天然起源のタンパク質およびそれから作られる材料
本発明は、天然起源のタンパク質およびそれから作られる材料、特にそれから得られる糸、線維およびゲルを対象とする。本発明はさらに、これらのタンパク質／糸および材料の、技術、バイオテクノロジーおよび／または医療の分野、特に創縫合システムまたは創傷被覆システム、縫合材料の製造ならびに代用材料、好ましくは人工の軟骨または腱の製造、加えて他の商業的用途における使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然起源のタンパク質およびそれから作られる材料、特にそれから得られる糸、繊維、発泡体およびゲルを対象とする。本発明はさらに、これらのタンパク質／糸および材料の、バイオテクノロジーおよび／または医療の分野における使用、特に創縫合システムまたは創傷被覆システム、縫合材料の製造および代用材料、好ましくは人工軟骨材料または人工腱材料の製造における使用、ならびに他の商業用途における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クモのしおり糸は、非晶質マトリックス中に埋め込まれた結晶領域を含有する、半結晶性ポリマー（２）としての組成に由来する並外れた性質（１）を有する。Ｘ線回折およびＮＭＲは、結晶領域が伸びたポリアラニンの折り返しβシートからなることを示しており、これが糸に強度を与え（３、４）、一方、非晶質マトリックスの主な二次構造はグリシンに富む３Ｉへリックスであり、弾性を与える（５）。分泌された直後のシルクタンパク質は高濃度で（６）液晶ドープ（７、８）として蓄えられ、紡糸管を通過する間にイオン組成、ｐＨの変化（ｐＨ６．９から６．３へ）（９、１０）および水の抜き出しによって変えられ（１０、１１）、最終的に伸長流によって誘起されて固形の糸に転換される（１２）。
【０００３】
これまでに研究されたすべてのしおり糸は、数百ｋＤａまでの分子質量を有する少なくとも２つの異なるタンパク質からなる（１３）。ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の、しおり糸の集合体および構造への個々の寄与はこれまで決定されていない。一次構造の解析は、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４（１４、１５）は同様のプロリン含有量およびポリアラニン・モチーフを有するが、グルタミンおよびセリンの含有量に加えてグリシンに富む領域の長さも異なることを明らかにした。重要なことに、シルク糸の性質を、基礎をなすタンパク質配列から推測することはできない。しかし、シルク糸の品質は関与するタンパク質の一次構造に基づくが、さらにシルク組立ての過程にも依存し（８）、そのことが構造および組立体の諸性質の実験的解析を必要とする。
【０００４】
科学的および商業的関心が、スパイダーシルクの工業的規模での製造の研究を開始させた。天然のスパイダーシルク生成はクモの共食いのために実用的ではなく、人工的な生成は十分なタンパク質の収量および糸集合体の品質のいずれを達成する上でも問題に遭遇してきた。細菌による発現は、おそらく細菌とクモとでは異なるコドン利用に起因して、低いレベルのタンパク質しか産生しなかった（１６）。発現ホストに適合されたコドン利用を有する合成遺伝子は、より高い収量に導いたが（１３、１７）、それから合成されたタンパク質は天然のスパイダーシルクと比べて異なる特徴を示した。しおり糸シルクの部分的ｃＤＮＡの哺乳類細胞株における発現は、まだ品質は劣るものではあるが、人工的に「シルクのような」糸に紡ぐことができたシルクタンパク質（たとえばＡＤＦ−３）を産生した（１８）。
【０００５】
国際公開公報第０３０６００９９号パンフレットは、生体フィラメントタンパク質を繊維に紡糸する方法および装置に関する。この発明は、組換えシルクタンパク質を溶液から繊維化することおよび繊維の強度および製造の実用性を、このような繊維の商業的な製造および使用を実用的なものにするように高めることに特に有用である。この公報では、哺乳類細胞、たとえば遺伝子組換えヤギの乳腺細胞中で、スパイダーシルクタンパク質を発現させることが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、スパイダーシルクの糸、繊維および他の材料を高い収量および優れた品質で製造するための、改良された出発材料すなわちタンパク質を提供することが本発明の１つの目的である。さらなる目的は、バイオテクノロジー、医療および他の商業目的で使用するための、新規なタンパク質／糸およびスパイダーシルクタンパク質に基づくさらなる材料および／またはその他の天然由来の材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの目的は独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項において示される。
スパイダーシルクタンパク質およびそれから得られる糸の製造に関する先行技術の方法の欠点に関して、本物のスパイダーシルクタンパク質を合成するための別のより効率的な経路を使用することができる。
【０００８】
並外れた強度と強靭性とを示すクモのしおり糸は、主に２つの関連タンパク質から構成されるが、それらの糸集合体における役割およびそれらのしおり糸の力学的性質への寄与は、ほとんど解っていない。
【０００９】
この役割を明らかにする目的で、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の組換え体を作成するために、バキュロウイルス発現系が本発明者らによってホスト昆虫細胞中で使用された。ＡＤＦ−４は細胞質中ですぐに自己集合化してフィラメントになるが、ＡＤＦ−３はそうならないことが示された。これらのＡＤＦ−４フィラメントは、本物のクモのしおり糸の典型的な並外れた科学的安定性を示す。その結果、ＡＤＦ−４の性質は、しおり糸における構造上の中心的存在としてのＡＤＦ−４の役割を示す。
【００１０】
これまで、クモのしおり糸の２つの主要なタンパク質成分の間の構造、機能および可能な相互作用についてはわずかしか解っていない。本発明者らは、一次構造の類似性にもかかわらず、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は意外なほど異なる性質を示すことに気付いた。ＡＤＦ−３は本質的に可溶性のタンパク質であるが、ＡＤＦ−４は、使用した実験条件下では事実上不溶性であり、Ｓｆ９細胞の細胞質中で天然のしおり糸と同等の化学的安定性を有するフィラメント状の集合体を形成する。ＡＤＦ−４フィラメントおよび天然のしおり糸の間の類似性は、ＡＤＦ−４が、しおり糸における構造上の「中心的存在」であり、その化学的および物理的な強度をもたらすことを示唆している。糸の形成は速くなければならない（天然の巻き取り速度で１〜１０ｃｍ／ｓ）ので（１９）、シルク形成のためにはＡＤＦ−４などの容易に集合する化合物が不可欠である。しかし、ＡＤＦ−４の会合しやすさは、分泌腺中における早すぎる重合を避けるためには、紡糸ドープ内において他の因子が必要となる可能性が高いことを暗示している。これらの因子は、リン酸化およびグリコシル化などの翻訳後修飾である可能性が高い。加えて、ＡＤＦ−４の溶解性は、共分泌されて同じくドープ中に蓄えられているタンパク質によって影響されることもありうる。ＡＤＦ−３は、昆虫細胞の細胞質内ではＡＤＦ−４の溶解性に影響を与えなかったが、それでもクモの分泌腺からの分泌中または分泌後には、ＡＤＦ−４の溶解性の調節において重要な役割を果たす可能性がある。クモの分泌腺細胞の分泌経路において、および分泌腺の内腔において存在する特定の条件が、しおり糸の集合体を制御するＡＤＦ−３とＡＤＦ−４との間の相互作用に導く可能性がある。
【００１１】
スパイダーシルクを将来のポリマー設計のためのベンチマークとみなすことができるが、それは、スパイダーシルクの素晴らしい性質のためだけではなく、好ましくは、経済的にかつ環境にやさしい方法で、水性の溶媒から周囲温度および圧力下で製造される可能性があるからである。しかし、主要な障害は、天然のシルク繊維生成過程に合致させるわれわれの能力にある。本願において提供される結果は、クモのしおり糸タンパク質、たとえばＡｒａｎｅｕｓのしおり糸の２つの主要成分、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の機能および相互作用を解明するための必須の基礎を構成する。このような知識は、組換えタンパク質から糸を紡糸するために、および新世代の繊維状材料を製造するために不可欠である。
【００１２】
本発明との関連では、主要瓶状腺（ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｇｌａｎｄ）から得られるクモのしおり糸タンパク質を生成する、以下の段階を含む方法を使用することができる。
【００１３】
ａ）１つまたは複数のクモのしおり糸タンパク質をコードしている核酸配列を準備する工程、
ｂ）ａ）において準備された核酸配列を昆虫の細胞中に導入する工程、
ｃ）ドラグラインタンパク質（ｄｒａｇｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させる工程、および
ｄ）前記ドラグラインタンパク質を取り出す工程。
【００１４】
こうして、前述したように、本方法によって提供される主な有利性は、クモのしおり糸タンパク質のための発現系、すなわち昆虫細胞中での発現を準備することにある。意外にも、前記で説明したように、昆虫細胞におけるこれらのタンパク質の発現が、他の細胞たとえば細菌細胞や哺乳類細胞のような他の細胞における発現よりも優れていることが分かった。この改良は性質、すなわち力学的性質および類似のもの、ならびにクモのしおり糸タンパク質の収量に等しく影響する。
【００１５】
例として、参考文献１６の方法によれば４ｍｇ／Ｌ細胞が得られたが、これは糸に紡ぐことができなかった。参考文献１８においては、２５ｍｇ／Ｌ細胞が得られた（糸は得られたが、品質は悪かった）。本方法によれば、＞３０ｍｇ／Ｌ細胞（自己集合性の安定な糸）を得ることができた。
【００１６】
前記方法の段階ａ）において得られた核酸配列によってコードされるドラグラインタンパク質は、好ましくは球形網のクモ（Ａｒａｎｅｉｄａｅ）のドラグラインタンパク質から選択される。
【００１７】
