された融合ペプチドをその後、エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＣａＣｌ2）中にて一晩透析し、そしてエンテロキナーゼで切断して成熟ｈＢＤ２を放出した。ｈＢＤ２ペプチドを、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ ｍａｔｒｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｈＢＤ２の正確な分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。
【００６６】
ｍＢＤ３（実施例７参照）の産生を、同一の手順を用いて行った。
【００６７】
ｈＢＤ２の適切なフォールディング及びジスルフィド架橋形態をその後、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分光法と連動したトリプシン消化を用いて確認した。
【００６８】
エンドトキシンを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって低ｐＨにて除去し、そしてエンドトキシンの含有量をＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＫＴＡ２）によって決定し、そして当該レベルは、当該アッセイの検出限界（０．０５ＥＵ／ｍｇ）未満であることが分かった。エンドトキシンアッセイの検出限界未満のレベルが、ＰＢＭＣを刺激することができないことを確定するために、非常に強力なリポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低レベルのこのＬＰＳ（０．０６ｎｇ／ｍｌ）は、検出可能なサイトカイン産生へとＰＢＭＣを刺激することができた。
【００６９】
実施例２
１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された結腸炎マウスモデル
以下の試験の目的は、マウスへデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を投与することによって誘導された、炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシン２の抗炎症活性を決定することであった。
【００７０】
Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．「Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１３（４２），ｐｐ．５５８１−５５９３（２００７）；及び、Ｗｉｒｔｚ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｔｈ「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．５９（１１），１０７３−１０８３（２００７）に記載されている通り、ＤＳＳ結腸炎マウスモデルは、炎症性腸疾患の試験のための、十分に認識されているモデルである。
【００７１】
材料
試験品目
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）；上の実施例１を参照
メチルプレドニゾロン２１−ヘミサクシネート（「プレドニゾロン」）
ＰＢＳ緩衝液（ＧＩＢＣＯ）
【００７２】
実験動物
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ ｌｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）を試験で使用した。これが、２％ＤＤＳの飲料水溶液を１０日間投与したときに、結腸の著しい炎症を引き起こすことが実証されている種及び性別であるためである。
【００７３】
識別
尾に書かれた数字及び文字コードで動物を識別した。さらに、動物の数及び性別、試験品目又は名前、投与量レベル、投与経路、処置期間、グルーブ番号、試験コード、及び試験監督者の名前を表示した、色コードされたカードによって各々のケージを識別した。
【００７４】
体重
試験開始日における動物の平均体重は２２．４±０．１６ｇであった。
【００７５】
順応（隔離所）
試験開始前最低７日間、主要な試験と同じ条件下に置いた。
【００７６】
収容
到着時、動物を分けて、ステンレス製の蓋を有するポリカーボネート製のケージ（Ｅ−Ｔｙｐｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，２５５×４０５×１９７ｍｍ）にランダムに収容した。
【００７７】
動物は、性別に従って、１ケージあたり５匹の動物のグループで収容され、動物の部屋内は、調節された温度（２２±２℃）、照明（１２／１２時間の光／暗闇）、空気圧、空気の入れ替え数、及び相対湿度（３０〜７０％）であった。
【００７８】
全てのケージは、敷物として床上におがくず（Ｌｉｇｎｏｃｅｌ３−４；Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｓｐａｉｎ）を有した。
【００７９】
食餌及び水
全てのマウスは、乾燥したペレット型の標準的齧歯動物用の食餌（Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ ２０１４；Ｈａｒｌａｎ ｌｎｔｅｒｆａｕｎａ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｓｐａｉｎ）を自由に食べることができた。
【００８０】
水はボトル中で自由に提供された。動物の部屋へのタップ水供給は、その組成を確認するために、及び可能のある汚染物質（化学物質及び微生物性のもの）を検出するために、定期的に分析された。
【００８１】
装置及び材料
装置
・動物はかり、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｏｄ．ＢＰ２１００
・外科的解剖装置
・Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｃ遠心分離機
・Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ顕微鏡
・Ｈｏｏｋ＆Ｔｕｃｋｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ｒｏｔａｍｉｘｅｒ
・ＩＫＡ ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘホモジナイザー
・Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｏｄ．ＢＰ２２１Ｓ化学天秤
・ＥＬＩＳＡマイクロプレート・リーダーＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸ
材料及び試薬：
・滅菌使い捨てシリンジ（１ｍｌ）
・滅菌Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ２５Ｇ輸液セット
