基板上でビルドアップ型コンビナトリアルライブラリーを合成する方法
【課題】糖類をビルドアップ的に合成して糖鎖チップ等を作製する方法を提供すること。
【解決手段】選択的に脱保護可能な水酸基の保護基により保護された糖を基板に結合し、第１の所望の水酸基を選択的に脱保護した後、光切断保護基Ｗを該水酸基に導入する。基板の所望の領域を選択的に露光して、その領域にある保護基Ｗを選択的に脱保護した後、所望の糖又はキャッピング基を選択的に導入する。基板上のすべての保護基Ｗを変換するまで、この露光及び糖又はキャッピング基の導入を繰り返す。次に、第２の所望の水酸基を選択的に脱保護、Ｗ基の導入、露光、糖又はキャッピング基の導入を繰り返す事を特徴とする糖鎖チップの作製方法。
【解決手段】選択的に脱保護可能な水酸基の保護基により保護された糖を基板に結合し、第１の所望の水酸基を選択的に脱保護した後、光切断保護基Ｗを該水酸基に導入する。基板の所望の領域を選択的に露光して、その領域にある保護基Ｗを選択的に脱保護した後、所望の糖又はキャッピング基を選択的に導入する。基板上のすべての保護基Ｗを変換するまで、この露光及び糖又はキャッピング基の導入を繰り返す。次に、第２の所望の水酸基を選択的に脱保護、Ｗ基の導入、露光、糖又はキャッピング基の導入を繰り返す事を特徴とする糖鎖チップの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２以上の水酸基を有する化合物、典型的には糖類のコンビナトリアルライブラリーの合成方法に関し、さらに詳細には、２以上の水酸基を有する化合物の基板上でのビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法および該ライブラリーを含む基板に関する。特に、病気や、毒素の診断薬・検査薬としてのニーズが高い糖鎖チップ等を作製するのに有用な化合物ライブラリーの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病気や、各種毒素には糖鎖を認識するものがある。それらを迅速に検査する為には、各種糖鎖が基板上に結合している糖鎖チップを用いるのが迅速でかつ高感度であると考えられる。既にＤＮＡチップは市販されており、研究・診断に用いられている。更にペプチド（プロテイン）チップも研究が盛んに行われている。しかし、その複雑な構造ゆえ現在においても満足のいく糖鎖チップは存在していない。
【０００３】
現存するすべての糖鎖チップは天然から単離精製した糖鎖や、それを酵素処理したものや、単純な糖の有機合成品などを基板に結合させることにより作製されている。これらの糖鎖チップ上の糖鎖は数十種類程度で、より多種類の糖鎖を基板上に結合させる事が望まれている。多種類の糖鎖構造を有する糖鎖チップを作製する為には、まずは必要な数の糖鎖を調達する必要がある。糖鎖は複雑に分岐を有する構造で、有機合成するのも容易ではなく、従来の技術により数百ないし数千種類もの糖鎖を合成することは、事実上不可能である。また、もし仮に合成できたとしても、コストが非常にかかり、実用的ではない。現在のＤＮＡチップ作製法は基板上でのＤＮＡ合成手法であるアフィメトリクス法と、既に作製したＤＮＡを基板に結合させるスタンフォード法に２分される。ビルドアップ的に基板上で合成するチップは低価格化・集積化等に優れており、糖鎖チップにおいても基板上での合成が期待されている。しかし、今までに、基板上でビルドアップ的に糖鎖を合成し、糖鎖チップを作製した例はない。
【０００４】
多数の水酸基を有する化合物（特に糖質、複合糖質、それらの誘導体又は類縁体）のコンビナトリアルライブラリー合成は未だ達成されていない未開の領域である。それはひとえに同じような反応性を持つ水酸基を選択的に脱保護させる技術、特にコンビナトリアルライブラリー合成に最適化された水酸基の保護基の技術が存在していない為である。多くの従来の技術では様々な種類の保護基を適宜用いて、その反応性の違いを利用して目的の保護基のみを選択的に脱離させていたが、この様な手法では、コンビナトリアルライブラリー合成は現実的には不可能である。
【０００５】
これを可能にする唯一の技術として、特定の保護基Ｙを用いた方法（以下「Ｙ法」という）が挙げられる（特許文献１及び２）。Ｙ法を用いれば、単にＹ基の重合度を変えるだけで無限の水酸基を選択的に脱保護させる事が出来る。
特許文献１及び２記載の方法は、重合度の異なる保護基により多くの水酸基を保護し、重合度の違いにより脱保護する順番を決定し、選択的に目的の水酸基を脱保護させることができるという手法である。それにより、樹脂ビーズ上で糖鎖ライブラリーを構築することができる。
しかし、この手法を基板上でのコンビナトリアルライブラリー合成に適応しようとすると、次のような問題があった。すなわち、基板のある部位のみに選択的に反応させる事が必要である為、当然、光による制御が必要になってくるが、光による反応を特許文献２記載の方法に組み合わせると非常に長い反応段階が必要になるということである。
【０００６】
特許文献２記載の方法を用いて基板上でビルドアップ的に糖鎖を合成する手法を図１に示す。
図１において、特許文献２記載の方法の典型的な構造として、糖の水酸基がＡ−Ｙ、Ａ−ＹＹ（Ａは酸性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良い。）により保護された、（１）の構造を有する糖が表面に結合したガラスを想定する。Ａはここでは酸性条件で脱離可能なＢｏｃ基（ターシャリー−ブトキシカルボニル基）とし、Ｙを−［（ＣＨ3ＣＨ2）2ＣＨ］Ｎ−ＣＨ2−ＣＯ−とする。ＲはＡの脱離する条件及び、光反応・ＰＩＴＣ化反応・ＴＦＡ処理反応・再Ｂｏｃ化反応・縮合反応で脱離しない保護基、例えばＢｚ基（ベンゾイル基）またはＢｎ基（ベンジル基）とする。
【０００７】
基板上のある特定の位置に存在する水酸基を選択的に脱保護させる為には、光により反応する保護基を用いるのが一般的である。そこで、酸性条件で切断できるＢｏｃ基を光により切断しようとする場合、光を当てると酸を発生する光酸発生剤が必要になる。この光酸発生剤を基板にコートしてから目的の部位に選択的に光を当て、酸を発生させ、Ｂｏｃ基を切断する。Ｂｏｃ基が切断されたら、その後はＹの重合度を減少させる操作を行う。
まずはＰＩＴＣ（フェニルイソチオシアネート）を反応させ、次にＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により２重合を１重合に変換し（すなわち、ＹＹをＹに）、同時に１重合のＹを除去し水酸基を脱保護する。最後に再Ｂｏｃ化を行い一連の反応を終了し基板（３）を得る。ここで選択的に脱保護された水酸基に次の糖を縮合させる。ここではＧａｌを導入し、部位特異的にＧａｌが導入された基板（４）を得る。
この操作を繰り返すことにより、基板の部位特異的に構造の異なる糖鎖を組み上げる（ビルドアップする）ことができる。しかし、１種類の糖を導入するのに、１.光によるＢｏｃ基の切断、２.ＰＩＴＣ化、３.ＴＦＡ処理、４.再Ｂｏｃ化、５.縮合、と５段階を必要とする。仮に異なる５種類の糖を導入しようとすると、５×５で２５段階が必要であり、非常に多段階を必要とする。従って、この方法は、糖の種類を増やしていったときには実現が極めて困難となってしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４１０２２６３号
【特許文献２】特開２００８−２０１６８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、特許文献２記載の技術上の問題点を改良し、基板上での糖鎖合成をより実現可能なものにしようとするものである。
すなわち、本発明の目的は、２以上の水酸基を有する化合物を基板上でビルドアップ的に合成してコンビナトリアルライブラリーを合成する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、糖類をビルドアップ的に合成して糖鎖チップ等を作製する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、病気や、毒素の診断薬・検査薬としてのニーズが高い糖鎖チップ等の基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下に示す化合物ライブラリーの合成方法及びこれを含む基板を提供するものである。
１．基板上に結合した、少なくとも２個の水酸基を有する化合物であって、そのすべての水酸基が、脱保護条件が相互に異なる少なくとも２種の保護基からなる群から選ばれる保護基で保護された化合物をアクセプターとして用い、該保護基を選択的に脱保護し、脱保護された水酸基に所望のドナー又はキャッピング基を選択的に導入して一枚の基板上でビルドアップ型コンビナトリアルライブラリーを合成する方法において、
（１）第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程、
（２）脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基（Ｗは光分解により脱離可能な保護基を示し、ＺはＷ基が脱離する光分解の条件でＷ基と同時に脱保護される基、もしくはＷ基が脱離する事により、活性化（もしくは不安定化）され、選択的に除去可能になる基を示す）を導入する工程、
（３）基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（４）ｎが２以上の整数である場合、工程（３）を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（５）第２の保護された水酸基について、工程（１）から（４）を繰り返し、第２の保護された水酸基を脱保護し、脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基を導入し、基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入し、上記工程を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（６）必要により、工程（５）を所望の、保護された水酸基について繰り返し、各水酸基の各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、第１ないし第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程を含み、
工程（１）〜（６）において、繰り返して使用する、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基、基板の分割部位の数ｎ、ドナー又はキャッピング基は、同一でも異なっていても良い、
ことを特徴とする、ビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法。
２．アクセプターの水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良く、ｍはＹの重合度を示し、１以上の整数であり、ｍが２以上の整数の場合、各Ｙ中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、相互に同一でも異なっていても良い。）である上記１記載の方法。
３．第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程が、Ａ（Ｙ）ｍ基のＹ基中の酸アミド結合をＮ末端側から逐次切り離す方法により重合度の小さなＹ基を選択的に脱保護する工程を含む上記２記載の方法。
４．アクセプターの１個の水酸基の保護基がＶ基（Ｖは塩基性、酸化剤、フッ素化合物、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。）であり、他の少なくとも１個の水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。ただし、ＡがＶと同一であることはなく、Ｖの脱離条件でＡが脱離することはない。）であり、第１の保護された水酸基がＶ基で保護された水酸基である上記１又は２記載の方法。
５．ドナーがＡ（Ｙ）ｍ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含み、工程（１）〜（６）を繰り返すことを特徴とする上記１〜４のいずれか1項記載の方法。
６．ドナーがＶ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含む上記１〜５のいずれか１項記載の方法。
７．アクセプターが糖である上記１〜６のいずれか１項記載の方法。
８．保護基ＡがＢｏｃ基であり、保護基ＷがＮＰＰＯＣ基である上記１〜７のいずれか１項記載の方法。
９．アクセプターが、リンカーを介して基板に固定されている上記１〜８のいずれか１項記載の方法。
１０．基板が、ガラスである上記１〜９のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、複雑な構造の化合物ライブラリー、特に糖鎖ライブラリーを簡単に、かつ正確、短工程で基板上で作り分けることが可能である。従って、一枚の基板上に構造の異なる数百〜数千の糖鎖を少ない工程数で正確かつ効率よく構築することが現実的に可能である。
本発明により製造された、化合物ライブラリーが結合した基板（具体的には糖鎖チップ）は、生物を扱うすべての分野に利用可能である。例えば、病気や、毒素の診断薬・検査薬等として極めて有用である。
糖鎖は遺伝子、蛋白質に継ぐ第３の生命鎖として重要であり、ＤＮＡチップ、プロテインチップに次ぐ糖鎖チップは生命科学に必須なツールである。本発明（基板上でのビルドアップ的糖鎖チップ作製手法）により、第３の生命鎖として重要な糖鎖を、基板上で効率よく作製することができると共に、様々な構造の糖鎖機能を一度に解析可能なツールである糖鎖チップを提供する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】特許文献２記載の方法の概要を示すスキームである。
【図２】本発明の方法の概要を示すスキームである。
【図３】基板に結合した３つの水酸基を有する化合物（各水酸基はそれぞれ脱離条件の違う保護基により保護されている）と、その置換基を示す模式図である。
【図４】それぞれ保護された、３つの水酸基を有する丸囲み数字１の化合物（例えばＧａｌ）の保護基Ａを脱保護した後、光切断保護基（星印）を導入して得られた基板の模式図を示す。ここでは基板に均一に同じ化合物が存在する。
【図５】図４の基板の左１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図６】図５の基板の中央１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図７】図６の基板の右１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図８】図７の基板の保護基Ｂを脱保護し、光切断保護基（星印）を導入して得られた基板の模式図を示す。
【図９】図８の基板を横方向に３分割し、まず下１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図１０】図９の基板の中央１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１１】図１０の基板の上１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１２】図１１の基板の保護基Ｃを脱保護し、光切断保護基（星印）を導入した基板の模式図を示す。
【図１３】図１２の基板を３分割し、３区分の各区分の左１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図１４】図１３の基板の３区分の各区分の中央１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１５】図１４の基板の３区分の各区分の右１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１６】以上の手順により複雑な構造の種々の化合物（例えば糖鎖）（２７種類：順列組み合わせで可能な全構造）が形成された基板の模式図を示す。
【図１７】実施例２で作製したガラスの蛍光スキャナーによる観察結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特許文献２記載の方法によれば、重合度の異なる保護基により基板上に存在する水酸基を保護した後、重合度の違いを利用して選択的に目的の水酸基を脱保護させる。ここで脱保護される水酸基は多数ある水酸基の中の特定の水酸基であるが、基板の部位による差はない。その後、特許文献２記載の方法では、次の糖もしくはキャッピング基を導入している。
本発明では、新たに、光で切断可能な水酸基の保護基（Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基）を導入しているため、基板上の目的の部位を選択的に露光することにより、その部位にある水酸基を選択的に脱保護することができる。このため、その後、次の糖を縮合すれば、露光部の基板上で脱保護された水酸基のみに次の糖が縮合され、基板の部位選択的に目的の糖鎖構造を構築することができる。
【００１４】
本発明の方法を、図２を参照しながら説明する。
図１と同じ基板（１）をスタート物質とする。基板としては、各種板状ガラス（例えば、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナケイ酸塩ガラス、シリカガラス、リン酸塩系ガラス、亜テルル酸塩ガラス、ハロゲン化物ガラス、カルコゲナイドガラス等）、板状各種樹脂（例えば、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、熱硬化性ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、ABS樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンスルファイド、ポリスルホン等）、板状各種繊維、板状シリカ、セロファン等が挙げられる。これら基板に対して、APTES（3-aminopropyltriethoxysilane: 3-アミノプロピルトリエトキシシラン）処理や、紫外線処理、電子線処理、プラズマ処理、高圧処理、高温処理、酸処理、塩基処理等を行い、表面改質を行う。この様な処理により表面に現れる官能基としては例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲノ基等が挙げられる。基板の寸法は幅1mmから100mm、好ましくは5mmから50mm、長さは1mmから200mm、好ましくは10mmから100mm、厚みは0.01mmから20mm、好ましくは0.1mmから5mmである。
【００１５】
アクセプターは、基板に直接固定しても良いが、リンカーを介して固定してもよい。リンカーの種類は特に制限がなく、基板に共有結合していても良く、疎水結合でも良い。例えばポリエチレングリコール、６−ヒドロキシヘキサン酸、２−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）酢酸、４−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）安息香酸、６−ヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ヘキサンアミド等が挙げられる。
【００１６】
アクセプターは、保護された水酸基ｎ個（ｎは２以上の整数）を有する化合物であれば特に制限されない。例えば、６炭糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、フコース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、ソルボース、タガトース、フルクトース、プシコース等、５炭糖、例えば、アラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、キシルロース等、更に、９炭糖のシアル酸等、これらのオリゴ糖、複合糖質、これらの誘導体及び類縁体等が挙げられる。
【００１７】
ドナーとしては、アクセプターとして例示した上記化合物が挙げられる。ドナーが糖である場合、そのアノメリック位水酸基は、リン酸エステル基、トリクロロアセトイミデート基、フェニルチオ基、メチルチオ基、ブロモ基、クロロ基、フルオロ基、ヨード基等、化学的に活性化可能な置換基に変換しておく必要がある。更にアノメリック位以外の水酸基の中で、後に他のドナー糖、又はキャッピング基を導入する予定の水酸基には目的の水酸基を選択的に脱保護可能な、オルソゴナルな保護基（orthogonal protecting groups）（ある特殊な条件で、他の保護基に影響を与えずに目的の保護基のみ選択的に脱保護可能な保護基の総称）を導入しておく必要がある。後に他のドナー糖、又はキャッピング基を導入する予定のない水酸基には、先に導入したオルソゴナルな保護基の脱離条件、縮合条件、光切断条件等、一連の反応条件で脱離しない保護基を導入しておく必要がある。このようなオルソゴナルな保護基として、例えば、ＮＨ2ＮＨ2（ヒドラジン）により選択的に除去可能なＬｅｖ基（レブリニル基）、thiourea（チオウレア）により選択的に除去可能なＣｌＣＨ2ＣＯ基（クロロアセチル基）、NaOMe（ナトリウムメチラート）により除去可能なＰｈＣＯ基（ベンゾイル基）を導入し、それ以外の水酸基は上記反応条件では安定でかつ、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）により除去可能なＢｎ基（ベンジル基）等を導入する。あるいは、オルソゴナルな保護基として、適切な重合度で、且つ適切な保護基を有するＹ基、又は、中性又は塩基性で脱離可能な保護基Ｖ基、又は光切断可能なＷ又はＷ（Ｚ）基を導入し、それ以外の水酸基には、Ｙ基の重合度を減少させるエドマン分解の反応条件及び、縮合条件及び、中性又は塩基性条件で脱離可能な保護基Ｖの除去条件、さらには、光切断条件に対して安定な保護基、例えば、ベンゾイル基、ベンジル基、アセチル基等を導入する。