そのようなドラグラインタンパク質は、以下のクモの１つまたは複数から得ることができる。Ａｒａｃｈｎｕｒａ ｈｉｇｇｉｎｓｉ、Ａｒａｎｅｕｓ ｃｉｒｃｕｌｉｓｓｐａｒｓｕｓ、Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ、Ａｒｇｉｏｐｅ ｐｉｃｔａ、Ｂａｎｄｅｄ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、Ｂａｔｉｋ Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌａ ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、Ｂｅｃｃａｒｉ’ｓ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｂｅｃｃａｒｉｉ）、Ｂｉｒｄ−ｄｒｏｐｐｉｎｇ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｅｌａｅｎｉａ ｅｘｃａｖａｔａ）、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−Ｗｉｔｅ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｋｕｈｌｉｉ）、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｕｒａｎｔｉａ）、Ｂｏｌａｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ）、Ｂｏｌａｓ Ｓｐｉｄｅｒｓ−Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ ｍａｇｎｉｆｉｃｕｓ）、Ｂｒｏｗｎ Ｓａｉｌｏｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｎａｕｔｉｃａ）、Ｂｒｏｗｎ−Ｌｅｇｇｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｒｕｆｏｆｅｍｏｒａｔａ）、Ｃａｐｐｅｄ Ｂｌａｃｋ −Ｈｅａｄｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｚｙｇｉｅｌｌａ ｃａｌｙｐｔｒａｔａ）、Ｃｏｍｍｏｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ ｄｅｈａａｎｉ）、Ｃｏｍｍｏｎ Ｏｒｂ Ｗｅａｖｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｏｘａｎｃｅｎｓｉｓ）、Ｃｒａｂ−ｌｉｋｅ Ｓｐｉｎｙ Ｏｒｂ Ｗｅａｖｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ（ｅｌｉｐｓｏｉｄｅｓ））、Ｃｕｒｖｅｄ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ａｒｃｕａｔａ）、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｍｏｌｕｃｃｅｎｓｉｓ、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｐａｒｎａｓｉａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ ｃｏｎｉｆｅｒａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ ｔｕｒｒｉｇｅｒａ、Ｄｏｒｉａ’ｓ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｄｏｒｉａｅ）、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｐｏｔｔｅｄ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｍａｍｍｏｓａ）、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｔａｉｌｅｄ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｅｘａｎｔｈｅｍａｔｉｃａ）、Ａｃｕｌｅｐｅｒｉａ ｃｅｒｏｐｅｇｉａ、Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｓｔｕｌｏｓａ、Ｆｌａｔ Ａｎｅｐｓｉｏｎ（Ａｎｅｐｓｉｏｎ ｄｅｐｒｅｓｓｉｕｍ）、Ｆｏｕｒ−ｓｐｉｎｅｄ Ｊｅｗｅｌ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｑｕａｄｒｉｓｐｉｎｏｓａ）、Ｇａｒｄｅｎ Ｏｒｂ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ ｔｒａｎｓｍａｒｉｎａ）、Ｇｉａｎｔ Ｌｉｃｈｅｎ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ａｒａｎｅｕｓ ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｃｕｌａｔａ）、Ｈａｓｓｅｌｔ’ｓ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｈａｓｓｅｌｔｉｉ）、Ｔｅｇｅｎａｒｉａ ａｔｒｉｃａ、Ｈｅｕｒｏｄｅｓ ｔｕｒｒｉｔａ、Ｉｓｌａｎｄ Ｃｙｃｌｏｓａ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｃｌｏｓａ ｉｎｓｕｌａｎａ）、Ｊｅｗｅｌ ｏｒ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｓｔｒａｃａｎｔｈａ ｍｉｎａｘ）、Ｋｉｄｎｅｙ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒａｎｅｕｓ ｍｉｔｉｆｉｃｕｓ）、Ｌａｇｌａｉｓｅ’ｓ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｅｒｉｏｖｉｘｉａ ｌａｇｌａｉｓｅｉ）、Ｌｏｎｇ−Ｂｅｌｌｉｅｄ Ｃｙｃｌｏｓａ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｃｌｏｓａ ｂｉｆｉｄａ）、Ｍａｌａｂａｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｍａｌａｂａｒｅｎｓｉｓ）、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｕｒｅｄ Ｓｔ Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｔｒｅｅ−Ｔｒｕｎｋ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｈｅｒｅｎｎｉａ ｏｒｎａｔｉｓｓｉｍａ）、Ｏｖａｌ Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｅｍｕｌａ）、Ｒｅｄ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｈｉｒｔａ）、Ｓａｉｎｔ Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、Ｓｃａｒｌｅｔ Ａｃｕｓｉｌａｓ（Ａｃｕｓｉｌａｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、Ｓｉｌｖｅｒ Ａｒｇｉｏｐｅ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｒｇｅｎｔａｔａ）、Ｓｐｉｎｙｂａｃｋｅｄ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｓｐｏｔｔｅｄ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｄｏｍｉｃｉｌｉｏｒｕｍ）、Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｅｔｈｅｒｉａ）、Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ Ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、Ｔｒｅｅ−Ｓｔｕｍｐ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐｏｌｔｙｓ ｉｌｌｅｐｉｄｕｓ）、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ Ｓｐｉｄｅｒ Ａｒｋｙｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｋｙｓ ｌａｎｃｅａｒｉｕｓ）、Ｔｗｏ−ｓｐｉｎｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐｏｅｃｉｌｏｐａｃｈｙｓ ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ）、Ｎｅｐｈｉｌａ種、たとえば、Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓおよびさらに多くのもの（他のクモ種については下記も参照のこと）。Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｍａｔｕｓが最も好ましい。
【００１８】
好ましくは、この方法によって生成されるドラグラインタンパク質は、野生型ドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ Ｉ、および／またはＭａＳｐ ＩＩである。用語ＡＤＦ−３／−４は、Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓによって生成されるＭａＳｐタンパク質（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄａｍａｔｕｓフィブロイン−３／−４）との関連で使用される。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の両方のタンパク質は、ＭａＳｐ ＩＩタンパク質（主要な瓶状スピドロインＩＩ（ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ＩＩ））の部類に入る。
【００１９】
これによって（すなわち、単独または他のタンパク質と共に）生成することができる他のスパイダーシルクタンパク質およびそのデータベース・アクセス番号を以下に挙げる。
