嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法及び当該方法のためのプライマーセット
【課題】嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において陰性となるいわゆる擬陽性の嘔吐毒産生セレウス菌を判別し、動物細胞空胞化試験において陽性となる嘔吐毒産生セレウス菌のみを確実に検出できる方法を提供する。
【解決手段】それぞれ特定の塩基配列を有する２種の核酸をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、それにより増幅生産された核酸の生産量曲線から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別する。
【解決手段】それぞれ特定の塩基配列を有する２種の核酸をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、それにより増幅生産された核酸の生産量曲線から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法、より具体的に言うと、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するための判別方法及び当該方法のためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
セレウス菌（B.cereus）は自然界に広く分布する好気性有芽胞菌で、食品を汚染し、増殖して食品の腐敗を引き起こすことがある。この際、セレウス菌は毒素を産生するが、産生される毒素の違いにより下痢または嘔吐を主な症状とする食中毒を引き起こすものがある。このうち、日本で発生件数が多いのは嘔吐毒（セレウリド）による食中毒である。
【０００３】
セレウリドは熱、酸、アルカリ、消化酵素に対して耐性の強い低分子の環状ペプチドであり、（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）３という構造を示し、例えば、国際公開公報 ＷＯ ０３／０９７８２１号（特許文献１）にその産生酵素をコードする遺伝子配列が開示されている。
【０００４】
一方、本願発明者らによって、セレウリド産生株において特異的にＤＮＡが増幅されるプライマーセットが見出され、セレウリド合成酵素遺伝子を持つセレウス菌を特異的に検出できるプライマーセットが特開２００６−６２５６号公報（特許文献２）に開示されている。また、これら以外にも、ＰＣＲ法によってセレウリド産生セレウス菌を検出する方法が、例えば、第２６回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集（非特許文献１）や特開２００５−５７２０２号公報（特許文献３）に開示されている。
【０００５】
しかしながら、本願発明者らの研究によると、特許文献２に開示されたプライマーセットを用いたＰＣＲ法で行ったセレウリド産生菌の検出結果と、生化学的試験である動物細胞空胞化試験における検出結果が一致しないことが確認された。つまり、セレウリド合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において嘔吐毒陰性となる菌株（以下「擬陽性嘔吐毒産生株」）が少数ながら存在し、嘔吐毒陰性であるにもかかわらず、嘔吐毒産生菌と判定される可能性があることが見出された。
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報 ＷＯ ０３／０９７８２１
【特許文献２】特開２００６−６２５６号公報
【特許文献３】特開２００５−５７２０２号公報
【非特許文献１】河合高生ら、「ＰＣＲ法を用いたセレウリド産生性セレウス菌検出法の検討」、第２６回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集、２００５、ｐ４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において陰性となるいわゆる擬陽性嘔吐毒産生セレウス菌を判別し、動物細胞空胞化試験において陽性となる嘔吐毒産生セレウス菌のみを確実に検出できる方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号１及び／又は配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを適用して、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するセレウス菌の判別方法を提供する。また、それに用いられるセレウス菌検出用のプライマー及び嘔吐毒産生セレウス菌の判別用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、嘔吐毒合成酵素をコードするｍＲＮＡを増幅するに適したプライマーセットが提供される。従って、本発明のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行えば、嘔吐毒の産生量若しくは嘔吐毒産生能にほぼ比例した増幅産物量曲線が得られる。この増幅産物量曲線から、嘔吐毒非産生セレウス菌かどうかの判別ができる。このように、本発明によれば、擬陽性菌かどうかの判定が極めて簡単かつ確実に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、配列番号１及び配列番号２で示された塩基配列からなるプライマーセットによるＲＴ−ＰＣＲを行い、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生菌を判別することを特徴とする。ＲＴ−ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じた増幅産物（核酸）を増幅と同時に検出する方法である。増幅された核酸の検出には、各種蛍光プローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（intercalater dye）を用いる手法があり、本発明においては、いずれの手法を用いることができる。
【００１１】
ところで、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるプライマーは、一般には、ターゲットとなる核酸を増幅できる塩基配列を有するものであればよい。従って、嘔吐毒産生セレウス菌をＲＴ−ＰＣＲで検出するためには、例えば、配列番号３で示された嘔吐毒であるセレウリド合成酵素をコードする遺伝子から決定された配列番号４で示される（Tyr-Ala-1F）プライマーや配列番号５で示される（ER-2）プライマーを用いることができる。しかしながら、これらのプライマーを用いた場合には、現実に嘔吐毒を産生する産生株のみならず、合成酵素を保有するが、現実には嘔吐毒を産生しないかあるいは嘔吐毒を産生しても空胞化活性試験で陰性となる程度の嘔吐毒しか産生しない菌株（擬陽性株）をも検出されることになる。そこで、擬陽性株を区別するため、本発明においては、セレウリド合成酵素をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを増幅するに適した配列番号１で示される核酸配列からなるプライマー及び配列番号２で示される核酸配列からなるプライマーが用いられる。これらのプライマーは、それぞれForward用プライマー（RT-f）及びReverse用プライマー（RT-r）として用いられる。通常は両者を１組（１セット）として用いられる。もっとも、いずれか一方のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行っても差し支えない。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲによって検出された核酸量（増幅産物量）は、例えば図４に示すように、増幅サイクルに従って対数的に増加し、次第にプラトーに達する。対数的に増加を開始するサイクル数は、セレウリドの産生量（若しくはセレウス菌のセレウリド産生能）に比例すると考えられる。従って、対数的に増加を開始するサイクル数を調べることによって、真性の嘔吐毒産生株、擬陽性産生株、非産生株のいずれであるかを判定することができる。すなわち、嘔吐毒を産生する標準株と嘔吐毒を産生しない標準株を用いて作成された核酸量の産生曲線（増幅産物量曲線）と、被検出株（検体株）を用いて作成された核酸量の産生曲線を対比させることによって判別される。被検出株の産生曲線が、標準株の産生曲線とほぼ一致すれば、その株は嘔吐毒産生株であり、非産生株の産生曲線とほぼ一致すればその株は非産生株（若しくは擬陽性株）であると判定される。そして、被検出株の産生曲線が、標準株の産生曲線と非産生株の産生曲線の間に位置するようであれば、それは擬陽性株、つまりセレウリド合成酵素遺伝子を有するが、嘔吐毒非産生株（若しくは嘔吐毒を産生するとしても動物細胞空胞化活性で陰性を示す程度しか産生しない株）であるとして判定される。また、ｍＲＮＡの発現量と嘔吐毒の産生量は比例すると考えられるので、対数的に増加を開始するサイクル数を調べることによって、嘔吐毒の産生量を定量的に測定したり、陽性株、擬陽性株の産生能を測定したりすることも考えられる。
【００１３】
セレウス菌には、セレウリド産生株と擬陽性株とが存在することより、セレウス菌が保有するセレウリド合成酵素をコードする遺伝子は、その菌株によって異なると考えられる。なお、本願で開示される配列番号３に示された塩基配列は、特許文献１に開示されたものとは異なる。