・麻酔剤（ケタミン／キシラジン）
・局所麻酔用クリーム（ＥＭＬＡ，Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）
・デキストラン硫酸ナトリウム３０．０００〜５０．０００Ｄａ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）
・中性緩衝ホルマリン（ＶＷＲ）
・ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）
・プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）
・マウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
【００８２】
実験手順
試験設計
動物を５つの実験グループへと分けた。各々のグループは、１０匹のオスから成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）、ｉ．ｖ．で処理
グループＢ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＣ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＤ：ｈＢＤ２（１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理
グループＥ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
【００８３】
全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って、）最大で５匹のマウスを各々のケージに収容した。試験品目の投与に先立ち、全ての動物について、研究所に到着時に体重を測定した。
【００８４】
試験物質の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、滅菌針（２５Ｇ）を用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量５ｍｌ／ｋｇ体重でゆっくりとボーラス投与した。動物は、対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）の一回投与量を、毎日（２４時間毎に）、１０日間連続して受けた。
【００８５】
プレドニゾロンは、ｈＢＤ２と同一の投与計画で、１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、５ｍｌ／ｋｇ体重の投与体積で経口投与された。
【００８６】
実験手順
結腸炎の誘導
ＤＤＳ２％含有飲料水を７日間補給することによって、結腸炎をマウスで誘導した。
【００８７】
１日目に全てのマウスの体重を測定し、実験グループに従って印をつけた。各々のケージの飲料容器をＤＤＳ溶液で満たし、全ての容器の蓋が適切に取り付けられていること、及び過度に詰め込まれていないことを確認した。
【００８８】
３日目に容器中に残存する溶液を空にし、そして再度新鮮なＤＳＳ溶液で満たした。この手順を５日目に再び繰り返した。
【００８９】
８日目に、残存する溶液を捨て、そしてオートクレーブされた水と置換した。２日経過後の１０日目に、動物を屠殺した。
【００９０】
臨床的評価（疾患活動性インデックス）
以下のパラメーターに従って、０〜４の範囲で、有効な臨床疾患活性インデックス（ＤＡＩ）の計算を行い、ＤＳＳ処理された動物の毎日の臨床的評価を行った：便の硬さ、直腸出血の存在、又は不在、及び体重減少：
【００９１】
【表１】
【００９２】
体重減少を、元の体重（１日目）と各々の実験日（２日目〜１０日目）における体重との間のパーセント差としてとして計算した。
【００９３】
下痢の外観は、肛門に着いた粘液/糞便物質として定義された。直腸出血は、目に見える血／粘液、又は直腸全体の出血を含む、下痢として定義された。各々の日における、ＤＡＩの最大スコアは１２である。
【００９４】
血液採取
試験期間中における２つの離れた時期：１日目と５日目において、２つの血液試料を各々の動物から得た。血液試料を各々の時期において、試験品目の投与後２時間で、伏在静脈の穿刺によってＭｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ−３００ミクロチューブに採った。この血液採取法は、麻酔剤又は鎮痛剤を必要とせず、そして動物に最小限のストレスを与える（Ｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらに、試験の最終日において、試験品目投与後２時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。
【００９５】
血液試料を凝固し、その後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして血清を−８０℃で貯蔵のために凍結した。
【００９６】
安楽死及び結腸試料の回収
１０日目において、コントロール・ビヒクル、ｈＢＤ２又はプレドニゾロンの最後の投与後２時間で、動物を過剰量の麻酔剤で殺した。それらの結腸を取り除き、そして盲腸の除去後、それらの長さ及び重量を測定した。
【００９７】
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、そして以下のスコアリング・システムに従う、その後の組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）のために、中性緩衝ホルマリンで保存した：
【００９８】
【表２】
【００９９】
結腸組織試料におけるＴＮＦ−アルファ濃度の決定
結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）含有ＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、その後のＴＮＦ−α濃度の決定のために、−２０℃で貯蔵した。
【０１００】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表１．１日目〜１０日目における疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの経過。所定の日におけるコントロール（ビヒクル）グループからの有意差を、*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
組織学評価
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を行い、そして上記のスコアリング・システムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。
【０１０３】
結腸組織試料におけるＴＮＦ−α濃度の決定
