変性アルギネートおよびその製造方法および用途
【課題】カチオン結合特にカルシウム結合の損傷およびヒドロゲルの安定性の損失を制限するために側鎖分子を有する選択的に変性したアルギネート並びにその繊維およびゲルの提供。
【解決手段】ａ）リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そして
ｂ）アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程を含む変性アルギネートポリマーを製造する方法。
【解決手段】ａ）リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そして
ｂ）アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程を含む変性アルギネートポリマーを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書に記載されたアルギネートポリマーの酵素化学的変性により製造された変性アルギネート、その製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に、アルギネートは、交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）構造（ＭＧ−ブロック）の領域が散在するＭ（Ｍ−ブロック）残基およびＧ（Ｇ−ブロック）残基のホモポリマー領域により鎖に沿ってブロック様パターンで配列された１→４結合β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の線状コポリマーである。天然には、アルギネートは、まずホモポリマー性マンヌロナンとして生成され、そしてマンヌロナンのＭ残基上のＣ−５転化を含む重合後エピマー化反応を経てＭおよびＧモノマーサブユニットを含むヘテロポリマーに転換される。反応は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼにより接触化される。
【０００３】
最近、アルギネート生成細菌アゾトバクター・ビンランディのゲノムが７つの異なるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子をエンコードしていることが見いだされた。これらの遺伝子は、配列決定され、クローンされそしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに発現され、そして得られた酵素は、ＡｌｇＥ１−ＡｌｇＥ７と命名された。すべての天然のアルギネートはＭからＧへの同じ基本的なＣ−５転化によりホモポリマー性マンヌロナンから生成されるので、多糖に見いだされる組成および配列における驚くべき変化は、単に異なるエピメラーゼの異なる触媒性による。例として、ＡｌｇＥ４は、ＭＧ−ブロックを有するアルギネートを主として形成するが、ＡｌｇＥ６は、ポリマー中に長いＧ−ブロックを導入する。これらのアルギネート変性酵素の利用可能性およびそれらの使用は、テイラーメイドに改変された構造的および物理的性質を有するアルギネートの製造を可能にする。
【０００４】
アルギネートは、イオン性結合を有するポリマーのＧモノマーサブユニットを架橋する二価のカチオンの存在下架橋したゲルを形成する。ミリモルの濃度のカルシウムの存在下のアルギネートの急速なゲル形成は、Ｇ残基のフラクション並びにＧおよびＭ残基の配列パターンに依存する。
【０００５】
ここ１０年の間に、バイオ技術、バイオ医学および製薬の応用のような需要が増大する最終用途にアルギネートを使用することについて関心が拡大してきている。細胞およびバイオ触媒に固定化材料としてアルギネートを使用することは、このトレンドの１例である。工業、医薬および農業におけるこのようなシステムの可能な使用は、限りなく多く、酵母からのエタノールの生産およびハイブリドーマからのモノクローナル抗体の生産から植物胚の閉じこめによる人工的な種子の大規模な生産に及ぶ。
【０００６】
アルギネートゲルは、また、細胞の固定、移植および組織エンジニアリングのための細胞外マトリックス材料（ＥＣＭ）としての可能性を有する。しかし、カルシウム−アルギネートヒドロゲルの興味のある物理的および質量輸送の点にもかかわらず、それらの応用は、生物学的不活発さ（例えば、細胞接着およびシグナル化）により制限されているアルギネートの閉じこめは、リビング細胞を固定化する非常に激しくない手法であるが、多くの細胞は、それらの増殖および生存のためにマトリックスとの特定の相互反応を要する。このような足場依存の行動は、ほとんどの哺乳動物の細胞では普通であるが、アルギネート網状構造それ自体は相互反応しない。
【０００７】
アルギネートは、非バイオ接着材料であることが知られているが、細胞特異性リガンドまたは細胞外シグナル化分子例えばペプチドまたはオリゴ糖の導入は、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ認識プロセスでのその直接的な関わり合いに必要である。この点に沿って、これら変性アルギネートに基づく第三世代のバイオ材料が、細胞との相互反応を顕著に増大させうることが既に報告されており、ポリマーエンジニアリングおよび組織再生の分野での新しいチャンスおよび将来の開発を開示している。しかし、適切なＥＣＭに類似したスカホールドのデザインは、基本的な生物学的側面とともに、また物理的性質例えばゲル形成、機械的強さおよび安定性による。
【０００８】
イオノトロピー性ゲル化の性質によって、アルギネートは、バイオ技術および医学の応用特に細胞および組織の被包化の分野の興味をそそる候補者になっている。１例として、ランゲルハンスの膵島を含むアルギネート−ポリ−Ｌ−リジンカプセルは、大動物の糖尿病を後退させることが示されており、その場合、カプセルにより示される安定かつ選択的な浸透可能なバリヤーが、移植された細胞を宿主の免疫系から保護する。
【０００９】
種々のリガンドが、アルギネートポリマーにカップリングされて、特許文献１におけるように、細胞／マトリックスの相互反応を改善する。アルギネートの化学的変性による主な問題は、このような変性がしばしば化学的選択性がないことである。すなわち、変性は、アルギネートが構成されている両方の糖類モノマー（グルロン酸（Ｇ）およびマンヌロン酸（Ｍ））で生ずる。ゲル形成そして特にゲルの強さが、未変性のＧの数に関連する性質であることがさらに知られている。従来技術のアルギネートの化学的変性は、Ｍ残基（Ｍユニット）に制限されるばかりかＧ−ブロック中のＧ残基（Ｇユニット）で生じそれにより利用可能なＧ残基の量を減らし、従って二価カチオンの協同的結合を損ないそしてゲル形成の速度を低下させる（弱いゲルの形成を生じそして塩水中のコントロールできない膨張を生ずる）置換を明らかにしている。本明細書で使用されるとき、「残基」は、単一のＭまたはＧユニットをいい、そして「ブロック」は、Ｍ、ＧまたはＭＧの複数のユニットをいう。
【００１０】
多糖鎖のウロン基の１−アミノ−１−デオキシ−β−ガラクトース残基を導入することにより得られるガラクトース置換アルギネートの合成および特徴は、報告されている。肝細胞の細胞表面に存在するアシアログリコ蛋白受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によるβ−ガラクトースの認識に基づきそして報告の結果を考えて、変性アルギネートは、肝細胞の被包化および接着を改善するために好適なゲル形成バイオ材料として提案されている。しかし、分子レベルでの変性アルギネートの特徴は、アルギネート鎖への側鎖基の導入が主としてＧ残基に影響をあたえ、そのためカルシウム結合性を損ないそしてその結果ヒドロゲルを安定にしないことを明らかにした。変性カルシウム−アルギネートヒドロゲルの剛性および安定性のかなりの低下は、既に報告されている。そのため、多糖鎖への細胞特異性リガンドの導入がヒドロゲルの機械的性質の低下を招くことと思われる。
【特許文献１】米国特許６６４２３６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この観点において、かなりな改善は、カルシウム結合の損傷およびヒドロゲルの安定性の損失を制限するためにマンヌロン残基に側鎖分子を有する選択的に変性したアルギネートの製造により示されるだろう。同様に、カチオン結合の損傷およびヒドロゲルの安定性の損失を制限するために、側鎖分子を有する変性アルギネートの性質を改善する必要性が存在する。本発明は、以下に説明されるように、種々のリガンドによる置換後のアルギネートゲルの機械的性質および膨張性をコントロールできる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、変性アルギネートポリマーを製造する方法に関する。その方法は、アルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そしてアルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程からなる。反応工程は、いずれかの順序および任意の配列で複数回行うことができる。
【００１３】
本発明は、さらに、アルギネートゲルおよび繊維を製造する方法に関する。その方法は、溶媒中で、複数の変性アルギネートポリマーを二価のゲル化イオンと組み合わせる工程を含む。或る態様では、リビング細胞がアルギネートゲル内に内包される。
【００１４】
本発明は、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性されそして変性がアセチル化ではない変性アルギネートポリマーに関する。
本発明は、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性されそして変性がアセチル化ではない変性アルギネートポリマーからなるアルギネートゲルおよび繊維に関する。
本発明は、さらに、成形したまたは成形していない固体の非架橋アルギネート組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
アルギネートは、種々の割合および連続した配列のＤ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸の線状コポリマーの１群をひとまとめにした用語である。カルシウムのような二価のカチオンによりゲルを形成するアルギネートポリマーの能力および得られるゲルの性質は、ポリマー鎖中の連続するＧ残基のブロックの割合および長さに強く相関する。
【００１６】
本発明は、少なくとも２つの工程を要するアルギネートを変性する方法を提供する。１つの工程は、変性用成分がアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに共有結合的に付着する工程であり、他の工程は、アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットが、酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに転換される工程である。本発明の方法によれば、これらの工程は、いずれかの順序で行うことができる。さらに、変性用成分がアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに共有結合的に付着する複数の工程を行うことができ、１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットが、酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに転換される複数の工程を行うことができる。複数の工程は、任意の順序で行うことができる。モノマー性サブユニットは、カルボキシル基および水酸基の何れかで変性される。
【００１７】
アルギネート中の官能基の置換は、置換基の化学的性質および大きさに応じて、ポリマーのゲル形成能力を減少させる。この効果は、Ｇブロックの量を増加することによって最低にされる。いくつかの好ましい態様では、官能基の置換は、変性のための原料としてＭのみを有するアルギネートを使用することによって、Ｍ残基の置換に限定される。変性後、未変性Ｍは、エピマー化によりＧに転換される。
【００１８】
Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーが生成される。変性アルギネートポリマーは、未変性Ｍおよび未変性Ｇを含むことができる。変性は、いくつかのＭがアセチル化されるが、アセチル化ではない。すなわち、これらポリマーのＭモノマー性サブユニットのいくつかは、これらポリマーの他のＭモノマー性サブユニットがアセチル化されるかまたはされないかにかかわらず、アセチル化以外の変性により変性される。いくつかの好ましい態様では、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーは、変性用成分例えばガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｅＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドの付加により変性される。Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーは、アルギネートゲルおよび繊維をつくるのに有用である。
【００１９】
原料アルギネートは、ＭＭ、ＧＧおよび／またはＭＧブロックの異なる構造配列に分類できるＭおよびＧを種々の量で有することができる。化学反応の工程は、適用可能なものとして、アルギネートのＭおよびＧ残基に反応する置換基（変性Ｍ残基および変性Ｇ残基）に導く。酵素による工程は、所望の数のＭ残基をＧ残基に転換することによりアルギネート中のＭおよびＧの量を変化する。例えば、Ｇの量は、ＭＭブロックをＭＧまたはＧＧに転換することまたはＭＧブロックをＧＧに転換することにより増加する。
【００２０】
いくつかの態様では、Ｍ含量の多い例えばＭおよびＧの全重量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９５＋％のＭ含量のアルギネートは有用である。本発明の１つの態様は、化学反応前のＭ残基の多い原料アルギネートとして、マンヌロン酸のホモポリマー例えばマンヌロナンを利用する。これらのホモポリマーは、本明細書で参考として引用されるＷＯ ０４０１１６２８に開示されているシュードモナス・エルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．シリンガエ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）またはＰ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＡＩｇＧネガティブミュータントにより製造される。高Ｍアルギネートの他の例は、本明細書で参考として引用されるＷＯ ０３０４６１９９Ａ２に開示されている。
【００２１】
本発明によれば、変性用成分は、任意の化学構造物であるが、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から好ましくは選ばれる。いくつかの態様では、変性用成分は、米国特許６６４２３６２にリストされているこの群から選ばれる。いくつかの態様では、変性用成分は、遊離基重合のできる炭素−炭素二重結合または三重結合を含む。単糖は、例えば、ラクトース、ガラクトース、しょ糖、フラクトース、マンノースおよびセルロースである。オリゴ糖は、例えばラクトース、ガラクトース、しょ糖、フラクトース、マンノースおよびセルロースのような単糖からなるホモポリマーまたはヘテロポリマーである。オリゴ糖は、好ましくは、２−１０のモノマー、より好ましくは２−３のモノマーを有する。モノヌクレオチドは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンまたはウラシルである。オリゴヌクレオチドは、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジンまたはウラシルのようなモノヌクレオチドからなるホモポリマーまたはヘテロポリマーである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２−１５０モノマー、より好ましくは２−５０モノマー、さらに好ましくは５−３５モノマーそして一層好ましくは１０−２０モノマーを有する。アミノ酸は、２６の天然のアミノ酸の任意のものおよび任意の合成アミノ酸残基である。ペプチドは、例えばポリリジンのようなホモポリマーまたはヘテロポリマーである。ペプチドは、好ましくは、２−２５モノマー、より好ましくは、２−２０モノマー、さらに好ましくは２−１５モノマー、一層好ましくは２−１０モノマー、より好ましくは２−５モノマーそしてさらに好ましくは２，３または４モノマーを有する。蛋白は、細胞付着また接着分子、受容体蛋白またはリガンドのような任意の蛋白様分子である。蛋白は、好ましくは、２５より多いアミノ酸を有し、そしていくつかの態様では、２５−２００またはそれ以上のアミノ酸である。
【００２２】
いくつかの態様では、変性用成分は、ガラクトースに基づくオリゴ糖例えばＡＳＧＰＲアシアログリゴ蛋白受容体またはガレクチンに結合するものである。ＡＳＰＧＲは、肝細胞接着受容体である。ガレクチンは、細胞接着受容体である。いくつかの態様では、変性用成分は、細胞−細胞認識分子であるセクチンであるｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）である。いくつかの態様では、変性用成分は、また肝細胞接着に有用であるＡＳＧＰであるＧｌｃＮＡｃである。いくつかの態様では、変性用成分は、上皮細胞増殖に有用であるＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）である。いくつかの態様では、変性用成分は、マンノースに基づくオリゴ糖例えばマンノース結合レクチンまたはランゲリンに結合するものである。マンノース結合レクチンは、ケラチノサイト増殖に関係がある。ランゲリンは、ランゲルハンス細胞の受容体である。
【００２３】
いくつかの態様では、変性用成分は、ＲＤＧペプチド例えばフィブロネクチンまたはビトロエンクチンから由来するものである。ＲＤＧペプチドは、細胞接着および筋芽細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＹＩＧＳＲペプチド例えばラミニンＢ１から由来するものである。ＹＩＧＳＲペプチドは、細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＲＥＤＶペプチド例えばフィブロネクチンから由来するものである。ＲＥＤＶペプチドは、上皮細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、ＩＫＶＡＶペプチド例えばラミニンから由来するものである。ＩＫＶＡＶペプチドは、神経突起延長ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチド例えば天然の細胞接着分子から由来するものである。ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよび２，３、４またはそれ以上のアミノ酸を有するそのフラグメントは、星状膠細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＫＲＳＲペプチド例えばヘパリン結合ドメインから由来するものである。ＫＲＳＲペプチドは、骨芽細胞接着ペプチドとして有用である。
【００２４】
アルギネートポリマーは、変性用成分の間の結合により架橋できる。これらの結合は、共有結合、イオン結合であり、そして結合中間物を含むことができる。アルギネートポリマーは、従って、非ゲル化架橋可能な例により予定された形状に製造できる。
【００２５】
変性アルギネートサンプルは、式Ａ−Ｘ（式中、Ａはアルギネート多糖でありそしてＸは変性用成分である）を有する。ＡおよびＸは、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、イミド、第二級アミン、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、スルフェートエステル、スルホネートエステル、ホスフェートエステル、ウレタン、カーボネートなどから選ばれる結合を経て共有結合的に結合している。すなわち、アルギネートの１つ以上のモノマーは、変性用成分に直接またはスペーサーにより共有結合している。従って、変性アルギネートサンプルは、また式Ａ−Ｙ−Ｘ（式中、ＡおよびＸは前記同様であり、Ｙはアルキルまたはアリール鎖例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基を含むスペーサーである）を有することができる。いくつかの態様では、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ１５、好ましくはＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ５、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基である。ＡおよびＹ並びにＹおよびＸは、上記の結合を経て結合される。
【００２６】
結合またはリンカーは、任意にスペーサーとともにまたはそれなしで提供されて変性用成分をアルギネートポリマーのモノマーサブユニットに接続する。リンカーの例は、スペーサー例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基と組み合わされてまたは組み合わされることなく、エステル、エーテル、チオエステル、ジスルフィド、アミド、イミド、第二級アミノ、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、スルフェートエステル、スルホネートエステル、ホスフェートエステル、ウレタンおよびカーボネートを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
エステル結合は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−の何れかの構造をいう。エーテル結合は、−Ｏ−の構造をいい、チオエーテル結合は、−Ｓ−の構造をいい、ジスルフィド結合は、−Ｓ−Ｓ−の構造をいい、アミド結合は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−または−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−の何れかの構造をいう。イミド結合は、−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−の構造をいう。第二級または第三級アミン結合は、−ＮＨ−または−Ｎ（−Ｒ）−の構造をいう。直接炭素−炭素結合は、−Ｃ−Ｃ−の構造をいい、スルホネートおよびスルファートエステル結合は、それぞれ−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−の構造をいう。ホスフェートエステル結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−Ｏ−の構造をいう。ウレタン結合は、−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−の構造をいう。カーボネート結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−の構造をいう。
【００２８】
本発明の方法は、アルギネートの１つ以上の未変性Ｍ残基が酵素によるエピマー化反応によりＧ残基に転換される１つ以上の工程を含む。エピメラーゼ酵素は、広く知られている。それらの例は、本明細書において参考として引用される米国特許５９３９２８９に記載されたもののようなアゾトバクター・ビンランディから由来する。他の源は、シュードモナス・シリンガエ（本明細書において参考として引用されるＢｊｅｒｋａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７９、２８９２０−２８９２９）およびラミナリア・ジギタタ（本明細書において参考として引用されるＷＯ ２００４０６５５９４）を含む。
【００２９】
ＡＩｇＥ酵素であるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼは、アゾトバクター・ビンランディのようなアルギネート生成細菌によりエンコードされるモジュラー蛋白の群からなる。米国特許５９３９２８９は、これらの酵素をコードする配列、限定されたＧ／Ｍ比およびブロック構造を有するアルギネートを製造するためのこれらの酵素の製法およびそれらの用途を開示している。これらのイソ酵素は、それらの活性およびそれらが導入するエピマー化パターンにおいて異なる。ＡＩｇＥ−１および６は、長いＧ−ブロックを生ずるのに有効であり、ＡＩｇＥ４は、ＭＧＭ配列のみを導入する。前者は、強いゲル形成剤を与え、一方後者の酵素は、たわみ性鎖を発生する。例えば以下の表１を参照。