【００１８】
アクセプターとドナーの反応は、公知の条件、例えば、活性化剤としてＴＭＳＯＴｆ、ＢＦ3ＯＥｔ2、ＮＩＳ−ＴｆＯＨ等を用い、反応溶媒としてジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等中、温度−４０〜５０℃で５分〜２４時間程度行えば良い。
【００１９】
本発明に使用する「キャッピング基」としては、オルソゴナルな保護基の脱離条件で脱離しない保護基が使用される。例えば、オルソゴナルな保護基がＹ基の場合、Ｂｚ基、Ｂｎ基、アセチル基、クロロアセチル基、レブリニル基、TBDMS基（ターシャリー−ブチルジメチルシリル基）、TBDPS基（ターシャリー−ブチルジフェニルシリル基）等が「キャッピング基」として使用される。
【００２０】
本発明の説明の便宜上、以下、アクセプター及びドナーとして糖を使用した場合について説明する。また、便宜上、光切断保護基（Ｗ基）としてＮＰＰＯＣ基［２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル基］、キャッピング基としてＢｚ基、ＡとしてＢｏｃ基、ＲとしてＢｚ基、Ｙとして−[（ＣＨ3ＣＨ2）2ＣＨ]Ｎ−ＣＨ2−ＣＯ−を使用した場合について説明する。
図２において、本発明ではまず、Ｙ基の重合度を減少させる操作を行う。つまり、１.ＴＦＡによる脱Ｂｏｃ化、２.ＰＩＴＣ化、３.ＴＦＡ処理、４.再Ｂｏｃ化を行うと、Ｙ基の重合度が一つずつ減少し、１重合のＹ基が選択的に脱保護される。その後、光切断保護基であるＷ基を導入する。１つの水酸基が選択的に脱保護されるため、Ｗ基も選択的に目的の水酸基に導入され、基板（８）が得られる。
基板の目的の部位を選択的に露光すると、その部位に存在するＷ基が脱離され、水酸基が脱保護された基板（９）が得られる。
そこに次の糖を縮合させる。ここではＧａｌを導入して基板（１０）を得ている。次に、基板（１０）の別の部位を露光すると、露光部の水酸基が選択的に脱保護された基板（１１）が得られる。基板（１１）のこの水酸基に、また別の糖、ここではＧｌｃを導入して基板（１２）を得ている。
【００２１】
このように、本発明によれば、導入する糖の種類が増えても露光、縮合の２段階が増えるのみである。本発明の方法では、２種類の糖の導入は、最初の５段階＋１種類目の糖の導入で２段階＋２種類目の糖の導入で２段階の全９段階で可能である。仮に異なるｎ種類の糖を導入しようとすると、（５＋２ｎ）段階（例えば、糖の種類が５種類であれば、５＋２＋２＋２＋２＋２の１５段階）でよく、導入する糖が増えれば増えるほど図１に示した従来の方法と比較して、反応段階が飛躍的に減少する。従って、本発明によれば、一枚の基板上に構造の異なる数百、数千の糖鎖を構築することが現実的に可能である。
【００２２】
多種類の糖鎖を基板上に構築する具体的な手法を、図３〜１６を参照しながら、詳細に説明する。
ここでは便宜上丸囲み数字１をＧａｌ、丸囲み数字２をＧｌｃ、四角囲み数字３をＧｌｃＮＡｃとしている。Ｇａｌの各水酸基は以下のように保護されているとする。Ｇａｌの２位水酸基は今後の反応で影響がない保護基により保護されている（例えばＢｚ基、Ｂｎ基等）。３位水酸基はＢ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＢという保護基により保護されている。４位水酸基はＡ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＡという保護基により保護されている。６位水酸基はＣ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＣという保護基により保護されている。Ｇａｌの３位、４位、および６位水酸基に、例としてそれぞれＧｌｃとＧｌｃＮＡｃを導入する手法を示す。順列組み合わせで可能な全２７種類の糖鎖の合成が、本発明を使えば短い反応段階で可能になる。
まずは、Ａを選択的に脱離し、光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図４に示す。ここでは基板に均一に同じ化合物が結合している。
【００２３】
図４の左１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行い、基板図５を得る。
次に中央１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２のＧｌｃを選択的に導入し、基板図６を得る。
最後に右１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃを選択的に導入し、基板図７を得る。
次にＢを選択的に脱保護し、３位水酸基に選択的に光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図８に示す。
【００２４】
先ほどと同様に基板を今度は横方向に３分割しそれぞれ露光する。まず下１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基にキャッピング基を導入しキャッピングを行い（図９）、次に、中央１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基に丸囲み数字２のＧｌｃを導入し（図１０）、さらに上１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基に四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃを導入する（図１１）。
最後にＣを選択的に脱保護し、６位水酸基に選択的に光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図１２に示す。
【００２５】
再度、基板を３分割し、３分割した各区分の左１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基にキャッピング基を導入しキャッピングを行い（図１３）、次に３分割した各区分の中央１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基に丸囲み数字２のＧｌｃを導入し（図１４）、さらに右１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基に四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃ（図１５）を導入する。
以上の手順により複雑な構造の糖鎖も簡単に、かつ正確、短工程で作り分けることが可能である（図１６）。
【００２６】
本発明において選択的に脱保護可能な水酸基の保護基の例としては、特許文献１及び２記載のＹ基、及び一般的なオルソゴナルな水酸基の保護基（Boltje, T. J., C. X. Li, et al. (2010). Organic Letters 12(20): 4636-4639.）が使用可能である。一般的なオルソゴナルな水酸基の保護基の例としては以下のものが挙げられる(Sears, P. and C. H. Wong (2001). Science 291(5512): 2344-2350.)。
【００２７】
【００２８】
これら保護基を使用して選択的に目的の水酸基を脱保護する事は一般的常套手段である。括弧の中の試薬は脱保護試薬である。
Pd/C:パラジウム炭素、Pd nanoparticles:パラジウムナノパーティクル、TFA:トリフルオロ酢酸、DDQ: 2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン、NaOMe:ナトリウムメチラート、2°amine:２級アミン、acid:酸、TsOH:p-トルエンスルホン酸、tBuKO:カリウム ターシャリーブトキシド、Ir:イリジウム、Pd:パラジウム、Rh:ロジウム、Bu4NF:フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム、HF:フッ化水素、AcOH:酢酸、thiourea:チオウレア、NaHCO3:炭酸水素ナトリウム、NH2NH2:ヒドラジン。
【００２９】
本発明において、光分解により脱離可能な保護基Ｗの例としては、ＮＰＰＯＣ基［２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル］（Kim, C., J. Kaysen, et al. (2006). Microelectronic Engineering 83(4-9): 1613-1616.）、ＭＮＰＰＯＣ基［2-(3,4-メチレンジオキシ−6−ニトロフェニル)-プロピルオキシカルボニル］（Bhushan, K. R. (2006). Organic & Biomolecular Chemistry 4(10): 1857-1859.）、ＮＶＯＣ基（オルト-ニトロベラトリルオキシカルボニル）（Patchorn.A, B. Amit, et al. (1970). Journal of the American Chemical Society 92(21): 6333-6335.）、ＭｅＮＰＯＣ基（α-メチル-オルト−ニトロピペロニルオキシカルボニル）（McGall, G. H., A. D. Barone, et al. (1997). Journal of the American Chemical Society 119(22): 5081-5090.）、Ａｑｍｏｃ基（アントラキノン-2-イルエトキシ-カルボニル）（Furuta, T., Y. Hirayama, et al. (2001). Organic Letters 3(12): 1809-1812.）、ＤＭＢ基（３，５−ジメトキシベンゾイン−カルボニル）（Pirrung, M. C., L. Fallon, et al. (1998). Journal of Organic Chemistry 63(2): 241-246.）等が挙げられる。
【００３０】
Ｗ（Ｚ）のＺ基の例としては、
【００３１】
などが挙げられる。
【００３２】
この様なＺ基はＷが切断される条件で同時に切断される。あるいはＷ基が切断される事により不安定になり弱酸性、もしくは弱塩基性で切断されるようになるものもある。またＷが切断される条件では完全には切断されず、その後、ＰＩＴＣ化を行う事により選択的に定量的に切断されるものもある。
ここで挙げた構造のみならず、Ｗ基が切断される事により活性化（もしくは不安定化）され、他の保護基に影響を与えない特殊な反応条件で選択的に切断され、脱保護される構造はいずれもＺとして使用することができる。
【００３３】
光分解により脱離可能な保護基ＷもしくはＷ（Ｚ）を脱離するのに使用する露光光源としては例えば、太陽光、ＵＶランプ、ＬＥＤ、水銀ランプ、レーザー、エキシマランプ等が挙げられ、露光量は0.01〜100 mW/cm2、好ましくは0.1〜50 mW/cm2、露光時間は通常１秒〜２４時間、好ましくは２０秒〜３時間である。露光の際の温度は０〜１００℃が適当であり、通常は室温でよい。
【００３４】
また、本発明において、塩基性、酸化剤、フッ素化合物、酵素、または２段階反応により脱離可能な保護基Ｖの例を表１に示すが、ここで挙げた構造に限定されるわけではない。
【００３５】
【表１】
【００３６】
さらに本発明において、Ｙの例としては、
等が挙げられる。
【００３７】
さらに本発明において、アクセプターを基板に結合する際に使用しても良いリンカーは特に制限はなく、リンカーは基板に対して共有結合していても良く、疎水結合でも良い。例えば、ポリエチレングリコール、６−ヒドロキシヘキサン酸、２−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）酢酸、４−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）安息香酸、６−ヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ヘキサンアミド等が挙げられる。
基板にリンカー又はアクセプターを結合する方法に特に限定はなく、例えばグリコシド結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、アルキル結合等により容易に結合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例において、質量分析装置ESI-FT-MSは、Bruker社製REFLEX IIを用いた。また、ＨＰＬＣは、Waters社製Delta600を用い、カラムとしてMightysil RP-18 GP 250-4.6 (4.6 x 250 mm, 5 μm, 関東化学)を付け、流速1 ml/minで流した。最初アセトニトリル：水＝30：70で１０分流し、１０分後直ちに40：60に変更した。その後５０分かけて50：50に変わるよう直線的にグラジェントをかけた。２１５nmでのUV吸収を検出した。蛍光スキャナーは、ＧＥヘルスケア社製Typhoonを用いた。溶媒及び試薬は市販の試薬グレードを用いた。
【００３９】
また、この明細書において、次の略号を使用する。
２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル(NPPOC)
二炭酸ジ-ターシャリー-ブチル（Boc2O）
Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）
４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）
ジクロロメタン（CH2Cl2、DCM）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）
フェニルイソチオシアネート（PITC）
Ｎ−メチルモルフォリン（NMM）
Ｎ−ヨードスクシンイミド（NIS）
トリフルオロメタンスルホン酸（TfOH）
安息香酸（BzOH）
トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）
テトラヒドロフラン（THF）
トリフルオロ酢酸（TFA）
tert（ターシャリー）−ブトキシカルボニル（Boc）
９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Fmoc）
ベンゾイル（Bz）
ベンジル（Bn）
チオフェニル（SPh）
アリール（Ar）
室温（r.t.）
ガラクトース（Gal）
グルコサミン（GlcN）
グリシン（Gly）
2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基（Troc）
ユニケモハイドロキシ保護基（UCHP）（特許文献１及び２記載のＹ基の総称）
【００４０】
実施例１
この実施例では、一枚のガラス上に結合位置の異なる３種類の２糖を作りわけている。
実施例１Ａ（アクセプターを基板に結合する工程）
ガラス（１３）（シリカガラスを3-アミノプロピルトリエトキシシラン処理後、６−ヒドロキシヘキサン酸を結合させた物。これによりガラス表面に水酸基を有するリンカーが共有結合している）にFmocGlyを導入し、導入されたFmocの量を定量することにより水酸基のローディング量を0.0235mmol/gと決定した。
そのガラス（１３）の全面にまず、３位水酸基がＢｏｃを持った１重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)で保護され、４位水酸基がNPPOCで保護され、６位水酸基がＢｏｃを持った２重合のＹ基により保護されたグルコサミンドナー（１５）を導入した。
ガラス（１３）３枚（(i)1.561g（2.7cm x 2.6cm x 0.1cm）、(ii)2.190g（5.0cm x 2.5cm x 0.1cm）、(iii)2.178g（5.0cm x 2.5cm x 0.1cm））に、グルコサミンドナー（１５）(566mg）、モレキュラーシーブス４Ａ(4.67g)、ＮＩＳ(309mg)を加え、窒素雰囲気下、脱水ジクロロメタン（6ml）を加えて、-30℃で振盪した。そこにTfOH (122μl)を加え-30℃で1日振盪した。ガラスをNa2S2O3水溶液／アセトン、水、メタノール、ＤＭＦの順に洗浄後、縮合時に切断されたＢｏｃ基の再導入のため、ＤＭＦ(6ml)、Ｂｏｃ2Ｏ(600μl)、飽和重曹水(600μl)を加え、室温にて4時間振盪した。ガラスを水／ＤＭＦ、ＤＭＦ、クロロホルムの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（１６）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（１６）を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし、切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物（化合物１７）を確認した。
化合物１７：MALDI-TOF-MS, C59H95Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1335.56, 実測値：1336.5
【００４１】
【化１】
【００４２】
縮合されなかった未反応の水酸基に対してBzキャッピングを行った。ガラス（１６）にBz2O (600mg)、DMAP (15mg)、ピリジン（6ml）を加え室温にて４時間振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ量でBz化を４時間行った。反応液を除去した後、ガラスを水／ＤＭＦ、２Ｎ―塩酸水、水、ＤＭＦ，クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。
Bzキャッピング後のガラスを４領域に区別する為にガラス切りで下記スキームに示すように十字の線を書いた。
【００４３】
【化２】
【００４４】
それぞれ、以下、領域１、領域２，領域３，領域４と呼ぶ。領域１には単糖（GlcN）、領域２には２糖（Galβ1-4GlcN）、領域３には２糖（Galβ1-3GlcN）、領域４には２糖（Galβ1-6GlcN）を作り分ける。
【００４５】
実施例１Ｂ（Galβ1-4GlcN構造を構築する工程）
まず、GlcNの４位水酸基を選択的に脱保護し、Galβ1-4GlcN構造を構築する為に、領域２だけに光を当てる。ガラスをアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域２にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域２に存在するGlcNの４位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（１８）を得た。
領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物１９を確認した。
化合物１９：MALDI-TOF-MS, C49H86Cl3N5O16Na+ (M+Na)+の計算値：1128.50, 実測値：1129.1
【００４６】
【化３】
【００４７】
ガラス（１８）にガラクトースドナー（２０）を縮合する。３枚のガラス（１８）（(i)1.1697g、(ii)1.5026g、(iii)2.1835g）に、ガラクトースドナー（２０）（116.4mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を入れ窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を入れ、−15℃に冷却した。−15℃にてTMSOTf（85μl）を入れそのまま２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。この縮合操作はもう一度同じ条件にて繰り返した。縮合時に脱離したBoc基の再導入の為に、縮合後のガラスにDMF（７ml）、Boc2O（700μl）、飽和重曹水（700μl）を加え室温にて６時間振盪した。ガラスをDMF/水、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。この再Boc化も同じ条件にて繰り返しガラス（２１）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（２１）の領域２を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(２２)を確認した。
化合物２２：MALDI-TOF-MS, C83H118Cl3N5O22Na+ (M+Na)+の計算値：1664.72, 実測値：1664.7
