培養装置並びに細胞の製造方法
【課題】 攪拌翼を使用することなく培養液の攪拌を行うことができ、細胞に与えるダメージが小さい培養装置を提供する。
【解決手段】 気体溜部材が伸びて仕切り構成管３内の空気の吸引すると、仕切り構成管３内の圧力が他の部位に比べて低下し、（ｂ）の様に内部の培養液が仕切り構成管３内に吸い込まれる。ギャードモータがさらに回転すると気体溜部材が収縮し、気体溜部材内の空気を仕切り構成管３側に排出する。その結果、仕切り構成管３内の圧力が他の部分に比べて高くなり、仕切り構成管３内に吸い込まれた培養液は培養容器２側に戻され、さらに（ｃ）の様に仕切り構成管３の周囲の液面を押し上げる。さらに続いてギャードモータ１８がさらに回転すると、前記した（ｂ）の様に内部の培養液が仕切り構成管３内に吸い込まれ、以下、この工程を繰り返す。
【解決手段】 気体溜部材が伸びて仕切り構成管３内の空気の吸引すると、仕切り構成管３内の圧力が他の部位に比べて低下し、（ｂ）の様に内部の培養液が仕切り構成管３内に吸い込まれる。ギャードモータがさらに回転すると気体溜部材が収縮し、気体溜部材内の空気を仕切り構成管３側に排出する。その結果、仕切り構成管３内の圧力が他の部分に比べて高くなり、仕切り構成管３内に吸い込まれた培養液は培養容器２側に戻され、さらに（ｃ）の様に仕切り構成管３の周囲の液面を押し上げる。さらに続いてギャードモータ１８がさらに回転すると、前記した（ｂ）の様に内部の培養液が仕切り構成管３内に吸い込まれ、以下、この工程を繰り返す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞や植物細胞等の細胞を培養する培養装置に関するものである。また本発明の培養装置は、微生物の細胞を培養する場合にも使用することができる。本発明は、間葉系幹細胞の様に剪断力に対して脆弱な細胞を培養するのに適するものである。
また本発明は、細胞等を培養する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の培養技術は、バイオテクノロジー分野における重要な技術の一つである。例えば種々のタンパク医薬が組み換え動物細胞を培養することによって生産されている。
一方、近年、いわゆる再生医療が注目され、実用化に向けて日々研究が行われている。ここで再生医療とは、体の一部が死滅したり失われてしまった様な場合に、細胞を利用してその失われた機能の取り戻しを図る医療である。
再生医療の実用化や実験研究には、幹細胞等の動物細胞の培養が欠かせない。ここで近年、人の骨髄組織中に、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞（心筋・骨格筋）等に分化する能力を持つ間葉系幹細胞が存在することが報告されており、研究者の間では、この間葉系幹細胞を如何にして培養するかという点に注目が集まっている。
【０００３】
間葉系幹細胞の培養は例えば次の方法によって行うことができる。
即ち人体から取り出した骨髄液から間葉系幹細胞を分離し、これをフラスコ内に培地と共に入れる（播種）。なお間葉系幹細胞は市販されているが、提供者の同意を得て当該提供者から採取する場合もある。
そして細胞をフラスコの底面に付着した状態で増殖させる。細胞は、二次元的に増殖し、フラスコ底面を覆ってゆく。
フラスコ底面に培養可能な余地面積が少なくなると、トリプシン等によって細胞を剥離・分離し、新たなフラスコに分離した間葉系幹細胞を播種し、増殖させてゆく。
この方法では、フラスコ底面からの細胞の剥離や、新たなフラスコへの播種に手間が掛かる。またこれらの作業は、多くの場合、手作業で行われるので作業中にコンタミネーションが起こる危険がある。
【０００４】
また間葉系幹細胞の培養に適用された例は報告されていないが、他に動物細胞を高密度で効率よく培養する方法として、キャリアビーズ等の担体上に細胞を付着させて培養する方策が知られている。
特許文献１，２には、キャリアビーズを使用した細胞の培養装置が開示されている。特許文献１に開示された培養装置では、培地と細胞との接触機会を増加させる目的と、細胞の分散を促す目的から、攪拌翼を回転させることによって培養液を攪拌している。特許文献２に開示された培養装置では、攪拌翼を振動させることによって培養液を攪拌している。
【特許文献１】特開平４−２７８０７６号公報
【特許文献２】特開平７−７５５４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
キャリアビースを使用した培養方法では、培養液の攪拌が必要であり、この方法を実現するための培養装置には攪拌翼が必須である。即ち前記した様に、細胞の効率的な培養には培養液の攪拌が欠かせず、従来技術においては、図６に示すように培養液１００中に攪拌翼１０１を挿入し、これを機械的に動かして培養液を攪拌している。
従来技術の培養装置は、前記した様に攪拌翼を機械的に動かして培養液を攪拌するものであるから、培養中に細胞と攪拌翼が接触し、細胞を傷つけてしまうことがある。そのため間葉系幹細胞の様に細胞膜を持たず、剪断力に対して極めて弱い細胞は、攪拌翼との接触によって大きなダメージを受け、効率良く培養することができないという問題があった。
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、攪拌翼を使用することなく培養液の攪拌を行うことができ、細胞に与えるダメージが小さい培養装置の提供を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そして上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、前記培養容器は、主たる培養室と、当該培養室と連通する気圧変動室を備え、気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【０００７】
本発明の培養装置では、培養室と連通する気圧変動室を備える。そして気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能である。その結果、培養装置内に培養液の流れが生じ、培養液が攪拌される。
【０００８】
また請求項２に記載の発明は、培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を有し、仕切り内の圧力を変化させる圧力変化手段を備え、仕切り内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【０００９】
本発明の培養装置では、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を備え、圧力変化手段は仕切り内の圧力を変化させる。そのため仕切り部材の内外で圧力差が生じ、培養装置内に培養液の流れが起こって培養液が攪拌される。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、培養容器内に培地と、細胞を着床させる担体が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養装置である。
【００１１】
本発明の培養装置では、培養容器内に細胞を着床させる担体が充填されている。ここで担体は、例えばマイクロキャリアや、マイクロビーズと称されるものである。本発明の培養装置では、細胞を着床させる担体を備えているので、容器の底面に細胞を着床させる場合に比べて着床し得る面積が著しく広い。また容器の底に着床させる場合に必要であった、「細胞を剥離・分離し、新たなフラスコに分離した間葉系幹細胞を播種」する作業を省略又は軽減することができる。前記した作業は、多くの場合、作業者の手作業によって行われていたのが現状であり、手間が掛かるばかりでなく、コンタミネーションの要因であったが、本発明では、この作業を省略又は軽減することができ、手間が掛からず、またコンタミネーションの危険性を軽減することができる。