【００１４】
また、本発明によるプライマーには、これらのプライマーと同様の機能を発揮する限りにおいて、欠失、置換、挿入若しくは付加により一部が改変された核酸を含む。
【００１５】
本発明のプライマーセットは、セレウス菌判別用のプライマーセットとして提供される他、他のＲＴ−ＰＣＲ用キットと同様に、ＲＴ−ＰＣＲに必要なＤＮＡ増幅用酵素（例えば、Taq DNA polymerase）やＤＮＡ合成試薬（dNTPや反応用緩衝液）、増幅された核酸検出用のＤＮＡ検出試薬、さらにはｃＤＮＡ合成酵素などとセットされ、セレウス菌判別用キットとして提供される。ＰＣＲの条件は適宜定められ、実施例２に記載された条件が例示される。
【実施例１】
【００１６】
本発明に係るプライマーの設計にあたり、下記に述べるようにまず、嘔吐毒産生株のＤＮＡを制限酵素EcoR Iで消化し、（Tyr-Ala-1F：配列番号４）-（ER-2：配列番号５）プライマーセットを用いたＰＣＲ産物をプローブとしたサザン分析により検出した約６ｋｂ及び８ｋｂの消化産物の塩基配列（配列番号６）を決定した。次に、この５'末端側の配列（（9R-ｆ：配列番号７）-（9R-r：配列番号８））をプライマーとしたＰＣＲ産物をプローブとして、嘔吐毒産生株のＤＮＡの制限酵素Pvu II消化断片から検出した約６．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を一部決定して、先の約６ｋｂ及び約８ｋｂの塩基配列と併せて嘔吐毒セレウリド合成酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。
【００１７】
〔嘔吐毒セレウリド合成酵素遺伝子の全塩基配列の決定〕
（１）ゲノムＤＮＡの調製
セレウリド産生セレウス菌のゲノムＤＮＡは最適な条件で培養して得た菌体からDNeasy Tissue Kit（QIAGEN社製）及びCetyltrimetylammoniumbromide（ＣＴＡＢ）法により調製された。ゲノムＤＮＡの調製には、岩手大学農学部において嘔吐型食中毒事件で分離され、明治乳業（株）で保存された菌株（B.cereus Ｎｏ．５５）が用いられた。
【００１８】
（２）EcoR IによるゲノムＤＮＡ消化及び（Tyr-Ala-1F）-（ER-2）プライマーセットを用いたサザン分析
次に、調製されたB.cereusゲノムＤＮＡを制限酵素EcoR I（TOYOBO社製）により完全消化した。この完全消化したＤＮＡ断片について、（Tyr-Ala-1F：配列番号４）-（ER-2：配列番号５）プライマーセットを用いて増幅して得られたＰＣＲ産物をプローブとしてサザン分析を行ったところ、約６ｋｂと約８ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。そして当該ＤＮＡ断片をクローニングしてこれらの塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのEcoR I消化断片を組み込んだ形質転換体プラスミドのEcoR I消化後の電気泳動図を図１に示す。
【００１９】
ここで決定した約６ｋｂｐと約８ｋｂｐの塩基配列とこれまでに決定している配列を含めた解析の結果（特許文献２、配列番号５及び図５参照）、これら２つのＤＮＡ断片は連続しておらず、間に３９０ｂｐのＤＮＡが存在すると考えられた。アライメントの結果、この３９０ｂｐの配列は、既に塩基配列が決定されている(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)ＰＣＲ産物の内部に存在した。これら新しく決定した６ｋｂ及び８ｋｂのＤＮＡ断片と(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)ＰＣＲ産物の関係を図２に示す。また、約６ｋｂおよび８ｋｂのＤＮＡ断片と中間の３９０ｂｐの断片をあわせた合計１３，６０５ｂｐのＤＮＰ断片の塩基配列を配列番号６として示す。
【００２０】
（３）Hinc II、Pvu II、Sph IによるゲノムＤＮＡ消化及び９Ｒプライマーセットによるサザン分析
次に、上記で決定された約１４ｋｂｐの塩基配列の前半部分から作製された配列番号７で示されるプライマー（9R-f）及び配列番号８で示されるプライマー（9R-r）をブローブとして、調製されたB.cereusゲノムＤＮＡの各種制限酵素（Hinc II（NEB社製）、Pvu II（MBI社製）、Sph I（NEB社製））による消化産物のサザン分析を行ったところ、約６．５ｋｂｐのPvu II消化産物と強くハイブリダイズした。そして、この消化産物をクローニングして、その一部塩基配列を決定した。約１４ｋｂｐの前半を９Ｒプローブセット（（9R-f）-（9R-r））で増幅して得られたＰＣＲ産物をプローブとしたサザン分析の電気泳動図を図３に示す。
【００２１】
このアライメント解析を行ったところ、これは先に述べた約１４ｋｂｐの前半部分に結合した。また、約１４ｋｂｐの後半部分は、Ehling-Schulzらの報告している配列（Accession number：AY691650）と同一であり、彼らの報告している塩基配列（Accession number：AY691650）のうち終止コドンを含む配列をリバースプライマー、すでに決定した14ｋｂｐの最終部分をフォワードプライマーとして用い、Ｎｏ.５５株のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、増幅されるＤＮＡの塩基配列を決定して、配列番号３に示す１８５９４ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２２】
配列番号３に示す塩基配列について、さらに解析をすすめたところ、この塩基配列には、配列番号３に示す塩基配列中３６０−１０５３５塩基までのＯＲＦ１と１０５７９−１８５９４塩基までのＯＲＦ２の２つの大きなＯＲＦが含まれることが分かった。ＯＲＦ１の推定アミノ酸配列を配列番号９に、ＯＲＦ２の推定アミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＯＲＦ１は３３９１アミノ酸からなる分子量３８７６２４．５のタンパク質をコードし、ＯＲＦ２は２６８１アミノ酸からなる分子量３０４２８９．０９のタンパク質をコードしていると推定された。
【００２３】
これらの塩基配列の決定に際して行われた処理条件は下記の通りである。
（ｉ）ゲノムＤＮＡの制限酵素による処理
調製したゲノムＤＮＡは制限酵素EcoR I、Hinc II、Pvu II、Sph Iによって消化された。ゲノムＤＮＡは１μｇが使用された。表１に示す反応液組成に総量が５０μlとなるように滅菌水を加え、３７℃で一晩（１６時間以上）インキュベートした。そして、制限酵素消化産物３０μlと１／１０容量のローディング緩衝液（３０％Glycerol、５０ｍＭ EDTA、０．２５％ Bromo phenol blue、０．２５％ Xylene cyanol FF、ｐＨ７．０）を混合した後、１．２％アガロースゲルの試料溝にチャージし、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Tris-acetate、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８．０）中、１００Ｖの印加電圧で電気泳動を行った。アガロースゲルはＴＡＥ緩衝液により調製された。泳動終了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液に浸して染色（エチブロ染色）し、紫外線照射装置 TFP-35M（VILBER LOURMAT社製）により照射してバンドを検出した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（ii）サザン分析法
（Ａ）ＰＣＲ産物の精製
調製されたＤＮＡの各消化産物について、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。酵素は、Taq DNA polymerase、KOD Dashのいずれかを使用した。EcoR IによるゲノムＤＮＡ消化産物については、プライマーセット（Tyr-Ala-1F）-（ER-2）をプローブとして、制限酵素Hinc II、Pvu II、Sph Iによる消化産物については、プライマーセット（9R-f）-（9R-r）をプローブとした。また、プライマーセット（9R-f）−（9R-r）では、Taq DNA polymeraseを使用し、プライマーセット（Tyr-Ala-1F）−（ER-2）では、KOD Dashを使用した。
【００２６】
（ａ）Taq DNA polymerase
<反応液組成>
１０×buffer for Taq DNA polymerase（ＳＩＧＭＡ社製） １．５μｌ
１ｍＭ dNTPS（ＳＩＧＭＡ社製） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（Foward） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（Reverse） ０．３μｌ
鋳型（３２ｎｇ／μl） １．０μｌ
５Ｕ／μｌ Taq DNA polymerase（ＳＩＧＭＡ） ０．０９μｌ
【００２７】