【００３０】
（表１）
（Ａ，ビンランディからの７つのＡＩｇＥエピメラーゼ）
タイプ ［ｋＤａ］ モジュラー構造 生成物
ＡＩｇＥ１ １４７．２ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａ２Ｒ４ ２官能性Ｇブロック＋
ＭＧブロック
ＡＩｇＥ２ １０３．１ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４ Ｇブロック（短い）
ＡＩｇＥ３ １９１ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａ２Ｒ４Ｒ５ ２官能性
Ｒ６Ｒ７
ＡＩｇＥ４ ５７．７ Ａ１Ｒ１ ＭＧブロック
ＡＩｇＥ５ １０３．７ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４ Ｇブロック（短い）
ＡＩｇＥ６ ９０．２ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３ Ｇブロック（長い）
ＡＩｇＥ７ ９０．４ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３ リアーゼ活性＋Ｇブロック
＋ＭＧブロック
Ａ：３６５アミノ酸、Ｒ：１５５アミノ酸
【００３１】
すべてのアルギネートおよびマンヌロナンは、置換前の原料アルギネートのエピマー化次に追加のエピマー化のような化学的工程および酵素的工程の順序を変更することを含む、１つの工程でまたは次々と、単一または混合物で使用される異なるＣ−５エピメラーゼの使用によってエピマー化できる。置換の程度並びにエピマー化の量および時間の両方を変えることにより、異なって選択的に置換されたアルギネート分子を得ることができる。エピマー化反応は、温度、反応時間、試薬の量およびこれらの組み合わせをコントロールすることによってコントロールできる。例えば、いくつかの態様では、エピマー化反応は、酸の添加、９０℃への加熱、または酵素反応に必要なカルシウムイオンを封鎖するＥＤＴＡ５０ｍＭの添加により停止される。反応をコントロールすることにより、Ｇに転換される未変性物の量はコントロールでき、従って最終の変性アルギネートにおけるＧの量はコントロールできる。
【００３２】
原料の性質も、最終生成物の性質をコントロールする。変性がエピマー化の前である方法における原料としてのポリマンヌロネートの使用は、Ｍのみが変性される最終生成物を与える。すなわち、マンヌロン酸残基を含む多糖（ポリマンヌロネート）を出発原料として使用すると、これらの物質は、カルボキシ官能基または水酸基の何れかで変性され次にＣ−５エピメラーゼの使用によりエピマー化されることが分かった。このエピマー化は、非変性残基で生じ、マンヌロン酸で選択的に変性されたアルギネート分子を生ずる。
【００３３】
もしマンヌロナンが原料として使用されそして残基の変性がＭからＧへのすべての酵素による転換の前であるならば、変性反応は、ポリマー鎖に沿ってランダムに分布した置換基を有するマンヌロナンを生ずる。未変性残基に対する変性残基の量は、反応時間、温度、試薬の量およびこれらの組み合わせをコントロールして所望度の変性Ｍを有する変性マンヌロナンを生成することによりコントロールできる。本発明の第二の工程では、部分的に置換されたマンヌロナンは、マンヌロナン−Ｃ−５エピメラーゼ、すなわちＤ−Ｍ残基をポリマー鎖の破壊なしにＬ−グルロン酸に転換する酵素により処理される。Ｃ−５エピメラーゼは、置換したＭ−残基を転換できないので、最終生成物は、カルシウム結合および結合形成のための未処理Ｇブロック並びに可溶な部分に残るＭ残基に排他的に位置する置換基を含むポリマーであろう。そこで、それらは、化学的架橋で互いに自由に相互反応するかまたは外性受容体と自由に反応する。
【００３４】
いくつかの態様では、原料アルギネートは、ＭおよびＧの両方を含む。この場合、化学的置換は、ＭおよびＧの両方の残基で起こることができる。酵素による部分的に置換したアルギネートの処理は、次に未置換のＭおよびＧ残基の一部を転換できる。１つの態様は、Ｍおよび／またはＧ基でまず部分的に置換され次にＭＧの残りのポリ交互セグメントを転換する特異性を有するＧ形成酵素（すなわちＡＩｇＥ−１）を使用するＣ−５エピマー化により酵素的に反応されるポリＭＧブロックからなるアルギネートである。
【００３５】
工程の順序および反応速度をコントロールすることにより、生成される変性アルギネートポリマーは、変化した度合の変性、Ｍ対Ｇの変化したレベルの変性、変化する量の未変性Ｍおよび変化する量の未変性Ｇを有する。
いくつかの態様では、Ｍのみが変性される。いくつかの態様では、ＭおよびＧが変性される。
【００３６】
いくつかの態様では、１０％より少ない残基が変性される。いくつかの態様では、２０％より少ない残基が変性される。いくつかの態様では、２０％より多い残基が変性される。いくつかの態様では、１０−８０％の残基が変性される。いくつかの態様では、２０−６０％の残基が変性される。いくつかの態様では、３０−５０％の残基が変性される。いくつかの態様では、約４０％の残基が変性される。
【００３７】
いくつかの態様では、２０％より少ない残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、２０％より多い残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、２０−８０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、３０−６０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、４０−５０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、約４５％の残基が未変性Ｇである。
【００３８】
変性アルギネートは、変性アルギネートと二価のゲル化イオン例えばＣａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｐｂ＋＋、Ｃｏ、Ｎｉまたはこれらの組み合わせとを組み合わせることによりアルギネートゲルまたは繊維を製造するのに使用できる。
【００３９】
いくつかの態様では、アルギネートゲルは、リビング細胞例えば増殖細胞または非増殖細胞を内包するのに使用される。細胞は、細胞株または患者／ドナーから得られる。細胞の例は、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株を含む。いくつかの態様では、内包した細胞は、細胞が維持されるとき発現する１つ以上の蛋白をエンコードする発現ベクターを含む。いくつかの態様では、蛋白は、サイトカイン、成長因子、インスリンまたは血管形成阻害剤例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、他の治療蛋白または他の分子例えば医薬である。約６０−７０より少ないｋＤの低いＭＷを有する蛋白は、ゲル網状構造の有孔性のために特に良好な候補者である。いくつかの態様では、細胞は、多細胞の凝集体または組織として存在する。
【００４０】
いくつかの態様では、アルギネート繊維は、複数の変性アルギネートポリマーと二価のゲル化イオンとを組み合わせそして架橋したアルギネートポリマーからなる繊維を押し出すことからなる方法で製造される。いくつかの態様では、固体の非架橋アルギネート組成物またはペーストは、複数の変性アルギネートポリマーを成形、成型、注型またはそれ以外の成形することにより製造される。
いくつかの態様では、変性工程および／またはエピメラーゼ工程は、既に存在するアルギネートゲルまたは繊維で行われる。
（実施例）
【実施例１】
【００４１】
（１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースを有する変性ポリマンヌロナンの製造）
１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトース（２７０ｍｇ）を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）（１．３ｇ）および１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２．１７ｇ）を含む０．２Ｍの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５、４００ｍＬ）中のポリマンヌロナン（１．５ｇ）のナトリウムの形の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌した。生成物を、５日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥してナトリウムポリマンヌロナンの精製したガラクトース誘導体を得た。収量１．４５ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算した置換度は、１２％であることが分かった。この方法によるアミド形成は、ポリマー中に存在するマンヌロン酸のカルボキシル（ウロン）基をターゲットにした。当業者は、生成物の置換度を、上記の反応においてポリマンヌロナン対１−アミノ−１−デオキシガラクトースの異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、分子とアミノ官能基との間のアルキルまたはアリールスペーサーを有するかまたは有しないアミノ基をもつアミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび光架橋可能な基に適用される。
【実施例２】
【００４２】
（ポリマンヌロナンのメタクリレートエステルの合成）
ナトリウムポリマンヌロナン（３ｇ）を３００ｍＬの脱イオン水に溶解し、そして氷浴で４℃に冷却した。無水メタクリル酸（２３ｇ）を冷却ポリマンヌロナン溶液に一定に攪拌しつつ滴下し、そしてｐＨを好適な量の５ＭのＮａＯＨの添加により９．０に維持した。攪拌を４℃の温度で２４時間続けた。反応生成物を９６％エタノールに沈殿させ、遠心分離し、エタノールにより３回洗った。生成物を次に水に溶解し、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜に対して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥してナトリウムポリマンヌロナンの精製メタクリレート誘導体を得た。収量２．６ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算して置換度は、８％であった。この方法によるエステル形成は、モノマー性単位に存在する第二級水酸基を目的とする。当業者は、生成物の置換度が、上記の反応においてポリマンヌロナン対無水物の異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、変性アミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび光架橋可能な基に適用される。
【実施例３】
【００４３】
（ＡＩｇＥ４を使用することによる変性ポリマーのエピマー化）
実施例１および２で記載したように得られた変性ポリマンヌロナン（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２００）、次に溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応は、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、そして４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌ（最終濃度０．２％）を加え、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．８５ｇ。当業者は、エピマー化度が、異なる反応時間の使用により変化することを認識する。
【実施例４】
【００４４】
（ＡＩｇＥ６を使用することによる変性ポリマーのエピマー化）
実施例１および２に記載したように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を次に添加し（酵素／ポリマーの重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で４８時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを添加し（最終濃度１．５％）、４℃に一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製エピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【００４５】
この方法は、２つのタイプのポリマーを与えた。（１）ガラクトースによるウロン基の変性次にエピマー化。ｄ．ｓ．＝１２％、ＦＧ＝０．４５、ＦＭ＝０．５５、ＦＧＧ＝０．１６。（２）光架橋可能な置換基による水酸基の変性次にエピマー化。原料；実施例２で報告されたポリマンヌロナン。ｄ．ｓ．＝８％、ＦＧ＝０．５４、ＦＭ＝０．４６、ＦＧＧ＝０．３７。
【００４６】
図１および２は、ラミナリア・ハイパーボレアン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａｎ）からの未変性および変性（ガラクトースの１４％）アルギネートに比べてガラクトシル化およびエピマー化マンヌロナンのゲル化性に対する効果を示す。
【実施例５】
【００４７】
（ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の組み合わせを使用することによる化学的に変性されたポリマーのエピマー化）
実施例１および２に記載されたように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨを維持する脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを加え（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が、異なる反応時間を使用することにより変化して、Ｇブロックおよび置換したＭ残基が分散しているポリ交互ブロックを有しそしてＭＭ配列を欠くことによりＡＩｇＥ６エピマー化ポリマーとは異なるポリマーを生ずることを認識する。これは、ポリマーのたわみ性を増大させそして高い離液および低い膨潤へ導く。
【実施例６】
【００４８】
（置換したポリＭＧ配列が散在するＧブロックからなるポリマーの製造）
実施例１および２に記載されたように得られたポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨを維持する脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを加え（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．８５ｇ。組成；Ｇのモルフラクション＝０．４７、ＧＧのモルフラクション＝０。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【００４９】
（１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースによる変性ポリＭＧの製造）
１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトース（２７０ｇ）を、ＮＨＳ（１．３ｇ）およびＥＤＣ（２．１７ｇ）を含む変性ポリマンヌロナンのナトリウムの形（１．５ｇ）の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌した。生成物を、５日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、ナトリウムポリマンヌロナンの精製したガラクトース誘導体を得た。収量１．４５ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算した置換度は、１２％であった。この方法によるアミド形成は、ポリマー中に存在するカルボキシル（ウロン）基を目的とした。当業者は、生成物の置換度が、上記の反応中のポリＭＧ対１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースの異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、アミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび分子とアミノ官能基との間にアルキルまたはアリールスペーサーを有するかまたは有しないアミノ基をもつ光架橋可能な基に適用される。
【００５０】
（ＡＩｇＥ１を使用することによる変性ポリＭＧの実験）
実施例１および２に記載したように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ１を次に添加し（酵素／ポリマーの重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で４８時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを添加し（最終濃度１．５％）、４℃に一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、ＭまたはＧ置換ポリＭＧ配列が散在する長いＧブロックを特徴とする変性マンヌロナンの精製エピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【実施例７】
【００５１】
化学的アプローチと酵素的アプローチとの組み合わせが開発されてＭ残基のみにβ−ガラクトース部分を有するアルギネート様ポリマーを得た。１−アミノ−１−デオキシガラクトースを、カップリング試薬としてＥＤＣ（１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）を使用してアミド結合を経てマンヌロナンに導入した。このポリマーは、交互Ｇ配列とホモポリマー性Ｇ配列との両方にグルロン酸残基を導入する２つの異なるＣ−５エピメラーゼの使用によりエピマー化された。Ｍ残基で選択的に変性されたグラフトアルギネートは、１Ｈ−ＮＭＲによりＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳと同定され、そして固有粘度およびそのカルシウム結合能は、円二色性スペクトル分析により検出された。変性物質は、同じ糖部分がＧ残基に導入されたアルギネートサンプルに比べたとき、機械的性質およびゲル形成の性質における改善を示した。最後に、Ｍ残基の選択的変性は、グラフトされたアルギネートから製造されたカルシウムビードの高い安定性を生じた。
【００５２】
（材料および方法）
ラミナリア・ハイパーボレアｓｔｐｅから単離されたナトリウムアルギネートの市販のサンプルＬＦ１０／６０（ＦＧ＝０．６９、ＦＧＧ＝０．５６）は、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ノルウェー）により用意された。高分子量マンヌロナン（ＦＧ＜０．００１）を、シュードモナス・フルオレセンスのエピメラーゼネガティブミュータント（Ａｌｇ）から単離した。精製および脱アセチル化は、本明細書で参考として引用されるＢｕｃｋｅ，Ｃ編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１０、７１に記載されているように実施された。ポリ交互ＭＧ（ＦＧ＝０．４７、ＦＧＧ＝０）を、本明細書で参考として引用されるＨａｒｔｍａｎｎ、Ｍ．ら「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」２００２、１５７０、１０４に記載されているように、ＡＩｇＥ４エピメラーゼの使用によりマンヌロナンから製造した。１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および塩化ナトリウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミルウオーキー、ＷＩ）から購入した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびＤ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイス、ＭＯ）から購入した。炭酸カルシウム（平均粒子サイズ４μｍ）は、Ｍｅｒｃｋ（ダルムスタット、ドイツ）から購入した。
【００５３】
（組み換えマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ）
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼは、Ｅ．コリ菌株のこれら組み換え体：ＪＭ１０５のＡＩｇＥ４およびＳＵＲＥのＡＩｇＥ６の発酵により製造された。酵素は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）のイオン交換クロマトグラフィーによりそしてフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の疎水性相互反応クロマトグラフィーにより部分的に精製した。酵素の活性は、３Ｈ−５−ラベルマンヌロナンを酵素とインキュベートしたとき、水へのトリチウムの放出を測定することにより分析された。
【００５４】
（ガラクトース置換マンヌロナン（ＭＧａｌ））
１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトース（ガラクトシルアミン）（２７０ｍｇ、０．２当量）を、ＮＨＳおよびＥＤＣ（［ＥＤＣ］／［Ｐｏｌｙｍ］＝１．５；［ＮＨＳ］／［ＥＤＣ］＝１、［Ｐｏｌｙｍ］は、グリコピラノシドポリマー繰り返し単位のモル濃度である）を含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５、４００ｍＬ）中のマンヌロナンのナトリウムの形（１．５ｇ）の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌し、ポリマーを、１日間ＮａＨＣＯ３（０．０５Ｍ）に対して透析し（膜のカットオフ分子量、約１２０００）、次に伝導度が４℃で２μＳより低くなるまで脱イオン水に対して透析した。ｐＨを７に調節し、ポリマーを０．４５μｍのミリポアフィルターを通して濾過し、凍結乾燥して、１Ｈ−ＮＭＲ分析（ポリマー鎖のＭ残基のアノマー性プロトンの強度に対するガラクトシルアミンのＨ−１シグナルの強度から計算した置換度（ｄ．ｓ．））および電位差滴定により明らかになる側鎖基として導入される１２％のガラクトースを含む変性マンヌロナンサンプルを得た。
【００５５】
（ＡＩｇＥ４によるエピマー化（ＭＧａｌＥ４））
ポリマーＭＧａｌを、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）そして溶液を３７℃で２４時間攪拌した。
【００５６】
（ＡＩｇＥ６によるエピマー化（ＭＧａｌＥ４Ｅ６））
ポリマーＭＧａｌＥ４を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２０）そして溶液を３７℃で２４時間攪拌した。
【００５７】
（エピマー化ポリマーの精製）
エピマー化反応を、５ＭのＮａＣｌ溶液（最終濃度１．５％）および塩酸（３Ｍ）を冷却ポリマー溶液に添加してｐＨ値をほぼ１−２にすることにより停止した。混合物を４℃で一晩貯蔵して沈降を助けた。沈殿物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。沈殿物を、希釈水酸化ナトリウムの添加により７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液をＮａＣｌの５Ｍ溶液と混合し（最終濃度０．２％）、エタノールにより沈殿させた。沈殿物を、伝導度が４℃で２μＳより低くなるまで脱イオン水に対して透析し（膜のカットオフ分子量、約１２０００）、ｐＨを７に調節し、ポリマーを０．４５μｍのミリポアフィルターを通して濾過し、凍結乾燥した。
【００５８】
（Ｌ．ハイパーボレアからのガラクトース置換アルギネート（ＬｈｙｐＧａｌ））