また従来、マイクロキャリア等を使用しての間葉系幹細胞の培養はできないとされていたが、本発明によりこれが可能となった。
即ちマイクロキャリア等の担体を使用する培養方法は、細胞を高密度で効率よく培養することができる利点がある反面、攪拌の際に細胞を傷付け易いという欠点がある。一方、間葉系幹細胞は、外力に対して極めて脆弱である。そのためマイクロキャリア等に着床させても、従来技術の様に回転翼がマイクロキャリア等に接触すると細胞が傷付き、成長が妨げられるという問題があった。
これに対して本発明の培養装置によると、容器内に機械的動作をする部材を無くすることも可能であり、回転翼による細胞の損傷がない。そのため本発明によると、間葉系幹細胞の様な極めて弱い細胞であっても、マイクロキャリア等を使用して培養することができる。
【００１２】
また請求項４に記載の発明は、仕切り部材は管体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の培養装置である。
【００１３】
本発明では、仕切り部材に管体が採用されている。そのため構造が簡単であり、製造が容易である。
【００１４】
また請求項５に記載の発明は、仕切り部材は培養容器と一体であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の培養装置である。
【００１５】
本発明の培養装置では、仕切り部材と培養容器とが一体であるから、コンタミネーションの危険性が低い。また本発明の培養装置は製造が容易である。
【００１６】
また請求項６に記載の発明は、内部に空間を有し、外部からの力によって前記空間が変形可能であり、且つ気密状態を維持することができる気体溜部材を備え、気体溜部材は仕切り内の空間と連通していることを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の培養装置である。
【００１７】
本発明の培養装置では、気体溜部材を有し、当該気体溜部材は仕切り内の空間と連通している。そのため気体溜部材を外力によって変形させて気体溜部材の体積を縮小させると、気体溜部材の気体が仕切り内の空間に移動し、仕切り内の圧力が上昇して仕切り内の液面を下降させる。逆に気体溜部材内の体積を増加させると、仕切り内の気体が気体溜部材内側に移動し、仕切り内の圧力が降下して仕切り内の液面が上昇する。
また本発明で採用する気体溜部材は、気密状態を維持することができるものであるから、外気と遮蔽されており、雑菌が培養容器内に混入したり、培養物が大気と触れる恐れがない。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、圧力変化手段は、圧力を、正負繰り返し状態となる様に変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の培養装置である。
【００１９】
本発明の培養装置では、圧力変化手段によって、仕切り内等の圧力が、正負繰り返し状態となる様に変化する。そのため培養容器内の液面は標準水位に対して上昇と下降を繰り返す。そのため本発明の培養装置は、培養液の攪拌効率が優れている。
【００２０】
また請求項８に記載の発明は、培養容器には送気口と排気口が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の培養装置である。
【００２１】
本発明の培養装置では、培養容器には送気口と排気口が設けられているので、培養に必要な酸素や二酸化炭素を供給することができる。
【００２２】
また請求項９に記載の発明は、培養容器には担体供給手段が取り付けられていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の培養装置である。
【００２３】
本発明の培養装置では、培養容器には担体供給手段が取り付けられているので、必要に応じて培養容器内に担体を供給することができる。
【００２４】
また請求項１０に記載の発明は、培養容器は気密状態とすることができるものであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の培養装置である。
【００２５】
本発明の培養装置は、培養容器を気密状態とすることができるので、雑菌等が培養容器内に混入したり、培養物が大気と触れる危険性が低い。
【００２６】
また請求項１１に記載の発明は、培養容器は底面が曲面状であり、遠心分離器に装着可能であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の培養装置である。
【００２７】
本発明の培養装置では、培養容器の底面が曲面状であり、遠心分離器に直接的に装着可能である。そのため培養した細胞の分離が容易であり、また分離の際にコンタミネーションが起こる危険性が低い。
【００２８】
また請求項１２に記載の発明は、細胞を着床させる担体及び培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器は底面が曲面状であり、培養容器の内部には管体が設けられ、さらに管体内の圧力を正負繰り返し状態となる様に変化させる圧力変化手段を備え、管体内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【００２９】
本発明の培養装置は、前記した構成を備えるものであり、攪拌翼を用いること無く培養液の攪拌が可能である。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、内部に仕切りが設けられた培養容器に液状の培地と細胞とを充填する工程と、仕切り内の圧力を変動させて培地の液面を昇降させる工程を含むことを特徴とする細胞又は微生物の製造方法である。
【００３１】
本発明によると、細胞を容易に培養することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の培養装置は、攪拌翼を用いること無く培養液を攪拌することができるので、細胞に与えるダメージが小さく、細胞を効率良く培養することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態の細胞培養装置の斜視図である。図２は、図１の細胞培養装置の断面図である。図３は、図１の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。図４は、本発明の他の実施形態の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。図５は、本発明のさらに他の実施形態の細胞培養装置の断面図である。
本実施形態の培養装置１は、図１、図２の様に培養容器２内に複数の管が挿入されたものである。
即ち本実施形態の培養装置１は、培養容器２内に仕切り構成管３、培養用気体供給管５、培養液排出管６が設けられ、さらに気体排出用開口７、培養液供給開口８、及びビーズ供給開口１０が設けられたものである。
また仕切り構成管３には、圧力変化装置１５が取り付けられている。圧力変化装置１５は気体溜部材１６と、クランク部材１７とギャードモータ１８によって構成されている。
【００３４】
培養容器２は、ガラス又は透明な樹脂で作られたものであり、内部の状態を観察することができる。培養容器２の形状は、遠沈管に似た形状であり、底部が球面をしている。培養容器２は後記する様に遠心分離機に直接装着することができる。
培養容器２の頂面には蓋部材１２が設けられている。仕切り構成管３、培養用気体供給管５、培養液排出管６、気体排出用開口７、培養液供給開口８及びビーズ供給開口１０は、いずれも蓋部材１２に設けられている。
【００３５】
仕切り構成管３は、培養容器２の中心にあり、その先端は培養容器２の先端部の近傍に至っている。仕切り構成管３の下端部側、即ち培養容器２に内蔵された側の先端は開放されている。仕切り構成管３の内径は、培養容器２の内径の１／５〜１／２程度である。