【００４８】
【化４】
【００４９】
次に、他の領域の４位水酸基をBz基にてキャッピングをする為に、他の領域（領域１，３，４）に光を当て、NPPOCを脱離する。
ガラスをアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，３，４だけに室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，３，４に存在するGlcNの４位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（２３）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの４位がBz化された化合物２４を確認した。
化合物２４：MALDI-TOF-MS, C56H90Cl3N5O17Na+ (M+Na)+の計算値：1232.53, 実測値：1233.5
【００５０】
【化５】
【００５１】
次に、GlcNの３位水酸基を選択的に脱保護する。特許文献１及び２記載の方法に従いＹ基の重合度を一つずつ減少させる。３位の１重合のＹ基を脱離すると共に、６位の２重合のＹ基を１重合にする。ガラス（２３）に、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、Boc2O（800μl）、飽和重曹水（800μl）を加え、室温にて１日振盪した。ガラスをDMF／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。その後もう一度Boc化を同様に行い、ガラス（２５）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて１時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がAc化され（選択的に脱保護された３位水酸基にアセチル基が選択的に導入された）、６位が１重合のＹ基により保護された化合物２６を確認した。
化合物２６：MALDI-TOF-MS, C39H58Cl3N3O14Na+ (M+Na)+の計算値：920.29, 実測値：920.4
【００５２】
【化６】
【００５３】
選択的に脱保護された３位水酸基に光切断保護基であるNPPOCを導入する。ガラス（２５）にピリジン（10ml）、NPPOC-OPNP（324mg）、DMAP（229mg）を加え室温にて１日振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このNPPOC化はさらに２回同様に行い、合計３回行い、ガラス（２７）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がNPPOC化された化合物２８を確認した。
化合物２８：MALDI-TOF-MS, C47H65Cl3N4O17Na+ (M+Na)+の計算値：1085.33, 実測値：1085.3
【００５４】
【化７】
【００５５】
実施例１Ｃ（Galβ1-3GlcN構造を構築する工程）
領域３に選択的にGalβ1-3GlcN構造を構築するために、領域３のみ３位水酸基を脱保護し、他の領域はBz基にてキャッピングする必要がある。
まず、領域１，２，４に対して３位水酸基のBzキャッピングを行う。ガラス（２７）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，２，４にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，２，４に存在するGlcNの３位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（２９）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がBz化された化合物３０を確認した。
化合物３０：MALDI-TOF-MS, C44H60Cl3N3O14Na+ (M+Na)+の計算値：982.30, 実測値：982.3
【００５６】
【化８】
【００５７】
次は領域３に選択的に光を当て３位水酸基を脱保護させる。ガラス（２９）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域３にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域３に存在するGlcNの３位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（３１）を得た。
領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物３２を確認した。
化合物３２：MALDI-TOF-MS, C37H56Cl3N3O13Na+ (M+Na)+の計算値：878.28, 実測値：878.4
【００５８】
【化９】
【００５９】
ガラス（３１）の領域３に選択的にガラクトースを導入する。ガラス（３１）にガラクトースドナー（２０）（232.8mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を加え-15℃に冷却した。-15℃でTMSOTｆ（169μl）を加え、２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。縮合時に切断されたBoc基の再導入のために、ガラスにDMF(10ml)、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて６時間振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムにて洗浄後真空乾燥した。この再Boc化はもう一度同じ条件にて繰り返し、ガラス（３３）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（３３）の領域３を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(３４)を確認した。
化合物３４：MALDI-TOF-MS, C71H88Cl3N3O19Na+ (M+Na)+の計算値：1414.50, 実測値：1414.5
【００６０】
【化１０】
【００６１】
次は、未反応の水酸基をBz基にてキャッピングを行う。ガラス（３３）にBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返した。その後、GlcNの６位水酸基を選択的に脱保護する。ガラスに、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥し、６位水酸基が選択的に脱保護されたガラスを得た。その後６位水酸基にNPPOCを導入した。ガラスにジクロロメタン（10ml）、NPPOC-OPNP（324mg）、DMAP（229mg）を加え室温にて１日振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このNPPOC化はもう一度同様に行い、ガラス（３５）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がNPPOC化された化合物３６を確認した。
化合物３６：MALDI-TOF-MS, C42H48Cl3N3O15Na+ (M+Na)+の計算値：962.20, 実測値：962.2
【００６２】
【化１１】
【００６３】
実施例１Ｄ（Galβ1-6GlcN構造を構築する工程）
領域４に選択的にGalβ1-6GlcN構造を構築するために、領域４のみ６位水酸基を脱保護し、他の領域はBz基にてキャッピングする必要がある。まず、領域１，２，３に対して６位水酸基のBzキャッピングを行う。ガラス（３５）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，２，３のみに室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，２，３に存在するGlcNの６位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（３７）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がBz化された化合物３８を確認した。
化合物３８：MALDI-TOF-MS, C39H43Cl3N2O12Na+ (M+Na)+の計算値：859.18, 実測値：859.5
【００６４】
【化１２】
【００６５】
次は領域４に選択的に光を当て６位水酸基を脱保護させる。ガラス（３７）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域４にのみ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域４に存在するGlcNの６位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（３９）を得た。
領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物４０を確認した。
化合物４０：MALDI-TOF-MS, C32H39Cl3N2O11Na+ (M+Na)+の計算値：755.15, 実測値：756.3
【００６６】
【化１３】
【００６７】
ガラス（３９）の領域４に選択的にガラクトースを導入する。ガラス（３９）にガラクトースドナー（２０）（232.8mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を加え-15℃に冷却した。-15℃でTMSOTｆ（169μl）を加え、２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥し、各領域を作り分けたガラス（４１）を得た。
【００６８】
各領域のガラスを少々砕き玉尾酸化することによりそれぞれ選択的に目的の構造が合成できていることを確認した。領域１から化合物４２（目的の単糖）、領域２から化合物４３（目的の２糖（Galβ1-4GlcN））、領域３から化合物４４（目的の２糖（Galβ1-3GlcN））、領域４から化合物４５（目的の２糖（Galβ1-6GlcN））を得た。
化合物４２：MALDI-TOF-MS, C39H43Cl3N2O12Na+ (M+Na)+の計算値：859.18, 実測値：859.7
化合物４３：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1292.5
化合物４４：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1291.7
化合物４５：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1291.8
【００６９】
【化１４】
【００７０】
以上の結果より、本発明の手法を用いると構造の異なる糖鎖をビルドアップ的に基板上に合成できることがわかる。
すべての工程をMSにより追跡できた事、及び特許文献１及び２記載の方法により、Ｙ基を用いた重合度の減少による水酸基の連続的脱保護は、選択的に進行することが証明されている事から、目的の領域に目的の化合物が合成できていることは確かであるが、念のため標品を用いたHPLCの保持時間の比較を行った。
領域２，３，４を玉尾酸化することにより得られる３種類の２糖、化合物（４３）（Galβ1-４GlcN）、化合物（４４）（Galβ1-３GlcN）、化合物（４５）（Galβ1-６GlcN）に対して、メタノール中、NaOMeを作用してそれぞれ化合物（４６）、（４７）、（４８）を得た。別途用意したこれら３種と同じ構造の化合物標品と、HPLCの保持時間を比較した。C-18HPLCカラムを用い、１ml／minの流速で流し、２１５nmでのUV吸収を検出した。最初アセトニトリル：水＝30：70で１０分流し、１０分後直ちに40：60に変更した。その後５０分かけて50：50に変わるようグラジェントをかけた。標品の保持時間は化合物（４６）、（４７）、（４８）それぞれ46.232分、45.572分、40.230分であるのに対し、各領域から得られた２糖由来のピークはそれぞれ45.700分、45.023分、39.510分であり、正確に各結合が合成できていることが証明された。
【００７１】
【化１５】
【００７２】
実施例２（レクチンによりガラス表面糖鎖が認識されることの確認）
ビルドアップ的に合成した糖鎖がレクチンにより認識されることを以下のようにして証明した。
リンカーを導入したガラス（４９）に対し、実施例１に記載した方法に従いNPPOCを導入し、その後未反応のOH基をBzでキャッピングを行いガラス（５０）を得た。そこに、星形に光を当てることにより星形にNPPOCが脱離し、星形に水酸基が脱保護されたガラス（５１）を得た。
そこにガラクトースドナー（５２）を縮合した。ガラス（５１）（50mg）にガラクトースドナー（５２）（10mg）、NIS（10mg）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタンを加え-30℃に冷却した。そこにTfOH（4μl）を加え、-30℃で１日振盪した。ガラスを飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、メタノール、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥することによりガラス（５３）を得た。すべての保護基を脱保護するために、ガラス（５３）にメタノール（1ml）を加え、NaOMeをpH11になるまで加えた後、室温にて１日振盪した。ガラスを水、２Ｎ−塩酸水、水、ＤＭＦ、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥することによりガラス（５４）を得た。
【００７３】
ガラス（５４）を１％ＰＢＳに浸し１５分振盪した。溶液を除去した後、１％BSA入り１％PBS溶液（１％BSA／PBS）に浸し６℃にて１２時間振盪した。溶液を除去した後、ビオチン化されたRCA120レクチン（50μl、10μg／ml）でガラスを覆い４時間室温にて軽く振盪した。溶液を除去した後、１％PBS溶液を加え軽く５分間振盪、その後溶液を除去するという洗いの操作を３回繰り返した。
溶液を除去したガラスにアビジン化されたAlexaFluor488（登録商標）(0.1mg)/(1%BSA/PBS(800μl))で覆い２時間室温にて軽く振盪した。溶液を除去した後上記洗いの操作を３回繰り返した。ガラスの蛍光を蛍光スキャナーで観察した。532nmレーザーを用い励起させ、蛍光フィルターとして526nmのバンドパスフィルターを用いて観察した結果、図１７のように星形に光った。つまり、星形に光を当てて光切断保護基を脱離した所にガラクトースが導入され、その導入されたガラクトースをレクチンが認識したためである。これによりビルドアップ的にガラス上で合成した糖鎖をレクチンが認識可能であることが証明できた。
【００７４】
【化１６】
【００７５】
実施例３（光切断保護基としてW（Z）基を使用した例）
実施例１では光切断保護基としてＷ基を直接水酸基に結合させていたが、この実施例では光切断保護基としてW(Z)基でも可能であることを示す。
リンカーを導入したガラス（５５）（5.59g、水酸基のローディング = 0.01652 mmol/g）に光切断保護基を持たないグルコサミン誘導体ドナー（５６）（509mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、NIS（249g）を入れ窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（5ml）を入れ、−30℃に冷却した。−30℃にてTfOH（98μl）を入れそのまま１日振盪した。ガラスをDMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、DMFの順で洗浄した。このガラスにDMF（12ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて12時間振盪した。ガラスをDMF/水、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥し、ガラス（５７）を得た。
ガラスに結合した化合物の構造確認の為に、ガラス（５７）を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(５８)を確認した。目的通りグルコサミン誘導体がガラス上に導入された。
化合物５８：MALDI-TOF-MS, C71H109Cl3N6O19Na+ (M+Na)+の計算値：1477.67, 実測値：1478.0
【００７６】
【化１７】
【００７７】
ガラス（５７）の未反応の水酸基をBz基にてキャッピングを行った。ガラス（５７）にBzOH（750mg）、DIC（900μl）、DMAP（12mg）、ジクロロメタン（12ml）を加え６℃にて12時間振盪した。クロロホルム、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。次は、６位水酸基を選択的に脱保護するためにＹ基の重合度を１つずつ減少させる。この操作により６位水酸基が選択的に脱保護されると共に、３位水酸基の２つのＹ基が１つだけ脱離する。Bzキャッピングしたガラスに、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、Boc2O（800μl）、飽和重曹水（800μl）を加え、室温にて12時間振盪した。ガラスをDMF／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥し、ガラス（５９）を得た。
構造確認のため、ガラスを少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて3時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がAc化され（選択的に脱保護された６位水酸基にアセチル基が選択的に導入された）、３位が１重合のＹ基により保護された化合物６０を確認した。
化合物６０：MALDI-TOF-MS, C54H77Cl3N4O16Na+ (M+Na)+の計算値：1165.43, 実測値：1166.3
【００７８】
【化１８】
【００７９】
ガラス（５９）（(i)1.160g、(ii)1.174g）にそれぞれ(i)NPPOC-UCHP（54mg）、(ii)NPPOC-Gly（66mg）を加えジクロロメタン（(i)1.5ml、(ii)1.5ml）を加えた。そこにDIC（(i)48μl、(ii)72μl）を加え６℃に冷却した後、DMAP（(i)5mg、(ii)7mg）を加え、６℃で１２時間振盪した。それぞれのガラスをクロロホルム、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗い、真空乾燥しガラス（６１、６２）を得た。構造確認のため、ガラスをそれぞれ少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて２時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位にNPPOC-UCHP及びNPPOC-Glyがそれぞれ導入された化合物６３，６４を確認した。
化合物６３：MALDI-TOF-MS, C69H97Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1457.57, 実測値：1457.6
化合物６４：MALDI-TOF-MS, C64H87Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1387.49, 実測値：1388.0
【００８０】
【化１９】
【００８１】
ガラス（６１）及び（６２）それぞれに光を当て６位水酸基の選択的脱保護を検討した。
それぞれのガラスをＴＨＦ／水（10ml／10ml）に浸し、PITC（120μl）を加えしばらく振盪した後、360nm（8.6 mW/cm2）の光を室温にて３０分間照射した。その後、水、アセトン、DMFの順にガラスを洗浄し、DMF（1.5ml）、PITC（500μl）、NMM（120μl）を加え室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥することによりガラス（６５）とガラス（６６）をそれぞれ得た。
ガラス上の構造確認の為に、それぞれのガラスを少々砕き、構造確認を行った。ガラス（６５、６６）はそれぞれ玉尾酸化し、MSを測定した。その結果両方から同じ目的物（６７、６８）をそれぞれ確認した。ガラス（６５）においては、念のため、遮光した部分のガラスを玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定した所、未反応体である化合物（６３）を確認した。
化合物６７：MALDI-TOF-MS, C52H75Cl3N4O15Na+ (M+Na)+の計算値：1123.42, 実測値：1123.4
化合物６８：MALDI-TOF-MS, C52H75Cl3N4O15Na+ (M+Na)+の計算値：1123.42, 実測値：1123.7
化合物６３：MALDI-TOF-MS, C69H97Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1457.57, 実測値：1458.0