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中で調製し、全量が１５μｌになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler（TaKaRa社製）若しくはThermo Hybaid PCR Express（Thermo BioAnalysis社製）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った。ＤＮＡの変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを３５サイクル繰り返した。
<反応条件>
前熱処理： ９５℃、３．０ｍｉｎ
ＤＮＡの変性： ９５℃、１．０ｍｉｎ
アニーリング： ５２℃、１．０ｍｉｎ
伸長反応： ７２℃、１．０ｍｉｎ
【００２８】
（ｂ）KOD Dash
<反応液組成>
KOD Dash １０×PCR buffer（TOYOBO社製） １．５μｌ
２ｍＭ dNTPs（TOYOBO社製） １．５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（foward） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（reverse） ０．３μｌ
鋳型（３２ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
２．５Ｕ／μｌ KOD Dash（ＴＯＹＯＢＯ社製） ０．０７９μｌ
【００２９】
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中で調製し、全量が１５μｌになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cyclerを用いて以下の条件でＰＣＲを行った。ＤＮＡの変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを３４サイクル繰り返した。
<反応条件>
前熱処理： ９５℃、３．０ｍｉｎ
ＤＮＡの変性： ９５℃、１．０ｍｉｎ
アニーリング： ４２℃、１．０ｍｉｎ
伸長反応： ７２℃、１．０ｍｉｎ
【００３０】
上記各ＰＣＲ反応液を１．２％アガロースゲルを用いてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、増幅産物を検出した。目的のバンドをゲルから切り出し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製した。精製したＤＮＡに、１／１０容量の３ＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ及び２．５容量の９９％エタノールを加え、−８０℃で２０分間放置した後、遠心分離（２０，４００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）してＤＮＡを沈殿させた。この沈殿を真空乾燥させ、滅菌水に溶解させた。
【００３１】
（Ｂ）ジゴキシゲニンによるＤＮＡの標識
DIG DNA Labeling and Detection Kit（DIG-ELISA）nonradioactive（Roche社製）を用いて以下の方法でＰＣＲ産物を標識した。上記方法で精製したＤＮＡ溶液１０μｌ（ＤＮＡ２μｇ）を０．２ｍｌのマイクロチューブに移し、滅菌水を加えて１５μｌとし、９５℃で１０分間熱変性させた後、急冷した。２μｌのヘキサヌクレオチド混合液（Kit付属）、２μｌのdNTPラベリング混合液（Kit付属）及び１μｌのKlenow enzyme（Kit付属）を添加、混合後、３７℃で１８時間インキュベートした。２μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え、６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ、これをプローブ溶液とした。
【００３２】
制限酵素による完全消化物を１．２％アガロースゲルを用いて、ＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、エチブロ染色でバンドを確認した。次にゲルを純水で洗浄し、加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ）中で２０分間振とうした。さらに変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で３０分間振とうし、０．４Ｍ ＮａＯＨで１０分間アルカリ変性を行った。Hybond-N+ ナイロン膜（アマシャム社製）をバキュームトランスファー装置（Bio CRAFT社製）にセット後、その上にアルカリ変性させたゲルを載せた。ゲルの上に０．４Ｍ ＮａＯＨをしみ込ませた海綿をのせ、その上から０．４Ｍ ＮａＯＨを注ぎ、５０〜７０ｍｍＨｇで吸引し、９０分間アルカリブロッティングした。ブロッティング終了後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３）で濯ぎ、洗浄した（２ｍｉｎ、３回）。
【００３３】
ハイブリボトルにブロッティングした膜を入れ、１５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、０．５w/v％ブロッキング試薬（Roche社製）、０．１w/v％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０２w/v％ＳＤＳ）を加え、回転式ハイブリオーブン（Lab-Line Instruments社製又はUVP Laboratory products社製）を用い、６８℃で４時間インキュベートした。上記（ｉ）で調製したプローブを９５℃で１０分間熱変性させた後、急冷し、これをハイブリボトルに加え、６８℃で一晩インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
【００３４】
膜をまず６８℃で洗浄し、ブロッティングした後、アルカリフォスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体−Fab フラグメント（Roche社製）と３０分間室温で反応させた。洗浄後、発色反応液（４５μｌのＮＢＴ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ in ７０％ dimethylformamide）（ナカライテスク社製）、３５μｌのＸ−リン酸溶液（５０ｍｇ／ｍｌ in ＤＭＦ）（ナカライテスク社製）を１０ｍｌのBuffer 3に添加したもの）中で膜をインキュベートして、発色させ、バンドを検出した。
【００３５】
（iii）制限酵素消化断片のクローニング
ゲノムＤＮＡの制限酵素（EcoR I及びPvu II）の消化断片を下記の方法で精製した後、それぞれLamda ZAP II Predigested EcoRl/CIAP Treated Vector Kit（Stratagene社製）及びClone Smart Blunt Cloning Kit（Lucigen Corporation社製）を用いてクローニングを行った。
Ａ．EcoR I消化断片の精製方法
EcoR I消化産物を１ｍｌの７０％Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ、滅菌水に溶解させた。
Ｂ．Pvu II消化断片の精製方法
Pvu II消化産物に、等量のＴＥ飽和Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol（容量比２５：２４：１）（ｐＨ７．９）混合液を加えよく混合した。遠心分離（２０、４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）して、水層を新しい１．５ｍｌのマイクロチューブに分取し、等量のChloroform-Isoamylalcoholを加え混合した後、再度遠心分離（２０、４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）した。水層を分取し、これに１／１０容量の３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）、２．５容量の９９％エタノールを加え室温で１０分程度放置し、遠心分離（２０、４００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）し、ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿を７０％Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ滅菌水に溶解させた。
【００３６】
（iv）塩基配列の決定
EcoR I消化断片、すなわち約６ｋｂ及び８ｋｂのＤＮＡを組み込んだ形質転換プラスミドは、Sanger法によって、塩基配列を決定した。また、さらに上流部分を含むと思われる約６．５ｋｂのPvu II断片についても同様に塩基配列を決定した。
【００３７】
上記のようにして配列が決定された約６ｋｂ及び８ｋｂのアミノ酸配列及び約６．５ｋｂのアミノ酸配列について、GenomeNet及びNCBIのBLAST programを用い、nucleic acidデータベース、proteinデータベースにおける相同性検索を行ったところ、Gramicidin S synthetase IやTyrocidine A synthetase IIなどの非リボソーム性ペプチド合成酵素遺伝子の一部と高い相同性が認められた。
【００３８】
