固体支持体及び該固体支持体上に複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法
【課題】本発明の課題は、多数の試料を迅速に質量分析する手段を提供し、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析を迅速に実施する方法を提供することである。
【解決手段】表面にカーボン層が形成された固体支持体、及び試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された物質を該固体支持体上に転写し、該固体支持体上の物質を脱離／イオン化することにより複数の物質を質量分析する方法。
【解決手段】表面にカーボン層が形成された固体支持体、及び試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された物質を該固体支持体上に転写し、該固体支持体上の物質を脱離／イオン化することにより複数の物質を質量分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル中に分離された核酸及びタンパク質等の生体分子を固体支持体に転写し、迅速に質量分析することにより分析及び解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド、タンパク質、核酸及び糖鎖など生体分子の多くは比較的少数の構成単位が一定の規則で重合してできている。例えば、ペプチドやタンパク質は２０種のＬ-α-アミノ酸がペプチド結合でつながった分子である。これらの構成単位の分子の構造は既にほとんどが明らかになっており、当然、それらの正確な分子量も明らかとなっている。従って、生体分子やその断片の分子量を正確に測定できれば、その構造（配列など）や生体内で受ける様々な修飾反応の解析に大きく寄与しうることから、質量分析法はＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析に欠かせない手段として位置づけられている。質量分析の中でもレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、ＤＮＡ、タンパク質等の巨大高分子をイオン化できるため、生体分子の有用な解析手段として注目されている。
【０００３】
レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置においては、分析したい試料部位にレーザを照射し、そこから脱離してきたイオンを電場によって加速する。
【０００４】
そうすると、ｍ／ｚ値が小さいイオン、すなわち軽いイオンほど高速で飛行して検出器に到着する。レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析は、このような質量電荷比（ｍ／ｚ値）の違いでイオンの飛行時間が異なることを利用して質量分析を行う方法である。
【０００５】
一方、質量分析によるＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析／決定には、分析対象を多数の成分に分離精製し、さらに個々の成分を制限酵素で断片化したものを分析する必要があり、非常に多数の試料を分析しなければならない。また、ＤＮＡ診断においては、多数の人間から得た試料を迅速に処理する必要がある。
【０００６】
それに対し市販されている一般的なレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、精製したそれぞれの試料をサンプルボードに配置し、これを１個ずつ質量分析していく。すなわちサンプリングした試料各点にレーザを照射し１個ずつ分析していく必要があった。従って、未精製の試料を電気泳動により分離した場合は、泳動後のゲルをバンドごとに切り出してそれぞれ精製してから１個ずつレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置によって質量分析する必要があり、多数の試料を迅速に分析することは非常に困難であった。
【０００７】
また、電気泳動した生体分子をゲルからニトロセルロース等のメンブレン上に転写してこれを分析する方法も知られているが、メンブレン上の分析においてはレーザを利用した質量分析を行うことはできず、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションを利用した蛍光検出等に限られる。なぜなら、従来使用されているニトロセルロースやＰＶＤＦ等のメンブレンは、レーザを照射するとメンブレン自体の分解が起きる可能性が高いからである。すなわち、これらのメンブレン上に転写された生体分子をそのまま上記のようなレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置で分析することは困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、多数の試料を迅速に質量分析する手段を提供し、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析を迅速に実施する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離展開された物質を、表面にカーボン層が形成された固体支持体上に転写し、これを脱離／イオン化して質量分析する方法により、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された該物質が転写保持されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（２）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写し、該メンブレン上に転写された物質をさらに転写保持することにより該物質が固定化されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（３）（１）又は（２）に記載の固体支持体上に固定化された物質に、これと相互作用する別の物質を加えて複合体を形成させてなる固体支持体。
（４）溶液中で相互作用する物質同士の複合体を形成させ、該複合体がゲル電気泳動で分離される（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（５）カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である（１）〜（４）のいずれかに記載の固体支持体。
（６）カーボン層の厚みが単分子層〜１００μｍである（１）〜（５）のいずれかに記載の固体支持体。
（７）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（８）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在し該カーボン層と共有結合しているアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（９）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１０）表面にカーボン層を有する固体支持体を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１１）転写保持された物質が核酸、ペプチド又はこれらの複合体である（１）〜（１０）のいずれかに記載の固体支持体。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の固体支持体上に転写保持された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法。
（１３）（１２）に記載の方法において使用するための、表面にカーボン層を有する固体支持体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。
【００１２】
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明では、試料をゲル電気泳動で分離し、泳動後のゲルと表面にカーボン層が形成された固体支持体とを密着させることにより、ゲル中に分離展開された分析対象物質を該固体支持体上に転写する。そして、固体支持体上に転写保持された物質を脱離／イオン化することにより複数の物質を質量分析する。
【００１４】
本発明において、固体支持体に転写保持し、分析できる物質としては、特に制限されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸及びペプチド等の生体分子が挙げられる。本明細書においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。特に高分子量の物質を分析できる点で有利である。これらの物質を含むゲル電気泳動の対象となる試料としては、特に制限されないが、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等が挙げられる。
【００１５】
電気泳動によりゲル中に分離された生体分子等の物質を転写保持するための固体支持体は、基板の表面にカーボン層を有し、これらの生体分子を転写保持できるものであれば特に制限されない。カーボン層に特定の化学修飾を施したものが好ましい。特定の化学修飾を施すことにより分析対象となる物質が保持しやすくなり、また安定に転写保持されるからである。
【００１６】
本発明において基板とはカーボン層を形成させるもととなる基材を意味し、このような基材としては、特に制限されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。ガラス又はプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものを使用することもできる。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。
【００１７】
固定化された物質について、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等によって質量分析を行う場合、固体支持体に高電圧がかかるため、基板は導電性を有するもの、例えば、ステンレス、アルミニウム、チタン等が好ましい。
【００１８】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、及びエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。
【００１９】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２０】
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。
【００２１】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００２２】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００２３】
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地固体支持体の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。
【００２４】
泳動後のゲルから物質を転写した後、直接レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等を行うため、本発明の固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。
【００２５】
核酸やペプチド等の生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された基板の表面を化学修飾することにより静電的に帯電させることが好ましい。このような表面静電化は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。
【００２６】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。又は、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００２７】
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。
【００２８】
エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００２９】
ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００３０】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００３１】
ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基を導入するのが好ましい。
【００３２】
ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートを導入するのが好ましい。金属キレートを導入した固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。
【００３３】
また、上記表面静電化は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００３４】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００３５】
静電層は、基板又はカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板又はカーボン層と共有結合させて形成してもよい。
【００３６】
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、カーボン層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。
【００３７】
また、静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又はカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００３８】
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又はカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００３９】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
【００４０】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００４１】
本発明において試料の分離に使用できる電気泳動法としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法などを挙げることができる。当業者であれば、分離の対象となる物質の種類及び分子量等から使用する電気泳動法の種類を適宜選択することができる。
【００４２】
アガロースゲル電気泳動法は、核酸を分離するために最もよく利用される手法である。アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較してゲルの網目構造が大きいため、数十〜数百ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを長さや分子構造の違いで分離することができる。ＤＮＡフラグメント全体の荷電状態は主にリン酸基の数に依存するため、移動度はＤＮＡフラグメントの大きさに比例する。電場方向を断続的に変化させて泳動すると酵母染色体などの巨大ＤＮＡを分離することもできる（パルスフィールド電気泳動）。
【００４３】
核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＤＮＡフラグメントの解析に主に用いられ、ポリアクリルアミドゲルの微細な網目構造を利用して、アガロースゲル電気泳動の場合に比較して短鎖（〜１Ｋｂｐ）のフラグメントを長さと構造に基づいて分離する手法である。ＤＮＡの立体構造（コンフォメーション）の影響を強く受けるため、ＤＮＡ鎖長の推定は二本鎖ＤＮＡを泳動する場合に限られる。一本鎖ＤＮＡは様々な構造を取ることが予想されるので移動度とそのＤＮＡ鎖長との間に相関は見られず、しばしば複数のバンドとして検出されることもある。ＤＮＡ塩基のわずかな違いでも構造変化がおこり、泳動パターンに反映される。これを利用したＤＮＡフラグメント解析手法（ＳＳＣＰ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も開発され遺伝子変異解析に利用されている。特殊な配列（繰返し配列や塩基の偏りなど）を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構造を歪めることが知られており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法はＤＮＡの構造・機能解析にも使用できる。また、尿素などを含む変性ゲル中では、一本鎖ＤＮＡも構造の影響を受けることなく鎖長に応じて分離できる。
【００４４】
ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、目的タンパク質の高次構造を変性して分子量の違いにより分離する手法である。ポリアクリルアミドゲルは、ゲル中の細孔径が密なため１００〜２００ＫＤａ以下のタンパク質やポリペプチドを分離するのに適している。操作が簡便で再現性が高いので、タンパク質の電気泳動では最もよく用いられている手法である。通常は、泳動サンプルの調製時にβ-メルカプトエタノールやＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などの還元剤を添加してタンパク質のＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を切断する。ＳＤＳの結合量によって分子の電荷がほぼ決まるため、電気泳動によりポリペプチド分子を分子量に従って分離することができる。ＳＤＳは強力な陰イオン界面活性剤なので、膜タンパク質などの不溶性タンパク質の可溶化にも適している。
【００４５】
等電点電気泳動は、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行う泳動手法である。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はｐＨ条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるｐＨの値が等電点となる。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にｐＨ勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のｐＩと同じｐＨに向かってｐＨ勾配を形成したゲル中を移動する。ｐＨ勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてｐＨ勾配を形成する手法と、様々なｐＩの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する手法（ＩＰＧ法：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）とがあり、プロテオミクス研究では、分離能、再現性、添加許容量ともに優れるＩＰＧ法が主に用いられている。ＩＰＧ法専用のプレキャストゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｇｅｌ）が市販されている。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ｐＨ単位の違いでも分離することができる。
【００４６】
二次元電気泳動法は、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する方法である。一般的に一次元目は等電点電気泳動によりタンパク質を分離し、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量で分離する。いずれの手法も分離能が非常に高いので、細胞全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができる。再現性と解像度に優れた固定化ｐＨ勾配法（ＩＰＧ法）を一次元目泳動に用いることが一般的である。また、より多くのスポットを得るために、幅広いｐＨレンジの分離結果を基にしてＮａｒｒｏｗ ｐＨ ＩＰＧゲルで目的ｐＨ部分のみを分離したり、２０ｃｍ以上の大型ゲルを用いて二次元目電気泳動を行うこともできる。
【００４７】
本発明においては、ＤＮＡ、ＲＮＡを分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。これらの電気泳動法は、当技術分野における当業者が通常使用する方法で実施することができる。
【００４８】
電気泳動後、ゲルを、使用する固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された分析対象物質を本発明の固体支持体上に転写する固体支持体への転写方法としては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法を使用することができる。例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティング及び電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。
【００４９】
エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式及びセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、当技術分野で通常用いられているエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。
【００５０】
以下に、試料中のタンパク質を分析する場合の本発明における電気泳動及び転写の一態様を示す。まず、試料中のタンパク質を可溶化する。すなわち、試料に存在するタンパク質分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってタンパク質を効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。続いて、ゲルを陰極側、転写用固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧で一定時間転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、及び陽極と固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、ホウ酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。Ｔｒｉｓ及びε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。
【００５１】
本発明の別の態様においては、対象物質を電気泳動後のゲルから従来技術において使用されるようなメンブレンに転写し、さらに該メンブレンから本発明の固体支持体上に転写することにより、ゲル中に分離された物質を固体支持体上に転写保持することもできる。この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロン及びポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写及びメンブレンから固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから固体支持体への転写においては、エレクロトブロッティング装置を利用するのが好ましい。
【００５２】
本発明の別の態様においては、電気泳動によって分離された物質を固体支持体上に転写保持し、この物質と相互作用する物質を反応させて複合体を形成し、形成した複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。既に述べたような方法により、タンパク質が固体支持体上に転写保持される場合は、該タンパク質に対する抗体を反応させて複合体を形成し、該複合体にレーザに照射等を行ってイオン化することにより質量分析を行うことができる。また、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸が固体支持体上に転写保持される場合は、該核酸に対して相補的な核酸を固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせ、形成した二本鎖をイオン化して質量分析を行うことができる。その他の相互作用としては、例えば、酵素反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等を利用することができる。相互作用によって形成した複合体の質量分析を行うことにより、プローブ分子に特異的に相互作用したターゲット分子の塩基配列或いはアミノ酸配列を解析することができる。
【００５３】
本発明の別の態様においては、相互作用する物質を分析することを目的として、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を固体支持体上に転写保持し、固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。