【００８２】
【化２０】
【００８３】
以上の結果より、W(Z)基でも光により選択的に切断可能であり、本発明に使用可能であることがわかる。
【００８４】
実施例４
光切断保護基Ｗ基の種類を検討した。
水酸基に対して光切断保護基として、Ａｑｍｏｃ基、ＮＰＰＯＣ基、ＭＮＰＰＯＣ基を導入し、光により切断されるか検討した。３，４位水酸基が脱保護されたＧａｌ（６９）に対してそれぞれの光切断保護基を導入し化合物７０，７１，７２を得た。これらに各種溶媒中太陽光を照射して反応をＴＬＣで追跡した。結果、いずれにおいてもＴＨＦ／水＝１／１の溶液中で反応させると定量的に脱保護でき、化合物７３を与える事が判明し、このような光切断保護基が本発明に使用可能である事がわかる。
ここで、compound:化合物、solvent:溶媒、product:生成物、by-product:副生成物、no solvent:溶媒なし、50% aq THF:５０％ＴＨＦ水溶液、CH2Cl2:ジクロロメタン、2% DBU in CH2Cl2:２％ＤＢＵ含有ジクロロメタン、2% DIPEA in CH2Cl2:２％ＤＩＰＥＡ含有ジクロロメタン、CH3CN:アセトニトリル、1,4-dioxane:１，４−ジオキサン、50% aq MeOH:５０％メタノール水溶液を示す。
【００８５】
【化２１】
【００８６】
実施例５
分岐を有する４糖を合成した例
リンカーが結合したガラス(７４)3.75ｇ（ローディング０．０３４７mmol/g）に、ガラクトースドナー（７５）（413mg）、NIS（263.7mg）、モレキュラーシーブス４A（2g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え、−３０℃に冷却した。−３０℃にてTfOH（103.7μl）を加え、そのまま−３０℃で３時間振盪した。DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、DMFで洗浄後、DMF（10ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて６時間振盪した。水／DMF、DMFで洗浄後、もう一度同じようにBoc化を行った。構造確認のため、ガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、目的の化合物７７を確認した。
化合物７７：MALDI-TOF-MS, C63H81N3O16Na+ (M+Na)+の計算値：1158.55, 実測値：1158.9
【００８７】
【化２２】
【００８８】
未反応の水酸基をベンゾイルキャッピングする為に、ガラス（７６）にBzOH（500mg）、DIC（600μl）、ジクロロメタン（10ml）を加えた後、６℃にてDMAP（8mg）を加え、そのまま６℃で１２時間振盪した。ガラスを水／アセトン、DMF、クロロホルムにて洗浄後、真空乾燥した。乾燥したガラスに、20%ピペリジン／DMF（10ml）を加え室温にて３０分間振盪した。DMFで洗浄後、DMF（7.5ml）、PITC（2.5ml）、NMM（600μl）を加え室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、アセトン、アセトン／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。乾燥したガラスに、ピリジン（10ml）、NPPOC-OPNP（225mg）、DMAP（32mg）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。乾燥したガラスにもう一度同じようにNPPOC化を行った。構造確認の為にガラスを少々砕き玉尾酸化を行い、３位水酸基にNPPOCが導入された化合物７９を確認した。
化合物７９：MALDI-TOF-MS, C51H67N3O17Na+ (M+Na)+の計算値：1016.44, 実測値：1016.6
【００８９】
【化２３】
【００９０】
ガラス（７８）に十字の傷を付け、下記のように４つの領域に分割した。それぞれ、領域１，領域２，領域３，領域４と呼ぶ。領域１はGal（ガラクトース）単糖、領域２はGalβ1-3Gal２糖、領域３はGlcNβ1-4Gal２糖、領域４はGalβ1-4Glcβ1-4(Galβ1-3)Gal４糖（分岐あり）を作り分ける。
【００９１】
【化２４】
【００９２】
ガラス（７８）の領域１および３を露光する。ガラス（７８）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域１および３に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。得られたガラスは水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥しガラス（８０）を得た。構造確認の為、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、３位NPPOCが選択的に除去された化合物８１を確認した。
化合物８１：MALDI-TOF-MS, C41H58N2O13Na+ (M+Na)+の計算値：809.38, 実測値：810.0
【００９３】
【化２５】
【００９４】
ガラス（８０）にBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返した。Bz化を行ったガラスをTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域２および４に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。得られたガラスは水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥しガラス（８２）を得た。構造確認の為、領域１および領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、領域１から化合物８３、領域２から化合物８４を確認した。
化合物８３：MALDI-TOF-MS, C48H62N2O14Na+ (M+Na)+の計算値：913.41, 実測値：913.3
化合物８４：MALDI-TOF-MS, C41H58N2O13Na+ (M+Na)+の計算値：809.38, 実測値：809.3
【００９５】
【化２６】
【００９６】
ガラス（８２）の領域２および４のガラクトースの３位水酸基に２糖目のガラクトースを導入する。ガラス（８２）にガラクトースドナー（８５）（389mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え−１５℃に冷却した。そこに、TMSOTf（283μl）を加え、−１５℃で２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、DMF/飽和重曹水の順に洗浄した。得られたガラスに、DMF（10ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）加え、室温にて６時間振盪した。DMF/水、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、もう一度同じようにBoc化の反応を行った。得られたガラスにBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返し、ガラス（８６）を得た。構造確認の為、領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、２糖化合物８７を確認した。
化合物８７：MALDI-TOF-MS, C75H90N2O19Na+ (M+Na)+の計算値：1345.60, 実測値：1345.7
【００９７】
【化２７】
【００９８】
ガラス（８６）にジクロロメタン（16ml）、TFA（4ml）を加え、室温にて３０分間振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。クロロホルム、DMFの順にガラスを洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥する事により４位水酸基を脱保護したガラス（８８）を得た。構造確認の為、領域１と２のガラスを少々砕きそれぞれ玉尾酸化し、領域１から化合物８９を、領域２から化合物９０を確認した。
化合物８９：MALDI-TOF-MS, C36H41NO11Na+ (M+Na)+の計算値：686.26, 実測値：686.2
化合物９０：MALDI-TOF-MS, C63H69NO16Na+ (M+Na)+の計算値：1118.45, 実測値：1118.3
【００９９】
【化２８】
【０１００】
ガラス（８８）にジクロロメタン（10ml）、NPPOC-OPNP（271mg）、DMAP（191mg）を加え室温にて１２時間振盪した。反応液を除去し、アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄後、真空乾燥した。得られたガラスにもう一度同じ操作を繰り返し行い、４位水酸基にNPPOC基が導入されたガラス（９１）を得た。構造確認の為、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、目的の化合物９２を確認した。
化合物９２：MALDI-TOF-MS, C46H50N2O15Na+ (M+Na)+の計算値：893.31, 実測値：893.3
【０１０１】
【化２９】
【０１０２】
ガラス（９１）の領域１および２を露光する。ガラス（９１）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域１および２に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥した。得られたガラスに、Bz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返しガラス（９３）を得た。構造確認の為、領域１および領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、領域１から化合物９４、領域２から化合物９５を確認した。
化合物９４：MALDI-TOF-MS, C43H45NO12Na+ (M+Na)+の計算値：790.28, 実測値：790.3
化合物９５：MALDI-TOF-MS, C70H73NO17Na+ (M+Na)+の計算値：1222.48, 実測値：1222.5
【０１０３】
【化３０】
【０１０４】
ガラス（９３）の領域３を露光する。ガラス（９３）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域３に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（９６）を得た。構造確認の為、領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化し、化合物９７を確認した。
化合物９７：MALDI-TOF-MS, C36H41NO11Na+ (M+Na)+の計算値：686.26, 実測値：687.0
【０１０５】
【化３１】
【０１０６】
ガラス（９６）の領域３のガラクトースの４位水酸基に、２糖目としてグルコサミンを導入する。ガラス（９６）にグルコサミンドナー（９８）（198mg）、NIS（176mg）、モレキュラーシーブス４A（2g）、脱水ジクロロメタン（8ml）を加え−30℃に冷却した。そこに、TfOH（69μl）を加え、−30℃で３時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液/アセトン、水、DMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥しガラス（９９）を得た。構造確認の為、領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化し、２糖化合物１００を確認した。
化合物１００：MALDI-TOF-MS, C66H65Cl3N2O20Na+ (M+Na)+の計算値：1333.31, 実測値：1334.0
【０１０７】
【化３２】
【０１０８】
ガラス（９９）にBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返した。得られたガラスをTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域４に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（１０１）を得た。構造確認の為、領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化し、化合物１０２を確認した。
化合物１０２：MALDI-TOF-MS, C63H69NO16Na+ (M+Na)+の計算値：1118.45, 実測値：1118.7
【０１０９】
【化３３】
【０１１０】
ガラス（１０１）の領域４の１糖目のガラクトース４位水酸基に、ラクトースを導入する。ガラス（１０１）にラクトースドナー（１０３）（303mg）、NIS（176mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え−30℃に冷却した。そこに、TfOH（69μl）を加え、−30℃で３時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液/アセトン、水、DMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥しガラス（１０４）を得た。構造確認の為、領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化し、４糖化合物１０５を確認した。
化合物１０５：MALDI-TOF-MS, C124H117NO33Na+ (M+Na)+の計算値：2170.74, 実測値：2172.4
【０１１１】
【化３４】
【０１１２】
以上の結果より、領域１にはガラクトース単糖（化合物９４）、領域２にはGalβ1-3Gal（化合物９５）、領域３にはGlcNβ1-4Gal（化合物１００）、領域４にはGalβ1-4Glcβ1-4(Galβ1-3)Gal（化合物１０５）が選択的に合成できることがわかる。 ここで、領域４においては、基板上の３位水酸基に対してガラクトースドナー（８５）を導入し、まず、Galβ1-3Gal２糖を得、その後この２糖をアクセプターとして使用し、これに、ラクトースドナー（１０３）を導入して４糖を合成している。
つまり、第１のアクセプターに第１のドナーを縮合させて第１の生成物を得、これを第２のアクセプターとし、これに第２のドナーを縮合させて第２の生成物を得る、という工程を順次必要な回数実施することにより、一枚の基板上で分岐構造及び／又は直鎖構造を有するコンビナトリアルライブラリーを効率よく合成することができる。
【０１１３】
実施例６
実施例１においてガラスの代わりに、板状ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）樹脂の表面に真空紫外光（ＶＵＶ）を照射した後、ＡＰＴＥＳ（3-アミノプロピルトリエトキシシラン）処理により表面にアミノ基を導入した樹脂基板を用いても、同様に基板上での糖鎖の作り分けが可能であった。
【０１１４】
実施例７
実施例１のグルコサミンドナー（１５）において、３位水酸基の保護基を、Ｂｏｃで保護された１重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)に代えて、Ｂｕ4ＮＦで選択的に脱保護可能なＴＢＤＭＳ基（tert-butyldimethylsilyl group: ターシャリー−ブチルジメチルシリル基）にし、６位水酸基の保護基をＢｏｃで保護された２重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)に代えて、ＤＤＱで選択的に脱保護可能なＰＭＢ基（p-methoxybenzyl group: パラメトキシベンジル基）にしたドナーを用いても同様に基板上での糖鎖の作り分けが可能であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２以上の水酸基を有する化合物、典型的には糖類のコンビナトリアルライブラリーの合成方法に関し、さらに詳細には、２以上の水酸基を有する化合物の基板上でのビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法および該ライブラリーを含む基板に関する。特に、病気や、毒素の診断薬・検査薬としてのニーズが高い糖鎖チップ等を作製するのに有用な化合物ライブラリーの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病気や、各種毒素には糖鎖を認識するものがある。それらを迅速に検査する為には、各種糖鎖が基板上に結合している糖鎖チップを用いるのが迅速でかつ高感度であると考えられる。既にＤＮＡチップは市販されており、研究・診断に用いられている。更にペプチド（プロテイン）チップも研究が盛んに行われている。しかし、その複雑な構造ゆえ現在においても満足のいく糖鎖チップは存在していない。
【０００３】
現存するすべての糖鎖チップは天然から単離精製した糖鎖や、それを酵素処理したものや、単純な糖の有機合成品などを基板に結合させることにより作製されている。これらの糖鎖チップ上の糖鎖は数十種類程度で、より多種類の糖鎖を基板上に結合させる事が望まれている。多種類の糖鎖構造を有する糖鎖チップを作製する為には、まずは必要な数の糖鎖を調達する必要がある。糖鎖は複雑に分岐を有する構造で、有機合成するのも容易ではなく、従来の技術により数百ないし数千種類もの糖鎖を合成することは、事実上不可能である。また、もし仮に合成できたとしても、コストが非常にかかり、実用的ではない。現在のＤＮＡチップ作製法は基板上でのＤＮＡ合成手法であるアフィメトリクス法と、既に作製したＤＮＡを基板に結合させるスタンフォード法に２分される。ビルドアップ的に基板上で合成するチップは低価格化・集積化等に優れており、糖鎖チップにおいても基板上での合成が期待されている。しかし、今までに、基板上でビルドアップ的に糖鎖を合成し、糖鎖チップを作製した例はない。
【０００４】
多数の水酸基を有する化合物（特に糖質、複合糖質、それらの誘導体又は類縁体）のコンビナトリアルライブラリー合成は未だ達成されていない未開の領域である。それはひとえに同じような反応性を持つ水酸基を選択的に脱保護させる技術、特にコンビナトリアルライブラリー合成に最適化された水酸基の保護基の技術が存在していない為である。多くの従来の技術では様々な種類の保護基を適宜用いて、その反応性の違いを利用して目的の保護基のみを選択的に脱離させていたが、この様な手法では、コンビナトリアルライブラリー合成は現実的には不可能である。
【０００５】
これを可能にする唯一の技術として、特定の保護基Ｙを用いた方法（以下「Ｙ法」という）が挙げられる（特許文献１及び２）。Ｙ法を用いれば、単にＹ基の重合度を変えるだけで無限の水酸基を選択的に脱保護させる事が出来る。
特許文献１及び２記載の方法は、重合度の異なる保護基により多くの水酸基を保護し、重合度の違いにより脱保護する順番を決定し、選択的に目的の水酸基を脱保護させることができるという手法である。それにより、樹脂ビーズ上で糖鎖ライブラリーを構築することができる。
しかし、この手法を基板上でのコンビナトリアルライブラリー合成に適応しようとすると、次のような問題があった。すなわち、基板のある部位のみに選択的に反応させる事が必要である為、当然、光による制御が必要になってくるが、光による反応を特許文献２記載の方法に組み合わせると非常に長い反応段階が必要になるということである。
【０００６】
特許文献２記載の方法を用いて基板上でビルドアップ的に糖鎖を合成する手法を図１に示す。
図１において、特許文献２記載の方法の典型的な構造として、糖の水酸基がＡ−Ｙ、Ａ−ＹＹ（Ａは酸性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良い。）により保護された、（１）の構造を有する糖が表面に結合したガラスを想定する。Ａはここでは酸性条件で脱離可能なＢｏｃ基（ターシャリー−ブトキシカルボニル基）とし、Ｙを−［（ＣＨ3ＣＨ2）2ＣＨ］Ｎ−ＣＨ2−ＣＯ−とする。ＲはＡの脱離する条件及び、光反応・ＰＩＴＣ化反応・ＴＦＡ処理反応・再Ｂｏｃ化反応・縮合反応で脱離しない保護基、例えばＢｚ基（ベンゾイル基）またはＢｎ基（ベンジル基）とする。
【０００７】
基板上のある特定の位置に存在する水酸基を選択的に脱保護させる為には、光により反応する保護基を用いるのが一般的である。そこで、酸性条件で切断できるＢｏｃ基を光により切断しようとする場合、光を当てると酸を発生する光酸発生剤が必要になる。この光酸発生剤を基板にコートしてから目的の部位に選択的に光を当て、酸を発生させ、Ｂｏｃ基を切断する。Ｂｏｃ基が切断されたら、その後はＹの重合度を減少させる操作を行う。
