増殖性疾患または炎症に用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン
本発明は、増殖性疾患または炎症性疾患の予防または治療のための医薬を製造するための化合物の使用であって、化合物が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンまたはその薬学上許容可能な塩である使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患および癌の予防または治療におけるジヒドロテトラベナジンの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
癌は、異常かつ制御不能な細胞増殖を特徴とする疾患の集団に対する集合的用語である。通常は、身体が必要とするときにのみ細胞が増殖し分割して、新たな細胞を形成する。細胞が老化して死ぬと、新しい細胞がその代わりをする。細胞内の遺伝子の突然変異によって、この過程が破壊されて、身体が必要としないときに新たな細胞が形成されかつ老細胞が死ぬべきときに死ないことがときとしてある。余分な細胞は、増殖、新生物または腫瘍と呼ばれる組織の塊を形成する。腫瘍は、良性（癌性でない）または悪性（癌性）のいずれかであることができる。良性腫瘍は身体の他の部分に広がらず、生命を脅かすことはまれにしかないが、悪性腫瘍は広がる（転移する）可能性があり、生命を脅かすことがある。癌は単一の細胞内から発生し、従ってそれらが発生する細胞の種類および細胞の位置によって分類することができる。例えば、腺腫は腺組織に由来し、癌腫は上皮細胞に由来し、白血病は骨髄幹細胞で生じ、リンパ腫はリンパ組織に由来し、黒色腫はメラニン細胞で生じ、肉腫は骨または筋肉の結合組織で生じ、奇形腫は生殖細胞で生じる。
【０００３】
癌治療には様々な方法があり、最も普通に行われるものは手術、化学療法および放射線療法である。一般に、療法の選択は腫瘍の部位と悪性度分類、および疾患の病期によって変わる。腫瘍が限局性であれば、手術が好ましい治療法であることが多い。普通に見られる外科処置法の例としては、前立腺癌についての前立腺切除および乳癌についての乳房切除が挙げられる。手術の目的は、腫瘍のみまたは全器官の除去のいずれかであることができる。単一の癌細胞は相当の大きさの腫瘍に増殖する可能性があるので、腫瘍のみの除去では再発の可能性が大きくなる。化学療法は、癌細胞を破壊しまたは増殖を防止することができる薬剤を用いる癌の治療を包含する。癌の化学療法によって開発された代替機構としては、腫瘍に供給する血管を途絶させる作用をする抗脈管形成剤および腫瘍組織に対する宿主の免疫応答を高める作用をする免疫療法剤が挙げられる。正常細胞は、制御された過程で増殖し、死ぬ。癌が生じると、正常でない身体の細胞は制御なしに分割を続け、更に細胞を形成する。抗癌薬の１つのクラスは、分割細胞を殺すことによってまたは細胞の成長または増殖を停止することによって作用する。健常細胞、特に速やかに分割する細胞も損なわれる可能性があり、またこれは副作用を生じる可能性がある。放射線療法は、イオン化放射線を用いて癌細胞を殺して腫瘍を縮小させることを含む。放射線療法は、遺伝子材料を傷付けることによって治療を行う部位（「標的組織」）の細胞に損傷を与えまたは破壊し、これらの細胞が増殖または分割を続けることを不可能にする。放射線は癌細胞と正常細胞を両方とも損傷するが、ほとんどの正常細胞は放射線の影響から回復して適正に機能することができる。放射線療法の目的は、附近の正常組織に対する傷害を限定しながら、できるだけ多くの癌細胞に損傷を与えることである。放射線療法は、脳、乳房、頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎、胃、子宮の癌、または柔組織肉腫などほとんどあらゆる種類の固形腫瘍の治療目的に使用することができる。放射線は、白血病およびリンパ腫（それぞれ、血液形成細胞およびリンパ系の癌）の治療目的で用いることもできる。
【０００４】
シグマ（σ）受容体のリガンドが腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有することが報告されている(Berthois et al., British Journal of Cancer, (2003), 88, 438-446)。また、Ｂｏｕｒｒｉｅらは(Current Opinion in Investigational Drugs, (2004) 5(11):1158-63)、２つのシグマ受容体サブタイプおよびそれらの２つの関連タンパク質も腫瘍細胞上で発現することを報告している。
【０００５】
シグマ受容体は、アヘン剤受容体のサブタイプであるとかつて考えられていた細胞表面受容体であるが、この受容体の特性決定および受容体に対する特異的リガンドの発見の後、それらはアヘン剤受容体とは異なることが明らかにされている(Bourrie et al., (2004))。
【０００６】
シグマ受容体は、シグマ−１（σ−１）およびシグマ−２（σ−２）サブタイプに分類することができる。σ−１受容体は、２２３個のアミノ酸を含んでいると考えられているが、クローニングされ(Hanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93:8072-8077)、任意の他の受容体クラスとは一次配列相同性を示さないことが分かっている。しかしながら、これは真菌ステロールＣ８−Ｃ７イソメラーゼの配列に３０．３％の同一性を有し、機能が未知の別のタンパク質ＳＲＢＰ２（ＳＲ−３１７４７結合タンパク質２）に関係することも分かっており、この酵素と高い相同性を共有している。σ−２受容体は、未だクローニングされていない。
【０００７】
Ｗａｎｇらは(Breast Cancer Research & Treatment, (2004), 87(3):205-14)、ヒト乳癌におけるシグマ−１受容体の発現を検討し、正常組織と比較して乳癌の６４％にシグマ−１受容体ｍＲＮＡの過剰発現を見出し、幾つかの正常およびほとんどの腫瘍性乳房上皮細胞および細胞系は一般にシグマ−１受容体を発現すると結論した。彼らは、非特異的シグマ−１リガンドであるハロペリドールが高濃度でこれらの細胞の増殖を阻害し、イン・ビトロでの化学療法の効果を増強することも見出した。
【０００８】
Ｂｅｒｔｈｏｉｓら(2003)は、ヒト上皮乳房および前立腺癌細胞系の増殖に対するシグマ受容体リガンドＳＲ３１７４７Ａの効果を測定した研究を報告した。彼らは、イン・ビトロではナノモル濃度のＳＲ３１７４７Ａがホルモン−応答性およびホルモン−非応答性癌細胞系のいずれにおいても細胞増殖を劇的に阻害することを報告した。彼らはまた、ＳＲ３１７４７Ａを処理されたことがあるマウスでは腫瘍の発生が有意に減少することも見出した。
【０００９】
Ｓｐｒｕｃｅら(Cancer Research, (2004), 64:4875-4886)は、小分子であるσ−１受容体拮抗薬が、免疫不全マウスにおける発達中および確立したホルモン感受性およびホルモン不感受性の乳癌キセノグラフ（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｓ）、正常位前立腺腫瘍およびｐ５３−ヌル肺癌キセノグラフの増殖を副作用なしで阻害することを報告している。彼らは、σ−１拮抗薬が腫瘍細胞においてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導するが、ほとんどの正常細胞の種類では誘発されないことを見出した。Ｓｐｒｕｃｅらは、σ−１拮抗薬を用いることによって、正常組織を殺さずに腫瘍を殺す方法を提供できるであろうと結論した。
【００１０】
癌細胞の増殖の阻害におけるσ−１受容体リガンドの使用についての他の報告は、Spruce et al.(2004)に引用されている文献に見出すことができ、例えば、Brent et al., Eur. J. Pharmacol, (1995), 278:151-60およびCrawford et al. Cancer Research, (2002), 62:313-22を参照されたい。
【００１１】
従って、シグマ受容体リガンドが癌細胞系の増殖を阻害することができ、かつ癌細胞にアポトーシスを誘導することができることは詳細に確立されており、この証拠に基づいて、シグマ−１拮抗薬のようなシグマ受容体リガンドは癌の治療に有用であることが立証されると思われる。
【００１２】
シグマ受容体リガンドは、抗炎症作用を有することも報告されている。例えば、Bourrie et al., Eur. J. Pharmacol, (2002), 456(1-3):123-31には、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ化合物ＳＳＲ１２５３２９Ａ（化学名：［（Ｚ）−３−（４−アダマンタン−２−イル−３，５−ジクロロ−フェニル）−アリル］−シクロヘキシル−エチルアミン）は強力な抗炎症特性を有する高親和性のシグマ受容体リガンドであることを報告されている。Ｂｏｕｒｒｉｅらは、彼らの研究結果が、シグマ受容体リガンドが関節リウマチ治療の新たな効果的方法となり得ることの実質的な証拠を提供していると結論している。
【００１３】
もう一つのＳａｎｏｆｉシグマ受容体拮抗薬（ＳＲ３１７４７）は、現在関節リウマチの治療のための臨床試験中である。
【００１４】
テトラベナジン（化学名： １，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−３−（２−メチルプロピル）−２Ｈ−ベンゾ（ａ）キノリジン−２−オン）が、１９５０年代後期から医薬品として用いられてきている。テトラベナジンは、当初は抗精神病薬として開発されたが、現在ではハンチントン病、片側バリスム、老人性舞踏病、チック、遅発性ジスキネジーおよびツレット症候群のような多動運動障害の対症療法に用いられている。例えば、Jankovic et al., Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8): 1279-81およびJankovic et al, Neurology (1997) Feb; 48(2):358-62を参照されたい。
【００１５】
テトラベナジンの化学構造は、下図１に示される通りである。
【化１】
図１ テトラベナジンの構造
【００１６】
この化合物は３および１１ｂ位の炭素原子にキラル中心を有しており、従って、理論上、図２に示されるように総数で４個の異性体形態を示すことができる。
【化２】
図２ 可能なテトラベナジン異性体
【００１７】
図２では、それぞれの異性体の立体化学はCahn, Ingold and Prelogによって開発された「ＲおよびＳ」命名法を用いて定義されている。「Jerry Marchの最新有機化学（Advanced Organic Chemistry by Jerry March）」， 第４版， John Wiley & Sons, ニューヨーク， 1992年， 109-114頁を参照されたい。図２および本特許出願明細書の他の箇所において、「Ｒ」または「Ｓ」という名称は炭素原子の位置番号の順に付けられている。従って、例えばＲＳは３Ｒ，１１ｂＳの省略表記である。同様に、下記のジヒドロテトラベナジンのように３個のキラル中心が存在するときには、「Ｒ」または「Ｓ」という名称が炭素原子２、３および１１ｂの順に付けられる。従って、２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体は、略記形態ではＳＲＲなどと呼ばれる。
【００１８】
市販のテトラベナジンはＲＲおよびＳＳ異性体の異性体混合物であり、ＲＲおよびＳＳ異性体（３および１１ｂ位の水素原子がトランス相対配向を有するので、以後個別的にまたは集合的にトランス−テトラベナジンと呼ぶ）が最も熱力学的に安定な異性体と思われる。
【００１９】
テトラベナジンは、バイオアベイラビリティーが幾分乏しくかつ変化しやすい。これは初回通過代謝によって完全に代謝され、未変化テトラベナジンは典型的には尿中にほとんどまたは全く検出されない。主要代謝産物はテトラベナジンの２−ケト基の還元によって形成されるジヒドロテトラベナジン（化学名： ２−ヒドロキシ−３−（２−メチルプロピル）−１，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−ベンゾ（ａ）キノリジン）であり、この薬剤の活性に主として関与していると考えられる（Mehvar et al , Drug Metab. Disp, 15, 250-255 (1987)およびJ. Pharm. Sci., 76, No.6, 461-465 (1987)を参照されたい）。
【００２０】
４個のジヒドロテトラベナジン異性体は以前に同定され、特性決定されており、それらの総ては親テトラベナジンの更に安定なＲＲおよびＳＳ異性体から誘導され、３および１１ｂ位の水素原子がトランス相対配向である（Kilbourn et al,Chirality, 9:59-62 (1997)およびBrossi et al, Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)を参照されたい）。４個の異性体は（＋）−α−ジヒドロテトラベナジン、（−）−α−ジヒドロテトラベナジン、（＋）−β−ジヒドロテトラベナジンおよび（−）−β−ジヒドロテトラベナジンである。４種類の既知のジヒドロテトラベナジン異性体の構造は、図３に示される通りであると考えられる。
【化３】
図３ ジヒドロテトラベナジンの既知異性体の構造
【００２１】
Ｋｉｌｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（Eur. J. Pharmacol, 278:249-252 (1995)およびMed. Chem. Res., 5:113-126 (1994)参照）は、意識のあるラット脳における個々の放射能標識したジヒドロテトラベナジン異性体の特異的な結合を検討した。彼らは、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン（２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＲ）異性体がニューロン膜ドパミン輸送体（ＤＡＴ）および小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）が一層高濃度であることと関連した脳の領域に蓄積されることを見出した。しかしながら、本質的に不活性な（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体は脳にほぼ均一に分布し、ＤＡＴおよびＶＭＡＴ２への特異的な結合が起こっていないことを示唆した。イン・ビボ研究はイン・ビトロ研究と相関し、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体は、（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体のＫｉより＞２０００倍高い［３Ｈ］メトキシテトラベナジンのｋｉを示すことを明らかにした。
【００２２】
本発明者らの先の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４６４号明細書には、テトラベナジンの不安定なＲＳおよびＳＲ異性体（３および１１ｂ位の水素原子はシス相対配向を有するので、以後個別的または集合的にシス−テトラベナジンと呼ぶ）から誘導される薬学用ジヒドロテトラベナジン異性体の調製および使用が開示されている。ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４６４号には、シス−ジヒドロテトラベナジン異性体がシグマ−１およびシグマ−２受容体に結合することを示す実験データーが含まれているが、シグマ受容体の結合活性を用いる治療的用途は開示されていない。
【００２３】
発明の概要
本発明は、本発明者らの先の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４６４号に記載のシス−ジヒドロテトラベナジンの炎症性疾患および癌の治療における使用に関する。
【００２４】
従って、第一の態様では、本発明は、増殖性疾患または炎症性疾患の予防または治療に用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００２５】
１つの具体的態様では、増殖性疾患は癌である。
【００２６】
従って、本発明は、癌などの増殖性疾患の予防または治療に用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００２７】
本発明は、また、以下のものを提供する：
・癌などの増殖性疾患の治療のための医薬を製造するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・異常細胞増殖から生じる疾患状態または症状（例えば、癌）の予防または治療のための医薬を製造するためのシス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の治療方法であって、哺乳類に治療上有効量のシス−ジヒドロテトラベナジンの投与を含んでなる方法。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の治療方法であって、哺乳類に異常細胞増殖を阻害するのに有効な量のシス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる方法。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の発病率を緩和または減少する方法であって、哺乳類に異常細胞増殖を阻害するのに有効な量のシス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる方法。
【００２８】
本発明の化合物は、
腺腫、
癌腫、
白血病、
リンパ腫、
黒色腫、
肉腫、および
奇形腫
から選択される任意の１以上の癌の治療または予防に有用であると考えられる。
【００２９】
阻害または治療することができる癌の具体例としては、癌腫、例えば、膀胱、乳房、結腸（例えば、結腸腺癌および結腸腺腫のような結腸直腸癌腫）、腎臓、表皮、肝臓、肺、例えば、腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、例えば、膵外分泌癌、胃、頸部、甲状腺、前立腺、または皮膚、例えば、扁平上皮癌；リンパ系の造血腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫、またはバーキットリンパ腫；骨髄系の造血腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または前骨髄性白血病；甲状腺小胞性癌；間葉起源の腫瘍、例えば、繊維肉腫または横紋筋肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、または神経鞘腫；黒色腫；精上皮腫；奇形癌；骨肉腫；キセノデローマ・ピグメントスム（ｘｅｎｏｄｅｒｏｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）；ケラトクタントーマ（ｋｅｒａｔｏｃｔａｎｔｈｏｍａ）；甲状腺小胞性癌；またはカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
更に詳細には、シス−ジヒドロテトラベナジンの使用によって治療または阻害することができる癌は、シグマ受容体リガンド、例えばσ−１拮抗薬に感受性の癌である。
【００３１】
シス−ジヒドロテトラベナジンの使用によって治療または阻害することができる癌の他の例は、シグマ受容体が過剰発現する癌である。
【００３２】
１つの具体的態様では、癌は乳癌である。
【００３３】
もう一つの具体的態様では、癌は前立腺腫瘍、例えば正常位前立腺腫瘍である。
【００３４】
更にもう一つの具体的態様では、癌は肺癌である。
【００３５】
もう一つの一般的態様では、本発明は、炎症性疾患の治療に使用するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００３６】
本発明は、また、以下のものを提供する：
・炎症性疾患の予防または治療のための医薬を製造するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・患者（例えば、ヒトなどの哺乳類）の炎症性疾患または症状の予防または治療方法であって、哺乳類に治療上有効量の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる、方法。
【００３７】
炎症性疾患および症状の例としては、関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風性関節炎、風疹関節炎、乾癬性関節炎、および他の関節炎症状；内毒素または炎症性腸疾患によって誘発される炎症性反応のような急性または慢性炎症性疾患状態；ライター症候群、痛風、リウマチ様脊椎炎、慢性肺炎症性疾患，クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
特定の炎症性疾患および症状は、シグマ受容体リガンド、例えば、シグマ受容体拮抗薬に感受性のものである。
【００３９】
１つの特定の炎症性疾患は、関節リウマチである。
【００４０】
本発明で用いられるシス−ジヒドロテトラベナジンは、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンである。
【００４１】
本発明で用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンは、実質的に純粋な形態、例えば異性体純度が９０％を上回り、典型的には９５％を上回り、更に好ましくは９８％を上回ることがある。
【００４２】
本発明における「異性体純度」という用語は、ジヒドロテトラベナジンの総ての異性体形態の総量または濃度に対して存在する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの量を意味する。例えば、組成物中に含まれる総ジヒドロテトラベナジンの９０％が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンであれば、異性体純度は９０％である。
【００４３】
本発明で用いられる１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンは、３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを実質的に含まない、好ましくは５％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、更に好ましくは３％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、最も好ましくは１％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを含む組成物の形態であることができる。
【００４４】
本明細書で用いられる「３，１１ｂ−シス」という用語は、ジヒドロテトラベナジン構造の３−および１１ｂ−位の水素原子がシス相対配向であることを意味している。従って、本発明の異性体は、式（Ｉ）の化合物およびその対掌体（鏡像）である。
【化４】
【００４５】
３，１１ｂ−シス配置を有するジヒドロテトラベナジンには４個の異性体の可能性があり、これらは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体、２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体および２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体である。これら４個の異性体は単離されて特性決定されており、もう一つの態様では、本発明は３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの個々の異性体を提供する。詳細には、本発明は、
（ａ） 式（Ｉａ）
【化５】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、
（ｂ） 式（Ｉｂ）
【化６】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体、
（ｃ） 式（Ｉｃ）
【化７】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、および
（ｄ） 式（Ｉｄ）
【化８】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体
を提供する。
【００４６】
本発明の個々の異性体は、それらの分光学的、光学的およびクロマトグラフィー特性によって、またＸ線結晶学によって決定されるそれらの絶対立体化学配置によっても特性決定することができる。
【００４７】
何ら特定の絶対配置または立体化学を含むことなく、４種類の新規異性体は下記のように特性決定することができる。
【００４８】
異性体Ａ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 左旋性（−）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載した通り。
【００４９】
異性体Ｂ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 右旋性（＋）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載した通りであり、およびＸ線結晶学的特性は実施例４に記載した通り。
【００５０】
異性体Ｃ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 右旋性（＋）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載した通り。
【００５１】
異性体Ｄ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 左旋性（−）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載した通り。
【００５２】
それぞれの異性体についてのＯＲＤ値は下記の実施例に示されているが、それらの値は例として挙げられており、異性体の純度や温度変動および残留溶媒分子の影響のような他の変量の影響によって変化することがあることが注目される。
【００５３】
鏡像異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ実質的に鏡像異性体的に純粋な形態でまたは本発明の他の鏡像異性体との混合物として存在することができる。
【００５４】
本発明に関連して「鏡像異性体純度」および「鏡像異性体的に純粋な」という用語は、ジヒドロテトラベナジンの総ての鏡像異性体および異性体の形態の総量または濃度に対して存在する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの所定の鏡像異性体の量を意味する。例えば、組成物に含まれる総ジヒドロテトラベナジンの９０％が単一の鏡像異性体の形態であるときには、この鏡像異性体の純度は９０％である。
【００５５】
一例として、本発明のそれぞれの態様および実施態様では、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤから選択される個々の鏡像異性体は、少なくとも５５％（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％）の鏡像異性体純度で存在することができる。
【００５６】
本発明の異性体は、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの１以上の混合物の形態で存在することもできる。このような混合物は、ラセミ混合物または非ラセミ混合物であってもよい。ラセミ混合物の例としては、異性体Ａと異性体Ｂのラセミ混合物および異性体Ｃと異性体Ｄのラセミ混合物が挙げられる。
【００５７】
薬学上許容可能な塩
特に断らない限り、本出願明細書におけるジヒドロテトラベナジンおよびその異性体という表現は、その範囲内にジヒドロテトラベナジンの遊離塩基だけでなくその塩、詳細には酸付加塩も包含する。
【００５８】
酸付加塩が形成される特定の酸としては、ｐＫａ値が３．５未満、更に通常は３未満である酸が挙げられる。例えば、酸付加塩は、ｐＫａが＋３．５〜−３．５の範囲である酸から形成することができる。
【００５９】
好ましい酸付加塩としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸およびナフタレンスルホン酸等のスルホン酸を用いて形成されるものが挙げられる。
【００６０】
酸付加塩を形成することができる１つの特定の酸は、メタンスルホン酸である。
【００６１】
酸付加塩は、本明細書に記載の方法または「医薬品塩： 特性、選択および使用（Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use)」, P. Heinrich Stahl （編集者）， Camille G. Wermuth （編集者）， ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388頁, 2002年8月に記載されているような通常の化学的方法によって調製することができる。一般的には、このような塩は、この化合物の遊離塩基形態を適当な塩基または酸と水中または有機溶媒中で、またはこれら２種類の混合物中で反応させることによって調製することができ、一般的にはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリル等の非水溶媒が用いられる。
【００６２】
これらの塩は、典型的には薬学上許容可能な塩である。しかしながら、薬学上許容可能でない塩を中間形態として調製し、次いでこれを薬学上許容可能な塩に転換することもできる。このような薬学上許容可能でない塩形態も、本発明の一部を形成する。
