大腸菌群の検出方法
【課題】試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを迅速に判定することができる大腸菌群の検出方法を提供することを課題とする。
【解決手段】大腸菌群の検出対象となる試料を、大腸菌群を培養することができる培地（ＢＧＬＢ培地など）に接種する（ステップＳ１）。試料が接種された培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する（ステップＳ２）。培養された培地に界面活性剤を添加するとともに、界面活性剤が添加された培地を４０℃〜５０℃程度に加温する。加温された培地を、フィルタにより濾過する（ステップＳ３）。フィルタ上に残留した残留物を液体中に分散させることにより残留物の浮遊液を調製し、浮遊液に含まれる菌体数をフローサイトメータにより計測する（ステップＳ４）。計測した菌体数に基づいて、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する（ステップＳ５）。
【解決手段】大腸菌群の検出対象となる試料を、大腸菌群を培養することができる培地（ＢＧＬＢ培地など）に接種する（ステップＳ１）。試料が接種された培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する（ステップＳ２）。培養された培地に界面活性剤を添加するとともに、界面活性剤が添加された培地を４０℃〜５０℃程度に加温する。加温された培地を、フィルタにより濾過する（ステップＳ３）。フィルタ上に残留した残留物を液体中に分散させることにより残留物の浮遊液を調製し、浮遊液に含まれる菌体数をフローサイトメータにより計測する（ステップＳ４）。計測した菌体数に基づいて、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する（ステップＳ５）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌群の検出方法に関し、さらに詳しくは、ＢＧＬＢ（Brilliant
Green Lactose Bile）培地などを用いた大腸菌群の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳および乳製品の成分規格に関する省令（乳等省令）では、牛乳および乳製品の成分規格が定められている。乳等省令では、牛乳および乳製品中の大腸菌群は、陰性であることが定められている。
【０００３】
大腸菌群とは、グラム陰性の芽胞を形成しない桿菌であり、４８時間以内に乳糖を分解して酸およびガスを産出する好気性細菌または通性嫌気性細菌の一群を指す。Klebsiella、Citrobacter、Enterobacter、Escherichiaなどの属が、大腸菌群に属する。
【０００４】
乳等省令では、牛乳の大腸菌群の検出方法として、ＢＧＬＢ法の使用が定められている。ＢＧＬＢ法は、牛乳あるいは乳製品などの検体を接種したＢＧＬＢ培地を４８時間で培養させる必要がある。また、乳等省令では、発酵乳などの乳製品における大腸菌群の検出方法として、デソキシコレート寒天培地（デソ培地）を用いる方法（デソ法）の使用が、定められている。デソ法は、牛乳の自主検査にも用いられる。デソ法は、検体を接種したデソ培地を２０時間培養させる必要がある。
【０００５】
しかし、ＢＧＬＢ法およびデソ法は、検体中の大腸菌群が陰性であることを確認するまでに長い時間を要するため、牛乳および乳製品の出荷鮮度を維持することが困難である。このため、検体中の大腸菌群の検出時間を短縮することが、以前から望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１８６４９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１には、培養時間を短縮することができる大腸菌群の検出方法が開示されている。具体的には、試料をグラム陽性細菌の生育を阻害する培地に接種し、培地を３５℃の温度条件下にて１２時間程度で培養する。培養後の培地に形成されたコロニーに、発色合成酵素基質を滴下する。大腸菌群のコロニーが発色合成酵素基質により発色するため、培養後の培地における大腸菌群の有無を肉眼により観察することができる。上記特許文献１に係る検出方法は、デソ法により大腸菌群が陽性であると推定された試料の確認試験などに用いられる。
【０００８】
上記特許文献１に開示された大腸菌群の検出方法を用いることにより、１２時間程度で検体中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定することができる。しかし、検体中の大腸菌群を検出するまでの時間をさらに短くすることにより、牛乳および乳製品の安全性や品質をさらに向上させることが可能となる。
【０００９】
そこで、本発明は、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを迅速に判定することができる大腸菌群の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、請求項１記載の発明は、大腸菌群の検出方法であって、試料を、大腸菌群を培養することができる培地に接種する工程と、前記試料が接種された前記培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する培養工程と、培養された前記培地を、フィルタにより濾過する濾過工程と、前記フィルタに残留した残留物の浮遊液を調製し、前記浮遊液に含まれる菌体数を、フローサイトメータにより計測する計測工程と、計測した前記菌体数に基づいて前記試料中の大腸菌群の有無を判定する判定工程と、を備える。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１に記載の大腸菌群の検出方法において、前記培地は、ＢＧＬＢ（Brilliant Green Lactose Bile）培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、及びラウリル硫酸トリプトースブイヨンのいずれかである。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の大腸菌群の検出方法において、前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を３４．５℃以上３５．５℃以下にて培養する。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を４時間以上５時間以下で培養する。
【００１４】
請求項５記載の発明は、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、前記濾過工程は、前記培養された前記培地に界面活性剤を添加し、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する。
【００１５】
請求項６記載の発明は、請求項５に記載の大腸菌群の検出方法において、前記濾過工程は、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する前に、前記界面活性剤が添加された前記培地を４０℃以上４７℃以下の温度にて加温する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る大腸菌群の検出方法は、試料をＢＧＬＢ培地などの大腸菌群を検出できる培地に接種し、試料が接種された培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する。培養された培地を濾過し、濾過後の残留物の浮遊液を調製する。フローサイトメータにより、浮遊液中の菌体数を計測する。培地の培養時間が５時間以下であるため、本発明に係る大腸菌群の検出方法は、フローサイトメータによる計測に要する時間を含めて、６時間程度で試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の手順を示す図である。