結腸の追加の試料を各々の動物から得、そして１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍｌ／２０ｇ組織）含有ＰＢＳ（１００ｍｇ組織／ｍｌ ＰＢＳ）中でホモジナイズした。ホモジネートをその後、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上清を、特異的酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、その後のＴＮＦ−α濃度の決定のために、−２０℃で貯蔵した。
【０１０４】
表３．組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のＴＮＦ−α濃度。コントロール（ビヒクル）グループからの組織学スコアにおける差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】
統計学的分析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカル・ワリス検定、及び多重比較を可能とするためのＤｕｎ事後検定によって評価した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。
【０１０７】
結論
試験された最低投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）のｈＢＤ２は、ＤＤＳ投与によって誘導された疾患活動性インデックスにおける増加を、７日目（１．４４±０．３８試験品目ｖｓ．４．１±０．６９ビヒクル；ｐ＜０．０１）、８日目（２．１１±０．２試験品目ｖｓ．５．９±１．２６ビヒクル；ｐ＜０．０５）、９日目（３．８９±０．３５試験品目ｖｓ．８．９±１．０２ビヒクル；ｐ＜０．０１）及び１０日目（６．４４±０．８５試験品目ｖｓ．１０．９±０．６２試験品目；ｐ＜０．０５）において、有意に減少させることを実証した。
【０１０８】
ｈＢＤ２の中等度の投与量（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で連続１０日間処置することにより、疾患活動性インデックス・スコアが明らかに減少したが、これは１０日目においてのみ有意であった（６．４４±１．０８試験品目ｖｓ．１０．９±０．６２ビヒクル；ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
１０日目における疾患活動性インデックスで得られた結果と同様に、各々の動物の近位結腸の組織学分析は、ｈＢＤ２の低用量での処理によって、組織学的損傷スコアが非常に有意に減少することを明らかとした（２．２２±０．４３試験品目ｖｓ．４．２±０．２５ビヒクル；ｐ＜０．０１）。さらに、組織学的損傷の有意な減少はまた、中等度用量のｈＢＤ２、高用量のｈＢＤ２、及びプレドニゾロンを用いた場合に観察された（各々、２．８９±０．３５；２．８９±０．３９及び２．８±０．５；ｐ＜０．０５）。対照的に、遠位結腸において、組織学的損傷の明らかな減少が低用量のｈＢＤ２、中等度用量のｈＢＤ２、及びプレドニゾロンで処理された動物で観察されたが、これは統計学的に有意ではなかった。高用量のｈＢＤ２で処理された動物において、減少は観察されなかった。同様に、低用量、及び中等度用量のｈＢＤ２を用いた処理により、結腸のＴＮＦ−アルファレベルが明らかに減少したが、この明らかな減少は統計的に有意ではなかった。
【０１１０】
本試験で得られた結果は、１０日間の処理期間後、マウスにおいて誘導されたＤＤＳ結腸炎モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性を実証している。しかし、この抗炎症活性は、より低用量のｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ／日ｉ．ｖ．）が使用されたときにより顕著であり、そして本試験で使用された最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ／日ｉ．ｖ．）まで、投与量を増大するにつれて徐々に失われるように思われる。さらに、ｈＢＤ２の最低用量の抗炎症効果は、１ｍｇ／ｋｇ／日ｐ．ｏ．でのプレドニゾロンにおける効果と同等か、又はそれよりもさらに大きい（例えば組織学スコア）。
【０１１１】
実施例３
１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導された結腸炎マウスモデル
基本的に実施例２に記載された通りに、実施例３を行った。違いを以下に示す。
【０１１２】
体重
試験開始日における動物の平均体重は１９．７４±０．０９ｇ（平均±ＳＥＭ）であった。
【０１１３】
試験設計
動物を５つの実験グループへと分けた。各々のグループは、１０匹のオスから成った：
グループＡ：コントロール・ビヒクル（ＰＢＳ）、ｉ．ｖ．で処理
グループＢ：ｈＢＤ２（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＣ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＤ：ｈＢＤ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＥ：ｈＢＤ２（０．００１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−１日１回
グループＦ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．＋ｓ．ｃ．）で処理−１日２回
グループＧ：ｈＢＤ２（０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）で処理−２日毎
グループＨ：メチルプレドニゾロン（１ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
グループＪ：メチルプレドニゾロン（１０ｍｇ／ｋｇ ｐ．ｏ．）で処理
【０１１４】
全実験グループへの動物の割り当てをランダムに行った。（指令８６／６０９／ＥＥＣに従って、）最大で５匹のマウスを各々のケージに収容した。試験化合物及びレファレンス化合物の投与に先立ち、全ての動物は、研究所に到着時に体重を測定された。
【０１１５】
試験品目の投与
コントロール・ビヒクル及びｈＢＤ２を、滅菌針（２５Ｇ）を用いて、尾の静脈を通じて静脈内に、投与量５ｍｌ／ｋｇ体重でゆっくりと（１５秒かけて）ボーラス投与した。
【０１１６】
グループＡ〜Ｅの動物は、対応する試験品目（ｈＢＤ２、プレドニゾロン、又はコントロール・ビヒクル）の一回投与量を、毎日（２４時間毎に）、１０日間連続して受けた。
【０１１７】
グループＦの動物は、対応する試験品目の一回投与量をｉ．ｖ．で、及び別の投与量を（ｉ．ｖ．投与後１２時間で）ｓ．ｃ．で、１０日間連続して受けた。
【０１１８】
グループＧの動物は、対応する試験品目の一回投与量を２日毎に、１０日間連続して受けた。
【０１１９】
メチルプレドニゾロンは、１ｍｇ／ｋｇ（グループＨ）及び１０ｍｇ／ｋｇ（グループＪ）の投与量で、５ｍｌ／ｋｇ体重の投与体積で、１日１回、１０日間連続して経口投与された。