仕切り構成管３内は、培養容器２の他の部分と仕切られている。また仕切り構成管３の内部と培養容器２の他の部分は連通する。
本実施形態では、仕切り構成管３の内部が気圧変動室２２として機能する。また仕切り構成管３の外側の部位が、主たる培養室２３として機能する。
【００３６】
圧力変化装置１５は前記した様に気体溜部材１６と、クランク部材１７とギャードモータ１８によって構成されている。気体溜部材１６は、ジャバラを有しており、軸方向に変形可能である。即ち気体溜部材１６は、ふいごの様な形状・機能を備えるものであり、全長を収縮させることによって内部の容積が縮小し、内部の気体が放出される。
クランク部材１７は、円板部材２０と軸部材２１によって構成されている。円板部材２０は、図１に示すように偏心した位置に３か所孔２５，２６，２７が設けられている。軸部材２１は、上記した３か所孔２５，２６，２７の孔のいずれかに取り付けられている。
本実施形態で採用するギャードモータ１８は変速機能を持ち、回転軸の回転数を変更することができる。
【００３７】
クランク部材１７は、ギャードモータ１８によって回転される。従ってギャードモータ１８の回転によって円板部材２０が回転し、軸部材２１が昇降する。なお軸部材２１の取付け位置を変更することによって軸部材２１の昇降ストロークが変わる。
さらにギャードモータ１８の回転数を変更することにより、昇降周期が変わる。
【００３８】
前記した仕切り構成管３の他端側、即ち大気露出側には、圧力変化装置１５の気体溜部材１６が接続されている。従ってギャードモータ１８を回転すると、気体溜部材１６が伸縮を繰り返し、仕切り構成管３内の空気の吸引・排出を繰り返す。
また軸部材２１の取付け位置を変更すると、一回ごとの給排気量が変わる。またギャードモータ１８の回転数を変更すると、給排気の周期が変更される。
【００３９】
培養用気体供給管５及び培養液排出管６は、いずれも仕切り構成管３に比べて十分に細いものであり、いずれもその先端は、培養容器２の先端部の近傍に至っている。
培養用気体供給管５は、気体供給装置３０に接続されている。気体供給装置３０は、送風ポンプ３１及びフィルター３２を備え、外気をポンプ３１で吸引し、フィルター３２を経て培養用気体供給管５に清浄状態の空気を供給するものである。またフィルター３２から培養用気体供給管５に至る中途部分には、二酸化炭素のボンベ３５がバルブ３６を介して接続されており、必要に応じて供給する空気中に二酸化炭素を補充することができる。 培養液排出管６は廃液管３８に接続されている。廃液管３８にはバルブ４０が取り付けられている。バルブ４０は、通常、閉止されている。
【００４０】
培養液供給開口８は、バルブ４１を介して培養液圧送タンク４３に接続されている。バルブ４１についても通常、閉止されている。
ビーズ供給開口１０は、バルブ４５を介して通常ビーズ供給ホッパー４６に接続されている。バルブ４５についても通常、閉止されている。
【００４１】
気体排出用開口７は、バルブ５２及びフィルター５３を介して大気開放されている。バルブ５２は常時開放されている
なお培養容器２に接続された全てのバルブを閉止すると、培養容器２は密閉状態となる。
【００４２】
次に本実施形態の培養装置１の機能を培養工程に沿って説明する。
培養の準備段階として、培養容器２内に培地と、マイクロキャリア（細胞を着床させる担体）を充填する。培地の充填量は、培養容器の容積の１／２未満であることが推奨される。ただし仕切り構成管３の下端は、培養液に浸っている。
そして培養容器２を図１，２に示す様な外部装置に接続する。即ち培養容器２から突出する仕切り構成管３に、圧力変化装置１５の気体溜部材１６を接続する。
また培養用気体供給管５に、気体供給装置３０を接続する。さらに培養液供給開口８は培養液圧送タンク４３に接続され、ビーズ供給開口１０は、ビーズ供給ホッパー４６に接続される。培養液排出管６は廃液管３８に接続される。
培養を行う際には、培養液供給開口８に繋がるバルブ４１、ビーズ供給開口１０に繋がるバルブ４５、及び廃液管３８に設けられたバルブ４０はいずれも閉止されている。
【００４３】
そして図示しない保温装置によって培養容器２を摂氏３７度程度に保温する。また培養用気体供給管５から培養に必要な空気や二酸化炭素を供給する。また培養用気体供給管５から空気や二酸化炭素を供給することによって余剰となった培養容器２内の気体は、気体排出用開口７から外部に排出される。
そして圧力変化装置１５のギャードモータ１８を起動する。その結果、気体溜部材１６が伸縮を繰り返し、仕切り構成管３内の空気の吸引・排出を繰り返す。
ここで気体溜部材１６が伸びて仕切り構成管３内の空気を吸引すると、仕切り構成管３内（仕切り内 気圧変動室２２）の圧力が他の部位（主たる培養室２３）に比べて低下し、図３（ｂ）の様に内部の培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれる。即ち気体溜部材１６は気密状態を維持することができるものであり、且つ気体溜部材１６と連通する仕切り構成管３の下端は培養液５０に浸った状態であるから、気体溜部材１６が伸びて仕切り構成管３内の空気を吸引すると、培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれる。
【００４４】
ギャードモータ１８がさらに回転すると気体溜部材１６が収縮し、気体溜部材１６内の空気を仕切り構成管３側に排出する。その結果、仕切り構成管３内の圧力が他の部分に比べて高くなり、仕切り構成管３内に吸い込まれた培養液５０は培養容器２側に戻され、さらに図３（ｃ）の様に仕切り構成管３の周囲の液面を押し上げる。
さらに続いてギャードモータ１８が回転すると、前記した図３（ｂ）の様に内部の培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれ、以下、この工程を繰り返す。
その結果、培養容器２内の培養液５０に流れが生じ、培養液５０が攪拌される。なお前記した様に気体溜部材１６は気密状態を維持することができるものであり、気体溜部材１６内の空気が外気と接することは無いので、コンタミネーションの危険は無い。
なお、培養液５０の液面が昇降すると、培養容器２内の主たる培養室２３の残余の体積が変動する。体積が減少する際には、残余の部分の気体は、気体排出用開口７から外部に排気される。逆に体積が増加する際には、培養用気体供給管５から新たに空気が供給される。即ち気体排出用開口７は圧力逃がしとして機能し、培養用気体供給管５は圧力緩衝として機能する。
【００４５】
培養期間中に培養液の交換が必要となった場合は、培養液供給開口８に繋がるバルブ４１と廃液管３８に設けられたバルブ４０を開き、培養液圧送タンク４３から新たな培養液を培養容器２に供給すると共に、古くなった培養液を培養液排出管６から抜き出す。抜き出された培養液は、廃液管３８に回収され、所定の処理を行った後に廃棄される。
【００４６】
また培養期間中にマイクロキャリアが不足した場合は、バルブ４５を開いてビーズ供給ホッパー４６からマイクロキャリアを培養容器２に追加する。
【００４７】
細胞の培養が完了すると、培養容器２を外部装置（圧力変化装置１５等）から取り外し、図示しない遠心分離機に掛ける。その結果、所望の細胞が分離される。
【００４８】
以上説明した培養装置１では、培養容器２内に仕切り構成管３を挿入して培養容器２内を二つの空間に仕切った。この構成は、培養液を中心部から吸排することができ、培養液の淀みが少ない点で推奨される。しかしながら、本発明は、この構成に限定されるものではなく、図４に示す様に培養容器６０内に平板状の仕切り壁６１を設け、当該仕切り壁６１によって培養容器６０内を二つの空間に仕切ってもよい。