【００５４】
固体支持体上に固定化された物質は、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等の手段によりそのまま質量分析を実施することができる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなα又はβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、単一又は多重四重極、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオン捕獲、高周波ならびにイオン捕獲／飛行時間等が挙げられ、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、高周波及びイオン捕獲／飛行時間を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式もしくはそれらの組合せを含む分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。生体分子などの高分子物質をイオン化し、及び固体支持体上の複数の物質を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析を利用するのが好ましい。
【００５５】
以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた質量分析の手順を説明する。
【００５６】
分析対象物質が固定化された本発明の固体支持体に、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などのマトリックスを添加し、乾燥させる。次ぎに該固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセス及びデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。このデータから相互作用したタンパク質の正確な質量を求めることができる。
【００５７】
質量分析に続いてタンパク質のアミノ酸配列分析及び同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、相互作用したタンパク質のアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、タンパク質を同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳに分析対象物質が固定化された固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、相互作用したタンパク質を同定することができる。
【００５８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）Ｔｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
固体支持体の作成
７６ｍｍ×２６ｍｍ×１．１ｍｍのスライドガラスにＴｉ層及びその上にＰｔ層をマグネトロンスパッタリングにより形成した。スパッタリングの条件は以下の通りである。生成した金属層の厚みは、Ｔｉ層及びＰｔ層それぞれが１００ｎｍであった。
【００６０】
【表１】
【００６１】
そして、金属層を形成した基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。
【００６２】
【表２】
【００６３】
上記のようにして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成した後、表面を塩素ガス中で１分間紫外線を照射することにより塩素化し、アンモニアガス中で１０分間紫外線を照射することによりアミノ化して固体支持体１を作成した。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳動
Ｃｙ３-プロテインＡ（１．５μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）、大腸菌タンパク質（０．５μｇ）及びマーカー（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、０．５μｌ、ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を試料として用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−７３００型）を用いて電気泳動を行った。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファー（ｐＨ８.３）を用い、泳動は２００Ｖで３５分間行った。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。
【００６５】
エレクトロブロッティング
泳動後のポリアクリルアミドゲルを、あらかじめ冷却しておいた転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％メタノール）に３０分間浸漬し、平衡化した。次いで、ポリアクリルアミドゲルを固体支持体１に載る大きさに切り取って、該固体支持体と密着させ、ポリアクリルアミドゲルを陰極、固体支持体を陽極に設置し、下記条件で通電した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
蛍光強度の測定
タンパク質転写後の固体支持体１の蛍光強度をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で測定したところ、蛍光強度が２８２７０として測定され、Ｃｙ３−プロテインＡが固体支持体表面に固定化されたことが確認された（図２）続いて、該固体支持体をＰＢＳで１０分間洗浄した後、同様に蛍光強度を測定したところ、蛍光強度は９７６６であり、約１／３程度まで低下した（図３）。ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）で１時間ブロッキングし、蛍光強度を測定したところ蛍光強度に変化はなかった。次ぎに、５００μｌの０．０５μｇ／μｌ Ｃｙ３−ＩｇＧを添加して室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで室温にて１２時間洗浄し、蛍光強度を測定した（図４）。蛍光強度は１６４４８であり、増加していることから、プロテインＡとＩｇＧが結合したこと、すなわち、転写保持されたタンパク質の結合能が維持されたことがわかる。
【００６８】
（実施例２）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
ステンレス−ＤＬＣ固体支持体の作成
ステンレス基板にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ステンレス基板は、平滑性と蛍光バックグラウンドを下げるために、予めバフ研磨後、更に電解研磨を施した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。また、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入することにより固体支持体２を作成した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
Ｃｙ３−プロテインＡ（０．２μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図５）。
【００７１】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファーＢ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体２の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｃ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を図６のように重ねてセミドライブロッティング装置に設置し、８Ｖ、４ｍＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた後、転写後の固体支持体とゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図７）。
【００７２】
(1)は、陰極側及び陽極側のろ紙の双方にイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルからほとんど抜け出ておらず、また固体支持体にも転写保持されていなかった。
【００７３】
(2)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙IIに転写用バッファーＢ、ろ紙IIIに転写用バッファーＡを含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルから多少減少しているが、固体支持体には転写保持されていなかった。
【００７４】
(3)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。ゲルは、固体支持体に重ねる前に、水分をふき取った。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上には形状は良くないが転写保持が見られた。
【００７５】
(4)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませ、ゲルの水分をふきとらずに固体支持体に重ねて転写を行った場合の結果である。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上にはＣｙ３−プロテインＡが形状良く転写保持されていた。
【００７６】
以上から、ゲル中のタンパク質の固体支持体への転写においては、陰極側のろ紙には転写用バッファーを、陽極側のろ紙にはイオン交換水を含ませ、泳動後のゲルの水分をふきとることなく転写を行うことが好ましいと考えられる。
【００７７】
（実施例３）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）及びＣｙ３−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図８）。なお、Ｃｙ３-ＩｇＡの泳動については、１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００７８】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）、Ｃ２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１又はＣ２を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図９）。
【００７９】
その結果、固体支持体への転写の際に陰極側のろ紙に含ませる転写用バッファーは、Ｃ１、すなわち、ε−アミノカプロン酸の濃度が４０ｍＭのものの方が転写保持効率がよいことが分かった。
【００８０】
（実施例４）ＰＶＤＦメンブレンからＴｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質転写
実施例１と同様にして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成し、イオン化蒸着装置を用いてアンモニアプラズマ中で処理することにより表面をアミノ化して固体支持体３を作成した。
【００８１】
また実施例１と同様にしてポリアクリルアミドゲルでＣｙ３−プロテインＡを電気泳動した。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影を行った（図１０）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。
【００８２】
転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｂ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）及びＣ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）を調製した。泳動後のゲルを取り出し、約２００ｍｌの転写用バッファーＢに浸して、５分間軽く振盪した。予めゲルの大きさに切っておいたＰＶＤＦメンブレン（ＡＴＴＯ社製）を少量のメタノールに５秒間浸した後、約１００ｍｌの転写用バッファーＢに浸し、５分以上振盪した。転写用バッファーＡ、Ｂ又はＣの各２００ｍｌに、予めゲルの大きさに切っておいたろ紙をそれぞれ２枚、１枚及び３枚ずつ浸した。続いて、セミドライブロッティング装置（日本エイドー）に、上記のろ紙、ゲル及びＰＶＤＦメンブレンを、気泡が入らないように図１１のように重ね合わせて設置し、電圧１５Ｖで６０分間通電した。転写後、ＰＶＤＦメンブレンを２００ｍｌのＰＢＳに浸して、５分間浸透した。