【０１２０】
血液採取
試験の最終日において、試験品目投与後２時間で、全ての動物から最終的な血液試料を、腹部大静脈から得た。
【０１２１】
血液試料を凝固し、その後３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして得られた血清をその後の分析のために−８０℃で凍結した。
【０１２２】
結果
疾患活動性インデックス・スコア
表４．１日目〜１０日目における疾患活動性インデックス（ＤＡＩ）スコアの経過。所定の日におけるコントロール（ビヒクル）グループからの有意差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。６日目〜１０日目を次のページに示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
組織学評価
結腸の２つの切片（近位部及び遠位部）を各々の動物から取り除き、組織学分析（ヘマトキシリン及びエオシン染色）を行い、そして上記のスコアリング・システムに従って盲検化観察者によってスコアリングした。
【０１２６】
表５．組織学スコア、結腸の重量及び長さ、並びに結腸のＴＮＦ−α濃度。コントロール（ビヒクル）グループの値からの組織学スコアにおける差を*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１（非母数データのためのクラスカル・ワリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ Ｔｅｓｔ））として示す。
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
統計学的分析
結果の統計的有意性を、統計プログラムＧｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｓｔａｔ３を用いて評価した。疾患活動性インデックスと組織学スコアとの間の差を、対応のないデータのためのクラスカル・ワリス検定、及び多重比較のためのＤｕｎ事後検定によって評価した。ｐ＜０．０５の値を有意とした。上の表において、対応するコントロール（ビヒクル）グループに対する有意差を*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１として表示する。
【０１２９】
結果
本試験の目的は、マウスへのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＤＳ、２％）経口投与によって誘導された炎症性腸疾患（結腸炎）の急性（１０日間）モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性を決定することであった。
【０１３０】
本試験において得られた結果は、１０日間の処置期間後、マウスにおいて誘導されたＤＤＳ結腸炎モデルにおける、ｈＢＤ２の抗炎症活性をさらに実証している。
【０１３１】
この抗炎症活性は、１日２回（１２時間毎）の、静脈内投与及び皮下投与の両方で、０．１ｍｇ／ｋｇの投与量での、ｈＢＤ２の投与後においてより顕著であり得る。さらに、このｈＢＤ２の投与量で観察された抗炎症効果は、プレドニゾロンを１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与したときの効果と同等又はさらに大きかった（疾患活動性インデックス及び組織学的スコアの両方）。
【０１３２】
実施例４
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の抗炎症活性
ヒトＰＢＭＣ培養中において、ｈＢＤ２を用いた処置が、ＬＰＳ、ＬＴＡ又はペプチドグリカン刺激された培養のサイトカイン・プロファイルにおいて大きな影響を有することが観察された。ｈＢＤ２が炎症性サイトカイン、並びに、ケモカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＩＬ−８を誘導することができることは以前に観察されている（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｂｏｎｉｏｔｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６）。
【０１３３】
本明細書において我々は、ｈＢＤ２が２つの炎症性サイトカイン、ＴＮＦ及びＩＬ−１βに対する下方制御潜在力を有することを、そしてｈＢＤ２がまた、リポポリ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた炎症性刺激時において、ＩＬ−１０を誘導することを示した。ＩＬ−１０は、潜在的な抗炎症性サイトカインであり、したがって、ｈＢＤ２のもたらす効果は抗炎症性である。これは、ヒトＰＢＭＣ、単球細胞株、及び樹状細胞株（ｄｅｎｄｒｉｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）において観察された。
【０１３４】
ｈＢＤ２は、実施例１に記載された通りに調製された。
【０１３５】
ＰＢＭＣの単離及び刺激
（デンマークの関連倫理委員会から認定されている）健常者から末梢血を採取した。ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内のＦｉｃｏｌｌ密度遠心にかけた。血漿を個々のドナーの上清から回収し、そしてそれが培養培地（自家培養培地）中２％で使用されるまで、氷上で保存した。単離されたＰＢＭＣを自家培養培地中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり２５５．０００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、それ単体で、或いは、０．６ｎｇ／ｍｌ若しくは２０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）のＬＰＳ、１．２５μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来，Ｓｉｇｍａ Ｌ３２６５）、又は４０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来，Ｓｉｇｍａ ７７１４０）と共に用いて、同一ドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。刺激のために使用される濃度は、実験初期に３人の異なるドナーにおいて最適化され、ＬＰＳに関しては、２つの異なる濃度が使用されて、調節可能なサイトカインレベル上にあることを確実なものとした。幾つかの実験において、デキサメサゾン及びインドメタシンを、単剤で、及び炎症性サイトカインの下方制御のコントロールとしてのＬＰＳ又はＬＴＡを共に用いてＰＢＭＣを処置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。全ての実験において生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定し、そして幾つかの場合においてはＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造業者の使用説明に従って測定し、そして幾つかの実験において、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって細胞数をカウントすることによって判断した。