まずはＰＩＴＣ（フェニルイソチオシアネート）を反応させ、次にＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）により２重合を１重合に変換し（すなわち、ＹＹをＹに）、同時に１重合のＹを除去し水酸基を脱保護する。最後に再Ｂｏｃ化を行い一連の反応を終了し基板（３）を得る。ここで選択的に脱保護された水酸基に次の糖を縮合させる。ここではＧａｌを導入し、部位特異的にＧａｌが導入された基板（４）を得る。
この操作を繰り返すことにより、基板の部位特異的に構造の異なる糖鎖を組み上げる（ビルドアップする）ことができる。しかし、１種類の糖を導入するのに、１.光によるＢｏｃ基の切断、２.ＰＩＴＣ化、３.ＴＦＡ処理、４.再Ｂｏｃ化、５.縮合、と５段階を必要とする。仮に異なる５種類の糖を導入しようとすると、５×５で２５段階が必要であり、非常に多段階を必要とする。従って、この方法は、糖の種類を増やしていったときには実現が極めて困難となってしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４１０２２６３号
【特許文献２】特開２００８−２０１６８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、特許文献２記載の技術上の問題点を改良し、基板上での糖鎖合成をより実現可能なものにしようとするものである。
すなわち、本発明の目的は、２以上の水酸基を有する化合物を基板上でビルドアップ的に合成してコンビナトリアルライブラリーを合成する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、糖類をビルドアップ的に合成して糖鎖チップ等を作製する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、病気や、毒素の診断薬・検査薬としてのニーズが高い糖鎖チップ等の基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下に示す化合物ライブラリーの合成方法及びこれを含む基板を提供するものである。
１．基板上に結合した、少なくとも２個の水酸基を有する化合物であって、そのすべての水酸基が、脱保護条件が相互に異なる少なくとも２種の保護基からなる群から選ばれる保護基で保護された化合物をアクセプターとして用い、該保護基を選択的に脱保護し、脱保護された水酸基に所望のドナー又はキャッピング基を選択的に導入して一枚の基板上でビルドアップ型コンビナトリアルライブラリーを合成する方法において、
（１）第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程、
（２）脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基（Ｗは光分解により脱離可能な保護基を示し、ＺはＷ基が脱離する光分解の条件でＷ基と同時に脱保護される基、もしくはＷ基が脱離する事により、活性化（もしくは不安定化）され、選択的に除去可能になる基を示す）を導入する工程、
（３）基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（４）ｎが２以上の整数である場合、工程（３）を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（５）第２の保護された水酸基について、工程（１）から（４）を繰り返し、第２の保護された水酸基を脱保護し、脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基を導入し、基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入し、上記工程を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（６）必要により、工程（５）を所望の、保護された水酸基について繰り返し、各水酸基の各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、第１ないし第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程を含み、
工程（１）〜（６）において、繰り返して使用する、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基、基板の分割部位の数ｎ、ドナー又はキャッピング基は、同一でも異なっていても良い、
ことを特徴とする、ビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法。
２．アクセプターの水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良く、ｍはＹの重合度を示し、１以上の整数であり、ｍが２以上の整数の場合、各Ｙ中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、相互に同一でも異なっていても良い。）である上記１記載の方法。
３．第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程が、Ａ（Ｙ）ｍ基のＹ基中の酸アミド結合をＮ末端側から逐次切り離す方法により重合度の小さなＹ基を選択的に脱保護する工程を含む上記２記載の方法。
４．アクセプターの１個の水酸基の保護基がＶ基（Ｖは塩基性、酸化剤、フッ素化合物、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。）であり、他の少なくとも１個の水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。ただし、ＡがＶと同一であることはなく、Ｖの脱離条件でＡが脱離することはない。）であり、第１の保護された水酸基がＶ基で保護された水酸基である上記１又は２記載の方法。
５．ドナーがＡ（Ｙ）ｍ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含み、工程（１）〜（６）を繰り返すことを特徴とする上記１〜４のいずれか1項記載の方法。
６．ドナーがＶ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含む上記１〜５のいずれか１項記載の方法。
７．アクセプターが糖である上記１〜６のいずれか１項記載の方法。
８．保護基ＡがＢｏｃ基であり、保護基ＷがＮＰＰＯＣ基である上記１〜７のいずれか１項記載の方法。
９．アクセプターが、リンカーを介して基板に固定されている上記１〜８のいずれか１項記載の方法。
１０．基板が、ガラスである上記１〜９のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、複雑な構造の化合物ライブラリー、特に糖鎖ライブラリーを簡単に、かつ正確、短工程で基板上で作り分けることが可能である。従って、一枚の基板上に構造の異なる数百〜数千の糖鎖を少ない工程数で正確かつ効率よく構築することが現実的に可能である。
本発明により製造された、化合物ライブラリーが結合した基板（具体的には糖鎖チップ）は、生物を扱うすべての分野に利用可能である。例えば、病気や、毒素の診断薬・検査薬等として極めて有用である。
糖鎖は遺伝子、蛋白質に継ぐ第３の生命鎖として重要であり、ＤＮＡチップ、プロテインチップに次ぐ糖鎖チップは生命科学に必須なツールである。本発明（基板上でのビルドアップ的糖鎖チップ作製手法）により、第３の生命鎖として重要な糖鎖を、基板上で効率よく作製することができると共に、様々な構造の糖鎖機能を一度に解析可能なツールである糖鎖チップを提供する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】特許文献２記載の方法の概要を示すスキームである。
【図２】本発明の方法の概要を示すスキームである。
【図３】基板に結合した３つの水酸基を有する化合物（各水酸基はそれぞれ脱離条件の違う保護基により保護されている）と、その置換基を示す模式図である。
【図４】それぞれ保護された、３つの水酸基を有する丸囲み数字１の化合物（例えばＧａｌ）の保護基Ａを脱保護した後、光切断保護基（星印）を導入して得られた基板の模式図を示す。ここでは基板に均一に同じ化合物が存在する。
【図５】図４の基板の左１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図６】図５の基板の中央１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図７】図６の基板の右１／３を露光し、元々Ａで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図８】図７の基板の保護基Ｂを脱保護し、光切断保護基（星印）を導入して得られた基板の模式図を示す。
【図９】図８の基板を横方向に３分割し、まず下１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図１０】図９の基板の中央１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１１】図１０の基板の上１／３を露光し、元々Ｂで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１２】図１１の基板の保護基Ｃを脱保護し、光切断保護基（星印）を導入した基板の模式図を示す。
【図１３】図１２の基板を３分割し、３区分の各区分の左１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行った基板の模式図を示す。
【図１４】図１３の基板の３区分の各区分の中央１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２の化合物（例えばＧｌｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１５】図１４の基板の３区分の各区分の右１／３を露光し、元々Ｃで保護されていた部位の水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３の化合物（例えばＧｌｃＮＡｃ）を選択的に導入した基板の模式図を示す。
【図１６】以上の手順により複雑な構造の種々の化合物（例えば糖鎖）（２７種類：順列組み合わせで可能な全構造）が形成された基板の模式図を示す。
【図１７】実施例２で作製したガラスの蛍光スキャナーによる観察結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特許文献２記載の方法によれば、重合度の異なる保護基により基板上に存在する水酸基を保護した後、重合度の違いを利用して選択的に目的の水酸基を脱保護させる。ここで脱保護される水酸基は多数ある水酸基の中の特定の水酸基であるが、基板の部位による差はない。その後、特許文献２記載の方法では、次の糖もしくはキャッピング基を導入している。
本発明では、新たに、光で切断可能な水酸基の保護基（Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基）を導入しているため、基板上の目的の部位を選択的に露光することにより、その部位にある水酸基を選択的に脱保護することができる。このため、その後、次の糖を縮合すれば、露光部の基板上で脱保護された水酸基のみに次の糖が縮合され、基板の部位選択的に目的の糖鎖構造を構築することができる。
【００１４】
本発明の方法を、図２を参照しながら説明する。
図１と同じ基板（１）をスタート物質とする。基板としては、各種板状ガラス（例えば、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナケイ酸塩ガラス、シリカガラス、リン酸塩系ガラス、亜テルル酸塩ガラス、ハロゲン化物ガラス、カルコゲナイドガラス等）、板状各種樹脂（例えば、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、熱硬化性ポリイミド、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、ABS樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンスルファイド、ポリスルホン等）、板状各種繊維、板状シリカ、セロファン等が挙げられる。これら基板に対して、APTES（3-aminopropyltriethoxysilane: 3-アミノプロピルトリエトキシシラン）処理や、紫外線処理、電子線処理、プラズマ処理、高圧処理、高温処理、酸処理、塩基処理等を行い、表面改質を行う。この様な処理により表面に現れる官能基としては例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲノ基等が挙げられる。基板の寸法は幅1mmから100mm、好ましくは5mmから50mm、長さは1mmから200mm、好ましくは10mmから100mm、厚みは0.01mmから20mm、好ましくは0.1mmから5mmである。
【００１５】
アクセプターは、基板に直接固定しても良いが、リンカーを介して固定してもよい。リンカーの種類は特に制限がなく、基板に共有結合していても良く、疎水結合でも良い。例えばポリエチレングリコール、６−ヒドロキシヘキサン酸、２−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）酢酸、４−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）安息香酸、６−ヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ヘキサンアミド等が挙げられる。
【００１６】
アクセプターは、保護された水酸基ｎ個（ｎは２以上の整数）を有する化合物であれば特に制限されない。例えば、６炭糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、フコース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、イズロン酸、ソルボース、タガトース、フルクトース、プシコース等、５炭糖、例えば、アラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、キシルロース等、更に、９炭糖のシアル酸等、これらのオリゴ糖、複合糖質、これらの誘導体及び類縁体等が挙げられる。
【００１７】
ドナーとしては、アクセプターとして例示した上記化合物が挙げられる。ドナーが糖である場合、そのアノメリック位水酸基は、リン酸エステル基、トリクロロアセトイミデート基、フェニルチオ基、メチルチオ基、ブロモ基、クロロ基、フルオロ基、ヨード基等、化学的に活性化可能な置換基に変換しておく必要がある。更にアノメリック位以外の水酸基の中で、後に他のドナー糖、又はキャッピング基を導入する予定の水酸基には目的の水酸基を選択的に脱保護可能な、オルソゴナルな保護基（orthogonal protecting groups）（ある特殊な条件で、他の保護基に影響を与えずに目的の保護基のみ選択的に脱保護可能な保護基の総称）を導入しておく必要がある。後に他のドナー糖、又はキャッピング基を導入する予定のない水酸基には、先に導入したオルソゴナルな保護基の脱離条件、縮合条件、光切断条件等、一連の反応条件で脱離しない保護基を導入しておく必要がある。このようなオルソゴナルな保護基として、例えば、ＮＨ2ＮＨ2（ヒドラジン）により選択的に除去可能なＬｅｖ基（レブリニル基）、thiourea（チオウレア）により選択的に除去可能なＣｌＣＨ2ＣＯ基（クロロアセチル基）、NaOMe（ナトリウムメチラート）により除去可能なＰｈＣＯ基（ベンゾイル基）を導入し、それ以外の水酸基は上記反応条件では安定でかつ、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）により除去可能なＢｎ基（ベンジル基）等を導入する。あるいは、オルソゴナルな保護基として、適切な重合度で、且つ適切な保護基を有するＹ基、又は、中性又は塩基性で脱離可能な保護基Ｖ基、又は光切断可能なＷ又はＷ（Ｚ）基を導入し、それ以外の水酸基には、Ｙ基の重合度を減少させるエドマン分解の反応条件及び、縮合条件及び、中性又は塩基性条件で脱離可能な保護基Ｖの除去条件、さらには、光切断条件に対して安定な保護基、例えば、ベンゾイル基、ベンジル基、アセチル基等を導入する。
【００１８】
アクセプターとドナーの反応は、公知の条件、例えば、活性化剤としてＴＭＳＯＴｆ、ＢＦ3ＯＥｔ2、ＮＩＳ−ＴｆＯＨ等を用い、反応溶媒としてジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、トルエン、ベンゼン等中、温度−４０〜５０℃で５分〜２４時間程度行えば良い。
【００１９】
本発明に使用する「キャッピング基」としては、オルソゴナルな保護基の脱離条件で脱離しない保護基が使用される。例えば、オルソゴナルな保護基がＹ基の場合、Ｂｚ基、Ｂｎ基、アセチル基、クロロアセチル基、レブリニル基、TBDMS基（ターシャリー−ブチルジメチルシリル基）、TBDPS基（ターシャリー−ブチルジフェニルシリル基）等が「キャッピング基」として使用される。
【００２０】
本発明の説明の便宜上、以下、アクセプター及びドナーとして糖を使用した場合について説明する。また、便宜上、光切断保護基（Ｗ基）としてＮＰＰＯＣ基［２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル基］、キャッピング基としてＢｚ基、ＡとしてＢｏｃ基、ＲとしてＢｚ基、Ｙとして−[（ＣＨ3ＣＨ2）2ＣＨ]Ｎ−ＣＨ2−ＣＯ−を使用した場合について説明する。
図２において、本発明ではまず、Ｙ基の重合度を減少させる操作を行う。つまり、１.ＴＦＡによる脱Ｂｏｃ化、２.ＰＩＴＣ化、３.ＴＦＡ処理、４.再Ｂｏｃ化を行うと、Ｙ基の重合度が一つずつ減少し、１重合のＹ基が選択的に脱保護される。その後、光切断保護基であるＷ基を導入する。１つの水酸基が選択的に脱保護されるため、Ｗ基も選択的に目的の水酸基に導入され、基板（８）が得られる。
基板の目的の部位を選択的に露光すると、その部位に存在するＷ基が脱離され、水酸基が脱保護された基板（９）が得られる。
そこに次の糖を縮合させる。ここではＧａｌを導入して基板（１０）を得ている。次に、基板（１０）の別の部位を露光すると、露光部の水酸基が選択的に脱保護された基板（１１）が得られる。基板（１１）のこの水酸基に、また別の糖、ここではＧｌｃを導入して基板（１２）を得ている。
【００２１】
このように、本発明によれば、導入する糖の種類が増えても露光、縮合の２段階が増えるのみである。本発明の方法では、２種類の糖の導入は、最初の５段階＋１種類目の糖の導入で２段階＋２種類目の糖の導入で２段階の全９段階で可能である。仮に異なるｎ種類の糖を導入しようとすると、（５＋２ｎ）段階（例えば、糖の種類が５種類であれば、５＋２＋２＋２＋２＋２の１５段階）でよく、導入する糖が増えれば増えるほど図１に示した従来の方法と比較して、反応段階が飛躍的に減少する。従って、本発明によれば、一枚の基板上に構造の異なる数百、数千の糖鎖を構築することが現実的に可能である。
【００２２】
多種類の糖鎖を基板上に構築する具体的な手法を、図３〜１６を参照しながら、詳細に説明する。
ここでは便宜上丸囲み数字１をＧａｌ、丸囲み数字２をＧｌｃ、四角囲み数字３をＧｌｃＮＡｃとしている。Ｇａｌの各水酸基は以下のように保護されているとする。Ｇａｌの２位水酸基は今後の反応で影響がない保護基により保護されている（例えばＢｚ基、Ｂｎ基等）。３位水酸基はＢ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＢという保護基により保護されている。４位水酸基はＡ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＡという保護基により保護されている。６位水酸基はＣ’という特殊な条件で選択的に切断可能なＣという保護基により保護されている。Ｇａｌの３位、４位、および６位水酸基に、例としてそれぞれＧｌｃとＧｌｃＮＡｃを導入する手法を示す。順列組み合わせで可能な全２７種類の糖鎖の合成が、本発明を使えば短い反応段階で可能になる。
まずは、Ａを選択的に脱離し、光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図４に示す。ここでは基板に均一に同じ化合物が結合している。
【００２３】
図４の左１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこにキャッピング基を選択的に導入しキャッピングを行い、基板図５を得る。
次に中央１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこに丸囲み数字２のＧｌｃを選択的に導入し、基板図６を得る。
最後に右１／３を露光し、４位水酸基を脱保護し、そこに四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃを選択的に導入し、基板図７を得る。
次にＢを選択的に脱保護し、３位水酸基に選択的に光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図８に示す。
【００２４】