【００８３】
転写後のＰＶＤＦメンブレンを固体支持体３に載る大きさに切り、図１２のような順番で重ね合わせ、３５ｇ／ｃｍ2の重しを載せた。室温にて１時間置き、メンブレン上のＣｙ３−プロテインＡを固体支持体３上に転写した。続いて該固体支持体３を、ＰＢＳで室温にて２０分間洗浄した後、乾燥させた。そして、固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。撮影画像を図１３に示す。画像中に囲った部分がメンブレンを密着させた部分である。対応する位置に蛍光が検出されたことから、Ｃｙ３-プロテインＡが固体支持体上に転写保持されていることがわかる。
【００８４】
（実施例５）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３ラベルした酵母タンパク質（３００μｇ／レーン）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（１））。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００８５】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、固体支持体２にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せた。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２を超純水で洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（２））。
その結果、転写効率が約４０％であり、十分転写ができていることが判明した。
【００８６】
（実施例６）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）とＣｙ５−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液中で混合し、実施例１と同様にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００８７】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。
その結果、転写後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度は、泳動終了後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度に比べて約３５％であった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。
【００８９】
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。また、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成することができるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】実施例１において、Ｃｙ３-プロテインＡ及び大腸菌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図２】実施例１において、電気泳動後のゲルを固体支持体１に転写し、転写後の固体支持体の蛍光強度をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図３】実施例１において、電気泳動後のゲルを転写した固体支持体１を、ＰＢＳで１０分間洗浄し、乾燥した後、画像撮影したものである。
【図４】実施例１において、電気泳動後のゲルを転写した固体支持体１を、ＰＢＳで１０分間洗浄し、さらにブロッキング試薬で１時間ブロッキングし、その後Ｃｙ３−ＩｇＧを添加して室温で１時間反応させ、ＰＢＳで１２時間洗浄し（室温）、画像撮影したものである。
【図５】実施例２において、Ｃｙ３-プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図６】実施例２において、タンパク質を電気泳動後のゲルから固体支持体２に転写するときの配置を表したものである。
【図７】実施例２において、電気泳動後のゲルからタンパク質を転写した固体支持体２を、ＰＢＳで３０分間洗浄して乾燥したもの及び転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図８】実施例３において、Ｃｙ３-プロテインＡ及びＣｙ３−ＩｇＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図９】実施例３において、電気泳動後のゲルからタンパク質を転写した固体支持体２を、ＰＢＳで３０分間洗浄して乾燥したもの及び転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１０】実施例４において、Ｃｙ３-プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、ゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１１】実施例４において、電気泳動した後のゲルからタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写するときの配置を表したものである。
【図１２】実施例４において、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンから固体支持体３に転写するときの配置を表したものである。
【図１３】実施例４において、ＰＶＤＦメンブレンからタンパク質が転写された固体支持体３を、ＰＢＳで２０分間洗浄し、乾燥した後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１４】図１４（１）は実施例５において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものであり、図１４（２）は、タンパク質が転写された固体支持体を、イオン交換水で３０分間洗浄し、乾燥した後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲル中に分離された核酸及びタンパク質等の生体分子を固体支持体に転写し、迅速に質量分析することにより分析及び解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド、タンパク質、核酸及び糖鎖など生体分子の多くは比較的少数の構成単位が一定の規則で重合してできている。例えば、ペプチドやタンパク質は２０種のＬ-α-アミノ酸がペプチド結合でつながった分子である。これらの構成単位の分子の構造は既にほとんどが明らかになっており、当然、それらの正確な分子量も明らかとなっている。従って、生体分子やその断片の分子量を正確に測定できれば、その構造（配列など）や生体内で受ける様々な修飾反応の解析に大きく寄与しうることから、質量分析法はＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析に欠かせない手段として位置づけられている。質量分析の中でもレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、ＤＮＡ、タンパク質等の巨大高分子をイオン化できるため、生体分子の有用な解析手段として注目されている。
【０００３】
レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置においては、分析したい試料部位にレーザを照射し、そこから脱離してきたイオンを電場によって加速する。
【０００４】
そうすると、ｍ／ｚ値が小さいイオン、すなわち軽いイオンほど高速で飛行して検出器に到着する。レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析は、このような質量電荷比（ｍ／ｚ値）の違いでイオンの飛行時間が異なることを利用して質量分析を行う方法である。
【０００５】
一方、質量分析によるＤＮＡ、タンパク質等の生体分子の構造解析／決定には、分析対象を多数の成分に分離精製し、さらに個々の成分を制限酵素で断片化したものを分析する必要があり、非常に多数の試料を分析しなければならない。また、ＤＮＡ診断においては、多数の人間から得た試料を迅速に処理する必要がある。
【０００６】
それに対し市販されている一般的なレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置は、精製したそれぞれの試料をサンプルボードに配置し、これを１個ずつ質量分析していく。すなわちサンプリングした試料各点にレーザを照射し１個ずつ分析していく必要があった。従って、未精製の試料を電気泳動により分離した場合は、泳動後のゲルをバンドごとに切り出してそれぞれ精製してから１個ずつレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置によって質量分析する必要があり、多数の試料を迅速に分析することは非常に困難であった。
【０００７】
また、電気泳動した生体分子をゲルからニトロセルロース等のメンブレン上に転写してこれを分析する方法も知られているが、メンブレン上の分析においてはレーザを利用した質量分析を行うことはできず、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションを利用した蛍光検出等に限られる。なぜなら、従来使用されているニトロセルロースやＰＶＤＦ等のメンブレンは、レーザを照射するとメンブレン自体の分解が起きる可能性が高いからである。すなわち、これらのメンブレン上に転写された生体分子をそのまま上記のようなレーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析装置で分析することは困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、多数の試料を迅速に質量分析する手段を提供し、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析を迅速に実施する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離展開された物質を、表面にカーボン層が形成された固体支持体上に転写し、これを脱離／イオン化して質量分析する方法により、上記課題が解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された該物質が転写保持されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（２）試料中の物質をゲル電気泳動で分離後、ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写し、該メンブレン上に転写された物質をさらに転写保持することにより該物質が固定化されてなる、表面にカーボン層を有する固体支持体。
（３）（１）又は（２）に記載の固体支持体上に固定化された物質に、これと相互作用する別の物質を加えて複合体を形成させてなる固体支持体。
（４）溶液中で相互作用する物質同士の複合体を形成させ、該複合体がゲル電気泳動で分離される（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（５）カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である（１）〜（４）のいずれかに記載の固体支持体。
（６）カーボン層の厚みが単分子層〜１００μｍである（１）〜（５）のいずれかに記載の固体支持体。
（７）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（８）固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在し該カーボン層と共有結合しているアミノ基含有化合物をさらに含む（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（９）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１０）表面にカーボン層を有する固体支持体を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られる（１）〜（６）のいずれかに記載の固体支持体。