【図２】浮遊液の調製に用いる蛍光染色液の組成を示す表である。
【図３】試料中の大腸菌群の計測結果を示す表である。
【図４】実施の形態に係る大腸菌群の検出方法を用いた大腸菌群の計測数と、従来の培養法を用いた大腸菌群のコロニー数との対応を示すグラフである。
【図５】試料中の大腸菌群に属さない菌の計測結果を示す表である。
【図６】ＢＧＬＢ法と、実施の形態に係る大腸菌群の検出方法との一致率を示す表である。
【図７】ＢＧＬＢ法とデソ法との一致率を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳しく説明する。本実施の形態における大腸菌群の検出方法は、試料を、大腸菌群を培養できる培地に接種した後に、試料が接種された培地を３０℃〜４０℃にて、３．５時間以上５時間以下で培養する。たとえば、大腸菌群を培養できる培地として、ＢＧＬＢ培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、あるいはラウリル硫酸トリプトースブイヨンなどを用いることができる。培養後の培地をフィルタにより濾過し、フィルタ上の残留物を回収する。回収した残留物を分散させた浮遊液を調製し、浮遊液中の菌体数をフローサイトメータにより計測する。これにより、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを６時間以内で判定することが可能となる。
【００１９】
本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の対象となる試料は、牛乳および乳飲料（乳を含む液体状の食品）である。水に溶解する固体状または半固体状の食品（粉末ミルク、ヨーグルトなどの乳製品）に対しても、本実施の形態の大腸菌群の検出方法を適用することができる。
【００２０】
図１は、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の手順を示すフローチャートである。以下、大腸菌群を培養できる培地として、ＢＧＬＢ培地を用いる例を説明する。まず、試料とＢＧＬＢ培地とが所定の比率になるように、ＢＧＬＢ培地に試料を接種する（ステップＳ１）。ＢＧＬＢ培地を用いることにより、大腸菌群に属する菌（以下、単に「大腸菌群」と呼ぶ。）を選択的に培養することができる。
【００２１】
試料が接種されたＢＧＬＢ培地を、３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する（ステップＳ２）。試料が接種されたＢＧＬＢ培地を３．５時間以上で培養することにより、フローサイトメータにより大腸菌群を検出することができる。
【００２２】
ＢＧＬＢ培地の培養時間は、４時間以上５時間以下であることが望ましい。試料が、大腸菌群のうち生育の遅い菌株のみを含んでいる場合であっても、フローサイトメータにより、生育の遅い菌株を検出することができる。また、ＢＧＬＢ培地を４時間以上で培養することにより、ＢＧＬＢ培地中の菌体数が増加するため、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かの判定精度を向上させることができる。
【００２３】
ＢＧＬＢ培地の培養時の温度（３０℃以上４０℃以下）は、大腸菌群の培養に適した温度として以前から知られている温度である。本実施の形態において、ＢＧＬＢ培地の温度は３４．５℃以上３５．５℃以下であることが望ましい。培養温度を３４．５℃以上３５．５℃以下に設定することにより、大腸菌群の活動が活発になるため、培養時間を短縮することができる。
【００２４】
次に、培養されたＢＧＬＢ培地（培養液）を、フィルタにより濾過する（ステップＳ３）。フィルタ上に大腸菌群を残留させるために、フィルタの孔径は、０．６μｍ程度であることが望ましい。
【００２５】
試料が牛乳あるいは乳製品である場合、培養液を濾過する前に、培養液に界面活性剤を添加することが望ましい。界面活性剤を培養液に添加しない場合、牛乳などに含まれる脂肪球がフィルタの孔を塞ぐ目詰まりが発生し、培養液を濾過できないおそれがある。培養液に界面活性剤を添加して脂肪球の界面張力を低下させることにより、脂肪球の柔軟性が向上する。この結果、脂肪球がフィルタの孔を通過しやすくなる。また、脂肪球がフィルタ上に残留することが防止されるため、菌体数の計測精度を向上させることができる。
【００２６】
培養液を濾過するときに、培養液の温度が４０℃以上４７℃以下であることが望ましい。培養液の温度が４０℃未満である場合、界面活性剤を培養液に添加したとしても、脂肪球の柔軟性が低下するおそれがある。培養液の温度が４７℃よりも高い場合、試料中のタンパク質成分が凝固するおそれがある。凝固したタンパク質成分は、フィルタの目詰まりの原因となる。培養液の温度が４７℃よりも高い場合、培養液中の大腸菌群の一部が死滅するおそれがある。このように、培養液を４０℃以上４７℃以下に加温することにより、培養液中の大腸菌群を減少させることなく、かつ、脂肪球の柔軟性を維持したまま、培養液を濾過することができる。また、フィルタ上に大腸菌群以外の成分が残留することを防ぐことができる。
【００２７】
次に、フィルタ上の残留物を分散させた液体（浮遊液）を調製し、浮遊液中の菌体数をフローサイトメータにより計測する（ステップＳ４）。フローサイトメータは、細胞などの微粒子を分散させた液体を高速度で流し、流れる液体中の微粒子を光学的に分析する装置である。
【００２８】
単位体積あたりの浮遊液中の菌体数に基づいて、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する（ステップＳ５）。具体的には、牛乳の公定法であるＢＧＬＢ法などにより、大腸菌群が陰性と判定された試料を比較試料（ブランク）とする。本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法を用いてブランクの菌体数を予め計測しておく。試料の菌体数とブランクの菌体数とを比較することにより、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する。
【００２９】
ＢＧＬＢ培地の培養時間は、最大で５時間である。ステップＳ３の濾過工程に要する時間は、約２０分である。ステップＳ４の計測工程およびステップＳ５の判定工程に要する時間は、合計で約４０分である。したがって、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法は、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを、６時間以内に判定することができる。
【００３０】
［実施例１］
以下、上記実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の実施例を説明する。
【００３１】
｛実験に用いた菌株｝
本実施例では、大腸菌群として、（１）〜（４）に示す４種の菌株を用いた。カッコ内の記載は、整理番号を示す。
（１）Enterobacter aerogenes（NBRC 13534T）
（２）Klebsiella oxytoca（JCM 1665）
（３）Citrobacter freundii（JCM 1657）
（４）Escherichia coli（NBRC 3972）
【００３２】
大腸菌群に属さないグラム陽性菌として、（５）〜（８）に示す４種の菌株を用いた。また、大腸菌群に属さないグラム陰性菌として、（９）および（１０）に示す２種の菌株を用いた。
（５）Bacillus cereus（JCM 2152）
（６）Staphylococcus aureus subsp. aureus（JCM 2151）
（７）Lactococcus lactis subsp. lactis（NBRC 12007）
（８）Microbacterium lauticum（NBRC14135）
（９）Acinetobacter calcoaceticus（NBRC12552）
（１０）Pseudomonas fluorescens（NBRC 3507）