【０１３６】
ＭＵＴＺ−３の培養及び刺激
ヒト骨髄性白血病由来の細胞株ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ａ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｍ４５２６）中で維持し、２０％［ｖ／ｖ］ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ６１７８）、及び４０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１５−ＧＭ−０５０）を追加した。これらの前駆細胞は以下に示す単球細胞株中に存在し、そしてこれらの単球を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、単剤で、又はＬＰＳ若しくはＬＴＡと共に用いて刺激した。
【０１３７】
樹状細胞の分化
樹状細胞株を生じさせるために、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈｌＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ヒト骨髄性白血病細胞株ＭＵＴＺ−３（１×１０5細胞／ｍｌ）を、７日間かけて分化させて未熟ＤＣとした。２〜３日毎に培地を交換した。分化された細胞株を、ＬＰＳ又はＬＴＡのいずれかを用いて、ｈＢＤ２の存在下で及び不在下でさらに刺激して、樹状細胞におけるｈＢＤ２の効果を調べた。
【０１３８】
サイトカインの測定
上清中におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーター上で、ヒト炎症サイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、製造業者の使用説明（ＢＤ）に従って測定した。以下のサイトカインを測定した：ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６。幾つかの実験において、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）によって、製造業者の使用説明に従って、サイトカインを測定した。
【０１３９】
データ分析
代表的結果が示されるように、全ての実験を少なくとも２回行った。得られたデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現した。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメサゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって統計的有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で有意であると見なされた。
【０１４０】
結果
ＬＰＳ及びＬＴＡで、処理された及び無処理のヒトＰＢＭＣで、ｈＢＤ２の効果を試験した（表６、７及び８）。ｈＢＤ２を用いた処理により、全３つの試験された濃度に関して、刺激された培養においてＴＮＦの有意な下方制御がなされ（表６）、当該下方制御は、０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに関して、及びＬＴＡに関して用量依存的であった。ＩＬ−１βに関して、主に最高用量で下方制御が観察された（表７）。興味深いことに、ＩＬ−１０は有意に且つ用量依存的に上方制御された（表８）。炎症性サイトカインの下方制御、及び抗炎症性サイトカインの誘導は、ｈＢＤ２の非常に強い抗炎症潜在力を示す。ｈＢＤ２の抗炎症効果が細胞毒性効果によるものであることを排除するために、生存率を２つの異なるアッセイで測定した。ｈＢＤ２は、細胞において細胞毒性を有さず、観察される効果は、細胞増殖をもたらす、ＬＰＳ又はＬＴＡの刺激による刺激効果であることが、表９及び１０において見られる。したがって、ｈＢＤ２は、これらの細胞において細胞毒性効果を有さない。
【０１４１】
表１１、１２及び１３において、別のドナーからの上清は、フローサイトメトリーによるサイトメトリック・ビーズ・アッセイの代わりに、ＥＬＩＳＡによって、サイトカインに関して分析され、同一のことが観察されたが、アッセイの感度がより低く、そして検出限界が非常により高いため、当該効果が有意なものではなかった。
【０１４２】
さらに別のＴｏｌｌ様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカンで刺激されたＰＢＭＣにおけるｈＢＤ２の効果が調べられた（表１４及び１５）。同一のことが観察された：ＴＮＦは用量依存的に下方制御され、そしてＩＬ−１０は用量依存的に誘導された。
【０１４３】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンを、アッセイにおいて試験した。当該化合物が毒性ではなく、且つ培地への溶解性のために達成可能な濃度であるように、濃度は選択された。ＬＴＡを用いた刺激後にのみ、インドメタシンはＴＮＦを阻害したが（表１６）、デキサメタゾンは、ＴＮＦ産生を効果的に下方制御し、同一のことがＩＬ−１βに関して観察された（表１８）。インドメタシンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害剤であり、軽度〜中等度の痛みを治療するために使用される非ステロイド系抗炎症剤であり、関節炎症状を緩和するために有用であり、並びにデキサメタゾンは炎症性疾患の治療において第一に使用される合成グルココルチコイドであり、そしてそれは、非常に低用量で、炎症性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有し（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９８）、そしてそれを我々は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βに関しても観察した。ｈＢＤ２は、２つの抗炎症性化合物と同じくらい、またはそれらよりも効果的であった。
【０１４４】
表１９及び２０において、単球細胞株、及び樹状細胞においてＴＮＦを下方制御する、ｈＢＤ２の効果が示され、同じことがＰＢＭＣに関して観察された。ＩＬ−１０はまた、ｈＢＤ２且つＬＰＳ、又はｈＢＤ２且つＬＴＡで刺激された樹状細胞に関して誘導された（結果は示さず）。
【０１４５】