さらにproteinデータベースにおけるモチーフ検索も行った。非リボソーム性ペプチド合成酵素には１つのアミノ酸に対し、その活性化やアミノ酸同士の結合を行うペプチド合成ユニットがある。このペプチド合成ユニットには、アミノ酸同士の縮合を行うコンデンセーションドメイン（Ｃ domain）、アミノ酸の活性化を行うアデニレーションドメイン（Ａ domain）、アミノ酸を運搬するペプチジルキャリアプロテインが含まれる（ＰＣＰ domain）。セレウリドは４種のアミノ酸から構成されるため、セレウリド合成酵素には４つのユニット、さらに最後にはペプチド鎖切断に必要なチオエステラーゼ活性部位があると推定されるが、これらのドメインの存在もモチーフ検索の結果、確認された。確認されたドメイン構造を表２に示す。
【００３９】
【表２】
【実施例２】
【００４０】
〔B.cereus 嘔吐毒セレウリド合成酵素発現株のリアルタイムＰＣＲによる検出〕
続いて、開始コドンと推定される領域を含むＤＮＡ塩基配列から転写されるｍＲＮＡを検出するために有効なプライマーセットを設計、合成した。そして合成されたプライマーセット（（RT-f：配列番号１）-（RT-r：配列番号２））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、嘔吐毒産生株、擬陽性株及び非産生株の判別を試みた。
【００４１】
B.cereus ＪＣＭ２１５２（標準株：理化学研究所保存施設に保存）、ＫＦ株（嘔吐毒産生株：九州大学農学研究院で分離保存）、Ｎｏ．５５株（嘔吐毒産生株）、Ｎｏ．１１株（嘔吐毒非産生、嘔吐毒合成酵素遺伝子保有株：明治乳業（株）で分離保存）、Ｎｏ．１７株（嘔吐毒非産生株：同前）、ＮＯ．２２株（嘔吐毒非産生株：同前）Ｎｏ．４株（嘔吐毒非産生株：同前）、Ｎｏ．４２株（嘔吐毒非産生株：同前）について判別を試みた。用いたB.cereus菌株の性状を表３にまとめた。
【００４２】
【表３】
【００４３】
種々のB.cereus菌株を最適条件で培養後に集菌した菌体から、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従い、ｍＲＮＡを抽出した。なお、菌体の溶菌は５ｍｇ／ｍｌLysozyme（生化学工業社製）及び０．０２ｍｇ／ｍｌのN-Acetylmuramidase（大日本製薬社製）存在下で、３７℃５分間インキュベートした後、超音波処理（３０Ｗ、１５ｓｅｃ、３７℃）によって行った。また、ＲＮＡへのゲノムＤＮＡの混入を防ぐためにRNase-free DNase I Set（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従いＤＮＡ消化を４回行った。
【００４４】
抽出したＲＮＡを鋳型として、セレウリド合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを合成した。また、常にその転写量が一定である１６ＳｒＲＮＡのｃＤＮＡも同時に合成した。ＲＮＡ１．２μｇに２種の逆転写用プライマー（（RT-R：配列番号２）又は（16SrRNA-r：配列番号１２））をそれぞれ２０ｐｍｏｌずつ混合し、RNase-free waterを加えて１２μｌとした溶液を７０℃で１０分間インキュベート後、５分間氷冷した。この溶液に、dNTP Mixture（２．５ｍＭeach）４μｌ及び付属の５×緩衝液（２５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ２、３７５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて２０μｌの反応液を調製した。２５℃で５分間インキュベート後、２００units／μｌ ReverScript I（Wako社製）１μｌを加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間インキュベートしてｃＤＮＡを合成した。
【００４５】
合成したｃＤＮＡ１μｌをそれぞれ鋳型として、（（RT-f：配列番号１）-（RT-r：配列番号２）及び（16SrRNA-f：配列番号１１）-（16SrRNA-r：配列番号１２））の両プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ装置による定量ＰＣＲにより、標的遺伝子であるセレウリド合成酵素及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部の増幅を行い、転写量を測定した。
【００４６】
《反応液組成》
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（forward） ０．５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（reverse） ０．５μｌ
SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa社製） １２．５μｌ
ROX Reference Dye（TaKaRa社製） ０．５μｌ
上記の反応液に全量が２５μｌになるように滅菌水を加え、Mx3000P Real-Time PCR System （STRATAGEN社製）を用いてＰＣＲを行った。熱変性、アニーリング、伸長反応を１サイクルとして４０サイクルの反応を行った。
【００４７】
《反応条件》
熱変性： ９５℃、１０ｓｅｃ
アニーリング： ５５℃、２０ｓｅｃ
伸長反応： ７２℃、３０ｓｅｃ
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅産物量（核酸量）を示す曲線を図４に示す。また、最終転写産物量を比較した図を図５に示す。
【００４９】
図４に示したように、ＫＦ株とＮｏ．５５株はほぼ同じサイクル数から急激に増幅産物量が増加したのに対し、Ｎｏ．１１株でそれよりも遅れて増幅産物量が急激に増加し、Ｎｏ．１１株の立ち上がりサイクル数は、嘔吐毒産生株と嘔吐毒非産生株との間に位置した。この結果、Ｎｏ．１１株は擬陽性株であると判断され、他のＰＣＲ法（表３参照）ではともに陽性として判断されたＫＦ株と区別することができた。また、嘔吐毒合成酵素転写産物量は、図５に示すように、Ｎｏ．５５株（中程度空胞化活性株）を１としたときに、ＫＦ株（強空胞化活性株）は約５倍多く、Ｎｏ．１１株（無空胞化活性株）は１／１０程度であった。このように、動物細胞空胞化活性は嘔吐毒合成酵素遺伝子転写量と比例した。Ｎｏ．１１株では、嘔吐毒合成酵素遺伝子の発現量が少ないために嘔吐毒産生量も微量で、動物細胞空胞化活性の測定法では非産生株かどうかの判定は困難だったものと考えられる。嘔吐毒合成酵素遺伝子転写発現の機構の違いにより、嘔吐毒産生が異なると考えられた。その他の嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有していないＪＣＭ２１５２, Ｎｏ．１７、２２、４、４２株では、嘔吐毒合成酵素転写産物は全く増幅検出されなかった。
【００５０】
このように、本発明のプライマーセットを用いたリアルタイム（定量）ＰＣＲにより、嘔吐毒合成酵素を発現する嘔吐毒産生株のみを特異的に検出できた。転写産物量は、動物細胞空胞化活性量と比例し、毒素産生量が微量なため動物細胞空胞化試験では嘔吐毒産生陰性となる菌株でも、嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有している菌株では、本遺伝子転写産物を定量検出できた。また、本発明のプライマーセットを用いたリアルタイム（定量）ＰＣＲ法により、嘔吐毒産生能の程度も判定できる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、嘔吐毒非産生菌はもちろんのこと、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが嘔吐毒を産生しないセレウス菌と嘔吐毒産生菌とを確実に判別することができる。この結果、食中毒の発生原因の早期解明、その対策等が迅速に行えるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】クローン化した嘔吐毒合成酵素遺伝子を含むと推定されるセレウス菌Ｎｏ.５５ＤＮＡのEcoRI消化産物について電気泳動を行った結果を示す図である。レーンＭは、λHind III marker、レーン１は、６ｋｂＤＮＡ断片を挿入したプラスミド、レーン２は、８ｋｂＤＮＡ断片を挿入したプラスミドについて示す。
【図２】６ｋｂ、８ｋｂのセレウス菌Ｎｏ．５５ＤＮＡのEcoRI消化産物と、（Try-Ala-1F）−（ＥＲ−２）プライマーセットで増幅される２２０５ｂｐＰＣＲ産物との関係を示す図である。
【図３】セレウス菌Ｎｏ．５５ＤＮＡの各種制限消化酵素産物についてのサザンブロッティング分析結果である電気泳動図である。レーン１はHinc IIによる消化産物、レーン２はPvu IIによる消化産物、レーン３はSph Iによる消化産物についての結果である。
【図４】本願のプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物量曲線の一例である。
【図５】嘔吐毒産生株と擬陽性嘔吐毒産生株並びに嘔吐毒非産生株における嘔吐毒合成遺伝子転写産物量を比較したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嘔吐毒産生セレウス菌の検出方法、より具体的に言うと、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するための判別方法及び当該方法のためのプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