先ほどと同様に基板を今度は横方向に３分割しそれぞれ露光する。まず下１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基にキャッピング基を導入しキャッピングを行い（図９）、次に、中央１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基に丸囲み数字２のＧｌｃを導入し（図１０）、さらに上１／３を露光し、選択的に脱保護された３位水酸基に四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃを導入する（図１１）。
最後にＣを選択的に脱保護し、６位水酸基に選択的に光切断保護基（星印）を導入する。こうして得られた基板の模式図を図１２に示す。
【００２５】
再度、基板を３分割し、３分割した各区分の左１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基にキャッピング基を導入しキャッピングを行い（図１３）、次に３分割した各区分の中央１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基に丸囲み数字２のＧｌｃを導入し（図１４）、さらに右１／３を露光し、選択的に脱保護された６位水酸基に四角囲み数字３のＧｌｃＮＡｃ（図１５）を導入する。
以上の手順により複雑な構造の糖鎖も簡単に、かつ正確、短工程で作り分けることが可能である（図１６）。
【００２６】
本発明において選択的に脱保護可能な水酸基の保護基の例としては、特許文献１及び２記載のＹ基、及び一般的なオルソゴナルな水酸基の保護基（Boltje, T. J., C. X. Li, et al. (2010). Organic Letters 12(20): 4636-4639.）が使用可能である。一般的なオルソゴナルな水酸基の保護基の例としては以下のものが挙げられる(Sears, P. and C. H. Wong (2001). Science 291(5512): 2344-2350.)。
【００２７】
【００２８】
これら保護基を使用して選択的に目的の水酸基を脱保護する事は一般的常套手段である。括弧の中の試薬は脱保護試薬である。
Pd/C:パラジウム炭素、Pd nanoparticles:パラジウムナノパーティクル、TFA:トリフルオロ酢酸、DDQ: 2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン、NaOMe:ナトリウムメチラート、2°amine:２級アミン、acid:酸、TsOH:p-トルエンスルホン酸、tBuKO:カリウム ターシャリーブトキシド、Ir:イリジウム、Pd:パラジウム、Rh:ロジウム、Bu4NF:フッ化テトラ-n-ブチルアンモニウム、HF:フッ化水素、AcOH:酢酸、thiourea:チオウレア、NaHCO3:炭酸水素ナトリウム、NH2NH2:ヒドラジン。
【００２９】
本発明において、光分解により脱離可能な保護基Ｗの例としては、ＮＰＰＯＣ基［２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル］（Kim, C., J. Kaysen, et al. (2006). Microelectronic Engineering 83(4-9): 1613-1616.）、ＭＮＰＰＯＣ基［2-(3,4-メチレンジオキシ−6−ニトロフェニル)-プロピルオキシカルボニル］（Bhushan, K. R. (2006). Organic & Biomolecular Chemistry 4(10): 1857-1859.）、ＮＶＯＣ基（オルト-ニトロベラトリルオキシカルボニル）（Patchorn.A, B. Amit, et al. (1970). Journal of the American Chemical Society 92(21): 6333-6335.）、ＭｅＮＰＯＣ基（α-メチル-オルト−ニトロピペロニルオキシカルボニル）（McGall, G. H., A. D. Barone, et al. (1997). Journal of the American Chemical Society 119(22): 5081-5090.）、Ａｑｍｏｃ基（アントラキノン-2-イルエトキシ-カルボニル）（Furuta, T., Y. Hirayama, et al. (2001). Organic Letters 3(12): 1809-1812.）、ＤＭＢ基（３，５−ジメトキシベンゾイン−カルボニル）（Pirrung, M. C., L. Fallon, et al. (1998). Journal of Organic Chemistry 63(2): 241-246.）等が挙げられる。
【００３０】
Ｗ（Ｚ）のＺ基の例としては、
【００３１】
などが挙げられる。
【００３２】
この様なＺ基はＷが切断される条件で同時に切断される。あるいはＷ基が切断される事により不安定になり弱酸性、もしくは弱塩基性で切断されるようになるものもある。またＷが切断される条件では完全には切断されず、その後、ＰＩＴＣ化を行う事により選択的に定量的に切断されるものもある。
ここで挙げた構造のみならず、Ｗ基が切断される事により活性化（もしくは不安定化）され、他の保護基に影響を与えない特殊な反応条件で選択的に切断され、脱保護される構造はいずれもＺとして使用することができる。
【００３３】
光分解により脱離可能な保護基ＷもしくはＷ（Ｚ）を脱離するのに使用する露光光源としては例えば、太陽光、ＵＶランプ、ＬＥＤ、水銀ランプ、レーザー、エキシマランプ等が挙げられ、露光量は0.01〜100 mW/cm2、好ましくは0.1〜50 mW/cm2、露光時間は通常１秒〜２４時間、好ましくは２０秒〜３時間である。露光の際の温度は０〜１００℃が適当であり、通常は室温でよい。
【００３４】
また、本発明において、塩基性、酸化剤、フッ素化合物、酵素、または２段階反応により脱離可能な保護基Ｖの例を表１に示すが、ここで挙げた構造に限定されるわけではない。
【００３５】
【表１】
【００３６】
さらに本発明において、Ｙの例としては、
等が挙げられる。
【００３７】
さらに本発明において、アクセプターを基板に結合する際に使用しても良いリンカーは特に制限はなく、リンカーは基板に対して共有結合していても良く、疎水結合でも良い。例えば、ポリエチレングリコール、６−ヒドロキシヘキサン酸、２−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）酢酸、４−（６−ヒドロキシヘキサンアミド）安息香酸、６−ヒドロキシ−Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）ヘキサンアミド等が挙げられる。
基板にリンカー又はアクセプターを結合する方法に特に限定はなく、例えばグリコシド結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、アルキル結合等により容易に結合することができる。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例において、質量分析装置ESI-FT-MSは、Bruker社製REFLEX IIを用いた。また、ＨＰＬＣは、Waters社製Delta600を用い、カラムとしてMightysil RP-18 GP 250-4.6 (4.6 x 250 mm, 5 μm, 関東化学)を付け、流速1 ml/minで流した。最初アセトニトリル：水＝30：70で１０分流し、１０分後直ちに40：60に変更した。その後５０分かけて50：50に変わるよう直線的にグラジェントをかけた。２１５nmでのUV吸収を検出した。蛍光スキャナーは、ＧＥヘルスケア社製Typhoonを用いた。溶媒及び試薬は市販の試薬グレードを用いた。
【００３９】
また、この明細書において、次の略号を使用する。
２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシカルボニル(NPPOC)
二炭酸ジ-ターシャリー-ブチル（Boc2O）
Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）
４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）
ジクロロメタン（CH2Cl2、DCM）
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）
フェニルイソチオシアネート（PITC）
Ｎ−メチルモルフォリン（NMM）
Ｎ−ヨードスクシンイミド（NIS）
トリフルオロメタンスルホン酸（TfOH）
安息香酸（BzOH）
トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（TMSOTf）
テトラヒドロフラン（THF）
トリフルオロ酢酸（TFA）
tert（ターシャリー）−ブトキシカルボニル（Boc）
９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Fmoc）
ベンゾイル（Bz）
ベンジル（Bn）
チオフェニル（SPh）
アリール（Ar）
室温（r.t.）
ガラクトース（Gal）
グルコサミン（GlcN）
グリシン（Gly）
2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル基（Troc）
ユニケモハイドロキシ保護基（UCHP）（特許文献１及び２記載のＹ基の総称）
【００４０】
実施例１
この実施例では、一枚のガラス上に結合位置の異なる３種類の２糖を作りわけている。
実施例１Ａ（アクセプターを基板に結合する工程）
ガラス（１３）（シリカガラスを3-アミノプロピルトリエトキシシラン処理後、６−ヒドロキシヘキサン酸を結合させた物。これによりガラス表面に水酸基を有するリンカーが共有結合している）にFmocGlyを導入し、導入されたFmocの量を定量することにより水酸基のローディング量を0.0235mmol/gと決定した。
そのガラス（１３）の全面にまず、３位水酸基がＢｏｃを持った１重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)で保護され、４位水酸基がNPPOCで保護され、６位水酸基がＢｏｃを持った２重合のＹ基により保護されたグルコサミンドナー（１５）を導入した。
ガラス（１３）３枚（(i)1.561g（2.7cm x 2.6cm x 0.1cm）、(ii)2.190g（5.0cm x 2.5cm x 0.1cm）、(iii)2.178g（5.0cm x 2.5cm x 0.1cm））に、グルコサミンドナー（１５）(566mg）、モレキュラーシーブス４Ａ(4.67g)、ＮＩＳ(309mg)を加え、窒素雰囲気下、脱水ジクロロメタン（6ml）を加えて、-30℃で振盪した。そこにTfOH (122μl)を加え-30℃で1日振盪した。ガラスをNa2S2O3水溶液／アセトン、水、メタノール、ＤＭＦの順に洗浄後、縮合時に切断されたＢｏｃ基の再導入のため、ＤＭＦ(6ml)、Ｂｏｃ2Ｏ(600μl)、飽和重曹水(600μl)を加え、室温にて4時間振盪した。ガラスを水／ＤＭＦ、ＤＭＦ、クロロホルムの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（１６）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（１６）を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし、切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物（化合物１７）を確認した。
化合物１７：MALDI-TOF-MS, C59H95Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1335.56, 実測値：1336.5
【００４１】
【化１】
【００４２】
縮合されなかった未反応の水酸基に対してBzキャッピングを行った。ガラス（１６）にBz2O (600mg)、DMAP (15mg)、ピリジン（6ml）を加え室温にて４時間振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ量でBz化を４時間行った。反応液を除去した後、ガラスを水／ＤＭＦ、２Ｎ―塩酸水、水、ＤＭＦ，クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。
Bzキャッピング後のガラスを４領域に区別する為にガラス切りで下記スキームに示すように十字の線を書いた。
【００４３】
【化２】
【００４４】
それぞれ、以下、領域１、領域２，領域３，領域４と呼ぶ。領域１には単糖（GlcN）、領域２には２糖（Galβ1-4GlcN）、領域３には２糖（Galβ1-3GlcN）、領域４には２糖（Galβ1-6GlcN）を作り分ける。
【００４５】
実施例１Ｂ（Galβ1-4GlcN構造を構築する工程）
まず、GlcNの４位水酸基を選択的に脱保護し、Galβ1-4GlcN構造を構築する為に、領域２だけに光を当てる。ガラスをアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域２にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域２に存在するGlcNの４位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（１８）を得た。
領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物１９を確認した。
化合物１９：MALDI-TOF-MS, C49H86Cl3N5O16Na+ (M+Na)+の計算値：1128.50, 実測値：1129.1
【００４６】
【化３】
【００４７】
ガラス（１８）にガラクトースドナー（２０）を縮合する。３枚のガラス（１８）（(i)1.1697g、(ii)1.5026g、(iii)2.1835g）に、ガラクトースドナー（２０）（116.4mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を入れ窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を入れ、−15℃に冷却した。−15℃にてTMSOTf（85μl）を入れそのまま２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。この縮合操作はもう一度同じ条件にて繰り返した。縮合時に脱離したBoc基の再導入の為に、縮合後のガラスにDMF（７ml）、Boc2O（700μl）、飽和重曹水（700μl）を加え室温にて６時間振盪した。ガラスをDMF/水、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥した。この再Boc化も同じ条件にて繰り返しガラス（２１）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（２１）の領域２を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(２２)を確認した。
化合物２２：MALDI-TOF-MS, C83H118Cl3N5O22Na+ (M+Na)+の計算値：1664.72, 実測値：1664.7
【００４８】
【化４】
【００４９】
次に、他の領域の４位水酸基をBz基にてキャッピングをする為に、他の領域（領域１，３，４）に光を当て、NPPOCを脱離する。
ガラスをアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，３，４だけに室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，３，４に存在するGlcNの４位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（２３）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの４位がBz化された化合物２４を確認した。
化合物２４：MALDI-TOF-MS, C56H90Cl3N5O17Na+ (M+Na)+の計算値：1232.53, 実測値：1233.5
【００５０】
【化５】
【００５１】
次に、GlcNの３位水酸基を選択的に脱保護する。特許文献１及び２記載の方法に従いＹ基の重合度を一つずつ減少させる。３位の１重合のＹ基を脱離すると共に、６位の２重合のＹ基を１重合にする。ガラス（２３）に、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、Boc2O（800μl）、飽和重曹水（800μl）を加え、室温にて１日振盪した。ガラスをDMF／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。その後もう一度Boc化を同様に行い、ガラス（２５）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて１時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がAc化され（選択的に脱保護された３位水酸基にアセチル基が選択的に導入された）、６位が１重合のＹ基により保護された化合物２６を確認した。
化合物２６：MALDI-TOF-MS, C39H58Cl3N3O14Na+ (M+Na)+の計算値：920.29, 実測値：920.4
【００５２】
【化６】
【００５３】
選択的に脱保護された３位水酸基に光切断保護基であるNPPOCを導入する。ガラス（２５）にピリジン（10ml）、NPPOC-OPNP（324mg）、DMAP（229mg）を加え室温にて１日振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このNPPOC化はさらに２回同様に行い、合計３回行い、ガラス（２７）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がNPPOC化された化合物２８を確認した。
化合物２８：MALDI-TOF-MS, C47H65Cl3N4O17Na+ (M+Na)+の計算値：1085.33, 実測値：1085.3
【００５４】
【化７】
【００５５】
実施例１Ｃ（Galβ1-3GlcN構造を構築する工程）
領域３に選択的にGalβ1-3GlcN構造を構築するために、領域３のみ３位水酸基を脱保護し、他の領域はBz基にてキャッピングする必要がある。
まず、領域１，２，４に対して３位水酸基のBzキャッピングを行う。ガラス（２７）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，２，４にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，２，４に存在するGlcNの３位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（２９）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの３位がBz化された化合物３０を確認した。
化合物３０：MALDI-TOF-MS, C44H60Cl3N3O14Na+ (M+Na)+の計算値：982.30, 実測値：982.3
【００５６】
【化８】
【００５７】
次は領域３に選択的に光を当て３位水酸基を脱保護させる。ガラス（２９）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域３にだけ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域３に存在するGlcNの３位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（３１）を得た。
領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物３２を確認した。
化合物３２：MALDI-TOF-MS, C37H56Cl3N3O13Na+ (M+Na)+の計算値：878.28, 実測値：878.4
【００５８】
【化９】
【００５９】
ガラス（３１）の領域３に選択的にガラクトースを導入する。ガラス（３１）にガラクトースドナー（２０）（232.8mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を加え-15℃に冷却した。-15℃でTMSOTｆ（169μl）を加え、２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。縮合時に切断されたBoc基の再導入のために、ガラスにDMF(10ml)、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて６時間振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムにて洗浄後真空乾燥した。この再Boc化はもう一度同じ条件にて繰り返し、ガラス（３３）を得た。
ガラス上の構造確認の為に、ガラス（３３）の領域３を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(３４)を確認した。
化合物３４：MALDI-TOF-MS, C71H88Cl3N3O19Na+ (M+Na)+の計算値：1414.50, 実測値：1414.5
【００６０】
【化１０】
【００６１】