図４に示す培養容器６０では、仕切り壁６１で仕切られた部位が気圧変動室７０として機能し、仕切り壁６１の外側が、主たる培養室７１として機能する。従って気圧変動室７０に設けられた開口６８は、図示しない圧力変化装置に接続される。
また図４において、開口７３は、図示しない気体供給装置３０に接続される。開口７４は、排気口である。
【００４９】
また前記した実施形態は、「主たる培養室」として機能する部位と、「気圧変動室」として機能する部位が一つの容器の内部に設けられた例であるが、「気圧変動室」が「主たる培養室」の外部に設けられていてもよい。
即ち図５に示すように培養容器６６を大瓶部（主たる培養室）６２と小瓶部（気圧変動室）６３に二分割し、この両者を導通管６５で接続したものであってもよい。図５に示す培養容器６６では、小瓶部６３に図示しない圧力変化装置を接続する。
また図５においても、開口７３は、図示しない気体供給装置３０に接続される。開口７４は、排気口である。
図５に示した培養容器６６では、大瓶部（主たる培養室）６２と小瓶部（気圧変動室）６３の下部近傍同士を導通管６５で接続したが、最下部に導通管を設けてもよい。勿論、全体形状が「Ｕ」字管の様なものであってもよい。
【００５０】
また上記した各実施形態では、「主たる培養室」として機能する部位が一つであり、「気圧変動室」として機能する部位についても一つであるが、一方又は双方が複数であってもよい。
例えば一つの「主たる培養室」に、２室又はそれ以上の「気圧変動室」が設けられていてもよい。逆に一つの「気圧変動室」をもって複数の「主たる培養室」の液面を昇降させてもよい。
【００５１】
また上述した本実施形態では、気体排出用開口７又は開口７４が、培養容器２，６０，６６内の気体の成分（二酸化炭素濃度等）を調節するための排気口と、内部の圧力を一定に維持するための排気口を兼ねているが、両者を別個のものとしてもよい。
【００５２】
また先の実施形態では、培養容器２に培養液圧送タンク４３やビーズ供給ホッパー４６を接続した。この構成によると、単にバルブを操作するだけで培地の更新や、担体の増量を行うことができる。しかしながら、これらの構成は必須ではなく、省略することもできる。培養液圧送タンク４３やビーズ供給ホッパー４６を省略する場合には、培養液供給開口８及びビーズ供給開口１０は不要である。
逆に、サンプリング用の開口等を培養容器２に設けてもよい。
また上記した実施形態では、ギャードモータ１８を採用することによって給排気の周期を変更可能とし、また軸部材２１の円板部材２０に対する取付け位置を変更可能として一回ごとの給排気量を変更可能とした。この構成によると、細胞等の成長過程において時期に応じた適切な攪拌を行うことができる。しかしながらこれらの構成についても、必須ではなく、省略することもできる。
【００５３】
また上記した実施形態では、各管や開口をいずれも蓋部材１２に設けたが、これらを培養容器２の側壁に設けてもよい。
【００５４】
培養装置１の製造方法は任意であるが、培養容器２と仕切り構成管３等をブロー成形等によって一体成形して製造することが望ましい。また或いは、蓋部材１２に仕切り構成管３等を射出成形等によって一体成形し、別途成形した培養容器２の本体部分に、蓋部材１２を接着してもよい。
【実施例】
【００５５】
図１に示す培養装置を試作した。培養装置１の培養容器２の内径は、５０ｍｍであり、仕切り構成管３の内径は、１５ｍｍである。そして培養装置をガンマー線滅菌した後、培地、担体及び培養する細胞を培養容器２に充填した。
なお本実施形態では、培地としては「ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％子ウシ血清」を使用し、担体はデキストランのマイクロキャリアを使用した。
培養する細胞としては、市販の間葉系幹細胞を使用した。
市販の間葉系幹細胞は、具体的にはＣａｍｂｒｅｘ社製であり、人体から取り出した骨髄液から間葉系幹細胞を分離したものである。
そして先述した実施形態の様に気体溜部材１６を伸縮して培養容器２内における培養液の液面を昇降し、培養液を攪拌しつつ細胞を培養した。
２０日後に担体を取り出して顕微鏡観察したところ、ほとんどのビースに細胞が着床していることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施形態の細胞培養装置の斜視図である。
【図２】図１の細胞培養装置の断面図である。
【図３】図１の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。
【図４】本発明の他の実施形態の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。
【図５】本発明のさらに他の実施形態の細胞培養装置の断面図である。
【図６】従来技術の細胞培養装置の断面図である。
【符号の説明】
【００５７】
１ 培養装置
２，６０，６６ 培養容器
３ 仕切り構成管
５ 培養用気体供給管
６ 培養液排出管
７ 気体排出用開口
８ 培養液供給開口
１０ ビーズ供給開口
１５ 圧力変化装置
１６ 気体溜部材
１７ クランク部材
１８ ギャードモータ
２０ 円板部材
２２，７０ 気圧変動室
２３，７１ 主たる培養室
６２ 大瓶部（主たる培養室）
６３ 小瓶部（気圧変動室）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞や植物細胞等の細胞を培養する培養装置に関するものである。また本発明の培養装置は、微生物の細胞を培養する場合にも使用することができる。本発明は、間葉系幹細胞の様に剪断力に対して脆弱な細胞を培養するのに適するものである。
また本発明は、細胞等を培養する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の培養技術は、バイオテクノロジー分野における重要な技術の一つである。例えば種々のタンパク医薬が組み換え動物細胞を培養することによって生産されている。
一方、近年、いわゆる再生医療が注目され、実用化に向けて日々研究が行われている。ここで再生医療とは、体の一部が死滅したり失われてしまった様な場合に、細胞を利用してその失われた機能の取り戻しを図る医療である。
再生医療の実用化や実験研究には、幹細胞等の動物細胞の培養が欠かせない。ここで近年、人の骨髄組織中に、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋肉細胞（心筋・骨格筋）等に分化する能力を持つ間葉系幹細胞が存在することが報告されており、研究者の間では、この間葉系幹細胞を如何にして培養するかという点に注目が集まっている。
【０００３】
間葉系幹細胞の培養は例えば次の方法によって行うことができる。
即ち人体から取り出した骨髄液から間葉系幹細胞を分離し、これをフラスコ内に培地と共に入れる（播種）。なお間葉系幹細胞は市販されているが、提供者の同意を得て当該提供者から採取する場合もある。
そして細胞をフラスコの底面に付着した状態で増殖させる。細胞は、二次元的に増殖し、フラスコ底面を覆ってゆく。
フラスコ底面に培養可能な余地面積が少なくなると、トリプシン等によって細胞を剥離・分離し、新たなフラスコに分離した間葉系幹細胞を播種し、増殖させてゆく。
この方法では、フラスコ底面からの細胞の剥離や、新たなフラスコへの播種に手間が掛かる。またこれらの作業は、多くの場合、手作業で行われるので作業中にコンタミネーションが起こる危険がある。
【０００４】
また間葉系幹細胞の培養に適用された例は報告されていないが、他に動物細胞を高密度で効率よく培養する方法として、キャリアビーズ等の担体上に細胞を付着させて培養する方策が知られている。
特許文献１，２には、キャリアビーズを使用した細胞の培養装置が開示されている。特許文献１に開示された培養装置では、培地と細胞との接触機会を増加させる目的と、細胞の分散を促す目的から、攪拌翼を回転させることによって培養液を攪拌している。特許文献２に開示された培養装置では、攪拌翼を振動させることによって培養液を攪拌している。