【００３３】
上記（１）〜（１０）の菌株のうち、整理番号が“JCM”で始まる菌株は、下記の寄託機関に寄託されている。
寄託機関名：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室
連絡先：郵便番号３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１、電話番号０４８−４６７−９５６０
【００３４】
上記（１）〜（１０）の菌株のうち、整理番号が“NBRC”で始まる菌株は、下記の寄託機関に寄託されている。
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門
連絡先：郵便番号２９２−０８１８、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、電話番号０４３８−２０−５７６３
【００３５】
｛実験手順｝
実験手順について説明する。まず、上記（１）〜（１０）の菌株がそれぞれ接種された試料を調製した。具体的には、上記（１）〜（９）の菌株を、ＴＳＢ（Trypcase Soy Broth）培地を用いて３５℃にて一晩培養した。（１０）の菌株のみ、ＴＳＢ培地を用いて３０℃にて一晩培養した。
【００３６】
（１）〜（４）の大腸菌群を培養したＴＳＢ培地を牛乳で段階的に希釈した。これにより、（１）〜（４）の大腸菌がそれぞれ希釈された１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液と、（１）〜（４）の大腸菌がそれぞれ希釈された１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液とを調製した。（１）〜（４）の大腸菌ごとに調製した２種類の汚染濃度の希釈液を、試料として用いた。ここで、１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルとは、液体に接種された菌数（接種菌数）が、１ｍｌあたり０．９〜９であることを指す。１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルとは、液体に対する接種菌数が、１ｍｌあたり１０〜９９であることを指す。
【００３７】
（５）〜（１０）の菌株をそれぞれ培養したＴＳＢ培地を牛乳で段階的に希釈した。これにより、（５）〜（１０）の菌株がそれぞれ希釈された１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液と、（５）〜（１０）の菌株がそれぞれ希釈された１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液とを調製した。（５）〜（１０）の菌株ごとに調製した２種類の汚染濃度の希釈液を、試料として用いた。また、（１）〜（１０）の菌のいずれも接種していない牛乳を比較試料（ブランク）として用いた。
【００３８】
以下、（１）の大腸菌の試料のうち、１（ＣＦＵ／ｍｌ）の試料を例にして、本実施例の手順を説明する。１０ｍｌのＢＧＬＢ培地が入った試験管に、１ｍｌの試料を接種した（ステップＳ１）。試料が接種されたＢＧＬＢ培地を３５℃に保ちながら、４時間培養した（ステップＳ２）。
【００３９】
ＢＧＬＢ培地の培養後、ＢＧＬＢ培地をメンブレンフィルタにより濾過した（ステップＳ３）。具体的には、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）の濃度が０．１％である生理食塩水を調製した。１０ｍｌの生理食塩水が入った試験管に、培養後のＢＧＬＢ培地（培養液）を３ｍｌ添加した。培養液が添加された生理食塩水を、試験管に入れたまま、４２℃の湯浴中に１０分間保持した。生理食塩水を試験管からシリンジに移し、シリンジ中の生理食塩水を、孔径０．６μｍのメンブレンフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社製、カタログ番号７０６０−２５０６）で濾過した。
【００４０】
次に、メンブレンフィルタ上の残留物を分散させた浮遊液を調製し、浮遊液中の菌体数を計測した（ステップＳ４）。浮遊液の調製手順について説明する。濾過後のメンブレンフィルタを容量５０ｍｌのファルコンチューブに移した。ファルコンチューブに１ｍｌの蛍光染色液を入れ、蛍光染色液を十分に攪拌した。これにより、メンブレンフィルタ上に残留した菌体を、蛍光染色液中に浮遊させた。図２に、蛍光染色液の組成を示す。図２に示す「ＣＨＥＭＳＯＬ Ｂ２６／１」、「ＣＳＶ」、及び「ＣＨＥＭＣＨＲＯＭＥ Ｖ１３」は、ＡＥＳ Ｃｈｅｍｕｎｅｘ社（日本国内代理店：（株）池田理化）の製品である。菌体を蛍光染色液により着色することで、フローサイトメータにより菌体を検出することが可能となる。菌体を浮遊させた蛍光染色液をファルコンチューブに入れた状態で、３０℃にて２０分間で保持した後に、４℃に冷却した。
【００４１】
冷却された蛍光染色液（１ｍｌ）のうち６００μｌを、フローサイトメータ専用の計測用チューブ（容量３ｍｌ）に移した。さらに、ＣＳＲ溶液８０μｌを計測用チューブに加え、計測用チューブ中の蛍光染色液を攪拌した。ＣＳＲ溶液は、菌体を染色することなく浮遊液中に遊離している蛍光物質を還元するために用いられる。これにより、フローサイトメータにより浮遊液中の菌体数を計測するときに、浮遊液中に遊離している蛍光物質を原因としたノイズを抑制することができる。
【００４２】
フローサイトメータとして、ＢａｃｔｉＦｌｏｗ（ＡＥＳ Ｃｈｅｍｕｎｅｘ社製）を用いて、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を測定した。菌体数の測定には、ＢａｃｔｉＦｌｏｗの専用アプリケーションである「ＴＶＣ ｉｎ Ｍｉｌｋ」を用いた。（２）〜（１０）の試料と、ブランクとについても、上記の手順に基づいて、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を計測した。
【００４３】
また、フローサイトメータの測定結果と、従来の培養法との測定結果との対応関係を調べるために、ＳＭＡ培地（標準寒天培地）を用いて、培養液中の生菌数を測定した。具体的には、各試料を３５℃にて４時間で培養した（ステップＳ２）後に、スパイラル法を用いて培養液をＳＭＡ平板上に接種した。（１）〜（９）の菌株の培養液が接種されたＳＭＡ平板を３５℃にて４８時間で培養した。（１０）の菌株の培養液が接種されたＳＭＡ平板を３０℃にて４８時間で培養した。培養後の（１）〜（１０）のそれぞれの菌株が培養されたＳＭＡ平板上のコロニー数を計測した。以下、ＳＭＡ平板を用いた培養法を、「ＳＭＡ培養法」と呼ぶ。
【００４４】
｛大腸菌群の計測結果｝
図３に、（１）〜（４）の試料における、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法で計測したコロニー数との計測結果を示す。図３において、「菌体カウント法」の欄に示す数値は、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を示す。以下、フローサイトメータを用いた本実施例の手順に基づく計測を、「菌体カウント法」と呼ぶ。
【００４５】
図３を参照して、（１）〜（４）の大腸菌群がいずれもフローサイトメータにより検出されていることが分かる。菌体カウント法に基づく菌体数と、ＳＭＡ培養法に基づくコロニー数とが、同程度の値となっている。
【００４６】
図３に示していないが、ブランクから得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数の平均値ＡＶＥは、６．５８（Ｃｅｌｌ／ｍｌ）であり、標準偏差σは、５．９７であった。ブランクとして使用した牛乳のサンプル数は、４である。試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを示す基準値Ｓを、平均値ＡＶＥおよび標準偏差σに基づいて決定した。計算式は、以下の通りである。
Ｓ＝ＡＶＥ＋５σ≒３７
【００４７】