スピドロイン２［Ａｒａｎｅｕｓ ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ］ｇｉ｜２９１１２７２
主要な瓶状腺しおり糸タンパク質−１［オニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｖｅｔｒｉｃｏｓｕｓ）］ｇｉ│２７２２８９５７
主要な瓶状腺しおり糸タンパク質−２［オニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）］ｇｉ│２７２２８９５９
瓶状スピドロイン１［マダガスカルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）］ｇｉ│１３５６２００６
主要な瓶状スピドロイン１［Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ│１３５６２０１０
主要な瓶状スピドロイン１［ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）］ｇｉ│１３５６１９９８
主要な瓶状スピドロイン１［Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ］ｇｉ│１３５６１９８４
主要な瓶状スピドロイン１［キマダラコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｕｒａｎｔｉａ）］ｇｉ│１３５６１９７６
しおり糸タンパク質スピドロイン２［ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）］ｇｉ│１６９７４７９１
主要な瓶状スピドロイン２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ│１３５６２０１２
主要な瓶状スピドロイン２［マダガスカルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）］ｇｉ│１３５６２００８
主要な瓶状スピドロイン２［ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）］ｇｉ│１３５６２００２
本発明は、特に以下の態様および実施形態を対象とする。
【００２０】
第１の態様によれば、本発明は、配列番号１または２の核酸配列あるいはこれらの核酸配列の変異体によってコードされるクモのドラグラインタンパク質を対象とし、中程度に厳しい条件下において変異体が配列番号１または２の配列を含む核酸とハイブリッド形成するか、あるいは遺伝子コードの縮退に起因する核酸の変更であって、配列番号１または２として前記アミノ酸と同じ、もしくは機能的に等価なアミノ酸をコードする核酸の変更を変異体が含むならば、変異体は、配列番号１または２の配列と比較して１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失を有するものと定義される。
【００２１】
用語「核酸配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列のことをいう。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本願においてはヌクレオチドのヘテロポリマーのことをいうために相互交換可能に使用される。
【００２２】
本願で使用されるハイブリッド形成の厳密性は、ハイブリッド形成下ではポリヌクレオチドの２本鎖が安定である条件のことをいう。当業者には知られているように、２本鎖の安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度との関数である（たとえば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９年）、参照）。当業者は、ハイブリッド形成させるために使用される厳密性のレベルを容易に変更することができる。
【００２３】
本願において使用する「中程度に厳しい条件」は、ＤＮＡが、このＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性を有する相補的な核酸と結合することを可能にする条件のことをいう。ＤＮＡと約９０％を超える同一性を有する相補的な核酸が特に好ましい。好ましくは、中程度に厳しい条件は、ホルムアミド５０％、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃におけるハイブリッド形成に続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳによる６５℃における洗浄と等価な条件である。
【００２４】
本発明においては、２つの異なる種類、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４のコード配列が検討されていることに注意する。第１に、すでに公表されているＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の配列（本願では、「野生型」配列）および、第２に、配列番号１（ＡＤＦ−３）および２（ＡＤＦ−４）によってコードされるこれらの変異体である。野生型配列はすでに公表されており、アクセッション番号Ｕ４７８５５およびＵ４７８５６（配列番号３および４）によって入手可能である。
【００２５】
前記で説明したように、シルク繊維は、液晶ポリマーに似た無定形の弾性セグメントによって間隔を空けられたβシートの結晶領域を有する。これらの２つのセグメントは、異なる遺伝子によってコードされる２つの異なるタンパク質、ＭａＳｐ Ｉ（主要な瓶状スピドロインＩ）およびＭａＳｐ ＩＩ（主要な瓶状スピドロインＩＩ）によって表される。
【００２６】
本発明の核酸配列は、好ましくはＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（配列番号１および２）またはこれらの変異体である。配列番号３および４は、対応する野生型配列のアミノ酸配列を示す。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、構成要素が前記で定義されたタンパク質の１つまたは複数あるいは該タンパク質の変異体の１つとして定義されるポリマーからなるスパイダーシルクタンパク質を提供する。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の挿入、欠失および置換によって、本願において開示される配列とは異なるすべての配列をも包含する。
【００２８】
好ましくは、アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造および／または化学的性質を有する他の１つのアミノ酸によって置き換えることの結果、すなわち保守的なアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行われてもよい。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ、極性天然アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００２９】
「挿入」または「欠失」は、通常約１〜５個のアミノ酸の範囲、好ましくは約１、２、または３個のアミノ酸である。アミノ酸の追加は、通常１００個以下であり、好ましくは８０個以下であり、より好ましくは５０個以下であり、最も好ましくは２０個以下であり、本発明のタンパク質上に延長／または中に挿入される。本発明においては、本願で開示されるタンパク質の力学的および他の特性にマイナスの影響を与えないアミノ酸の追加だけが検討されることに注意する。
【００３０】
許される変異は、タンパク質へのアミノ酸の挿入、欠失、または置換を、組換えＤＮＡ技法を使用して体系的に行い、得られた組換え変異体の活性を分析することによって実験的に決定されてもよい。これは、当業者に対して、日常的実験を超えるものを要求しない。
【００３１】
好ましい一実施形態によれば、前記で定義された核酸配列の１つまたは複数がベクターに収容される。好ましくは、このベクターは、上記で定義された１つまたは複数のドラグラインタンパク質および１つまたは複数の調節配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。そのような調節配列は、好ましくはプロモーターｐ１０および／またはポリヘドリンを含んでもよいが、他の後期および極めて後期のバキュロウイルス・プロモーターも同様に使用することができる。
【００３２】
ベクターは、より好ましくはウイルスベクター、最も好ましくはバキュロウイルスベクター系またはワクシニアウイルスベクター系である。他のウイルスベクター系が本発明において使用されてもよい。場合によっては、ベクターの改変が必要なこともある。他のウイルスベクターの例は、アデノウイルスおよびすべてのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、たとえば狂犬病、麻疹、ＲＳＶ等である。
【００３３】
昆虫細胞としては、鱗翅目昆虫細胞が好ましくは使用され、より好ましくはツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの細胞およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）からの細胞が使用される。最も好ましくは、昆虫細胞はＳｆ９、Ｓｆ２１またはｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞である。
【００３４】
昆虫細胞の発現系の一つの利点は、たとえばバクテリア系に関しては、生成されたタンパク質がグリコシル化されており、したがって微生物による分解の標的であるという事実にある。この特徴は、たとえば医療分野において、シルクタンパク質のインビボ使用が意図されるときは常に重要である。インビボ使用では生物分解が望ましい。この特徴は、特に縫合材料ならびに創縫合システムおよび創傷被覆システムにおいて用途を見出す可能性がある。
【００３５】
他の好ましい一実施形態によれば、発現されるドラグラインタンパク質は、野生型のＡＤＦ−４または配列番号２によってコードされたＡＤＦ−４だけである。
一つの代替物として、発現されたドラグラインタンパク質は、野生型ＡＤＦ−３または配列番号１の核酸によってドラグラインタンパク質としてコードされたアミノ酸だけである。
【００３６】