【００６３】
ジヒドロテトラベナジン異性体の調製方法
本発明のジヒドロテトラベナジンは、式（ＩＩ）
【化９】
の化合物を、式（ＩＩ）の化合物における２，３−二重結合の水和に適している試薬または試薬類と反応させた後、必要ならば所望のジヒドロテトラベナジン異性体形態を分離して単離することを含んでなる方法によって調製することができる。
【００６４】
２，３−二重結合の水和は、ジボランまたはボラン−エーテル（例えば、ボラン−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））のようなボラン試薬を用いるヒドロホウ素化によって中間体アルキルボラン付加物を得た後、アルキルボラン付加物の酸化および塩基の存在下での加水分解によって行うことができる。ヒドロホウ素化は、典型的にはエーテル（例えば、ＴＨＦ）のような乾燥した極性の非プロトン性溶媒中で非高温、例えば室温で行われる。ボラン−アルケン付加物は、典型的には水酸化アンモニウムまたはアルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムのような水酸化物イオンの供給源を提供する塩基の存在下にて過酸化水素のような酸化剤で酸化される。方法Ａの反応をヒドロホウ素化−酸化−加水分解の順序で行うことによって、典型的には２−および３−位の水素原子がトランス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体が得られる。
【００６５】
式（ＩＩ）の化合物は、テトラベナジンを還元してジヒドロテトラベナジンを得た後、このジヒドロテトラベナジンの脱水によって調製することができる。テトラベナジンの還元は、水素化アルミニウムリチウムのような水素化アルミニウム試薬、または水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムまたは水素化ホウ素誘導体、例えばトリ第二ブチル水素化ホウ素リチウムのようなアルキル水素化ホウ素などの水素化ホウ素試薬を用いて行うことができる。あるいは、還元工程を、例えばラネーニッケルまたは酸化白金触媒上での接触水素化を用いて行うことができる。還元工程を行うのに適する条件は、下記に更に詳細に説明しており、または米国特許第２，８４３，５９１号明細書（Hoffmann-La Roche）およびBrossi et al, Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, ppl793-1806 (1958)に見出すことができる。
【００６６】
還元反応の出発材料として用いられるテトラベナジンは、典型的にはＲＲとＳＳ異性体の混合物（すなわち、トランス−テトラベナジン）であるので、還元工程によって形成されたジヒドロテトラベナジンは３および１１ｂ位について同じトランス配置を有し、上記図３に示されている既知のジヒドロテトラベナジン異性体の１以上の形態をとる。従って、方法Ａは、ジヒドロテトラベナジンの既知異性体をとり、それらを脱水してアルケン（ＩＩ）を形成した後、本発明の求める新規なシスジヒドロテトラベナジン異性体を生じる条件を用いてアルケン（ＩＩ）を「再水和する」ことを含むことがある。
【００６７】
ジヒドロテトラベナジンのアルケン（ＩＩ）への脱水は、アルコールを脱水してアルケンを形成するための様々な標準的条件を用いて行うことができ、例えばＪ． Ｍａｒｃｈ （上記引用）， ３８９−３９０頁およびそこに引用されている文献を参照されたい。このような条件の例としては、ハロゲン化リンまたはオキシハロゲン化リンのようなリンを基剤とする脱水剤、例えばＰＯＣｌ３およびＰＣｌ５の使用が挙げられる。直接脱水法に代わるものとしては、ジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をハロゲン（例えば、塩素または臭素）のような脱離基Ｌに転換した後、Ｈ−Ｌを除去するための条件（例えば、塩基の存在）に付することができる。ヒドロキシル基のハロゲン化物への転換は、熟練化学者には周知の方法を用いて、例えばトリフェニルホスフィンまたはトリブチルホスフィンのようなトリアルキルまたはトリアリールホスフィンの存在下で四塩化炭素または四臭化炭素と反応させることによって行うことができる。
【００６８】
ジヒドロテトラベナジンを得る還元のための出発材料として用いられるテトラベナジンは、商業的に得ることができ、または米国特許第２，８３０，９９３号（Hoffmann-La Roche）に記載の方法によって合成することができる。
【００６９】
本発明のジヒドロテトラベナジンを調製するためのもう一つの方法（方法Ｂ）は、式（ＩＩＩ）
【化１０】
の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物における２，３−エポキシド基を開環する条件に付した後、必要ならば所望のジヒドロテトラベナジン異性体形態を分離して単離することを含んでなる。
【００７０】
開環は、エポキシド開環の既知の方法によって行うことができる。しかしながら、エポキシドの開環の現在好ましい方法は、ボラン−ＴＨＦのような還元剤を用いて行うことができる還元的開環である。ボラン−ＴＨＦとの反応は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）のような極性の非プロトン性溶媒中で通常は周囲温度で行い、このようにして生成したボラン複合体を次に水と塩基の存在下にて溶媒の還流温度で加熱することによって加水分解することができる。方法Ｂは、典型的には２−および３−位の水素原子がシス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体を生じさせる。
【００７１】
式（ＩＩＩ）のエポキシド化合物は、上記式（ＩＩ）のアルケンエポキシ化によって調製することができる。エポキシ化反応は、熟練化学者には周知の条件および試薬を用いて行うことができ、例えばJ. March （上記引用）， 826-829頁およびそこに引用されている文献を参照されたい。典型的には、メタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）のような過酸または過酸と過塩素酸のような別の酸化剤との混合物を用いて、エポキシ化を行うことができる。
【００７２】
上記方法ＡおよびＢの出発材料が鏡像異性体の混合物であるときには、これらの方法の生成物は典型的には鏡像異性体の対、例えば、可能であれば、ジアステレオ異性体不純物とのラセミ混合物となる。好ましくないジアステレオ異性体はクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）のような手法によって除去することができ、個々の鏡像異性体は熟練化学者に知られている様々な方法によって分離することができる。例えば、それらは
（ｉ） キラルクロマトグラフィー（キラル支持体上でのクロマトグラフィー）、または
（ｉｉ） 光学的に純粋なキラル酸と塩を形成し、２種類のジアステレオ異性体の塩を分別結晶によって分離した後、その塩からジヒドロテトラベナジンを放出すること、または
（ｉｉｉ） 光学的に純粋なキラル誘導剤（例えば、エステル化剤）を用いて誘導体（例えば、エステル）を形成し、生成されるエピマーを（例えば、クロマトグラフィーによって）分離した後、この誘導体をジヒドロテトラベナジンに転換すること
によって分離することができる。
【００７３】
方法ＡおよびＢのそれぞれから得られる鏡像異性体の対を分離する１つの方法であって、特に有効であることが見出された方法は、ジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をモッシャーの酸（Ｍｏｓｈｅｒ’ｓ ａｃｉｄ）の光学活性形態、例えば下記に示されるＲ（＋）異性体
【化１１】
またはその活性形態でエステル化することである。
【００７４】
ジヒドロベナジンの２つの鏡像異性体の生成されるエステルはクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって分離することができ、分離したエステルをメタノールのような極性溶媒中でアルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ）のような塩基を用いて加水分解して個々のジヒドロベナジン異性体を得ることができる。
【００７５】
方法ＡおよびＢにおいて出発材料として鏡像異性体の混合物を用いた後、続いて鏡像異性体を分離する方法の代替法として、方法ＡおよびＢをそれぞれ単一の鏡像異性体出発材料について行うことで単一鏡像異性体が優勢である生成物を生じることができる。アルケン（ＩＩ）の単一鏡像異性体は、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンにトリ第二ブチル水素化ホウ素リチウムを用いて立体選択的還元を行ってジヒドロテトラベナジンのＳＲＲおよびＲＳＳ鏡像異性体の混合物を得て、鏡像異性体を（例えば、分別結晶によって）分離した後、ジヒドロテトラベナジンの分離した単一鏡像異性体を脱水し、式（ＩＩ）の化合物の単一鏡像異性体を優勢にまたは独占的に得ることによって調製することができる。
【００７６】
方法ＡおよびＢを、それぞれスキーム１および２で更に詳細に説明する。
【化１２】
【００７７】
スキーム１は、２−および３−位に結合している水素原子がトランス相対配向で配列されている２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の調製を示す。この反応スキームは、上記で定義した工程Ａを包含する。
【００７８】
スキーム１における反応の順序についての出発点は、テトラベナジンのＲＲおよびＳＳ光学異性体のラセミ混合物である市販のテトラベナジン（ＩＶ）である。ＲＲおよびＳＳ異性体のそれぞれにおいて、３−および１１ｂ−位の水素原子はトランス相対配向に配列されている。市販の化合物を用いる代わりに、テトラベナジンを米国特許第２，８３０，９９３号に記載の手順に従って合成することができる（詳細には、実施例１１を参照）。
【００７９】
ＲＲおよびＳＳテトラベナジンのラセミ混合物を水素化ホウ素還元剤トリ第二ブチル水素化ホウ素リチウム（「Ｌ−セレクトリド」）を用いて還元すると、ジヒドロテトラベナジンの既知の２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体（Ｖ）の混合物が得られるが、便宜上２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体のみが示されている。水素化ホウ素ナトリウムよりも立体的要求の厳しいＬ−セレクトリドを水素化ホウ素還元剤として用いることによって、ジヒドロテトラベナジンのＲＲＲおよびＳＳＳ異性体の形成は最小限になるかまたは抑制される。
【００８０】
ジヒドロテトラベナジン異性体（Ｖ）を、塩素化炭化水素（例えば、クロロホルムまたはジクロロメタン、好ましくはジクロロメタン）のような非プロトン性溶媒中で五塩化リンのような脱水剤と反応させて、不飽和化合物（ＩＩ）を鏡像異性体の対として形成させるが、スキームにはそのＲ−鏡像異性体のみが示されている。脱水反応は、典型的には室温より低い温度、例えば約０−５℃で行われる。
【００８１】
次に、不飽和化合物（ＩＩ）を立体選択的再水和に供し、ジヒドロテトラベナジン（ＶＩ）およびその鏡像または対掌体（図示せず）であって、３−および１１ｂ−位の水素原子がシス相対配向に配列されており、かつ２−および３−位の水素原子がトランス相対配向に配列されているものを生成する。立体選択的再水和は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でボラン−ＴＨＦを用いるヒドロホウ素化手順によって行って中間体ボラン複合体（図示せず）を形成させた後、水酸化ナトリウムのような塩基の存在下にて過酸化水素で酸化する。
【００８２】
次に、最初の精製工程を（例えば、ＨＰＬＣによって）行って、再水和反応順序の生成物（Ｖ）を２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得ることができるが、工程図には２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体のみが示されている。異性体を分離するため、混合物をジクロロメタン中で塩化オキサリルおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下でＲ（＋）モッシャーの酸で処理して、ジアステレオ異性体エステル（ＶＩＩ）の対（１個のジアステレオ異性体のみが示されている）を得て、これを次にＨＰＬＣを用いて分離することができる。次いで、個々のエステルを水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解して、単一異性体（ＶＩ）を得ることができる。
【００８３】
スキーム１に示されている工程の順序の変形では、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元の後に生成するジヒドロテトラベナジン（Ｖ）の鏡像異性体の混合物を分離して、個々の鏡像異性体を得ることができる。分離は、（＋）または（−）カンファースルホン酸のようなキラル酸で塩を形成し、生成されたジアステレオ異性体を分別結晶によって分離し、単一鏡像異性体の塩を得た後、その塩から遊離塩基を取り出すことによって行うことができる。
【００８４】
分離したジヒドロテトラベナジン鏡像異性体を脱水して、アルケン（ＩＩ）の単一鏡像異性体を得ることができる。次いで、アルケン（ＩＩ）の再水和により、シス−ジヒドロテトラベナジン（ＶＩ）の単一鏡像異性体が優勢にまたは独占的に得られる。この変形の利点は、モッシャーの酸のエステルの形成を含まないので、モッシャーの酸のエステルを分離するのに典型的に用いられるクロマトグラフィー分離を行う必要がないことである。
【００８５】
スキーム２は、２−および３−位に結合した水素原子がシス相対配向で配列されている２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の調製を示している。この反応スキームは、上記で定義した工程Ｂを含む。
【化１３】
【００８６】
スキーム２において、不飽和化合物（ＩＩ）をテトラベナジンを還元して生成させてジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体（Ｖ）を得て、スキーム１に上記した方法でＰＣｌ５を用いて脱水する。しかしながら、化合物（ＩＩ）をヒドロホウ素化に供す代わりに、２，３−二重結合をメタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）と過塩素酸と反応させることによってエポキシドに転換する。エポキシ化反応は、メタノールのようなアルコール溶媒中で、典型的には室温附近で好都合に行われる。
【００８７】
次に、エポキシド（ＶＩＩ）に、ボラン−ＴＨＦを親電子性還元剤として用いて還元的開環を行って中間体ボラン複合体（図示せず）を得て、これを次に水酸化ナトリウムのようなアルカリの存在下にて過酸化水素で酸化して開裂させ、ジヒドロテトラベナジン（ＶＩＩＩ）を２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得ることができるが、便宜上２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲのみが示されている。異性体（ＶＩＩＩ）の混合物をジクロロメタン中で塩化オキサリルとジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下にてＲ（＋）モッシャーの酸で処理すると、エピマーエステル（ＩＸ）の対（スキームには、１つのエピマーのみが示されている）が得られ、これを次にクロマトグラフィーによって分離し、スキーム１に関して上記した方法でメタノール中にて水酸化ナトリウムで加水分解することができる。
【００８８】
生物学的活性
本発明のシス−ジヒドロテトラベナジン化合物は、下記の実施例に例示されているように、シグマ−１およびシグマ−２受容体のいずれにも結合する。シス−ジヒドロテトラベナジンの４個の異性体は、シグマ−２に対するリガンドとしてほぼ等しい能力を有するが、異性体ＢとＤは異性体ＡおよびＣよりも強くシグマ−１受容体に結合する。
【００８９】
本発明のシス−ジヒドロテトラベナジン化合物は、そのシグマ受容体結合活性により、腫瘍細胞の増殖の阻害または予防に有用であると考えられる。
【００９０】
化合物が腫瘍細胞の増殖を阻害しまたは防止する能力は、例えば下記の実施例６に記載の方法でまたはSpruce et al., Cancer Research, (2004), 64:4875-4886に記載の方法を用いて、化合物を様々な腫瘍細胞系に対して試験することによって測定することができる。
【００９１】
細胞系に対するイン・ビトロでの検討に加えて、本発明の化合物は、免疫不全のマウスでのヒト腫瘍キセノグラフで、例えば、Spruce et al., (2004), p. 487で記載されているようにイン・ビボで試験することもできる。
【００９２】
本発明の化合物は、抗炎症薬としての活性を有するとも考えられる。化合物の抗炎症活性は、熟練者に周知の様々な方法を用いて試験することができる。
【００９３】
本発明の化合物の関節炎を治療する能力は、下記の検定法およびモデルの任意の１つ以上で明らかにすることができる：
（ｉ） Kakimoto et al., Cell Immunol. 142: 326-337, 1992に記載のネズミコラーゲン誘導関節炎モデル。
（ｉｉ） Knoerzer et al., Toxicol. Pathol. 25:13-19, 1997に記載のラットコラーゲン誘導関節炎モデル。
（ｉｉｉ） Halloran et al., Arthritis Rheum. 39:810-819, 1996に記載のラットアジュバント関節炎モデル。
（ｉｖ） Schimmer, et al., J. Immunol. 160: 1466-1477, 1998に記載のラット連鎖球菌細胞壁誘導関節炎モデル。
（ｖ） Oppenheimer-Marks et al., J. Clin. Invest. 101:1261-1272, 1998に記載のＳＣＩＤマウスヒト関節リウマチモデル。
【００９４】
本発明の化合物が炎症性肺損傷を治療する能力は、下記の分析法および検定モデルによって明らかにすることができる：
（ｖｉ） Wegner et al., Lung 170:267-279, 1992に記載のネズミ酸素誘導肺損傷モデル。
（ｖｉｉ） Mulligan et al., J. Immunol. 154:1350-1363, 1995に記載のネズミ免疫複合体誘導肺損傷モデル。
（ｖｉｉｉ） Nagase et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:504-510, 1996に記載のネズミ酸誘導肺損傷モデル。
【００９５】
本発明の化合物の炎症性腸疾患を治療する能力は、Bennet et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:988-1000, 1997に記載のウサギ化学誘導大腸炎モデルで明らかにすることができる。
【００９６】
本発明の化合物の炎症性肝臓損傷を治療する能力は、Tanaka et al., J. Immunol. 151:5088-5095, 1993に記載のネズミ肝臓損傷モデルで明らかにすることができる。
【００９７】
本発明の化合物の炎症性糸球体損傷を治療する能力は、Kawasaki, et al., J. Immunol 150:1074-1083, 1993に記載のラット腎毒性血清腎炎モデルで明らかにすることができる。
【００９８】
本発明の化合物の抗炎症活性は、下記の実施例に記載されているように炎症促進性サイトカインの産生を減少させ、かつＴ−細胞増殖を阻害する能力によっても示される。
【００９９】
医薬処方物
ジヒドロテトラベナジン化合物は、典型的には医薬組成物の形態で投与される。
【０１００】
医薬組成物は、経口、非経口、局所、鼻内、気管支内、眼、耳、直腸、膣内、または経皮投与に適する任意の形態とすることができる。組成物を非経口投与使用とする場合には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与用に、または注射、輸液または他の送達手段によって標的器官または組織へ直接送達する目的で処方することができる。
【０１０１】
経口投与に適する医薬の剤形としては、錠剤、カプセル、キャブレッツ、ピル、ロゼンジ、シロップ、溶液、スプレー、散剤、顆粒、エリキシルおよび懸濁液、舌下錠、スプレー、カシェ剤、またはパッチおよびバッカルパッチが挙げられる。
【０１０２】
本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を含有する医薬組成物は、既知手法によって処方することができ、例えば「レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， イーストン， ペンシルバニア， 米国を参照されたい。
【０１０３】
例えば、錠剤組成物は、単位投薬量の活性化合物を、糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、スクロース、ソルビトールまたはマンニトールのような不活性希釈剤またはキャリヤー、および／または炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、タルク、炭酸カルシウムのような糖以外から誘導した希釈剤、またはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トウモロコシ澱粉のような澱粉などのセルロースまたはその誘導体と共に含むことができる。錠剤は、ポリビニルピロリドンのような結合および造粒剤、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチルセルロースのような膨潤性の架橋ポリマー）、滑沢剤（例えば、ステアレート）、防腐剤（例えば、パラベン）、酸化防止剤（例えば、ＢＨＴ）、緩衝剤（例えば、リン酸またはクエン酸緩衝剤）、クエン酸／重炭酸塩混合物のような起泡剤などの標準的成分を含むこともできる。このような賦形剤は周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。
【０１０４】
カプセル処方物は硬質ゼラチンまたは軟質ゼラチンの種類であることがあり、活性成分を固体、半固体または液体形態で含むことができる。ゼラチンカプセルは、動物ゼラチンまたはその合成または植物由来の同等なものから形成することができる。
【０１０５】
固体剤形（例えば、錠剤、カプセルなど）はコーティングを行ってもよく、またはコーティングを行わなくてもよいが、典型的にはコーティング、例えば保護フィルムコーティング（例えば、ワックスまたはワニス）または放出制御コーティングを有する。コーティング（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）型ポリマー）は、消化管内の所望な部位で活性成分を放出するようにデザインすることができる。従って、コーティングは、消化管内の一定のｐＨ条件下で崩壊させることによって化合物を胃、または回腸、または十二指腸に選択的に放出するように選択することができる。
【０１０６】
コーティングの代わりに、または加えて、薬剤は、放出制御剤、例えば消化管での変化する酸性またはアルカリ性の条件下で化合物を選択的に放出するのに適合させることができる放出遅延剤、を含んでなる固体マトリックスで提示することができる。あるいは、マトリックス材料または放出遅延コーティングは、剤形が消化管を通過するときに実質的に連続的に侵食される侵食性ポリマー（例えば、無水マレイン酸ポリマー）の形態をとることができる。
【０１０７】
局所使用の組成物としては、軟膏、クリーム、スプレー、パッチ、ゲル、液滴およびインサート（例えば、眼内インサート）が挙げられる。このような組成物は、既知の方法によって処方することができる。
【０１０８】
非経口投与用の組成物は、典型的には滅菌水性または油性溶液または微細懸濁液として提示され、または注射用滅菌水でその場で作製するための細かく分割された滅菌粉末形態で提供することができる。
【０１０９】
直腸または膣内投与用の処方物の例としては、例えば、活性化合物を含む成形可能なまたはワキシー材料から形成することができる膣座薬または座薬が挙げられる。
【０１１０】
吸入投与用の組成物は、吸入可能な粉末組成物または液体もしくは粉末スプレーの形態をとることができ、粉末吸入装置またはエアゾール調剤装置を用いて標準的形態で投与することができる。このような装置は周知である。吸入による投与には、粉末化処方物は、典型的には活性化合物をラクトースのような不活性固体の粉末化希釈剤と共に含んでなる。
【０１１１】
本発明の化合物は一般的には単位剤形で提示され、それ自体は所望なレベルの生物学的活性を提供するのに十分な化合物を含む。例えば、経口投与を目的とする処方物は、活性成分を２ｍｇ〜２００ｍｇ、より普通には１０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば１２．５ｍｇ、２５ｍｇおよび５０ｍｇ含むことができる。
【０１１２】
活性化合物は、それを必要とする患者（例えば、ヒトまたは動物患者）に所望な治療効果を得るのに十分な量で投与される。
【０１１３】
このような投与を必要としている人は、典型的には、上記で定義した癌のような増殖性疾患または炎症性疾患に罹っているまたは罹る危険性のある患者である。
【０１１４】
化合物は、典型的には、治療上または予防上有用でありかつ通常は毒性のない量で投与される。しかしながら、状況によっては、特に癌治療の場合には、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を投与する利益は、如何なる毒性作用や副作用の不利益より重要であることがあり、このような場合には、毒性の程度と関連した量で化合物を投与するのが望ましいと考えることができる。
【０１１５】
化合物の典型的な一日用量は１０００ｍｇ／日以下、例えば、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、更に通常は０．０２５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、３ｍｇ／ｋｇ体重、更に典型的には０．１５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができるが、必要ならばこれより多いまたは少ない用量を投与することができる。
【０１１６】
癌の治療には、式（Ｉ）の化合物を単独の治療薬として投与することができ、またはそれらを特定の疾患状態、例えば上記で定義した癌、の治療用の１以上の他の化合物との組合せ療法で投与することができる。式（Ｉ）の化合物と共に（同時にまたは異なる時間間隔で）用いるまたは投与することができる他の治療薬および方法の例としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：
・トポイソメラーゼＩ阻害薬（例えば、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、イリノテカンおよびＣＰＴ１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）のようなカンプトテシン化合物）。
・代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、ゲンシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ラルチトレキシド（Ｔｏｍｕｄｅｘ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、ペメトレキシド（Ａｌｉｍｔａ）、シタラビンまたはシトシンアラビノシドまたはアラビノシルシトシン［ＡｒａＣ］（Ｃｙｔｏｓａｒ（登録商標））、メトトレキサート（Ｍａｔｒｅｘ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）、およびテガフールのような抗腫瘍ヌクレオシド）。
・チューブリンターゲッティング薬（例えば、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂｅ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）のようなビンカアルカロイド、ビンブラスチンおよびタキサン化合物）。
・ＤＮＡ結合薬およびトポＩＩ阻害薬（例えば、エトポシド（Ｅｐｏｓｉｎ， Ｅｔｏｐｈｏｓ， Ｖｅｐｅｓｉｄ， ＶＰ−１６）、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ， ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）、エピルビシン（Ｐｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎｅ， Ｄｏｘｉｌ， Ｒｕｂｅｘ）、イダルビシン（Ｚａｖｅｄｏｓ）、ペジル化リポソームドキソルビシン塩酸塩（Ｃａｅｙｌｘ）、リポソームカプセル化ドキソルビシンクエン酸塩（Ｍｙｏｃｅｔ）、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ， Ｏｎｋｏｔｒｏｎｅ）のようなポドフィロトキシン誘導体およびアントラサイクリン誘導体）。
・アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎａ）、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、イフォスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ Ｋｙｏｍａ）のような窒素マスタードまたはニトロソウレアアルキル化剤およびアジリジン）。
・アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）およびオキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）のような白金化合物）。
・モノクローナル抗体（例えば、ＥＧＦファミリーおよびその受容体、およびＶＥＧＦファミリーおよびその受容体、更に具体的にはトラスツヅマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）およびベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ））。
・抗ホルモン薬（例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ Ｄ， Ｓｏｌｔａｍｏｘ， Ｔａｍｏｆｅｎ）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、ドロロキシフェン、レトラゾール（Ｆｅｍａｒａ）、アナストラゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、ボロゾール（Ｒｉｖｉｚｏｒ）、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ， Ｃｏｓｕｄｅｘ）、ルプロリド（Ｚｏｌａｄｅｘ）、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）、アミノグルテチミド（Ｃｙｔａｄｒｅｎ）およびベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）のような抗エストロゲン薬（例えば、アロマターゼ阻害薬）などの抗アンドロゲン薬）。
・シグナル伝達阻害薬（ゲフチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）およびセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）など）。
・ボルテジミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）などのプロテアーゼ阻害薬。
・テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ。
・インターフェロンα（ＩｎｔｒｏｎＡ， Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）、インターロイキン２（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ， Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）および総てのトランスレチノイン酸［ＡＴＲＡ］またはトレチノイン（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）などのサイトカインおよびレチノイド。
・放射線療法。
【０１１７】
本発明の化合物を併用療法において他の治療薬または治療方法と共に投与する場合には、２以上の治療法を個々に種々の用量計画で、かつ異なる経路で行うことができる。
【０１１８】
本発明の化合物を併用療法において１以上の他の治療薬と共に投与する場合には、化合物を同時にまたは順次に投与することができる。順次に投与する場合には、間隔を狭めて（例えば、５〜１０分間以上）または長めの間隔で（例えば、１、２、３、４時間以上離して、または必要ならば更に長時間離して）投与することができるが、正確な投薬法は（複数の）治療薬の特性に対応する。
【０１１９】
本発明の化合物は、放射線療法、光ダイナミック療法、遺伝子療法、手術および食事管理のような化学療法以外の治療法と共に投与することもできる。
【０１２０】
別の化学療法薬と共に併用療法で用いるには、本発明の化合物と１、２、３、４種類以上の他の治療薬を、例えば２、３、４種類以上の治療薬を含む投薬形態で一緒に処方することができる。あるいは、個々の治療薬を別々に処方し、キットの形態で、場合によってはその使用説明書と共に提示することができる。
【０１２１】
実施例
下記の非制限的実施例により、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物の合成および特性を説明する。
【０１２２】
実施例１
ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ１１ｂＳ異性体の調製
１Ａ． ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元
【化１４】
テトラヒドロフラン中の１Ｍ Ｌ−セレクトリド（登録商標）（１３５ｍｌ，１３５ミリモル，２．８７当量）を、３０分間かけてテトラベナジンＲＲ／ＳＳラセミ体（１５ｇ，４７ミリモル）のエタノール（７５ｍｌ）とテトラヒドロフラン（７５ｍｌ）の攪拌溶液に０℃で徐々に加えた。添加を完了した後、混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで室温まで温度を上昇させた。
【０１２３】
混合物を粉砕氷（３００ｇ）上に空けて、水（１００ｍｌ）を加えた。溶液をジエチルエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出し、合わせたエーテル抽出物を水（１００ｍｌ）で洗浄し、無水炭酸カリウム上で部分乾燥した。無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥を完了し、濾過した後、溶媒を減圧留去し（遮光，槽温度＜２０℃）、淡黄色固形物を得た。
【０１２４】
固体を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にし、濾過して、白色粉末状固形物（１２ｇ，８０％）を得た。
【０１２５】
１Ｂ． 還元テトラベナジンの脱水
【化１５】
五塩化リン（３２．８ｇ，１５７．５ミリモル，２．５当量）を、３０分間かけて実施例１Ａからの還元テトラベナジン生成物（２０ｇ，６２．７ミリモル）のジクロロメタン（２００ｍｌ）の攪拌溶液に０℃で分割して加えた。添加を完了した後、反応混合物を０℃で更に３０分間攪拌し、溶液を粉砕氷を含む２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０℃）に徐々に空けた。初期の酸ガス発生が止んだら、混合物を固形炭酸ナトリウムを用いて塩基性（約ｐＨ１２）にした。
【０１２６】
アルカリ性溶液を酢酸エチル（８００ｍｌ）を用いて抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を減圧留去して褐色油状生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製し、半純粋アルケンを黄色固形物として得た（１０．８７ｇ，５８％）。
【０１２７】
１Ｃ． 実施例１Ｂからの粗アルケンの水和
【化１６】
実施例１Ｂからの粗アルケン（１０．８７ｇ，３６．１１ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（５２ｍｌ）に室温で溶解したものに、１Ｍボラン−ＴＨＦ（１５５．６ｍｌ，１５５．６ミリモル，４．３０当量）を滴加して処理した。反応を２時間攪拌し、水（２０ｍｌ）を加え、溶液を３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２の塩基性にした。
【０１２８】
３０％過酸化水素水溶液（３０ｍｌ）を攪拌アルカリ性反応混合物に加え、溶液を加熱して１時間還流した後、放冷した。水（１００ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（３ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去して黄色油状生成物（９ｇ）を得た。
【０１２９】
油状生成物を調製用ＨＰＬＣ（カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：エタノール：ジクロロメタン（８５：１５：５）；ＵＶ ２５４ｎｍ，流速：１０ｍｌ分−１）を用いて３５０ｍｇ／注入で精製した後、目的とする画分を真空濃縮した。生成された油状物を次にエーテルに溶解し、再度真空濃縮して、上記に示したジヒドロテトラベナジンラセミ体を黄色フォーム（５．７６ｇ，５０％）として得た。
【０１３０】
１Ｄ． モッシャーエステル誘導体の調製
【化１７】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（５ｇ，２１．３５ミリモル）、塩化オキサリル（２．０２ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１６ｍｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に加え、溶液を室温で４５分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を再度無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した。生成された溶液を氷−水槽を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．８３ｇ，３１．３４ミリモル）を加えた後、実施例１Ｃの固体生成物（５ｇ，１５．６ミリモル）を予備乾燥した（４Å篩上）無水ジクロロメタンに溶解したものを加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加え、混合物をエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、シリカのパッドを通し、生成物をエーテルを用いて溶出させた。
【０１３１】
集めたエーテル溶出物を減圧濃縮して油状生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１０：１））を用いて精製した。集めた目的のカラム画分を蒸発させて溶媒を減圧で留去したところ、固形物を得て、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：酢酸エチル（１：１））を用いて更に精製し、３つの主成分が得られ、これらを部分的にモッシャーエステルピーク１および２に分割した。
【０１３２】
３００ｍｇの装填量での３成分の調製用ＨＰＬＣ（カラム：２ｘＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９７：３），ＵＶ ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ分−１）の後、目的画分を真空濃縮したところ、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１ （３．８９ｇ，４６．５％）
ピーク２ （２．７８ｇ，３３％）
【０１３３】
２つのピークに対応する画分に加水分解を施し、異性体ＡおよびＢとして同定され特性決定された個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離した。異性体ＡおよびＢは、それぞれ下記の構造の１つを有すると思われる。
【化１８】
【０１３４】
更に具体的には、異性体Ｂは、下記の実施例４に記載のＸ線結晶学実験に基づいて２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ絶対配置を有すると思われる。
【０１３５】
１Ｅ． ピーク１の加水分解による異性体Ａの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（８７．５ｍｌ）をモッシャーのエステルピーク１（３．８９ｇ，７．２７ミリモル）をメタノール（２６０ｍｌ）に溶解したものに加え、混合物を攪拌加熱して１５０分間還流させた。室温まで冷却した後、水（２００ｍｌ）を加え、溶液をエーテル（６００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。
【０１３６】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解し、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮し、黄色フォームを得た。この材料を、カラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（１：１）−酢酸エチルの勾配溶出）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣をエーテルに溶解させ、溶媒を再度減圧留去し、異性体Ａを灰白色フォーム（１．１ｇ，４７％）として得た。
【０１３７】
２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有すると思われる（絶対立体化学は決定しなかった）異性体Ａを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＡのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表３に示す。
【０１３８】
１Ｆ． ピーク２の加水分解による異性体Ｂの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（６２．５ｍｌ）をモッシャーのエステルピーク２（２．７８ｇ，５．１９ミリモル）をメタノール（１８５ｍｌ）に溶解したものに加え、混合物を攪拌加熱して１５０分間還流させた。室温まで冷却した後、水（１４２ｍｌ）を加え、溶液をエーテル（４４０ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。
【０１３９】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解させ、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。石油エーテル（３０〜４０℃）を残渣に加え、溶液を再度真空濃縮し、異性体Ｂを白色フォーム（１．３４ｇ，８１％）として得た。
【０１４０】
２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ配置を有すると思われる異性体Ｂを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣ、ＯＲＤおよびＸ線結晶学によって特性決定した。異性体ＢのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータ表３に示す。Ｘ線結晶学データは、実施例４に示す。
【０１４１】
実施例２
ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の調製
２Ａ． ２，３−デヒドロテトラベナジンの調製
テトラヒドロフラン中にＲＲおよびＳＳテトラベナジン鏡像異性体のラセミ混合物（１５ｇ，４７ミリモル）を含む溶液を実施例１Ａの方法によってＬ−セレクトリド（登録商標）を用いて還元し、ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ鏡像異性体の混合物を白色粉末状固形物（１２ｇ，８０％）として得た。次に、部分精製したジヒドロテトラベナジンを実施例１Ｂの方法に従ってＰＣｌ５を用いて脱水し、２，３−デヒドロテトラベナジン１１ｂＲおよび１１ｂＳ異性体の半純粋混合物（その１１ｂＲ鏡像異性体を下記に示す）を黄色固形物（１２．９２ｇ，６８％）として得た。
【化１９】
【０１４２】
２Ｂ． 実施例２Ａからの粗アルケンのエポキシ化
【化２０】
実施例２Ａからの粗アルケン（１２，９２ｇ，４２．９ミリモル）をメタノール（２１５ｍｌ）に攪拌溶解したものに７０％過塩素酸（３．７０ｍｌ，４３ミリモル）をメタノール（２１５ｍｌ）に溶解したものに加えた。７７％ ３−クロロ過安息香酸（１５．５０ｇ，６５ミリモル）を反応に加え、生成された混合物を室温遮光下で１８時間攪拌した。
【０１４３】
反応混合物を飽和亜硫酸ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）に空けて、水（２００ｍｌ）を加えた。クロロホルム（３００ｍｌ）を生成エマルションに加え、混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）で塩基性にした。
【０１４４】
有機層を集めて、水相を追加のクロロホルム（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。合わせたクロロホルム層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去して、褐色油状物（１４．３５ｇ，収率＞１００％ 溶媒が生成物に残っていると思われる）を得た。この材料を、更に精製することなく用いた。
【０１４５】
２Ｃ． ２Ｂからのエポキシドの還元的開環
【化２１】
実施例２Ｂからの粗エポキシド（１４．３５ｇ，４２．９ミリモル，１００％収率と仮定）を乾燥ＴＨＦ（８０ｍｌ）に攪拌溶解したものを、１Ｍボラン／ＴＨＦ（１８４．６ｍｌ，１８４．６ミリモル）で１５分間かけて徐々に処理した。反応を２時間攪拌し、水（６５ｍｌ）を加えて、溶液を攪拌加熱により３０分間還流した。
【０１４６】
冷却後、３０％水酸化ナトリウム溶液（９７ｍｌ）を反応混合物に加えた後、３０％過酸化水素溶液（４８．６ｍｌ）を加え、反応を攪拌および加熱により更に１時間還流した。
【０１４７】
冷却した反応混合物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出し、濾過した後、溶媒を減圧留去し、油状物を得た。ヘキサン（２３０ｍｌ）を油状物に加え、溶液を再度減圧濃縮した。
【０１４８】
油状残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣を、カラムクロマトグラフィー（シリカ，勾配，ヘキサン−エーテル）を用いて再度精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去し、淡黄色固形物（５．１８ｇ，３８％）を得た。
【０１４９】
２Ｄ． ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体のモッシャーエステル誘導体の調製
【化２２】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（４．６８ｇ，１９．９８ミリモル）、塩化オキサリル（１．９０ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１３ｍｌ）を無水ジクロロメタン（４６ｍｌ）に加え、溶液を室温で４５分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を再度無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解した。生成する溶液を氷−水槽を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．６５ｇ，２９．８７ミリモル）を加えた後、実施例２Ｃ（４．６８ｇ，１４．６ミリモル）の固体生成物を予備乾燥した（４Å篩上）無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解したものを加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加えて、混合物をエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、シリカのパッドを通し、生成物をエーテルを用いて溶出させた。
【０１５０】
集めたエーテル溶出物を減圧濃縮して、油状物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１：１））を用いて精製した。集めた目的のカラム画分を蒸発させて溶媒を減圧で留去したところ、淡紅色固形物（６．５３ｇ）を得た。
【０１５１】
１００ｍｇの装填量での固形物の調製用ＨＰＬＣ（カラム：２ｘＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９７：３），ＵＶ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ分−１）の後、目的画分を真空濃縮したところ、固形物が得られ、これを石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にして、濾過によって集め、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１ （２．３７ｇ，３０％）
ピーク２ （２．４２ｇ，３０％）
【０１５２】
２つのピークに対応する画分を加水分解して、異性体ＣおよびＤとして同定され特性決定された個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離した。異性体ＣおよびＤは、それぞれ下記の構造
【化２３】
を有すると思われる。
【０１５３】
２Ｆ． ピーク１の加水分解による異性体Ｃの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を、モッシャーエステルピーク１（２．３７ｇ，４．４３ミリモル）をメタノール（１５８ｍｌ）に攪拌溶解したものに加え、混合物を還流温度で１５０分間攪拌した。冷却後、水（８８ｍｌ）を反応混合物に加え、生成する溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。酢酸エチル（２００ｍｌ）を残渣に加え、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。
【０１５４】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、生成する懸濁固形物を濾過によって集めた。濾液を減圧濃縮し、懸濁固形物の第二のバッチを濾過によって集めた。両方の集めた固形物を合わせて、減圧乾燥し、異性体Ｃ（１．０ｇ，７０％）を得た。
【０１５５】
２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置（絶対立体化学は決定しなかった）のいずれかを有すると思われる異性体Ｃを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＣについてのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータは表４に示す。
【０１５６】
２Ｇ． ピーク２の加水分解による異性体Ｄの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を、モッシャーのエステルピーク２（２．４２ｇ，４．５２ミリモル）をメタノール（１５８ｍｌ）に攪拌溶解したものに加え、混合物を還流温度で１５０分間攪拌した。冷却後、水（８８ｍｌ）を反応混合物に加え、生成された溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。酢酸エチル（２００ｍｌ）を残渣に加え、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。
【０１５７】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、生成された懸濁橙色固形物を濾過によって集めた。この固形物を酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）に溶解し、カラムクロマトグラフィー（シリカ，勾配：酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）−酢酸エチル）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にし、生成する懸濁液を濾過によって集めた。集めた固形物を減圧乾燥し、異性体Ｄを白色固形物（０．９３ｇ，６４％）として得た。
【０１５８】
２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置（絶対立体化学は決定しなかった）のいずれかを有すると思われる異性体Ｄを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＤについてのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータは表４に示す。
【０１５９】
表１および２において、赤外スペクトルはＫＢｒディスク法を用いて決定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＭＲ分光計（２００ＭＨｚ．）を用いて重水素化クロロホルムの溶液について測定した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＭＲ分光計（５０ＭＨｚ）を用いて重水素化クロロホルムの溶液について測定した。質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ （ＥＳ＋条件）分光計を用いて得た。表３および４において、旋光分散曲線は、Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＰｏｌＡＡｒ ２００１装置を用いてメタノール溶液中で２４℃で得た。ＨＰＬＣ保持時間は、ＵＶ検出器を備えたＨＰ １０５０ ＨＰＬＣクロマトグラフィー装置を用いて測定した。
【０１６０】
表１および２： 分光データ
【表１】
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
表３および４： クロマトグラフィーおよびＯＲＤデータ
【表３】
【０１６３】
【表４】
【０１６４】
実施例３
異性体Ｂの調製およびメシレート塩の調製の代替法
３Ａ． ＲＲ／ＳＳ テトラベナジンの還元
【化２４】
１Ｍ Ｌ−セレクトリド（登録商標）をテトラヒドロフランに溶解したもの（５２ｍｌ，５２ミリモル，１．１当量）を、テトラベナジンラセミ体（１５ｇ，４７ミリモル）をテトラヒドロフラン（５６ｍｌ）に攪拌溶解して冷却したもの（氷槽）に３０分間かけて徐々に加えた。添加を完了した後、混合物を室温まで温度上昇させ、更に６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、出発材料が極めて微量しか残っていないことを示していた。
【０１６５】
混合物を、粉砕氷（１１２ｇ）、水（５６ｍｌ）および氷酢酸（１２．２ｇ）の攪拌混合物に空けた。生成される黄色溶液をエーテル（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、固形炭酸ナトリウム（約１３ｇ）を徐々に加えて塩基性にした。石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を混合物に攪拌しながら加え、粗β−ＤＨＴＢＺを濾過によって白色固形物として集めた。
【０１６６】
粗固形物をジクロロメタン（約１５０ｍｌ）に溶解し、生成される溶液を水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、濾過して、約４０ｍｌまで減圧濃縮した。白色固形物の粘稠な懸濁液が、形成された。石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を加え、懸濁液を実験室温度で１５分間攪拌した。生成物を濾過によって集め、フィルター上で石油エーテル（３０〜４０℃）（４０〜６０ｍｌ）を用いて純白になるまで洗浄した後、室温で風乾し、β−ＤＨＴＢＺ（１０．１ｇ，６７％）を白色固形物として得た。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、１成分のみを示していた。
【０１６７】
３Ｂ． ラセミβ−ＤＨＴＢＺのカンファースルホン酸塩の調製および分別結晶
実施例３Ａの生成物と１当量の（Ｓ）−（＋）−カンファー−１０−スルホン酸を、最小限の量のメタノールに加熱しながら溶解した。生成される溶液を冷却した後、生成される固形物沈澱の形成が完了するまでエーテルで徐々に希釈した。生成される白色結晶性固形物を濾過によって集め、エーテルで洗浄した後、乾燥した。
【０１６８】
カンファースルホン酸塩（１０ｇ）を、高温絶対エタノール（１７０ｍｌ）およびメタノール（３０ｍｌ）の混合物に溶解した。生成される溶液を、攪拌して冷却した。２時間後、形成された沈澱を、白色結晶性固形物（２．９ｇ）として濾過によって集めた。結晶性材料の試料を、過剰の飽和炭酸ナトリウム水溶液およびジクロロメタンと共に分液漏斗中で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）を用いて磨砕し、有機溶液を再度濃縮した。この塩のＣｈｉｒｅｘ（Ｓ）−ＶＡＬおよび（Ｒ）−ＮＥＡ ２５０ｘ４．６ｍｍカラム、およびヘキサン：エタノール（９８：２）溶離剤を流速が１ｍｌ／分で用いるキラルＨＰＬＣ分析では、単離したβ−ＤＨＴＢＺは一方の鏡像異性体が豊富であった（ｅ．ｅ．約８０％）。
【０１６９】
豊富なカンファースルホン酸塩（１４ｇ）を高温の絶対エタノール（１４０ｍｌ）に溶解し、プロパン−２−オール（４２０ｍｌ）を加えた。生成される溶液を攪拌し、１分以内に沈澱が形成し始めた。混合物を室温まで冷却し、１時間攪拌した。形成された沈澱をを濾過によって集め、エーテルで洗浄し、乾燥して、白色結晶性固形物（１２ｇ）を得た。
【０１７０】
結晶性材料を、過剰量の飽和炭酸ナトリウム水溶液とジクロロメタンと共に分液漏斗中で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）を用いて磨砕し、有機溶液を再度濃縮し、（真空乾燥後に）（＋）−β−ＤＨＴＢＺ（６．６ｇ，ＯＲＤ＋１０７．８°）を得た。単離された鏡像異性体はｅ．ｅ．＞９７％である。
【０１７１】
３Ｃ． 異性体Ｂの調製