基準値Ｓよりも小さい菌体数が得られた試料を陰性と判定した。この結果、（１）〜（４）の全ての試料において、菌体カウント法により計測した菌体数は、基準値Ｓを上回っている。このため、（１）〜（４）の全ての試料は、大腸菌群が陽性であると判定された。図３に示す結果から、牛乳１ｍｌあたりの大腸菌群の汚染が１〜２（ＣＦＵ／ｍｌ）程度であれば、上記手順に基づいて、牛乳中の大腸菌群が陰性であるか否かを判断できることが明らかとなった。
【００４８】
図３に示すように、（２）、（４）の大腸菌群の試料に接種された菌体数は、（１）、（３）の大腸菌群の試料に接種された菌体数よりも少ない。しかし、菌体カウント法に基づく菌体数は、（１）〜（４）の大腸菌群で同程度である。（２）、（４）の大腸菌群は、生育が速いことが知られている。したがって、菌体カウント法は、培養時間を３．５時間とした場合であっても、生育が速い（２）、（４）の大腸菌群を検出することができると考えられる。
【００４９】
図４は、（１）〜（４）の試料における、菌体カウント法により得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法で計測したコロニー数との相関関係を示すグラフである。図４に示すグラフでは、図３に示す菌体数およびコロニー数の対数値をプロットしている。フローサイトメータに基づく菌体数と、ＳＭＡ培養法に基づくコロニー数とは、相関関係にあることがわかる。菌体のカウント数の対数値と、コロニー数の対数値との相関係数Ｒの値は、０．９５５３であった。つまり、菌体カウント法を用いて、浮遊液中の菌体数を計測することにより、従来の培養法（ＳＭＡ培養法）と同様の結果が得られることが明らかとなった。
【００５０】
｛大腸菌群に属さない菌株の計測結果｝
図５に、（５）〜（１０）の試料における、菌体カウント法により得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法によるコロニー数との計測結果を示す。図５に示すように、（５）〜（８）の試料において、培養後の菌体数が、培養前の菌体数よりも減少している。（９）および（１０）の試料では、培養後の菌体数が、試料に接種された菌体数よりも減少する試料と、培養後の菌体数が試料に接種された菌体数よりも増加する試料が存在する。しかし、（９）および（１０）の試料における菌体の増加率は、（１）〜（４）の試料における菌体の増加率に比べて著しく低い。つまり、大腸菌群に属さない菌株は、ＢＧＬＢ培地を用いて３５℃にて４時間で培養しても、大腸菌群に属する菌株に比べて大量に増殖しないことが明らかとなった。この結果から、大腸菌群に属さない菌株は、培養時間が３．５時間であっても、大量に増殖しないと考えられる。
【００５１】
したがって、大腸菌群に属しないグラム陽性菌およびグラム陰性菌による牛乳の汚染が１０（ＣＦＵ／ｍｌ）以下であれば、これらの菌が、菌体カウント法を用いた大腸菌群の陰性の判定に大きな影響を与えることはないと考えられる。また、菌体カウント法は、培養時間を３．５時間に設定したとしても、大腸菌群に属さない菌株による影響を受けることなく、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定することができると考えられる。
【００５２】
［実施例２］
本実施例では、ＢＧＬＢ法を基準とした、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の精度を検討した。大腸菌群の汚染濃度が、０．１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベル、１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベル、および１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの試料を準備した。つまり、未殺菌の生乳を牛乳で希釈して、試料を調製した。試料の総数は、６５である。各試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを、下記の３種類の検出方法を用いて判定した。
【００５３】
上記実施例１に記載した菌体カウント法を用いて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５４】
牛乳の公定法であるＢＧＬＢ法に基づいて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。具体的には、１０ｍｌのＢＧＬＢ培地に１ｍｌの試料を接種し、接種後のＢＧＬＢ培地を３５℃にて４８時間で培養した。培養後のＢＧＬＢ培地中の気泡の有無、およびＢＧＬＢ培地が黄色に変色しているか否かによって、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５５】
牛乳の自主検査として広く用いられているデソ法を用いて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否か判定した。１０〜１５ｍｌのデソ培地と１ｍｌの試料とを混釈し、デソ培地を３５℃にて２０時間で培養した。培養後のデソ培地における赤色コロニーの有無を観察することにより、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５６】
図６は、ＢＧＬＢ法の判定結果と、菌体カウント法の判定結果とが一致した試料数を示す表である。図６において、「＋」は、陽性を示す。「−」は、陰性を示す。
【００５７】
ＢＧＬＢ法および菌体カウント法の両者が陽性と判定した試料の数は、４４である。ＢＧＬＢ法および菌体カウント法の両者が陰性と判定した試料の数は、１０である。すなわち、ＢＧＬＢ法および菌体カウント法により、判定結果が一致した試料の数は、５４である。試料の総数が６５であり、判定結果が一致した試料の数が５４であることから、ＢＧＬＢ法および菌体カウント法とで、判定結果が一致する確率（一致率Ｐ１）は、８３．１（％）である。
【００５８】
図７は、ＢＧＬＢ法およびデソ法の判定結果が一致した試料数を示す表である。ＢＧＬＢ法およびデソ法の両者が陽性と判定した試料の数は、４５である。ＢＧＬＢ法およびデソ法の両者が陰性と判定した試料の数は、１１である。すなわち、ＢＧＬＢ法およびデソ法により、判定結果が一致した試料の数は、５６である。試料の総数が６５であり、判定結果が一致した試料の数が５６であることから、ＢＧＬＢ法およびデソ法とで、判定結果が一致する確率（一致率Ｐ２）の値は、８６．２（％）である。
【００５９】
一致率Ｐ１，Ｐ２が、同程度の値であることから、上記実施の形態に係る菌体カウント法は、牛乳の検査で広く用いられているデソ法と同程度の精度を有しているといえる。したがって、菌体カウント法を、デソ法と同様に自主検査として用いることができると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌群の検出方法に関し、さらに詳しくは、ＢＧＬＢ（Brilliant
Green Lactose Bile）培地などを用いた大腸菌群の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳および乳製品の成分規格に関する省令（乳等省令）では、牛乳および乳製品の成分規格が定められている。乳等省令では、牛乳および乳製品中の大腸菌群は、陰性であることが定められている。
【０００３】
大腸菌群とは、グラム陰性の芽胞を形成しない桿菌であり、４８時間以内に乳糖を分解して酸およびガスを産出する好気性細菌または通性嫌気性細菌の一群を指す。Klebsiella、Citrobacter、Enterobacter、Escherichiaなどの属が、大腸菌群に属する。
【０００４】
乳等省令では、牛乳の大腸菌群の検出方法として、ＢＧＬＢ法の使用が定められている。ＢＧＬＢ法は、牛乳あるいは乳製品などの検体を接種したＢＧＬＢ培地を４８時間で培養させる必要がある。また、乳等省令では、発酵乳などの乳製品における大腸菌群の検出方法として、デソキシコレート寒天培地（デソ培地）を用いる方法（デソ法）の使用が、定められている。デソ法は、牛乳の自主検査にも用いられる。デソ法は、検体を接種したデソ培地を２０時間培養させる必要がある。