本発明者らは、意外にも先行技術の信念とは対照的に、２つの周知の主要なドラグラインタンパク質の１つだけ（好ましくはＡＤＦ−４）が、しおり糸の作成および集合のために必要であることを見出した。したがって、しおり糸の作成のすでに知られている方法は、当業において周知の２つではなく、しおり糸の調製のための１つだけの成分を使用することによって大幅に簡単化することができる。このように、ＡＤＦ−３だけ、好ましくはＡＤＦ−４だけからなるしおり糸が本発明の好ましい一実施形態である。
【００３７】
ＭａＳｐ Ｉ類は、アミノ酸プロリンの含有量によってＭａｓｐ ＩＩと区別することができる。ＭａＳｐ ＩＩ類の中には、他には正式の部分範囲は存在しない。しかし、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は、アミノ酸グルタミンの含有量およびポリアラニン領域の間隔と長さとによって互いに異なっている。したがって、当業者は、ＭａＳｐ ＩＩ中のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に相当する領域をそれぞれ容易に判定することができる。
【００３８】
好ましくは、前記ドラグラインタンパク質の発現は分泌発現によって起こる。詳細については実施例を参照されたい。あるいは、発現は細胞質における生成によって起こる。実施例に示すように、発現のために使用した昆虫細胞中に存在する条件は、前記で述べたように、スパイダーシルクタンパク質が高濃度および高品質で発現され、さらにそれらのタンパク質の糸への自己集合が、すでに細胞質中で、なんらそれ以上の生成段階なしに起こるという驚くべき結果に導いた。
【００３９】
本発明の状況においては、以下の段階を含むクモのドラグラインタンパク質の糸の製造方法を使用することができる。
ａ）前記で定義されたクモのドラグラインタンパク質を発現させる工程、
ｂ）該タンパク質を取り出す工程、および
ｃ）該タンパク質を適当な方法によって糸に紡糸する工程。
【００４０】
段階ｃ）においては、当業に周知の紡糸方法が使用されてもよい。たとえば、スパイダーシルクタンパク質のドープ溶液は、糸疣（出糸突起）を通して押し出されてバイオフィラメントを形成する。得られたバイオフィラメントは、引き出されたり、延伸されたりすることができる。バイオフィラメント中に結晶性および無定形の両方の分子配列が存在するときはいつでも、引き出しまたは延伸は、分子を配向させるのに十分なせん断応力を与えて分子をフィラメントの壁に対してより並行にし、バイオフィラメントの引張り強度および靭性を高める。
【００４１】
ドープ溶液は、１つまたは複数のクモ種からのシルクタンパク質、またはさまざまなシルク生成属からのシルクタンパク質の混合物、たとえばクモおよびカイコガ（Ｂ．ｍｏｒｉ）からのシルクタンパク質の混合物を含有してもよい。最も好ましい実施形態においては、シルクタンパク質は、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓまたはＡ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓからのしおり糸、特にタンパク質ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩ、ＡＤＦ−３、およびＡＤＦ−４である。代替実施形態においては、ドープ溶液は、シルクタンパク質と、１つまたは複数の合成ポリマーあるいは天然または合成バイオフィラメントタンパク質との混合物を含有する。
【００４２】
好ましくは、ドープ溶液は、少なくとも１、５、１０、１５重量／容積（ｗ／ｖ）％シルクタンパク質である。より好ましくは、ドープ溶液は、約２０ｗ／ｖ％、２５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％、３５ｗ／ｖ％、４０ｗ／ｖ％、４５ｗ／ｖ％、または５０ｗ／ｖ％シルクタンパク質である。好ましい実施形態においては、ドープ溶液は、実質的に純粋なスパイダーシルクタンパク質を含有する。好ましい実施形態においては、ドープのｐＨは約６．９である。
【００４３】
「ドープ溶液」は任意の液体混合物を意味しており、この液体混合物はシルクタンパク質を含有しており、かつバイオフィラメントの形成またはフィルムのキャスティングのために押し出され易い。ドープ溶液はまた、タンパク質モノマーに加えて、たとえばダイマー、トリマー、およびテトラマーを含む、より高い秩序の集合体を含有してもよい。通常、ドープ溶液はｐＨ４．０〜１２．０の水性溶液であり、４０ｗ／ｖ％未満の有機物またはカオトロピック剤を有する。好ましくは、ドープ溶液は有機溶媒またはカオトロピック剤を何も含有しないが、溶液の保存性、安定性、または作業性を高めるための添加物を含有してもよい。
【００４４】
「フィラメント」は、顕微鏡的な長さから１マイルあるいはそれ以上の長さにわたる、不定の長さの繊維を意味する。シルクは天然のフィラメントであり、例としてナイロンおよびポリエステルは合成フィラメントである。
【００４５】
「バイオフィラメント」は、組換え技術によって作られたスパイダーシルクタンパク質を含むタンパク質から作られた（たとえば、紡糸された）フィラメントを意味する。
スパイダーシルクタンパク質繊維を紡糸する方法に関するより詳細な情報は、２００３年７月２４日発行の国際公開第０３０６００９９号パンフレット（カラツァスら（Ｋａｒａｔｚａｓ ｅｔ ａｌ．））で見出すことができ、これを参照により本願に援用する。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号１および／または２の核酸もしくは変異体によってコードされるアミノ酸配列を含む、クモのドラグラインタンパク質またはしおり糸を包含する。
好ましい実施形態においては、クモのドラグラインタンパク質／しおり糸は、ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−４または配列番号２の核酸によってコードされるアミノ酸だけを含む。
【００４７】
あるいは、クモのドラグラインタンパク質／しおり糸は、ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−３または配列番号１の核酸によってコードされるアミノ酸だけを含む。
【００４８】
他の態様によれば、本発明は、本願において前記で定義されたタンパク質を含む、またはタンパク質からなるゲルまたはフォームを提供する。そのようなフォームおよびゲルの作り方は、実施例において見出すことができ、後記の「スパイダーシルク由来のタンパク質の集合体」の項を参照されたい。
【００４９】
さらに本発明は、前記で定義された本発明のタンパク質を含む、またはそれからなる、インプラントおよびステントのための被覆を対象とする。この被覆は、それぞれの用途に応じて可溶性タンパク質、フィルム、ゲル、フォーム、ナノ線維、および糸で作ることができる。一般に、セラミック、金属、プラスチック、その他の非生物材料に対するタンパク質被覆は非生物表面を「隠蔽し」、身体の炎症反応または拒絶反応を防ぐ。タンパク質の被覆は、非生物材料を取り囲む細胞の結合を可能にする。さらに、これまでステントグラフト器具において使用されてきたものよりも、本質的にさらに生体適合性であるこれらのグラフト材料を選択することによって、インプラント関連炎症の軽減を達成することができる。ＰＥＴポリエステルおよびナイロンなどの従来のグラフト材料は、その材料に生体血管内でのより速い可溶化の傾向があることを示す高い可溶化因子を有し、したがってより炎症反応を起こし易い。
【００５０】
本発明の材料は、ステントグラフト用途において使用される従来の他のポリマー材料について観察される炎症反応を抑制するという望ましい特徴を示す。
本発明はさらに、前記で規定されたタンパク質、糸または繊維および、クモ起源ではなく好ましくは植物由来の材料または繊維である他の材料または繊維を含む、糸または繊維を提供する。たとえば、スパイダーシルクタンパク質および綿の混合繊維は有利であるかもしれない。
【００５１】
その他の使用される繊維としては、１つまたは複数のナイロン、ａｒａｍｉｄｅ、ケブラー、ウール、炭素繊維、コラーゲン繊維、セルロース、ケラチン繊維、エラスチン繊維、ガムなどが挙げられる。
【００５２】
野生型ＡＤＦ−４を唯一のドラグラインタンパク質としてコードしている核酸を含むベクター、または配列番号１および／または配列番号２の核酸を含むベクターが、本発明において更なる態様として提供される。
【００５３】
更なる態様においては、１つまたは複数のドラグラインタンパク質、好ましくはドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（野生型）、ＡＤＦ−３（配列番号１）および／またはＡＤＦ−４（配列番号２）をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクターが提供される。
【００５４】
すでに前記で説明したように、本願において定義されるタンパク質／糸は、バイオテクノロジー、および／または医療分野において、好ましくは創縫合システムまたは創傷被覆システム、神経外科または眼科手術において使用される縫合材料の製造のために使用されることができる。
【００５５】
意外にも、本発明のタンパク質ならびに繊維、糸およびこれらから作られる他の材料は、抗微生物性、特に抗菌性を示す。これらの固有の生物分解性を念頭に置くと、これらは、ヒトまたは動物におけるインビボ用途に対して最適の特徴を有する。このように、本発明のタンパク質およびそれらから得られる材料を使用することによって、手術中の身体に対する有害な影響を最小限にすることができ、追加の手術を避けることができ、かつ手術後の回復の加速が可能である。
【００５６】
さらに、タンパク質／糸は、好ましくは代用材料、好ましくは人工軟骨材料または人工腱材料の製造に使用されてもよい。
他の使用は、人工代用品、好ましくは人工代用肺の安定化のための使用である。
【００５７】
加えて、本発明の糸／繊維は、医療用接着テープ、植皮、代用靭帯、外科用網などの医療用品の製造において、および衣料用織物、防弾ベストの内張り、容器用織物、バッグまたは財布用ストラップ、ケーブル、ロープ、接着性結束材、非接着性結束材、紐用材料、乗り物カバーおよび部品、建設材料、コンクリート、塗料、ポリシロキサン、耐候性材料、フレキシブル・パーティション材料、スポーツ器具などの広い範囲の工業製品および商業製品において、また、高い引張り強さおよび弾力性が望まれる特徴である繊維または織物の、事実上ほとんどあらゆる用途において使用可能である。他の形態の安定な繊維製品の適合性および用途、たとえばドライスプレー塗料、ビーズ様粒子、または他の組成物との混合物における用途も本発明において意図されている。