Ｌ．ハイパーボレアからのアルギネートサンプルを、前記のように１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースにより処理した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により明らかにされるようにＧ残基に導入された１４％のガラクトース部分を有する変性アルギネートを得た。
【００５９】
（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析）
サンプルを、Ｇｒａｓｄａｌｅｎらにより記載されたように製造した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＷＭ３００により９０℃でＤ２Ｏで記録された。化学シフトは、３−（トリメチルシリル）プロパンスルホネートに関するシグナルからダウンフィールドでｐ．ｐ．ｍ．で示された。
【００６０】
（電位差測定）
電位差滴定は、ＭＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６サンプルの当量を決定するのに行われた。ガラス電極を備えた放射計ｐＨＭ２４０ｐＨメーターを使用した。ポリマーのＨ＋の形は、一晩０．１ＭのＨＣｌに対して３ｇ／Ｌの溶液を透析することにより製造された。過剰のＨＣｌは、脱イオン水に対する完全透析により除いた。ポリマーを凍結乾燥によって回収した。特定の濃度を有する周知のポリマーの水溶液を、０．１ＭのＮａＯＨ標準溶液（Ｔｒｉｔｉｓｏｌ、Ｍｅｒｃｋ）により滴定した。１９８±４ｇ／モルおよび２００±３ｇ／モルの繰り返し単位のモル質量が、それぞれＭＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６の＋Ｈ形について見いだされ、それらは、ＮＭＲから得られる置換度に基づいて計算された理論値（１９５．３ｇ／モル）とややうまく類似した。
【００６１】
（円二色性スペクトル分析）
ポリマーＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のナトリウムの形の円二色性スペクトル（表２参照）は、それぞれＪａｓｃｏ Ｊ−７００分光偏光計により脱イオン水（ｃ〜２＊１０−３モノモル／Ｌ）中で記録された。１ｃｍ光路長の石英セルを使用しそして以下の構成を維持した。バンド幅、１ｎｍ、時間定数、２ｓ、走査速度、２０ｎｍ／分。バックグラウンドに対して補正された４つのスペクトルをそれぞれのサンプルについて平均化した。それぞれのサンプルのスペクトルは、［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］＝０．２６へのＣａ（ＣｌＯ４）２溶液の添加前および後に記録された。
【００６２】
（ビード形成）
それぞれＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６であるＬ．ハイパーボレアからのカルシウムビードは、２％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液を５０ｍＭのＣａＣｌ２溶液に注ぐことにより得られた。小滴のサイズは、高電圧静電気ビード発生器（７ｋＶ、１０ｍＬ／時、外径０．４ｍｍの鋼針、針からゲル化溶液の距離１．７ｃｍ）を使用することによりコントロールできた。得られたアルギネートゲルビードを、使用前にゲル化溶液中で３０分間攪拌した。
【００６３】
（塩水溶液中の安定性）
Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られたカルシウムアルギネートビードの寸法安定性は、１／２ｍＬのゲルビードが３ｍＬの塩水溶液（０．９％）に添加されたとき、それぞれ倒立光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により測定された。サンプルを１時間攪拌した。塩水溶液を数回取り替え、そしてカプセルの直径を、それぞれの取り替え前に測定した（ｎ＝２５）。カプセルを、測定前に脱イオン水により洗った。
【００６４】
（ゲル化の反応の仕組みおよびレオロジーの同定）
ゲル化の反応の仕組みおよび動的粘弾性の測定は、Ｓｔｒｅｓｓ−Ｔｅｃｈ汎用レオメーター（ＲＥＯＬＯＧＩＣＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、２２３６３ Ｌｕｎｄ、スウェーデン）を用いることにより実施された。簡単にいえば、それぞれＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６の１．５％溶液（表２参照）に、ＣａＣＯ３（２０ｍＭ）およびＧＤＬ（４０ｍＭ）を添加しそして混合物を測定前に３０秒間攪拌した。これらの実験は、Ｔ＝２０℃およびギャップ＝１．００ｍｍで、切り込みの入ったプレート−プレート（ｄ＝４０ｍｍ）の測定パターンにより行われた。ゲル化の反応の仕組みは、ほぼ１８時間３分間の間隔でＧ′およびＧ′′（ω＝６．２８ｒａｄ＊ｓ−１）の繰り返された測定により得られた。動的粘弾性の測定は、動的弾性率（Ｇ′）および損失弾性率（Ｇ′′）の振動数依存度を測定することによりゲル化２４時間後に行われた。振動数の掃引は、振動数の範囲０．０１−５０Ｈｚで一定のひずみ（０．００１）で行われた。サンプルは、低密度シリコーン油によりシールされて、ゲル化実験中の溶媒の蒸発に伴う不都合な作用を避けた。
【００６５】
（ゲル円筒の製造および離液）
Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６からの均質なカルシウムゲルは、それぞれ、ポリマー溶液とＣａ２＋（ＣａＣＯ３）の不活性形とをブレンドし次に徐々に加水分解したＤ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）をモル比ＧＤＬ／Ｃａ２＋＝２に維持しつつ添加することにより製造した。ポリマーの最終の濃度は、すべての場合に１％（ｗ／ｖ）であった。
【００６６】
Ｃａ−アルギネートゲルの離液は、密度の値を１と考えて計算して、最初の重量に対するゲルの重量減として測定された。上記のようにして製造されたＣａ−ポリマーゲル化溶液の一部を、直径１６ｍｍおよび高さ１８ｍｍを有する２４穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、ＭＡ）で硬化した。ゲルを２４時間後穴から取りだし、そしてそれらの重量を測定した。離液は、（１−Ｗ／Ｗ０）＊１００（ただし、ＷおよびＷ０は、それぞれ、ゲル円筒の最終および最初の重量である）として計算された。
【００６７】
得られるゲルのヤング率（Ｅ）は、２０℃でＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＴＡ−ＸＴ２ Ｔｅｘｔｕｒｅ分析器により測定された力／変形の曲線の最初のスロープから計算された。離液を示すすべてのゲルについて、最終のポリマー濃度が決定され、そしてＥは、Ｅ∝ｃ２を採用して補正された。
【００６８】
（粘度測定）
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のナトリウム形（表２参照）の細管粘度の低下は、それぞれ、Ｓｃｈｏｔｔ−Ｇｅｒｅａｔｅ ＡＶＳ／Ｇ自動装置およびＵｂｂｅｌｏｈｄｅタイプ粘度計を使用することにより２５℃で０．１ＭのＮａＣｌで測定された。固有粘度の値は、低下した比粘度（ηｓｐ／ｃ）の濃度依存性並びにＨｕｇｇｉｎｓ（１）およびＫｒａｅｍｅｒ（２）の式を使用することによる相対粘度（Ｉｎηｓｐ／ｃ）の対数の低下をそれぞれ分析することによって測定された。
ηｓｐ／ｃ＝［η］＋ｋ′［η］２ｃ （１）
（ｌｎηｒｅｌ）／ｃ＝［η］−ｋ′′［η］２ｃ （２）
（式中、ｋ′およびｋ′′は、ＨｕｇｇｉｎｓおよびＫｒａｅｍｅｒの定数である。）
【００６９】
（複数角レーザー光散乱と組み合わされた高速サイズ除外クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳ））
ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳシステムは、オンライン脱気器（島津ＤＧＵ−４Ａ）、ポンプ（島津ＬＣ−１０ＡＤ）および３つの直列に連結したカラム（ＴＳＫ ＧＥＬ Ｇ６０００／５０００／４０００ＰＷＸＬ）から成った。溶離液は、０．５ｍＬ／分で０．０１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６）を含む０．０５ＭのＮａ２ＳＯ４であった。検出器は、屈折率（ＲＩ）ＵＶモニター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ ＵＶ−Ｍ ＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．ウプサラ、スウェーデン）および複数角レーザー光散乱（Ｈｅ−Ｎｅレーザー６３２．８ｎｍを備えたＭＡＬＬＳ−Ｄａｗｎ ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．サンタ バーバラ、ＣＡ、米国）であった。サンプルを、ｐＨ＝６で０．０１ＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＮａ２ＳＯ４中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、そして１００μＬの注入前に０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。分子量測定のためのデータは、ＡＳＴＲＡソフトウエア（バージョン４．７０．０７、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．サンタ バーバラ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。使用された屈折率の増分（ｄｎ／ｄｃ）は、０．１５であった。角適合度は、Ｄｅｂｙｅの方法に基づき、重量平均分子量Ｍｗそして数平均分子量Ｍｎは、ｌｏｇＭ（Ｍ＝分子量）対溶離体積の一次多項曲線に従って得られた。
【００７０】
（結果および検討）
（合成および特性）
アルギネート鎖への１−アミノ−１−デオキシ−β−ガラクトースの導入が、Ｇ残基に主として影響を与え、ゲル化の能力および安定性の両者並びにポリマー鎖のコンホメーションに影響することが既に報告されている。明白な改善は、マンヌロナン（Ｍ）残基への側鎖基の選択的導入の可能性により示されるだろう。これらの基がゲルの形成に含まれないことを考えて、これらの選択的に変性されたアルギネートのカルシウム結合およびゲル化性は、影響されないだろう。しかし、ウロン性官能基の類似性から、本発明者の考えによれば、保護基に基づくどんな方法も、この目的には適さない。この問題を克服するために、Ｃ−５エピメラーゼにより誘導される２つのエピマー化を伴うマンヌロナンの連続する化学的変性が、考えられてきた（図１４）。
【００７１】
第一の工程では、１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトース（ガラクトシルアミン）は、マンヌロナンのＭ残基のウロン性基にＮグルコシド結合を経て導入された。アルギネートとガラクトシルアミンとの間のカップリング反応は、既に成功することが証明されているＮＨＳの存在下縮合剤ＥＤＣを利用して行われた。ガラクトース置換マンヌロナンＭＧａｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図６に報告されている。前述したように、Ｍ残基へガラクトシルアミン部分が導入されると、新しく形成されたピークは、約４．７５ｐｐｍで検知可能であり、側鎖として存在する糖のアノマー性プロトンから生ずる。このピークの領域から得られた置換度（１２％）は、ポリマーのＨ＋形の電位差滴定から得られる値と良く一致する。
【００７２】
ガラクトース置換マンヌロナンから出発して、グルロン残基は、酵素ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の使用により行われた２つの連続するエピマー化反応によりポリマー鎖に導入された。従来の研究と矛盾して、２つの酵素は、最高のエピマー化の能率を達成するために必要な異なる塩化ナトリウムの濃度からみて、別々に使用された。始めのエピマー化反応では、サンプルＭＧａｌは、２４時間ＡＩｇＥ４により処理され、そのためエピメラーゼの作用の態様をもたらすと予想されるように、Ｇ残基は長い交互ＭＧＭ配列に導入される（図１４）、事実、エピマー化された物質すなわちＭＧａｌＥ４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは（図６）、新しく導入されるＧ残基のアノマー性プロトンから生ずる〜５．０７ｐｐｍでのピークの存在は、明確に検知可能である。後者のピークの領域から数値が求められるＧ残基の全体の含量（ＦＧ）は、０．３３であると分かった（表２）。その上、交互の配列のＧ残基に属するＨ−５シグナルの存在により誘導される４．８−４．６５ｐｐｍに及ぶ領域のスペクトルの複雑性の増大に注目することが重要である。
【００７３】
ホモポリマー性配列または交互配列のＭ残基に結合するガラクトシルアミン間を区別する可能性のために、変性Ｍ残基および隣接基へのエピマー化反応の障害は、容易に予言できるものとして開示された。事実、Ｇ残基に隣接するＭに導入されるガラクトシルアミンのアノマー性プロトンに属する〜４．９ｐｐｍに位置するどんなシグナルも検知されず、変性Ｍ部分に隣接するＭ残基がエピマー化に利用されないことを証明した。この考えに基づいて、ＭＧａｌＥ４の場合に達成されたエピマー化全体を、ＡＩｇＥ４処理マンヌロナンについて得られた結果と比較した。図７ａは、実験上のＧ残基含量と理論上のＧ残基含量との間の比として示される酵素の能率（％）を報告し、後者は、厳密な交互配列を生成するすべての利用可能なＭ残基の全エピマー化として計算された。ＡＩｇＥ４処理マンヌロナンの場合には、最終のＧ含量は、厳密な交互配列で０．４７であることを見いだした。この基質について０．５０の理論上の最大値を考えて、９４％の酵素の能率は計算された。サンプルＭＧａｌＥ４の場合では、ガラクトース変性残基および隣接するＭ基は、エピマー化反応では利用されず、この事実は、０．３８に等しい導入されたＧ残基の理論上最大の量（ＦＧ）に導く。そのため、酵素の活性が後者の場合に８６％に低下されるので、側鎖としてガラクトース残基の存在は、エピマー化反応に小さい作用のみをもたらすに過ぎない。
【００７４】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６を生ずる第二のエピマー化は、ホモポリマー性Ｇ配列を導入するために、エピメラーゼＡＩｇＥ６を使用して行われた（図１４）。図６は、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのアノマー性領域を報告している。ホモポリマー性配列のＧ残基のＨ−５プロトンから生ずる〜４．４５ｐｐｍでの新しく形成されたシグナルは、排他的にＭ残基に１２％のガラクトース部分を有するサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の交互性およびホモポリマー性の両者のＧ配列の存在を証明する。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の１価の基および２価の基の含量は、表２に報告される。カルシウムゲルの形成に必須の特徴である約１６％のＧＧ２価基の存在を強調することは重要である。
【００７５】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６中のポリマー鎖のシグナルのいくつかは、側鎖として存在するガラクトース部分のシグナルと重なり、これは、独立した方法により置換度をチェックさせる。従って、このポリマーのＨ＋形の電位差滴定が行われた。後者の方法で計算される置換度（１５％）は、Ｎ−グリコシド結合のどんな劣化もエピマー化または最終の生成物の精製の何れの間で生じなかった。
【００７６】
サンプルＭＧａｌＥ４に関するエピメラーゼＡＩｇＥ６の能率の数値を求めるために、厳密に交互するＭＧポリマーを同じ反応条件で処理した（図７ｂ）。上記の同じ推定の下、ポリマー性鎖のガラクトシルアミンの存在が、ポリマー中の追加のＧ残基の導入を劇的に妨げないと結論せざるをえない。事実、図７ｂに報告されたように、僅かな減少（５９％）が、ポリ交互ＭＧサンプルについて観察されたそれ（６７％）に比べたとき、ガラクトース変性ポリマーに対するＡＩｇＥ６の能率について経験された。しかし、側鎖の作用は、ポリ交互ＭＧサンプルに対する同じ酵素により示される４１％に比べて、ＭＧａｌＥ４に対する２１％に等しい酵素の能率により、ＧＧ２価基の導入に一層明らかである。
【００７７】
表２は、１価の基および２価の基の両者において３つのサンプルの組成を要約している。交互性およびホモポリマー性の両方のＧ配列が存在するので、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、選択的にＭ残基に１２％のガラクトシルアミンを有するアルギネート様部分として記述できる。
【００７８】
ポリマーと糖部分との間に導入されるスペーサーのエピマー化に対する作用を予備的に明らかにするために、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ）をマンヌロナンポリマー鎖に結合する。０．３当量のｐＮＨ２ＰｈβＧａｌを使用するＥＤＣ／ＮＨＳ化学（材料および方法参照）により達成されるこの変性ポリマーは、ＭＧａｌについて報告された同じ反応条件の下にエピマー化され、そして得られたサンプルは、１Ｈ−ＮＭＲにより分析された。図８（ａ−ｃ）で報告されているスペクトルから、比較的高い置換度（ｄ．ｓ．＝１８％）にもかかわらず、注目すべきエピマー化が達成されていることに注目すべきである。事実、図８に報告されている１Ｈ−ＮＭＲの定量分析は、ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ変性基質へのＧ残基の導入に関して、それぞれＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の場合の８２％および５６％の能率を明らかにしており、従ってフェニル部分により示される剛いスペーサー基が、未変性Ｍ残基のＣ−５転化に顕著に影響しないことを証明している。さらに、ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６による処理が、エピマー化サンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中の芳香族環に属する容易に検出できる共鳴の存在により証明されるように、ポリマーと側鎖基との間のアミド結合を開裂しない（図８ｂおよびｃ参照）。
【００７９】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の分子的な詳細の予備的な評価は、固有粘度およびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ測定により得られた（表２）。両方の方法が、エピマー化の結果として分子量の低下（恐らく酵素の僅かなリアーゼ活性から生ずる）を明らかにしていることを強調したい。この劣化にもかかわらず、本発明の化学−酵素的なアプローチすなわちＭＧａｌＥ４Ｅ６から生成されるポリマーは、比較的高い分子量（〜１８３０００）を示す。
【００８０】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の永存長ｑは、ＦｌｏｒｙおよびＦｏｘによる等しいモデル（「ノンドレイニング（ｎｏｎｄｒａｉｎｉｎｇ）」理論）から誘導された以下の式を用いて試みられた。アルギネートを比較的硬い分子（毛虫様鎖）としてアルギネートを考えると、永存長は、固有粘度の値および分子量から推定できる。
ｑ＝１／２＊［（１／ＤＰ＊ｌ）＊（［η］Ｍｗ／Φ）２／３］
（式中、ＤＰは重合度を表し、ｌは仮想の結合長であり、そしてΦは鎖分子単位の空間的分布の関数である）。上記の式は、単分散系では完全にあてはまり、その上、Φは普遍的な定数であるか、または少なくとも考慮されている異なるポリマーの所定の群では一定である。これらの仮定の下で、ｑの非常に類似した値が得られ（ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６について、それぞれ、１２．２±１．２ｎｍ、１３．５±０．６ｎｍおよび１４．４±０．３ｎｍ）、定性的なレベルで、Ｍ残基のエピマー化がこれらのガラクトース変性ポリマーの剛さを顕著に変えないことを示唆している。
【００８１】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のキロプチカル性は、それぞれ、円二色性により調べられた（図９ａ−ｃ）。波長の関数としてのモル楕円率の異なるプロフィルが、３つのサンプルにより開示され、それはポリマー鎖中のＧ残基の導入から生ずることが注目される。事実、アルギネートの２つの糖成分が異なるキロプチカル挙動を示し、ポリマーの全体のＣＤスペクトルがＭおよびＧ部分の相対的量および配列パターンに依存することは、良く知られている。特に、ＧＧ、ＭＭおよびＭＧ配列のＣＤスペクトルは、ピークの位置、サインおよび強度において相違を示す。円二色性は、また、上記の３つのポリマーすなわちＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６によるカルシウムのような二価のカチオンの結合に関する定量ではないが有用な情報をもたらすことができる。ポリマーのウロン性部分による二価のカチオンの強い配位は、Ｃａ結合の配列のコンホメーションに変化をもたらす。後者は、ポリマーサンプルの全体のＣＤスペクトルの変化として検出される、カルボキシレート基のエレクトロニック環境の変性に導かれる。ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のＣＤスペクトルは、それぞれ、既知でしかも等しい量のカルシウムの添加前および後に記録され、結果は、図９（ａ−ｃ）に報告される。特に、サンプルＭＧａｌは、カルシウムの添加によりスペクトルに関連のある変化を示さなかったが（図９ａ）、そのため、ホモポリマー性Ｍ配列によるカルシウムイオンの特異的な配位の可能性を排除することを注意すべきである。対照的に、当量のカルシウムによりサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６を処理することにより、スペクトルの注目すべき変化が検出され（図９ｃ）、これは、ＭＧａｌＥ４Ｅ６にのみ生ずるにすぎないいわゆる「エッグボックス」構造であるコンホメーション的に配列されたホモポリマー性Ｇ配列の形成により説明される。この結果は、これらの選択的に変性かつエ）ピマー化された物質が協働してカルシウムを結合する能力を証明する。図９ｂに報告されるように、またポリマーＭＧａｌＥ４は、ＧＧ二価基を完全に欠いているにもかかわらず、カルシウムの添加によりかなりな変化を示すことは、意味のあることである。さらなる分析が必要であるが、カルシウムの存在により誘導される長い規則的な交互配列間の鎖内結合の形成は、Ｍｏｒｒｉｓおよび共同研究者により既に示唆されているように、観察された挙動の原因であると提案することができるだろう。
【００８２】
（ゲルの形成および性質）
好適なバイオ活性のバイオ材料として選択的に変性されたアルギネートＭＧａｌＥ４Ｅ６を提示するために、そのカルシウムゲルの物理的性質すなわちゲルの反応の仕組み、粘弾性挙動およびヤング率が測定された。特に、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６からのカルシウム−ヒドロゲルは、既に報告されたようにサンプルＬｈｙｐＧａｌから得られるものと比較された。前者はＭ残基にのみ１２％の１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースを有するが、後者はＧ部分に位置する同じ残基の同様な含量（１４％）の存在を特徴とすることを強調するのが重要である。Ｌ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートは、標準ゲル形成材料としてこの比較に使用された。
【００８３】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアからのアルギネートに関するゲル形成の反応の仕組みは、それぞれ、ポリマー溶液に不活性形のカルシウムイオン（ＣａＣＯ３）を添加し、次に徐々に加水分解するラクトンＧＤＬを添加することにより研究された。添加されるカルシウムのモルとポリマー繰り返し単位のモルとの間の比は、ゲルの離液を制限するために、すべての３つのサンプルで０．２６に等しかった（図１２ｂ参照）。
【００８４】
この「内部ゲル化」プロセスでは、ＧＤＬの（遅い）加水分解は、ＨＣＯ３−の不溶性ＣａＣＯ３を転換するプロトンを放出し、それによりゲルの形成に必要なカルシウムイオンをもたらす。ラクトンの混合とゲル形成との間の遅延は、レオメーターにおけるヒドロゲルの形成および硬化の研究を可能にする（図１０ａ−ｃ）。