【０００５】
しかし、ＢＧＬＢ法およびデソ法は、検体中の大腸菌群が陰性であることを確認するまでに長い時間を要するため、牛乳および乳製品の出荷鮮度を維持することが困難である。このため、検体中の大腸菌群の検出時間を短縮することが、以前から望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１８６４９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記特許文献１には、培養時間を短縮することができる大腸菌群の検出方法が開示されている。具体的には、試料をグラム陽性細菌の生育を阻害する培地に接種し、培地を３５℃の温度条件下にて１２時間程度で培養する。培養後の培地に形成されたコロニーに、発色合成酵素基質を滴下する。大腸菌群のコロニーが発色合成酵素基質により発色するため、培養後の培地における大腸菌群の有無を肉眼により観察することができる。上記特許文献１に係る検出方法は、デソ法により大腸菌群が陽性であると推定された試料の確認試験などに用いられる。
【０００８】
上記特許文献１に開示された大腸菌群の検出方法を用いることにより、１２時間程度で検体中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定することができる。しかし、検体中の大腸菌群を検出するまでの時間をさらに短くすることにより、牛乳および乳製品の安全性や品質をさらに向上させることが可能となる。
【０００９】
そこで、本発明は、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを迅速に判定することができる大腸菌群の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、請求項１記載の発明は、大腸菌群の検出方法であって、試料を、大腸菌群を培養することができる培地に接種する工程と、前記試料が接種された前記培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する培養工程と、培養された前記培地を、フィルタにより濾過する濾過工程と、前記フィルタに残留した残留物の浮遊液を調製し、前記浮遊液に含まれる菌体数を、フローサイトメータにより計測する計測工程と、計測した前記菌体数に基づいて前記試料中の大腸菌群の有無を判定する判定工程と、を備える。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１に記載の大腸菌群の検出方法において、前記培地は、ＢＧＬＢ（Brilliant Green Lactose Bile）培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、及びラウリル硫酸トリプトースブイヨンのいずれかである。
【００１２】
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の大腸菌群の検出方法において、前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を３４．５℃以上３５．５℃以下にて培養する。
【００１３】
請求項４記載の発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を４時間以上５時間以下で培養する。
【００１４】
請求項５記載の発明は、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、前記濾過工程は、前記培養された前記培地に界面活性剤を添加し、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する。
【００１５】
請求項６記載の発明は、請求項５に記載の大腸菌群の検出方法において、前記濾過工程は、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する前に、前記界面活性剤が添加された前記培地を４０℃以上４７℃以下の温度にて加温する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る大腸菌群の検出方法は、試料をＢＧＬＢ培地などの大腸菌群を検出できる培地に接種し、試料が接種された培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する。培養された培地を濾過し、濾過後の残留物の浮遊液を調製する。フローサイトメータにより、浮遊液中の菌体数を計測する。培地の培養時間が５時間以下であるため、本発明に係る大腸菌群の検出方法は、フローサイトメータによる計測に要する時間を含めて、６時間程度で試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の手順を示す図である。
【図２】浮遊液の調製に用いる蛍光染色液の組成を示す表である。
【図３】試料中の大腸菌群の計測結果を示す表である。
【図４】実施の形態に係る大腸菌群の検出方法を用いた大腸菌群の計測数と、従来の培養法を用いた大腸菌群のコロニー数との対応を示すグラフである。
【図５】試料中の大腸菌群に属さない菌の計測結果を示す表である。
【図６】ＢＧＬＢ法と、実施の形態に係る大腸菌群の検出方法との一致率を示す表である。
【図７】ＢＧＬＢ法とデソ法との一致率を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照し、本発明の実施の形態を詳しく説明する。本実施の形態における大腸菌群の検出方法は、試料を、大腸菌群を培養できる培地に接種した後に、試料が接種された培地を３０℃〜４０℃にて、３．５時間以上５時間以下で培養する。たとえば、大腸菌群を培養できる培地として、ＢＧＬＢ培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、あるいはラウリル硫酸トリプトースブイヨンなどを用いることができる。培養後の培地をフィルタにより濾過し、フィルタ上の残留物を回収する。回収した残留物を分散させた浮遊液を調製し、浮遊液中の菌体数をフローサイトメータにより計測する。これにより、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを６時間以内で判定することが可能となる。
【００１９】
本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の対象となる試料は、牛乳および乳飲料（乳を含む液体状の食品）である。水に溶解する固体状または半固体状の食品（粉末ミルク、ヨーグルトなどの乳製品）に対しても、本実施の形態の大腸菌群の検出方法を適用することができる。
【００２０】
図１は、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の手順を示すフローチャートである。以下、大腸菌群を培養できる培地として、ＢＧＬＢ培地を用いる例を説明する。まず、試料とＢＧＬＢ培地とが所定の比率になるように、ＢＧＬＢ培地に試料を接種する（ステップＳ１）。ＢＧＬＢ培地を用いることにより、大腸菌群に属する菌（以下、単に「大腸菌群」と呼ぶ。）を選択的に培養することができる。
【００２１】
試料が接種されたＢＧＬＢ培地を、３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する（ステップＳ２）。試料が接種されたＢＧＬＢ培地を３．５時間以上で培養することにより、フローサイトメータにより大腸菌群を検出することができる。
【００２２】
ＢＧＬＢ培地の培養時間は、４時間以上５時間以下であることが望ましい。試料が、大腸菌群のうち生育の遅い菌株のみを含んでいる場合であっても、フローサイトメータにより、生育の遅い菌株を検出することができる。また、ＢＧＬＢ培地を４時間以上で培養することにより、ＢＧＬＢ培地中の菌体数が増加するため、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かの判定精度を向上させることができる。