【００５８】
別途に定義しない限り、本願において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明に関する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本願において言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照により援用する。紛争の場合は、定義を含む本願が統御する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定的であることを意図するものではない。
【００５９】
ここで、本発明を以下の実施例および添付の図面によって例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
実施例
本願において提供される改良は、ニワオニグモ（ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）のしおり糸の２つの主要な成分を同時に発現させて研究するという着想に基づいていた。昆虫はクモと同じ門に属することから、本発明者らは、昆虫細胞株Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来）を、ベクターとしてバキュロウイルスを使用するａｄｆ−３およびａｄｆ−４の発現のために選択した。ａｄｆ−３およびａｄｆ−４の部分的ｃＤＮＡを含有している組換えバキュロウイルスを生成した（１４）。合成をモニターするために、両方のタンパク質をＨｉｓ６−Ｔａｇと共に準備した。ｔａｇに起因する人為的な影響を排除するために、Ｈｉｓ６−Ｔａｇを伴わない変形も使用した。
【００６１】
組換えウイルスを、細胞質中でスパイダーシルクタンパク質を生成するためのＳｆ９細胞を感染させるために使用した。３日間培養後、感染細胞を超音波処理によって溶解し、不溶の細胞内容物を沈降によって可溶物質から分離した。免疫ブロットによる分析前に、沈降物をグアニジウムチオシアネート（ＧｄｍＳＣＮ）に溶解した。
【００６２】
ＡＤＦ−３の大部分は可溶であることが見出され、ＡＤＦ−４は、使用した条件下で感染の３日後には、ほとんど完全に不溶であり（図１Ａ）、Ｈｉｓ６−Ｔａｇの存在とは無関係であった（図４Ａ）。意外にも、ａｄｆ−４（配列番号２）発現細胞内の集合体を詳しく調べると、細胞質全体に輪になったフィラメントが見られたが、大部分の細胞はただ１つまたは少数の均一な幅のフィラメントを含有していた（図１Ｂ）。これと対比して、対照ウイルスまたはａｄｆ−３（配列番号１）をコードしているウイルスで感染させた細胞は、決してそのようなフィラメントを生成しなかった（図４Ｃ、Ｄ）。抗Ｈｉｓ６抗体を使用して感染させた細胞について行った免疫蛍光法はフィラメントの特有の着色を示し、したがって、フィラメントはＡＤＦ−４からなることを裏付けた（図１Ｂ）。
【００６３】
次に、本発明者らは、ＡＤＦ−３とＡＤＦ−４とが一緒に集合してフィラメントになることができるかどうかを詳細に調べた。本発明者らは、ｐＦａｓｔｂａｃＤＵＡＬドナープラスミドを使用して、異なる独立のプロモーター下でａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の両方を含有している組換えバキュロウイルスを生成した。このウイルスでＳｆ９細胞を感染させた結果、両方のタンパク質が合成され、ＡＤＦ−４単独の合成によって形成されるフィラメントと比較して類似の外観を示すタンパク質フィラメントが形成された（図４Ｂ）。興味深いことに、二重発現系において集合したフィラメントは完全にＡＤＦ−４によって形成されており、組み込まれたり安定に会合したりしているＡＤＦ−３はなかった（図１Ｃ、データは示していない）。
【００６４】
この見かけ上の自己集合が、ＡＤＦ−４の性質だけによるものか、あるいはその他の因子または修飾が関与しているかを調べるために、本発明者らはＨｉｓ６−ＡＤＦ−４の分泌形態をコードする組換えバキュロウイルスを創出した。細胞をこのウイルスで感染させると、細胞の培地中でのＡＤＦ−４の蓄積に至った（図１Ｄ）。免疫蛍光法は、分泌された小胞を含有しているＡＤＦ−４が感染細胞の表面に多量にあること明らかにした（図１Ｅ）。特に印象的なことは、本発明者らは、ホスト細胞室内にも培地中にもＡＤＦ−４フィラメントの形成をまったく観察しなかったことである。
【００６５】
シルク糸の形成は、一般にはタンパク質の濃度に加えてその他の因子にも依存する。興味深いことには、Ｓｆ９細胞の細胞内のｐＨ６．３は、シルク糸の集合前の紡糸ドープ中のｐＨに相当する（１９）。ＡＤＦ−４フィラメント集合形成に必要な、細胞質環境中の他の因子はまだよく分かっていない。ＡＤＦ−４のインビトロ自己集合性の詳しい調査は、その他の因子の重要性を強調した。フィラメントを６Ｍ ＧｄｍＳＣＮ中に溶解させることによって可溶性のＡＤＦ−４を容易に得た。溶解したＡＤＦ−４は、ＧｄｍＳＣＮを透析または希釈によって取り除くと、急速に集合体となった。しかし、インビトロで形成されたＡＤＦ−４集合体は線維状の構造を示さず、またＳｆ９細胞内部で形成されるＡＤＦ−４フィラメントの化学的安定性も示さなかった（下記および図４Ｅ、Ｆ参照）。前記の知見は詳細な細胞質環境の重要性を示唆しており、これには他の、まだ解明されていない、自己集合の制御のために重要な細胞質因子が含まれていると思われる。
【００６６】
本発明者らは次に、ＡＤＦ−４フィラメントの形態を特徴付けた。フィラメントの直径は２００ｎｍ〜１μｍの範囲であるが、それぞれの単一フィラメントについては、直径は一定であることを見出した。さらに、フィラメントは１００μｍまでの長さを示し、しばしば末端が結び目、枝分かれであるかまたは閉じた円を形成していた（図２Ａ、Ｄ、Ｅ）。フィラメントは滑らかな表面を示し、しばしばナノファイバー（直径〜５ｎｍ）および他のタンパク質集合体を伴っていた（図２）。免疫ブロッティング法および免疫電子顕微鏡は、フィラメントおよび会合した集合体形態がＡＤＦ−４で構成されていることを示した（図２Ｃ、３Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続く銀着色によって視覚化されたフィラメント中には、ＡＤＦ−４以外には他の豊富なタンパク質を検出することができなかった（図３Ａ）。細胞当たりのフィラメントの数が少ないこと、およびほとんど全部の細胞内ＡＤＦ−４が集合体中に動員されることは、Ｓｆ９細胞中のＡＤＦ−４の自己集合が核から始まる過程である可能性が高いことを示唆しており、これは以前にカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のシルクの紡糸過程についても提案されている（２０）。
【００６７】
Ｓｆ９細胞中で形成されるフィラメントの寸法は細胞の容積によって制約されるようであり、これらのフィラメントは通常、シルク糸について行われる力学的な力の測定のためには短すぎるものとなる（２１）。しかし、本発明者らは、濡れた、または乾燥したＡＤＦ−４フィラメントの化学的な安定性を、ニワオニグモ（Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の天然しおり糸と比較して解析することができた。しおり糸は、多くの変性剤中に不溶であると報告されてきた（２２）。２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および８Ｍの尿素の適用は、３０秒の暴露後にＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸の構造に対して明らかに影響しない（図３、データは示していない）。フィラメントの、６Ｍの塩化グアニジウム（ＧｄｍＣｌ）中への浸漬は、ＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸のいずれの可溶化にも至らなかったが、しおり糸の膨潤には至った。このような膨潤は、以前に水性溶液中に浸漬されたスパイダーシルクについて記載されている繊維の超収縮（２１）に起因すると考えられ、これは非晶質マトリックス中の水素結合の再形成（組換え）の結果である（２１）。前記で言及した変性剤とは対照的に、６ＭのＧｄｍＳＣＮの１つの小滴が、数秒間以内にＡＤＦ−４フィラメントもしおり糸も同様に完全に溶解させた（図３）。その結果、本発明者らは、両方の構造が特定の変性剤に対する化学的抵抗性の原因となる同じ分子相互作用を持つと結論している。
【００６８】
方法
プラスミド構築
配列番号１および２のｃＤＮＡを、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ドナープラスミド中にクローン化した。ペプチドタグをコードする配列を遺伝子断片の５’末端に設けた。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質については、遺伝子をホストベクターからＳｐｅＩ／ＸｈｏＩを使用して切除し、同程度に消化したｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ＨＴａでライゲートした。Ｔ７−タグ付き（２３）タンパク質については、遺伝子をまずノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのｐＥＴ２１中に、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを使用してクローン化した。次に、Ｔ７−Ｔａｇをコードしている領域を含む挿入部分をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切除し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１でライゲートした。ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）を共発現させるために、両方の遺伝子をｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬ中にクローン化し、Ｔ７−ＴａｇおよびＳ−Ｔａｇをコードしている配列を設けた（２４）。ａｄｆ−４（配列番号２）遺伝子をｐＥＴ２１−ａｄｆ−４（配列番号２）からＢｇ１ＩＩ／ＸｈｏＩで切除し、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで開裂されたｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬでライゲートした。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、Ｓ−Ｔａｇをコードしている配列を設けるようにアニールし、これが結果的にＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ適合性の２本の１本鎖を有する２本鎖ＤＮＡをもたらす。