【特許文献１】特開平４−２７８０７６号公報
【特許文献２】特開平７−７５５４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
キャリアビースを使用した培養方法では、培養液の攪拌が必要であり、この方法を実現するための培養装置には攪拌翼が必須である。即ち前記した様に、細胞の効率的な培養には培養液の攪拌が欠かせず、従来技術においては、図６に示すように培養液１００中に攪拌翼１０１を挿入し、これを機械的に動かして培養液を攪拌している。
従来技術の培養装置は、前記した様に攪拌翼を機械的に動かして培養液を攪拌するものであるから、培養中に細胞と攪拌翼が接触し、細胞を傷つけてしまうことがある。そのため間葉系幹細胞の様に細胞膜を持たず、剪断力に対して極めて弱い細胞は、攪拌翼との接触によって大きなダメージを受け、効率良く培養することができないという問題があった。
そこで本発明は、従来技術の上記した問題点に注目し、攪拌翼を使用することなく培養液の攪拌を行うことができ、細胞に与えるダメージが小さい培養装置の提供を課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そして上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、前記培養容器は、主たる培養室と、当該培養室と連通する気圧変動室を備え、気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【０００７】
本発明の培養装置では、培養室と連通する気圧変動室を備える。そして気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能である。その結果、培養装置内に培養液の流れが生じ、培養液が攪拌される。
【０００８】
また請求項２に記載の発明は、培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を有し、仕切り内の圧力を変化させる圧力変化手段を備え、仕切り内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【０００９】
本発明の培養装置では、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を備え、圧力変化手段は仕切り内の圧力を変化させる。そのため仕切り部材の内外で圧力差が生じ、培養装置内に培養液の流れが起こって培養液が攪拌される。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、培養容器内に培地と、細胞を着床させる担体が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養装置である。
【００１１】
本発明の培養装置では、培養容器内に細胞を着床させる担体が充填されている。ここで担体は、例えばマイクロキャリアや、マイクロビーズと称されるものである。本発明の培養装置では、細胞を着床させる担体を備えているので、容器の底面に細胞を着床させる場合に比べて着床し得る面積が著しく広い。また容器の底に着床させる場合に必要であった、「細胞を剥離・分離し、新たなフラスコに分離した間葉系幹細胞を播種」する作業を省略又は軽減することができる。前記した作業は、多くの場合、作業者の手作業によって行われていたのが現状であり、手間が掛かるばかりでなく、コンタミネーションの要因であったが、本発明では、この作業を省略又は軽減することができ、手間が掛からず、またコンタミネーションの危険性を軽減することができる。
また従来、マイクロキャリア等を使用しての間葉系幹細胞の培養はできないとされていたが、本発明によりこれが可能となった。
即ちマイクロキャリア等の担体を使用する培養方法は、細胞を高密度で効率よく培養することができる利点がある反面、攪拌の際に細胞を傷付け易いという欠点がある。一方、間葉系幹細胞は、外力に対して極めて脆弱である。そのためマイクロキャリア等に着床させても、従来技術の様に回転翼がマイクロキャリア等に接触すると細胞が傷付き、成長が妨げられるという問題があった。
これに対して本発明の培養装置によると、容器内に機械的動作をする部材を無くすることも可能であり、回転翼による細胞の損傷がない。そのため本発明によると、間葉系幹細胞の様な極めて弱い細胞であっても、マイクロキャリア等を使用して培養することができる。
【００１２】
また請求項４に記載の発明は、仕切り部材は管体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の培養装置である。
【００１３】
本発明では、仕切り部材に管体が採用されている。そのため構造が簡単であり、製造が容易である。
【００１４】
また請求項５に記載の発明は、仕切り部材は培養容器と一体であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の培養装置である。
【００１５】
本発明の培養装置では、仕切り部材と培養容器とが一体であるから、コンタミネーションの危険性が低い。また本発明の培養装置は製造が容易である。
【００１６】
また請求項６に記載の発明は、内部に空間を有し、外部からの力によって前記空間が変形可能であり、且つ気密状態を維持することができる気体溜部材を備え、気体溜部材は仕切り内の空間と連通していることを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の培養装置である。
【００１７】
本発明の培養装置では、気体溜部材を有し、当該気体溜部材は仕切り内の空間と連通している。そのため気体溜部材を外力によって変形させて気体溜部材の体積を縮小させると、気体溜部材の気体が仕切り内の空間に移動し、仕切り内の圧力が上昇して仕切り内の液面を下降させる。逆に気体溜部材内の体積を増加させると、仕切り内の気体が気体溜部材内側に移動し、仕切り内の圧力が降下して仕切り内の液面が上昇する。
また本発明で採用する気体溜部材は、気密状態を維持することができるものであるから、外気と遮蔽されており、雑菌が培養容器内に混入したり、培養物が大気と触れる恐れがない。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、圧力変化手段は、圧力を、正負繰り返し状態となる様に変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の培養装置である。
【００１９】
本発明の培養装置では、圧力変化手段によって、仕切り内等の圧力が、正負繰り返し状態となる様に変化する。そのため培養容器内の液面は標準水位に対して上昇と下降を繰り返す。そのため本発明の培養装置は、培養液の攪拌効率が優れている。
【００２０】
また請求項８に記載の発明は、培養容器には送気口と排気口が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の培養装置である。
【００２１】
本発明の培養装置では、培養容器には送気口と排気口が設けられているので、培養に必要な酸素や二酸化炭素を供給することができる。
【００２２】
また請求項９に記載の発明は、培養容器には担体供給手段が取り付けられていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の培養装置である。
【００２３】
本発明の培養装置では、培養容器には担体供給手段が取り付けられているので、必要に応じて培養容器内に担体を供給することができる。
【００２４】
また請求項１０に記載の発明は、培養容器は気密状態とすることができるものであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の培養装置である。
【００２５】