五塩化リン（４．５ｇ，２１．６ミリモル，１．０５当量）をジクロロメタン（５５ｍｌ）に溶解したものを、実施例３Ｂの生成物（６．６ｇ，２０．６ミリモル）をジクロロメタン（９０ｍｌ）に溶解して攪拌冷却したもの（氷水槽）に一定速度で１０分間かけて加えた。添加を完了したならば、生成される黄色溶液を更に１０分間攪拌した後、炭酸ナトリウム（１５ｇ）を水（９０ｍｌ）および粉砕氷（９０ｇ）に混合攪拌したものに素早く空けた。混合物を更に１０分間攪拌した後、分液漏斗に移した。
【０１７２】
相を分離したならば、褐色ジクロロメタン層を採りだし、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、粗アルケン中間体を褐色油状物（約６．７ｇ）として得た。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、（＋）−β−ＤＨＴＢＺが粗生成物に残っていないことを示していた。
【０１７３】
粗アルケン（乾燥窒素雰囲気中）を無水テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）に溶解し、ボランをＴＨＦに溶解したもの（１Ｍ溶液，２．５当量，５２ｍｌ）を攪拌しながら１５分間かけて加えた。反応混合物を、次に室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、アルケン中間体が反応混合物に残っていないことを示していた。
【０１７４】
水酸化ナトリウム（３．７ｇ）を水（１０ｍｌ）に溶解したものを攪拌反応混合物に加えた後、過酸化水素水溶液（５０％，約７ｍｌ）を加え、形成された二相混合物を還流温度で１時間攪拌した。この時点での有機相のＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、異性体Ｂについて予想したＲｆを有する生成物の出現を示していた。特徴的な無極性成分も見られた。
【０１７５】
反応混合物を室温まで冷却し、分液漏斗に空けた。上部の有機層を採りだして減圧濃縮し、大半のＴＨＦを除去した。残渣をエーテル（安定化（ＢＨＴ），７５ｍｌ）に溶解し、水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮し、淡黄色油状物（８．１ｇ）を得た。
【０１７６】
黄色油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（８０：２０），１００％酢酸エチルまで増加）を用いて精製し、所望なカラム画分を集め、合わせて、減圧濃縮し、青白色油状物を得て、これをエーテル（安定化，１８ｍｌ）で処理し、減圧濃縮し、異性体Ｂを淡黄色固形フォーム（２．２ｇ）として得た。
【０１７７】
実施例３Ｂに示した条件を用いるキラルＨＰＬＣにより、異性体Ｂは９７％を上回る鏡像異性体過剰量（ｅ．ｅ．）で生成したことが明らかになった。
【０１７８】
旋光度をＢｅｌｌｉｎｇｈａｍ Ｓｔａｎｌｅｙ ＡＤＰ２２０旋光計を用いて測定し、［αＤ］＋１２３．５°を得た。
【０１７９】
３Ｄ． 異性体Ｂのメシレート塩の調製
異性体Ｂのメタンスルホン酸塩は、実施例３Ｃからの１当量の異性体Ｂと１当量のメタンスルホン酸の混合物を最小限の量のエタノールに溶解した後、ジエチルエーテルを加えることによって調製した。形成される白色沈澱を濾過によって集め、真空乾燥して、メシレート塩を収率約８５％および純度（ＨＰＬＣによる）約９６％で得た。
【０１８０】
実施例４
異性体ＢについてのＸ線結晶学的検討
異性体Ｂの（Ｓ）−（＋）−カンファー−１０−スルホン酸塩を調製し、単結晶について下記の条件下でＸ線結晶学的検討を行った。
回折計： Ｎｏｎｉｕｓ ＫａｐｐａＣＣＤ領域検出器（ｔ／ｉスキャンおよびＯＪスキャンによる非対称性ユニットを満たす）
セル決定（Ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）： ＤｉｒＡｘ （Duisenberg, A.J.M.(1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96.）
データ収集： Ｃｏｌｌｅｃｔ （Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B. V5 1998）
データー還元およびセル微細化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）： Ｄｅｍｏ (Z. Otwinowski & W. Minor, Methods in Enzymology (1997) Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307- 326; C. W. Carter, Jr & R. M. Sweet, Eds., Academic Press）．
吸収補正： Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ， Ｇ． Ｍ． ＳＡＤＡＢＳ − Ｂｒｕｋｅｒ Ｎｏｎｉｕｓ領域検出器スケーリングおよび吸収補正 − Ｖ２．＼０
構造説明： ＳＨＥＬＸＳ９７ （G. M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) A46 467-473）．
構造精製： ＳＨＥＬＸＬ９７ （G. M. Sheldrick (1997), University of Goettingen, Germany）
グラフィック： Ｃａｍｅｒｏｎ − Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐａｃｋａｇｅ （D. M. Watkin, L. Pearce and C K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford, 1993）
特殊な詳細： 総ての水素原子は、ディファレンス・マップに置かれ、レストレイント（ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）を用いて微細化したＮＨおよびＯＨの水素原子を除き、理想化位置に置き、ライディングモデルを用いて微細化した。キラリティー： ＮＩ＝Ｒ， ＣＩ２＝Ｓ， ＣＩ３＝Ｓ， ＣＩ５＝Ｒ， Ｃ２１＝Ｓ， Ｃ２４＝Ｒ
【０１８１】
検討の結果を、表Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに示す。
【０１８２】
表において、ＲＵＳ０３５０というラベルは異性体Ｂを表す。
【０１８３】
【表５】
【０１８４】
【表６】
【０１８５】
【表７】
【０１８６】
【表８】
【０１８７】
【表９】
【０１８８】
【表１０】
【化２５】
３０％の確率水準で描いた熱振動楕円体
【０１８９】
上記のデーターに基づいて、異性体Ｂは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ配置を有し、式（Ｉａ）
【化２６】
に対応していると思われる。
【０１９０】
実施例５
シグマ受容体結合研究
４種類のジヒドロテトラベナジン異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに特異結合分析法を行い、シグマ−１およびシグマ−２受容体へのそれらの結合能力を試験した。結果を表５に示す。
（ａ） シグマσ１受容体：
文献： Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251-
260, (1999)
供給源： ヒトジャーカット細胞
リガンド： ８ｎＭ ［３Ｈ］ハロペリドール
ビヒクル： １％ ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：４時間、２５℃
インキュベーション緩衝液： ５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液 ｐＨ７．５
非特異的リガンド： １０μＭハロペリドール
Ｋｄ： ５．８ｎＭ
Ｂｍａｘ： ０．７１ピコモル／ｍｇ タンパク質
特異的結合： ８０％
定量方法： 放射性リガンド結合
有意基準： 最大刺激または阻害の>５０％
（ｂ）シグマσ２受容体：
文献： Hashimoto et al. , Eur. J. Pharmacol. , 236: 159-1
63, (1993)
供給源： ウィスターラット脳
リガンド： ３ｎＭ ［３Ｈ］イフェンプロジル
ビヒクル： １％ ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：６０分間、３７℃
インキュベーション緩衝液： ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
非特異的リガンド： １０μＭイフェンプロジル
Ｋｄ： ４．８ｎＭ
Ｂｍａｘ： １．３ピコモル／ｍｇ タンパク質
特異的結合： ８５％
定量方法： 放射性リガンド結合
有意基準： 最大刺激または阻害の>５０％
【０１９１】
【表１１】
データは、４種類総ての異性体がシグマ−１およびシグマ−２受容体のいずれにも結合することを示している。これら４種類の異性体はシグマ−２受容体での結合研究ではほぼ等しい効力を有するが、異性体ＢおよびＤはシグマ−１受容体に対して一層強い結合を示す。
【０１９２】
実施例６
抗増殖活性
本発明の化合物の抗増殖活性は、多数の細胞系における細胞増殖を阻害する化合物の能力を測定することによって決定することができる。細胞増殖の阻害は、アラマーブルー分析法(Nociari, M.M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167)を用いて測定される。この方法は、生存細胞がレサズリンをその蛍光生成物レゾルフィンに還元する能力に基づいている。それぞれの増殖分析に対して、細胞を９６穴プレート上で培養し、１６時間回復させた後、阻害薬化合物を更に７２時間添加する。インキュベーション期間の終了時に、１０％（ｖ／ｖ）アラマーブルーを加え、更に６時間インキュベーションした後、５３５ｎＭ ｅｘ／５９０ｎＭ ｅｍで蛍光生成物を測定した。非増殖細胞分析の場合には、細胞を９６時間コンフルエンスに保持した後、阻害薬化合物を更に７２時間添加する。生存細胞の数を、上記のアラマーブルー分析法によって測定する。総ての細胞系は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得ている。このような細胞系の例は、ヒトＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫およびラットＣ６神経膠腫細胞系である。
【０１９３】
実施例７
ヒト単球によるサイトカインのＬＰＳ／ＩＦＮ刺激産生に対する本発明の化合物の効果の測定
本発明の化合物を、ヒト単球によるサイトカインの産生を調節することができる範囲を決定する目的で試験した。単球はマクロファージの前駆体であり、広範囲の疾患状態における炎症性サイトカインの重要な供給源である。従って、単球産生に対する本発明の化合物の活性は、化合物が抗炎症活性を有する可能性の良好な指標を提供する。
【０１９４】
下記の治療群を設定した。
【表１２】
【０１９５】
手順
ヒト単球のサイトカイン産生の調節
材料
ＭＡＣＳ緩衝液：１ｘＰＢＳ ｐＨ７．２， ２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ），５％ヒトＡＢ血清
培地：５００ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），５ｍｌ Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ），５ｍｌ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１０ｍｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ），５％自己血漿
化合物：無水エタノール中に１０ｍＭで保管
ＬＰＳ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｉｓ，１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｌ１８８７）
ＩＦＮγ：組換えヒト，１０μｇ／ｍｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，製品番号５５４６１７）
ＭＡＣＳ ＣＤ１４正の選択ビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
ＣＤ１４：ＦＩＴＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
軟膜（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）はＢｒｉｓｔｏｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手。
血液１ｍｌは、７ｘ１０６個の全細胞を供給する。
【０１９６】
自己血漿の調製
軟膜を３５００ｒｐｍで１０分間回転する。
上部血漿層を取りだし、５６℃で３０分間熱不活性化する。
３５００ｒｐｍで１０分間回転し、熱不活性化した補体タンパク質などを除去する。
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）単離
１． 残っている軟膜を等容のＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、反転混合する。
２． ヒストパーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）を室温（ＲＴ）まで予備加温し、１０ｍｌを全体に加える。
３． １５ｍｌの血液／培地混合物で徐々に被覆する。
４． ＲＴにて１６００ｒｐｍで２５分間回転する（減速なし）。
５． ＰＢＭＣを培地とヒストパークとの間の界面層に分離し、細胞を５０ｍｌ ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、１０ｍｌ培地を加える。
６． ＲＴにて１８００ｒｐｍで１０分間回転する。
７． ４０ｍｌＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、培地に再懸濁する。
【０１９７】
ＣＤ１４＋マイクロビーズを用いる正の選択によりＣＤ１４＋細胞の単離
氷上で予め冷却した溶液を用いて作業する。
１． 細胞数（３１３ｘ１０ｘ５ｘ１０４＝１．５６５ｘ１０８全細胞）を決定する。
２． 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析の目的で１００μｌ細胞試料を取り出す（予備選択試料）。
３． ４℃にて１８００ｒｐｍで１０分間回転する。上清を除く。
４． ペレットを１ｘ１０７個の全細胞当たり８０μｌ緩衝液に再懸濁する（２４００μｌ／全細胞）。
５． ２０μｌのＣＤ１４マイクロビーズ／１ｘ１０７個の全細胞を加える（４００μｌ／全細胞）。
６． 十分に混合し、４−８℃で１５分間インキュベーションする。
７． 細胞を１〜２ｍｌの緩衝液で洗浄し、４℃にて３００ｘｇで１０分間回転する。
８． １ｘ１０８個の細胞／５００μｌ緩衝液まで再懸濁する（１ｍｌ／全細胞）。
【０１９８】
ＬＳカラムを用いる磁気分離
１． ＭＡＣＳ（登録商標）分離器の磁場にカラムを置く。カラムを３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。
２． 細胞懸濁液をカラムに加える。
３． 通過する未標識細胞を集める。カラムを３ｍｌ緩衝液で３回洗浄し、それぞれの洗浄の間にはカラム液溜めを空にする。全流出物を集める（未標識細胞画分）。
４． 分離器からカラムを外し、収集管上に置く。
５． ５ｍｌの緩衝液をカラムに加え、カラムプランジャーを使用することによって磁気標識した細胞を含む画分を直ちに流し出す。
６． ＭＡＣＳ緩衝液中の細胞を回転し、細胞ペレットを培地に再懸濁する。
７． 正に選択された細胞について細胞計数を行う。
７１ｘ２０ｘ５ｘ１０４＝７．１ｘ１０７個の細胞／ｍｌ。１．７５ｍｌであるから、１．２４ｘ１０８個の全細胞となる。
８． 試料を採取してＦＡＣＳによって純度をチェックする。１０μｌのＣＤ１４−ＦＩＴＣ抗体を加え、４−８℃で５分間インキュベーションする。
【０１９９】
化合物調製
無水エタノール中で１０ｍＭの化合物を調製する。培地中で培養する前に必要な濃度まで希釈する。
【０２００】
細胞培養
単離したＣＤ１４＋単球を、２４穴プレートで１ｘ１０６細胞／ｍｌ／ウェルで培養した。単球を、下表に示す様々な希釈度の試験化合物および対照化合物の存在下にて培養した。一晩インキュベーションした後、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて単球の活性化を刺激し、ＣＢ２発現を高めた。４８時間後に、上清を採り出してＣＢＡサイトカイン分析を行った。
【０２０１】
ＣＢＡサイトカイン分析（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ ヒトＴｈ１／Ｔｈ２キット［製品番号ＢＭＳ７１６ＦＦ］）
使用前に、総ての緩衝液を室温にし、渦流混合する。
１． ４５０ｍｌの蒸留水に加えて徐々に混合することによって、アッセイバッファーを作製する。４℃で保管する。
２． それぞれのビオチン接合体６００μｌを全体に加えることによって、ビオチン接合体混合物を作製する。
３． それぞれのビーズセット３００μｌを加えることによって、ビーズ混合物を作製する。
４． バイアルのラベルに推奨されているようにそれぞれの標準物を蒸留水で再構成する。１００μｌのアッセイバッファーを、標準物１とラベルが貼られたチューブに加える。それぞれの再構成した標準物１０μｌを加え、混合する。標準混合物を連続希釈する（１００μｌアッセイバッファーをチューブ２−７に入れ、５０μｌ標準物１をチューブ２に加え、混合し、５０μｌをチューブ３に加える、など）。
５． ＦＡＣＳチューブをラベルし、標準物１−７ ２５μｌを指定チューブ加える。２５μｌのアッセイバッファーをブランクチューブに加える。
６． 試料２５μｌを指定した試料チューブに加える。
７． ビーズ混合物２５μｌを総てのチューブに加える。
８． ５０μｌビオチン接合体を総てのチューブに加える。
９． 渦流によって混合した後、金属箔で被覆し、ＲＴにて２時間インキュベーションする。
１０． １７６μｌを５３２４μｌアッセイバッファーに混合することによって、ストレプアビジン−ＰＥ溶液を調製する。アッセイバッファー１ｍｌを総てのチューブに加え、２００ｘｇで５分間回転する。上清を捨てる。洗浄処置を繰り返し、上清を捨てる。
１１． ストレプアビジン−ＰＥ ５０μｌを総てのチューブに加える。渦流混合の後、金属箔で被覆し、ＲＴにて１時間インキュベーションする。
１２． 洗浄処置を２回繰り返す。
１３． アッセイバッファー５００μｌを総てのチューブに加える。
【０２０２】
フローサイトメーターの設定
ポジティブおよびネガティブビーズ（キットで供給）を用いて設定を最適にし、補正などを決定する。試料の前に標準曲線を用い、ゲートされた集団について３０００イベントを計数する（３００イベント／検体）。
【０２０３】
結果
結果を図１〜６に示す。図において、ラベルＲＵ３４８は異性体Ｄを表す。
【０２０４】
図１〜６から分かるように、２個のシス−ジヒドロテトラベナジン異性体ＢおよびＤは、いずれもＬＰＳ／ＩＦＮによって刺激した単球における様々なサイトカインの産生を減少させた。
【０２０５】
例えば、異性体Ｂは、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１２の産生を試験した総ての濃度で減少させ、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生を試験した濃度の大半で減少させた。
【０２０６】
異性体ＤはサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２の産生を試験したすべての濃度で減少させ、サイトカインＴＮＦａ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生を試験した濃度の大半で減少させた。
【０２０７】
実施例８
Ｔ細胞増殖に対する本発明の化合物の効果の測定
本発明の化合物を試験し、それらがＴ細胞増殖を阻害することができる程度を測定した。Ｔ細胞は適応免疫応答の調整（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ）に関係しており、広汎な疾患状態における炎症の駆動因子である。
【０２０８】
従って、本発明の化合物のＴ細胞増殖に対する活性は、化合物が抗炎症活性を有する可能性の良好な指標を提供する。
【０２０９】
材料
ＨＢＳＳ＋２％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍｌ＋１０ｍｌ）、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ（５００ｍｌ）＋２％ ＨＥＰＥＳ（１０ｍｌ）＋１％ Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（５ｍｌ）＋２％ Ｌ−グルタミン（ｌ０ｍｌ）＋５０μＭ ２−ＭＥ（５００μｌ）および正常マウス血清（ＮＭＳ）
【０２１０】
方法
１． ９６穴プレートカラム１−８、列Ａ−Ｈに１００μｌ抗マウスＣＤ３を１μｇ／ｍｌ ＰＢＳで３回コーティングする。全部で１９２穴であるので、１．４４ｍｇ／ｍｌのストックを１７μｌ加えることによってＰＢＳで２４ｍｌとする。３７℃で２時間インキュベーションする。
２． ＮＭＳ調製のため心臓穿刺後に２匹のｂａｌｂ／ｃマウスからの血液をプールし、脾臓を取り出してＨＢＳＳ＋Ｈｅｐｅｓに移す。
３． 血液を３７℃で３０分間置いて凝固させ、３，０００ｒｐｍで１０分間Ｃｈｉｌｓｐｉｎで回転する。血清を取りだし、滅菌濾過し、使用まで冷蔵庫に保管する。
４． 脾臓を１０ｍｌ ＨＢＳＳを入れたペトリ皿に移し、脾臓上に置かれた清浄な滅菌ワイヤーメッシュを用い、ガラス棒を用いて細胞を外す。パスツールピペットを用いて細胞をメッシュから洗い流し、１５ｍｌチューブに移す。室温（ＲＴ）、１０００ｒｐｍにて１０分間回転する。
５． 細胞を再懸濁させ、０．５ｍｌの滅菌ＤＷを加えてＲＢＣを溶解し、混合し、直ちにＨＢＳＳで希釈し、５０ｍｌチューブに移し、細胞濾過器（７０μＭ）を通過させて残屑を除去し、上記のようにして回転し、細胞を再度ＨＢＳＳで洗浄し、最後に補体（上記）を含む２ｍｌ αＭＥＭに再懸濁する。
６． 細胞計数−２５２細胞ｘ２ｘ５ｘ１０４＝４ｍｌ中に２．５２ｘ１０７細胞／ｍｌ＝総数１０８細胞。２ｍｌを２５ｍｌに希釈し、２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を得る。
７． ２５０μｌのＮＭＳを細胞に加え、濃度を１％とする。
８． 抗ＣＤ３をコーティングしたプレートをＰＢＳで３回洗浄する。
９． １００μｌ分量の細胞を３ｘ９６穴プレートの列Ａ−Ｈカラム１−８のコーティングしたウェルに移す。等容の化合物を加え、下記のように９６穴プレートで希釈する。
【０２１１】
化合物
１０ｍＭの化合物３．５μｌを３４６．５μｌの培地に移し（１／１００）、１／１００希釈液３５μｌを３１５μｌの培地に移す（１／１０）などによりプレートを引き下げ、化合物の連続１／１０希釈液を得る。様々な化合物の希釈液の１００μｌ分量を、Ｔ細胞を含むトリプリケートプレートのウェルに移す。
【表１３】
【０２１２】
４８時間培養した後、それぞれのウェルに３Ｈ−チミジンを滴加し（１６μｌ）、３７℃、５％ ＣＯ２で一晩インキュベーションする。回収し、３Ｈ−チミジン取り込みを測定する。
【０２１３】
結果
３Ｈ−チミジン取り込みのレベルによって示されるＴ細胞増殖の程度を、下表に示されるデータで示す。
【表１４】
【０２１４】
表において、「Ｎａｂ」はナビロンを表し、「ＲＵ３４６」は異性体Ｄを表し、「ＲＵ３５０」は異性体Ｂを表す。
【０２１５】
これらの結果は、最大濃度で試験した化合物のそれぞれがＴ細胞の増殖を阻害することを表している。
【０２１６】
実施例９
医薬組成物
（ｉ）錠剤処方物−Ｉ
本発明のジヒドロテトラベナジンを含む錠剤組成物を、ジヒドロテトラベナジン５０ｍｇを希釈剤としてのラクトース（ＢＰ）１９７ｍｇおよび滑沢剤としてのステアリン酸マグネシウム３ｍｇと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を成形することによって調製する。
【０２１７】
（ｉｉ）錠剤処方物−ＩＩ
本発明のジヒドロテトラベナジンを含む錠剤組成物を、化合物（２５ｍｇ）を酸化鉄、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、白色トウモロコシ澱粉およびタルクと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を成形することによって調製する。
【０２１８】
（ｉｉｉ）カプセル処方物
カプセル処方物は、本発明のジヒドロテトラベナジン１００ｍｇをラクトース１００ｍｇと混合し、生成される混合物を標準的な不透明硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【０２１９】
同等物
本発明の具体的態様に対して多数の改質および変更を本発明の基礎となる原理から離反することなく行うことができることは、容易に明らかになるであろう。総てのこのような改質および変更は、本出願によって包含されることを意味するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）の単球によるＴＮＦαの産生に対する効果。
【図２】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）の単球によるＩＬ−４の産生に対する効果。
【図３】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−２の産生に対する効果。
【図４】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−５の産生に対する効果。
【図５】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−１０の産生に対する効果。
【図６】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−１２の産生に対する効果。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患および癌の予防または治療におけるジヒドロテトラベナジンの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
癌は、異常かつ制御不能な細胞増殖を特徴とする疾患の集団に対する集合的用語である。通常は、身体が必要とするときにのみ細胞が増殖し分割して、新たな細胞を形成する。細胞が老化して死ぬと、新しい細胞がその代わりをする。細胞内の遺伝子の突然変異によって、この過程が破壊されて、身体が必要としないときに新たな細胞が形成されかつ老細胞が死ぬべきときに死ないことがときとしてある。余分な細胞は、増殖、新生物または腫瘍と呼ばれる組織の塊を形成する。腫瘍は、良性（癌性でない）または悪性（癌性）のいずれかであることができる。良性腫瘍は身体の他の部分に広がらず、生命を脅かすことはまれにしかないが、悪性腫瘍は広がる（転移する）可能性があり、生命を脅かすことがある。癌は単一の細胞内から発生し、従ってそれらが発生する細胞の種類および細胞の位置によって分類することができる。例えば、腺腫は腺組織に由来し、癌腫は上皮細胞に由来し、白血病は骨髄幹細胞で生じ、リンパ腫はリンパ組織に由来し、黒色腫はメラニン細胞で生じ、肉腫は骨または筋肉の結合組織で生じ、奇形腫は生殖細胞で生じる。
【０００３】
癌治療には様々な方法があり、最も普通に行われるものは手術、化学療法および放射線療法である。一般に、療法の選択は腫瘍の部位と悪性度分類、および疾患の病期によって変わる。腫瘍が限局性であれば、手術が好ましい治療法であることが多い。普通に見られる外科処置法の例としては、前立腺癌についての前立腺切除および乳癌についての乳房切除が挙げられる。手術の目的は、腫瘍のみまたは全器官の除去のいずれかであることができる。単一の癌細胞は相当の大きさの腫瘍に増殖する可能性があるので、腫瘍のみの除去では再発の可能性が大きくなる。化学療法は、癌細胞を破壊しまたは増殖を防止することができる薬剤を用いる癌の治療を包含する。癌の化学療法によって開発された代替機構としては、腫瘍に供給する血管を途絶させる作用をする抗脈管形成剤および腫瘍組織に対する宿主の免疫応答を高める作用をする免疫療法剤が挙げられる。正常細胞は、制御された過程で増殖し、死ぬ。癌が生じると、正常でない身体の細胞は制御なしに分割を続け、更に細胞を形成する。抗癌薬の１つのクラスは、分割細胞を殺すことによってまたは細胞の成長または増殖を停止することによって作用する。健常細胞、特に速やかに分割する細胞も損なわれる可能性があり、またこれは副作用を生じる可能性がある。放射線療法は、イオン化放射線を用いて癌細胞を殺して腫瘍を縮小させることを含む。放射線療法は、遺伝子材料を傷付けることによって治療を行う部位（「標的組織」）の細胞に損傷を与えまたは破壊し、これらの細胞が増殖または分割を続けることを不可能にする。放射線は癌細胞と正常細胞を両方とも損傷するが、ほとんどの正常細胞は放射線の影響から回復して適正に機能することができる。放射線療法の目的は、附近の正常組織に対する傷害を限定しながら、できるだけ多くの癌細胞に損傷を与えることである。放射線療法は、脳、乳房、頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎、胃、子宮の癌、または柔組織肉腫などほとんどあらゆる種類の固形腫瘍の治療目的に使用することができる。放射線は、白血病およびリンパ腫（それぞれ、血液形成細胞およびリンパ系の癌）の治療目的で用いることもできる。
【０００４】