セレウス菌（B.cereus）は自然界に広く分布する好気性有芽胞菌で、食品を汚染し、増殖して食品の腐敗を引き起こすことがある。この際、セレウス菌は毒素を産生するが、産生される毒素の違いにより下痢または嘔吐を主な症状とする食中毒を引き起こすものがある。このうち、日本で発生件数が多いのは嘔吐毒（セレウリド）による食中毒である。
【０００３】
セレウリドは熱、酸、アルカリ、消化酵素に対して耐性の強い低分子の環状ペプチドであり、（D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val）３という構造を示し、例えば、国際公開公報 ＷＯ ０３／０９７８２１号（特許文献１）にその産生酵素をコードする遺伝子配列が開示されている。
【０００４】
一方、本願発明者らによって、セレウリド産生株において特異的にＤＮＡが増幅されるプライマーセットが見出され、セレウリド合成酵素遺伝子を持つセレウス菌を特異的に検出できるプライマーセットが特開２００６−６２５６号公報（特許文献２）に開示されている。また、これら以外にも、ＰＣＲ法によってセレウリド産生セレウス菌を検出する方法が、例えば、第２６回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集（非特許文献１）や特開２００５−５７２０２号公報（特許文献３）に開示されている。
【０００５】
しかしながら、本願発明者らの研究によると、特許文献２に開示されたプライマーセットを用いたＰＣＲ法で行ったセレウリド産生菌の検出結果と、生化学的試験である動物細胞空胞化試験における検出結果が一致しないことが確認された。つまり、セレウリド合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において嘔吐毒陰性となる菌株（以下「擬陽性嘔吐毒産生株」）が少数ながら存在し、嘔吐毒陰性であるにもかかわらず、嘔吐毒産生菌と判定される可能性があることが見出された。
【０００６】
【特許文献１】国際公開公報 ＷＯ ０３／０９７８２１
【特許文献２】特開２００６−６２５６号公報
【特許文献３】特開２００５−５７２０２号公報
【非特許文献１】河合高生ら、「ＰＣＲ法を用いたセレウリド産生性セレウス菌検出法の検討」、第２６回日本食品微生物学会学術総会 講演要旨集、２００５、ｐ４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが動物細胞空胞化試験において陰性となるいわゆる擬陽性嘔吐毒産生セレウス菌を判別し、動物細胞空胞化試験において陽性となる嘔吐毒産生セレウス菌のみを確実に検出できる方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号１及び／又は配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを適用して、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するセレウス菌の判別方法を提供する。また、それに用いられるセレウス菌検出用のプライマー及び嘔吐毒産生セレウス菌の判別用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、嘔吐毒合成酵素をコードするｍＲＮＡを増幅するに適したプライマーセットが提供される。従って、本発明のプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行えば、嘔吐毒の産生量若しくは嘔吐毒産生能にほぼ比例した増幅産物量曲線が得られる。この増幅産物量曲線から、嘔吐毒非産生セレウス菌かどうかの判別ができる。このように、本発明によれば、擬陽性菌かどうかの判定が極めて簡単かつ確実に行える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、配列番号１及び配列番号２で示された塩基配列からなるプライマーセットによるＲＴ−ＰＣＲを行い、嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生菌を判別することを特徴とする。ＲＴ−ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生じた増幅産物（核酸）を増幅と同時に検出する方法である。増幅された核酸の検出には、各種蛍光プローブを用いる手法と、インターカレーター蛍光色素（intercalater dye）を用いる手法があり、本発明においては、いずれの手法を用いることができる。
【００１１】
ところで、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるプライマーは、一般には、ターゲットとなる核酸を増幅できる塩基配列を有するものであればよい。従って、嘔吐毒産生セレウス菌をＲＴ−ＰＣＲで検出するためには、例えば、配列番号３で示された嘔吐毒であるセレウリド合成酵素をコードする遺伝子から決定された配列番号４で示される（Tyr-Ala-1F）プライマーや配列番号５で示される（ER-2）プライマーを用いることができる。しかしながら、これらのプライマーを用いた場合には、現実に嘔吐毒を産生する産生株のみならず、合成酵素を保有するが、現実には嘔吐毒を産生しないかあるいは嘔吐毒を産生しても空胞化活性試験で陰性となる程度の嘔吐毒しか産生しない菌株（擬陽性株）をも検出されることになる。そこで、擬陽性株を区別するため、本発明においては、セレウリド合成酵素をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを増幅するに適した配列番号１で示される核酸配列からなるプライマー及び配列番号２で示される核酸配列からなるプライマーが用いられる。これらのプライマーは、それぞれForward用プライマー（RT-f）及びReverse用プライマー（RT-r）として用いられる。通常は両者を１組（１セット）として用いられる。もっとも、いずれか一方のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行っても差し支えない。
【００１２】
ＲＴ−ＰＣＲによって検出された核酸量（増幅産物量）は、例えば図４に示すように、増幅サイクルに従って対数的に増加し、次第にプラトーに達する。対数的に増加を開始するサイクル数は、セレウリドの産生量（若しくはセレウス菌のセレウリド産生能）に比例すると考えられる。従って、対数的に増加を開始するサイクル数を調べることによって、真性の嘔吐毒産生株、擬陽性産生株、非産生株のいずれであるかを判定することができる。すなわち、嘔吐毒を産生する標準株と嘔吐毒を産生しない標準株を用いて作成された核酸量の産生曲線（増幅産物量曲線）と、被検出株（検体株）を用いて作成された核酸量の産生曲線を対比させることによって判別される。被検出株の産生曲線が、標準株の産生曲線とほぼ一致すれば、その株は嘔吐毒産生株であり、非産生株の産生曲線とほぼ一致すればその株は非産生株（若しくは擬陽性株）であると判定される。そして、被検出株の産生曲線が、標準株の産生曲線と非産生株の産生曲線の間に位置するようであれば、それは擬陽性株、つまりセレウリド合成酵素遺伝子を有するが、嘔吐毒非産生株（若しくは嘔吐毒を産生するとしても動物細胞空胞化活性で陰性を示す程度しか産生しない株）であるとして判定される。また、ｍＲＮＡの発現量と嘔吐毒の産生量は比例すると考えられるので、対数的に増加を開始するサイクル数を調べることによって、嘔吐毒の産生量を定量的に測定したり、陽性株、擬陽性株の産生能を測定したりすることも考えられる。
【００１３】
セレウス菌には、セレウリド産生株と擬陽性株とが存在することより、セレウス菌が保有するセレウリド合成酵素をコードする遺伝子は、その菌株によって異なると考えられる。なお、本願で開示される配列番号３に示された塩基配列は、特許文献１に開示されたものとは異なる。
【００１４】
また、本発明によるプライマーには、これらのプライマーと同様の機能を発揮する限りにおいて、欠失、置換、挿入若しくは付加により一部が改変された核酸を含む。
【００１５】
本発明のプライマーセットは、セレウス菌判別用のプライマーセットとして提供される他、他のＲＴ−ＰＣＲ用キットと同様に、ＲＴ−ＰＣＲに必要なＤＮＡ増幅用酵素（例えば、Taq DNA polymerase）やＤＮＡ合成試薬（dNTPや反応用緩衝液）、増幅された核酸検出用のＤＮＡ検出試薬、さらにはｃＤＮＡ合成酵素などとセットされ、セレウス菌判別用キットとして提供される。ＰＣＲの条件は適宜定められ、実施例２に記載された条件が例示される。
【実施例１】
【００１６】
本発明に係るプライマーの設計にあたり、下記に述べるようにまず、嘔吐毒産生株のＤＮＡを制限酵素EcoR Iで消化し、（Tyr-Ala-1F：配列番号４）-（ER-2：配列番号５）プライマーセットを用いたＰＣＲ産物をプローブとしたサザン分析により検出した約６ｋｂ及び８ｋｂの消化産物の塩基配列（配列番号６）を決定した。次に、この５'末端側の配列（（9R-ｆ：配列番号７）-（9R-r：配列番号８））をプライマーとしたＰＣＲ産物をプローブとして、嘔吐毒産生株のＤＮＡの制限酵素Pvu II消化断片から検出した約６．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を一部決定して、先の約６ｋｂ及び約８ｋｂの塩基配列と併せて嘔吐毒セレウリド合成酵素遺伝子の全塩基配列を決定した。
【００１７】
〔嘔吐毒セレウリド合成酵素遺伝子の全塩基配列の決定〕