本発明の培養装置は、培養容器を気密状態とすることができるので、雑菌等が培養容器内に混入したり、培養物が大気と触れる危険性が低い。
【００２６】
また請求項１１に記載の発明は、培養容器は底面が曲面状であり、遠心分離器に装着可能であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の培養装置である。
【００２７】
本発明の培養装置では、培養容器の底面が曲面状であり、遠心分離器に直接的に装着可能である。そのため培養した細胞の分離が容易であり、また分離の際にコンタミネーションが起こる危険性が低い。
【００２８】
また請求項１２に記載の発明は、細胞を着床させる担体及び培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器は底面が曲面状であり、培養容器の内部には管体が設けられ、さらに管体内の圧力を正負繰り返し状態となる様に変化させる圧力変化手段を備え、管体内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置である。
【００２９】
本発明の培養装置は、前記した構成を備えるものであり、攪拌翼を用いること無く培養液の攪拌が可能である。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、内部に仕切りが設けられた培養容器に液状の培地と細胞とを充填する工程と、仕切り内の圧力を変動させて培地の液面を昇降させる工程を含むことを特徴とする細胞又は微生物の製造方法である。
【００３１】
本発明によると、細胞を容易に培養することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の培養装置は、攪拌翼を用いること無く培養液を攪拌することができるので、細胞に与えるダメージが小さく、細胞を効率良く培養することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下さらに本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の実施形態の細胞培養装置の斜視図である。図２は、図１の細胞培養装置の断面図である。図３は、図１の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。図４は、本発明の他の実施形態の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。図５は、本発明のさらに他の実施形態の細胞培養装置の断面図である。
本実施形態の培養装置１は、図１、図２の様に培養容器２内に複数の管が挿入されたものである。
即ち本実施形態の培養装置１は、培養容器２内に仕切り構成管３、培養用気体供給管５、培養液排出管６が設けられ、さらに気体排出用開口７、培養液供給開口８、及びビーズ供給開口１０が設けられたものである。
また仕切り構成管３には、圧力変化装置１５が取り付けられている。圧力変化装置１５は気体溜部材１６と、クランク部材１７とギャードモータ１８によって構成されている。
【００３４】
培養容器２は、ガラス又は透明な樹脂で作られたものであり、内部の状態を観察することができる。培養容器２の形状は、遠沈管に似た形状であり、底部が球面をしている。培養容器２は後記する様に遠心分離機に直接装着することができる。
培養容器２の頂面には蓋部材１２が設けられている。仕切り構成管３、培養用気体供給管５、培養液排出管６、気体排出用開口７、培養液供給開口８及びビーズ供給開口１０は、いずれも蓋部材１２に設けられている。
【００３５】
仕切り構成管３は、培養容器２の中心にあり、その先端は培養容器２の先端部の近傍に至っている。仕切り構成管３の下端部側、即ち培養容器２に内蔵された側の先端は開放されている。仕切り構成管３の内径は、培養容器２の内径の１／５〜１／２程度である。
仕切り構成管３内は、培養容器２の他の部分と仕切られている。また仕切り構成管３の内部と培養容器２の他の部分は連通する。
本実施形態では、仕切り構成管３の内部が気圧変動室２２として機能する。また仕切り構成管３の外側の部位が、主たる培養室２３として機能する。
【００３６】
圧力変化装置１５は前記した様に気体溜部材１６と、クランク部材１７とギャードモータ１８によって構成されている。気体溜部材１６は、ジャバラを有しており、軸方向に変形可能である。即ち気体溜部材１６は、ふいごの様な形状・機能を備えるものであり、全長を収縮させることによって内部の容積が縮小し、内部の気体が放出される。
クランク部材１７は、円板部材２０と軸部材２１によって構成されている。円板部材２０は、図１に示すように偏心した位置に３か所孔２５，２６，２７が設けられている。軸部材２１は、上記した３か所孔２５，２６，２７の孔のいずれかに取り付けられている。
本実施形態で採用するギャードモータ１８は変速機能を持ち、回転軸の回転数を変更することができる。
【００３７】
クランク部材１７は、ギャードモータ１８によって回転される。従ってギャードモータ１８の回転によって円板部材２０が回転し、軸部材２１が昇降する。なお軸部材２１の取付け位置を変更することによって軸部材２１の昇降ストロークが変わる。
さらにギャードモータ１８の回転数を変更することにより、昇降周期が変わる。
【００３８】
前記した仕切り構成管３の他端側、即ち大気露出側には、圧力変化装置１５の気体溜部材１６が接続されている。従ってギャードモータ１８を回転すると、気体溜部材１６が伸縮を繰り返し、仕切り構成管３内の空気の吸引・排出を繰り返す。
また軸部材２１の取付け位置を変更すると、一回ごとの給排気量が変わる。またギャードモータ１８の回転数を変更すると、給排気の周期が変更される。
【００３９】
培養用気体供給管５及び培養液排出管６は、いずれも仕切り構成管３に比べて十分に細いものであり、いずれもその先端は、培養容器２の先端部の近傍に至っている。
培養用気体供給管５は、気体供給装置３０に接続されている。気体供給装置３０は、送風ポンプ３１及びフィルター３２を備え、外気をポンプ３１で吸引し、フィルター３２を経て培養用気体供給管５に清浄状態の空気を供給するものである。またフィルター３２から培養用気体供給管５に至る中途部分には、二酸化炭素のボンベ３５がバルブ３６を介して接続されており、必要に応じて供給する空気中に二酸化炭素を補充することができる。 培養液排出管６は廃液管３８に接続されている。廃液管３８にはバルブ４０が取り付けられている。バルブ４０は、通常、閉止されている。
【００４０】
培養液供給開口８は、バルブ４１を介して培養液圧送タンク４３に接続されている。バルブ４１についても通常、閉止されている。
ビーズ供給開口１０は、バルブ４５を介して通常ビーズ供給ホッパー４６に接続されている。バルブ４５についても通常、閉止されている。
【００４１】
気体排出用開口７は、バルブ５２及びフィルター５３を介して大気開放されている。バルブ５２は常時開放されている
なお培養容器２に接続された全てのバルブを閉止すると、培養容器２は密閉状態となる。
【００４２】
次に本実施形態の培養装置１の機能を培養工程に沿って説明する。
培養の準備段階として、培養容器２内に培地と、マイクロキャリア（細胞を着床させる担体）を充填する。培地の充填量は、培養容器の容積の１／２未満であることが推奨される。ただし仕切り構成管３の下端は、培養液に浸っている。
そして培養容器２を図１，２に示す様な外部装置に接続する。即ち培養容器２から突出する仕切り構成管３に、圧力変化装置１５の気体溜部材１６を接続する。
また培養用気体供給管５に、気体供給装置３０を接続する。さらに培養液供給開口８は培養液圧送タンク４３に接続され、ビーズ供給開口１０は、ビーズ供給ホッパー４６に接続される。培養液排出管６は廃液管３８に接続される。
培養を行う際には、培養液供給開口８に繋がるバルブ４１、ビーズ供給開口１０に繋がるバルブ４５、及び廃液管３８に設けられたバルブ４０はいずれも閉止されている。