シグマ（σ）受容体のリガンドが腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有することが報告されている(Berthois et al., British Journal of Cancer, (2003), 88, 438-446)。また、Ｂｏｕｒｒｉｅらは(Current Opinion in Investigational Drugs, (2004) 5(11):1158-63)、２つのシグマ受容体サブタイプおよびそれらの２つの関連タンパク質も腫瘍細胞上で発現することを報告している。
【０００５】
シグマ受容体は、アヘン剤受容体のサブタイプであるとかつて考えられていた細胞表面受容体であるが、この受容体の特性決定および受容体に対する特異的リガンドの発見の後、それらはアヘン剤受容体とは異なることが明らかにされている(Bourrie et al., (2004))。
【０００６】
シグマ受容体は、シグマ−１（σ−１）およびシグマ−２（σ−２）サブタイプに分類することができる。σ−１受容体は、２２３個のアミノ酸を含んでいると考えられているが、クローニングされ(Hanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93:8072-8077)、任意の他の受容体クラスとは一次配列相同性を示さないことが分かっている。しかしながら、これは真菌ステロールＣ８−Ｃ７イソメラーゼの配列に３０．３％の同一性を有し、機能が未知の別のタンパク質ＳＲＢＰ２（ＳＲ−３１７４７結合タンパク質２）に関係することも分かっており、この酵素と高い相同性を共有している。σ−２受容体は、未だクローニングされていない。
【０００７】
Ｗａｎｇらは(Breast Cancer Research & Treatment, (2004), 87(3):205-14)、ヒト乳癌におけるシグマ−１受容体の発現を検討し、正常組織と比較して乳癌の６４％にシグマ−１受容体ｍＲＮＡの過剰発現を見出し、幾つかの正常およびほとんどの腫瘍性乳房上皮細胞および細胞系は一般にシグマ−１受容体を発現すると結論した。彼らは、非特異的シグマ−１リガンドであるハロペリドールが高濃度でこれらの細胞の増殖を阻害し、イン・ビトロでの化学療法の効果を増強することも見出した。
【０００８】
Ｂｅｒｔｈｏｉｓら(2003)は、ヒト上皮乳房および前立腺癌細胞系の増殖に対するシグマ受容体リガンドＳＲ３１７４７Ａの効果を測定した研究を報告した。彼らは、イン・ビトロではナノモル濃度のＳＲ３１７４７Ａがホルモン−応答性およびホルモン−非応答性癌細胞系のいずれにおいても細胞増殖を劇的に阻害することを報告した。彼らはまた、ＳＲ３１７４７Ａを処理されたことがあるマウスでは腫瘍の発生が有意に減少することも見出した。
【０００９】
Ｓｐｒｕｃｅら(Cancer Research, (2004), 64:4875-4886)は、小分子であるσ−１受容体拮抗薬が、免疫不全マウスにおける発達中および確立したホルモン感受性およびホルモン不感受性の乳癌キセノグラフ（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｓ）、正常位前立腺腫瘍およびｐ５３−ヌル肺癌キセノグラフの増殖を副作用なしで阻害することを報告している。彼らは、σ−１拮抗薬が腫瘍細胞においてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導するが、ほとんどの正常細胞の種類では誘発されないことを見出した。Ｓｐｒｕｃｅらは、σ−１拮抗薬を用いることによって、正常組織を殺さずに腫瘍を殺す方法を提供できるであろうと結論した。
【００１０】
癌細胞の増殖の阻害におけるσ−１受容体リガンドの使用についての他の報告は、Spruce et al.(2004)に引用されている文献に見出すことができ、例えば、Brent et al., Eur. J. Pharmacol, (1995), 278:151-60およびCrawford et al. Cancer Research, (2002), 62:313-22を参照されたい。
【００１１】
従って、シグマ受容体リガンドが癌細胞系の増殖を阻害することができ、かつ癌細胞にアポトーシスを誘導することができることは詳細に確立されており、この証拠に基づいて、シグマ−１拮抗薬のようなシグマ受容体リガンドは癌の治療に有用であることが立証されると思われる。
【００１２】
シグマ受容体リガンドは、抗炎症作用を有することも報告されている。例えば、Bourrie et al., Eur. J. Pharmacol, (2002), 456(1-3):123-31には、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ化合物ＳＳＲ１２５３２９Ａ（化学名：［（Ｚ）−３−（４−アダマンタン−２−イル−３，５−ジクロロ−フェニル）−アリル］−シクロヘキシル−エチルアミン）は強力な抗炎症特性を有する高親和性のシグマ受容体リガンドであることを報告されている。Ｂｏｕｒｒｉｅらは、彼らの研究結果が、シグマ受容体リガンドが関節リウマチ治療の新たな効果的方法となり得ることの実質的な証拠を提供していると結論している。
【００１３】
もう一つのＳａｎｏｆｉシグマ受容体拮抗薬（ＳＲ３１７４７）は、現在関節リウマチの治療のための臨床試験中である。
【００１４】
テトラベナジン（化学名： １，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−３−（２−メチルプロピル）−２Ｈ−ベンゾ（ａ）キノリジン−２−オン）が、１９５０年代後期から医薬品として用いられてきている。テトラベナジンは、当初は抗精神病薬として開発されたが、現在ではハンチントン病、片側バリスム、老人性舞踏病、チック、遅発性ジスキネジーおよびツレット症候群のような多動運動障害の対症療法に用いられている。例えば、Jankovic et al., Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8): 1279-81およびJankovic et al, Neurology (1997) Feb; 48(2):358-62を参照されたい。
【００１５】
テトラベナジンの化学構造は、下図１に示される通りである。
【化１】
図１ テトラベナジンの構造
【００１６】
この化合物は３および１１ｂ位の炭素原子にキラル中心を有しており、従って、理論上、図２に示されるように総数で４個の異性体形態を示すことができる。
【化２】
図２ 可能なテトラベナジン異性体
【００１７】
図２では、それぞれの異性体の立体化学はCahn, Ingold and Prelogによって開発された「ＲおよびＳ」命名法を用いて定義されている。「Jerry Marchの最新有機化学（Advanced Organic Chemistry by Jerry March）」， 第４版， John Wiley & Sons, ニューヨーク， 1992年， 109-114頁を参照されたい。図２および本特許出願明細書の他の箇所において、「Ｒ」または「Ｓ」という名称は炭素原子の位置番号の順に付けられている。従って、例えばＲＳは３Ｒ，１１ｂＳの省略表記である。同様に、下記のジヒドロテトラベナジンのように３個のキラル中心が存在するときには、「Ｒ」または「Ｓ」という名称が炭素原子２、３および１１ｂの順に付けられる。従って、２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体は、略記形態ではＳＲＲなどと呼ばれる。
【００１８】
市販のテトラベナジンはＲＲおよびＳＳ異性体の異性体混合物であり、ＲＲおよびＳＳ異性体（３および１１ｂ位の水素原子がトランス相対配向を有するので、以後個別的にまたは集合的にトランス−テトラベナジンと呼ぶ）が最も熱力学的に安定な異性体と思われる。
【００１９】
テトラベナジンは、バイオアベイラビリティーが幾分乏しくかつ変化しやすい。これは初回通過代謝によって完全に代謝され、未変化テトラベナジンは典型的には尿中にほとんどまたは全く検出されない。主要代謝産物はテトラベナジンの２−ケト基の還元によって形成されるジヒドロテトラベナジン（化学名： ２−ヒドロキシ−３−（２−メチルプロピル）−１，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−ベンゾ（ａ）キノリジン）であり、この薬剤の活性に主として関与していると考えられる（Mehvar et al , Drug Metab. Disp, 15, 250-255 (1987)およびJ. Pharm. Sci., 76, No.6, 461-465 (1987)を参照されたい）。
【００２０】
４個のジヒドロテトラベナジン異性体は以前に同定され、特性決定されており、それらの総ては親テトラベナジンの更に安定なＲＲおよびＳＳ異性体から誘導され、３および１１ｂ位の水素原子がトランス相対配向である（Kilbourn et al,Chirality, 9:59-62 (1997)およびBrossi et al, Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)を参照されたい）。４個の異性体は（＋）−α−ジヒドロテトラベナジン、（−）−α−ジヒドロテトラベナジン、（＋）−β−ジヒドロテトラベナジンおよび（−）−β−ジヒドロテトラベナジンである。４種類の既知のジヒドロテトラベナジン異性体の構造は、図３に示される通りであると考えられる。
【化３】
図３ ジヒドロテトラベナジンの既知異性体の構造
【００２１】
Ｋｉｌｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．（Eur. J. Pharmacol, 278:249-252 (1995)およびMed. Chem. Res., 5:113-126 (1994)参照）は、意識のあるラット脳における個々の放射能標識したジヒドロテトラベナジン異性体の特異的な結合を検討した。彼らは、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン（２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＲ）異性体がニューロン膜ドパミン輸送体（ＤＡＴ）および小胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）が一層高濃度であることと関連した脳の領域に蓄積されることを見出した。しかしながら、本質的に不活性な（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体は脳にほぼ均一に分布し、ＤＡＴおよびＶＭＡＴ２への特異的な結合が起こっていないことを示唆した。イン・ビボ研究はイン・ビトロ研究と相関し、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体は、（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体のＫｉより＞２０００倍高い［３Ｈ］メトキシテトラベナジンのｋｉを示すことを明らかにした。
【００２２】
本発明者らの先の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４６４号明細書には、テトラベナジンの不安定なＲＳおよびＳＲ異性体（３および１１ｂ位の水素原子はシス相対配向を有するので、以後個別的または集合的にシス−テトラベナジンと呼ぶ）から誘導される薬学用ジヒドロテトラベナジン異性体の調製および使用が開示されている。ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００４６４号には、シス−ジヒドロテトラベナジン異性体がシグマ−１およびシグマ−２受容体に結合することを示す実験データーが含まれているが、シグマ受容体の結合活性を用いる治療的用途は開示されていない。
【００２３】
発明の概要
本発明は、本発明者らの先の出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００４６４号に記載のシス−ジヒドロテトラベナジンの炎症性疾患および癌の治療における使用に関する。
【００２４】
従って、第一の態様では、本発明は、増殖性疾患または炎症性疾患の予防または治療に用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００２５】
１つの具体的態様では、増殖性疾患は癌である。
【００２６】
従って、本発明は、癌などの増殖性疾患の予防または治療に用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００２７】
本発明は、また、以下のものを提供する：
・癌などの増殖性疾患の治療のための医薬を製造するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・異常細胞増殖から生じる疾患状態または症状（例えば、癌）の予防または治療のための医薬を製造するためのシス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の治療方法であって、哺乳類に治療上有効量のシス−ジヒドロテトラベナジンの投与を含んでなる方法。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の治療方法であって、哺乳類に異常細胞増殖を阻害するのに有効な量のシス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる方法。
・哺乳類における異常細胞増殖を含んでなるまたはこれから生じる疾患または症状（例えば、癌）の発病率を緩和または減少する方法であって、哺乳類に異常細胞増殖を阻害するのに有効な量のシス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる方法。
【００２８】
本発明の化合物は、
腺腫、
癌腫、
白血病、
リンパ腫、
黒色腫、
肉腫、および
奇形腫
から選択される任意の１以上の癌の治療または予防に有用であると考えられる。
【００２９】
阻害または治療することができる癌の具体例としては、癌腫、例えば、膀胱、乳房、結腸（例えば、結腸腺癌および結腸腺腫のような結腸直腸癌腫）、腎臓、表皮、肝臓、肺、例えば、腺癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、例えば、膵外分泌癌、胃、頸部、甲状腺、前立腺、または皮膚、例えば、扁平上皮癌；リンパ系の造血腫瘍、例えば、白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリーセルリンパ腫、またはバーキットリンパ腫；骨髄系の造血腫瘍、例えば、急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、または前骨髄性白血病；甲状腺小胞性癌；間葉起源の腫瘍、例えば、繊維肉腫または横紋筋肉腫；中枢または末梢神経系の腫瘍、例えば、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、または神経鞘腫；黒色腫；精上皮腫；奇形癌；骨肉腫；キセノデローマ・ピグメントスム（ｘｅｎｏｄｅｒｏｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ）；ケラトクタントーマ（ｋｅｒａｔｏｃｔａｎｔｈｏｍａ）；甲状腺小胞性癌；またはカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
更に詳細には、シス−ジヒドロテトラベナジンの使用によって治療または阻害することができる癌は、シグマ受容体リガンド、例えばσ−１拮抗薬に感受性の癌である。
【００３１】
シス−ジヒドロテトラベナジンの使用によって治療または阻害することができる癌の他の例は、シグマ受容体が過剰発現する癌である。
【００３２】
１つの具体的態様では、癌は乳癌である。
【００３３】
もう一つの具体的態様では、癌は前立腺腫瘍、例えば正常位前立腺腫瘍である。
【００３４】
更にもう一つの具体的態様では、癌は肺癌である。
【００３５】
もう一つの一般的態様では、本発明は、炎症性疾患の治療に使用するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００３６】
本発明は、また、以下のものを提供する：
・炎症性疾患の予防または治療のための医薬を製造するための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの使用。
・患者（例えば、ヒトなどの哺乳類）の炎症性疾患または症状の予防または治療方法であって、哺乳類に治療上有効量の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる、方法。
【００３７】
炎症性疾患および症状の例としては、関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風性関節炎、風疹関節炎、乾癬性関節炎、および他の関節炎症状；内毒素または炎症性腸疾患によって誘発される炎症性反応のような急性または慢性炎症性疾患状態；ライター症候群、痛風、リウマチ様脊椎炎、慢性肺炎症性疾患，クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
特定の炎症性疾患および症状は、シグマ受容体リガンド、例えば、シグマ受容体拮抗薬に感受性のものである。
【００３９】
１つの特定の炎症性疾患は、関節リウマチである。
【００４０】
本発明で用いられるシス−ジヒドロテトラベナジンは、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンである。
【００４１】
本発明で用いられる３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンは、実質的に純粋な形態、例えば異性体純度が９０％を上回り、典型的には９５％を上回り、更に好ましくは９８％を上回ることがある。
【００４２】
本発明における「異性体純度」という用語は、ジヒドロテトラベナジンの総ての異性体形態の総量または濃度に対して存在する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの量を意味する。例えば、組成物中に含まれる総ジヒドロテトラベナジンの９０％が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンであれば、異性体純度は９０％である。
【００４３】
本発明で用いられる１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンは、３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを実質的に含まない、好ましくは５％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、更に好ましくは３％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、最も好ましくは１％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを含む組成物の形態であることができる。
【００４４】
本明細書で用いられる「３，１１ｂ−シス」という用語は、ジヒドロテトラベナジン構造の３−および１１ｂ−位の水素原子がシス相対配向であることを意味している。従って、本発明の異性体は、式（Ｉ）の化合物およびその対掌体（鏡像）である。
【化４】
【００４５】
３，１１ｂ−シス配置を有するジヒドロテトラベナジンには４個の異性体の可能性があり、これらは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体、２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体および２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体である。これら４個の異性体は単離されて特性決定されており、もう一つの態様では、本発明は３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの個々の異性体を提供する。詳細には、本発明は、
（ａ） 式（Ｉａ）
【化５】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、
（ｂ） 式（Ｉｂ）
【化６】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体、
（ｃ） 式（Ｉｃ）
【化７】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、および
（ｄ） 式（Ｉｄ）
【化８】
を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体
を提供する。
【００４６】
本発明の個々の異性体は、それらの分光学的、光学的およびクロマトグラフィー特性によって、またＸ線結晶学によって決定されるそれらの絶対立体化学配置によっても特性決定することができる。
【００４７】
何ら特定の絶対配置または立体化学を含むことなく、４種類の新規異性体は下記のように特性決定することができる。
【００４８】
異性体Ａ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 左旋性（−）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載した通り。
【００４９】
異性体Ｂ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 右旋性（＋）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載した通りであり、およびＸ線結晶学的特性は実施例４に記載した通り。
【００５０】
異性体Ｃ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 右旋性（＋）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載した通り。
【００５１】
異性体Ｄ
ＯＲＤ（メタノール， ２１℃）によって測定した光学活性： 左旋性（−）
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ 固体）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載した通り。
【００５２】
それぞれの異性体についてのＯＲＤ値は下記の実施例に示されているが、それらの値は例として挙げられており、異性体の純度や温度変動および残留溶媒分子の影響のような他の変量の影響によって変化することがあることが注目される。
【００５３】
鏡像異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ実質的に鏡像異性体的に純粋な形態でまたは本発明の他の鏡像異性体との混合物として存在することができる。
【００５４】
本発明に関連して「鏡像異性体純度」および「鏡像異性体的に純粋な」という用語は、ジヒドロテトラベナジンの総ての鏡像異性体および異性体の形態の総量または濃度に対して存在する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの所定の鏡像異性体の量を意味する。例えば、組成物に含まれる総ジヒドロテトラベナジンの９０％が単一の鏡像異性体の形態であるときには、この鏡像異性体の純度は９０％である。
【００５５】
一例として、本発明のそれぞれの態様および実施態様では、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤから選択される個々の鏡像異性体は、少なくとも５５％（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％）の鏡像異性体純度で存在することができる。
【００５６】
本発明の異性体は、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの１以上の混合物の形態で存在することもできる。このような混合物は、ラセミ混合物または非ラセミ混合物であってもよい。ラセミ混合物の例としては、異性体Ａと異性体Ｂのラセミ混合物および異性体Ｃと異性体Ｄのラセミ混合物が挙げられる。
【００５７】
薬学上許容可能な塩
特に断らない限り、本出願明細書におけるジヒドロテトラベナジンおよびその異性体という表現は、その範囲内にジヒドロテトラベナジンの遊離塩基だけでなくその塩、詳細には酸付加塩も包含する。
【００５８】
酸付加塩が形成される特定の酸としては、ｐＫａ値が３．５未満、更に通常は３未満である酸が挙げられる。例えば、酸付加塩は、ｐＫａが＋３．５〜−３．５の範囲である酸から形成することができる。
【００５９】
好ましい酸付加塩としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸およびナフタレンスルホン酸等のスルホン酸を用いて形成されるものが挙げられる。
【００６０】
酸付加塩を形成することができる１つの特定の酸は、メタンスルホン酸である。
【００６１】
酸付加塩は、本明細書に記載の方法または「医薬品塩： 特性、選択および使用（Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use)」, P. Heinrich Stahl （編集者）， Camille G. Wermuth （編集者）， ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388頁, 2002年8月に記載されているような通常の化学的方法によって調製することができる。一般的には、このような塩は、この化合物の遊離塩基形態を適当な塩基または酸と水中または有機溶媒中で、またはこれら２種類の混合物中で反応させることによって調製することができ、一般的にはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリル等の非水溶媒が用いられる。
【００６２】
これらの塩は、典型的には薬学上許容可能な塩である。しかしながら、薬学上許容可能でない塩を中間形態として調製し、次いでこれを薬学上許容可能な塩に転換することもできる。このような薬学上許容可能でない塩形態も、本発明の一部を形成する。
【００６３】
ジヒドロテトラベナジン異性体の調製方法
本発明のジヒドロテトラベナジンは、式（ＩＩ）
【化９】
の化合物を、式（ＩＩ）の化合物における２，３−二重結合の水和に適している試薬または試薬類と反応させた後、必要ならば所望のジヒドロテトラベナジン異性体形態を分離して単離することを含んでなる方法によって調製することができる。
【００６４】
２，３−二重結合の水和は、ジボランまたはボラン−エーテル（例えば、ボラン−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））のようなボラン試薬を用いるヒドロホウ素化によって中間体アルキルボラン付加物を得た後、アルキルボラン付加物の酸化および塩基の存在下での加水分解によって行うことができる。ヒドロホウ素化は、典型的にはエーテル（例えば、ＴＨＦ）のような乾燥した極性の非プロトン性溶媒中で非高温、例えば室温で行われる。ボラン−アルケン付加物は、典型的には水酸化アンモニウムまたはアルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムのような水酸化物イオンの供給源を提供する塩基の存在下にて過酸化水素のような酸化剤で酸化される。方法Ａの反応をヒドロホウ素化−酸化−加水分解の順序で行うことによって、典型的には２−および３−位の水素原子がトランス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体が得られる。
【００６５】
式（ＩＩ）の化合物は、テトラベナジンを還元してジヒドロテトラベナジンを得た後、このジヒドロテトラベナジンの脱水によって調製することができる。テトラベナジンの還元は、水素化アルミニウムリチウムのような水素化アルミニウム試薬、または水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムまたは水素化ホウ素誘導体、例えばトリ第二ブチル水素化ホウ素リチウムのようなアルキル水素化ホウ素などの水素化ホウ素試薬を用いて行うことができる。あるいは、還元工程を、例えばラネーニッケルまたは酸化白金触媒上での接触水素化を用いて行うことができる。還元工程を行うのに適する条件は、下記に更に詳細に説明しており、または米国特許第２，８４３，５９１号明細書（Hoffmann-La Roche）およびBrossi et al, Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, ppl793-1806 (1958)に見出すことができる。
【００６６】
還元反応の出発材料として用いられるテトラベナジンは、典型的にはＲＲとＳＳ異性体の混合物（すなわち、トランス−テトラベナジン）であるので、還元工程によって形成されたジヒドロテトラベナジンは３および１１ｂ位について同じトランス配置を有し、上記図３に示されている既知のジヒドロテトラベナジン異性体の１以上の形態をとる。従って、方法Ａは、ジヒドロテトラベナジンの既知異性体をとり、それらを脱水してアルケン（ＩＩ）を形成した後、本発明の求める新規なシスジヒドロテトラベナジン異性体を生じる条件を用いてアルケン（ＩＩ）を「再水和する」ことを含むことがある。
【００６７】
ジヒドロテトラベナジンのアルケン（ＩＩ）への脱水は、アルコールを脱水してアルケンを形成するための様々な標準的条件を用いて行うことができ、例えばＪ． Ｍａｒｃｈ （上記引用）， ３８９−３９０頁およびそこに引用されている文献を参照されたい。このような条件の例としては、ハロゲン化リンまたはオキシハロゲン化リンのようなリンを基剤とする脱水剤、例えばＰＯＣｌ３およびＰＣｌ５の使用が挙げられる。直接脱水法に代わるものとしては、ジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をハロゲン（例えば、塩素または臭素）のような脱離基Ｌに転換した後、Ｈ−Ｌを除去するための条件（例えば、塩基の存在）に付することができる。ヒドロキシル基のハロゲン化物への転換は、熟練化学者には周知の方法を用いて、例えばトリフェニルホスフィンまたはトリブチルホスフィンのようなトリアルキルまたはトリアリールホスフィンの存在下で四塩化炭素または四臭化炭素と反応させることによって行うことができる。