次は、未反応の水酸基をBz基にてキャッピングを行う。ガラス（３３）にBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返した。その後、GlcNの６位水酸基を選択的に脱保護する。ガラスに、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥し、６位水酸基が選択的に脱保護されたガラスを得た。その後６位水酸基にNPPOCを導入した。ガラスにジクロロメタン（10ml）、NPPOC-OPNP（324mg）、DMAP（229mg）を加え室温にて１日振盪した。ガラスをアセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このNPPOC化はもう一度同様に行い、ガラス（３５）を得た。
構造確認のため、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がNPPOC化された化合物３６を確認した。
化合物３６：MALDI-TOF-MS, C42H48Cl3N3O15Na+ (M+Na)+の計算値：962.20, 実測値：962.2
【００６２】
【化１１】
【００６３】
実施例１Ｄ（Galβ1-6GlcN構造を構築する工程）
領域４に選択的にGalβ1-6GlcN構造を構築するために、領域４のみ６位水酸基を脱保護し、他の領域はBz基にてキャッピングする必要がある。まず、領域１，２，３に対して６位水酸基のBzキャッピングを行う。ガラス（３５）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域１，２，３のみに室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域１，２，３に存在するGlcNの６位に結合したNPPOC基を脱離したガラスを得た。その後、ガラスにBz2O（500mg）、DMAP（50mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄し、真空乾燥した。このBzキャッピングを同条件で繰り返し、ガラス（３７）を得た。
構造確認のため、領域１を玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がBz化された化合物３８を確認した。
化合物３８：MALDI-TOF-MS, C39H43Cl3N2O12Na+ (M+Na)+の計算値：859.18, 実測値：859.5
【００６４】
【化１２】
【００６５】
次は領域４に選択的に光を当て６位水酸基を脱保護させる。ガラス（３７）をアセトニトリル１０ｍｌ、水１０ｍｌの混合溶媒中に浸し、３６０nmの光(9.19 mW/cm2)を領域４にのみ室温下３０分照射した。水、アセトンの順にガラスを洗浄し、真空乾燥することにより、領域４に存在するGlcNの６位に結合したNPPOC基を脱離したガラス（３９）を得た。
領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化することにより選択的にNPPOCが脱離された化合物４０を確認した。
化合物４０：MALDI-TOF-MS, C32H39Cl3N2O11Na+ (M+Na)+の計算値：755.15, 実測値：756.3
【００６６】
【化１３】
【００６７】
ガラス（３９）の領域４に選択的にガラクトースを導入する。ガラス（３９）にガラクトースドナー（２０）（232.8mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（6ml）を加え-15℃に冷却した。-15℃でTMSOTｆ（169μl）を加え、２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥し、各領域を作り分けたガラス（４１）を得た。
【００６８】
各領域のガラスを少々砕き玉尾酸化することによりそれぞれ選択的に目的の構造が合成できていることを確認した。領域１から化合物４２（目的の単糖）、領域２から化合物４３（目的の２糖（Galβ1-4GlcN））、領域３から化合物４４（目的の２糖（Galβ1-3GlcN））、領域４から化合物４５（目的の２糖（Galβ1-6GlcN））を得た。
化合物４２：MALDI-TOF-MS, C39H43Cl3N2O12Na+ (M+Na)+の計算値：859.18, 実測値：859.7
化合物４３：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1292.5
化合物４４：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1291.7
化合物４５：MALDI-TOF-MS, C66H71Cl3N2O17Na+ (M+Na)+の計算値：1291.37, 実測値：1291.8
【００６９】
【化１４】
【００７０】
以上の結果より、本発明の手法を用いると構造の異なる糖鎖をビルドアップ的に基板上に合成できることがわかる。
すべての工程をMSにより追跡できた事、及び特許文献１及び２記載の方法により、Ｙ基を用いた重合度の減少による水酸基の連続的脱保護は、選択的に進行することが証明されている事から、目的の領域に目的の化合物が合成できていることは確かであるが、念のため標品を用いたHPLCの保持時間の比較を行った。
領域２，３，４を玉尾酸化することにより得られる３種類の２糖、化合物（４３）（Galβ1-４GlcN）、化合物（４４）（Galβ1-３GlcN）、化合物（４５）（Galβ1-６GlcN）に対して、メタノール中、NaOMeを作用してそれぞれ化合物（４６）、（４７）、（４８）を得た。別途用意したこれら３種と同じ構造の化合物標品と、HPLCの保持時間を比較した。C-18HPLCカラムを用い、１ml／minの流速で流し、２１５nmでのUV吸収を検出した。最初アセトニトリル：水＝30：70で１０分流し、１０分後直ちに40：60に変更した。その後５０分かけて50：50に変わるようグラジェントをかけた。標品の保持時間は化合物（４６）、（４７）、（４８）それぞれ46.232分、45.572分、40.230分であるのに対し、各領域から得られた２糖由来のピークはそれぞれ45.700分、45.023分、39.510分であり、正確に各結合が合成できていることが証明された。
【００７１】
【化１５】
【００７２】
実施例２（レクチンによりガラス表面糖鎖が認識されることの確認）
ビルドアップ的に合成した糖鎖がレクチンにより認識されることを以下のようにして証明した。
リンカーを導入したガラス（４９）に対し、実施例１に記載した方法に従いNPPOCを導入し、その後未反応のOH基をBzでキャッピングを行いガラス（５０）を得た。そこに、星形に光を当てることにより星形にNPPOCが脱離し、星形に水酸基が脱保護されたガラス（５１）を得た。
そこにガラクトースドナー（５２）を縮合した。ガラス（５１）（50mg）にガラクトースドナー（５２）（10mg）、NIS（10mg）を加え窒素雰囲気下、無水ジクロロメタンを加え-30℃に冷却した。そこにTfOH（4μl）を加え、-30℃で１日振盪した。ガラスを飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、メタノール、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥することによりガラス（５３）を得た。すべての保護基を脱保護するために、ガラス（５３）にメタノール（1ml）を加え、NaOMeをpH11になるまで加えた後、室温にて１日振盪した。ガラスを水、２Ｎ−塩酸水、水、ＤＭＦ、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥することによりガラス（５４）を得た。
【００７３】
ガラス（５４）を１％ＰＢＳに浸し１５分振盪した。溶液を除去した後、１％BSA入り１％PBS溶液（１％BSA／PBS）に浸し６℃にて１２時間振盪した。溶液を除去した後、ビオチン化されたRCA120レクチン（50μl、10μg／ml）でガラスを覆い４時間室温にて軽く振盪した。溶液を除去した後、１％PBS溶液を加え軽く５分間振盪、その後溶液を除去するという洗いの操作を３回繰り返した。
溶液を除去したガラスにアビジン化されたAlexaFluor488（登録商標）(0.1mg)/(1%BSA/PBS(800μl))で覆い２時間室温にて軽く振盪した。溶液を除去した後上記洗いの操作を３回繰り返した。ガラスの蛍光を蛍光スキャナーで観察した。532nmレーザーを用い励起させ、蛍光フィルターとして526nmのバンドパスフィルターを用いて観察した結果、図１７のように星形に光った。つまり、星形に光を当てて光切断保護基を脱離した所にガラクトースが導入され、その導入されたガラクトースをレクチンが認識したためである。これによりビルドアップ的にガラス上で合成した糖鎖をレクチンが認識可能であることが証明できた。
【００７４】
【化１６】
【００７５】
実施例３（光切断保護基としてW（Z）基を使用した例）
実施例１では光切断保護基としてＷ基を直接水酸基に結合させていたが、この実施例では光切断保護基としてW(Z)基でも可能であることを示す。
リンカーを導入したガラス（５５）（5.59g、水酸基のローディング = 0.01652 mmol/g）に光切断保護基を持たないグルコサミン誘導体ドナー（５６）（509mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、NIS（249g）を入れ窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン（5ml）を入れ、−30℃に冷却した。−30℃にてTfOH（98μl）を入れそのまま１日振盪した。ガラスをDMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、DMFの順で洗浄した。このガラスにDMF（12ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて12時間振盪した。ガラスをDMF/水、DMF、クロロホルムの順で洗浄し真空乾燥し、ガラス（５７）を得た。
ガラスに結合した化合物の構造確認の為に、ガラス（５７）を少々砕き玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定し目的物(５８)を確認した。目的通りグルコサミン誘導体がガラス上に導入された。
化合物５８：MALDI-TOF-MS, C71H109Cl3N6O19Na+ (M+Na)+の計算値：1477.67, 実測値：1478.0
【００７６】
【化１７】
【００７７】
ガラス（５７）の未反応の水酸基をBz基にてキャッピングを行った。ガラス（５７）にBzOH（750mg）、DIC（900μl）、DMAP（12mg）、ジクロロメタン（12ml）を加え６℃にて12時間振盪した。クロロホルム、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥した。次は、６位水酸基を選択的に脱保護するためにＹ基の重合度を１つずつ減少させる。この操作により６位水酸基が選択的に脱保護されると共に、３位水酸基の２つのＹ基が１つだけ脱離する。Bzキャッピングしたガラスに、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）を加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄後、２０％TFA/ジクロロメタン（20ml）を加え３０分間室温にて振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。ガラスをクロロホルム、DMFの順に洗浄後、DMF（8ml）、Boc2O（800μl）、飽和重曹水（800μl）を加え、室温にて12時間振盪した。ガラスをDMF／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥し、ガラス（５９）を得た。
構造確認のため、ガラスを少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて3時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位がAc化され（選択的に脱保護された６位水酸基にアセチル基が選択的に導入された）、３位が１重合のＹ基により保護された化合物６０を確認した。
化合物６０：MALDI-TOF-MS, C54H77Cl3N4O16Na+ (M+Na)+の計算値：1165.43, 実測値：1166.3
【００７８】
【化１８】
【００７９】
ガラス（５９）（(i)1.160g、(ii)1.174g）にそれぞれ(i)NPPOC-UCHP（54mg）、(ii)NPPOC-Gly（66mg）を加えジクロロメタン（(i)1.5ml、(ii)1.5ml）を加えた。そこにDIC（(i)48μl、(ii)72μl）を加え６℃に冷却した後、DMAP（(i)5mg、(ii)7mg）を加え、６℃で１２時間振盪した。それぞれのガラスをクロロホルム、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗い、真空乾燥しガラス（６１、６２）を得た。構造確認のため、ガラスをそれぞれ少々砕きピリジン（1ml）、無水酢酸（500μl）を加え室温にて２時間振盪し、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、GlcNの６位にNPPOC-UCHP及びNPPOC-Glyがそれぞれ導入された化合物６３，６４を確認した。
化合物６３：MALDI-TOF-MS, C69H97Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1457.57, 実測値：1457.6
化合物６４：MALDI-TOF-MS, C64H87Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1387.49, 実測値：1388.0
【００８０】
【化１９】
【００８１】
ガラス（６１）及び（６２）それぞれに光を当て６位水酸基の選択的脱保護を検討した。
それぞれのガラスをＴＨＦ／水（10ml／10ml）に浸し、PITC（120μl）を加えしばらく振盪した後、360nm（8.6 mW/cm2）の光を室温にて３０分間照射した。その後、水、アセトン、DMFの順にガラスを洗浄し、DMF（1.5ml）、PITC（500μl）、NMM（120μl）を加え室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し真空乾燥することによりガラス（６５）とガラス（６６）をそれぞれ得た。
ガラス上の構造確認の為に、それぞれのガラスを少々砕き、構造確認を行った。ガラス（６５、６６）はそれぞれ玉尾酸化し、MSを測定した。その結果両方から同じ目的物（６７、６８）をそれぞれ確認した。ガラス（６５）においては、念のため、遮光した部分のガラスを玉尾酸化の条件にさらし切り出しを行い、ＭＳ（MALDI-TOF）を測定した所、未反応体である化合物（６３）を確認した。
化合物６７：MALDI-TOF-MS, C52H75Cl3N4O15Na+ (M+Na)+の計算値：1123.42, 実測値：1123.4
化合物６８：MALDI-TOF-MS, C52H75Cl3N4O15Na+ (M+Na)+の計算値：1123.42, 実測値：1123.7
化合物６３：MALDI-TOF-MS, C69H97Cl3N6O20Na+ (M+Na)+の計算値：1457.57, 実測値：1458.0
【００８２】
【化２０】
【００８３】
以上の結果より、W(Z)基でも光により選択的に切断可能であり、本発明に使用可能であることがわかる。
【００８４】
実施例４
光切断保護基Ｗ基の種類を検討した。
水酸基に対して光切断保護基として、Ａｑｍｏｃ基、ＮＰＰＯＣ基、ＭＮＰＰＯＣ基を導入し、光により切断されるか検討した。３，４位水酸基が脱保護されたＧａｌ（６９）に対してそれぞれの光切断保護基を導入し化合物７０，７１，７２を得た。これらに各種溶媒中太陽光を照射して反応をＴＬＣで追跡した。結果、いずれにおいてもＴＨＦ／水＝１／１の溶液中で反応させると定量的に脱保護でき、化合物７３を与える事が判明し、このような光切断保護基が本発明に使用可能である事がわかる。
ここで、compound:化合物、solvent:溶媒、product:生成物、by-product:副生成物、no solvent:溶媒なし、50% aq THF:５０％ＴＨＦ水溶液、CH2Cl2:ジクロロメタン、2% DBU in CH2Cl2:２％ＤＢＵ含有ジクロロメタン、2% DIPEA in CH2Cl2:２％ＤＩＰＥＡ含有ジクロロメタン、CH3CN:アセトニトリル、1,4-dioxane:１，４−ジオキサン、50% aq MeOH:５０％メタノール水溶液を示す。
【００８５】
【化２１】
【００８６】
実施例５
分岐を有する４糖を合成した例
リンカーが結合したガラス(７４)3.75ｇ（ローディング０．０３４７mmol/g）に、ガラクトースドナー（７５）（413mg）、NIS（263.7mg）、モレキュラーシーブス４A（2g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え、−３０℃に冷却した。−３０℃にてTfOH（103.7μl）を加え、そのまま−３０℃で３時間振盪した。DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液／アセトン、水、DMFで洗浄後、DMF（10ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）を加え室温にて６時間振盪した。水／DMF、DMFで洗浄後、もう一度同じようにBoc化を行った。構造確認のため、ガラスを少々砕き玉尾酸化し、MSを測定した。その結果、目的の化合物７７を確認した。
化合物７７：MALDI-TOF-MS, C63H81N3O16Na+ (M+Na)+の計算値：1158.55, 実測値：1158.9
【００８７】
【化２２】
【００８８】
未反応の水酸基をベンゾイルキャッピングする為に、ガラス（７６）にBzOH（500mg）、DIC（600μl）、ジクロロメタン（10ml）を加えた後、６℃にてDMAP（8mg）を加え、そのまま６℃で１２時間振盪した。ガラスを水／アセトン、DMF、クロロホルムにて洗浄後、真空乾燥した。乾燥したガラスに、20%ピペリジン／DMF（10ml）を加え室温にて３０分間振盪した。DMFで洗浄後、DMF（7.5ml）、PITC（2.5ml）、NMM（600μl）を加え室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、アセトン、アセトン／水、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。乾燥したガラスに、ピリジン（10ml）、NPPOC-OPNP（225mg）、DMAP（32mg）を加え室温にて１日振盪した。２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。乾燥したガラスにもう一度同じようにNPPOC化を行った。構造確認の為にガラスを少々砕き玉尾酸化を行い、３位水酸基にNPPOCが導入された化合物７９を確認した。
化合物７９：MALDI-TOF-MS, C51H67N3O17Na+ (M+Na)+の計算値：1016.44, 実測値：1016.6
【００８９】
【化２３】
【００９０】
ガラス（７８）に十字の傷を付け、下記のように４つの領域に分割した。それぞれ、領域１，領域２，領域３，領域４と呼ぶ。領域１はGal（ガラクトース）単糖、領域２はGalβ1-3Gal２糖、領域３はGlcNβ1-4Gal２糖、領域４はGalβ1-4Glcβ1-4(Galβ1-3)Gal４糖（分岐あり）を作り分ける。
【００９１】
【化２４】
【００９２】
ガラス（７８）の領域１および３を露光する。ガラス（７８）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域１および３に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。得られたガラスは水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥しガラス（８０）を得た。構造確認の為、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、３位NPPOCが選択的に除去された化合物８１を確認した。
化合物８１：MALDI-TOF-MS, C41H58N2O13Na+ (M+Na)+の計算値：809.38, 実測値：810.0
【００９３】
【化２５】
【００９４】
ガラス（８０）にBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返した。Bz化を行ったガラスをTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域２および４に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。得られたガラスは水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥しガラス（８２）を得た。構造確認の為、領域１および領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、領域１から化合物８３、領域２から化合物８４を確認した。