５’−ＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
５’−ＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＧＧＧ−３’（配列番号６）
Ｔ７−Ｔａｇをコードしている領域を除去するために、ｐＥＴ２１−ａｄｆ−３（配列番号１）をＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化した。次いで、Ｓ−ｔａｇをコードしているＤＮＡでベクターをライゲートした。ＸｈｏＩ／ＸｍａＩを使用して、Ｓ−タグ付きａｄｆ−３（配列番号１）をｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬ−ａｄｆ−４（配列番号：２）中にクローン化した。この二重構造において、ａｄｆ−３およびａｄｆ−４は、独立のｐ１０（２５）プロモーターおよびポリヘドリン（２６）プロモーターの制御下にあった。ミツバチ・メリチンの分泌シグナルをコードしている配列を、テンプレートとしてのｐＭＩＢ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターおよびＣｐｏｌ制限サイトを含有している下記のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
５’−ＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＣ（配列番号７）
５’−ＣＣＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号８）
得られたＰＣＲ生成物をＣｐｏ１で切断し、同様に消化されたｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ＨＴａ−ａｄｆ−４（配列番号２）中にライゲートした。ポジティブクローンの配向および正確性をシークエンシングによって調べた。
【００６９】
細胞培養
Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）：ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１７１１）細胞を、ＢＩＯＩＮＳＥＣＴ−１無血清昆虫細胞培地（バイオロジカル・インダストリー社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中に２７℃で繁殖させた。Ｓｆ９細胞を、６ウエルプレート中のカバースリップ上の単層で、または８０ｒｐｍで撹拌されているシェーカーフラスコ中でのいずれかで培養した。
【００７０】
バキュロウイルス含有組換えａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の生成
組換えバクミドを生成するために、バクミド（バキュロウイルス・シャトルベクター・プラスミド）およびヘルパープラスミドを含有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ＢＡＣのコンピテント細胞を製造者の指示（インビトロジュン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従って使用した。バクミドへの遺伝子の挿入をＰＣＲによって検証した。ＥＳＣＯＲＴ導入試薬（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して、Ｓｆ９細胞に組換えバクミドＤＮＡを６ウエルプレート中で導入した。細胞を２７℃で５時間培養し、リンスしてからさらに７２時間培養した。培地を集めて遠心分離し、ウイルスを含有している上澄みをプラーク測定法によって滴定した。
【００７１】
ａｄｆ−３およびａｄｆ−４の発現
０．１〜１０の範囲のさまざまな感染多重度（ＭＯＩ）でＳｆ９細胞（３×１０６細胞／ｍＬ）を組換えウイルスに感染させた。感染（ＰＩ）３日後、５００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞を集めた。
【００７２】
ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の検出および溶解性
細胞を１．２×１０７細胞／ｍＬでｐＨ７．５の１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。１２５，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって、可溶成分と不溶成分とを分離した。その後の分析のために、ペレットを６ＭのＧｄｍＳＣＮに再懸濁し、８Ｍの尿素に対して透析した。細胞１．５×１０５個からの上澄み液およびペレットを、還元性条件下でトリス−グリシンポリアクリルアミド１０％のゲル上に載せてＰＶＤＦ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））へブロットした。マウス抗Ｈｉｓ６モノクロナール抗体（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１：１０，０００）またはマウス抗Ｔ７モノクロナール抗体（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１：１０，０００）および抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼ共役体（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１：５，０００）を二次抗体として使用して、スパイダーシルクタンパク質を検出した。Ｓタグ付きＡＤＦ−３を直接検出するために、Ｓタンパク質パーオキシダーゼ共役体（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１：５，０００）を使用した。
【００７３】
免疫細胞化学
カバースリップ上で５０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、組換えウイルスをＭＯＩ＝１０で含有しているａｄｆ−３（配列番号１）またはａｄｆ−４（配列番号２）で感染させた。３日間培養後、ＰＩ細胞を−２０℃のメタノールで固定した。カバースリップを、１：３００で希釈したマウス抗Ｈｉｓ６モノクロナール抗体（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、続いて１：５００で希釈したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ共役抗マウス二次ＩｇＧとともに培養した。細胞をＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察し、画像をＭａｇｎａｆｉｒｅ ＳＰカメラで撮影するか、または共焦点顕微鏡によって解析した。
【００７４】
ＡＤＦ−４糸の精製
細胞を、１．２×１０７細胞／ｍＬでｐＨ７．５の１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳに再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウム２ｗ／ｖ％を加え、続いて９５℃で５分間のインキュベーションによって溶解させた。糸を５，０００×ｇで沈降させ、続いて８Ｍの尿素および２回蒸留した水で洗浄した。
【００７５】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
精製されたフィラメントを２回蒸留した水に再懸濁し、分割したてのマイカ上で３分間インキュベートするか（ＡＦＭ）、またはＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）プラスチックのカバースリップ（ナルジェン ヌンク社（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ））上に載せた（ＳＥＭ）。ＡＦＭのために、Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ＳＰＭ（ビーコ社（Ｖｅｅｃｏ））を使用する接触方式の画像化の前に、試料を２回蒸留した水で４回リンスして風乾した。ＳＥＭのために、溶液を除去した後に試料を風乾し、金層で真空被覆してからＪＳＭ−５９００ＬＶ（ジェール社（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．））によって２０ｋＶで解析した。ＴＥＭ（ジェール社（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．））解析のために、フォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）で被覆したグリッド上にフィラメントを吸着させてから酢酸ウラニルで負染色した。免疫染色のために、繊維をマウス抗Ｈｉｓ６抗体でインキュベートし、続いて１８ｎｍの金共役ヤギ抗マウスＩｇＧで標識した。
【００７６】
Ｈｉｓ６−ｔａｇを含まない糸の形成
Ｈｉｓ６−ｔａｇのフィラメント形成に対する起こりえる影響を排除するために、Ｔ７−タグ付きＡＤＦ−４をＳｆ９細胞中で合成した。Ｔ７タグ付きＡＤＦ−４フィラメント形成は、明らかにＨｉｓ６タグ付きＡＤＦ−４のそれと区別できなかった（図４Ａ）。
【００７７】
ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）共発現細胞における糸の形成
ａｄｆ−３およびａｄｆ−４を共発現するＳｆ９細胞においては、ＡＤＦ−４だけを生成する細胞において形成されるフィラメントと比較して明らかに区別のつかない形態を示すフィラメントを検出することができた（図４Ｂ）。
【００７８】
Ｓｆ９細胞におけるａｄｆ−３（配列番号１）の発現