【００２３】
ＢＧＬＢ培地の培養時の温度（３０℃以上４０℃以下）は、大腸菌群の培養に適した温度として以前から知られている温度である。本実施の形態において、ＢＧＬＢ培地の温度は３４．５℃以上３５．５℃以下であることが望ましい。培養温度を３４．５℃以上３５．５℃以下に設定することにより、大腸菌群の活動が活発になるため、培養時間を短縮することができる。
【００２４】
次に、培養されたＢＧＬＢ培地（培養液）を、フィルタにより濾過する（ステップＳ３）。フィルタ上に大腸菌群を残留させるために、フィルタの孔径は、０．６μｍ程度であることが望ましい。
【００２５】
試料が牛乳あるいは乳製品である場合、培養液を濾過する前に、培養液に界面活性剤を添加することが望ましい。界面活性剤を培養液に添加しない場合、牛乳などに含まれる脂肪球がフィルタの孔を塞ぐ目詰まりが発生し、培養液を濾過できないおそれがある。培養液に界面活性剤を添加して脂肪球の界面張力を低下させることにより、脂肪球の柔軟性が向上する。この結果、脂肪球がフィルタの孔を通過しやすくなる。また、脂肪球がフィルタ上に残留することが防止されるため、菌体数の計測精度を向上させることができる。
【００２６】
培養液を濾過するときに、培養液の温度が４０℃以上４７℃以下であることが望ましい。培養液の温度が４０℃未満である場合、界面活性剤を培養液に添加したとしても、脂肪球の柔軟性が低下するおそれがある。培養液の温度が４７℃よりも高い場合、試料中のタンパク質成分が凝固するおそれがある。凝固したタンパク質成分は、フィルタの目詰まりの原因となる。培養液の温度が４７℃よりも高い場合、培養液中の大腸菌群の一部が死滅するおそれがある。このように、培養液を４０℃以上４７℃以下に加温することにより、培養液中の大腸菌群を減少させることなく、かつ、脂肪球の柔軟性を維持したまま、培養液を濾過することができる。また、フィルタ上に大腸菌群以外の成分が残留することを防ぐことができる。
【００２７】
次に、フィルタ上の残留物を分散させた液体（浮遊液）を調製し、浮遊液中の菌体数をフローサイトメータにより計測する（ステップＳ４）。フローサイトメータは、細胞などの微粒子を分散させた液体を高速度で流し、流れる液体中の微粒子を光学的に分析する装置である。
【００２８】
単位体積あたりの浮遊液中の菌体数に基づいて、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する（ステップＳ５）。具体的には、牛乳の公定法であるＢＧＬＢ法などにより、大腸菌群が陰性と判定された試料を比較試料（ブランク）とする。本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法を用いてブランクの菌体数を予め計測しておく。試料の菌体数とブランクの菌体数とを比較することにより、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定する。
【００２９】
ＢＧＬＢ培地の培養時間は、最大で５時間である。ステップＳ３の濾過工程に要する時間は、約２０分である。ステップＳ４の計測工程およびステップＳ５の判定工程に要する時間は、合計で約４０分である。したがって、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法は、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを、６時間以内に判定することができる。
【００３０】
［実施例１］
以下、上記実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の実施例を説明する。
【００３１】
｛実験に用いた菌株｝
本実施例では、大腸菌群として、（１）〜（４）に示す４種の菌株を用いた。カッコ内の記載は、整理番号を示す。
（１）Enterobacter aerogenes（NBRC 13534T）
（２）Klebsiella oxytoca（JCM 1665）
（３）Citrobacter freundii（JCM 1657）
（４）Escherichia coli（NBRC 3972）
【００３２】
大腸菌群に属さないグラム陽性菌として、（５）〜（８）に示す４種の菌株を用いた。また、大腸菌群に属さないグラム陰性菌として、（９）および（１０）に示す２種の菌株を用いた。
（５）Bacillus cereus（JCM 2152）
（６）Staphylococcus aureus subsp. aureus（JCM 2151）
（７）Lactococcus lactis subsp. lactis（NBRC 12007）
（８）Microbacterium lauticum（NBRC14135）
（９）Acinetobacter calcoaceticus（NBRC12552）
（１０）Pseudomonas fluorescens（NBRC 3507）
【００３３】
上記（１）〜（１０）の菌株のうち、整理番号が“JCM”で始まる菌株は、下記の寄託機関に寄託されている。
寄託機関名：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター 微生物材料開発室
連絡先：郵便番号３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１、電話番号０４８−４６７−９５６０
【００３４】
上記（１）〜（１０）の菌株のうち、整理番号が“NBRC”で始まる菌株は、下記の寄託機関に寄託されている。
寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門
連絡先：郵便番号２９２−０８１８、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、電話番号０４３８−２０−５７６３
【００３５】
｛実験手順｝
実験手順について説明する。まず、上記（１）〜（１０）の菌株がそれぞれ接種された試料を調製した。具体的には、上記（１）〜（９）の菌株を、ＴＳＢ（Trypcase Soy Broth）培地を用いて３５℃にて一晩培養した。（１０）の菌株のみ、ＴＳＢ培地を用いて３０℃にて一晩培養した。
【００３６】
（１）〜（４）の大腸菌群を培養したＴＳＢ培地を牛乳で段階的に希釈した。これにより、（１）〜（４）の大腸菌がそれぞれ希釈された１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液と、（１）〜（４）の大腸菌がそれぞれ希釈された１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液とを調製した。（１）〜（４）の大腸菌ごとに調製した２種類の汚染濃度の希釈液を、試料として用いた。ここで、１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルとは、液体に接種された菌数（接種菌数）が、１ｍｌあたり０．９〜９であることを指す。１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルとは、液体に対する接種菌数が、１ｍｌあたり１０〜９９であることを指す。
【００３７】
（５）〜（１０）の菌株をそれぞれ培養したＴＳＢ培地を牛乳で段階的に希釈した。これにより、（５）〜（１０）の菌株がそれぞれ希釈された１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液と、（５）〜（１０）の菌株がそれぞれ希釈された１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの希釈液とを調製した。（５）〜（１０）の菌株ごとに調製した２種類の汚染濃度の希釈液を、試料として用いた。また、（１）〜（１０）の菌のいずれも接種していない牛乳を比較試料（ブランク）として用いた。
【００３８】