（１）ゲノムＤＮＡの調製
セレウリド産生セレウス菌のゲノムＤＮＡは最適な条件で培養して得た菌体からDNeasy Tissue Kit（QIAGEN社製）及びCetyltrimetylammoniumbromide（ＣＴＡＢ）法により調製された。ゲノムＤＮＡの調製には、岩手大学農学部において嘔吐型食中毒事件で分離され、明治乳業（株）で保存された菌株（B.cereus Ｎｏ．５５）が用いられた。
【００１８】
（２）EcoR IによるゲノムＤＮＡ消化及び（Tyr-Ala-1F）-（ER-2）プライマーセットを用いたサザン分析
次に、調製されたB.cereusゲノムＤＮＡを制限酵素EcoR I（TOYOBO社製）により完全消化した。この完全消化したＤＮＡ断片について、（Tyr-Ala-1F：配列番号４）-（ER-2：配列番号５）プライマーセットを用いて増幅して得られたＰＣＲ産物をプローブとしてサザン分析を行ったところ、約６ｋｂと約８ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。そして当該ＤＮＡ断片をクローニングしてこれらの塩基配列を決定した。ゲノムＤＮＡのEcoR I消化断片を組み込んだ形質転換体プラスミドのEcoR I消化後の電気泳動図を図１に示す。
【００１９】
ここで決定した約６ｋｂｐと約８ｋｂｐの塩基配列とこれまでに決定している配列を含めた解析の結果（特許文献２、配列番号５及び図５参照）、これら２つのＤＮＡ断片は連続しておらず、間に３９０ｂｐのＤＮＡが存在すると考えられた。アライメントの結果、この３９０ｂｐの配列は、既に塩基配列が決定されている(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)ＰＣＲ産物の内部に存在した。これら新しく決定した６ｋｂ及び８ｋｂのＤＮＡ断片と(Tyr-Ala-1F)-(ER-2)ＰＣＲ産物の関係を図２に示す。また、約６ｋｂおよび８ｋｂのＤＮＡ断片と中間の３９０ｂｐの断片をあわせた合計１３，６０５ｂｐのＤＮＰ断片の塩基配列を配列番号６として示す。
【００２０】
（３）Hinc II、Pvu II、Sph IによるゲノムＤＮＡ消化及び９Ｒプライマーセットによるサザン分析
次に、上記で決定された約１４ｋｂｐの塩基配列の前半部分から作製された配列番号７で示されるプライマー（9R-f）及び配列番号８で示されるプライマー（9R-r）をブローブとして、調製されたB.cereusゲノムＤＮＡの各種制限酵素（Hinc II（NEB社製）、Pvu II（MBI社製）、Sph I（NEB社製））による消化産物のサザン分析を行ったところ、約６．５ｋｂｐのPvu II消化産物と強くハイブリダイズした。そして、この消化産物をクローニングして、その一部塩基配列を決定した。約１４ｋｂｐの前半を９Ｒプローブセット（（9R-f）-（9R-r））で増幅して得られたＰＣＲ産物をプローブとしたサザン分析の電気泳動図を図３に示す。
【００２１】
このアライメント解析を行ったところ、これは先に述べた約１４ｋｂｐの前半部分に結合した。また、約１４ｋｂｐの後半部分は、Ehling-Schulzらの報告している配列（Accession number：AY691650）と同一であり、彼らの報告している塩基配列（Accession number：AY691650）のうち終止コドンを含む配列をリバースプライマー、すでに決定した14ｋｂｐの最終部分をフォワードプライマーとして用い、Ｎｏ.５５株のＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、増幅されるＤＮＡの塩基配列を決定して、配列番号３に示す１８５９４ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２２】
配列番号３に示す塩基配列について、さらに解析をすすめたところ、この塩基配列には、配列番号３に示す塩基配列中３６０−１０５３５塩基までのＯＲＦ１と１０５７９−１８５９４塩基までのＯＲＦ２の２つの大きなＯＲＦが含まれることが分かった。ＯＲＦ１の推定アミノ酸配列を配列番号９に、ＯＲＦ２の推定アミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＯＲＦ１は３３９１アミノ酸からなる分子量３８７６２４．５のタンパク質をコードし、ＯＲＦ２は２６８１アミノ酸からなる分子量３０４２８９．０９のタンパク質をコードしていると推定された。
【００２３】
これらの塩基配列の決定に際して行われた処理条件は下記の通りである。
（ｉ）ゲノムＤＮＡの制限酵素による処理
調製したゲノムＤＮＡは制限酵素EcoR I、Hinc II、Pvu II、Sph Iによって消化された。ゲノムＤＮＡは１μｇが使用された。表１に示す反応液組成に総量が５０μlとなるように滅菌水を加え、３７℃で一晩（１６時間以上）インキュベートした。そして、制限酵素消化産物３０μlと１／１０容量のローディング緩衝液（３０％Glycerol、５０ｍＭ EDTA、０．２５％ Bromo phenol blue、０．２５％ Xylene cyanol FF、ｐＨ７．０）を混合した後、１．２％アガロースゲルの試料溝にチャージし、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Tris-acetate、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８．０）中、１００Ｖの印加電圧で電気泳動を行った。アガロースゲルはＴＡＥ緩衝液により調製された。泳動終了後、アガロースゲルを１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液に浸して染色（エチブロ染色）し、紫外線照射装置 TFP-35M（VILBER LOURMAT社製）により照射してバンドを検出した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（ii）サザン分析法
（Ａ）ＰＣＲ産物の精製
調製されたＤＮＡの各消化産物について、以下の反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。酵素は、Taq DNA polymerase、KOD Dashのいずれかを使用した。EcoR IによるゲノムＤＮＡ消化産物については、プライマーセット（Tyr-Ala-1F）-（ER-2）をプローブとして、制限酵素Hinc II、Pvu II、Sph Iによる消化産物については、プライマーセット（9R-f）-（9R-r）をプローブとした。また、プライマーセット（9R-f）−（9R-r）では、Taq DNA polymeraseを使用し、プライマーセット（Tyr-Ala-1F）−（ER-2）では、KOD Dashを使用した。
【００２６】
（ａ）Taq DNA polymerase
<反応液組成>
１０×buffer for Taq DNA polymerase（ＳＩＧＭＡ社製） １．５μｌ
１ｍＭ dNTPS（ＳＩＧＭＡ社製） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（Foward） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（Reverse） ０．３μｌ
鋳型（３２ｎｇ／μl） １．０μｌ
５Ｕ／μｌ Taq DNA polymerase（ＳＩＧＭＡ） ０．０９μｌ
【００２７】
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中で調製し、全量が１５μｌになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cycler（TaKaRa社製）若しくはThermo Hybaid PCR Express（Thermo BioAnalysis社製）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った。ＤＮＡの変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを３５サイクル繰り返した。
<反応条件>
前熱処理： ９５℃、３．０ｍｉｎ
ＤＮＡの変性： ９５℃、１．０ｍｉｎ
アニーリング： ５２℃、１．０ｍｉｎ
伸長反応： ７２℃、１．０ｍｉｎ
【００２８】
（ｂ）KOD Dash
<反応液組成>
KOD Dash １０×PCR buffer（TOYOBO社製） １．５μｌ
２ｍＭ dNTPs（TOYOBO社製） １．５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（foward） ０．３μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌ プライマー（reverse） ０．３μｌ
鋳型（３２ｎｇ／μｌ） １．０μｌ
２．５Ｕ／μｌ KOD Dash（ＴＯＹＯＢＯ社製） ０．０７９μｌ
【００２９】
上記反応液を０．２ｍｌマイクロチューブ中で調製し、全量が１５μｌになるように滅菌水を加え、TaKaRa PCR Thermal Cyclerを用いて以下の条件でＰＣＲを行った。ＤＮＡの変性、アニーリング、伸長反応のサイクルを３４サイクル繰り返した。
<反応条件>
前熱処理： ９５℃、３．０ｍｉｎ
ＤＮＡの変性： ９５℃、１．０ｍｉｎ
アニーリング： ４２℃、１．０ｍｉｎ
伸長反応： ７２℃、１．０ｍｉｎ
【００３０】