【００８５】
図１０ａは、ゲル形成プロセスの最初の１０００秒におけるＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６のそれぞれの動的弾性率（Ｇ′）の変化を報告している。データは、アルギネート中のＧ残基へのガラクトース部分の導入は、ゲル形成の反応の仕組みに強く影響する。事実、ＬｈｙｐＧａｌとＬ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートサンプルとの比較から、前者は、最初の１０００秒ではＧ′値の顕著な変化を示さないが、後者は、動的弾性率の１６倍の増加を開示することが強調される。逆に、ＬｈｙｐＧａｌのそれに似た量のガラクトースを有するがＭ残基に選択的に導入されたサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、同じ観察時間で動的弾性率の顕著な増加を示し、Ｌ．ハイパーボレアからのガラクトース変性アルギネートに比較するとき、より早いゲル形成を示した。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の場合の動的弾性率の顕著な増加は、長い交互配列のポリマーにおける量の多さにさかのぼることができ、それは結合のより早い、しかもより能率的な形成を導くものと思われる。
【００８６】
これらの考察は、図１０ｂにより確認でき、そこでは、ゲル形成の最初の１０００秒中記録される相角度（δ）の変化が、それぞれＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６について報告されている。繰り返すが、Ｇ残基への側鎖の導入は、ＬｈｙｐＧａｌのゲル形成を損なう。反対に、酵素化学的変性アプローチを開発しそして非ゲル形成Ｍ残基上の選択的置換すなわちＭＧａｌＥ４Ｅ６を達成することにより、ポリマーのゲル形成性は、影響されることがない。
【００８７】
内部ゲル化により得られるゲルの硬化は、Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６について、それぞれ約７×１０４秒行われ、図１０ｃで示されるように、すべての３つのケースで安定なゲルを得た。ゲルの完全な形成後、機械的な面は、Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６サンプルについて、それぞれ測定された（図１１）。すべての３つのケースにおいて、動的弾性率（Ｇ′）は、ωの全範囲にわたって損失弾性率（Ｇ′′）より常に高く、これらの物質をゲルとして規定するための本当に初めの要件を満足する。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の場合、振動数からのＧ′の独立性は、Ｇ′とＧ′′との間のほぼ１００倍の相違とあいまって、この系を強いゲルとする。
【００８８】
３つのアルギネートサンプルからのヒドロゲルの物理的性質における相違のさらなる評価を得るために、ＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよび未変性Ｌ．ハイパーボレアアルギネートサンプルから得られるゲル円筒に関するヤング率は、それぞれ測定された（図１２ａ）。３つのサンプルの定量的比較のために、カルシウムキレート化に利用できるＣａ２＋イオンのモルとＧ残基のモルとの間の一定の比が使用された。従って、ＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアからのアルギネートからのゲル円筒は、各ポリマーの炭酸カルシウムの異なる濃度すなわちそれぞれ１３．３、１６および２２ｍＭを使用して製造された。
【００８９】
変性アルギネートサンプルの値（〜１１ｋＰａ）から出発して、Ｇ残基へのガラクトシルアミン部分の導入は、ゲルの強さに劇的に影響し、そしてＬｈｙｐＧａｌについてヤング率を〜４．２ｋＰａ低下させたことに注意することが重要である。しかし、マンヌロナンへの側鎖ガラクトースの導入次に２つのエピマー化を行うことは、ゲルの強さの点で良好な結果を生ずる。事実、８．７ｋＰａのヤング率は、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６について測定され、それはポリマー鎖の選択的変性の重要性を強調する。
【００９０】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、また、図１２ｂで報告されるように、添加されたカルシウムの量により誘導される驚くべき離液を示す。ゲルの離液は、液体の部分的な滲出を生ずる遅い時間に依存する収縮を顕微鏡的に特徴とする現象である。離液は、ゲル形成後のポリマー鎖の横方向の会合により生ずるものとされており、そしてそれは、アルギネートサンプル中に存在する交互配列の量に既に関連している。図１２ｂでは、カルシウム／ポリマー繰り返し単位の比に対する離液（％）は、それぞれサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアについてプロットされた。エピマー化された物質すなわちサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６が、Ｌ．ハイパーボレアからの未変性サンプルに比べたとき、溶液中に分散したＣａＣＯ３の量に対する離液の高い依存性を示すことを認めることができる。この挙動は、前のポリマーに存在する多量の交互ＭＧＭ配列を考慮に入れることによって説明できる。対照的に、Ｌ．ハイパーボレア源からのＧ変性アルギネートサンプルすなわちＬｈｙｐＧａｌは、カルシウム濃度に対する離液の依存性をなんら示さず、後者の場合には、Ｇ残基上のかさ高なガラクトース部分の存在は、ゲル中のポリマー鎖の横方向の会合を立体的に障害し、従って脱膨潤作用を妨げる。
【００９１】
（カプセルの形成および安定性）
カプセルを形成するサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の能力について特別な注目が集まっている。ＭＧａｌＥ４Ｅ６の２％溶液を５０ｍＭの塩化カルシウム溶液に注ぐと、安定なカプセルが得られたことが観察された。これらカプセルの直径は、静電気ビード発生器（材料および方法の項参照）によりコントロールされるが、４０４±１９μｍであることが分かった（ｎ＝２０）。
【００９２】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られるカプセルの安定性は、塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）による処理によって寸法（直径）の変化を測ることによりテストされた。比較のために、未変性Ｌ．ハイパーボレアおよびサンプルＬｈｙｐＧａｌから得られるカプセルの安定性を考えた。
【００９３】
カプセルは、イオン性ゲルであり、その体積は、正の浸透圧（膨張）により主として左右され、その正の圧は、ゲル中の架橋の数に関連する網状構造の弾性による負の圧により平衡になる。
【００９４】
カプセルを過剰のＮａ＋対イオンすなわち塩水溶液により処理することによって、一価のカチオンと二価のカチオンとの間の競合は、カプセル中のカルシウムイオンへの置換に導かれることが最終的に生ずる。これらの処理の効果のすべては、カプセルの直径の増大に関係のあるＧ結合の数および長さの減少である。そのため、塩水処理の取り替えの所定の数による寸法の変化が大きければ大きいほど、カプセルの安定性は低くなる。
【００９５】
図１３は、それぞれＬ．ハイパーボレアアルギネート、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られるカプセルに対する塩水溶液の置換の取り替えの効果を報告している。未変性Ｌ．ハイパーボレアとＧ残基に導入される１４％のガラクトースを有するサンプルすなわちＬｈｙｐＧａｌとの間の比較から、後者の場合では安定性の低下を合わせたものが、既に論じられたように、経験されることを強調すべきである。事実、塩水溶液を２回変えた後、サンプルＬｈｙｐＧａｌからのカプセルは直径が２倍増加するが、Ｌ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートから得られるカプセルは、１．１倍の増加を示すに過ぎなかった。この効果は、アルギネート中のグルロン残基における側鎖基の存在にさかのぼり、そのカルシウム結合性を実質的に損なうことになる。
【００９６】
逆に、ＭＧａｌＥ４Ｅ６からのカプセルは、驚くべき安定性を示し、塩水を２回変えた後に直径が１．３倍に増加した。Ｇ変性物質ＬｈｙｐＧａｌに比較してこのサンプルによって示される高い安定性は、サンプルポリマーにおいて、側鎖基の導入はＭ残基のみに影響することを考えて、説明できる。ゲル形成に含まれない残基上の選択的なこのような変性は、アルギネートサンプルによるカルシウムの結合を妨げず、一層安定なカプセルに導かれる。さらに、カプセルの安定における長い交互配列の役割も、また、既に報告されたように、提案されている。
【００９７】
（結論）
構造的に精製されたマンヌロナンの利用可能性および異なるＣ−５エピメラーゼの利用可能性は、Ｍ残基で選択的に変性されるアルギネート様分子を生成する新しい方法を案出することを可能にした。酵素化学的変性アプローチは、マンヌロン部分に排他的にガラクトース残基を有する新しいバイオ活性バイオ材料の生成でテストされた。ガラクトース変性物質に対するエピメラーゼの作用は、１Ｈ−ＮＭＲにより分析され、そして得られたポリマーは、固有粘度、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳおよび円二色性スペクトル分析により分析された。
【００９８】
変性かつエピマー化された物質のレオロージー測定は、特にＧ残基を同様に変性したアルギネートサンプルとの比較において、Ｍ残基への側鎖基の選択的導入の機械的性質への有利さを指摘している。
【００９９】
ガラクトース部分を存在させることにより、変性かつエピマー化された物質は、肝細胞の内包のための新しいバイオ活性バイオ材料として提案でき、その場合、アルギネートゲルの機械的および膨潤の性質が、Ｌ．ハイパーボレアサンプルからの変性アルギネートに関して改善されている。しかし、このような酵素化学的変性アプローチが、広範囲な応用可能性をもたらし、新規なバイオ材料の製造に向かって新しい機会を特にアピールし開くようにすることに注目することが重要である。結論として、エピマー化を伴うマンヌロナンの変性は、テイラーメイドの構造および物理性を有する選択的に変性された物質を得るために、信頼できる新しい方法として提案できる。
【０１００】
（表２）
（ポリマーＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の１価の基および２価の基としての組成、固有粘度および分子量）
サンプル ＦＧ ＦＭ ＦＧＧ ＦＧＭ／ＭＧ ＦＭＭ
ＭＧａｌ ０ １ ０ ０ １
ＭＧａｌＥ４ ０．３３ ０．６７ ０ ０．３３ ０．３４
ＭＧａｌＥ４Ｅ６ ０．４５ ０．５５ ０．１６ ０．２９ ０．２６
サンプル ［η］ Ｋ′ Ｋ′′ Ｍｗ ｄ
（ｄＬ／ｇ）ａ （ｇ／モル）ｂ（Ｍｗ／Ｍｎ）ｃ
ＭＧａｌ １１．９８ ０．４２４ ０．１２ ４４８×１０３ １．５４
ＭＧａｌＥ４ ９．３４ ０．３９３ ０．１３０ ２３６２×１０２ １．６８
ＭＧａｌＥ４Ｅ６ ８．８５ ０．３７２ ０．１４１ １８３２×１０２ １．７３
【０１０１】
ＦＧは、グルロン酸からなるアルギネートの割合を示し、ＦＧＧは、ダイマーのブロック中のグルロン酸からなるアルギネートの割合を示し、一方ＦＭＭは、２価のマンヌロン基からなるアルギネートの割合を示し、ＦＧＭ／ＭＧは、グルロン酸およびマンヌロン酸の混合配列からなるアルギネートの割合を示す。ａは、溶媒：ＮａＣｌ ０．１Ｍ、Ｔ＝２０℃であり、ｋ′およびｋ′′は、それぞれヒギンスの定数およびクレマーの定数を示す。ｂは、重量平均分子量であり、そしてｃは、ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳにより測定された多分散性指数である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】アルギネートのＭａｎＡ残基の選択的置換の２工程方法の例を示す。第一の工程は、ガラクトサミンによるマンヌロナンの置換である。第二の工程は、組み換えで生成したＣ−５エピメラーゼを使用するＣ−５エピマー化である。実施例１は、図１に示された方法に関する。
【図２】以下の３つから作られたカルシウムアルギネートゲルビードの膨潤を示す。四角：Ｌ．ハイパーボレア、丸：ポリマンヌロナン、変性およびエピマー化（１２％のガラクトース）、三角：塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）の取り替えの数による変性Ｌ．ハイパーボレア（１４％のガラクトース）。
【図３】以下の１−３に関するヤング率として測定された機械的強さを示す。１：未変性Ｌ．ハイパーボレア、２：変性Ｌ．ハイパーボレア（１４％のガラクトース）、３；ポリマンヌロナン、変性およびエピマー化（１２％のガラクトース）。
【図４】塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）の取り替えの数による、以下の３つから製造されたＣａアルギネートゲルビードの膨潤に対するＭ残基の選択的変性の効果を示す。丸：Ｌ．ハイパーボレア、四角：変性かつエピマー化マンヌロナン、三角：Ｌ．ｈｙｐ．アルギネート。
【図５】５０ｍＭのＥＤＴＡにおける安定性（左）および０．９％ＮａＣｌ溶液中の膨潤（右）に対するＭ置換アルギネートカプセルの光架橋の効果を示す。四角：未架橋サンプル、丸：光架橋サンプル。
【図６】ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（アノマー性領域）を示す。
【図７】ａは、ポリマー鎖中の単一Ｇ残基の導入に関するマンヌロナンおよびＭＧａｌサンプルに対するエピメラーゼＡＩｇＥ４の能率（％）の比較を示す。ｂは、ポリマー鎖中の単一のＧ残基（淡いグレー）およびＧＧ２価基（濃いグレー）の導入に関するポリ交互ＭＧ（ＦＧ＝０．４７）およびＭＧａｌＥ４サンプルに対するエピメラーゼＡＩｇＥ６の能率（％）の比較を示す。
【図８】ａは、ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ（ｄ．ｓ．＝０．１８）により変性されたマンヌロナンの３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ｂは、ａの変性マンヌロナンをＡＩｇＥ４によりエピマー化した生成物（最終組成物；ＦＧ＝０．２６、ＦＧＧ＝０）の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ｃは、ｂの生成物をさらにＡＩｇＥ６により処理された生成物（最終組成物；ＦＧ＝０．３６、ＦＧＧ＝０．１７）の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。Ｈ−ＩＧは、導入されるグルロン残基のアノマー性シグナルを表し、Ｈ−５Ｇ（Ｇ）は、他のグルロン部分に隣接するグルロン残基のＨ５シグナルを表す。
【図９】ａは、ＭＧａｌの円二色性スペクトルであり、ｂはＭＧａｌＥ４の円二色性スペクトルであり、ｃはＭＧａｌＥ４Ｅ６の円二色性スペクトルである。図中、実線はカルシウムの添加前であり、点線はその添加後である。報告されたサンプルのすべてで、［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］＝０．２６である。
【図１０】ａは、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）から得られたゲルの初めの１０００秒のＧ′の変化を示す。ｂは、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）から得られたゲルの初めの１０００秒のδの変化を示す。ｃは、ＭＧａｌＥ４Ｅ６（実線）、ＬｈｙｐＧａｌ（太い点線）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（細かい点線）の硬化中のＧ′の変化を示す。ゲルは、２０ｍＭのＣａＣＯ３および４０ｍＭのＧＤＬを添加された１．５％ポリマー溶液から得られた。
【図１１】Ｌ．ハイパーボレアアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）から得られるヒドロゲルに関する動的弾性率Ｇ′（黒いシンボル）および損失弾性率Ｇ′′（白いシンボル）を示す。ゲルは、２０ｍＭのＣａＣＯ３および４０ｍＭのＧＤＬを添加された１．５％ポリマー溶液から得られた。
【図１２】ａは、Ｌ．ハイパーボレアアルギネート、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られたゲル円筒のヤング率（Ｅ）を示す。モル比［Ｃａ２＋］／［Ｇ残基］は、すべて３つのサンプルで０．５９に等しかった。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。（ｎ＝８）。ｂは、Ｌ．ハイパーボレアアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（三角）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（丸）から得られたゲル円筒に関する比［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］に対する離液の依存性を示す。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。（ｎ＝８）。
【図１３】Ｌ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（三角）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（丸）に関する塩水溶液の取り替えを増やすとき絶対直径（ｄ０＝ビードの最初の直径）の増加として示されるカルシウムビードの安定性を示す。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。
【図１４】Ｍ残基を選択的に変性されたアルギネートの生成に関する酵素化学的変性アプローチを示す。Ｓ＝１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトースまたはｐＮＨ２Ｐｈ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書に記載されたアルギネートポリマーの酵素化学的変性により製造された変性アルギネート、その製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学的に、アルギネートは、交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）構造（ＭＧ−ブロック）の領域が散在するＭ（Ｍ−ブロック）残基およびＧ（Ｇ−ブロック）残基のホモポリマー領域により鎖に沿ってブロック様パターンで配列された１→４結合β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の線状コポリマーである。天然には、アルギネートは、まずホモポリマー性マンヌロナンとして生成され、そしてマンヌロナンのＭ残基上のＣ−５転化を含む重合後エピマー化反応を経てＭおよびＧモノマーサブユニットを含むヘテロポリマーに転換される。反応は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼにより接触化される。
【０００３】
最近、アルギネート生成細菌アゾトバクター・ビンランディのゲノムが７つの異なるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子をエンコードしていることが見いだされた。これらの遺伝子は、配列決定され、クローンされそしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに発現され、そして得られた酵素は、ＡｌｇＥ１−ＡｌｇＥ７と命名された。すべての天然のアルギネートはＭからＧへの同じ基本的なＣ−５転化によりホモポリマー性マンヌロナンから生成されるので、多糖に見いだされる組成および配列における驚くべき変化は、単に異なるエピメラーゼの異なる触媒性による。例として、ＡｌｇＥ４は、ＭＧ−ブロックを有するアルギネートを主として形成するが、ＡｌｇＥ６は、ポリマー中に長いＧ−ブロックを導入する。これらのアルギネート変性酵素の利用可能性およびそれらの使用は、テイラーメイドに改変された構造的および物理的性質を有するアルギネートの製造を可能にする。
【０００４】
アルギネートは、イオン性結合を有するポリマーのＧモノマーサブユニットを架橋する二価のカチオンの存在下架橋したゲルを形成する。ミリモルの濃度のカルシウムの存在下のアルギネートの急速なゲル形成は、Ｇ残基のフラクション並びにＧおよびＭ残基の配列パターンに依存する。
【０００５】
ここ１０年の間に、バイオ技術、バイオ医学および製薬の応用のような需要が増大する最終用途にアルギネートを使用することについて関心が拡大してきている。細胞およびバイオ触媒に固定化材料としてアルギネートを使用することは、このトレンドの１例である。工業、医薬および農業におけるこのようなシステムの可能な使用は、限りなく多く、酵母からのエタノールの生産およびハイブリドーマからのモノクローナル抗体の生産から植物胚の閉じこめによる人工的な種子の大規模な生産に及ぶ。
【０００６】
アルギネートゲルは、また、細胞の固定、移植および組織エンジニアリングのための細胞外マトリックス材料（ＥＣＭ）としての可能性を有する。しかし、カルシウム−アルギネートヒドロゲルの興味のある物理的および質量輸送の点にもかかわらず、それらの応用は、生物学的不活発さ（例えば、細胞接着およびシグナル化）により制限されているアルギネートの閉じこめは、リビング細胞を固定化する非常に激しくない手法であるが、多くの細胞は、それらの増殖および生存のためにマトリックスとの特定の相互反応を要する。このような足場依存の行動は、ほとんどの哺乳動物の細胞では普通であるが、アルギネート網状構造それ自体は相互反応しない。
【０００７】
アルギネートは、非バイオ接着材料であることが知られているが、細胞特異性リガンドまたは細胞外シグナル化分子例えばペプチドまたはオリゴ糖の導入は、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ認識プロセスでのその直接的な関わり合いに必要である。この点に沿って、これら変性アルギネートに基づく第三世代のバイオ材料が、細胞との相互反応を顕著に増大させうることが既に報告されており、ポリマーエンジニアリングおよび組織再生の分野での新しいチャンスおよび将来の開発を開示している。しかし、適切なＥＣＭに類似したスカホールドのデザインは、基本的な生物学的側面とともに、また物理的性質例えばゲル形成、機械的強さおよび安定性による。
【０００８】
イオノトロピー性ゲル化の性質によって、アルギネートは、バイオ技術および医学の応用特に細胞および組織の被包化の分野の興味をそそる候補者になっている。１例として、ランゲルハンスの膵島を含むアルギネート−ポリ−Ｌ−リジンカプセルは、大動物の糖尿病を後退させることが示されており、その場合、カプセルにより示される安定かつ選択的な浸透可能なバリヤーが、移植された細胞を宿主の免疫系から保護する。
【０００９】
種々のリガンドが、アルギネートポリマーにカップリングされて、特許文献１におけるように、細胞／マトリックスの相互反応を改善する。アルギネートの化学的変性による主な問題は、このような変性がしばしば化学的選択性がないことである。すなわち、変性は、アルギネートが構成されている両方の糖類モノマー（グルロン酸（Ｇ）およびマンヌロン酸（Ｍ））で生ずる。ゲル形成そして特にゲルの強さが、未変性のＧの数に関連する性質であることがさらに知られている。従来技術のアルギネートの化学的変性は、Ｍ残基（Ｍユニット）に制限されるばかりかＧ−ブロック中のＧ残基（Ｇユニット）で生じそれにより利用可能なＧ残基の量を減らし、従って二価カチオンの協同的結合を損ないそしてゲル形成の速度を低下させる（弱いゲルの形成を生じそして塩水中のコントロールできない膨張を生ずる）置換を明らかにしている。本明細書で使用されるとき、「残基」は、単一のＭまたはＧユニットをいい、そして「ブロック」は、Ｍ、ＧまたはＭＧの複数のユニットをいう。
【００１０】