化合物８３：MALDI-TOF-MS, C48H62N2O14Na+ (M+Na)+の計算値：913.41, 実測値：913.3
化合物８４：MALDI-TOF-MS, C41H58N2O13Na+ (M+Na)+の計算値：809.38, 実測値：809.3
【００９５】
【化２６】
【００９６】
ガラス（８２）の領域２および４のガラクトースの３位水酸基に２糖目のガラクトースを導入する。ガラス（８２）にガラクトースドナー（８５）（389mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え−１５℃に冷却した。そこに、TMSOTf（283μl）を加え、−１５℃で２時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、DMF/飽和重曹水の順に洗浄した。得られたガラスに、DMF（10ml）、Boc2O（1ml）、飽和重曹水（1ml）加え、室温にて６時間振盪した。DMF/水、DMF、クロロホルムの順に洗浄した後、もう一度同じようにBoc化の反応を行った。得られたガラスにBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返し、ガラス（８６）を得た。構造確認の為、領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、２糖化合物８７を確認した。
化合物８７：MALDI-TOF-MS, C75H90N2O19Na+ (M+Na)+の計算値：1345.60, 実測値：1345.7
【００９７】
【化２７】
【００９８】
ガラス（８６）にジクロロメタン（16ml）、TFA（4ml）を加え、室温にて３０分間振盪した。反応液を除去した後、もう一度同じ反応を繰り返した。クロロホルム、DMFの順にガラスを洗浄後、DMF（8ml）、PITC（4ml）、NMM（960μl）加え、室温にて３０分間振盪した。ガラスをDMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥する事により４位水酸基を脱保護したガラス（８８）を得た。構造確認の為、領域１と２のガラスを少々砕きそれぞれ玉尾酸化し、領域１から化合物８９を、領域２から化合物９０を確認した。
化合物８９：MALDI-TOF-MS, C36H41NO11Na+ (M+Na)+の計算値：686.26, 実測値：686.2
化合物９０：MALDI-TOF-MS, C63H69NO16Na+ (M+Na)+の計算値：1118.45, 実測値：1118.3
【００９９】
【化２８】
【０１００】
ガラス（８８）にジクロロメタン（10ml）、NPPOC-OPNP（271mg）、DMAP（191mg）を加え室温にて１２時間振盪した。反応液を除去し、アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順にガラスを洗浄後、真空乾燥した。得られたガラスにもう一度同じ操作を繰り返し行い、４位水酸基にNPPOC基が導入されたガラス（９１）を得た。構造確認の為、領域１のガラスを少々砕き玉尾酸化し、目的の化合物９２を確認した。
化合物９２：MALDI-TOF-MS, C46H50N2O15Na+ (M+Na)+の計算値：893.31, 実測値：893.3
【０１０１】
【化２９】
【０１０２】
ガラス（９１）の領域１および２を露光する。ガラス（９１）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域１および２に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥した。得られたガラスに、Bz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返しガラス（９３）を得た。構造確認の為、領域１および領域２のガラスを少々砕き玉尾酸化し、領域１から化合物９４、領域２から化合物９５を確認した。
化合物９４：MALDI-TOF-MS, C43H45NO12Na+ (M+Na)+の計算値：790.28, 実測値：790.3
化合物９５：MALDI-TOF-MS, C70H73NO17Na+ (M+Na)+の計算値：1222.48, 実測値：1222.5
【０１０３】
【化３０】
【０１０４】
ガラス（９３）の領域３を露光する。ガラス（９３）をTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域３に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（９６）を得た。構造確認の為、領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化し、化合物９７を確認した。
化合物９７：MALDI-TOF-MS, C36H41NO11Na+ (M+Na)+の計算値：686.26, 実測値：687.0
【０１０５】
【化３１】
【０１０６】
ガラス（９６）の領域３のガラクトースの４位水酸基に、２糖目としてグルコサミンを導入する。ガラス（９６）にグルコサミンドナー（９８）（198mg）、NIS（176mg）、モレキュラーシーブス４A（2g）、脱水ジクロロメタン（8ml）を加え−30℃に冷却した。そこに、TfOH（69μl）を加え、−30℃で３時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液/アセトン、水、DMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥しガラス（９９）を得た。構造確認の為、領域３のガラスを少々砕き玉尾酸化し、２糖化合物１００を確認した。
化合物１００：MALDI-TOF-MS, C66H65Cl3N2O20Na+ (M+Na)+の計算値：1333.31, 実測値：1334.0
【０１０７】
【化３２】
【０１０８】
ガラス（９９）にBz2O（600mg）、DMAP（400mg）、ジクロロメタン（10ml）を加え室温で１２時間振盪した。アセトン、２N-塩酸水／アセトン、水／アセトン、DMF、クロロホルムの順に洗浄し、真空乾燥した。このBz化はもう一度同じように繰り返した。得られたガラスをTHF/水（10ml/10ml）に浸し、領域４に360 nmのUV光（9.19 mW/cm2）を３０分間照射した。水、アセトンの順に洗浄後真空乾燥し、ガラス（１０１）を得た。構造確認の為、領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化し、化合物１０２を確認した。
化合物１０２：MALDI-TOF-MS, C63H69NO16Na+ (M+Na)+の計算値：1118.45, 実測値：1118.7
【０１０９】
【化３３】
【０１１０】
ガラス（１０１）の領域４の１糖目のガラクトース４位水酸基に、ラクトースを導入する。ガラス（１０１）にラクトースドナー（１０３）（303mg）、NIS（176mg）、モレキュラーシーブス４A（5g）、脱水ジクロロメタン（6ml）を加え−30℃に冷却した。そこに、TfOH（69μl）を加え、−30℃で３時間振盪した。ガラスをクロロホルム、DMF、チオ硫酸ナトリウム水溶液/アセトン、水、DMF、クロロホルムの順に洗浄後、真空乾燥しガラス（１０４）を得た。構造確認の為、領域４のガラスを少々砕き玉尾酸化し、４糖化合物１０５を確認した。
化合物１０５：MALDI-TOF-MS, C124H117NO33Na+ (M+Na)+の計算値：2170.74, 実測値：2172.4
【０１１１】
【化３４】
【０１１２】
以上の結果より、領域１にはガラクトース単糖（化合物９４）、領域２にはGalβ1-3Gal（化合物９５）、領域３にはGlcNβ1-4Gal（化合物１００）、領域４にはGalβ1-4Glcβ1-4(Galβ1-3)Gal（化合物１０５）が選択的に合成できることがわかる。 ここで、領域４においては、基板上の３位水酸基に対してガラクトースドナー（８５）を導入し、まず、Galβ1-3Gal２糖を得、その後この２糖をアクセプターとして使用し、これに、ラクトースドナー（１０３）を導入して４糖を合成している。
つまり、第１のアクセプターに第１のドナーを縮合させて第１の生成物を得、これを第２のアクセプターとし、これに第２のドナーを縮合させて第２の生成物を得る、という工程を順次必要な回数実施することにより、一枚の基板上で分岐構造及び／又は直鎖構造を有するコンビナトリアルライブラリーを効率よく合成することができる。
【０１１３】
実施例６
実施例１においてガラスの代わりに、板状ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）樹脂の表面に真空紫外光（ＶＵＶ）を照射した後、ＡＰＴＥＳ（3-アミノプロピルトリエトキシシラン）処理により表面にアミノ基を導入した樹脂基板を用いても、同様に基板上での糖鎖の作り分けが可能であった。
【０１１４】
実施例７
実施例１のグルコサミンドナー（１５）において、３位水酸基の保護基を、Ｂｏｃで保護された１重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)に代えて、Ｂｕ4ＮＦで選択的に脱保護可能なＴＢＤＭＳ基（tert-butyldimethylsilyl group: ターシャリー−ブチルジメチルシリル基）にし、６位水酸基の保護基をＢｏｃで保護された２重合のＹ基(-[(CH3CH2)2CH]N-CH2-CO-)に代えて、ＤＤＱで選択的に脱保護可能なＰＭＢ基（p-methoxybenzyl group: パラメトキシベンジル基）にしたドナーを用いても同様に基板上での糖鎖の作り分けが可能であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に結合した、少なくとも２個の水酸基を有する化合物であって、そのすべての水酸基が、脱保護条件が相互に異なる少なくとも２種の保護基からなる群から選ばれる保護基で保護された化合物をアクセプターとして用い、該保護基を選択的に脱保護し、脱保護された水酸基に所望のドナー又はキャッピング基を選択的に導入して一枚の基板上でビルドアップ型コンビナトリアルライブラリーを合成する方法において、
（１）第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程、
（２）脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基（Ｗは光分解により脱離可能な保護基を示し、ＺはＷ基が脱離する光分解の条件でＷ基と同時に脱保護される基、もしくはＷ基が脱離する事により、活性化（もしくは不安定化）され、選択的に除去可能になる基を示す）を導入する工程、
（３）基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（４）ｎが２以上の整数である場合、工程（３）を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（５）第２の保護された水酸基について、工程（１）から（４）を繰り返し、第２の保護された水酸基を脱保護し、脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基を導入し、基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入し、上記工程を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（６）必要により、工程（５）を所望の、保護された水酸基について繰り返し、各水酸基の各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、第１ないし第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程を含み、
工程（１）〜（６）において、繰り返して使用する、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基、基板の分割部位の数ｎ、ドナー又はキャッピング基は、同一でも異なっていても良い、
ことを特徴とする、ビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法。
【請求項２】
アクセプターの水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良く、ｍはＹの重合度を示し、１以上の整数であり、ｍが２以上の整数の場合、各Ｙ中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、相互に同一でも異なっていても良い。）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程が、Ａ（Ｙ）ｍ基のＹ基中の酸アミド結合をＮ末端側から逐次切り離す方法により重合度の小さなＹ基を選択的に脱保護する工程を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
アクセプターの１個の水酸基の保護基がＶ基（Ｖは塩基性、酸化剤、フッ素化合物、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。）であり、他の少なくとも１個の水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。ただし、ＡがＶと同一であることはなく、Ｖの脱離条件でＡが脱離することはない。）であり、第１の保護された水酸基がＶ基で保護された水酸基である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ドナーがＡ（Ｙ）ｍ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含み、工程（１）〜（６）を繰り返すことを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
ドナーがＶ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含む請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アクセプターが糖である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
保護基ＡがＢｏｃ基であり、保護基ＷがＮＰＰＯＣ基である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
アクセプターが、リンカーを介して基板に固定されている請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
基板が、ガラスである請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
基板上に結合した、少なくとも２個の水酸基を有する化合物であって、そのすべての水酸基が、脱保護条件が相互に異なる少なくとも２種の保護基からなる群から選ばれる保護基で保護された化合物をアクセプターとして用い、該保護基を選択的に脱保護し、脱保護された水酸基に所望のドナー又はキャッピング基を選択的に導入して一枚の基板上でビルドアップ型コンビナトリアルライブラリーを合成する方法において、
（１）第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程、
（２）脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基（Ｗは光分解により脱離可能な保護基を示し、ＺはＷ基が脱離する光分解の条件でＷ基と同時に脱保護される基、もしくはＷ基が脱離する事により、活性化（もしくは不安定化）され、選択的に除去可能になる基を示す）を導入する工程、
（３）基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（４）ｎが２以上の整数である場合、工程（３）を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（５）第２の保護された水酸基について、工程（１）から（４）を繰り返し、第２の保護された水酸基を脱保護し、脱保護された水酸基に、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基を導入し、基板をｎ個（ｎは１以上の整数）の部位に分割し、該基板の第１の部位を選択的に露光し、露光部のＷ基もしくはＷ（Ｚ）基を選択的に脱保護し、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第１のドナー又はキャッピング基を選択的に導入し、上記工程を第２の部位から所望の第ｎの部位まで繰り返し、各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、所望の第２のドナー又はキャッピング基ないし所望の第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程、
（６）必要により、工程（５）を所望の、保護された水酸基について繰り返し、各水酸基の各部位において、選択的に脱保護された水酸基に、第１ないし第ｎのドナー又はキャッピング基を選択的に導入する工程を含み、
工程（１）〜（６）において、繰り返して使用する、Ｗ基もしくはＷ（Ｚ）基、基板の分割部位の数ｎ、ドナー又はキャッピング基は、同一でも異なっていても良い、
ことを特徴とする、ビルドアップ型コンビナトリアルライブラリー合成方法。
【請求項２】
アクセプターの水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。Ｙは−ＮＲ1−ＣＲ2Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ1は炭素数１〜６のアルキル基又は水素原子、Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数３〜２０のアルケニル基、炭素数６〜７のアリール基、又は炭素数７〜２０のアリールアルキル基であり、同一でも異なっていても良く、ｍはＹの重合度を示し、１以上の整数であり、ｍが２以上の整数の場合、各Ｙ中のＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、相互に同一でも異なっていても良い。）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の保護された水酸基を選択的に脱保護する工程が、Ａ（Ｙ）ｍ基のＹ基中の酸アミド結合をＮ末端側から逐次切り離す方法により重合度の小さなＹ基を選択的に脱保護する工程を含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
アクセプターの１個の水酸基の保護基がＶ基（Ｖは塩基性、酸化剤、フッ素化合物、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。）であり、他の少なくとも１個の水酸基の保護基がＡ（Ｙ）ｍ基（Ａは酸性、塩基性、遷移金属又は遷移金属有機錯体、光分解、又は酵素により脱離可能な保護基を示す。ただし、ＡがＶと同一であることはなく、Ｖの脱離条件でＡが脱離することはない。）であり、第１の保護された水酸基がＶ基で保護された水酸基である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ドナーがＡ（Ｙ）ｍ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含み、工程（１）〜（６）を繰り返すことを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
ドナーがＶ基により保護された少なくとも１個の水酸基を含む請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
アクセプターが糖である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
保護基ＡがＢｏｃ基であり、保護基ＷがＮＰＰＯＣ基である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
アクセプターが、リンカーを介して基板に固定されている請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
基板が、ガラスである請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１２−１１６８０３（Ｐ２０１２−１１６８０３Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６９４８２（Ｐ２０１０−２６９４８２）
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業個人型研究（さきがけ）、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業個人型研究（さきがけ）、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]