【００４３】
そして図示しない保温装置によって培養容器２を摂氏３７度程度に保温する。また培養用気体供給管５から培養に必要な空気や二酸化炭素を供給する。また培養用気体供給管５から空気や二酸化炭素を供給することによって余剰となった培養容器２内の気体は、気体排出用開口７から外部に排出される。
そして圧力変化装置１５のギャードモータ１８を起動する。その結果、気体溜部材１６が伸縮を繰り返し、仕切り構成管３内の空気の吸引・排出を繰り返す。
ここで気体溜部材１６が伸びて仕切り構成管３内の空気を吸引すると、仕切り構成管３内（仕切り内 気圧変動室２２）の圧力が他の部位（主たる培養室２３）に比べて低下し、図３（ｂ）の様に内部の培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれる。即ち気体溜部材１６は気密状態を維持することができるものであり、且つ気体溜部材１６と連通する仕切り構成管３の下端は培養液５０に浸った状態であるから、気体溜部材１６が伸びて仕切り構成管３内の空気を吸引すると、培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれる。
【００４４】
ギャードモータ１８がさらに回転すると気体溜部材１６が収縮し、気体溜部材１６内の空気を仕切り構成管３側に排出する。その結果、仕切り構成管３内の圧力が他の部分に比べて高くなり、仕切り構成管３内に吸い込まれた培養液５０は培養容器２側に戻され、さらに図３（ｃ）の様に仕切り構成管３の周囲の液面を押し上げる。
さらに続いてギャードモータ１８が回転すると、前記した図３（ｂ）の様に内部の培養液５０が仕切り構成管３内に吸い込まれ、以下、この工程を繰り返す。
その結果、培養容器２内の培養液５０に流れが生じ、培養液５０が攪拌される。なお前記した様に気体溜部材１６は気密状態を維持することができるものであり、気体溜部材１６内の空気が外気と接することは無いので、コンタミネーションの危険は無い。
なお、培養液５０の液面が昇降すると、培養容器２内の主たる培養室２３の残余の体積が変動する。体積が減少する際には、残余の部分の気体は、気体排出用開口７から外部に排気される。逆に体積が増加する際には、培養用気体供給管５から新たに空気が供給される。即ち気体排出用開口７は圧力逃がしとして機能し、培養用気体供給管５は圧力緩衝として機能する。
【００４５】
培養期間中に培養液の交換が必要となった場合は、培養液供給開口８に繋がるバルブ４１と廃液管３８に設けられたバルブ４０を開き、培養液圧送タンク４３から新たな培養液を培養容器２に供給すると共に、古くなった培養液を培養液排出管６から抜き出す。抜き出された培養液は、廃液管３８に回収され、所定の処理を行った後に廃棄される。
【００４６】
また培養期間中にマイクロキャリアが不足した場合は、バルブ４５を開いてビーズ供給ホッパー４６からマイクロキャリアを培養容器２に追加する。
【００４７】
細胞の培養が完了すると、培養容器２を外部装置（圧力変化装置１５等）から取り外し、図示しない遠心分離機に掛ける。その結果、所望の細胞が分離される。
【００４８】
以上説明した培養装置１では、培養容器２内に仕切り構成管３を挿入して培養容器２内を二つの空間に仕切った。この構成は、培養液を中心部から吸排することができ、培養液の淀みが少ない点で推奨される。しかしながら、本発明は、この構成に限定されるものではなく、図４に示す様に培養容器６０内に平板状の仕切り壁６１を設け、当該仕切り壁６１によって培養容器６０内を二つの空間に仕切ってもよい。
図４に示す培養容器６０では、仕切り壁６１で仕切られた部位が気圧変動室７０として機能し、仕切り壁６１の外側が、主たる培養室７１として機能する。従って気圧変動室７０に設けられた開口６８は、図示しない圧力変化装置に接続される。
また図４において、開口７３は、図示しない気体供給装置３０に接続される。開口７４は、排気口である。
【００４９】
また前記した実施形態は、「主たる培養室」として機能する部位と、「気圧変動室」として機能する部位が一つの容器の内部に設けられた例であるが、「気圧変動室」が「主たる培養室」の外部に設けられていてもよい。
即ち図５に示すように培養容器６６を大瓶部（主たる培養室）６２と小瓶部（気圧変動室）６３に二分割し、この両者を導通管６５で接続したものであってもよい。図５に示す培養容器６６では、小瓶部６３に図示しない圧力変化装置を接続する。
また図５においても、開口７３は、図示しない気体供給装置３０に接続される。開口７４は、排気口である。
図５に示した培養容器６６では、大瓶部（主たる培養室）６２と小瓶部（気圧変動室）６３の下部近傍同士を導通管６５で接続したが、最下部に導通管を設けてもよい。勿論、全体形状が「Ｕ」字管の様なものであってもよい。
【００５０】
また上記した各実施形態では、「主たる培養室」として機能する部位が一つであり、「気圧変動室」として機能する部位についても一つであるが、一方又は双方が複数であってもよい。
例えば一つの「主たる培養室」に、２室又はそれ以上の「気圧変動室」が設けられていてもよい。逆に一つの「気圧変動室」をもって複数の「主たる培養室」の液面を昇降させてもよい。
【００５１】
また上述した本実施形態では、気体排出用開口７又は開口７４が、培養容器２，６０，６６内の気体の成分（二酸化炭素濃度等）を調節するための排気口と、内部の圧力を一定に維持するための排気口を兼ねているが、両者を別個のものとしてもよい。
【００５２】
また先の実施形態では、培養容器２に培養液圧送タンク４３やビーズ供給ホッパー４６を接続した。この構成によると、単にバルブを操作するだけで培地の更新や、担体の増量を行うことができる。しかしながら、これらの構成は必須ではなく、省略することもできる。培養液圧送タンク４３やビーズ供給ホッパー４６を省略する場合には、培養液供給開口８及びビーズ供給開口１０は不要である。
逆に、サンプリング用の開口等を培養容器２に設けてもよい。
また上記した実施形態では、ギャードモータ１８を採用することによって給排気の周期を変更可能とし、また軸部材２１の円板部材２０に対する取付け位置を変更可能として一回ごとの給排気量を変更可能とした。この構成によると、細胞等の成長過程において時期に応じた適切な攪拌を行うことができる。しかしながらこれらの構成についても、必須ではなく、省略することもできる。
【００５３】
また上記した実施形態では、各管や開口をいずれも蓋部材１２に設けたが、これらを培養容器２の側壁に設けてもよい。
【００５４】
培養装置１の製造方法は任意であるが、培養容器２と仕切り構成管３等をブロー成形等によって一体成形して製造することが望ましい。また或いは、蓋部材１２に仕切り構成管３等を射出成形等によって一体成形し、別途成形した培養容器２の本体部分に、蓋部材１２を接着してもよい。
【実施例】
【００５５】
図１に示す培養装置を試作した。培養装置１の培養容器２の内径は、５０ｍｍであり、仕切り構成管３の内径は、１５ｍｍである。そして培養装置をガンマー線滅菌した後、培地、担体及び培養する細胞を培養容器２に充填した。
なお本実施形態では、培地としては「ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％子ウシ血清」を使用し、担体はデキストランのマイクロキャリアを使用した。
培養する細胞としては、市販の間葉系幹細胞を使用した。
市販の間葉系幹細胞は、具体的にはＣａｍｂｒｅｘ社製であり、人体から取り出した骨髄液から間葉系幹細胞を分離したものである。
そして先述した実施形態の様に気体溜部材１６を伸縮して培養容器２内における培養液の液面を昇降し、培養液を攪拌しつつ細胞を培養した。
２０日後に担体を取り出して顕微鏡観察したところ、ほとんどのビースに細胞が着床していることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施形態の細胞培養装置の斜視図である。