多糖鎖のウロン基の１−アミノ−１−デオキシ−β−ガラクトース残基を導入することにより得られるガラクトース置換アルギネートの合成および特徴は、報告されている。肝細胞の細胞表面に存在するアシアログリコ蛋白受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）によるβ−ガラクトースの認識に基づきそして報告の結果を考えて、変性アルギネートは、肝細胞の被包化および接着を改善するために好適なゲル形成バイオ材料として提案されている。しかし、分子レベルでの変性アルギネートの特徴は、アルギネート鎖への側鎖基の導入が主としてＧ残基に影響をあたえ、そのためカルシウム結合性を損ないそしてその結果ヒドロゲルを安定にしないことを明らかにした。変性カルシウム−アルギネートヒドロゲルの剛性および安定性のかなりの低下は、既に報告されている。そのため、多糖鎖への細胞特異性リガンドの導入がヒドロゲルの機械的性質の低下を招くことと思われる。
【特許文献１】米国特許６６４２３６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この観点において、かなりな改善は、カルシウム結合の損傷およびヒドロゲルの安定性の損失を制限するためにマンヌロン残基に側鎖分子を有する選択的に変性したアルギネートの製造により示されるだろう。同様に、カチオン結合の損傷およびヒドロゲルの安定性の損失を制限するために、側鎖分子を有する変性アルギネートの性質を改善する必要性が存在する。本発明は、以下に説明されるように、種々のリガンドによる置換後のアルギネートゲルの機械的性質および膨張性をコントロールできる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、変性アルギネートポリマーを製造する方法に関する。その方法は、アルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そしてアルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程からなる。反応工程は、いずれかの順序および任意の配列で複数回行うことができる。
【００１３】
本発明は、さらに、アルギネートゲルおよび繊維を製造する方法に関する。その方法は、溶媒中で、複数の変性アルギネートポリマーを二価のゲル化イオンと組み合わせる工程を含む。或る態様では、リビング細胞がアルギネートゲル内に内包される。
【００１４】
本発明は、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性されそして変性がアセチル化ではない変性アルギネートポリマーに関する。
本発明は、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性されそして変性がアセチル化ではない変性アルギネートポリマーからなるアルギネートゲルおよび繊維に関する。
本発明は、さらに、成形したまたは成形していない固体の非架橋アルギネート組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
アルギネートは、種々の割合および連続した配列のＤ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸の線状コポリマーの１群をひとまとめにした用語である。カルシウムのような二価のカチオンによりゲルを形成するアルギネートポリマーの能力および得られるゲルの性質は、ポリマー鎖中の連続するＧ残基のブロックの割合および長さに強く相関する。
【００１６】
本発明は、少なくとも２つの工程を要するアルギネートを変性する方法を提供する。１つの工程は、変性用成分がアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに共有結合的に付着する工程であり、他の工程は、アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットが、酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに転換される工程である。本発明の方法によれば、これらの工程は、いずれかの順序で行うことができる。さらに、変性用成分がアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに共有結合的に付着する複数の工程を行うことができ、１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットが、酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに転換される複数の工程を行うことができる。複数の工程は、任意の順序で行うことができる。モノマー性サブユニットは、カルボキシル基および水酸基の何れかで変性される。
【００１７】
アルギネート中の官能基の置換は、置換基の化学的性質および大きさに応じて、ポリマーのゲル形成能力を減少させる。この効果は、Ｇブロックの量を増加することによって最低にされる。いくつかの好ましい態様では、官能基の置換は、変性のための原料としてＭのみを有するアルギネートを使用することによって、Ｍ残基の置換に限定される。変性後、未変性Ｍは、エピマー化によりＧに転換される。
【００１８】
Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーが生成される。変性アルギネートポリマーは、未変性Ｍおよび未変性Ｇを含むことができる。変性は、いくつかのＭがアセチル化されるが、アセチル化ではない。すなわち、これらポリマーのＭモノマー性サブユニットのいくつかは、これらポリマーの他のＭモノマー性サブユニットがアセチル化されるかまたはされないかにかかわらず、アセチル化以外の変性により変性される。いくつかの好ましい態様では、Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーは、変性用成分例えばガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｅＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドの付加により変性される。Ｍモノマー性サブユニットのみが変性される変性アルギネートポリマーは、アルギネートゲルおよび繊維をつくるのに有用である。
【００１９】
原料アルギネートは、ＭＭ、ＧＧおよび／またはＭＧブロックの異なる構造配列に分類できるＭおよびＧを種々の量で有することができる。化学反応の工程は、適用可能なものとして、アルギネートのＭおよびＧ残基に反応する置換基（変性Ｍ残基および変性Ｇ残基）に導く。酵素による工程は、所望の数のＭ残基をＧ残基に転換することによりアルギネート中のＭおよびＧの量を変化する。例えば、Ｇの量は、ＭＭブロックをＭＧまたはＧＧに転換することまたはＭＧブロックをＧＧに転換することにより増加する。
【００２０】
いくつかの態様では、Ｍ含量の多い例えばＭおよびＧの全重量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９５＋％のＭ含量のアルギネートは有用である。本発明の１つの態様は、化学反応前のＭ残基の多い原料アルギネートとして、マンヌロン酸のホモポリマー例えばマンヌロナンを利用する。これらのホモポリマーは、本明細書で参考として引用されるＷＯ ０４０１１６２８に開示されているシュードモナス・エルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．シリンガエ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）またはＰ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＡＩｇＧネガティブミュータントにより製造される。高Ｍアルギネートの他の例は、本明細書で参考として引用されるＷＯ ０３０４６１９９Ａ２に開示されている。
【００２１】
本発明によれば、変性用成分は、任意の化学構造物であるが、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から好ましくは選ばれる。いくつかの態様では、変性用成分は、米国特許６６４２３６２にリストされているこの群から選ばれる。いくつかの態様では、変性用成分は、遊離基重合のできる炭素−炭素二重結合または三重結合を含む。単糖は、例えば、ラクトース、ガラクトース、しょ糖、フラクトース、マンノースおよびセルロースである。オリゴ糖は、例えばラクトース、ガラクトース、しょ糖、フラクトース、マンノースおよびセルロースのような単糖からなるホモポリマーまたはヘテロポリマーである。オリゴ糖は、好ましくは、２−１０のモノマー、より好ましくは２−３のモノマーを有する。モノヌクレオチドは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンまたはウラシルである。オリゴヌクレオチドは、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジンまたはウラシルのようなモノヌクレオチドからなるホモポリマーまたはヘテロポリマーである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２−１５０モノマー、より好ましくは２−５０モノマー、さらに好ましくは５−３５モノマーそして一層好ましくは１０−２０モノマーを有する。アミノ酸は、２６の天然のアミノ酸の任意のものおよび任意の合成アミノ酸残基である。ペプチドは、例えばポリリジンのようなホモポリマーまたはヘテロポリマーである。ペプチドは、好ましくは、２−２５モノマー、より好ましくは、２−２０モノマー、さらに好ましくは２−１５モノマー、一層好ましくは２−１０モノマー、より好ましくは２−５モノマーそしてさらに好ましくは２，３または４モノマーを有する。蛋白は、細胞付着また接着分子、受容体蛋白またはリガンドのような任意の蛋白様分子である。蛋白は、好ましくは、２５より多いアミノ酸を有し、そしていくつかの態様では、２５−２００またはそれ以上のアミノ酸である。
【００２２】
いくつかの態様では、変性用成分は、ガラクトースに基づくオリゴ糖例えばＡＳＧＰＲアシアログリゴ蛋白受容体またはガレクチンに結合するものである。ＡＳＰＧＲは、肝細胞接着受容体である。ガレクチンは、細胞接着受容体である。いくつかの態様では、変性用成分は、細胞−細胞認識分子であるセクチンであるｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）である。いくつかの態様では、変性用成分は、また肝細胞接着に有用であるＡＳＧＰであるＧｌｃＮＡｃである。いくつかの態様では、変性用成分は、上皮細胞増殖に有用であるＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）である。いくつかの態様では、変性用成分は、マンノースに基づくオリゴ糖例えばマンノース結合レクチンまたはランゲリンに結合するものである。マンノース結合レクチンは、ケラチノサイト増殖に関係がある。ランゲリンは、ランゲルハンス細胞の受容体である。
【００２３】
いくつかの態様では、変性用成分は、ＲＤＧペプチド例えばフィブロネクチンまたはビトロエンクチンから由来するものである。ＲＤＧペプチドは、細胞接着および筋芽細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＹＩＧＳＲペプチド例えばラミニンＢ１から由来するものである。ＹＩＧＳＲペプチドは、細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＲＥＤＶペプチド例えばフィブロネクチンから由来するものである。ＲＥＤＶペプチドは、上皮細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、ＩＫＶＡＶペプチド例えばラミニンから由来するものである。ＩＫＶＡＶペプチドは、神経突起延長ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチド例えば天然の細胞接着分子から由来するものである。ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよび２，３、４またはそれ以上のアミノ酸を有するそのフラグメントは、星状膠細胞接着ペプチドとして有用である。いくつかの態様では、変性用成分は、ＫＲＳＲペプチド例えばヘパリン結合ドメインから由来するものである。ＫＲＳＲペプチドは、骨芽細胞接着ペプチドとして有用である。
【００２４】
アルギネートポリマーは、変性用成分の間の結合により架橋できる。これらの結合は、共有結合、イオン結合であり、そして結合中間物を含むことができる。アルギネートポリマーは、従って、非ゲル化架橋可能な例により予定された形状に製造できる。
【００２５】
変性アルギネートサンプルは、式Ａ−Ｘ（式中、Ａはアルギネート多糖でありそしてＸは変性用成分である）を有する。ＡおよびＸは、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、イミド、第二級アミン、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、スルフェートエステル、スルホネートエステル、ホスフェートエステル、ウレタン、カーボネートなどから選ばれる結合を経て共有結合的に結合している。すなわち、アルギネートの１つ以上のモノマーは、変性用成分に直接またはスペーサーにより共有結合している。従って、変性アルギネートサンプルは、また式Ａ−Ｙ−Ｘ（式中、ＡおよびＸは前記同様であり、Ｙはアルキルまたはアリール鎖例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基を含むスペーサーである）を有することができる。いくつかの態様では、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ１５、好ましくはＣ１−Ｃ１０、好ましくはＣ１−Ｃ５、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基である。ＡおよびＹ並びにＹおよびＸは、上記の結合を経て結合される。
【００２６】
結合またはリンカーは、任意にスペーサーとともにまたはそれなしで提供されて変性用成分をアルギネートポリマーのモノマーサブユニットに接続する。リンカーの例は、スペーサー例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基と組み合わされてまたは組み合わされることなく、エステル、エーテル、チオエステル、ジスルフィド、アミド、イミド、第二級アミノ、直接炭素−炭素（Ｃ−Ｃ）結合、スルフェートエステル、スルホネートエステル、ホスフェートエステル、ウレタンおよびカーボネートを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
エステル結合は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−の何れかの構造をいう。エーテル結合は、−Ｏ−の構造をいい、チオエーテル結合は、−Ｓ−の構造をいい、ジスルフィド結合は、−Ｓ−Ｓ−の構造をいい、アミド結合は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−または−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−の何れかの構造をいう。イミド結合は、−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−の構造をいう。第二級または第三級アミン結合は、−ＮＨ−または−Ｎ（−Ｒ）−の構造をいう。直接炭素−炭素結合は、−Ｃ−Ｃ−の構造をいい、スルホネートおよびスルファートエステル結合は、それぞれ−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−の構造をいう。ホスフェートエステル結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｏ−）−Ｏ−の構造をいう。ウレタン結合は、−Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−の構造をいう。カーボネート結合は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−の構造をいう。
【００２８】
本発明の方法は、アルギネートの１つ以上の未変性Ｍ残基が酵素によるエピマー化反応によりＧ残基に転換される１つ以上の工程を含む。エピメラーゼ酵素は、広く知られている。それらの例は、本明細書において参考として引用される米国特許５９３９２８９に記載されたもののようなアゾトバクター・ビンランディから由来する。他の源は、シュードモナス・シリンガエ（本明細書において参考として引用されるＢｊｅｒｋａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７９、２８９２０−２８９２９）およびラミナリア・ジギタタ（本明細書において参考として引用されるＷＯ ２００４０６５５９４）を含む。
【００２９】
ＡＩｇＥ酵素であるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼは、アゾトバクター・ビンランディのようなアルギネート生成細菌によりエンコードされるモジュラー蛋白の群からなる。米国特許５９３９２８９は、これらの酵素をコードする配列、限定されたＧ／Ｍ比およびブロック構造を有するアルギネートを製造するためのこれらの酵素の製法およびそれらの用途を開示している。これらのイソ酵素は、それらの活性およびそれらが導入するエピマー化パターンにおいて異なる。ＡＩｇＥ−１および６は、長いＧ−ブロックを生ずるのに有効であり、ＡＩｇＥ４は、ＭＧＭ配列のみを導入する。前者は、強いゲル形成剤を与え、一方後者の酵素は、たわみ性鎖を発生する。例えば以下の表１を参照。
【００３０】
（表１）
（Ａ，ビンランディからの７つのＡＩｇＥエピメラーゼ）
タイプ ［ｋＤａ］ モジュラー構造 生成物
ＡＩｇＥ１ １４７．２ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａ２Ｒ４ ２官能性Ｇブロック＋
ＭＧブロック
ＡＩｇＥ２ １０３．１ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４ Ｇブロック（短い）
ＡＩｇＥ３ １９１ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ａ２Ｒ４Ｒ５ ２官能性
Ｒ６Ｒ７
ＡＩｇＥ４ ５７．７ Ａ１Ｒ１ ＭＧブロック
ＡＩｇＥ５ １０３．７ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４ Ｇブロック（短い）
ＡＩｇＥ６ ９０．２ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３ Ｇブロック（長い）
ＡＩｇＥ７ ９０．４ Ａ１Ｒ１Ｒ２Ｒ３ リアーゼ活性＋Ｇブロック
＋ＭＧブロック
Ａ：３６５アミノ酸、Ｒ：１５５アミノ酸
【００３１】
すべてのアルギネートおよびマンヌロナンは、置換前の原料アルギネートのエピマー化次に追加のエピマー化のような化学的工程および酵素的工程の順序を変更することを含む、１つの工程でまたは次々と、単一または混合物で使用される異なるＣ−５エピメラーゼの使用によってエピマー化できる。置換の程度並びにエピマー化の量および時間の両方を変えることにより、異なって選択的に置換されたアルギネート分子を得ることができる。エピマー化反応は、温度、反応時間、試薬の量およびこれらの組み合わせをコントロールすることによってコントロールできる。例えば、いくつかの態様では、エピマー化反応は、酸の添加、９０℃への加熱、または酵素反応に必要なカルシウムイオンを封鎖するＥＤＴＡ５０ｍＭの添加により停止される。反応をコントロールすることにより、Ｇに転換される未変性物の量はコントロールでき、従って最終の変性アルギネートにおけるＧの量はコントロールできる。
【００３２】
原料の性質も、最終生成物の性質をコントロールする。変性がエピマー化の前である方法における原料としてのポリマンヌロネートの使用は、Ｍのみが変性される最終生成物を与える。すなわち、マンヌロン酸残基を含む多糖（ポリマンヌロネート）を出発原料として使用すると、これらの物質は、カルボキシ官能基または水酸基の何れかで変性され次にＣ−５エピメラーゼの使用によりエピマー化されることが分かった。このエピマー化は、非変性残基で生じ、マンヌロン酸で選択的に変性されたアルギネート分子を生ずる。
【００３３】
もしマンヌロナンが原料として使用されそして残基の変性がＭからＧへのすべての酵素による転換の前であるならば、変性反応は、ポリマー鎖に沿ってランダムに分布した置換基を有するマンヌロナンを生ずる。未変性残基に対する変性残基の量は、反応時間、温度、試薬の量およびこれらの組み合わせをコントロールして所望度の変性Ｍを有する変性マンヌロナンを生成することによりコントロールできる。本発明の第二の工程では、部分的に置換されたマンヌロナンは、マンヌロナン−Ｃ−５エピメラーゼ、すなわちＤ−Ｍ残基をポリマー鎖の破壊なしにＬ−グルロン酸に転換する酵素により処理される。Ｃ−５エピメラーゼは、置換したＭ−残基を転換できないので、最終生成物は、カルシウム結合および結合形成のための未処理Ｇブロック並びに可溶な部分に残るＭ残基に排他的に位置する置換基を含むポリマーであろう。そこで、それらは、化学的架橋で互いに自由に相互反応するかまたは外性受容体と自由に反応する。
【００３４】
いくつかの態様では、原料アルギネートは、ＭおよびＧの両方を含む。この場合、化学的置換は、ＭおよびＧの両方の残基で起こることができる。酵素による部分的に置換したアルギネートの処理は、次に未置換のＭおよびＧ残基の一部を転換できる。１つの態様は、Ｍおよび／またはＧ基でまず部分的に置換され次にＭＧの残りのポリ交互セグメントを転換する特異性を有するＧ形成酵素（すなわちＡＩｇＥ−１）を使用するＣ−５エピマー化により酵素的に反応されるポリＭＧブロックからなるアルギネートである。
【００３５】
工程の順序および反応速度をコントロールすることにより、生成される変性アルギネートポリマーは、変化した度合の変性、Ｍ対Ｇの変化したレベルの変性、変化する量の未変性Ｍおよび変化する量の未変性Ｇを有する。
いくつかの態様では、Ｍのみが変性される。いくつかの態様では、ＭおよびＧが変性される。
【００３６】
いくつかの態様では、１０％より少ない残基が変性される。いくつかの態様では、２０％より少ない残基が変性される。いくつかの態様では、２０％より多い残基が変性される。いくつかの態様では、１０−８０％の残基が変性される。いくつかの態様では、２０−６０％の残基が変性される。いくつかの態様では、３０−５０％の残基が変性される。いくつかの態様では、約４０％の残基が変性される。
【００３７】
いくつかの態様では、２０％より少ない残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、２０％より多い残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、２０−８０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、３０−６０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、４０−５０％の残基が未変性Ｇである。いくつかの態様では、約４５％の残基が未変性Ｇである。
【００３８】
変性アルギネートは、変性アルギネートと二価のゲル化イオン例えばＣａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｆｅ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｐｂ＋＋、Ｃｏ、Ｎｉまたはこれらの組み合わせとを組み合わせることによりアルギネートゲルまたは繊維を製造するのに使用できる。
【００３９】
いくつかの態様では、アルギネートゲルは、リビング細胞例えば増殖細胞または非増殖細胞を内包するのに使用される。細胞は、細胞株または患者／ドナーから得られる。細胞の例は、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株を含む。いくつかの態様では、内包した細胞は、細胞が維持されるとき発現する１つ以上の蛋白をエンコードする発現ベクターを含む。いくつかの態様では、蛋白は、サイトカイン、成長因子、インスリンまたは血管形成阻害剤例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン、他の治療蛋白または他の分子例えば医薬である。約６０−７０より少ないｋＤの低いＭＷを有する蛋白は、ゲル網状構造の有孔性のために特に良好な候補者である。いくつかの態様では、細胞は、多細胞の凝集体または組織として存在する。
【００４０】