【００６８】
ジヒドロテトラベナジンを得る還元のための出発材料として用いられるテトラベナジンは、商業的に得ることができ、または米国特許第２，８３０，９９３号（Hoffmann-La Roche）に記載の方法によって合成することができる。
【００６９】
本発明のジヒドロテトラベナジンを調製するためのもう一つの方法（方法Ｂ）は、式（ＩＩＩ）
【化１０】
の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物における２，３−エポキシド基を開環する条件に付した後、必要ならば所望のジヒドロテトラベナジン異性体形態を分離して単離することを含んでなる。
【００７０】
開環は、エポキシド開環の既知の方法によって行うことができる。しかしながら、エポキシドの開環の現在好ましい方法は、ボラン−ＴＨＦのような還元剤を用いて行うことができる還元的開環である。ボラン−ＴＨＦとの反応は、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン）のような極性の非プロトン性溶媒中で通常は周囲温度で行い、このようにして生成したボラン複合体を次に水と塩基の存在下にて溶媒の還流温度で加熱することによって加水分解することができる。方法Ｂは、典型的には２−および３−位の水素原子がシス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体を生じさせる。
【００７１】
式（ＩＩＩ）のエポキシド化合物は、上記式（ＩＩ）のアルケンエポキシ化によって調製することができる。エポキシ化反応は、熟練化学者には周知の条件および試薬を用いて行うことができ、例えばJ. March （上記引用）， 826-829頁およびそこに引用されている文献を参照されたい。典型的には、メタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）のような過酸または過酸と過塩素酸のような別の酸化剤との混合物を用いて、エポキシ化を行うことができる。
【００７２】
上記方法ＡおよびＢの出発材料が鏡像異性体の混合物であるときには、これらの方法の生成物は典型的には鏡像異性体の対、例えば、可能であれば、ジアステレオ異性体不純物とのラセミ混合物となる。好ましくないジアステレオ異性体はクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）のような手法によって除去することができ、個々の鏡像異性体は熟練化学者に知られている様々な方法によって分離することができる。例えば、それらは
（ｉ） キラルクロマトグラフィー（キラル支持体上でのクロマトグラフィー）、または
（ｉｉ） 光学的に純粋なキラル酸と塩を形成し、２種類のジアステレオ異性体の塩を分別結晶によって分離した後、その塩からジヒドロテトラベナジンを放出すること、または
（ｉｉｉ） 光学的に純粋なキラル誘導剤（例えば、エステル化剤）を用いて誘導体（例えば、エステル）を形成し、生成されるエピマーを（例えば、クロマトグラフィーによって）分離した後、この誘導体をジヒドロテトラベナジンに転換すること
によって分離することができる。
【００７３】
方法ＡおよびＢのそれぞれから得られる鏡像異性体の対を分離する１つの方法であって、特に有効であることが見出された方法は、ジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をモッシャーの酸（Ｍｏｓｈｅｒ’ｓ ａｃｉｄ）の光学活性形態、例えば下記に示されるＲ（＋）異性体
【化１１】
またはその活性形態でエステル化することである。
【００７４】
ジヒドロベナジンの２つの鏡像異性体の生成されるエステルはクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって分離することができ、分離したエステルをメタノールのような極性溶媒中でアルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ）のような塩基を用いて加水分解して個々のジヒドロベナジン異性体を得ることができる。
【００７５】
方法ＡおよびＢにおいて出発材料として鏡像異性体の混合物を用いた後、続いて鏡像異性体を分離する方法の代替法として、方法ＡおよびＢをそれぞれ単一の鏡像異性体出発材料について行うことで単一鏡像異性体が優勢である生成物を生じることができる。アルケン（ＩＩ）の単一鏡像異性体は、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンにトリ第二ブチル水素化ホウ素リチウムを用いて立体選択的還元を行ってジヒドロテトラベナジンのＳＲＲおよびＲＳＳ鏡像異性体の混合物を得て、鏡像異性体を（例えば、分別結晶によって）分離した後、ジヒドロテトラベナジンの分離した単一鏡像異性体を脱水し、式（ＩＩ）の化合物の単一鏡像異性体を優勢にまたは独占的に得ることによって調製することができる。
【００７６】
方法ＡおよびＢを、それぞれスキーム１および２で更に詳細に説明する。
【化１２】
【００７７】
スキーム１は、２−および３−位に結合している水素原子がトランス相対配向で配列されている２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の調製を示す。この反応スキームは、上記で定義した工程Ａを包含する。
【００７８】
スキーム１における反応の順序についての出発点は、テトラベナジンのＲＲおよびＳＳ光学異性体のラセミ混合物である市販のテトラベナジン（ＩＶ）である。ＲＲおよびＳＳ異性体のそれぞれにおいて、３−および１１ｂ−位の水素原子はトランス相対配向に配列されている。市販の化合物を用いる代わりに、テトラベナジンを米国特許第２，８３０，９９３号に記載の手順に従って合成することができる（詳細には、実施例１１を参照）。
【００７９】
ＲＲおよびＳＳテトラベナジンのラセミ混合物を水素化ホウ素還元剤トリ第二ブチル水素化ホウ素リチウム（「Ｌ−セレクトリド」）を用いて還元すると、ジヒドロテトラベナジンの既知の２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体（Ｖ）の混合物が得られるが、便宜上２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体のみが示されている。水素化ホウ素ナトリウムよりも立体的要求の厳しいＬ−セレクトリドを水素化ホウ素還元剤として用いることによって、ジヒドロテトラベナジンのＲＲＲおよびＳＳＳ異性体の形成は最小限になるかまたは抑制される。
【００８０】
ジヒドロテトラベナジン異性体（Ｖ）を、塩素化炭化水素（例えば、クロロホルムまたはジクロロメタン、好ましくはジクロロメタン）のような非プロトン性溶媒中で五塩化リンのような脱水剤と反応させて、不飽和化合物（ＩＩ）を鏡像異性体の対として形成させるが、スキームにはそのＲ−鏡像異性体のみが示されている。脱水反応は、典型的には室温より低い温度、例えば約０−５℃で行われる。
【００８１】
次に、不飽和化合物（ＩＩ）を立体選択的再水和に供し、ジヒドロテトラベナジン（ＶＩ）およびその鏡像または対掌体（図示せず）であって、３−および１１ｂ−位の水素原子がシス相対配向に配列されており、かつ２−および３−位の水素原子がトランス相対配向に配列されているものを生成する。立体選択的再水和は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でボラン−ＴＨＦを用いるヒドロホウ素化手順によって行って中間体ボラン複合体（図示せず）を形成させた後、水酸化ナトリウムのような塩基の存在下にて過酸化水素で酸化する。
【００８２】
次に、最初の精製工程を（例えば、ＨＰＬＣによって）行って、再水和反応順序の生成物（Ｖ）を２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得ることができるが、工程図には２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体のみが示されている。異性体を分離するため、混合物をジクロロメタン中で塩化オキサリルおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下でＲ（＋）モッシャーの酸で処理して、ジアステレオ異性体エステル（ＶＩＩ）の対（１個のジアステレオ異性体のみが示されている）を得て、これを次にＨＰＬＣを用いて分離することができる。次いで、個々のエステルを水酸化ナトリウムのようなアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解して、単一異性体（ＶＩ）を得ることができる。
【００８３】
スキーム１に示されている工程の順序の変形では、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元の後に生成するジヒドロテトラベナジン（Ｖ）の鏡像異性体の混合物を分離して、個々の鏡像異性体を得ることができる。分離は、（＋）または（−）カンファースルホン酸のようなキラル酸で塩を形成し、生成されたジアステレオ異性体を分別結晶によって分離し、単一鏡像異性体の塩を得た後、その塩から遊離塩基を取り出すことによって行うことができる。
【００８４】
分離したジヒドロテトラベナジン鏡像異性体を脱水して、アルケン（ＩＩ）の単一鏡像異性体を得ることができる。次いで、アルケン（ＩＩ）の再水和により、シス−ジヒドロテトラベナジン（ＶＩ）の単一鏡像異性体が優勢にまたは独占的に得られる。この変形の利点は、モッシャーの酸のエステルの形成を含まないので、モッシャーの酸のエステルを分離するのに典型的に用いられるクロマトグラフィー分離を行う必要がないことである。
【００８５】
スキーム２は、２−および３−位に結合した水素原子がシス相対配向で配列されている２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の調製を示している。この反応スキームは、上記で定義した工程Ｂを含む。
【化１３】
【００８６】
スキーム２において、不飽和化合物（ＩＩ）をテトラベナジンを還元して生成させてジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体（Ｖ）を得て、スキーム１に上記した方法でＰＣｌ５を用いて脱水する。しかしながら、化合物（ＩＩ）をヒドロホウ素化に供す代わりに、２，３−二重結合をメタクロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）と過塩素酸と反応させることによってエポキシドに転換する。エポキシ化反応は、メタノールのようなアルコール溶媒中で、典型的には室温附近で好都合に行われる。
【００８７】
次に、エポキシド（ＶＩＩ）に、ボラン−ＴＨＦを親電子性還元剤として用いて還元的開環を行って中間体ボラン複合体（図示せず）を得て、これを次に水酸化ナトリウムのようなアルカリの存在下にて過酸化水素で酸化して開裂させ、ジヒドロテトラベナジン（ＶＩＩＩ）を２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得ることができるが、便宜上２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲのみが示されている。異性体（ＶＩＩＩ）の混合物をジクロロメタン中で塩化オキサリルとジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下にてＲ（＋）モッシャーの酸で処理すると、エピマーエステル（ＩＸ）の対（スキームには、１つのエピマーのみが示されている）が得られ、これを次にクロマトグラフィーによって分離し、スキーム１に関して上記した方法でメタノール中にて水酸化ナトリウムで加水分解することができる。
【００８８】
生物学的活性
本発明のシス−ジヒドロテトラベナジン化合物は、下記の実施例に例示されているように、シグマ−１およびシグマ−２受容体のいずれにも結合する。シス−ジヒドロテトラベナジンの４個の異性体は、シグマ−２に対するリガンドとしてほぼ等しい能力を有するが、異性体ＢとＤは異性体ＡおよびＣよりも強くシグマ−１受容体に結合する。
【００８９】
本発明のシス−ジヒドロテトラベナジン化合物は、そのシグマ受容体結合活性により、腫瘍細胞の増殖の阻害または予防に有用であると考えられる。
【００９０】
化合物が腫瘍細胞の増殖を阻害しまたは防止する能力は、例えば下記の実施例６に記載の方法でまたはSpruce et al., Cancer Research, (2004), 64:4875-4886に記載の方法を用いて、化合物を様々な腫瘍細胞系に対して試験することによって測定することができる。
【００９１】
細胞系に対するイン・ビトロでの検討に加えて、本発明の化合物は、免疫不全のマウスでのヒト腫瘍キセノグラフで、例えば、Spruce et al., (2004), p. 487で記載されているようにイン・ビボで試験することもできる。
【００９２】
本発明の化合物は、抗炎症薬としての活性を有するとも考えられる。化合物の抗炎症活性は、熟練者に周知の様々な方法を用いて試験することができる。
【００９３】
本発明の化合物の関節炎を治療する能力は、下記の検定法およびモデルの任意の１つ以上で明らかにすることができる：
（ｉ） Kakimoto et al., Cell Immunol. 142: 326-337, 1992に記載のネズミコラーゲン誘導関節炎モデル。
（ｉｉ） Knoerzer et al., Toxicol. Pathol. 25:13-19, 1997に記載のラットコラーゲン誘導関節炎モデル。
（ｉｉｉ） Halloran et al., Arthritis Rheum. 39:810-819, 1996に記載のラットアジュバント関節炎モデル。
（ｉｖ） Schimmer, et al., J. Immunol. 160: 1466-1477, 1998に記載のラット連鎖球菌細胞壁誘導関節炎モデル。
（ｖ） Oppenheimer-Marks et al., J. Clin. Invest. 101:1261-1272, 1998に記載のＳＣＩＤマウスヒト関節リウマチモデル。
【００９４】
本発明の化合物が炎症性肺損傷を治療する能力は、下記の分析法および検定モデルによって明らかにすることができる：
（ｖｉ） Wegner et al., Lung 170:267-279, 1992に記載のネズミ酸素誘導肺損傷モデル。
（ｖｉｉ） Mulligan et al., J. Immunol. 154:1350-1363, 1995に記載のネズミ免疫複合体誘導肺損傷モデル。
（ｖｉｉｉ） Nagase et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154:504-510, 1996に記載のネズミ酸誘導肺損傷モデル。
【００９５】
本発明の化合物の炎症性腸疾患を治療する能力は、Bennet et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:988-1000, 1997に記載のウサギ化学誘導大腸炎モデルで明らかにすることができる。
【００９６】
本発明の化合物の炎症性肝臓損傷を治療する能力は、Tanaka et al., J. Immunol. 151:5088-5095, 1993に記載のネズミ肝臓損傷モデルで明らかにすることができる。
【００９７】
本発明の化合物の炎症性糸球体損傷を治療する能力は、Kawasaki, et al., J. Immunol 150:1074-1083, 1993に記載のラット腎毒性血清腎炎モデルで明らかにすることができる。
【００９８】
本発明の化合物の抗炎症活性は、下記の実施例に記載されているように炎症促進性サイトカインの産生を減少させ、かつＴ−細胞増殖を阻害する能力によっても示される。
【００９９】
医薬処方物
ジヒドロテトラベナジン化合物は、典型的には医薬組成物の形態で投与される。
【０１００】
医薬組成物は、経口、非経口、局所、鼻内、気管支内、眼、耳、直腸、膣内、または経皮投与に適する任意の形態とすることができる。組成物を非経口投与使用とする場合には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与用に、または注射、輸液または他の送達手段によって標的器官または組織へ直接送達する目的で処方することができる。
【０１０１】
経口投与に適する医薬の剤形としては、錠剤、カプセル、キャブレッツ、ピル、ロゼンジ、シロップ、溶液、スプレー、散剤、顆粒、エリキシルおよび懸濁液、舌下錠、スプレー、カシェ剤、またはパッチおよびバッカルパッチが挙げられる。
【０１０２】
本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を含有する医薬組成物は、既知手法によって処方することができ、例えば「レミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， イーストン， ペンシルバニア， 米国を参照されたい。
【０１０３】
例えば、錠剤組成物は、単位投薬量の活性化合物を、糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、スクロース、ソルビトールまたはマンニトールのような不活性希釈剤またはキャリヤー、および／または炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、タルク、炭酸カルシウムのような糖以外から誘導した希釈剤、またはメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トウモロコシ澱粉のような澱粉などのセルロースまたはその誘導体と共に含むことができる。錠剤は、ポリビニルピロリドンのような結合および造粒剤、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチルセルロースのような膨潤性の架橋ポリマー）、滑沢剤（例えば、ステアレート）、防腐剤（例えば、パラベン）、酸化防止剤（例えば、ＢＨＴ）、緩衝剤（例えば、リン酸またはクエン酸緩衝剤）、クエン酸／重炭酸塩混合物のような起泡剤などの標準的成分を含むこともできる。このような賦形剤は周知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。
【０１０４】
カプセル処方物は硬質ゼラチンまたは軟質ゼラチンの種類であることがあり、活性成分を固体、半固体または液体形態で含むことができる。ゼラチンカプセルは、動物ゼラチンまたはその合成または植物由来の同等なものから形成することができる。
【０１０５】
固体剤形（例えば、錠剤、カプセルなど）はコーティングを行ってもよく、またはコーティングを行わなくてもよいが、典型的にはコーティング、例えば保護フィルムコーティング（例えば、ワックスまたはワニス）または放出制御コーティングを有する。コーティング（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）型ポリマー）は、消化管内の所望な部位で活性成分を放出するようにデザインすることができる。従って、コーティングは、消化管内の一定のｐＨ条件下で崩壊させることによって化合物を胃、または回腸、または十二指腸に選択的に放出するように選択することができる。
【０１０６】
コーティングの代わりに、または加えて、薬剤は、放出制御剤、例えば消化管での変化する酸性またはアルカリ性の条件下で化合物を選択的に放出するのに適合させることができる放出遅延剤、を含んでなる固体マトリックスで提示することができる。あるいは、マトリックス材料または放出遅延コーティングは、剤形が消化管を通過するときに実質的に連続的に侵食される侵食性ポリマー（例えば、無水マレイン酸ポリマー）の形態をとることができる。
【０１０７】
局所使用の組成物としては、軟膏、クリーム、スプレー、パッチ、ゲル、液滴およびインサート（例えば、眼内インサート）が挙げられる。このような組成物は、既知の方法によって処方することができる。
【０１０８】
非経口投与用の組成物は、典型的には滅菌水性または油性溶液または微細懸濁液として提示され、または注射用滅菌水でその場で作製するための細かく分割された滅菌粉末形態で提供することができる。
【０１０９】
直腸または膣内投与用の処方物の例としては、例えば、活性化合物を含む成形可能なまたはワキシー材料から形成することができる膣座薬または座薬が挙げられる。
【０１１０】
吸入投与用の組成物は、吸入可能な粉末組成物または液体もしくは粉末スプレーの形態をとることができ、粉末吸入装置またはエアゾール調剤装置を用いて標準的形態で投与することができる。このような装置は周知である。吸入による投与には、粉末化処方物は、典型的には活性化合物をラクトースのような不活性固体の粉末化希釈剤と共に含んでなる。
【０１１１】
本発明の化合物は一般的には単位剤形で提示され、それ自体は所望なレベルの生物学的活性を提供するのに十分な化合物を含む。例えば、経口投与を目的とする処方物は、活性成分を２ｍｇ〜２００ｍｇ、より普通には１０ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば１２．５ｍｇ、２５ｍｇおよび５０ｍｇ含むことができる。
【０１１２】
活性化合物は、それを必要とする患者（例えば、ヒトまたは動物患者）に所望な治療効果を得るのに十分な量で投与される。
【０１１３】
このような投与を必要としている人は、典型的には、上記で定義した癌のような増殖性疾患または炎症性疾患に罹っているまたは罹る危険性のある患者である。
【０１１４】
化合物は、典型的には、治療上または予防上有用でありかつ通常は毒性のない量で投与される。しかしながら、状況によっては、特に癌治療の場合には、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を投与する利益は、如何なる毒性作用や副作用の不利益より重要であることがあり、このような場合には、毒性の程度と関連した量で化合物を投与するのが望ましいと考えることができる。
【０１１５】
化合物の典型的な一日用量は１０００ｍｇ／日以下、例えば、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、更に通常は０．０２５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、３ｍｇ／ｋｇ体重、更に典型的には０．１５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができるが、必要ならばこれより多いまたは少ない用量を投与することができる。
【０１１６】
癌の治療には、式（Ｉ）の化合物を単独の治療薬として投与することができ、またはそれらを特定の疾患状態、例えば上記で定義した癌、の治療用の１以上の他の化合物との組合せ療法で投与することができる。式（Ｉ）の化合物と共に（同時にまたは異なる時間間隔で）用いるまたは投与することができる他の治療薬および方法の例としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定されない：
・トポイソメラーゼＩ阻害薬（例えば、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、イリノテカンおよびＣＰＴ１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）のようなカンプトテシン化合物）。
・代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、ゲンシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ラルチトレキシド（Ｔｏｍｕｄｅｘ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、ペメトレキシド（Ａｌｉｍｔａ）、シタラビンまたはシトシンアラビノシドまたはアラビノシルシトシン［ＡｒａＣ］（Ｃｙｔｏｓａｒ（登録商標））、メトトレキサート（Ｍａｔｒｅｘ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）、およびテガフールのような抗腫瘍ヌクレオシド）。
・チューブリンターゲッティング薬（例えば、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂｅ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）のようなビンカアルカロイド、ビンブラスチンおよびタキサン化合物）。
・ＤＮＡ結合薬およびトポＩＩ阻害薬（例えば、エトポシド（Ｅｐｏｓｉｎ， Ｅｔｏｐｈｏｓ， Ｖｅｐｅｓｉｄ， ＶＰ−１６）、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ， ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）、エピルビシン（Ｐｈａｒｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎｅ， Ｄｏｘｉｌ， Ｒｕｂｅｘ）、イダルビシン（Ｚａｖｅｄｏｓ）、ペジル化リポソームドキソルビシン塩酸塩（Ｃａｅｙｌｘ）、リポソームカプセル化ドキソルビシンクエン酸塩（Ｍｙｏｃｅｔ）、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｔｒｏｎｅ， Ｏｎｋｏｔｒｏｎｅ）のようなポドフィロトキシン誘導体およびアントラサイクリン誘導体）。
・アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎａ）、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、イフォスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ Ｋｙｏｍａ）のような窒素マスタードまたはニトロソウレアアルキル化剤およびアジリジン）。
・アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）およびオキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）のような白金化合物）。
・モノクローナル抗体（例えば、ＥＧＦファミリーおよびその受容体、およびＶＥＧＦファミリーおよびその受容体、更に具体的にはトラスツヅマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）およびベバシツマブ（Ａｖａｓｔｉｎ））。
・抗ホルモン薬（例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ Ｄ， Ｓｏｌｔａｍｏｘ， Ｔａｍｏｆｅｎ）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、ドロロキシフェン、レトラゾール（Ｆｅｍａｒａ）、アナストラゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）、ボロゾール（Ｒｉｖｉｚｏｒ）、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ， Ｃｏｓｕｄｅｘ）、ルプロリド（Ｚｏｌａｄｅｘ）、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）、アミノグルテチミド（Ｃｙｔａｄｒｅｎ）およびベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）のような抗エストロゲン薬（例えば、アロマターゼ阻害薬）などの抗アンドロゲン薬）。
・シグナル伝達阻害薬（ゲフチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）およびセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）など）。
・ボルテジミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）などのプロテアーゼ阻害薬。
・テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ。
・インターフェロンα（ＩｎｔｒｏｎＡ， Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ）、インターロイキン２（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ， Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）および総てのトランスレチノイン酸［ＡＴＲＡ］またはトレチノイン（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）などのサイトカインおよびレチノイド。
・放射線療法。
【０１１７】
本発明の化合物を併用療法において他の治療薬または治療方法と共に投与する場合には、２以上の治療法を個々に種々の用量計画で、かつ異なる経路で行うことができる。
【０１１８】
本発明の化合物を併用療法において１以上の他の治療薬と共に投与する場合には、化合物を同時にまたは順次に投与することができる。順次に投与する場合には、間隔を狭めて（例えば、５〜１０分間以上）または長めの間隔で（例えば、１、２、３、４時間以上離して、または必要ならば更に長時間離して）投与することができるが、正確な投薬法は（複数の）治療薬の特性に対応する。
【０１１９】
本発明の化合物は、放射線療法、光ダイナミック療法、遺伝子療法、手術および食事管理のような化学療法以外の治療法と共に投与することもできる。
【０１２０】
別の化学療法薬と共に併用療法で用いるには、本発明の化合物と１、２、３、４種類以上の他の治療薬を、例えば２、３、４種類以上の治療薬を含む投薬形態で一緒に処方することができる。あるいは、個々の治療薬を別々に処方し、キットの形態で、場合によってはその使用説明書と共に提示することができる。