上記各ＰＣＲ反応液を１．２％アガロースゲルを用いてＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、増幅産物を検出した。目的のバンドをゲルから切り出し、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製した。精製したＤＮＡに、１／１０容量の３ＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ及び２．５容量の９９％エタノールを加え、−８０℃で２０分間放置した後、遠心分離（２０，４００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）してＤＮＡを沈殿させた。この沈殿を真空乾燥させ、滅菌水に溶解させた。
【００３１】
（Ｂ）ジゴキシゲニンによるＤＮＡの標識
DIG DNA Labeling and Detection Kit（DIG-ELISA）nonradioactive（Roche社製）を用いて以下の方法でＰＣＲ産物を標識した。上記方法で精製したＤＮＡ溶液１０μｌ（ＤＮＡ２μｇ）を０．２ｍｌのマイクロチューブに移し、滅菌水を加えて１５μｌとし、９５℃で１０分間熱変性させた後、急冷した。２μｌのヘキサヌクレオチド混合液（Kit付属）、２μｌのdNTPラベリング混合液（Kit付属）及び１μｌのKlenow enzyme（Kit付属）を添加、混合後、３７℃で１８時間インキュベートした。２μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え、６５℃で１０分間加熱して反応を停止させ、これをプローブ溶液とした。
【００３２】
制限酵素による完全消化物を１．２％アガロースゲルを用いて、ＴＡＥ緩衝液中で電気泳動後、エチブロ染色でバンドを確認した。次にゲルを純水で洗浄し、加水分解液（０．２５Ｍ ＨＣｌ）中で２０分間振とうした。さらに変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で３０分間振とうし、０．４Ｍ ＮａＯＨで１０分間アルカリ変性を行った。Hybond-N+ ナイロン膜（アマシャム社製）をバキュームトランスファー装置（Bio CRAFT社製）にセット後、その上にアルカリ変性させたゲルを載せた。ゲルの上に０．４Ｍ ＮａＯＨをしみ込ませた海綿をのせ、その上から０．４Ｍ ＮａＯＨを注ぎ、５０〜７０ｍｍＨｇで吸引し、９０分間アルカリブロッティングした。ブロッティング終了後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍ Ｃ６Ｈ５Ｎａ３）で濯ぎ、洗浄した（２ｍｉｎ、３回）。
【００３３】
ハイブリボトルにブロッティングした膜を入れ、１５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ、０．５w/v％ブロッキング試薬（Roche社製）、０．１w/v％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、０．０２w/v％ＳＤＳ）を加え、回転式ハイブリオーブン（Lab-Line Instruments社製又はUVP Laboratory products社製）を用い、６８℃で４時間インキュベートした。上記（ｉ）で調製したプローブを９５℃で１０分間熱変性させた後、急冷し、これをハイブリボトルに加え、６８℃で一晩インキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。
【００３４】
膜をまず６８℃で洗浄し、ブロッティングした後、アルカリフォスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体−Fab フラグメント（Roche社製）と３０分間室温で反応させた。洗浄後、発色反応液（４５μｌのＮＢＴ溶液（７５ｍｇ／ｍｌ in ７０％ dimethylformamide）（ナカライテスク社製）、３５μｌのＸ−リン酸溶液（５０ｍｇ／ｍｌ in ＤＭＦ）（ナカライテスク社製）を１０ｍｌのBuffer 3に添加したもの）中で膜をインキュベートして、発色させ、バンドを検出した。
【００３５】
（iii）制限酵素消化断片のクローニング
ゲノムＤＮＡの制限酵素（EcoR I及びPvu II）の消化断片を下記の方法で精製した後、それぞれLamda ZAP II Predigested EcoRl/CIAP Treated Vector Kit（Stratagene社製）及びClone Smart Blunt Cloning Kit（Lucigen Corporation社製）を用いてクローニングを行った。
Ａ．EcoR I消化断片の精製方法
EcoR I消化産物を１ｍｌの７０％Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ、滅菌水に溶解させた。
Ｂ．Pvu II消化断片の精製方法
Pvu II消化産物に、等量のＴＥ飽和Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol（容量比２５：２４：１）（ｐＨ７．９）混合液を加えよく混合した。遠心分離（２０、４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）して、水層を新しい１．５ｍｌのマイクロチューブに分取し、等量のChloroform-Isoamylalcoholを加え混合した後、再度遠心分離（２０、４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）した。水層を分取し、これに１／１０容量の３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２）、２．５容量の９９％エタノールを加え室温で１０分程度放置し、遠心分離（２０、４００×ｇ、２０ｍｉｎ、４℃）し、ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿を７０％Ethanolで洗浄した後、真空乾燥させ滅菌水に溶解させた。
【００３６】
（iv）塩基配列の決定
EcoR I消化断片、すなわち約６ｋｂ及び８ｋｂのＤＮＡを組み込んだ形質転換プラスミドは、Sanger法によって、塩基配列を決定した。また、さらに上流部分を含むと思われる約６．５ｋｂのPvu II断片についても同様に塩基配列を決定した。
【００３７】
上記のようにして配列が決定された約６ｋｂ及び８ｋｂのアミノ酸配列及び約６．５ｋｂのアミノ酸配列について、GenomeNet及びNCBIのBLAST programを用い、nucleic acidデータベース、proteinデータベースにおける相同性検索を行ったところ、Gramicidin S synthetase IやTyrocidine A synthetase IIなどの非リボソーム性ペプチド合成酵素遺伝子の一部と高い相同性が認められた。
【００３８】
さらにproteinデータベースにおけるモチーフ検索も行った。非リボソーム性ペプチド合成酵素には１つのアミノ酸に対し、その活性化やアミノ酸同士の結合を行うペプチド合成ユニットがある。このペプチド合成ユニットには、アミノ酸同士の縮合を行うコンデンセーションドメイン（Ｃ domain）、アミノ酸の活性化を行うアデニレーションドメイン（Ａ domain）、アミノ酸を運搬するペプチジルキャリアプロテインが含まれる（ＰＣＰ domain）。セレウリドは４種のアミノ酸から構成されるため、セレウリド合成酵素には４つのユニット、さらに最後にはペプチド鎖切断に必要なチオエステラーゼ活性部位があると推定されるが、これらのドメインの存在もモチーフ検索の結果、確認された。確認されたドメイン構造を表２に示す。
【００３９】
【表２】
【実施例２】
【００４０】
〔B.cereus 嘔吐毒セレウリド合成酵素発現株のリアルタイムＰＣＲによる検出〕
続いて、開始コドンと推定される領域を含むＤＮＡ塩基配列から転写されるｍＲＮＡを検出するために有効なプライマーセットを設計、合成した。そして合成されたプライマーセット（（RT-f：配列番号１）-（RT-r：配列番号２））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、嘔吐毒産生株、擬陽性株及び非産生株の判別を試みた。
【００４１】
B.cereus ＪＣＭ２１５２（標準株：理化学研究所保存施設に保存）、ＫＦ株（嘔吐毒産生株：九州大学農学研究院で分離保存）、Ｎｏ．５５株（嘔吐毒産生株）、Ｎｏ．１１株（嘔吐毒非産生、嘔吐毒合成酵素遺伝子保有株：明治乳業（株）で分離保存）、Ｎｏ．１７株（嘔吐毒非産生株：同前）、ＮＯ．２２株（嘔吐毒非産生株：同前）Ｎｏ．４株（嘔吐毒非産生株：同前）、Ｎｏ．４２株（嘔吐毒非産生株：同前）について判別を試みた。用いたB.cereus菌株の性状を表３にまとめた。
【００４２】
【表３】
【００４３】
種々のB.cereus菌株を最適条件で培養後に集菌した菌体から、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従い、ｍＲＮＡを抽出した。なお、菌体の溶菌は５ｍｇ／ｍｌLysozyme（生化学工業社製）及び０．０２ｍｇ／ｍｌのN-Acetylmuramidase（大日本製薬社製）存在下で、３７℃５分間インキュベートした後、超音波処理（３０Ｗ、１５ｓｅｃ、３７℃）によって行った。また、ＲＮＡへのゲノムＤＮＡの混入を防ぐためにRNase-free DNase I Set（QIAGEN社製）を用いて、付属のプロトコールに従いＤＮＡ消化を４回行った。
【００４４】