ＬＰＳ又はＬＴＡへのｈＢＤ２の結合がＴＮＦ及びＩＬ−１βの下方制御を引き起こすことを排除するために、合成リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２−ＴＬＲ１リガンド），ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｔｌｒｔ−ｐｍｓ）を用いたＰＭＢＣの刺激に対するｈＢＤ２の効果を試験した。このリガンドを用いた刺激後においても、ｈＢＤ２は下方制御することができ、このことは、ＬＰＳ又はＬＴＡの中和が、観察される効果に関与しないことを示している（結果は示さず）。さらに、ＴＮＦ−α及びＩＬ−αを含有するサイトカイン・カクテル、並びにｈＢＤ２を用いた樹状細胞の刺激は、サイトカイン・カクテル単体を用いた刺激と比較して、ＩＬ−１β、及びＩＬ−８、及びＩＬ−６の下方制御効果を有した。ＴＮＦ−αを用いた刺激のために、ＴＮＦに対する効果を明白に分析することができなかった（結果を示さず）。
【０１４６】
表６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロール（太字）と比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１４７】
【表８】
【０１４８】
表７．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１４９】
【表９】
【０１５０】
表８．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，*ｐ＜０．５、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１５１】
【表１０】
【０１５２】
表９．ＭＴＳアッセイによって測定された、刺激の２４時間後におけるＰＢＭＣ生存率。横列中、異なる下付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１５３】
【表１１】
【０１５４】
表１０．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって測定されたＰＢＭＣ生存率、５人の異なるドナーからの、５つの実験からの、１つの代表的実験。横列中異なる上付き文字を有する値、及び縦列中異なる上付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１５５】
【表１２】
【０１５６】
表１１．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−アルファ分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１ｎｇ／ｍｌ、*ｐ＜０．０５、各々のコントロールと比較；**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１５７】
【表１３】
【０１５８】
表１２．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０３ｎｇ／ｍｌ。
【０１５９】
【表１４】
【０１６０】
表１３．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１６ｎｇ／ｍｌ、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１６１】
【表１５】
【０１６２】
表１４．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６３】
【表１６】
【０１６４】
表１５．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６５】
【表１７】
【０１６６】
表１６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又はＴＮＦ阻害のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６７】
【表１８】
【０１６８】
表１７．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に増加した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１６９】
【表１９】
【０１７０】
表１８．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７１】
【表２０】
【０１７２】
表１９．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト単球細胞株（ＭＵＴＺ−３）の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較してｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７３】
【表２１】
【０１７４】
表２０．（成熟ＤＣを生じさせるために）ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、未成熟樹状細胞の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０５、***各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１７５】
【表２２】
【０１７６】
実施例５
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの抗炎症活性
基本的に実施例４に記載された通りに実施例５を行った。下の表に示した通り、化合物ｒｈＢＤ２は組み換えｈＢＤ２であり、そしてそれは実施例４において使用されたｈＢＤ２と同一である。
【０１７７】
下の表に示した通り、化合物ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントは、化学合成を用いて調製され、そしてＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．から得た。
【０１７８】
組み換えｈＢＤ２（ｒｈＢＤ２）のアミノ酸配列は、化学合成により調製されたｈＢＤ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１７９】
下の表で示されたｈＢＤ４バリアントは、ｈＢＤ４のアミノ酸３〜３９から成り、そして当該アミノ酸の配列は配列番号５に示した通りである。
【０１８０】
各々の表において、全ての試料は同一のドナーで試験された。ＳＤは標準偏差を意味する。
【０１８１】
結果
表２１．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８２】
【表２３】
【０１８３】
表２２．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８４】
【表２４】
【０１８５】
表２３．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１８６】
【表２５】
【０１８７】