いくつかの態様では、アルギネート繊維は、複数の変性アルギネートポリマーと二価のゲル化イオンとを組み合わせそして架橋したアルギネートポリマーからなる繊維を押し出すことからなる方法で製造される。いくつかの態様では、固体の非架橋アルギネート組成物またはペーストは、複数の変性アルギネートポリマーを成形、成型、注型またはそれ以外の成形することにより製造される。
いくつかの態様では、変性工程および／またはエピメラーゼ工程は、既に存在するアルギネートゲルまたは繊維で行われる。
（実施例）
【実施例１】
【００４１】
（１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースを有する変性ポリマンヌロナンの製造）
１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトース（２７０ｍｇ）を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）（１．３ｇ）および１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（２．１７ｇ）を含む０．２Ｍの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．５、４００ｍＬ）中のポリマンヌロナン（１．５ｇ）のナトリウムの形の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌した。生成物を、５日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥してナトリウムポリマンヌロナンの精製したガラクトース誘導体を得た。収量１．４５ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算した置換度は、１２％であることが分かった。この方法によるアミド形成は、ポリマー中に存在するマンヌロン酸のカルボキシル（ウロン）基をターゲットにした。当業者は、生成物の置換度を、上記の反応においてポリマンヌロナン対１−アミノ−１−デオキシガラクトースの異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、分子とアミノ官能基との間のアルキルまたはアリールスペーサーを有するかまたは有しないアミノ基をもつアミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび光架橋可能な基に適用される。
【実施例２】
【００４２】
（ポリマンヌロナンのメタクリレートエステルの合成）
ナトリウムポリマンヌロナン（３ｇ）を３００ｍＬの脱イオン水に溶解し、そして氷浴で４℃に冷却した。無水メタクリル酸（２３ｇ）を冷却ポリマンヌロナン溶液に一定に攪拌しつつ滴下し、そしてｐＨを好適な量の５ＭのＮａＯＨの添加により９．０に維持した。攪拌を４℃の温度で２４時間続けた。反応生成物を９６％エタノールに沈殿させ、遠心分離し、エタノールにより３回洗った。生成物を次に水に溶解し、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜に対して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥してナトリウムポリマンヌロナンの精製メタクリレート誘導体を得た。収量２．６ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算して置換度は、８％であった。この方法によるエステル形成は、モノマー性単位に存在する第二級水酸基を目的とする。当業者は、生成物の置換度が、上記の反応においてポリマンヌロナン対無水物の異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、変性アミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび光架橋可能な基に適用される。
【実施例３】
【００４３】
（ＡＩｇＥ４を使用することによる変性ポリマーのエピマー化）
実施例１および２で記載したように得られた変性ポリマンヌロナン（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２００）、次に溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応は、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、そして４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌ（最終濃度０．２％）を加え、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．８５ｇ。当業者は、エピマー化度が、異なる反応時間の使用により変化することを認識する。
【実施例４】
【００４４】
（ＡＩｇＥ６を使用することによる変性ポリマーのエピマー化）
実施例１および２に記載したように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を次に添加し（酵素／ポリマーの重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で４８時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを添加し（最終濃度１．５％）、４℃に一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製エピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【００４５】
この方法は、２つのタイプのポリマーを与えた。（１）ガラクトースによるウロン基の変性次にエピマー化。ｄ．ｓ．＝１２％、ＦＧ＝０．４５、ＦＭ＝０．５５、ＦＧＧ＝０．１６。（２）光架橋可能な置換基による水酸基の変性次にエピマー化。原料；実施例２で報告されたポリマンヌロナン。ｄ．ｓ．＝８％、ＦＧ＝０．５４、ＦＭ＝０．４６、ＦＧＧ＝０．３７。
【００４６】
図１および２は、ラミナリア・ハイパーボレアン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａｎ）からの未変性および変性（ガラクトースの１４％）アルギネートに比べてガラクトシル化およびエピマー化マンヌロナンのゲル化性に対する効果を示す。
【実施例５】
【００４７】
（ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の組み合わせを使用することによる化学的に変性されたポリマーのエピマー化）
実施例１および２に記載されたように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨを維持する脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを加え（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が、異なる反応時間を使用することにより変化して、Ｇブロックおよび置換したＭ残基が分散しているポリ交互ブロックを有しそしてＭＭ配列を欠くことによりＡＩｇＥ６エピマー化ポリマーとは異なるポリマーを生ずることを認識する。これは、ポリマーのたわみ性を増大させそして高い離液および低い膨潤へ導く。
【実施例６】
【００４８】
（置換したポリＭＧ配列が散在するＧブロックからなるポリマーの製造）
実施例１および２に記載されたように得られたポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を次に添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）、溶液を３７℃で２４時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却ポリマー溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを加え（最終濃度１．５％）、４℃で一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）で洗った。生成物を７より僅か上のｐＨを維持する脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを加え（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、変性マンヌロナンの精製したエピマー化ポリマーを得た。収量０．８５ｇ。組成；Ｇのモルフラクション＝０．４７、ＧＧのモルフラクション＝０。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【００４９】
（１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースによる変性ポリＭＧの製造）
１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトース（２７０ｇ）を、ＮＨＳ（１．３ｇ）およびＥＤＣ（２．１７ｇ）を含む変性ポリマンヌロナンのナトリウムの形（１．５ｇ）の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌した。生成物を、５日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、ナトリウムポリマンヌロナンの精製したガラクトース誘導体を得た。収量１．４５ｇ。１Ｈ−ＮＭＲから計算した置換度は、１２％であった。この方法によるアミド形成は、ポリマー中に存在するカルボキシル（ウロン）基を目的とした。当業者は、生成物の置換度が、上記の反応中のポリＭＧ対１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースの異なる比の使用により変化できることを認識する。同じ方法は、アミノ酸、ペプチド、異なる単糖およびオリゴ糖、ヌクレオチドおよび分子とアミノ官能基との間にアルキルまたはアリールスペーサーを有するかまたは有しないアミノ基をもつ光架橋可能な基に適用される。
【００５０】
（ＡＩｇＥ１を使用することによる変性ポリＭＧの実験）
実施例１および２に記載したように得られた変性ポリマンヌロナンサンプル（１ｇ）を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ１を次に添加し（酵素／ポリマーの重量の比＝１／２０）、溶液を３７℃で４８時間攪拌した。エピマー化反応を、１−２のｐＨ値に濃ＨＣｌを冷却溶液に添加することにより停止した。混合物にＮａＣｌを添加し（最終濃度１．５％）、４℃に一晩維持した。沈殿した生成物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。生成物を７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液にＮａＣｌを添加し（最終濃度０．２％）、９６％エタノールにより沈殿させた。生成物を濾過し、３回エタノールで洗い、そして３日間１２０００−１４０００の分子量カットオフの透析膜を通して脱イオン水に対して透析した。透析した生成物を凍結乾燥して、ＭまたはＧ置換ポリＭＧ配列が散在する長いＧブロックを特徴とする変性マンヌロナンの精製エピマー化ポリマーを得た。収量０．９０ｇ。当業者は、エピマー化度が異なる反応時間の使用により変化できることを認識する。
【実施例７】
【００５１】
化学的アプローチと酵素的アプローチとの組み合わせが開発されてＭ残基のみにβ−ガラクトース部分を有するアルギネート様ポリマーを得た。１−アミノ−１−デオキシガラクトースを、カップリング試薬としてＥＤＣ（１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）を使用してアミド結合を経てマンヌロナンに導入した。このポリマーは、交互Ｇ配列とホモポリマー性Ｇ配列との両方にグルロン酸残基を導入する２つの異なるＣ−５エピメラーゼの使用によりエピマー化された。Ｍ残基で選択的に変性されたグラフトアルギネートは、１Ｈ−ＮＭＲによりＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳと同定され、そして固有粘度およびそのカルシウム結合能は、円二色性スペクトル分析により検出された。変性物質は、同じ糖部分がＧ残基に導入されたアルギネートサンプルに比べたとき、機械的性質およびゲル形成の性質における改善を示した。最後に、Ｍ残基の選択的変性は、グラフトされたアルギネートから製造されたカルシウムビードの高い安定性を生じた。
【００５２】
（材料および方法）
ラミナリア・ハイパーボレアｓｔｐｅから単離されたナトリウムアルギネートの市販のサンプルＬＦ１０／６０（ＦＧ＝０．６９、ＦＧＧ＝０．５６）は、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ノルウェー）により用意された。高分子量マンヌロナン（ＦＧ＜０．００１）を、シュードモナス・フルオレセンスのエピメラーゼネガティブミュータント（Ａｌｇ）から単離した。精製および脱アセチル化は、本明細書で参考として引用されるＢｕｃｋｅ，Ｃ編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、１０、７１に記載されているように実施された。ポリ交互ＭＧ（ＦＧ＝０．４７、ＦＧＧ＝０）を、本明細書で参考として引用されるＨａｒｔｍａｎｎ、Ｍ．ら「Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ」２００２、１５７０、１０４に記載されているように、ＡＩｇＥ４エピメラーゼの使用によりマンヌロナンから製造した。１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および塩化ナトリウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミルウオーキー、ＷＩ）から購入した。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）、２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびＤ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（セントルイス、ＭＯ）から購入した。炭酸カルシウム（平均粒子サイズ４μｍ）は、Ｍｅｒｃｋ（ダルムスタット、ドイツ）から購入した。
【００５３】
（組み換えマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ）
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼは、Ｅ．コリ菌株のこれら組み換え体：ＪＭ１０５のＡＩｇＥ４およびＳＵＲＥのＡＩｇＥ６の発酵により製造された。酵素は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）のイオン交換クロマトグラフィーによりそしてフェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の疎水性相互反応クロマトグラフィーにより部分的に精製した。酵素の活性は、３Ｈ−５−ラベルマンヌロナンを酵素とインキュベートしたとき、水へのトリチウムの放出を測定することにより分析された。
【００５４】
（ガラクトース置換マンヌロナン（ＭＧａｌ））
１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトース（ガラクトシルアミン）（２７０ｍｇ、０．２当量）を、ＮＨＳおよびＥＤＣ（［ＥＤＣ］／［Ｐｏｌｙｍ］＝１．５；［ＮＨＳ］／［ＥＤＣ］＝１、［Ｐｏｌｙｍ］は、グリコピラノシドポリマー繰り返し単位のモル濃度である）を含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．５、４００ｍＬ）中のマンヌロナンのナトリウムの形（１．５ｇ）の攪拌溶液に添加した。溶液を室温で３０分間攪拌し、ポリマーを、１日間ＮａＨＣＯ３（０．０５Ｍ）に対して透析し（膜のカットオフ分子量、約１２０００）、次に伝導度が４℃で２μＳより低くなるまで脱イオン水に対して透析した。ｐＨを７に調節し、ポリマーを０．４５μｍのミリポアフィルターを通して濾過し、凍結乾燥して、１Ｈ−ＮＭＲ分析（ポリマー鎖のＭ残基のアノマー性プロトンの強度に対するガラクトシルアミンのＨ−１シグナルの強度から計算した置換度（ｄ．ｓ．））および電位差滴定により明らかになる側鎖基として導入される１２％のガラクトースを含む変性マンヌロナンサンプルを得た。
【００５５】
（ＡＩｇＥ４によるエピマー化（ＭＧａｌＥ４））
ポリマーＭＧａｌを、２．５ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（１０ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ４を添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／１００）そして溶液を３７℃で２４時間攪拌した。
【００５６】
（ＡＩｇＥ６によるエピマー化（ＭＧａｌＥ４Ｅ６））
ポリマーＭＧａｌＥ４を、２．３７ｇ／Ｌの濃度で、ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）およびＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含む５０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）に溶解した。Ｃ−５エピメラーゼＡＩｇＥ６を添加し（酵素／ポリマー重量の比＝１／２０）そして溶液を３７℃で２４時間攪拌した。
【００５７】
（エピマー化ポリマーの精製）
エピマー化反応を、５ＭのＮａＣｌ溶液（最終濃度１．５％）および塩酸（３Ｍ）を冷却ポリマー溶液に添加してｐＨ値をほぼ１−２にすることにより停止した。混合物を４℃で一晩貯蔵して沈降を助けた。沈殿物を遠心分離し、３回希釈ＨＣｌ（０．０５Ｍ）により洗った。沈殿物を、希釈水酸化ナトリウムの添加により７より僅か上のｐＨに維持した脱イオン水に溶解した。溶液をＮａＣｌの５Ｍ溶液と混合し（最終濃度０．２％）、エタノールにより沈殿させた。沈殿物を、伝導度が４℃で２μＳより低くなるまで脱イオン水に対して透析し（膜のカットオフ分子量、約１２０００）、ｐＨを７に調節し、ポリマーを０．４５μｍのミリポアフィルターを通して濾過し、凍結乾燥した。
【００５８】
（Ｌ．ハイパーボレアからのガラクトース置換アルギネート（ＬｈｙｐＧａｌ））
Ｌ．ハイパーボレアからのアルギネートサンプルを、前記のように１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースにより処理した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により明らかにされるようにＧ残基に導入された１４％のガラクトース部分を有する変性アルギネートを得た。
【００５９】
（１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析）
サンプルを、Ｇｒａｓｄａｌｅｎらにより記載されたように製造した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＷＭ３００により９０℃でＤ２Ｏで記録された。化学シフトは、３−（トリメチルシリル）プロパンスルホネートに関するシグナルからダウンフィールドでｐ．ｐ．ｍ．で示された。
【００６０】
（電位差測定）
電位差滴定は、ＭＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６サンプルの当量を決定するのに行われた。ガラス電極を備えた放射計ｐＨＭ２４０ｐＨメーターを使用した。ポリマーのＨ＋の形は、一晩０．１ＭのＨＣｌに対して３ｇ／Ｌの溶液を透析することにより製造された。過剰のＨＣｌは、脱イオン水に対する完全透析により除いた。ポリマーを凍結乾燥によって回収した。特定の濃度を有する周知のポリマーの水溶液を、０．１ＭのＮａＯＨ標準溶液（Ｔｒｉｔｉｓｏｌ、Ｍｅｒｃｋ）により滴定した。１９８±４ｇ／モルおよび２００±３ｇ／モルの繰り返し単位のモル質量が、それぞれＭＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６の＋Ｈ形について見いだされ、それらは、ＮＭＲから得られる置換度に基づいて計算された理論値（１９５．３ｇ／モル）とややうまく類似した。
【００６１】
（円二色性スペクトル分析）
ポリマーＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のナトリウムの形の円二色性スペクトル（表２参照）は、それぞれＪａｓｃｏ Ｊ−７００分光偏光計により脱イオン水（ｃ〜２＊１０−３モノモル／Ｌ）中で記録された。１ｃｍ光路長の石英セルを使用しそして以下の構成を維持した。バンド幅、１ｎｍ、時間定数、２ｓ、走査速度、２０ｎｍ／分。バックグラウンドに対して補正された４つのスペクトルをそれぞれのサンプルについて平均化した。それぞれのサンプルのスペクトルは、［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］＝０．２６へのＣａ（ＣｌＯ４）２溶液の添加前および後に記録された。
【００６２】
（ビード形成）
それぞれＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６であるＬ．ハイパーボレアからのカルシウムビードは、２％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液を５０ｍＭのＣａＣｌ２溶液に注ぐことにより得られた。小滴のサイズは、高電圧静電気ビード発生器（７ｋＶ、１０ｍＬ／時、外径０．４ｍｍの鋼針、針からゲル化溶液の距離１．７ｃｍ）を使用することによりコントロールできた。得られたアルギネートゲルビードを、使用前にゲル化溶液中で３０分間攪拌した。
【００６３】
（塩水溶液中の安定性）
Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られたカルシウムアルギネートビードの寸法安定性は、１／２ｍＬのゲルビードが３ｍＬの塩水溶液（０．９％）に添加されたとき、それぞれ倒立光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により測定された。サンプルを１時間攪拌した。塩水溶液を数回取り替え、そしてカプセルの直径を、それぞれの取り替え前に測定した（ｎ＝２５）。カプセルを、測定前に脱イオン水により洗った。
【００６４】
（ゲル化の反応の仕組みおよびレオロジーの同定）
ゲル化の反応の仕組みおよび動的粘弾性の測定は、Ｓｔｒｅｓｓ−Ｔｅｃｈ汎用レオメーター（ＲＥＯＬＯＧＩＣＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、２２３６３ Ｌｕｎｄ、スウェーデン）を用いることにより実施された。簡単にいえば、それぞれＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６の１．５％溶液（表２参照）に、ＣａＣＯ３（２０ｍＭ）およびＧＤＬ（４０ｍＭ）を添加しそして混合物を測定前に３０秒間攪拌した。これらの実験は、Ｔ＝２０℃およびギャップ＝１．００ｍｍで、切り込みの入ったプレート−プレート（ｄ＝４０ｍｍ）の測定パターンにより行われた。ゲル化の反応の仕組みは、ほぼ１８時間３分間の間隔でＧ′およびＧ′′（ω＝６．２８ｒａｄ＊ｓ−１）の繰り返された測定により得られた。動的粘弾性の測定は、動的弾性率（Ｇ′）および損失弾性率（Ｇ′′）の振動数依存度を測定することによりゲル化２４時間後に行われた。振動数の掃引は、振動数の範囲０．０１−５０Ｈｚで一定のひずみ（０．００１）で行われた。サンプルは、低密度シリコーン油によりシールされて、ゲル化実験中の溶媒の蒸発に伴う不都合な作用を避けた。
【００６５】
（ゲル円筒の製造および離液）
Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６からの均質なカルシウムゲルは、それぞれ、ポリマー溶液とＣａ２＋（ＣａＣＯ３）の不活性形とをブレンドし次に徐々に加水分解したＤ−グルコノ−δ−ラクトン（ＧＤＬ）をモル比ＧＤＬ／Ｃａ２＋＝２に維持しつつ添加することにより製造した。ポリマーの最終の濃度は、すべての場合に１％（ｗ／ｖ）であった。
【００６６】