（１１）転写保持された物質が核酸、ペプチド又はこれらの複合体である（１）〜（１０）のいずれかに記載の固体支持体。
（１２）（１）〜（１１）のいずれかに記載の固体支持体上に転写保持された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する方法。
（１３）（１２）に記載の方法において使用するための、表面にカーボン層を有する固体支持体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。
【００１２】
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明では、試料をゲル電気泳動で分離し、泳動後のゲルと表面にカーボン層が形成された固体支持体とを密着させることにより、ゲル中に分離展開された分析対象物質を該固体支持体上に転写する。そして、固体支持体上に転写保持された物質を脱離／イオン化することにより複数の物質を質量分析する。
【００１４】
本発明において、固体支持体に転写保持し、分析できる物質としては、特に制限されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸及びペプチド等の生体分子が挙げられる。本明細書においてペプチドとは、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。特に高分子量の物質を分析できる点で有利である。これらの物質を含むゲル電気泳動の対象となる試料としては、特に制限されないが、細胞抽出物、菌体抽出物、無細胞系合成産物、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物、酵素処理産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド等が挙げられる。
【００１５】
電気泳動によりゲル中に分離された生体分子等の物質を転写保持するための固体支持体は、基板の表面にカーボン層を有し、これらの生体分子を転写保持できるものであれば特に制限されない。カーボン層に特定の化学修飾を施したものが好ましい。特定の化学修飾を施すことにより分析対象となる物質が保持しやすくなり、また安定に転写保持されるからである。
【００１６】
本発明において基板とはカーボン層を形成させるもととなる基材を意味し、このような基材としては、特に制限されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；上記金属とセラミックスとの積層体；ガラス；シリコン；繊維；木材；紙；ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック；及びプラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体を挙げることができる。ガラス又はプラスチック等の表面にプラチナ、チタン等からなる金属層を形成させたものを使用することもできる。金属層の形成は、スパッタリング、真空蒸着、イオンビーム蒸着、電気めっき、無電解めっき等により実施することができる。
【００１７】
固定化された物質について、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等によって質量分析を行う場合、固体支持体に高電圧がかかるため、基板は導電性を有するもの、例えば、ステンレス、アルミニウム、チタン等が好ましい。
【００１８】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、無定形炭素、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム又は炭化バナジウム等からなる層を挙げることができ、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）層が好ましい。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、ＵＶ吸収がないため検出系ＵＶに対して透明性である点、及びエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。
【００１９】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｖａｐｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００２０】
高周波プラズマＣＶＤ法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にＤＬＣ（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス１〜９９体積％と残りメタンガス９９〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりＤＬＣ層を形成してもよい。
【００２１】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００２２】
レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００２３】
本発明の固体支持体表面のカーボン層の厚さは、通常、単分子層〜１００μｍ程度であり、薄すぎると下地固体支持体の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは２ｎｍ〜1μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。なお、固体支持体のすべてが炭素材料で構成されていてもよい。
【００２４】
泳動後のゲルから物質を転写した後、直接レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等を行うため、本発明の固体支持体の形状は平板状であることが好ましい。そのサイズは、特に制限されないが、通常は、幅１０〜２００ｍｍ×長さ１０〜２００ｍｍ×厚み０．１〜２０ｍｍ程度である。
【００２５】
核酸やペプチド等の生体分子を固定化するためには、カーボン層が形成された基板の表面を化学修飾することにより静電的に帯電させることが好ましい。このような表面静電化は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基を導入することが挙げられる。また、ニッケルキレート、コバルトキレート等の金属キレートを導入することも有効である。
【００２６】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。又は、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００２７】
カルボキシル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。
【００２８】
エポキシ基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００２９】
ホルミル基の導入は、例えば、上記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００３０】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、上記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００３１】
ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸を保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基を導入するのが好ましい。
【００３２】
ペプチドを保持する場合は、アミノ基、カルボジイミド基、エポキシ基、ホルミル基、金属キレートを導入するのが好ましい。金属キレートを導入した固体支持体を使用すると、ポリヒスチジン配列等の金属イオンと親和性のある標識を有するペプチドを効果的かつ安定に固定化することができる。金属キレートの導入は、例えば、カーボン層が形成された基板を塩素化し、次いでこれをアミノ化した後、クロロ酢酸等のハロカルボン酸を添加してキレート配位子を導入することにより実施できる。ポリヒスチジン配列等の標識は、当業者に公知の方法により導入することができる。
【００３３】
また、上記表面静電化は、表面カーボン層上に静電層を形成することにより行ってもよい。該静電層は、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００３４】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００３５】
静電層は、基板又はカーボン層と共有結合させずに形成してもよく、基板又はカーボン層と共有結合させて形成してもよい。
【００３６】
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、カーボン層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、カーボン層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。
【００３７】
また、静電層を基板又はカーボン層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又はカーボン層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００３８】
静電層を基板又はカーボン層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又はカーボン層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００３９】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
【００４０】
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００４１】
本発明において試料の分離に使用できる電気泳動法としては、特に制限されないが、例えば、アガロースゲル電気泳動法、ｓｉｅｖｉｎｇアガロースゲル電気泳動法、変性アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、等電点ゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法などを挙げることができる。当業者であれば、分離の対象となる物質の種類及び分子量等から使用する電気泳動法の種類を適宜選択することができる。
【００４２】
アガロースゲル電気泳動法は、核酸を分離するために最もよく利用される手法である。アガロースゲルはポリアクリルアミドゲルと比較してゲルの網目構造が大きいため、数十〜数百ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを長さや分子構造の違いで分離することができる。ＤＮＡフラグメント全体の荷電状態は主にリン酸基の数に依存するため、移動度はＤＮＡフラグメントの大きさに比例する。電場方向を断続的に変化させて泳動すると酵母染色体などの巨大ＤＮＡを分離することもできる（パルスフィールド電気泳動）。
【００４３】
核酸のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＤＮＡフラグメントの解析に主に用いられ、ポリアクリルアミドゲルの微細な網目構造を利用して、アガロースゲル電気泳動の場合に比較して短鎖（〜１Ｋｂｐ）のフラグメントを長さと構造に基づいて分離する手法である。ＤＮＡの立体構造（コンフォメーション）の影響を強く受けるため、ＤＮＡ鎖長の推定は二本鎖ＤＮＡを泳動する場合に限られる。一本鎖ＤＮＡは様々な構造を取ることが予想されるので移動度とそのＤＮＡ鎖長との間に相関は見られず、しばしば複数のバンドとして検出されることもある。ＤＮＡ塩基のわずかな違いでも構造変化がおこり、泳動パターンに反映される。これを利用したＤＮＡフラグメント解析手法（ＳＳＣＰ：Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も開発され遺伝子変異解析に利用されている。特殊な配列（繰返し配列や塩基の偏りなど）を含む二本鎖ＤＮＡフラグメントはＤＮＡ構造を歪めることが知られており、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法はＤＮＡの構造・機能解析にも使用できる。また、尿素などを含む変性ゲル中では、一本鎖ＤＮＡも構造の影響を受けることなく鎖長に応じて分離できる。
【００４４】
ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、目的タンパク質の高次構造を変性して分子量の違いにより分離する手法である。ポリアクリルアミドゲルは、ゲル中の細孔径が密なため１００〜２００ＫＤａ以下のタンパク質やポリペプチドを分離するのに適している。操作が簡便で再現性が高いので、タンパク質の電気泳動では最もよく用いられている手法である。通常は、泳動サンプルの調製時にβ-メルカプトエタノールやＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）などの還元剤を添加してタンパク質のＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を切断する。ＳＤＳの結合量によって分子の電荷がほぼ決まるため、電気泳動によりポリペプチド分子を分子量に従って分離することができる。ＳＤＳは強力な陰イオン界面活性剤なので、膜タンパク質などの不溶性タンパク質の可溶化にも適している。
【００４５】
等電点電気泳動は、タンパク質の等電点（ｐＩ）の違いを利用して分離し、目的タンパク質の等電点測定や分析を行う泳動手法である。タンパク質を構成しているアミノ酸側鎖やアミノ末端、カルボキシル末端の電荷はｐＨ条件によって変化し、電荷の総和がゼロになるｐＨの値が等電点となる。等電点電気泳動を行うには、泳動ゲル中にｐＨ勾配を作る必要がある。サンプルを泳動ゲルに添加して電場をかけると、それぞれのタンパク質は固有のｐＩと同じｐＨに向かってｐＨ勾配を形成したゲル中を移動する。ｐＨ勾配ゲルの作製には、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけてｐＨ勾配を形成する手法と、様々なｐＩの側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する手法（ＩＰＧ法：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ）とがあり、プロテオミクス研究では、分離能、再現性、添加許容量ともに優れるＩＰＧ法が主に用いられている。ＩＰＧ法専用のプレキャストゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ Ｇｅｌ）が市販されている。キャリアアンフォライトを用いる等電点泳動の分離能は０．０１〜０．０２ｐＨ単位で、ＩＰＧ法では０．００１ｐＨ単位の違いでも分離することができる。
【００４６】
二次元電気泳動法は、二段階の電気泳動によりタンパク質を二次元に分離する方法である。一般的に一次元目は等電点電気泳動によりタンパク質を分離し、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子量で分離する。いずれの手法も分離能が非常に高いので、細胞全タンパク質を数千以上にもおよぶスポットに分離することができる。再現性と解像度に優れた固定化ｐＨ勾配法（ＩＰＧ法）を一次元目泳動に用いることが一般的である。また、より多くのスポットを得るために、幅広いｐＨレンジの分離結果を基にしてＮａｒｒｏｗ ｐＨ ＩＰＧゲルで目的ｐＨ部分のみを分離したり、２０ｃｍ以上の大型ゲルを用いて二次元目電気泳動を行うこともできる。
【００４７】
本発明においては、ＤＮＡ、ＲＮＡを分離する場合は、アガロースゲル電気泳動法を使用するのが好ましく、ペプチドを分離する場合は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及び二次元電気泳動法を使用するのが好ましい。これらの電気泳動法は、当技術分野における当業者が通常使用する方法で実施することができる。
【００４８】
電気泳動後、ゲルを、使用する固体支持体に載る大きさに切り出し、ゲルと固体支持体とを密着させて、ゲル中に分離された分析対象物質を本発明の固体支持体上に転写する固体支持体への転写方法としては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法を使用することができる。例えば、毛細管現象を利用したキャピラリー式ブロッティング、ポンプにより吸引するバキューム式ブロッティング及び電気的手法を用いるエレクトロブロッティングが挙げられる。核酸を転写する場合は、キャピラリー式ブロッティングを使用するのが好ましく、ペプチドを転写する場合は、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。
【００４９】
エレクトロブロッティングにおいては、タンク式、セミドライ式及びセミウェット式のいずれも使用することができるが、バッファー使用量の少なさや、反応時間の短さ等の観点からセミドライ式エレクトロブロッティングを使用するのが好ましい。ブロッティング装置としては、当技術分野で通常用いられているエレクトロブロッティング装置を使用することができる。エレクトロブロッティングにおける通電条件は、定電圧、２００Ｖ以下、好ましくは０．１〜１０Ｖで、１〜５００分間、好ましくは５〜１００分間が好ましい。ただし、電圧を金属基板の酸化電位より高くすると金属の溶出がおこるため、基板金属の酸化電位より低い電圧で行うのが好ましい。
【００５０】
以下に、試料中のタンパク質を分析する場合の本発明における電気泳動及び転写の一態様を示す。まず、試料中のタンパク質を可溶化する。すなわち、試料に存在するタンパク質分解酵素を失活させるとともに、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールによってタンパク質を効果的に変性させる目的で沸騰水中で一定時間熱処理する。次にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの各レーンに一定量注入し、ＳＤＳを含むグリシン−トリスバッファーを泳動用バッファーとして、一定電圧で一定時間泳動させる。泳動後、ゲルをあらかじめ冷却しておいたメタノールを含むグリシン−トリスバッファー（転写用バッファー）に一定時間浸漬し、平衡化する。続いて、ゲルを陰極側、転写用固体支持体を陽極側としてエレクトロブロッティング装置に装着する。転写槽には転写用バッファーを加え、氷冷下、定電圧で一定時間転写を行う。このとき、転写効率を上げる観点から、陰極とゲルの間、及び陽極と固体支持体の間に、バッファーやイオン交換水を含ませたろ紙を配置するのが好ましい。陰極側のろ紙に含ませるバッファーとしては、Ｔｒｉｓ、ε−アミノカプロン酸、酢酸、ＥＤＴＡ、リン酸、ホウ酸、酒石酸、ＳＤＳ等を含むものが挙げられる。Ｔｒｉｓ及びε−アミノカプロン酸を含むバッファーを用いる場合、ε−アミノカプロン酸の濃度は通常、１０００ｍＭ以下、好ましくは１μＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは１〜３００ｍＭである。陽極側のろ紙には、イオン交換水を含ませるのが好ましい。
【００５１】
本発明の別の態様においては、対象物質を電気泳動後のゲルから従来技術において使用されるようなメンブレンに転写し、さらに該メンブレンから本発明の固体支持体上に転写することにより、ゲル中に分離された物質を固体支持体上に転写保持することもできる。この場合に使用できるメンブレンの材質としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロン及びポジティブチャージナイロン等が挙げられる。タンパク質の転写においては、タンパク質の結合能力が最も高いＰＶＤＦを使用するのが好ましく、核酸の転写においても核酸の非特異吸着が少ないＰＶＤＦを使用するのが好ましい。泳動物質のゲルからメンブレンへの転写及びメンブレンから固体支持体への転写は、上記と同様の方法により実施できる。ゲルからメンブレンへの転写においては、エレクトロブロッティングを使用するのが好ましく、エレクトロブロッティングにおける通電条件は、０．１〜５０Ｖで、５〜１２０分間程度が好ましい。メンブレンから固体支持体への転写においては、エレクロトブロッティング装置を利用するのが好ましい。
【００５２】
本発明の別の態様においては、電気泳動によって分離された物質を固体支持体上に転写保持し、この物質と相互作用する物質を反応させて複合体を形成し、形成した複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。質量分析方法として、電気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する手法を使用できる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。既に述べたような方法により、タンパク質が固体支持体上に転写保持される場合は、該タンパク質に対する抗体を反応させて複合体を形成し、該複合体にレーザに照射等を行ってイオン化することにより質量分析を行うことができる。また、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸が固体支持体上に転写保持される場合は、該核酸に対して相補的な核酸を固体支持体上の核酸にハイブリダイズさせ、形成した二本鎖をイオン化して質量分析を行うことができる。その他の相互作用としては、例えば、酵素反応、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用等を利用することができる。相互作用によって形成した複合体の質量分析を行うことにより、プローブ分子に特異的に相互作用したターゲット分子の塩基配列或いはアミノ酸配列を解析することができる。
【００５３】
本発明の別の態様においては、相互作用する物質を分析することを目的として、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成した後、これを電気泳動に付し、電気泳動によって分離された複合体を固体支持体上に転写保持し、固体支持体上の複合体をイオン化することによって質量分析を行うこともできる。このような分析方法は、溶液中で複合体形成を行うものであるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。
【００５４】
固体支持体上に固定化された物質は、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析等の手段によりそのまま質量分析を実施することができる。質量分析する際に使用できるイオン化法の様式としては、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法、光イオン化法、放射性同位体から放射されるＬＥＴの大きなα又はβ線を使用するイオン化法、２次イオン化法、高速原子衝突イオン化法、電界電離イオン化法、表面電離イオン化法、化学イオン化（ＣＩ）法、フィールドイオン化（ＦＩ）法、火花放電によるイオン化法等が挙げられ、マトリックス補助レーザ脱着（ＭＡＬＤＩ）法、電子衝撃によるイオン化（ＥＩ）法が好ましい。また、分離様式としては、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、単一又は多重四重極、単一又は多重磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオン捕獲、高周波ならびにイオン捕獲／飛行時間等が挙げられ、線形又は非線形反射飛行時間（ＴＯＦ）、高周波及びイオン捕獲／飛行時間を用いるものが好ましい。上記のようなイオン化法と分離様式もしくはそれらの組合せを含む分離様式、電気的記録ならびに写真記録のような検出様式とを組み合わせることにより質量分析を実施することができる。このような質量分析装置は、イオンの生成・分離・検出の三つの異なる働きを持つものである。生体分子などの高分子物質をイオン化し、及び固体支持体上の複数の物質を分析するという観点からは、レーザ脱離／イオン化−飛行時間型質量分析を利用するのが好ましい。
【００５５】
以下に本発明の一態様として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた質量分析の手順を説明する。
【００５６】
分析対象物質が固定化された本発明の固体支持体に、α-シアノヒドロキシ桂皮酸、シナピン酸などのマトリックスを添加し、乾燥させる。次ぎに該固体支持体を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのフラットターゲットに設置する。そして、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア等を用いて質量分析を開始する。ＭａｓｓＬｙｎｘによって測定と解析の全てをコントロールすることができる。測定時に、自動測定のパラメーターファイルと、測定後に行うデータプロセス及びデータベース解析のプロセスファイル、ならびに試料リストなどを作成する。データプロセシングは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウエアを用いてＭａｓｓＬｙｎｘ上で行うことができる。取り込まれたデータから質量スペクトルを作成し、作成されたスペクトルは、ＭａｘＥｎｔ ３ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）により、精度を高めた後、モノアイソトピック・ピークデータに変換する。続いてキャリブレーションを行い質量誤差約５０ｐｐｍの最終データとする。このデータから相互作用したタンパク質の正確な質量を求めることができる。