抽出したＲＮＡを鋳型として、セレウリド合成酵素遺伝子のｃＤＮＡを合成した。また、常にその転写量が一定である１６ＳｒＲＮＡのｃＤＮＡも同時に合成した。ＲＮＡ１．２μｇに２種の逆転写用プライマー（（RT-R：配列番号２）又は（16SrRNA-r：配列番号１２））をそれぞれ２０ｐｍｏｌずつ混合し、RNase-free waterを加えて１２μｌとした溶液を７０℃で１０分間インキュベート後、５分間氷冷した。この溶液に、dNTP Mixture（２．５ｍＭeach）４μｌ及び付属の５×緩衝液（２５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ２、３７５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ）を用いて２０μｌの反応液を調製した。２５℃で５分間インキュベート後、２００units／μｌ ReverScript I（Wako社製）１μｌを加え、２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間インキュベートしてｃＤＮＡを合成した。
【００４５】
合成したｃＤＮＡ１μｌをそれぞれ鋳型として、（（RT-f：配列番号１）-（RT-r：配列番号２）及び（16SrRNA-f：配列番号１１）-（16SrRNA-r：配列番号１２））の両プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ装置による定量ＰＣＲにより、標的遺伝子であるセレウリド合成酵素及び１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部の増幅を行い、転写量を測定した。
【００４６】
《反応液組成》
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（forward） ０．５μｌ
２０ｐｍｏｌ／μｌプライマー（reverse） ０．５μｌ
SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa社製） １２．５μｌ
ROX Reference Dye（TaKaRa社製） ０．５μｌ
上記の反応液に全量が２５μｌになるように滅菌水を加え、Mx3000P Real-Time PCR System （STRATAGEN社製）を用いてＰＣＲを行った。熱変性、アニーリング、伸長反応を１サイクルとして４０サイクルの反応を行った。
【００４７】
《反応条件》
熱変性： ９５℃、１０ｓｅｃ
アニーリング： ５５℃、２０ｓｅｃ
伸長反応： ７２℃、３０ｓｅｃ
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅産物量（核酸量）を示す曲線を図４に示す。また、最終転写産物量を比較した図を図５に示す。
【００４９】
図４に示したように、ＫＦ株とＮｏ．５５株はほぼ同じサイクル数から急激に増幅産物量が増加したのに対し、Ｎｏ．１１株でそれよりも遅れて増幅産物量が急激に増加し、Ｎｏ．１１株の立ち上がりサイクル数は、嘔吐毒産生株と嘔吐毒非産生株との間に位置した。この結果、Ｎｏ．１１株は擬陽性株であると判断され、他のＰＣＲ法（表３参照）ではともに陽性として判断されたＫＦ株と区別することができた。また、嘔吐毒合成酵素転写産物量は、図５に示すように、Ｎｏ．５５株（中程度空胞化活性株）を１としたときに、ＫＦ株（強空胞化活性株）は約５倍多く、Ｎｏ．１１株（無空胞化活性株）は１／１０程度であった。このように、動物細胞空胞化活性は嘔吐毒合成酵素遺伝子転写量と比例した。Ｎｏ．１１株では、嘔吐毒合成酵素遺伝子の発現量が少ないために嘔吐毒産生量も微量で、動物細胞空胞化活性の測定法では非産生株かどうかの判定は困難だったものと考えられる。嘔吐毒合成酵素遺伝子転写発現の機構の違いにより、嘔吐毒産生が異なると考えられた。その他の嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有していないＪＣＭ２１５２, Ｎｏ．１７、２２、４、４２株では、嘔吐毒合成酵素転写産物は全く増幅検出されなかった。
【００５０】
このように、本発明のプライマーセットを用いたリアルタイム（定量）ＰＣＲにより、嘔吐毒合成酵素を発現する嘔吐毒産生株のみを特異的に検出できた。転写産物量は、動物細胞空胞化活性量と比例し、毒素産生量が微量なため動物細胞空胞化試験では嘔吐毒産生陰性となる菌株でも、嘔吐毒合成酵素遺伝子を保有している菌株では、本遺伝子転写産物を定量検出できた。また、本発明のプライマーセットを用いたリアルタイム（定量）ＰＣＲ法により、嘔吐毒産生能の程度も判定できる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、嘔吐毒非産生菌はもちろんのこと、嘔吐毒合成酵素遺伝子を有するが嘔吐毒を産生しないセレウス菌と嘔吐毒産生菌とを確実に判別することができる。この結果、食中毒の発生原因の早期解明、その対策等が迅速に行えるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】クローン化した嘔吐毒合成酵素遺伝子を含むと推定されるセレウス菌Ｎｏ.５５ＤＮＡのEcoRI消化産物について電気泳動を行った結果を示す図である。レーンＭは、λHind III marker、レーン１は、６ｋｂＤＮＡ断片を挿入したプラスミド、レーン２は、８ｋｂＤＮＡ断片を挿入したプラスミドについて示す。
【図２】６ｋｂ、８ｋｂのセレウス菌Ｎｏ．５５ＤＮＡのEcoRI消化産物と、（Try-Ala-1F）−（ＥＲ−２）プライマーセットで増幅される２２０５ｂｐＰＣＲ産物との関係を示す図である。
【図３】セレウス菌Ｎｏ．５５ＤＮＡの各種制限消化酵素産物についてのサザンブロッティング分析結果である電気泳動図である。レーン１はHinc IIによる消化産物、レーン２はPvu IIによる消化産物、レーン３はSph Iによる消化産物についての結果である。
【図４】本願のプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物量曲線の一例である。
【図５】嘔吐毒産生株と擬陽性嘔吐毒産生株並びに嘔吐毒非産生株における嘔吐毒合成遺伝子転写産物量を比較したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するためのセレウス菌判別方法であって、
配列番号１で示す塩基配列及び／又は配列番号２で示す塩基配列を有する核酸をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを適用することを特徴とするセレウス菌判別方法。
【請求項２】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するためのセレウス菌判別用キットであって、
少なくとも配列番号１で示す塩基配列を有する核酸及び／又は配列番号２で示す塩基配列を有する核酸と、
ＤＮＡ増幅用酵素と、
ＤＮＡ合成用試薬と、
ＤＮＡ検出用試薬とを含むことを特徴とするセレウス菌判別用キット。
【請求項３】
さらに、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＤＮＡ合成酵素を含むことを特徴とする請求項２に記載のセレウス菌判別用キット。
【請求項４】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号１で示す塩基配列を有する核酸。
【請求項５】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号２で示す塩基配列を有する核酸。
【請求項１】
嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌を判別するためのセレウス菌判別方法であって、
配列番号１で示す塩基配列及び／又は配列番号２で示す塩基配列を有する核酸をプライマーとして、ＲＴ−ＰＣＲを適用することを特徴とするセレウス菌判別方法。
【請求項２】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するためのセレウス菌判別用キットであって、
少なくとも配列番号１で示す塩基配列を有する核酸及び／又は配列番号２で示す塩基配列を有する核酸と、
ＤＮＡ増幅用酵素と、
ＤＮＡ合成用試薬と、
ＤＮＡ検出用試薬とを含むことを特徴とするセレウス菌判別用キット。
【請求項３】
さらに、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＤＮＡ合成酵素を含むことを特徴とする請求項２に記載のセレウス菌判別用キット。
【請求項４】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号１で示す塩基配列を有する核酸。
【請求項５】
ＲＴ−ＰＣＲにより増幅生産された核酸の生産量から嘔吐毒産生セレウス菌と嘔吐毒非産生セレウス菌とを判別するために用いられる配列番号２で示す塩基配列を有する核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−３１２６５９（Ｐ２００７−３１２６５９Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４４７２２（Ｐ２００６−１４４７２２）
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２４日（２００６．５．２４）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]