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの効果を、ＬＰＳで処置された及び処置されていないヒトＰＢＭＣで試験した（表２１、２２及び２３）。比較のために、ｒｈＢＤ２を各々の設定に含めた。
【０１８８】
全てのディフェンシンに関して、ＴＮＦは下方制御された。ＩＬ−１β分泌の減少は、ＴＮＦと同等であったが、ＴＮＦほど顕著ではなかった。ｈＢＤ２及びｈＢＤ４バリアントに関して、ＩＬ−１０の分泌は、有意に且つ用量依存的に上昇した。
【０１８９】
ｈＢＤ３は１０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌで試験され、並びにｈＢＤ４バリアントは４０μｇ／ｍｌで試験された；しかし、これらの濃度においていずれの分子も毒性であったために、毒性効果と抗炎症性効果とを区別することができなかった。
【０１９０】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブが当該設定中に含まれた。
【０１９１】
結論
全ての試験されたヒト・ベータ・ディフェンシンは、抗炎症潜在力を示した。
【０１９２】
実施例６
ヒトの単球由来樹状細胞及びヒトＰＢＭＣの、ＩＬ−２３の減少
実施例６は、ヒトＰＢＭＣに関して基本的に実施例４で記載された通りに行われた；しかし、読み出しはＴＮＦ、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１０の代わりにＩＬ−２３であった。さらに、ヒトの単球由来樹状細胞におけるｒｈＢＤ２の効果が同様に調べられた。
【０１９３】
単球由来樹状細胞（ＤＣ）の生成
ＤＣは、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．によって初めに記載された改良手順に従って調製された。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントをかけた遠心分離によって、健常なドナーの軟膜から精製された。製造業者の使用指示に従った、マグネティックビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による、ＣＤ１４＋細胞の正の選択によって、単球をＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＲＰＭＩ／２％ヒトＡＢ血清、組換え型ヒト顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中で６日間、６ウェルプレート中で培養し、２日後、及び５日後に培地／サイトカインを再補充した。培養６日後、未熟ＤＣを９６ウェルプレート中で１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再度培養し、そしてさらに２４時間、カクテル、及び／又はｈＢＤ２で、処置されなかったか、又は処置された。ｈＢＤ２を４つの濃度で、４通りで試験した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む炎症性カクテルを用いて、ｈＢＤ２は、炎症性フェノタイプへのｈＤＣ成熟を抑制するその能力を分析された。デキサメタゾンを加え、２０時間後に当該カクテルを、臨床的抗炎症活性を有することが証明されている化合物のためのポジティブ・コントロールとして加えた。ｈＢＤ２とのインキュベーションを行い、４時間後にカクテルを加えた。
【０１９４】
サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培養上清を回収し、−８０℃で保存した。製造業者の手順（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、市販の抗体及びスタンダードを用いた標準的サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２３の量を測定した。
【０１９５】
ＭＴＴアッセイ
ビヒクル、カクテル、又はｈＢＤ２を用いた処置によって任意の細胞が大幅に影響を受けるか否かを評価するために、４８時間後の細胞の生存の測定において、ＭＴＴ系細胞増殖決定キットを使用し、製造業者の手順（Ｓｉｇｍａ）に従って行った。
【０１９６】
統計学的分析
全ての実験は少なくとも２回行われ、代表的な結果を示す。示されたデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現された。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。差はｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【０１９７】
結果
表２４．培地（未刺激）、又はＬＰＳ及びＩＦＮ−γのいずれかで刺激され、培地（未処置）、ｈＢＤ２、又はデキサメタゾンのいずれかで処置された、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞の上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）、Ｎ＝４、３人の内１人の代表的ドナー。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。ｎｄ：検出されず（検出限界未満）。
【０１９８】
【表２６】
【０１９９】
表２５．培地（コントロール）、０．６ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、又は５μｇ／ｍｌ ＬＴＡのいずれかで刺激され、ｈＢＤ２、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処置された、ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較事後検定によって未処置細胞と比較。
【０２００】
【表２７】
【０２０１】
表２４に示された通り、ｈＢＤ２は、有意に且つ用量依存的に、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞からのＩＬ−２３分泌を抑制した。
【０２０２】
ヒトＰＢＭＣに関して、ＩＬ−２３分泌はまた、有意に抑制された（表２５）。これらの細胞において、逆の用量依存性が存在し、そしてそれは、より低用量のｈＢＤ２を試験したとき、鐘形の用量−反応阻害曲線であることが分かった（データを示さず）。
【０２０３】
これは、ＩＬ−２３分泌の抑制によって、ｈＢＤ２が慢性自己免疫状態の抑制効果を有し、したがってＩＬ−２３が、炎症性応答において重要な役割を果たすことを示している。Ｔｈ１７細胞は、それらの生存及び増殖に関して、ＩＬ−２３に依存しており、そしてＴｈ１７細胞は、幾つかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。
【０２０４】
実施例７
マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を用いた、ＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌の減少