Ｃａ−アルギネートゲルの離液は、密度の値を１と考えて計算して、最初の重量に対するゲルの重量減として測定された。上記のようにして製造されたＣａ−ポリマーゲル化溶液の一部を、直径１６ｍｍおよび高さ１８ｍｍを有する２４穴組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、ＭＡ）で硬化した。ゲルを２４時間後穴から取りだし、そしてそれらの重量を測定した。離液は、（１−Ｗ／Ｗ０）＊１００（ただし、ＷおよびＷ０は、それぞれ、ゲル円筒の最終および最初の重量である）として計算された。
【００６７】
得られるゲルのヤング率（Ｅ）は、２０℃でＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＴＡ−ＸＴ２ Ｔｅｘｔｕｒｅ分析器により測定された力／変形の曲線の最初のスロープから計算された。離液を示すすべてのゲルについて、最終のポリマー濃度が決定され、そしてＥは、Ｅ∝ｃ２を採用して補正された。
【００６８】
（粘度測定）
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のナトリウム形（表２参照）の細管粘度の低下は、それぞれ、Ｓｃｈｏｔｔ−Ｇｅｒｅａｔｅ ＡＶＳ／Ｇ自動装置およびＵｂｂｅｌｏｈｄｅタイプ粘度計を使用することにより２５℃で０．１ＭのＮａＣｌで測定された。固有粘度の値は、低下した比粘度（ηｓｐ／ｃ）の濃度依存性並びにＨｕｇｇｉｎｓ（１）およびＫｒａｅｍｅｒ（２）の式を使用することによる相対粘度（Ｉｎηｓｐ／ｃ）の対数の低下をそれぞれ分析することによって測定された。
ηｓｐ／ｃ＝［η］＋ｋ′［η］２ｃ （１）
（ｌｎηｒｅｌ）／ｃ＝［η］−ｋ′′［η］２ｃ （２）
（式中、ｋ′およびｋ′′は、ＨｕｇｇｉｎｓおよびＫｒａｅｍｅｒの定数である。）
【００６９】
（複数角レーザー光散乱と組み合わされた高速サイズ除外クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳ））
ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳシステムは、オンライン脱気器（島津ＤＧＵ−４Ａ）、ポンプ（島津ＬＣ−１０ＡＤ）および３つの直列に連結したカラム（ＴＳＫ ＧＥＬ Ｇ６０００／５０００／４０００ＰＷＸＬ）から成った。溶離液は、０．５ｍＬ／分で０．０１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６）を含む０．０５ＭのＮａ２ＳＯ４であった。検出器は、屈折率（ＲＩ）ＵＶモニター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ ＵＶ−Ｍ ＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．ウプサラ、スウェーデン）および複数角レーザー光散乱（Ｈｅ−Ｎｅレーザー６３２．８ｎｍを備えたＭＡＬＬＳ−Ｄａｗｎ ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．サンタ バーバラ、ＣＡ、米国）であった。サンプルを、ｐＨ＝６で０．０１ＭのＥＤＴＡを含む０．０５ＭのＮａ２ＳＯ４中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、そして１００μＬの注入前に０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。分子量測定のためのデータは、ＡＳＴＲＡソフトウエア（バージョン４．７０．０７、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．サンタ バーバラ、ＣＡ、米国）を用いて分析した。使用された屈折率の増分（ｄｎ／ｄｃ）は、０．１５であった。角適合度は、Ｄｅｂｙｅの方法に基づき、重量平均分子量Ｍｗそして数平均分子量Ｍｎは、ｌｏｇＭ（Ｍ＝分子量）対溶離体積の一次多項曲線に従って得られた。
【００７０】
（結果および検討）
（合成および特性）
アルギネート鎖への１−アミノ−１−デオキシ−β−ガラクトースの導入が、Ｇ残基に主として影響を与え、ゲル化の能力および安定性の両者並びにポリマー鎖のコンホメーションに影響することが既に報告されている。明白な改善は、マンヌロナン（Ｍ）残基への側鎖基の選択的導入の可能性により示されるだろう。これらの基がゲルの形成に含まれないことを考えて、これらの選択的に変性されたアルギネートのカルシウム結合およびゲル化性は、影響されないだろう。しかし、ウロン性官能基の類似性から、本発明者の考えによれば、保護基に基づくどんな方法も、この目的には適さない。この問題を克服するために、Ｃ−５エピメラーゼにより誘導される２つのエピマー化を伴うマンヌロナンの連続する化学的変性が、考えられてきた（図１４）。
【００７１】
第一の工程では、１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトース（ガラクトシルアミン）は、マンヌロナンのＭ残基のウロン性基にＮグルコシド結合を経て導入された。アルギネートとガラクトシルアミンとの間のカップリング反応は、既に成功することが証明されているＮＨＳの存在下縮合剤ＥＤＣを利用して行われた。ガラクトース置換マンヌロナンＭＧａｌの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図６に報告されている。前述したように、Ｍ残基へガラクトシルアミン部分が導入されると、新しく形成されたピークは、約４．７５ｐｐｍで検知可能であり、側鎖として存在する糖のアノマー性プロトンから生ずる。このピークの領域から得られた置換度（１２％）は、ポリマーのＨ＋形の電位差滴定から得られる値と良く一致する。
【００７２】
ガラクトース置換マンヌロナンから出発して、グルロン残基は、酵素ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の使用により行われた２つの連続するエピマー化反応によりポリマー鎖に導入された。従来の研究と矛盾して、２つの酵素は、最高のエピマー化の能率を達成するために必要な異なる塩化ナトリウムの濃度からみて、別々に使用された。始めのエピマー化反応では、サンプルＭＧａｌは、２４時間ＡＩｇＥ４により処理され、そのためエピメラーゼの作用の態様をもたらすと予想されるように、Ｇ残基は長い交互ＭＧＭ配列に導入される（図１４）、事実、エピマー化された物質すなわちＭＧａｌＥ４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは（図６）、新しく導入されるＧ残基のアノマー性プロトンから生ずる〜５．０７ｐｐｍでのピークの存在は、明確に検知可能である。後者のピークの領域から数値が求められるＧ残基の全体の含量（ＦＧ）は、０．３３であると分かった（表２）。その上、交互の配列のＧ残基に属するＨ−５シグナルの存在により誘導される４．８−４．６５ｐｐｍに及ぶ領域のスペクトルの複雑性の増大に注目することが重要である。
【００７３】
ホモポリマー性配列または交互配列のＭ残基に結合するガラクトシルアミン間を区別する可能性のために、変性Ｍ残基および隣接基へのエピマー化反応の障害は、容易に予言できるものとして開示された。事実、Ｇ残基に隣接するＭに導入されるガラクトシルアミンのアノマー性プロトンに属する〜４．９ｐｐｍに位置するどんなシグナルも検知されず、変性Ｍ部分に隣接するＭ残基がエピマー化に利用されないことを証明した。この考えに基づいて、ＭＧａｌＥ４の場合に達成されたエピマー化全体を、ＡＩｇＥ４処理マンヌロナンについて得られた結果と比較した。図７ａは、実験上のＧ残基含量と理論上のＧ残基含量との間の比として示される酵素の能率（％）を報告し、後者は、厳密な交互配列を生成するすべての利用可能なＭ残基の全エピマー化として計算された。ＡＩｇＥ４処理マンヌロナンの場合には、最終のＧ含量は、厳密な交互配列で０．４７であることを見いだした。この基質について０．５０の理論上の最大値を考えて、９４％の酵素の能率は計算された。サンプルＭＧａｌＥ４の場合では、ガラクトース変性残基および隣接するＭ基は、エピマー化反応では利用されず、この事実は、０．３８に等しい導入されたＧ残基の理論上最大の量（ＦＧ）に導く。そのため、酵素の活性が後者の場合に８６％に低下されるので、側鎖としてガラクトース残基の存在は、エピマー化反応に小さい作用のみをもたらすに過ぎない。
【００７４】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６を生ずる第二のエピマー化は、ホモポリマー性Ｇ配列を導入するために、エピメラーゼＡＩｇＥ６を使用して行われた（図１４）。図６は、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのアノマー性領域を報告している。ホモポリマー性配列のＧ残基のＨ−５プロトンから生ずる〜４．４５ｐｐｍでの新しく形成されたシグナルは、排他的にＭ残基に１２％のガラクトース部分を有するサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の交互性およびホモポリマー性の両者のＧ配列の存在を証明する。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の１価の基および２価の基の含量は、表２に報告される。カルシウムゲルの形成に必須の特徴である約１６％のＧＧ２価基の存在を強調することは重要である。
【００７５】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６中のポリマー鎖のシグナルのいくつかは、側鎖として存在するガラクトース部分のシグナルと重なり、これは、独立した方法により置換度をチェックさせる。従って、このポリマーのＨ＋形の電位差滴定が行われた。後者の方法で計算される置換度（１５％）は、Ｎ−グリコシド結合のどんな劣化もエピマー化または最終の生成物の精製の何れの間で生じなかった。
【００７６】
サンプルＭＧａｌＥ４に関するエピメラーゼＡＩｇＥ６の能率の数値を求めるために、厳密に交互するＭＧポリマーを同じ反応条件で処理した（図７ｂ）。上記の同じ推定の下、ポリマー性鎖のガラクトシルアミンの存在が、ポリマー中の追加のＧ残基の導入を劇的に妨げないと結論せざるをえない。事実、図７ｂに報告されたように、僅かな減少（５９％）が、ポリ交互ＭＧサンプルについて観察されたそれ（６７％）に比べたとき、ガラクトース変性ポリマーに対するＡＩｇＥ６の能率について経験された。しかし、側鎖の作用は、ポリ交互ＭＧサンプルに対する同じ酵素により示される４１％に比べて、ＭＧａｌＥ４に対する２１％に等しい酵素の能率により、ＧＧ２価基の導入に一層明らかである。
【００７７】
表２は、１価の基および２価の基の両者において３つのサンプルの組成を要約している。交互性およびホモポリマー性の両方のＧ配列が存在するので、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、選択的にＭ残基に１２％のガラクトシルアミンを有するアルギネート様部分として記述できる。
【００７８】
ポリマーと糖部分との間に導入されるスペーサーのエピマー化に対する作用を予備的に明らかにするために、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ）をマンヌロナンポリマー鎖に結合する。０．３当量のｐＮＨ２ＰｈβＧａｌを使用するＥＤＣ／ＮＨＳ化学（材料および方法参照）により達成されるこの変性ポリマーは、ＭＧａｌについて報告された同じ反応条件の下にエピマー化され、そして得られたサンプルは、１Ｈ−ＮＭＲにより分析された。図８（ａ−ｃ）で報告されているスペクトルから、比較的高い置換度（ｄ．ｓ．＝１８％）にもかかわらず、注目すべきエピマー化が達成されていることに注目すべきである。事実、図８に報告されている１Ｈ−ＮＭＲの定量分析は、ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ変性基質へのＧ残基の導入に関して、それぞれＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６の場合の８２％および５６％の能率を明らかにしており、従ってフェニル部分により示される剛いスペーサー基が、未変性Ｍ残基のＣ−５転化に顕著に影響しないことを証明している。さらに、ＡＩｇＥ４およびＡＩｇＥ６による処理が、エピマー化サンプルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル中の芳香族環に属する容易に検出できる共鳴の存在により証明されるように、ポリマーと側鎖基との間のアミド結合を開裂しない（図８ｂおよびｃ参照）。
【００７９】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の分子的な詳細の予備的な評価は、固有粘度およびＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ測定により得られた（表２）。両方の方法が、エピマー化の結果として分子量の低下（恐らく酵素の僅かなリアーゼ活性から生ずる）を明らかにしていることを強調したい。この劣化にもかかわらず、本発明の化学−酵素的なアプローチすなわちＭＧａｌＥ４Ｅ６から生成されるポリマーは、比較的高い分子量（〜１８３０００）を示す。
【００８０】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の永存長ｑは、ＦｌｏｒｙおよびＦｏｘによる等しいモデル（「ノンドレイニング（ｎｏｎｄｒａｉｎｉｎｇ）」理論）から誘導された以下の式を用いて試みられた。アルギネートを比較的硬い分子（毛虫様鎖）としてアルギネートを考えると、永存長は、固有粘度の値および分子量から推定できる。
ｑ＝１／２＊［（１／ＤＰ＊ｌ）＊（［η］Ｍｗ／Φ）２／３］
（式中、ＤＰは重合度を表し、ｌは仮想の結合長であり、そしてΦは鎖分子単位の空間的分布の関数である）。上記の式は、単分散系では完全にあてはまり、その上、Φは普遍的な定数であるか、または少なくとも考慮されている異なるポリマーの所定の群では一定である。これらの仮定の下で、ｑの非常に類似した値が得られ（ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６について、それぞれ、１２．２±１．２ｎｍ、１３．５±０．６ｎｍおよび１４．４±０．３ｎｍ）、定性的なレベルで、Ｍ残基のエピマー化がこれらのガラクトース変性ポリマーの剛さを顕著に変えないことを示唆している。
【００８１】
サンプルＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のキロプチカル性は、それぞれ、円二色性により調べられた（図９ａ−ｃ）。波長の関数としてのモル楕円率の異なるプロフィルが、３つのサンプルにより開示され、それはポリマー鎖中のＧ残基の導入から生ずることが注目される。事実、アルギネートの２つの糖成分が異なるキロプチカル挙動を示し、ポリマーの全体のＣＤスペクトルがＭおよびＧ部分の相対的量および配列パターンに依存することは、良く知られている。特に、ＧＧ、ＭＭおよびＭＧ配列のＣＤスペクトルは、ピークの位置、サインおよび強度において相違を示す。円二色性は、また、上記の３つのポリマーすなわちＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６によるカルシウムのような二価のカチオンの結合に関する定量ではないが有用な情報をもたらすことができる。ポリマーのウロン性部分による二価のカチオンの強い配位は、Ｃａ結合の配列のコンホメーションに変化をもたらす。後者は、ポリマーサンプルの全体のＣＤスペクトルの変化として検出される、カルボキシレート基のエレクトロニック環境の変性に導かれる。ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６のＣＤスペクトルは、それぞれ、既知でしかも等しい量のカルシウムの添加前および後に記録され、結果は、図９（ａ−ｃ）に報告される。特に、サンプルＭＧａｌは、カルシウムの添加によりスペクトルに関連のある変化を示さなかったが（図９ａ）、そのため、ホモポリマー性Ｍ配列によるカルシウムイオンの特異的な配位の可能性を排除することを注意すべきである。対照的に、当量のカルシウムによりサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６を処理することにより、スペクトルの注目すべき変化が検出され（図９ｃ）、これは、ＭＧａｌＥ４Ｅ６にのみ生ずるにすぎないいわゆる「エッグボックス」構造であるコンホメーション的に配列されたホモポリマー性Ｇ配列の形成により説明される。この結果は、これらの選択的に変性かつエ）ピマー化された物質が協働してカルシウムを結合する能力を証明する。図９ｂに報告されるように、またポリマーＭＧａｌＥ４は、ＧＧ二価基を完全に欠いているにもかかわらず、カルシウムの添加によりかなりな変化を示すことは、意味のあることである。さらなる分析が必要であるが、カルシウムの存在により誘導される長い規則的な交互配列間の鎖内結合の形成は、Ｍｏｒｒｉｓおよび共同研究者により既に示唆されているように、観察された挙動の原因であると提案することができるだろう。
【００８２】
（ゲルの形成および性質）
好適なバイオ活性のバイオ材料として選択的に変性されたアルギネートＭＧａｌＥ４Ｅ６を提示するために、そのカルシウムゲルの物理的性質すなわちゲルの反応の仕組み、粘弾性挙動およびヤング率が測定された。特に、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６からのカルシウム−ヒドロゲルは、既に報告されたようにサンプルＬｈｙｐＧａｌから得られるものと比較された。前者はＭ残基にのみ１２％の１−アミノ−１−デオキシ−ガラクトースを有するが、後者はＧ部分に位置する同じ残基の同様な含量（１４％）の存在を特徴とすることを強調するのが重要である。Ｌ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートは、標準ゲル形成材料としてこの比較に使用された。
【００８３】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアからのアルギネートに関するゲル形成の反応の仕組みは、それぞれ、ポリマー溶液に不活性形のカルシウムイオン（ＣａＣＯ３）を添加し、次に徐々に加水分解するラクトンＧＤＬを添加することにより研究された。添加されるカルシウムのモルとポリマー繰り返し単位のモルとの間の比は、ゲルの離液を制限するために、すべての３つのサンプルで０．２６に等しかった（図１２ｂ参照）。
【００８４】
この「内部ゲル化」プロセスでは、ＧＤＬの（遅い）加水分解は、ＨＣＯ３−の不溶性ＣａＣＯ３を転換するプロトンを放出し、それによりゲルの形成に必要なカルシウムイオンをもたらす。ラクトンの混合とゲル形成との間の遅延は、レオメーターにおけるヒドロゲルの形成および硬化の研究を可能にする（図１０ａ−ｃ）。
【００８５】
図１０ａは、ゲル形成プロセスの最初の１０００秒におけるＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６のそれぞれの動的弾性率（Ｇ′）の変化を報告している。データは、アルギネート中のＧ残基へのガラクトース部分の導入は、ゲル形成の反応の仕組みに強く影響する。事実、ＬｈｙｐＧａｌとＬ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートサンプルとの比較から、前者は、最初の１０００秒ではＧ′値の顕著な変化を示さないが、後者は、動的弾性率の１６倍の増加を開示することが強調される。逆に、ＬｈｙｐＧａｌのそれに似た量のガラクトースを有するがＭ残基に選択的に導入されたサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、同じ観察時間で動的弾性率の顕著な増加を示し、Ｌ．ハイパーボレアからのガラクトース変性アルギネートに比較するとき、より早いゲル形成を示した。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の場合の動的弾性率の顕著な増加は、長い交互配列のポリマーにおける量の多さにさかのぼることができ、それは結合のより早い、しかもより能率的な形成を導くものと思われる。
【００８６】
これらの考察は、図１０ｂにより確認でき、そこでは、ゲル形成の最初の１０００秒中記録される相角度（δ）の変化が、それぞれＬ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６について報告されている。繰り返すが、Ｇ残基への側鎖の導入は、ＬｈｙｐＧａｌのゲル形成を損なう。反対に、酵素化学的変性アプローチを開発しそして非ゲル形成Ｍ残基上の選択的置換すなわちＭＧａｌＥ４Ｅ６を達成することにより、ポリマーのゲル形成性は、影響されることがない。
【００８７】
内部ゲル化により得られるゲルの硬化は、Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６について、それぞれ約７×１０４秒行われ、図１０ｃで示されるように、すべての３つのケースで安定なゲルを得た。ゲルの完全な形成後、機械的な面は、Ｌ．ハイパーボレア、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６サンプルについて、それぞれ測定された（図１１）。すべての３つのケースにおいて、動的弾性率（Ｇ′）は、ωの全範囲にわたって損失弾性率（Ｇ′′）より常に高く、これらの物質をゲルとして規定するための本当に初めの要件を満足する。サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の場合、振動数からのＧ′の独立性は、Ｇ′とＧ′′との間のほぼ１００倍の相違とあいまって、この系を強いゲルとする。
【００８８】
３つのアルギネートサンプルからのヒドロゲルの物理的性質における相違のさらなる評価を得るために、ＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよび未変性Ｌ．ハイパーボレアアルギネートサンプルから得られるゲル円筒に関するヤング率は、それぞれ測定された（図１２ａ）。３つのサンプルの定量的比較のために、カルシウムキレート化に利用できるＣａ２＋イオンのモルとＧ残基のモルとの間の一定の比が使用された。従って、ＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアからのアルギネートからのゲル円筒は、各ポリマーの炭酸カルシウムの異なる濃度すなわちそれぞれ１３．３、１６および２２ｍＭを使用して製造された。
【００８９】
変性アルギネートサンプルの値（〜１１ｋＰａ）から出発して、Ｇ残基へのガラクトシルアミン部分の導入は、ゲルの強さに劇的に影響し、そしてＬｈｙｐＧａｌについてヤング率を〜４．２ｋＰａ低下させたことに注意することが重要である。しかし、マンヌロナンへの側鎖ガラクトースの導入次に２つのエピマー化を行うことは、ゲルの強さの点で良好な結果を生ずる。事実、８．７ｋＰａのヤング率は、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６について測定され、それはポリマー鎖の選択的変性の重要性を強調する。
【００９０】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６は、また、図１２ｂで報告されるように、添加されたカルシウムの量により誘導される驚くべき離液を示す。ゲルの離液は、液体の部分的な滲出を生ずる遅い時間に依存する収縮を顕微鏡的に特徴とする現象である。離液は、ゲル形成後のポリマー鎖の横方向の会合により生ずるものとされており、そしてそれは、アルギネートサンプル中に存在する交互配列の量に既に関連している。図１２ｂでは、カルシウム／ポリマー繰り返し単位の比に対する離液（％）は、それぞれサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６、ＬｈｙｐＧａｌおよびＬ．ハイパーボレアについてプロットされた。エピマー化された物質すなわちサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６が、Ｌ．ハイパーボレアからの未変性サンプルに比べたとき、溶液中に分散したＣａＣＯ３の量に対する離液の高い依存性を示すことを認めることができる。この挙動は、前のポリマーに存在する多量の交互ＭＧＭ配列を考慮に入れることによって説明できる。対照的に、Ｌ．ハイパーボレア源からのＧ変性アルギネートサンプルすなわちＬｈｙｐＧａｌは、カルシウム濃度に対する離液の依存性をなんら示さず、後者の場合には、Ｇ残基上のかさ高なガラクトース部分の存在は、ゲル中のポリマー鎖の横方向の会合を立体的に障害し、従って脱膨潤作用を妨げる。
【００９１】
（カプセルの形成および安定性）
カプセルを形成するサンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６の能力について特別な注目が集まっている。ＭＧａｌＥ４Ｅ６の２％溶液を５０ｍＭの塩化カルシウム溶液に注ぐと、安定なカプセルが得られたことが観察された。これらカプセルの直径は、静電気ビード発生器（材料および方法の項参照）によりコントロールされるが、４０４±１９μｍであることが分かった（ｎ＝２０）。