【図２】図１の細胞培養装置の断面図である。
【図３】図１の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。
【図４】本発明の他の実施形態の細胞培養装置の作用を説明する説明図である。
【図５】本発明のさらに他の実施形態の細胞培養装置の断面図である。
【図６】従来技術の細胞培養装置の断面図である。
【符号の説明】
【００５７】
１ 培養装置
２，６０，６６ 培養容器
３ 仕切り構成管
５ 培養用気体供給管
６ 培養液排出管
７ 気体排出用開口
８ 培養液供給開口
１０ ビーズ供給開口
１５ 圧力変化装置
１６ 気体溜部材
１７ クランク部材
１８ ギャードモータ
２０ 円板部材
２２，７０ 気圧変動室
２３，７１ 主たる培養室
６２ 大瓶部（主たる培養室）
６３ 小瓶部（気圧変動室）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、前記培養容器は、主たる培養室と、当該培養室と連通する気圧変動室を備え、気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項２】
培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を有し、仕切り内の圧力を変化させる圧力変化手段を備え、仕切り内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項３】
培養容器内に培地と、細胞を着床させる担体が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養装置。
【請求項４】
仕切り部材は管体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の培養装置。
【請求項５】
仕切り部材は培養容器と一体であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の培養装置。
【請求項６】
内部に空間を有し、外部からの力によって前記空間が変形可能であり、且つ気密状態を維持することができる気体溜部材を備え、気体溜部材は仕切り内の空間と連通していることを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の培養装置。
【請求項７】
圧力変化手段は、圧力を、正負繰り返し状態となる様に変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の培養装置。
【請求項８】
培養容器には送気口と排気口が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の培養装置。
【請求項９】
培養容器には担体供給手段が取り付けられていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１０】
培養容器は気密状態とすることができるものであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の培養装置。
。
【請求項１１】
培養容器は底面が曲面状であり、遠心分離器に装着可能であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１２】
細胞を着床させる担体及び培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器は底面が曲面状であり、培養容器の内部には管体が設けられ、さらに管体内の圧力を正負繰り返し状態となる様に変化させる圧力変化手段を備え、管体内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項１３】
内部に仕切りが設けられた培養容器に液状の培地と細胞とを充填する工程と、仕切り内の圧力を変動させて培地の液面を昇降させる工程を含むことを特徴とする細胞又は微生物の製造方法。
【請求項１】
培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、前記培養容器は、主たる培養室と、当該培養室と連通する気圧変動室を備え、気圧変動室内の気圧を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項２】
培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器の内部を仕切る仕切り部材を有し、仕切り内の圧力を変化させる圧力変化手段を備え、仕切り内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項３】
培養容器内に培地と、細胞を着床させる担体が充填されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養装置。
【請求項４】
仕切り部材は管体であることを特徴とする請求項２又は３に記載の培養装置。
【請求項５】
仕切り部材は培養容器と一体であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれかに記載の培養装置。
【請求項６】
内部に空間を有し、外部からの力によって前記空間が変形可能であり、且つ気密状態を維持することができる気体溜部材を備え、気体溜部材は仕切り内の空間と連通していることを特徴とする請求項２乃至５のいずれかに記載の培養装置。
【請求項７】
圧力変化手段は、圧力を、正負繰り返し状態となる様に変化させることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の培養装置。
【請求項８】
培養容器には送気口と排気口が設けられていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の培養装置。
【請求項９】
培養容器には担体供給手段が取り付けられていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１０】
培養容器は気密状態とすることができるものであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の培養装置。
。
【請求項１１】
培養容器は底面が曲面状であり、遠心分離器に装着可能であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１２】
細胞を着床させる担体及び培養液が充填される培養容器を備え、当該培養容器内で細胞を培養する培養装置において、培養容器は底面が曲面状であり、培養容器の内部には管体が設けられ、さらに管体内の圧力を正負繰り返し状態となる様に変化させる圧力変化手段を備え、管体内の圧力を変化させて培養液の液面を昇降可能とすることを特徴とする培養装置。
【請求項１３】
内部に仕切りが設けられた培養容器に液状の培地と細胞とを充填する工程と、仕切り内の圧力を変動させて培地の液面を昇降させる工程を含むことを特徴とする細胞又は微生物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２８８２４４（Ｐ２００６−２８８２４４Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１１４５９（Ｐ２００５−１１１４５９）
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（０００１０８７９７）エスペック株式会社 (282)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【出願人】（０００１０８７９７）エスペック株式会社 (282)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]