以下、（１）の大腸菌の試料のうち、１（ＣＦＵ／ｍｌ）の試料を例にして、本実施例の手順を説明する。１０ｍｌのＢＧＬＢ培地が入った試験管に、１ｍｌの試料を接種した（ステップＳ１）。試料が接種されたＢＧＬＢ培地を３５℃に保ちながら、４時間培養した（ステップＳ２）。
【００３９】
ＢＧＬＢ培地の培養後、ＢＧＬＢ培地をメンブレンフィルタにより濾過した（ステップＳ３）。具体的には、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ８０）の濃度が０．１％である生理食塩水を調製した。１０ｍｌの生理食塩水が入った試験管に、培養後のＢＧＬＢ培地（培養液）を３ｍｌ添加した。培養液が添加された生理食塩水を、試験管に入れたまま、４２℃の湯浴中に１０分間保持した。生理食塩水を試験管からシリンジに移し、シリンジ中の生理食塩水を、孔径０．６μｍのメンブレンフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社製、カタログ番号７０６０−２５０６）で濾過した。
【００４０】
次に、メンブレンフィルタ上の残留物を分散させた浮遊液を調製し、浮遊液中の菌体数を計測した（ステップＳ４）。浮遊液の調製手順について説明する。濾過後のメンブレンフィルタを容量５０ｍｌのファルコンチューブに移した。ファルコンチューブに１ｍｌの蛍光染色液を入れ、蛍光染色液を十分に攪拌した。これにより、メンブレンフィルタ上に残留した菌体を、蛍光染色液中に浮遊させた。図２に、蛍光染色液の組成を示す。図２に示す「ＣＨＥＭＳＯＬ Ｂ２６／１」、「ＣＳＶ」、及び「ＣＨＥＭＣＨＲＯＭＥ Ｖ１３」は、ＡＥＳ Ｃｈｅｍｕｎｅｘ社（日本国内代理店：（株）池田理化）の製品である。菌体を蛍光染色液により着色することで、フローサイトメータにより菌体を検出することが可能となる。菌体を浮遊させた蛍光染色液をファルコンチューブに入れた状態で、３０℃にて２０分間で保持した後に、４℃に冷却した。
【００４１】
冷却された蛍光染色液（１ｍｌ）のうち６００μｌを、フローサイトメータ専用の計測用チューブ（容量３ｍｌ）に移した。さらに、ＣＳＲ溶液８０μｌを計測用チューブに加え、計測用チューブ中の蛍光染色液を攪拌した。ＣＳＲ溶液は、菌体を染色することなく浮遊液中に遊離している蛍光物質を還元するために用いられる。これにより、フローサイトメータにより浮遊液中の菌体数を計測するときに、浮遊液中に遊離している蛍光物質を原因としたノイズを抑制することができる。
【００４２】
フローサイトメータとして、ＢａｃｔｉＦｌｏｗ（ＡＥＳ Ｃｈｅｍｕｎｅｘ社製）を用いて、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を測定した。菌体数の測定には、ＢａｃｔｉＦｌｏｗの専用アプリケーションである「ＴＶＣ ｉｎ Ｍｉｌｋ」を用いた。（２）〜（１０）の試料と、ブランクとについても、上記の手順に基づいて、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を計測した。
【００４３】
また、フローサイトメータの測定結果と、従来の培養法との測定結果との対応関係を調べるために、ＳＭＡ培地（標準寒天培地）を用いて、培養液中の生菌数を測定した。具体的には、各試料を３５℃にて４時間で培養した（ステップＳ２）後に、スパイラル法を用いて培養液をＳＭＡ平板上に接種した。（１）〜（９）の菌株の培養液が接種されたＳＭＡ平板を３５℃にて４８時間で培養した。（１０）の菌株の培養液が接種されたＳＭＡ平板を３０℃にて４８時間で培養した。培養後の（１）〜（１０）のそれぞれの菌株が培養されたＳＭＡ平板上のコロニー数を計測した。以下、ＳＭＡ平板を用いた培養法を、「ＳＭＡ培養法」と呼ぶ。
【００４４】
｛大腸菌群の計測結果｝
図３に、（１）〜（４）の試料における、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法で計測したコロニー数との計測結果を示す。図３において、「菌体カウント法」の欄に示す数値は、浮遊液１ｍｌあたりの菌体数を示す。以下、フローサイトメータを用いた本実施例の手順に基づく計測を、「菌体カウント法」と呼ぶ。
【００４５】
図３を参照して、（１）〜（４）の大腸菌群がいずれもフローサイトメータにより検出されていることが分かる。菌体カウント法に基づく菌体数と、ＳＭＡ培養法に基づくコロニー数とが、同程度の値となっている。
【００４６】
図３に示していないが、ブランクから得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数の平均値ＡＶＥは、６．５８（Ｃｅｌｌ／ｍｌ）であり、標準偏差σは、５．９７であった。ブランクとして使用した牛乳のサンプル数は、４である。試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを示す基準値Ｓを、平均値ＡＶＥおよび標準偏差σに基づいて決定した。計算式は、以下の通りである。
Ｓ＝ＡＶＥ＋５σ≒３７
【００４７】
基準値Ｓよりも小さい菌体数が得られた試料を陰性と判定した。この結果、（１）〜（４）の全ての試料において、菌体カウント法により計測した菌体数は、基準値Ｓを上回っている。このため、（１）〜（４）の全ての試料は、大腸菌群が陽性であると判定された。図３に示す結果から、牛乳１ｍｌあたりの大腸菌群の汚染が１〜２（ＣＦＵ／ｍｌ）程度であれば、上記手順に基づいて、牛乳中の大腸菌群が陰性であるか否かを判断できることが明らかとなった。
【００４８】
図３に示すように、（２）、（４）の大腸菌群の試料に接種された菌体数は、（１）、（３）の大腸菌群の試料に接種された菌体数よりも少ない。しかし、菌体カウント法に基づく菌体数は、（１）〜（４）の大腸菌群で同程度である。（２）、（４）の大腸菌群は、生育が速いことが知られている。したがって、菌体カウント法は、培養時間を３．５時間とした場合であっても、生育が速い（２）、（４）の大腸菌群を検出することができると考えられる。
【００４９】
図４は、（１）〜（４）の試料における、菌体カウント法により得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法で計測したコロニー数との相関関係を示すグラフである。図４に示すグラフでは、図３に示す菌体数およびコロニー数の対数値をプロットしている。フローサイトメータに基づく菌体数と、ＳＭＡ培養法に基づくコロニー数とは、相関関係にあることがわかる。菌体のカウント数の対数値と、コロニー数の対数値との相関係数Ｒの値は、０．９５５３であった。つまり、菌体カウント法を用いて、浮遊液中の菌体数を計測することにより、従来の培養法（ＳＭＡ培養法）と同様の結果が得られることが明らかとなった。
【００５０】
｛大腸菌群に属さない菌株の計測結果｝
図５に、（５）〜（１０）の試料における、菌体カウント法により得られた浮遊液１ｍｌあたりの菌体数と、ＳＭＡ培養法によるコロニー数との計測結果を示す。図５に示すように、（５）〜（８）の試料において、培養後の菌体数が、培養前の菌体数よりも減少している。（９）および（１０）の試料では、培養後の菌体数が、試料に接種された菌体数よりも減少する試料と、培養後の菌体数が試料に接種された菌体数よりも増加する試料が存在する。しかし、（９）および（１０）の試料における菌体の増加率は、（１）〜（４）の試料における菌体の増加率に比べて著しく低い。つまり、大腸菌群に属さない菌株は、ＢＧＬＢ培地を用いて３５℃にて４時間で培養しても、大腸菌群に属する菌株に比べて大量に増殖しないことが明らかとなった。この結果から、大腸菌群に属さない菌株は、培養時間が３．５時間であっても、大量に増殖しないと考えられる。
【００５１】
したがって、大腸菌群に属しないグラム陽性菌およびグラム陰性菌による牛乳の汚染が１０（ＣＦＵ／ｍｌ）以下であれば、これらの菌が、菌体カウント法を用いた大腸菌群の陰性の判定に大きな影響を与えることはないと考えられる。また、菌体カウント法は、培養時間を３．５時間に設定したとしても、大腸菌群に属さない菌株による影響を受けることなく、試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを判定することができると考えられる。