【００９２】
サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られるカプセルの安定性は、塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）による処理によって寸法（直径）の変化を測ることによりテストされた。比較のために、未変性Ｌ．ハイパーボレアおよびサンプルＬｈｙｐＧａｌから得られるカプセルの安定性を考えた。
【００９３】
カプセルは、イオン性ゲルであり、その体積は、正の浸透圧（膨張）により主として左右され、その正の圧は、ゲル中の架橋の数に関連する網状構造の弾性による負の圧により平衡になる。
【００９４】
カプセルを過剰のＮａ＋対イオンすなわち塩水溶液により処理することによって、一価のカチオンと二価のカチオンとの間の競合は、カプセル中のカルシウムイオンへの置換に導かれることが最終的に生ずる。これらの処理の効果のすべては、カプセルの直径の増大に関係のあるＧ結合の数および長さの減少である。そのため、塩水処理の取り替えの所定の数による寸法の変化が大きければ大きいほど、カプセルの安定性は低くなる。
【００９５】
図１３は、それぞれＬ．ハイパーボレアアルギネート、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られるカプセルに対する塩水溶液の置換の取り替えの効果を報告している。未変性Ｌ．ハイパーボレアとＧ残基に導入される１４％のガラクトースを有するサンプルすなわちＬｈｙｐＧａｌとの間の比較から、後者の場合では安定性の低下を合わせたものが、既に論じられたように、経験されることを強調すべきである。事実、塩水溶液を２回変えた後、サンプルＬｈｙｐＧａｌからのカプセルは直径が２倍増加するが、Ｌ．ハイパーボレアからの未変性アルギネートから得られるカプセルは、１．１倍の増加を示すに過ぎなかった。この効果は、アルギネート中のグルロン残基における側鎖基の存在にさかのぼり、そのカルシウム結合性を実質的に損なうことになる。
【００９６】
逆に、ＭＧａｌＥ４Ｅ６からのカプセルは、驚くべき安定性を示し、塩水を２回変えた後に直径が１．３倍に増加した。Ｇ変性物質ＬｈｙｐＧａｌに比較してこのサンプルによって示される高い安定性は、サンプルポリマーにおいて、側鎖基の導入はＭ残基のみに影響することを考えて、説明できる。ゲル形成に含まれない残基上の選択的なこのような変性は、アルギネートサンプルによるカルシウムの結合を妨げず、一層安定なカプセルに導かれる。さらに、カプセルの安定における長い交互配列の役割も、また、既に報告されたように、提案されている。
【００９７】
（結論）
構造的に精製されたマンヌロナンの利用可能性および異なるＣ−５エピメラーゼの利用可能性は、Ｍ残基で選択的に変性されるアルギネート様分子を生成する新しい方法を案出することを可能にした。酵素化学的変性アプローチは、マンヌロン部分に排他的にガラクトース残基を有する新しいバイオ活性バイオ材料の生成でテストされた。ガラクトース変性物質に対するエピメラーゼの作用は、１Ｈ−ＮＭＲにより分析され、そして得られたポリマーは、固有粘度、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳおよび円二色性スペクトル分析により分析された。
【００９８】
変性かつエピマー化された物質のレオロージー測定は、特にＧ残基を同様に変性したアルギネートサンプルとの比較において、Ｍ残基への側鎖基の選択的導入の機械的性質への有利さを指摘している。
【００９９】
ガラクトース部分を存在させることにより、変性かつエピマー化された物質は、肝細胞の内包のための新しいバイオ活性バイオ材料として提案でき、その場合、アルギネートゲルの機械的および膨潤の性質が、Ｌ．ハイパーボレアサンプルからの変性アルギネートに関して改善されている。しかし、このような酵素化学的変性アプローチが、広範囲な応用可能性をもたらし、新規なバイオ材料の製造に向かって新しい機会を特にアピールし開くようにすることに注目することが重要である。結論として、エピマー化を伴うマンヌロナンの変性は、テイラーメイドの構造および物理性を有する選択的に変性された物質を得るために、信頼できる新しい方法として提案できる。
【０１００】
（表２）
（ポリマーＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の１価の基および２価の基としての組成、固有粘度および分子量）
サンプル ＦＧ ＦＭ ＦＧＧ ＦＧＭ／ＭＧ ＦＭＭ
ＭＧａｌ ０ １ ０ ０ １
ＭＧａｌＥ４ ０．３３ ０．６７ ０ ０．３３ ０．３４
ＭＧａｌＥ４Ｅ６ ０．４５ ０．５５ ０．１６ ０．２９ ０．２６
サンプル ［η］ Ｋ′ Ｋ′′ Ｍｗ ｄ
（ｄＬ／ｇ）ａ （ｇ／モル）ｂ（Ｍｗ／Ｍｎ）ｃ
ＭＧａｌ １１．９８ ０．４２４ ０．１２ ４４８×１０３ １．５４
ＭＧａｌＥ４ ９．３４ ０．３９３ ０．１３０ ２３６２×１０２ １．６８
ＭＧａｌＥ４Ｅ６ ８．８５ ０．３７２ ０．１４１ １８３２×１０２ １．７３
【０１０１】
ＦＧは、グルロン酸からなるアルギネートの割合を示し、ＦＧＧは、ダイマーのブロック中のグルロン酸からなるアルギネートの割合を示し、一方ＦＭＭは、２価のマンヌロン基からなるアルギネートの割合を示し、ＦＧＭ／ＭＧは、グルロン酸およびマンヌロン酸の混合配列からなるアルギネートの割合を示す。ａは、溶媒：ＮａＣｌ ０．１Ｍ、Ｔ＝２０℃であり、ｋ′およびｋ′′は、それぞれヒギンスの定数およびクレマーの定数を示す。ｂは、重量平均分子量であり、そしてｃは、ＨＰＳＥＣ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳにより測定された多分散性指数である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】アルギネートのＭａｎＡ残基の選択的置換の２工程方法の例を示す。第一の工程は、ガラクトサミンによるマンヌロナンの置換である。第二の工程は、組み換えで生成したＣ−５エピメラーゼを使用するＣ−５エピマー化である。実施例１は、図１に示された方法に関する。
【図２】以下の３つから作られたカルシウムアルギネートゲルビードの膨潤を示す。四角：Ｌ．ハイパーボレア、丸：ポリマンヌロナン、変性およびエピマー化（１２％のガラクトース）、三角：塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）の取り替えの数による変性Ｌ．ハイパーボレア（１４％のガラクトース）。
【図３】以下の１−３に関するヤング率として測定された機械的強さを示す。１：未変性Ｌ．ハイパーボレア、２：変性Ｌ．ハイパーボレア（１４％のガラクトース）、３；ポリマンヌロナン、変性およびエピマー化（１２％のガラクトース）。
【図４】塩水溶液（ＮａＣｌ ０．９％）の取り替えの数による、以下の３つから製造されたＣａアルギネートゲルビードの膨潤に対するＭ残基の選択的変性の効果を示す。丸：Ｌ．ハイパーボレア、四角：変性かつエピマー化マンヌロナン、三角：Ｌ．ｈｙｐ．アルギネート。
【図５】５０ｍＭのＥＤＴＡにおける安定性（左）および０．９％ＮａＣｌ溶液中の膨潤（右）に対するＭ置換アルギネートカプセルの光架橋の効果を示す。四角：未架橋サンプル、丸：光架橋サンプル。
【図６】ＭＧａｌ、ＭＧａｌＥ４およびＭＧａｌＥ４Ｅ６の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（アノマー性領域）を示す。
【図７】ａは、ポリマー鎖中の単一Ｇ残基の導入に関するマンヌロナンおよびＭＧａｌサンプルに対するエピメラーゼＡＩｇＥ４の能率（％）の比較を示す。ｂは、ポリマー鎖中の単一のＧ残基（淡いグレー）およびＧＧ２価基（濃いグレー）の導入に関するポリ交互ＭＧ（ＦＧ＝０．４７）およびＭＧａｌＥ４サンプルに対するエピメラーゼＡＩｇＥ６の能率（％）の比較を示す。
【図８】ａは、ｐＮＨ２ＰｈβＧａｌ（ｄ．ｓ．＝０．１８）により変性されたマンヌロナンの３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ｂは、ａの変性マンヌロナンをＡＩｇＥ４によりエピマー化した生成物（最終組成物；ＦＧ＝０．２６、ＦＧＧ＝０）の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ｃは、ｂの生成物をさらにＡＩｇＥ６により処理された生成物（最終組成物；ＦＧ＝０．３６、ＦＧＧ＝０．１７）の３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。Ｈ−ＩＧは、導入されるグルロン残基のアノマー性シグナルを表し、Ｈ−５Ｇ（Ｇ）は、他のグルロン部分に隣接するグルロン残基のＨ５シグナルを表す。
【図９】ａは、ＭＧａｌの円二色性スペクトルであり、ｂはＭＧａｌＥ４の円二色性スペクトルであり、ｃはＭＧａｌＥ４Ｅ６の円二色性スペクトルである。図中、実線はカルシウムの添加前であり、点線はその添加後である。報告されたサンプルのすべてで、［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］＝０．２６である。
【図１０】ａは、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）から得られたゲルの初めの１０００秒のＧ′の変化を示す。ｂは、サンプルＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）から得られたゲルの初めの１０００秒のδの変化を示す。ｃは、ＭＧａｌＥ４Ｅ６（実線）、ＬｈｙｐＧａｌ（太い点線）およびＬ．ハイパーボレアからのアルギネート（細かい点線）の硬化中のＧ′の変化を示す。ゲルは、２０ｍＭのＣａＣＯ３および４０ｍＭのＧＤＬを添加された１．５％ポリマー溶液から得られた。
【図１１】Ｌ．ハイパーボレアアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（丸）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（三角）から得られるヒドロゲルに関する動的弾性率Ｇ′（黒いシンボル）および損失弾性率Ｇ′′（白いシンボル）を示す。ゲルは、２０ｍＭのＣａＣＯ３および４０ｍＭのＧＤＬを添加された１．５％ポリマー溶液から得られた。
【図１２】ａは、Ｌ．ハイパーボレアアルギネート、ＬｈｙｐＧａｌおよびＭＧａｌＥ４Ｅ６から得られたゲル円筒のヤング率（Ｅ）を示す。モル比［Ｃａ２＋］／［Ｇ残基］は、すべて３つのサンプルで０．５９に等しかった。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。（ｎ＝８）。ｂは、Ｌ．ハイパーボレアアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（三角）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（丸）から得られたゲル円筒に関する比［Ｃａ２＋］／［Ｐｏｌｙｍ］に対する離液の依存性を示す。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。（ｎ＝８）。
【図１３】Ｌ．ハイパーボレアからのアルギネート（四角）、ＬｈｙｐＧａｌ（三角）およびＭＧａｌＥ４Ｅ６（丸）に関する塩水溶液の取り替えを増やすとき絶対直径（ｄ０＝ビードの最初の直径）の増加として示されるカルシウムビードの安定性を示す。値は、平均±ｓ．ｄ．として報告された。
【図１４】Ｍ残基を選択的に変性されたアルギネートの生成に関する酵素化学的変性アプローチを示す。Ｓ＝１−アミノ−１−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトースまたはｐＮＨ２Ｐｈ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そして
ｂ）アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程
を含むことを特徴とする変性アルギネートポリマーを製造する方法。
【請求項２】
変性用成分が、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項３】
変性用成分が、ガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドからなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項４】
酵素によるエピマー化反応が、アゾトバクター・ビンランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）またはラミナリア・ジギタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）から由来するエピメラーゼ酵素を使用する請求項１の方法。
【請求項５】
酵素によるエピマー化反応が、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ１、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ２、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ３、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ４、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ５、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ６およびアゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ７からなる群から選ばれるエピメラーゼ酵素を使用する請求項１の方法。
【請求項６】
工程ａ）が工程ｂ）の前に行われる請求項１の方法。
【請求項７】
アルギネートポリマーのすべての未変性モノマー性サブユニットが、工程ａ）の前の未変性Ｍモノマー性サブユニットである請求項１の方法。
【請求項８】
変性アルギネートポリマーが、工程ａ）およびｂ）の後で４０−５０％の未変性Ｇモノマー性サブユニットを含む請求項１の方法。
【請求項９】
複数の請求項１のアルギネートポリマーと二価のゲル化イオンとを溶媒中で組み合わせることを特徴とするアルギネートゲルまたは繊維の製造方法。
【請求項１０】
二価のゲル化イオンがカルシウム、ストロンチウムまたはバリウムである請求項９の方法。
【請求項１１】
該アルギネートゲルが１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項９のアルギネートゲルの製造方法。
【請求項１２】
該アルギネートゲルが、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株からなる群から選ばれる１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットのみが変性され、そして変性が、リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上のマンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットに結合したアセチル基以外の変性用成分からなることを特徴とする未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットおよび未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットを含む変性アルギネートポリマー。
【請求項１４】
変性用成分が、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から選ばれる請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１５】
変性用成分が、ガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドからなる群から選ばれる請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１６】
変性アルギネートポリマーが、４０−５０％の未変性Ｇモノマー性サブユニットを含む請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１７】
二価のゲル化イオンにより架橋された複数の請求項１３のアルギネートポリマーを含むことを特徴とするアルギネートゲルまたは繊維。
【請求項１８】
二価のゲル化イオンがカルシウム、ストロンチウムまたはバリウムである請求項１７のアルギネートゲルまたは繊維。
【請求項１９】
該アルギネートゲルが１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１７のアルギネートゲル。
【請求項２０】
該アルギネートゲルが、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株からなる群から選ばれる１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１９のアルギネートゲル。
【請求項１】
ａ）リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上の未変性モノマー性サブユニットに変性用成分を共有結合的に結合させる工程、そして
ｂ）アルギネートポリマーの１つ以上の未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットを酵素によるエピマー化反応により１つ以上の未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットに変化させる工程
を含むことを特徴とする変性アルギネートポリマーを製造する方法。
【請求項２】
変性用成分が、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項３】
変性用成分が、ガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドからなる群から選ばれる請求項１の方法。
【請求項４】
酵素によるエピマー化反応が、アゾトバクター・ビンランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）またはラミナリア・ジギタータ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）から由来するエピメラーゼ酵素を使用する請求項１の方法。
【請求項５】
酵素によるエピマー化反応が、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ１、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ２、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ３、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ４、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ５、アゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ６およびアゾトバクター・ビンランディ ＡＩｇＥ７からなる群から選ばれるエピメラーゼ酵素を使用する請求項１の方法。
【請求項６】
工程ａ）が工程ｂ）の前に行われる請求項１の方法。
【請求項７】
アルギネートポリマーのすべての未変性モノマー性サブユニットが、工程ａ）の前の未変性Ｍモノマー性サブユニットである請求項１の方法。
【請求項８】
変性アルギネートポリマーが、工程ａ）およびｂ）の後で４０−５０％の未変性Ｇモノマー性サブユニットを含む請求項１の方法。
【請求項９】
複数の請求項１のアルギネートポリマーと二価のゲル化イオンとを溶媒中で組み合わせることを特徴とするアルギネートゲルまたは繊維の製造方法。
【請求項１０】
二価のゲル化イオンがカルシウム、ストロンチウムまたはバリウムである請求項９の方法。
【請求項１１】
該アルギネートゲルが１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項９のアルギネートゲルの製造方法。
【請求項１２】
該アルギネートゲルが、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株からなる群から選ばれる１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットのみが変性され、そして変性が、リンカーを有するかまたは有しないアルギネートポリマーの１つ以上のマンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットに結合したアセチル基以外の変性用成分からなることを特徴とする未変性マンヌロン（Ｍ）モノマー性サブユニットおよび未変性グルロン（Ｇ）モノマー性サブユニットを含む変性アルギネートポリマー。
【請求項１４】
変性用成分が、単糖、オリゴ糖、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白からなる群から選ばれる請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１５】
変性用成分が、ガラクトースおよびそのオリゴマー、マンノースおよびそのオリゴマー、ｓＬｅｘ（ＮｅｕＡｃａ２−３Ｇａｌβ１−［４Ｆｕｃａｌ−３］ＧｌｃＮＡｃ）、ＧｌｃＮＡｃ、ＨＡ−オリゴマー（ヒアラドヘジン；ヒアルロナン結合蛋白）、ＲＤＧペプチド、ＹＩＧＳＲペプチド、ＲＥＤＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥペプチドおよびＫＲＳＲペプチドからなる群から選ばれる請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１６】
変性アルギネートポリマーが、４０−５０％の未変性Ｇモノマー性サブユニットを含む請求項１３の変性アルギネートポリマー。
【請求項１７】
二価のゲル化イオンにより架橋された複数の請求項１３のアルギネートポリマーを含むことを特徴とするアルギネートゲルまたは繊維。
【請求項１８】
二価のゲル化イオンがカルシウム、ストロンチウムまたはバリウムである請求項１７のアルギネートゲルまたは繊維。
【請求項１９】
該アルギネートゲルが１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１７のアルギネートゲル。
【請求項２０】
該アルギネートゲルが、膵島、肝細胞、神経細胞、腎皮質細胞、血管上皮細胞、甲状腺および上皮小体細胞、副腎細胞、胸腺細胞、卵巣細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、心臓細胞、幹細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイトまたは確立された細胞株から由来する細胞例えば２９３、ＭＤＣＫおよびＣ２Ｃ１２細胞株からなる群から選ばれる１つ以上のリビング細胞をさらに含む請求項１９のアルギネートゲル。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５１９５９５（Ｐ２００８−５１９５９５Ａ）
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０７５１（Ｐ２００７−５４０７５１）
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３６３３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５１４２１
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０４３６９６６１）エフエムシー バイオポリマー エイエス (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３６３３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５１４２１
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５０４３６９６６１）エフエムシー バイオポリマー エイエス (14)
【Ｆターム（参考）】
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