【０１２１】
実施例
下記の非制限的実施例により、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物の合成および特性を説明する。
【０１２２】
実施例１
ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ１１ｂＳ異性体の調製
１Ａ． ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元
【化１４】
テトラヒドロフラン中の１Ｍ Ｌ−セレクトリド（登録商標）（１３５ｍｌ，１３５ミリモル，２．８７当量）を、３０分間かけてテトラベナジンＲＲ／ＳＳラセミ体（１５ｇ，４７ミリモル）のエタノール（７５ｍｌ）とテトラヒドロフラン（７５ｍｌ）の攪拌溶液に０℃で徐々に加えた。添加を完了した後、混合物を０℃で３０分間攪拌し、次いで室温まで温度を上昇させた。
【０１２３】
混合物を粉砕氷（３００ｇ）上に空けて、水（１００ｍｌ）を加えた。溶液をジエチルエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出し、合わせたエーテル抽出物を水（１００ｍｌ）で洗浄し、無水炭酸カリウム上で部分乾燥した。無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥を完了し、濾過した後、溶媒を減圧留去し（遮光，槽温度＜２０℃）、淡黄色固形物を得た。
【０１２４】
固体を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にし、濾過して、白色粉末状固形物（１２ｇ，８０％）を得た。
【０１２５】
１Ｂ． 還元テトラベナジンの脱水
【化１５】
五塩化リン（３２．８ｇ，１５７．５ミリモル，２．５当量）を、３０分間かけて実施例１Ａからの還元テトラベナジン生成物（２０ｇ，６２．７ミリモル）のジクロロメタン（２００ｍｌ）の攪拌溶液に０℃で分割して加えた。添加を完了した後、反応混合物を０℃で更に３０分間攪拌し、溶液を粉砕氷を含む２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（０℃）に徐々に空けた。初期の酸ガス発生が止んだら、混合物を固形炭酸ナトリウムを用いて塩基性（約ｐＨ１２）にした。
【０１２６】
アルカリ性溶液を酢酸エチル（８００ｍｌ）を用いて抽出し、合わせた有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を減圧留去して褐色油状生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製し、半純粋アルケンを黄色固形物として得た（１０．８７ｇ，５８％）。
【０１２７】
１Ｃ． 実施例１Ｂからの粗アルケンの水和
【化１６】
実施例１Ｂからの粗アルケン（１０．８７ｇ，３６．１１ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（５２ｍｌ）に室温で溶解したものに、１Ｍボラン−ＴＨＦ（１５５．６ｍｌ，１５５．６ミリモル，４．３０当量）を滴加して処理した。反応を２時間攪拌し、水（２０ｍｌ）を加え、溶液を３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２の塩基性にした。
【０１２８】
３０％過酸化水素水溶液（３０ｍｌ）を攪拌アルカリ性反応混合物に加え、溶液を加熱して１時間還流した後、放冷した。水（１００ｍｌ）を加え、混合物を酢酸エチル（３ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去して黄色油状生成物（９ｇ）を得た。
【０１２９】
油状生成物を調製用ＨＰＬＣ（カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：エタノール：ジクロロメタン（８５：１５：５）；ＵＶ ２５４ｎｍ，流速：１０ｍｌ分−１）を用いて３５０ｍｇ／注入で精製した後、目的とする画分を真空濃縮した。生成された油状物を次にエーテルに溶解し、再度真空濃縮して、上記に示したジヒドロテトラベナジンラセミ体を黄色フォーム（５．７６ｇ，５０％）として得た。
【０１３０】
１Ｄ． モッシャーエステル誘導体の調製
【化１７】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（５ｇ，２１．３５ミリモル）、塩化オキサリル（２．０２ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１６ｍｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に加え、溶液を室温で４５分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を再度無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解した。生成された溶液を氷−水槽を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．８３ｇ，３１．３４ミリモル）を加えた後、実施例１Ｃの固体生成物（５ｇ，１５．６ミリモル）を予備乾燥した（４Å篩上）無水ジクロロメタンに溶解したものを加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加え、混合物をエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、シリカのパッドを通し、生成物をエーテルを用いて溶出させた。
【０１３１】
集めたエーテル溶出物を減圧濃縮して油状生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１０：１））を用いて精製した。集めた目的のカラム画分を蒸発させて溶媒を減圧で留去したところ、固形物を得て、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：酢酸エチル（１：１））を用いて更に精製し、３つの主成分が得られ、これらを部分的にモッシャーエステルピーク１および２に分割した。
【０１３２】
３００ｍｇの装填量での３成分の調製用ＨＰＬＣ（カラム：２ｘＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９７：３），ＵＶ ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ分−１）の後、目的画分を真空濃縮したところ、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１ （３．８９ｇ，４６．５％）
ピーク２ （２．７８ｇ，３３％）
【０１３３】
２つのピークに対応する画分に加水分解を施し、異性体ＡおよびＢとして同定され特性決定された個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離した。異性体ＡおよびＢは、それぞれ下記の構造の１つを有すると思われる。
【化１８】
【０１３４】
更に具体的には、異性体Ｂは、下記の実施例４に記載のＸ線結晶学実験に基づいて２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ絶対配置を有すると思われる。
【０１３５】
１Ｅ． ピーク１の加水分解による異性体Ａの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（８７．５ｍｌ）をモッシャーのエステルピーク１（３．８９ｇ，７．２７ミリモル）をメタノール（２６０ｍｌ）に溶解したものに加え、混合物を攪拌加熱して１５０分間還流させた。室温まで冷却した後、水（２００ｍｌ）を加え、溶液をエーテル（６００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。
【０１３６】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解し、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮し、黄色フォームを得た。この材料を、カラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（１：１）−酢酸エチルの勾配溶出）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣をエーテルに溶解させ、溶媒を再度減圧留去し、異性体Ａを灰白色フォーム（１．１ｇ，４７％）として得た。
【０１３７】
２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有すると思われる（絶対立体化学は決定しなかった）異性体Ａを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＡのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表３に示す。
【０１３８】
１Ｆ． ピーク２の加水分解による異性体Ｂの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（６２．５ｍｌ）をモッシャーのエステルピーク２（２．７８ｇ，５．１９ミリモル）をメタノール（１８５ｍｌ）に溶解したものに加え、混合物を攪拌加熱して１５０分間還流させた。室温まで冷却した後、水（１４２ｍｌ）を加え、溶液をエーテル（４４０ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。
【０１３９】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解させ、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、減圧濃縮した。石油エーテル（３０〜４０℃）を残渣に加え、溶液を再度真空濃縮し、異性体Ｂを白色フォーム（１．３４ｇ，８１％）として得た。
【０１４０】
２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ配置を有すると思われる異性体Ｂを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣ、ＯＲＤおよびＸ線結晶学によって特性決定した。異性体ＢのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータ表３に示す。Ｘ線結晶学データは、実施例４に示す。
【０１４１】
実施例２
ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の調製
２Ａ． ２，３−デヒドロテトラベナジンの調製
テトラヒドロフラン中にＲＲおよびＳＳテトラベナジン鏡像異性体のラセミ混合物（１５ｇ，４７ミリモル）を含む溶液を実施例１Ａの方法によってＬ−セレクトリド（登録商標）を用いて還元し、ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ鏡像異性体の混合物を白色粉末状固形物（１２ｇ，８０％）として得た。次に、部分精製したジヒドロテトラベナジンを実施例１Ｂの方法に従ってＰＣｌ５を用いて脱水し、２，３−デヒドロテトラベナジン１１ｂＲおよび１１ｂＳ異性体の半純粋混合物（その１１ｂＲ鏡像異性体を下記に示す）を黄色固形物（１２．９２ｇ，６８％）として得た。
【化１９】
【０１４２】
２Ｂ． 実施例２Ａからの粗アルケンのエポキシ化
【化２０】
実施例２Ａからの粗アルケン（１２，９２ｇ，４２．９ミリモル）をメタノール（２１５ｍｌ）に攪拌溶解したものに７０％過塩素酸（３．７０ｍｌ，４３ミリモル）をメタノール（２１５ｍｌ）に溶解したものに加えた。７７％ ３−クロロ過安息香酸（１５．５０ｇ，６５ミリモル）を反応に加え、生成された混合物を室温遮光下で１８時間攪拌した。
【０１４３】
反応混合物を飽和亜硫酸ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）に空けて、水（２００ｍｌ）を加えた。クロロホルム（３００ｍｌ）を生成エマルションに加え、混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）で塩基性にした。
【０１４４】
有機層を集めて、水相を追加のクロロホルム（２ｘ１５０ｍｌ）で洗浄した。合わせたクロロホルム層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去して、褐色油状物（１４．３５ｇ，収率＞１００％ 溶媒が生成物に残っていると思われる）を得た。この材料を、更に精製することなく用いた。
【０１４５】
２Ｃ． ２Ｂからのエポキシドの還元的開環
【化２１】
実施例２Ｂからの粗エポキシド（１４．３５ｇ，４２．９ミリモル，１００％収率と仮定）を乾燥ＴＨＦ（８０ｍｌ）に攪拌溶解したものを、１Ｍボラン／ＴＨＦ（１８４．６ｍｌ，１８４．６ミリモル）で１５分間かけて徐々に処理した。反応を２時間攪拌し、水（６５ｍｌ）を加えて、溶液を攪拌加熱により３０分間還流した。
【０１４６】
冷却後、３０％水酸化ナトリウム溶液（９７ｍｌ）を反応混合物に加えた後、３０％過酸化水素溶液（４８．６ｍｌ）を加え、反応を攪拌および加熱により更に１時間還流した。
【０１４７】
冷却した反応混合物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出し、濾過した後、溶媒を減圧留去し、油状物を得た。ヘキサン（２３０ｍｌ）を油状物に加え、溶液を再度減圧濃縮した。
【０１４８】
油状残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、酢酸エチル）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣を、カラムクロマトグラフィー（シリカ，勾配，ヘキサン−エーテル）を用いて再度精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去し、淡黄色固形物（５．１８ｇ，３８％）を得た。
【０１４９】
２Ｄ． ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体のモッシャーエステル誘導体の調製
【化２２】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（４．６８ｇ，１９．９８ミリモル）、塩化オキサリル（１．９０ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１３ｍｌ）を無水ジクロロメタン（４６ｍｌ）に加え、溶液を室温で４５分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、残渣を再度無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解した。生成する溶液を氷−水槽を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．６５ｇ，２９．８７ミリモル）を加えた後、実施例２Ｃ（４．６８ｇ，１４．６ミリモル）の固体生成物を予備乾燥した（４Å篩上）無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解したものを加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加えて、混合物をエーテル（２ｘ２００ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、シリカのパッドを通し、生成物をエーテルを用いて溶出させた。
【０１５０】
集めたエーテル溶出物を減圧濃縮して、油状物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１：１））を用いて精製した。集めた目的のカラム画分を蒸発させて溶媒を減圧で留去したところ、淡紅色固形物（６．５３ｇ）を得た。
【０１５１】
１００ｍｇの装填量での固形物の調製用ＨＰＬＣ（カラム：２ｘＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉ６０，５μｍ，２５０ｘ２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９７：３），ＵＶ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ分−１）の後、目的画分を真空濃縮したところ、固形物が得られ、これを石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にして、濾過によって集め、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１ （２．３７ｇ，３０％）
ピーク２ （２．４２ｇ，３０％）
【０１５２】
２つのピークに対応する画分を加水分解して、異性体ＣおよびＤとして同定され特性決定された個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離した。異性体ＣおよびＤは、それぞれ下記の構造
【化２３】
を有すると思われる。
【０１５３】
２Ｆ． ピーク１の加水分解による異性体Ｃの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を、モッシャーエステルピーク１（２．３７ｇ，４．４３ミリモル）をメタノール（１５８ｍｌ）に攪拌溶解したものに加え、混合物を還流温度で１５０分間攪拌した。冷却後、水（８８ｍｌ）を反応混合物に加え、生成する溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。酢酸エチル（２００ｍｌ）を残渣に加え、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。
【０１５４】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、生成する懸濁固形物を濾過によって集めた。濾液を減圧濃縮し、懸濁固形物の第二のバッチを濾過によって集めた。両方の集めた固形物を合わせて、減圧乾燥し、異性体Ｃ（１．０ｇ，７０％）を得た。
【０１５５】
２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置（絶対立体化学は決定しなかった）のいずれかを有すると思われる異性体Ｃを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＣについてのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータは表４に示す。
【０１５６】
２Ｇ． ピーク２の加水分解による異性体Ｄの生成
２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を、モッシャーのエステルピーク２（２．４２ｇ，４．５２ミリモル）をメタノール（１５８ｍｌ）に攪拌溶解したものに加え、混合物を還流温度で１５０分間攪拌した。冷却後、水（８８ｍｌ）を反応混合物に加え、生成された溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。酢酸エチル（２００ｍｌ）を残渣に加え、溶液を水（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過した後、溶媒を減圧留去した。
【０１５７】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、生成された懸濁橙色固形物を濾過によって集めた。この固形物を酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）に溶解し、カラムクロマトグラフィー（シリカ，勾配：酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）−酢酸エチル）によって精製した。目的の画分を合わせて、溶媒を減圧留去した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリー状にし、生成する懸濁液を濾過によって集めた。集めた固形物を減圧乾燥し、異性体Ｄを白色固形物（０．９３ｇ，６４％）として得た。
【０１５８】
２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置（絶対立体化学は決定しなかった）のいずれかを有すると思われる異性体Ｄを、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析法、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤによって特性決定した。異性体ＤについてのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータは表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータは表４に示す。
【０１５９】
表１および２において、赤外スペクトルはＫＢｒディスク法を用いて決定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＭＲ分光計（２００ＭＨｚ．）を用いて重水素化クロロホルムの溶液について測定した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＭＲ分光計（５０ＭＨｚ）を用いて重水素化クロロホルムの溶液について測定した。質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ （ＥＳ＋条件）分光計を用いて得た。表３および４において、旋光分散曲線は、Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＰｏｌＡＡｒ ２００１装置を用いてメタノール溶液中で２４℃で得た。ＨＰＬＣ保持時間は、ＵＶ検出器を備えたＨＰ １０５０ ＨＰＬＣクロマトグラフィー装置を用いて測定した。
【０１６０】
表１および２： 分光データ
【表１】
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
表３および４： クロマトグラフィーおよびＯＲＤデータ
【表３】
【０１６３】
【表４】
【０１６４】
実施例３
異性体Ｂの調製およびメシレート塩の調製の代替法
３Ａ． ＲＲ／ＳＳ テトラベナジンの還元
【化２４】
１Ｍ Ｌ−セレクトリド（登録商標）をテトラヒドロフランに溶解したもの（５２ｍｌ，５２ミリモル，１．１当量）を、テトラベナジンラセミ体（１５ｇ，４７ミリモル）をテトラヒドロフラン（５６ｍｌ）に攪拌溶解して冷却したもの（氷槽）に３０分間かけて徐々に加えた。添加を完了した後、混合物を室温まで温度上昇させ、更に６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、出発材料が極めて微量しか残っていないことを示していた。
【０１６５】
混合物を、粉砕氷（１１２ｇ）、水（５６ｍｌ）および氷酢酸（１２．２ｇ）の攪拌混合物に空けた。生成される黄色溶液をエーテル（２ｘ５０ｍｌ）で洗浄し、固形炭酸ナトリウム（約１３ｇ）を徐々に加えて塩基性にした。石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を混合物に攪拌しながら加え、粗β−ＤＨＴＢＺを濾過によって白色固形物として集めた。
【０１６６】
粗固形物をジクロロメタン（約１５０ｍｌ）に溶解し、生成される溶液を水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、濾過して、約４０ｍｌまで減圧濃縮した。白色固形物の粘稠な懸濁液が、形成された。石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を加え、懸濁液を実験室温度で１５分間攪拌した。生成物を濾過によって集め、フィルター上で石油エーテル（３０〜４０℃）（４０〜６０ｍｌ）を用いて純白になるまで洗浄した後、室温で風乾し、β−ＤＨＴＢＺ（１０．１ｇ，６７％）を白色固形物として得た。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、１成分のみを示していた。
【０１６７】
３Ｂ． ラセミβ−ＤＨＴＢＺのカンファースルホン酸塩の調製および分別結晶
実施例３Ａの生成物と１当量の（Ｓ）−（＋）−カンファー−１０−スルホン酸を、最小限の量のメタノールに加熱しながら溶解した。生成される溶液を冷却した後、生成される固形物沈澱の形成が完了するまでエーテルで徐々に希釈した。生成される白色結晶性固形物を濾過によって集め、エーテルで洗浄した後、乾燥した。
【０１６８】
カンファースルホン酸塩（１０ｇ）を、高温絶対エタノール（１７０ｍｌ）およびメタノール（３０ｍｌ）の混合物に溶解した。生成される溶液を、攪拌して冷却した。２時間後、形成された沈澱を、白色結晶性固形物（２．９ｇ）として濾過によって集めた。結晶性材料の試料を、過剰の飽和炭酸ナトリウム水溶液およびジクロロメタンと共に分液漏斗中で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）を用いて磨砕し、有機溶液を再度濃縮した。この塩のＣｈｉｒｅｘ（Ｓ）−ＶＡＬおよび（Ｒ）−ＮＥＡ ２５０ｘ４．６ｍｍカラム、およびヘキサン：エタノール（９８：２）溶離剤を流速が１ｍｌ／分で用いるキラルＨＰＬＣ分析では、単離したβ−ＤＨＴＢＺは一方の鏡像異性体が豊富であった（ｅ．ｅ．約８０％）。
【０１６９】
豊富なカンファースルホン酸塩（１４ｇ）を高温の絶対エタノール（１４０ｍｌ）に溶解し、プロパン−２−オール（４２０ｍｌ）を加えた。生成される溶液を攪拌し、１分以内に沈澱が形成し始めた。混合物を室温まで冷却し、１時間攪拌した。形成された沈澱をを濾過によって集め、エーテルで洗浄し、乾燥して、白色結晶性固形物（１２ｇ）を得た。
【０１７０】
結晶性材料を、過剰量の飽和炭酸ナトリウム水溶液とジクロロメタンと共に分液漏斗中で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）を用いて磨砕し、有機溶液を再度濃縮し、（真空乾燥後に）（＋）−β−ＤＨＴＢＺ（６．６ｇ，ＯＲＤ＋１０７．８°）を得た。単離された鏡像異性体はｅ．ｅ．＞９７％である。
【０１７１】
３Ｃ． 異性体Ｂの調製
五塩化リン（４．５ｇ，２１．６ミリモル，１．０５当量）をジクロロメタン（５５ｍｌ）に溶解したものを、実施例３Ｂの生成物（６．６ｇ，２０．６ミリモル）をジクロロメタン（９０ｍｌ）に溶解して攪拌冷却したもの（氷水槽）に一定速度で１０分間かけて加えた。添加を完了したならば、生成される黄色溶液を更に１０分間攪拌した後、炭酸ナトリウム（１５ｇ）を水（９０ｍｌ）および粉砕氷（９０ｇ）に混合攪拌したものに素早く空けた。混合物を更に１０分間攪拌した後、分液漏斗に移した。
【０１７２】
相を分離したならば、褐色ジクロロメタン層を採りだし、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、減圧濃縮して、粗アルケン中間体を褐色油状物（約６．７ｇ）として得た。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、（＋）−β−ＤＨＴＢＺが粗生成物に残っていないことを示していた。
【０１７３】
粗アルケン（乾燥窒素雰囲気中）を無水テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）に溶解し、ボランをＴＨＦに溶解したもの（１Ｍ溶液，２．５当量，５２ｍｌ）を攪拌しながら１５分間かけて加えた。反応混合物を、次に室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、アルケン中間体が反応混合物に残っていないことを示していた。
【０１７４】
水酸化ナトリウム（３．７ｇ）を水（１０ｍｌ）に溶解したものを攪拌反応混合物に加えた後、過酸化水素水溶液（５０％，約７ｍｌ）を加え、形成された二相混合物を還流温度で１時間攪拌した。この時点での有機相のＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）は、異性体Ｂについて予想したＲｆを有する生成物の出現を示していた。特徴的な無極性成分も見られた。
【０１７５】
反応混合物を室温まで冷却し、分液漏斗に空けた。上部の有機層を採りだして減圧濃縮し、大半のＴＨＦを除去した。残渣をエーテル（安定化（ＢＨＴ），７５ｍｌ）に溶解し、水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過して、減圧濃縮し、淡黄色油状物（８．１ｇ）を得た。
【０１７６】
黄色油状物をカラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（８０：２０），１００％酢酸エチルまで増加）を用いて精製し、所望なカラム画分を集め、合わせて、減圧濃縮し、青白色油状物を得て、これをエーテル（安定化，１８ｍｌ）で処理し、減圧濃縮し、異性体Ｂを淡黄色固形フォーム（２．２ｇ）として得た。
【０１７７】
実施例３Ｂに示した条件を用いるキラルＨＰＬＣにより、異性体Ｂは９７％を上回る鏡像異性体過剰量（ｅ．ｅ．）で生成したことが明らかになった。
【０１７８】
旋光度をＢｅｌｌｉｎｇｈａｍ Ｓｔａｎｌｅｙ ＡＤＰ２２０旋光計を用いて測定し、［αＤ］＋１２３．５°を得た。
【０１７９】
３Ｄ． 異性体Ｂのメシレート塩の調製
異性体Ｂのメタンスルホン酸塩は、実施例３Ｃからの１当量の異性体Ｂと１当量のメタンスルホン酸の混合物を最小限の量のエタノールに溶解した後、ジエチルエーテルを加えることによって調製した。形成される白色沈澱を濾過によって集め、真空乾燥して、メシレート塩を収率約８５％および純度（ＨＰＬＣによる）約９６％で得た。
【０１８０】
実施例４
異性体ＢについてのＸ線結晶学的検討
異性体Ｂの（Ｓ）−（＋）−カンファー−１０−スルホン酸塩を調製し、単結晶について下記の条件下でＸ線結晶学的検討を行った。