実施例７は基本的に、ヒトＰＢＭＣに関して、実施例４に記載された通りに行われた。実施例１においてｈＢＤ２の産生のために使用された手順と同一のものを使用して、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を調製した。ｍＢＤ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される。マウスＰＢＭＣを、以下に記載した通りに調製した。
【０２０５】
マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び刺激
マウス末梢血単核細胞を、１０匹のＮＭＲＩマウスの血液から単離した。要約すれば、ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内でＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。血漿を上清から回収し、そして廃棄された。単離されたＰＢＭＣを培養培地（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，４２４０１）ｗ／１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに１％ Ｌ−グルタミン）中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり１５５．５００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２又はｍＢＤ３（マウス・ベータ・ディフェンシン３）を；それ単体で、又は、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）と共に用いて、同一のドナーからのＰＢＭＣを刺激した。ＬＰＳ刺激をした及びしていない培地へ、デキサメサゾンを３．５ｎｇ／ｍｌ加えた。３７℃で２４時間インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０２０６】
ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターにおける製造業者の使用説明に従って、マウス炎症サイトメトリック・ビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、上清におけるサイトカインの産生を測定した。
【０２０７】
上清を回収後、生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定した。
【０２０８】
結果
表２６．ＬＰＳを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料を同一のドナーで試験された。２人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０２０９】
【表２８】
【０２１０】
表２７．ＬＰＳを用いた、ｍＢＤ３を用いた及び用いない処置後における、マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。２匹のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０２１１】
【表２９】
【０２１２】
表２６に示された通り、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）は、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を、ｈＢＤ２及びデキサメタゾンと同程度まで下方制御した。ｍＤＢ３はまた、マウスＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を下方制御した（表２７）。
【０２１３】
したがってこの設定において、ｍＢＤ３は、すぐれた抗炎症活性を示した。
【０２１４】
【表３０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患の治療における、非経口投与のための医薬の製造における、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記治療がなされた組織中において、ＴＮＦ−アルファ活性が減少する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
治療を必要とする対象へ、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを非経口投与することを含む、炎症性腸疾患の治療方法。
【請求項１１】
前記有効量が、前記治療がなされた組織中において、ＴＮＦ−アルファ活性を減少させるために効果的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
炎症性腸疾患の治療における、非経口投与のための医薬の製造における、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記治療がなされた組織中において、ＴＮＦ−アルファ活性が減少する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
治療を必要とする対象へ、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを非経口投与することを含む、炎症性腸疾患の治療方法。
【請求項１１】
前記有効量が、前記治療がなされた組織中において、ＴＮＦ−アルファ活性を減少させるために効果的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、皮下又は静脈内投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日用量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１０に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５２８３３３（Ｐ２０１１−５２８３３３Ａ）
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７９５５（Ｐ２０１１−５１７９５５）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９２５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００７１６６
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９２５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００７１６６
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]