【００５２】
［実施例２］
本実施例では、ＢＧＬＢ法を基準とした、本実施の形態に係る大腸菌群の検出方法の精度を検討した。大腸菌群の汚染濃度が、０．１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベル、１（ＣＦＵ／ｍｌ）レベル、および１０（ＣＦＵ／ｍｌ）レベルの試料を準備した。つまり、未殺菌の生乳を牛乳で希釈して、試料を調製した。試料の総数は、６５である。各試料中の大腸菌群が陰性であるか否かを、下記の３種類の検出方法を用いて判定した。
【００５３】
上記実施例１に記載した菌体カウント法を用いて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５４】
牛乳の公定法であるＢＧＬＢ法に基づいて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。具体的には、１０ｍｌのＢＧＬＢ培地に１ｍｌの試料を接種し、接種後のＢＧＬＢ培地を３５℃にて４８時間で培養した。培養後のＢＧＬＢ培地中の気泡の有無、およびＢＧＬＢ培地が黄色に変色しているか否かによって、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５５】
牛乳の自主検査として広く用いられているデソ法を用いて、各試料の大腸菌群が陰性であるか否か判定した。１０〜１５ｍｌのデソ培地と１ｍｌの試料とを混釈し、デソ培地を３５℃にて２０時間で培養した。培養後のデソ培地における赤色コロニーの有無を観察することにより、各試料の大腸菌群が陰性であるか否かを判定した。
【００５６】
図６は、ＢＧＬＢ法の判定結果と、菌体カウント法の判定結果とが一致した試料数を示す表である。図６において、「＋」は、陽性を示す。「−」は、陰性を示す。
【００５７】
ＢＧＬＢ法および菌体カウント法の両者が陽性と判定した試料の数は、４４である。ＢＧＬＢ法および菌体カウント法の両者が陰性と判定した試料の数は、１０である。すなわち、ＢＧＬＢ法および菌体カウント法により、判定結果が一致した試料の数は、５４である。試料の総数が６５であり、判定結果が一致した試料の数が５４であることから、ＢＧＬＢ法および菌体カウント法とで、判定結果が一致する確率（一致率Ｐ１）は、８３．１（％）である。
【００５８】
図７は、ＢＧＬＢ法およびデソ法の判定結果が一致した試料数を示す表である。ＢＧＬＢ法およびデソ法の両者が陽性と判定した試料の数は、４５である。ＢＧＬＢ法およびデソ法の両者が陰性と判定した試料の数は、１１である。すなわち、ＢＧＬＢ法およびデソ法により、判定結果が一致した試料の数は、５６である。試料の総数が６５であり、判定結果が一致した試料の数が５６であることから、ＢＧＬＢ法およびデソ法とで、判定結果が一致する確率（一致率Ｐ２）の値は、８６．２（％）である。
【００５９】
一致率Ｐ１，Ｐ２が、同程度の値であることから、上記実施の形態に係る菌体カウント法は、牛乳の検査で広く用いられているデソ法と同程度の精度を有しているといえる。したがって、菌体カウント法を、デソ法と同様に自主検査として用いることができると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌群の検出方法であって、
試料を、大腸菌群を培養することができる培地に接種する工程と、
前記試料が接種された前記培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する培養工程と、
培養された前記培地を、フィルタにより濾過する濾過工程と、
前記フィルタに残留した残留物の浮遊液を調製し、前記浮遊液に含まれる菌体数を、フローサイトメータにより計測する計測工程と、
計測した前記菌体数に基づいて前記試料中の大腸菌群の有無を判定する判定工程と、
を備える大腸菌群の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培地は、ＢＧＬＢ（Brilliant Green Lactose Bile）培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、及びラウリル硫酸トリプトースブイヨンのいずれかである大腸菌群の検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を３４．５℃以上３５．５℃以下にて培養する大腸菌群の検出方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を４時間以上５時間以下で培養する大腸菌群の検出方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、
前記濾過工程は、前記培養された前記培地に界面活性剤を添加し、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する大腸菌群の検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記濾過工程は、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する前に、前記界面活性剤が添加された前記培地を４０℃以上４７℃以下の温度にて加温する大腸菌群の検出方法。
【請求項１】
大腸菌群の検出方法であって、
試料を、大腸菌群を培養することができる培地に接種する工程と、
前記試料が接種された前記培地を３０℃以上４０℃以下の温度にて、３．５時間以上５時間以下で培養する培養工程と、
培養された前記培地を、フィルタにより濾過する濾過工程と、
前記フィルタに残留した残留物の浮遊液を調製し、前記浮遊液に含まれる菌体数を、フローサイトメータにより計測する計測工程と、
計測した前記菌体数に基づいて前記試料中の大腸菌群の有無を判定する判定工程と、
を備える大腸菌群の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培地は、ＢＧＬＢ（Brilliant Green Lactose Bile）培地、ＥＣ（Escherichia coli）培地、及びラウリル硫酸トリプトースブイヨンのいずれかである大腸菌群の検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を３４．５℃以上３５．５℃以下にて培養する大腸菌群の検出方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、
前記培養工程は、前記試料が接種された前記培地を４時間以上５時間以下で培養する大腸菌群の検出方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の大腸菌群の検出方法において、
前記濾過工程は、前記培養された前記培地に界面活性剤を添加し、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する大腸菌群の検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の大腸菌群の検出方法において、
前記濾過工程は、前記界面活性剤が添加された前記培地を濾過する前に、前記界面活性剤が添加された前記培地を４０℃以上４７℃以下の温度にて加温する大腸菌群の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２９６８７（Ｐ２０１２−２９６８７Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４７０６１（Ｐ２０１１−１４７０６１）
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【出願人】（０００００６１３８）株式会社明治 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【出願人】（０００００６１３８）株式会社明治 (265)
【Ｆターム（参考）】
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