免疫細胞化学は、ａｄｆ−３（配列番号１）発現細胞中に複数の蛍光焦点を示したが、フィラメント様の構造は観察できなかった（図４Ｃ、Ｄ）。重要なことに、Ｓｆ９細胞中で合成されたＡＤＦ−３の大部分が可溶性であった。したがって、焦点の形成は、タンパク質の集合というよりも細胞成分（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）の蓄積を表していた。
【００７９】
ＡＤＦ−４のインビトロ集合
ＡＤＦ−４は、変性剤の透析による除去直後または水性緩衝液中への希釈後に集合した。得られた集合体は線維状の形態を示さなかった（図４Ｅ）。化学的安定性の試験は、細胞質ゾル中に形成されるＡＤＦ−４フィラメントと比較して、インビトロ形成された集合体は２％ＳＤＳまたは８Ｍの尿素中に可溶であることを示した（図４Ｆ）。
【００８０】
スパイダーシルク由来のタンパク質の集合
以下の実験を実施して、スパイダーシルク配列ＡＤＦ−３（配列番号１）またはＡＤＦ−４（配列番号２）由来のタンパク質を形態学的に異なる形態に集合させることができることを実証した。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に基づくタンパク質を、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４年、４３巻、１３６０４〜１１３６２頁（２７）に記載されているように、水溶液中で構成、製造および調製した。別途に言及しない限り、タンパク質溶液は、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）ｐＨ８．０を含有していた。
【００８１】
１．球
直径が０．５〜２μｍの範囲の直径を示すタンパク質球（図５ａ）を、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質の０．２ｗ／ｖ％溶液に０．８Ｍの硫酸アンモニウムを加えることによって生成した。
【００８２】
２．ナノ線維
直径が０．７〜４ｎｍのナノ線維（図５ｂ）を、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質の１ｗ／ｖ％溶液を室温で２週間インキュベートすることによって形成した。
【００８３】
３．微細線維
微細線維を形成するために、ＡＤＦ−３に基づくタンパク質の２５ｗ／ｖ％溶液５〜１０μＬを、ｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸カリウムにゆっくり安定な１滴を形成させながら注入した。１分間インキュベーションした後、タンパク質の滴をピンセットで溶液から取り出した。空気中でさらに１分間インキュベーションした後、第２のピンセットを使用してタンパク質の滴からタンパク質の線維を約２ｃｍ／ｓの速度で引き出すことができた。この線維は、直径４μｍの円形断面を示した（図５ｃ、ｄ）。
【００８４】
４．泡
２．５ｍＭのアンモニウムパーオキソジサルフェート（ＡＰＳ）、１００μＭのトリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕｂｐｙ）およびＡＤＦ−３に基づくタンパク質１０ｗ／ｖ％またはＡＤＦ−４に基づくタンパク質２ｗ／ｖ％を含有している溶液からタンパク質の泡（図５ｅ、ｆ）を生成した。このタンパク質溶液を空気で泡立てた。得られた泡構造を安定させるために、タンパク質をタングステン・ランプからの可視光に１分間露光させた（２８）。次に泡を９５℃で乾燥した。
【００８５】
５．ゲル
濃度１ｗ／ｖ％のＡＤＦ−４に基づくナノ線維（第２項参照）はゲル様の外観を示したが、これは撹拌またはせん断によって容易に崩壊させることができた。ゲルの力学的性質を改善するために、ＡＰＳおよびＲｕｂｐｙを拡散によってゲル中に入れて最終濃度が１０ｍＭのＡＰＳおよび１００μＭのＲｕｂｐｙとなるようにした。光誘起架橋（第４項参照）後、寸法安定性のゲルを得ることができた（図５ｇ）。
【００８６】
６．フィルム
ＡＤＦ−３由来のタンパク質を、１，１，１，３，３，３、−ヘキサフルオル−２−プロパノール中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。２００μＬの溶液をポリスチレンの表面（約２０ｃｍ２）に展開させた。溶媒の蒸発後、透明なタンパク質フィルムを引き剥がすことができた（図６参照）。
【００８７】
参考文献
1. J. M. Gosline, P. A. Guerette, C. S. Ortlepp, K. N. Savage, J.Exp.Biol. 202 Pt 23, 3295-3303 (1999).
2. J. Warwicker, J.Mol.Biol. 2, 350-362 (1960).
3. A. H. Simmons, E. Ray, L. W. Jelinski, Macromolecules 27, 5235-5237 (1994).
4. A. D. Parkhe, S. K. Seeley, K. Gardner, L. Thompson, R. V. Lewis, J. MoI. Recognit. 10, 1-6 (1997).
5. J. D. van Beek, S. Hess, F. Vollrath, B. H. Meier, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 99, 10266-10271 (2002).
6. D. H. Hijirida et al, Biophys. J. 71 , 3442-3447 (1996).
7. K. Kerkam, C. Viney, D. Kaplan, S. Lombardi, Nature 349, 596-598 (1991).
8. D. P. Knight and F. Vollrath, Proc.R.Soc.Lond. 519-523 (1999).
9. D. P. Knight and F. Vollrath, Naturwissenschaften 88, 179-182 (2001).
10. F. Vollrath, D. Knight, X. W. Hu, Proc.R.Soc.Lond B Biol. ScL 265, 817-820 (1998).
11. E. K. Tillinghast, S. F. Chase, M. A. Townley, J.Insect Physiol. 30, 591-596 (1984).
12. D. P. Knight, M. M. Knight, F. Vollrath, InU. Biol. Macromol. 27, 205-210 (2000).
13. S. Winkler and D. L. Kaplan, J. Biot[beta]chnol. 74, 85-93 (2000).
14. P. A. Guerette, D. G. Ginzinger, B. H. Weber, J. M. Gosline, Science 272, 112-1 15 (1996).
15. J. Gatesy, C. Hayashi, D. Motriuk, J. Woods, R. Lewis, Science 291 , 2603-2605 (2001). 16. S. Arcidiacono, C. Mello, D. Kaplan, S. Cheley, H. Bayley, Appl. Microbiol.Biotechnol. 49, 31 -38 ( 1998).
17. J. Scheller, K. H. Guhrs, F. Grosse, U. Conrad, Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
18. A. Lazaris et al., Science 295, 472-476 (2002).
19. V. Vachon, M. J. Paradis, M. Marsolais, J. L. Schwartz, R. Laprade, Biochemistry 34, 15157-15164 (1995).
20. G. Li et al., Eiir.J.Biochem. 268, 6600-6606 (2001).
21. Z. Shao, R. J. Young, F. Vollrath, InU MolMacromol 24, 295-300 (1999).
22. S. Lombardi and D. Kaplan, J.Arachnol. 18, 297-306 (1990).
23. Kroll, D. J. et al. DNA Cell Biol. 12, 441-453 (1993).
24. Kim, J. S. & Raines, R. T. Protein ScL 2, 348-356 (1993).
25. Knebel, D., Lubbert, H. & Doerfler, W. EMBO J. 4, 1301-1306 (1985).
26. Smith, G. E., Summers, M. D. & Fraser, M. J. MoI. Cell Biol 3, 2156-2165 (1983).
27. Huemmerich, D., Helsen, C.W., Oschmann, J., Rudolph, R. & Scheibel, T. Biochemistry 43, 13604-13612 (2004)
28. Fancy, D.A. & Kodadek, T. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 96, 6020-6024 (1999)
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】Ｓｆ９細胞におけるａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の発現。（Ａ）合成後のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の溶解性。細胞溶解物の可溶性（Ｓ）成分および不溶性（Ｐ）成分は沈降により分離した。抗Ｈｉｓ６抗体を用いる免疫ブロット法でタンパク質を検出した。（Ｂ）ａｄｆ−４発現細胞中のフィラメントの光学顕微鏡観察（上段パネル）および免疫細胞化学後の蛍光顕微鏡観察（中段パネル）。さらに、別の細胞の免疫細胞化学後の共焦点蛍光画像を下段のパネルに示している。スケールバー：１０μｍ。（Ｃ）共合成ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の溶解性。可溶性（Ｓ）細胞成分は、不溶性（Ｐ）細胞成分から沈降により分離した。ウエスタンブロット後にＳタンパク質−パーオキシダーゼ共役体を用いてＡＤＦ−３を検出し、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＡＤＦ−４を検出した。（Ｄ）懸濁液中のＳｆ９細胞をｍｅｌ−Ｈｉｓ６−ａｄｆ−４ウイルスに感染させた。表示された時間（感染後の日数）に、細胞数が６×１０４相当のアリコートを培地から取り出して細胞を取り除き、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に掛け、続いて免疫ブロットした。（Ｅ）ｍｅｌ−ｈｉｓ６−ａｄｆ−４ウイルスに３日間感染させた細胞を免疫蛍光測定に掛けた。細胞表面の分泌小胞を明瞭に検出することができた。スケールバー：１０μｍ。