回折計： Ｎｏｎｉｕｓ ＫａｐｐａＣＣＤ領域検出器（ｔ／ｉスキャンおよびＯＪスキャンによる非対称性ユニットを満たす）
セル決定（Ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）： ＤｉｒＡｘ （Duisenberg, A.J.M.(1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96.）
データ収集： Ｃｏｌｌｅｃｔ （Collect: Data collection software, R. Hooft, Nonius B. V5 1998）
データー還元およびセル微細化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）： Ｄｅｍｏ (Z. Otwinowski & W. Minor, Methods in Enzymology (1997) Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307- 326; C. W. Carter, Jr & R. M. Sweet, Eds., Academic Press）．
吸収補正： Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ， Ｇ． Ｍ． ＳＡＤＡＢＳ − Ｂｒｕｋｅｒ Ｎｏｎｉｕｓ領域検出器スケーリングおよび吸収補正 − Ｖ２．＼０
構造説明： ＳＨＥＬＸＳ９７ （G. M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) A46 467-473）．
構造精製： ＳＨＥＬＸＬ９７ （G. M. Sheldrick (1997), University of Goettingen, Germany）
グラフィック： Ｃａｍｅｒｏｎ − Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐａｃｋａｇｅ （D. M. Watkin, L. Pearce and C K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford, 1993）
特殊な詳細： 総ての水素原子は、ディファレンス・マップに置かれ、レストレイント（ｒｅｓｔｒａｉｎｔｓ）を用いて微細化したＮＨおよびＯＨの水素原子を除き、理想化位置に置き、ライディングモデルを用いて微細化した。キラリティー： ＮＩ＝Ｒ， ＣＩ２＝Ｓ， ＣＩ３＝Ｓ， ＣＩ５＝Ｒ， Ｃ２１＝Ｓ， Ｃ２４＝Ｒ
【０１８１】
検討の結果を、表Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに示す。
【０１８２】
表において、ＲＵＳ０３５０というラベルは異性体Ｂを表す。
【０１８３】
【表５】
【０１８４】
【表６】
【０１８５】
【表７】
【０１８６】
【表８】
【０１８７】
【表９】
【０１８８】
【表１０】
【化２５】
３０％の確率水準で描いた熱振動楕円体
【０１８９】
上記のデーターに基づいて、異性体Ｂは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ配置を有し、式（Ｉａ）
【化２６】
に対応していると思われる。
【０１９０】
実施例５
シグマ受容体結合研究
４種類のジヒドロテトラベナジン異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに特異結合分析法を行い、シグマ−１およびシグマ−２受容体へのそれらの結合能力を試験した。結果を表５に示す。
（ａ） シグマσ１受容体：
文献： Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251-
260, (1999)
供給源： ヒトジャーカット細胞
リガンド： ８ｎＭ ［３Ｈ］ハロペリドール
ビヒクル： １％ ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：４時間、２５℃
インキュベーション緩衝液： ５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４緩衝液 ｐＨ７．５
非特異的リガンド： １０μＭハロペリドール
Ｋｄ： ５．８ｎＭ
Ｂｍａｘ： ０．７１ピコモル／ｍｇ タンパク質
特異的結合： ８０％
定量方法： 放射性リガンド結合
有意基準： 最大刺激または阻害の>５０％
（ｂ）シグマσ２受容体：
文献： Hashimoto et al. , Eur. J. Pharmacol. , 236: 159-1
63, (1993)
供給源： ウィスターラット脳
リガンド： ３ｎＭ ［３Ｈ］イフェンプロジル
ビヒクル： １％ ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：６０分間、３７℃
インキュベーション緩衝液： ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
非特異的リガンド： １０μＭイフェンプロジル
Ｋｄ： ４．８ｎＭ
Ｂｍａｘ： １．３ピコモル／ｍｇ タンパク質
特異的結合： ８５％
定量方法： 放射性リガンド結合
有意基準： 最大刺激または阻害の>５０％
【０１９１】
【表１１】
データは、４種類総ての異性体がシグマ−１およびシグマ−２受容体のいずれにも結合することを示している。これら４種類の異性体はシグマ−２受容体での結合研究ではほぼ等しい効力を有するが、異性体ＢおよびＤはシグマ−１受容体に対して一層強い結合を示す。
【０１９２】
実施例６
抗増殖活性
本発明の化合物の抗増殖活性は、多数の細胞系における細胞増殖を阻害する化合物の能力を測定することによって決定することができる。細胞増殖の阻害は、アラマーブルー分析法(Nociari, M.M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167)を用いて測定される。この方法は、生存細胞がレサズリンをその蛍光生成物レゾルフィンに還元する能力に基づいている。それぞれの増殖分析に対して、細胞を９６穴プレート上で培養し、１６時間回復させた後、阻害薬化合物を更に７２時間添加する。インキュベーション期間の終了時に、１０％（ｖ／ｖ）アラマーブルーを加え、更に６時間インキュベーションした後、５３５ｎＭ ｅｘ／５９０ｎＭ ｅｍで蛍光生成物を測定した。非増殖細胞分析の場合には、細胞を９６時間コンフルエンスに保持した後、阻害薬化合物を更に７２時間添加する。生存細胞の数を、上記のアラマーブルー分析法によって測定する。総ての細胞系は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から得ている。このような細胞系の例は、ヒトＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫およびラットＣ６神経膠腫細胞系である。
【０１９３】
実施例７
ヒト単球によるサイトカインのＬＰＳ／ＩＦＮ刺激産生に対する本発明の化合物の効果の測定
本発明の化合物を、ヒト単球によるサイトカインの産生を調節することができる範囲を決定する目的で試験した。単球はマクロファージの前駆体であり、広範囲の疾患状態における炎症性サイトカインの重要な供給源である。従って、単球産生に対する本発明の化合物の活性は、化合物が抗炎症活性を有する可能性の良好な指標を提供する。
【０１９４】
下記の治療群を設定した。
【表１２】
【０１９５】
手順
ヒト単球のサイトカイン産生の調節
材料
ＭＡＣＳ緩衝液：１ｘＰＢＳ ｐＨ７．２， ２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ），５％ヒトＡＢ血清
培地：５００ｍｌ ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），５ｍｌ Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ），５ｍｌ Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），１０ｍｌ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ），５％自己血漿
化合物：無水エタノール中に１０ｍＭで保管
ＬＰＳ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｂｏｒｔｉｓ，１ｍｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，製品番号Ｌ１８８７）
ＩＦＮγ：組換えヒト，１０μｇ／ｍｌ（ＢＤ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，製品番号５５４６１７）
ＭＡＣＳ ＣＤ１４正の選択ビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
ＣＤ１４：ＦＩＴＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
軟膜（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）はＢｒｉｓｔｏｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓから入手。
血液１ｍｌは、７ｘ１０６個の全細胞を供給する。
【０１９６】
自己血漿の調製
軟膜を３５００ｒｐｍで１０分間回転する。
上部血漿層を取りだし、５６℃で３０分間熱不活性化する。
３５００ｒｐｍで１０分間回転し、熱不活性化した補体タンパク質などを除去する。
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）単離
１． 残っている軟膜を等容のＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、反転混合する。
２． ヒストパーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）を室温（ＲＴ）まで予備加温し、１０ｍｌを全体に加える。
３． １５ｍｌの血液／培地混合物で徐々に被覆する。
４． ＲＴにて１６００ｒｐｍで２５分間回転する（減速なし）。
５． ＰＢＭＣを培地とヒストパークとの間の界面層に分離し、細胞を５０ｍｌ ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、１０ｍｌ培地を加える。
６． ＲＴにて１８００ｒｐｍで１０分間回転する。
７． ４０ｍｌＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、培地に再懸濁する。
【０１９７】
ＣＤ１４＋マイクロビーズを用いる正の選択によりＣＤ１４＋細胞の単離
氷上で予め冷却した溶液を用いて作業する。
１． 細胞数（３１３ｘ１０ｘ５ｘ１０４＝１．５６５ｘ１０８全細胞）を決定する。
２． 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析の目的で１００μｌ細胞試料を取り出す（予備選択試料）。
３． ４℃にて１８００ｒｐｍで１０分間回転する。上清を除く。
４． ペレットを１ｘ１０７個の全細胞当たり８０μｌ緩衝液に再懸濁する（２４００μｌ／全細胞）。
５． ２０μｌのＣＤ１４マイクロビーズ／１ｘ１０７個の全細胞を加える（４００μｌ／全細胞）。
６． 十分に混合し、４−８℃で１５分間インキュベーションする。
７． 細胞を１〜２ｍｌの緩衝液で洗浄し、４℃にて３００ｘｇで１０分間回転する。
８． １ｘ１０８個の細胞／５００μｌ緩衝液まで再懸濁する（１ｍｌ／全細胞）。
【０１９８】
ＬＳカラムを用いる磁気分離
１． ＭＡＣＳ（登録商標）分離器の磁場にカラムを置く。カラムを３ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。
２． 細胞懸濁液をカラムに加える。
３． 通過する未標識細胞を集める。カラムを３ｍｌ緩衝液で３回洗浄し、それぞれの洗浄の間にはカラム液溜めを空にする。全流出物を集める（未標識細胞画分）。
４． 分離器からカラムを外し、収集管上に置く。
５． ５ｍｌの緩衝液をカラムに加え、カラムプランジャーを使用することによって磁気標識した細胞を含む画分を直ちに流し出す。
６． ＭＡＣＳ緩衝液中の細胞を回転し、細胞ペレットを培地に再懸濁する。
７． 正に選択された細胞について細胞計数を行う。
７１ｘ２０ｘ５ｘ１０４＝７．１ｘ１０７個の細胞／ｍｌ。１．７５ｍｌであるから、１．２４ｘ１０８個の全細胞となる。
８． 試料を採取してＦＡＣＳによって純度をチェックする。１０μｌのＣＤ１４−ＦＩＴＣ抗体を加え、４−８℃で５分間インキュベーションする。
【０１９９】
化合物調製
無水エタノール中で１０ｍＭの化合物を調製する。培地中で培養する前に必要な濃度まで希釈する。
【０２００】
細胞培養
単離したＣＤ１４＋単球を、２４穴プレートで１ｘ１０６細胞／ｍｌ／ウェルで培養した。単球を、下表に示す様々な希釈度の試験化合物および対照化合物の存在下にて培養した。一晩インキュベーションした後、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて単球の活性化を刺激し、ＣＢ２発現を高めた。４８時間後に、上清を採り出してＣＢＡサイトカイン分析を行った。
【０２０１】
ＣＢＡサイトカイン分析（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ ヒトＴｈ１／Ｔｈ２キット［製品番号ＢＭＳ７１６ＦＦ］）
使用前に、総ての緩衝液を室温にし、渦流混合する。
１． ４５０ｍｌの蒸留水に加えて徐々に混合することによって、アッセイバッファーを作製する。４℃で保管する。
２． それぞれのビオチン接合体６００μｌを全体に加えることによって、ビオチン接合体混合物を作製する。
３． それぞれのビーズセット３００μｌを加えることによって、ビーズ混合物を作製する。
４． バイアルのラベルに推奨されているようにそれぞれの標準物を蒸留水で再構成する。１００μｌのアッセイバッファーを、標準物１とラベルが貼られたチューブに加える。それぞれの再構成した標準物１０μｌを加え、混合する。標準混合物を連続希釈する（１００μｌアッセイバッファーをチューブ２−７に入れ、５０μｌ標準物１をチューブ２に加え、混合し、５０μｌをチューブ３に加える、など）。
５． ＦＡＣＳチューブをラベルし、標準物１−７ ２５μｌを指定チューブ加える。２５μｌのアッセイバッファーをブランクチューブに加える。
６． 試料２５μｌを指定した試料チューブに加える。
７． ビーズ混合物２５μｌを総てのチューブに加える。
８． ５０μｌビオチン接合体を総てのチューブに加える。
９． 渦流によって混合した後、金属箔で被覆し、ＲＴにて２時間インキュベーションする。
１０． １７６μｌを５３２４μｌアッセイバッファーに混合することによって、ストレプアビジン−ＰＥ溶液を調製する。アッセイバッファー１ｍｌを総てのチューブに加え、２００ｘｇで５分間回転する。上清を捨てる。洗浄処置を繰り返し、上清を捨てる。
１１． ストレプアビジン−ＰＥ ５０μｌを総てのチューブに加える。渦流混合の後、金属箔で被覆し、ＲＴにて１時間インキュベーションする。
１２． 洗浄処置を２回繰り返す。
１３． アッセイバッファー５００μｌを総てのチューブに加える。
【０２０２】
フローサイトメーターの設定
ポジティブおよびネガティブビーズ（キットで供給）を用いて設定を最適にし、補正などを決定する。試料の前に標準曲線を用い、ゲートされた集団について３０００イベントを計数する（３００イベント／検体）。
【０２０３】
結果
結果を図１〜６に示す。図において、ラベルＲＵ３４８は異性体Ｄを表す。
【０２０４】
図１〜６から分かるように、２個のシス−ジヒドロテトラベナジン異性体ＢおよびＤは、いずれもＬＰＳ／ＩＦＮによって刺激した単球における様々なサイトカインの産生を減少させた。
【０２０５】
例えば、異性体Ｂは、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１２の産生を試験した総ての濃度で減少させ、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生を試験した濃度の大半で減少させた。
【０２０６】
異性体ＤはサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２の産生を試験したすべての濃度で減少させ、サイトカインＴＮＦａ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生を試験した濃度の大半で減少させた。
【０２０７】
実施例８
Ｔ細胞増殖に対する本発明の化合物の効果の測定
本発明の化合物を試験し、それらがＴ細胞増殖を阻害することができる程度を測定した。Ｔ細胞は適応免疫応答の調整（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ）に関係しており、広汎な疾患状態における炎症の駆動因子である。
【０２０８】
従って、本発明の化合物のＴ細胞増殖に対する活性は、化合物が抗炎症活性を有する可能性の良好な指標を提供する。
【０２０９】
材料
ＨＢＳＳ＋２％ ＨＥＰＥＳ緩衝液（５００ｍｌ＋１０ｍｌ）、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ（５００ｍｌ）＋２％ ＨＥＰＥＳ（１０ｍｌ）＋１％ Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（５ｍｌ）＋２％ Ｌ−グルタミン（ｌ０ｍｌ）＋５０μＭ ２−ＭＥ（５００μｌ）および正常マウス血清（ＮＭＳ）
【０２１０】
方法
１． ９６穴プレートカラム１−８、列Ａ−Ｈに１００μｌ抗マウスＣＤ３を１μｇ／ｍｌ ＰＢＳで３回コーティングする。全部で１９２穴であるので、１．４４ｍｇ／ｍｌのストックを１７μｌ加えることによってＰＢＳで２４ｍｌとする。３７℃で２時間インキュベーションする。
２． ＮＭＳ調製のため心臓穿刺後に２匹のｂａｌｂ／ｃマウスからの血液をプールし、脾臓を取り出してＨＢＳＳ＋Ｈｅｐｅｓに移す。
３． 血液を３７℃で３０分間置いて凝固させ、３，０００ｒｐｍで１０分間Ｃｈｉｌｓｐｉｎで回転する。血清を取りだし、滅菌濾過し、使用まで冷蔵庫に保管する。
４． 脾臓を１０ｍｌ ＨＢＳＳを入れたペトリ皿に移し、脾臓上に置かれた清浄な滅菌ワイヤーメッシュを用い、ガラス棒を用いて細胞を外す。パスツールピペットを用いて細胞をメッシュから洗い流し、１５ｍｌチューブに移す。室温（ＲＴ）、１０００ｒｐｍにて１０分間回転する。
５． 細胞を再懸濁させ、０．５ｍｌの滅菌ＤＷを加えてＲＢＣを溶解し、混合し、直ちにＨＢＳＳで希釈し、５０ｍｌチューブに移し、細胞濾過器（７０μＭ）を通過させて残屑を除去し、上記のようにして回転し、細胞を再度ＨＢＳＳで洗浄し、最後に補体（上記）を含む２ｍｌ αＭＥＭに再懸濁する。
６． 細胞計数−２５２細胞ｘ２ｘ５ｘ１０４＝４ｍｌ中に２．５２ｘ１０７細胞／ｍｌ＝総数１０８細胞。２ｍｌを２５ｍｌに希釈し、２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞濃度を得る。
７． ２５０μｌのＮＭＳを細胞に加え、濃度を１％とする。
８． 抗ＣＤ３をコーティングしたプレートをＰＢＳで３回洗浄する。
９． １００μｌ分量の細胞を３ｘ９６穴プレートの列Ａ−Ｈカラム１−８のコーティングしたウェルに移す。等容の化合物を加え、下記のように９６穴プレートで希釈する。
【０２１１】
化合物
１０ｍＭの化合物３．５μｌを３４６．５μｌの培地に移し（１／１００）、１／１００希釈液３５μｌを３１５μｌの培地に移す（１／１０）などによりプレートを引き下げ、化合物の連続１／１０希釈液を得る。様々な化合物の希釈液の１００μｌ分量を、Ｔ細胞を含むトリプリケートプレートのウェルに移す。
【表１３】
【０２１２】
４８時間培養した後、それぞれのウェルに３Ｈ−チミジンを滴加し（１６μｌ）、３７℃、５％ ＣＯ２で一晩インキュベーションする。回収し、３Ｈ−チミジン取り込みを測定する。
【０２１３】
結果
３Ｈ−チミジン取り込みのレベルによって示されるＴ細胞増殖の程度を、下表に示されるデータで示す。
【表１４】
【０２１４】
表において、「Ｎａｂ」はナビロンを表し、「ＲＵ３４６」は異性体Ｄを表し、「ＲＵ３５０」は異性体Ｂを表す。
【０２１５】
これらの結果は、最大濃度で試験した化合物のそれぞれがＴ細胞の増殖を阻害することを表している。
【０２１６】
実施例９
医薬組成物
（ｉ）錠剤処方物−Ｉ
本発明のジヒドロテトラベナジンを含む錠剤組成物を、ジヒドロテトラベナジン５０ｍｇを希釈剤としてのラクトース（ＢＰ）１９７ｍｇおよび滑沢剤としてのステアリン酸マグネシウム３ｍｇと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を成形することによって調製する。
【０２１７】
（ｉｉ）錠剤処方物−ＩＩ
本発明のジヒドロテトラベナジンを含む錠剤組成物を、化合物（２５ｍｇ）を酸化鉄、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、白色トウモロコシ澱粉およびタルクと混合し、圧縮して既知の方法で錠剤を成形することによって調製する。
【０２１８】
（ｉｉｉ）カプセル処方物
カプセル処方物は、本発明のジヒドロテトラベナジン１００ｍｇをラクトース１００ｍｇと混合し、生成される混合物を標準的な不透明硬質ゼラチンカプセルに充填することによって調製する。
【０２１９】
同等物
本発明の具体的態様に対して多数の改質および変更を本発明の基礎となる原理から離反することなく行うことができることは、容易に明らかになるであろう。総てのこのような改質および変更は、本出願によって包含されることを意味するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）の単球によるＴＮＦαの産生に対する効果。
【図２】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）の単球によるＩＬ−４の産生に対する効果。
【図３】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−２の産生に対する効果。
【図４】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−５の産生に対する効果。
【図５】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−１０の産生に対する効果。
【図６】本発明の化合物である異性体Ｂ（ＲＵ３５０）および異性体Ｄ（ＲＵ３４６）のヒト単球によるＩＬ−１２の産生に対する効果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患または炎症性疾患の予防または治療のための医薬を製造するための化合物の使用であって、化合物が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンまたはその薬学上許容可能な塩である、使用。
【請求項２】
医薬が、炎症性疾患の予防または治療に用いられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風性関節炎、風疹関節炎、乾癬性関節炎、および他の関節炎症状；内毒素または炎症性腸疾患によって誘発される炎症性反応のような急性または慢性炎症性疾患状態；ライター症候群、痛風、リウマチ様脊椎炎、慢性肺炎症性疾患、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
炎症性疾患が、関節リウマチである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
炎症性疾患、例えば、請求項３または４に記載の炎症性疾患の予防または治療に用いられる化合物であって、化合物が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンである、化合物。
【請求項６】
患者（例えば、ヒトなどの哺乳類）における炎症性疾患または症状（例えば、請求項３または４に記載の炎症性疾患）を予防または治療する方法であって、哺乳類に治療上有効量の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる、方法。
【請求項７】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが本明細書で定義された異性体Ｂまたは異性体Ｄである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項８】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが、式（Ｉａ）：
【化１】
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項９】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが、酸付加塩の形態である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための化合物、使用または方法。
【請求項１０】
塩が、メタンスルホン酸塩である、請求項９に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項１１】
実質的に実施例に関して本明細書に記載されている、使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項１】
増殖性疾患または炎症性疾患の予防または治療のための医薬を製造するための化合物の使用であって、化合物が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンまたはその薬学上許容可能な塩である、使用。
【請求項２】
医薬が、炎症性疾患の予防または治療に用いられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、外傷性関節炎、痛風性関節炎、風疹関節炎、乾癬性関節炎、および他の関節炎症状；内毒素または炎症性腸疾患によって誘発される炎症性反応のような急性または慢性炎症性疾患状態；ライター症候群、痛風、リウマチ様脊椎炎、慢性肺炎症性疾患、クローン病および潰瘍性大腸炎から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
炎症性疾患が、関節リウマチである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
炎症性疾患、例えば、請求項３または４に記載の炎症性疾患の予防または治療に用いられる化合物であって、化合物が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンである、化合物。
【請求項６】
患者（例えば、ヒトなどの哺乳類）における炎症性疾患または症状（例えば、請求項３または４に記載の炎症性疾患）を予防または治療する方法であって、哺乳類に治療上有効量の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる、方法。
【請求項７】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが本明細書で定義された異性体Ｂまたは異性体Ｄである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項８】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが、式（Ｉａ）：
【化１】
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項９】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが、酸付加塩の形態である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための化合物、使用または方法。
【請求項１０】
塩が、メタンスルホン酸塩である、請求項９に記載の使用、使用のための化合物、または方法。
【請求項１１】
実質的に実施例に関して本明細書に記載されている、使用、使用のための化合物、または方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５０３０４５（Ｐ２００９−５０３０４５Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２４５８８（Ｐ２００８−５２４５８８）
【出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２９０９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７６４３
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０６２７０４８８）ケンブリッジ、ラボラトリーズ、（アイルランド）、リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＩＲＥＬＡＮＤ） ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月４日（２００６．８．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００２９０９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１７６４３
【国際公開日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【出願人】（５０６２７０４８８）ケンブリッジ、ラボラトリーズ、（アイルランド）、リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＩＲＥＬＡＮＤ） ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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