【００５７】
質量分析に続いてタンパク質のアミノ酸配列分析及び同定を行うことができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの分析モードをポストソースディケイ(ＰＳＤ)スペクトルを検出できるモードにし、相互作用したタンパク質のアミノ酸配列を分析する。続いて、アミノ酸配列データを基にＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースを検索し、タンパク質を同定する。あるいは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳやＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳに分析対象物質が固定化された固体支持体を設置してアミノ酸配列を分析し、相互作用したタンパク質を同定することができる。
【００５８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
（実施例１）Ｔｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
固体支持体の作成
７６ｍｍ×２６ｍｍ×１．１ｍｍのスライドガラスにＴｉ層及びその上にＰｔ層をマグネトロンスパッタリングにより形成した。スパッタリングの条件は以下の通りである。生成した金属層の厚みは、Ｔｉ層及びＰｔ層それぞれが１００ｎｍであった。
【００６０】
【表１】
【００６１】
そして、金属層を形成した基板上にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。
【００６２】
【表２】
【００６３】
上記のようにして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成した後、表面を塩素ガス中で１分間紫外線を照射することにより塩素化し、アンモニアガス中で１０分間紫外線を照射することによりアミノ化して固体支持体１を作成した。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による電気泳動
Ｃｙ３-プロテインＡ（１．５μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）、大腸菌タンパク質（０．５μｇ）及びマーカー（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、０．５μｌ、ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を試料として用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用装置（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−７３００型）を用いて電気泳動を行った。泳動用のゲルとしては、１０％ポリアクリルアミドゲルを使用した。泳動用バッファーは０.１％ＳＤＳを含むグリシン―トリスバッファー（ｐＨ８.３）を用い、泳動は２００Ｖで３５分間行った。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。
【００６５】
エレクトロブロッティング
泳動後のポリアクリルアミドゲルを、あらかじめ冷却しておいた転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％メタノール）に３０分間浸漬し、平衡化した。次いで、ポリアクリルアミドゲルを固体支持体１に載る大きさに切り取って、該固体支持体と密着させ、ポリアクリルアミドゲルを陰極、固体支持体を陽極に設置し、下記条件で通電した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
蛍光強度の測定
タンパク質転写後の固体支持体１の蛍光強度をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で測定したところ、蛍光強度が２８２７０として測定され、Ｃｙ３−プロテインＡが固体支持体表面に固定化されたことが確認された（図２）続いて、該固体支持体をＰＢＳで１０分間洗浄した後、同様に蛍光強度を測定したところ、蛍光強度は９７６６であり、約１／３程度まで低下した（図３）。ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）で１時間ブロッキングし、蛍光強度を測定したところ蛍光強度に変化はなかった。次ぎに、５００μｌの０．０５μｇ／μｌ Ｃｙ３−ＩｇＧを添加して室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで室温にて１２時間洗浄し、蛍光強度を測定した（図４）。蛍光強度は１６４４８であり、増加していることから、プロテインＡとＩｇＧが結合したこと、すなわち、転写保持されたタンパク質の結合能が維持されたことがわかる。
【００６８】
（実施例２）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
ステンレス−ＤＬＣ固体支持体の作成
ステンレス基板にダイヤモンドライクカーボン層を形成した。ステンレス基板は、平滑性と蛍光バックグラウンドを下げるために、予めバフ研磨後、更に電解研磨を施した。ダイヤモンドライクカーボン層の形成はイオン化蒸着法により以下の条件で行った。生成したダイヤモンドライクカーボン層の厚みは、２０ｎｍであった。また、アンモニアプラズマ処理することによりアミノ基を導入することにより固体支持体２を作成した。
【００６９】
【表４】
【００７０】
Ｃｙ３−プロテインＡ（０．２μｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図５）。
【００７１】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファーＢ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体２の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｃ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を図６のように重ねてセミドライブロッティング装置に設置し、８Ｖ、４ｍＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた後、転写後の固体支持体とゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図７）。
【００７２】
(1)は、陰極側及び陽極側のろ紙の双方にイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルからほとんど抜け出ておらず、また固体支持体にも転写保持されていなかった。
【００７３】
(2)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙IIに転写用バッファーＢ、ろ紙IIIに転写用バッファーＡを含ませて転写を行った場合の結果である。Ｃｙ３−プロテインＡはゲルから多少減少しているが、固体支持体には転写保持されていなかった。
【００７４】
(3)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませて転写を行った場合の結果である。ゲルは、固体支持体に重ねる前に、水分をふき取った。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上には形状は良くないが転写保持が見られた。
【００７５】
(4)は、ろ紙Iに転写用バッファーＣ、ろ紙II及びIIIにイオン交換水を含ませ、ゲルの水分をふきとらずに固体支持体に重ねて転写を行った場合の結果である。その結果、Ｃｙ３−プロテインＡは、均一ではないがゲルから抜け出ていることが確認された。また、固体支持体上にはＣｙ３−プロテインＡが形状良く転写保持されていた。
【００７６】
以上から、ゲル中のタンパク質の固体支持体への転写においては、陰極側のろ紙には転写用バッファーを、陽極側のろ紙にはイオン交換水を含ませ、泳動後のゲルの水分をふきとることなく転写を行うことが好ましいと考えられる。
【００７７】
（実施例３）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）及びＣｙ３−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図８）。なお、Ｃｙ３-ＩｇＡの泳動については、１２％ポリアクリルアミドゲルを使用した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００７８】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）、Ｃ２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１又はＣ２を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図９）。
【００７９】
その結果、固体支持体への転写の際に陰極側のろ紙に含ませる転写用バッファーは、Ｃ１、すなわち、ε−アミノカプロン酸の濃度が４０ｍＭのものの方が転写保持効率がよいことが分かった。
【００８０】
（実施例４）ＰＶＤＦメンブレンからＴｉ−Ｐｔ−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質転写
実施例１と同様にして基板１にダイヤモンドライクカーボン層を形成し、イオン化蒸着装置を用いてアンモニアプラズマ中で処理することにより表面をアミノ化して固体支持体３を作成した。
【００８１】
また実施例１と同様にしてポリアクリルアミドゲルでＣｙ３−プロテインＡを電気泳動した。泳動終了後、１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色したあと、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影を行った（図１０）。約５０ｋＤａ付近にＣｙ３-プロテインＡのバンドが検出された。
【００８２】
転写用バッファーＡ（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）、Ｂ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）及びＣ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）を調製した。泳動後のゲルを取り出し、約２００ｍｌの転写用バッファーＢに浸して、５分間軽く振盪した。予めゲルの大きさに切っておいたＰＶＤＦメンブレン（ＡＴＴＯ社製）を少量のメタノールに５秒間浸した後、約１００ｍｌの転写用バッファーＢに浸し、５分以上振盪した。転写用バッファーＡ、Ｂ又はＣの各２００ｍｌに、予めゲルの大きさに切っておいたろ紙をそれぞれ２枚、１枚及び３枚ずつ浸した。続いて、セミドライブロッティング装置（日本エイドー）に、上記のろ紙、ゲル及びＰＶＤＦメンブレンを、気泡が入らないように図１１のように重ね合わせて設置し、電圧１５Ｖで６０分間通電した。転写後、ＰＶＤＦメンブレンを２００ｍｌのＰＢＳに浸して、５分間浸透した。
【００８３】
転写後のＰＶＤＦメンブレンを固体支持体３に載る大きさに切り、図１２のような順番で重ね合わせ、３５ｇ／ｃｍ2の重しを載せた。室温にて１時間置き、メンブレン上のＣｙ３−プロテインＡを固体支持体３上に転写した。続いて該固体支持体３を、ＰＢＳで室温にて２０分間洗浄した後、乾燥させた。そして、固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。撮影画像を図１３に示す。画像中に囲った部分がメンブレンを密着させた部分である。対応する位置に蛍光が検出されたことから、Ｃｙ３-プロテインＡが固体支持体上に転写保持されていることがわかる。
【００８４】
（実施例５）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３ラベルした酵母タンパク質（３００μｇ／レーン）を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（１））。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００８５】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、１０％メタノールでゲルを洗浄後、新しい１０％メタノールに交換し、更に３０秒洗浄した。洗浄後、固体支持体２にゲルを載せ、その上に透析膜、１Ｍ Ｈ３ＢＯ３バッファー（ｐＨ８．０）を含むろ紙を載せた。そして、２Ｖで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２を超純水で洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した（図１４（２））。
その結果、転写効率が約４０％であり、十分転写ができていることが判明した。
【００８６】
（実施例６）ステンレス−ＤＬＣ固体支持体へのタンパク質の転写
Ｃｙ３−プロテインＡ（５０ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）とＣｙ５−ＩｇＡ（１００ｎｇ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液中で混合し、実施例１と同様にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ法（ＡＴＴＯ社製 ＡＥ−６５３０型）で泳動し、泳動終了後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。また、実施例２と同様にして、固体支持体２を作成した。
【００８７】
泳動後のゲルを取り出し、固体支持体２に載る大きさに切った後、転写用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％ メタノール）に浸した。予め固体支持体の大きさに切っておいたろ紙（ＡＴＴＯ社製）をそれぞれ、転写用バッファーＣ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ ε−アミノカプロン酸、５％ メタノール）又はイオン交換水に浸した。続いて、気泡が入らないように、ろ紙、ゲル、固体支持体を実施例２の図６と同様に重ね、セミドライブロッティング装置に設置した。このとき、陰極側のろ紙３枚には、転写用バッファーＣ１を含ませたものを使用し、陽極側のろ紙３枚には、イオン交換水を含ませたものを使用した。そして、２Ｖ、２μＡで６０分間通電し、タンパク質複合体を固体支持体２に転写した。転写後の固体支持体２をイオン交換水で室温にて３０分間洗浄し、乾燥させた。そして該固体支持体と転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影した。
その結果、転写後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度は、泳動終了後のＦＬＡ８０００で画像撮影したものの蛍光強度に比べて約３５％であった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の方法により、試料中に含まれる多数の物質を電気泳動で分離した後、個々のバンドに含まれる物質を固体支持体上に転写保持することができ、複数の物質を精製することなく同時かつ直接に質量分析することが可能となるため、多数の試料を迅速に解析することができる。
【００８９】
従って、本発明は、核酸及びタンパク質等の生体分子の解析において非常に有用な手段となる。また、溶液中で相互作用する物質の複合体を形成することができるため、タンパク質の分析など、分析対象物質の立体構造を高度に保持する必要がある解析に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】実施例１において、Ｃｙ３-プロテインＡ及び大腸菌タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図２】実施例１において、電気泳動後のゲルを固体支持体１に転写し、転写後の固体支持体の蛍光強度をＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図３】実施例１において、電気泳動後のゲルを転写した固体支持体１を、ＰＢＳで１０分間洗浄し、乾燥した後、画像撮影したものである。
【図４】実施例１において、電気泳動後のゲルを転写した固体支持体１を、ＰＢＳで１０分間洗浄し、さらにブロッキング試薬で１時間ブロッキングし、その後Ｃｙ３−ＩｇＧを添加して室温で１時間反応させ、ＰＢＳで１２時間洗浄し（室温）、画像撮影したものである。
【図５】実施例２において、Ｃｙ３-プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図６】実施例２において、タンパク質を電気泳動後のゲルから固体支持体２に転写するときの配置を表したものである。
【図７】実施例２において、電気泳動後のゲルからタンパク質を転写した固体支持体２を、ＰＢＳで３０分間洗浄して乾燥したもの及び転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図８】実施例３において、Ｃｙ３-プロテインＡ及びＣｙ３−ＩｇＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、泳動後のゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後、ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図９】実施例３において、電気泳動後のゲルからタンパク質を転写した固体支持体２を、ＰＢＳで３０分間洗浄して乾燥したもの及び転写後のゲルをＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１０】実施例４において、Ｃｙ３-プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動し、ゲルを１５分間ＣＢＢ染色し、脱染色した後ＬＡＳ１０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１１】実施例４において、電気泳動した後のゲルからタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写するときの配置を表したものである。
【図１２】実施例４において、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンから固体支持体３に転写するときの配置を表したものである。
【図１３】実施例４において、ＰＶＤＦメンブレンからタンパク質が転写された固体支持体３を、ＰＢＳで２０分間洗浄し、乾燥した後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【図１４】図１４（１）は実施例５において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で電気泳動後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものであり、図１４（２）は、タンパク質が転写された固体支持体を、イオン交換水で３０分間洗浄し、乾燥した後、ＦＬＡ８０００（富士写真フイルム株式会社製）で画像撮影したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の物質を質量分析する方法であって、
試料中の物質をゲル電気泳動で分離する工程、
ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写する工程、及び
該メンブレン上に転写された物質を、表面にカーボン層を有する固体支持体に転写保持する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在し該カーボン層と共有結合しているアミノ基含有化合物をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が、基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
固体支持体が、カーボン層が形成された基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
試料中の物質を質量分析する方法であって、
試料中の物質をゲル電気泳動で分離する工程、
ゲル中に分離された該物質を表面にカーボン層を有する固体支持体に転写保持する工程、
及び
固体支持体上に転写保持された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する工程を含み、
表面にカーボン層を有する固体支持体がカーボン層上に非置換アミノ基を有するものである、前記方法。
【請求項７】
固体支持体上に固定化された物質に、これと相互作用する別の物質を加えて複合体を形成させる工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶液中で相互作用する物質同士の複合体を形成させ、該複合体をゲル電気泳動で分離する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
カーボン層の厚みが単分子層〜１００μｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体に転写保持された物質が核酸、ペプチド又はこれらの複合体である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
試料中の物質を質量分析する方法であって、
試料中の物質をゲル電気泳動で分離する工程、
ゲル中に分離された物質をメンブレンに転写する工程、及び
該メンブレン上に転写された物質を、表面にカーボン層を有する固体支持体に転写保持する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在するが該カーボン層と共有結合していないアミノ基含有化合物をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、基板表面のカーボン層上に存在し該カーボン層と共有結合しているアミノ基含有化合物をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
固体支持体が、基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
固体支持体が、カーボン層が形成された基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られるものである請求項１記載の方法。
【請求項６】
試料中の物質を質量分析する方法であって、
試料中の物質をゲル電気泳動で分離する工程、
ゲル中に分離された該物質を表面にカーボン層を有する固体支持体に転写保持する工程、
及び
固体支持体上に転写保持された複数の物質又は複合体を脱離／イオン化することにより質量分析する工程を含み、
表面にカーボン層を有する固体支持体がカーボン層上に非置換アミノ基を有するものである、前記方法。
【請求項７】
固体支持体上に固定化された物質に、これと相互作用する別の物質を加えて複合体を形成させる工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
溶液中で相互作用する物質同士の複合体を形成させ、該複合体をゲル電気泳動で分離する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
カーボン層が、ダイヤモンドライクカーボン層である請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
カーボン層の厚みが単分子層〜１００μｍである請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体に転写保持された物質が核酸、ペプチド又はこれらの複合体である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−１８０７２８（Ｐ２００８−１８０７２８Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５７８１９（Ｐ２００８−５７８１９）
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【分割の表示】特願２００４−４６８８１（Ｐ２００４−４６８８１）の分割
【原出願日】平成１６年２月２３日（２００４．２．２３）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【分割の表示】特願２００４−４６８８１（Ｐ２００４−４６８８１）の分割
【原出願日】平成１６年２月２３日（２００４．２．２３）
【出願人】（３９０００３１９３）東洋鋼鈑株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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