【図２】ＡＤＦ−４フィラメントおよび集合体の形態。（Ａ）精製フィラメントの走査型電子顕微鏡観察。スケールバー：５μｍ。（Ｂ）精製フィラメントの透過型電子顕微鏡観察。スケールバー：５００ｎｍ。（Ｃ）精製フィラメントのマウス抗Ｈｉｓ６抗体に続いて抗マウス抗体結合金を使用した免疫電子顕微鏡観察。スケールバー：５００ｎｍ。（Ｄ、Ｅ）原子間力顕微鏡観察（ＡＭＦ）：（Ｄ）高さ画像（ｈｅｉｇｈｔ ｉｍａｇｅ）（Ｅ）偏差画像。フィラメントの高さは０．７μｍ。スケールバー：５μｍ。
【図３】ＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸の化学的安定性。（Ａ）ＡＤＦ−４フィラメントは、示されているように変性された。未溶解のフィラメントおよび集合体はゲルに入らなかった。溶解したＡＤＦ−４を、抗Ｈｉｓ６抗体を使用する免疫ブロットによって検出された。６Ｍ ＧｄｍＳＣＮで処理した試料をまた銀着色した（ＧｄｍＳＣＮ／Ｓ）。（Ｂ）マイカ上の風乾ＡＤＦ−４フィラメントおよびポリプロピレン上のしおり糸を、示されている各溶液約０．１μＬを用いて３０秒間インキュベートした。水でリンス後、試料を光学顕微鏡によって観察した。スケールバー：２５μｍ。
【図４】（Ａ）Ｓｆ９細胞内で形成されるＨｉｓ６−ｔａｇを含まないＡＤＦ−４フィラメントを光学顕微鏡によって視覚化した。（Ｂ）ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の二重発現後に得られたフィラメントの形態を走査型電子顕微鏡によって詳細に調べた。（Ｃ）ａｄｆ−３（配列番号１）を発現するＳｆ９細胞を光学顕微鏡によって画像化した。（Ｄ）ＡＤＦ−３の細胞内位置決定。ａｄｆ−３（配列番号１）ウイルスで３日間感染させた細胞を免疫蛍光分析に掛けた。（Ｅ）走査型電子顕微鏡によって視覚化された、インビトロ再生後に形成されたＡＤＦ−４集合体。（Ｆ）インビトロで形成されたＡＤＦ−４集合体の化学的安定性。示されている変性剤による処理後、可溶化されたＡＤＦ−３を免疫ブロットによって検出した。スケールバー：５μｍ（Ｂ、Ｅ）および１０μｍ（Ａ、Ｃ、Ｄ）。
【図５】スパイダーシルクタンパク質の集合形態。（Ａ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって視覚化された、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質によって形成された球。（Ｂ）原子間力顕微鏡によって視覚化された、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質によって形成されたナノ線維（高さ情報（ｈｅｉｇｈｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））。（Ｃ、Ｄ）ＳＥＭによって観察された、ＡＤＭ−３に基づくタンパク質によって形成された微細線維（Ｃ）。線維の切断およびその後の断面の視覚化のためにはＧａ＋イオンビームを使用した（Ｄ）。（Ｅ）ＡＤＦ−３に基づくタンパク質溶液から発生した泡。（Ｆ）ＡＤＦ−４に基づく溶液から発生した泡。（Ｇ）ＡＤＦ−４ナノ線維によって形成された架橋ゲル。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は、それぞれ配列番号１および２に相当する。
【図６】本発明のスパイダーシルクタンパク質から作成されたフィルム。ＡＤＦ−３由来のタンパク質を、１，１，１，３，３，３、−ヘキサフルオル−２−プロパノール中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。この溶液２００μＬをポリスチレンの表面（約２０ｃｍ２）上に展開した。溶媒の蒸発後、透明のタンパク質フィルムを引き剥がすことができた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然起源のタンパク質およびそれから作られる材料、特にそれから得られる糸、繊維、発泡体およびゲルを対象とする。本発明はさらに、これらのタンパク質／糸および材料の、バイオテクノロジーおよび／または医療の分野における使用、特に創縫合システムまたは創傷被覆システム、縫合材料の製造および代用材料、好ましくは人工軟骨材料または人工腱材料の製造における使用、ならびに他の商業用途における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クモのしおり糸は、非晶質マトリックス中に埋め込まれた結晶領域を含有する、半結晶性ポリマー（２）としての組成に由来する並外れた性質（１）を有する。Ｘ線回折およびＮＭＲは、結晶領域が伸びたポリアラニンの折り返しβシートからなることを示しており、これが糸に強度を与え（３、４）、一方、非晶質マトリックスの主な二次構造はグリシンに富む３Ｉへリックスであり、弾性を与える（５）。分泌された直後のシルクタンパク質は高濃度で（６）液晶ドープ（７、８）として蓄えられ、紡糸管を通過する間にイオン組成、ｐＨの変化（ｐＨ６．９から６．３へ）（９、１０）および水の抜き出しによって変えられ（１０、１１）、最終的に伸長流によって誘起されて固形の糸に転換される（１２）。
【０００３】
これまでに研究されたすべてのしおり糸は、数百ｋＤａまでの分子質量を有する少なくとも２つの異なるタンパク質からなる（１３）。ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の、しおり糸の集合体および構造への個々の寄与はこれまで決定されていない。一次構造の解析は、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４（１４、１５）は同様のプロリン含有量およびポリアラニン・モチーフを有するが、グルタミンおよびセリンの含有量に加えてグリシンに富む領域の長さも異なることを明らかにした。重要なことに、シルク糸の性質を、基礎をなすタンパク質配列から推測することはできない。しかし、シルク糸の品質は関与するタンパク質の一次構造に基づくが、さらにシルク組立ての過程にも依存し（８）、そのことが構造および組立体の諸性質の実験的解析を必要とする。
【０００４】
科学的および商業的関心が、スパイダーシルクの工業的規模での製造の研究を開始させた。天然のスパイダーシルク生成はクモの共食いのために実用的ではなく、人工的な生成は十分なタンパク質の収量および糸集合体の品質のいずれを達成する上でも問題に遭遇してきた。細菌による発現は、おそらく細菌とクモとでは異なるコドン利用に起因して、低いレベルのタンパク質しか産生しなかった（１６）。発現ホストに適合されたコドン利用を有する合成遺伝子は、より高い収量に導いたが（１３、１７）、それから合成されたタンパク質は天然のスパイダーシルクと比べて異なる特徴を示した。しおり糸シルクの部分的ｃＤＮＡの哺乳類細胞株における発現は、まだ品質は劣るものではあるが、人工的に「シルクのような」糸に紡ぐことができたシルクタンパク質（たとえばＡＤＦ−３）を産生した（１８）。
【０００５】
国際公開公報第０３０６００９９号パンフレットは、生体フィラメントタンパク質を繊維に紡糸する方法および装置に関する。この発明は、組換えシルクタンパク質を溶液から繊維化することおよび繊維の強度および製造の実用性を、このような繊維の商業的な製造および使用を実用的なものにするように高めることに特に有用である。この公報では、哺乳類細胞、たとえば遺伝子組換えヤギの乳腺細胞中で、スパイダーシルクタンパク質を発現させることが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、スパイダーシルクの糸、繊維および他の材料を高い収量および優れた品質で製造するための、改良された出発材料すなわちタンパク質を提供することが本発明の１つの目的である。さらなる目的は、バイオテクノロジー、医療および他の商業目的で使用するための、新規なタンパク質／糸およびスパイダーシルクタンパク質に基づくさらなる材料および／またはその他の天然由来の材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの目的は独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項において示される。
スパイダーシルクタンパク質およびそれから得られる糸の製造に関する先行技術の方法の欠点に関して、本物のスパイダーシルクタンパク質を合成するための別のより効率的な経路を使用することができる。
【０００８】
並外れた強度と強靭性とを示すクモのしおり糸は、主に２つの関連タンパク質から構成されるが、それらの糸集合体における役割およびそれらのしおり糸の力学的性質への寄与は、ほとんど解っていない。
【０００９】
この役割を明らかにする目的で、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の組換え体を作成するために、バキュロウイルス発現系が本発明者らによってホスト昆虫細胞中で使用された。ＡＤＦ−４は細胞質中ですぐに自己集合化してフィラメントになるが、ＡＤＦ−３はそうならないことが示された。これらのＡＤＦ−４フィラメントは、本物のクモのしおり糸の典型的な並外れた科学的安定性を示す。その結果、ＡＤＦ−４の性質は、しおり糸における構造上の中心的存在としてのＡＤＦ−４の役割を示す。
【００１０】
これまで、クモのしおり糸の２つの主要なタンパク質成分の間の構造、機能および可能な相互作用についてはわずかしか解っていない。本発明者らは、一次構造の類似性にもかかわらず、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は意外なほど異なる性質を示すことに気付いた。ＡＤＦ−３は本質的に可溶性のタンパク質であるが、ＡＤＦ−４は、使用した実験条件下では事実上不溶性であり、Ｓｆ９細胞の細胞質中で天然のしおり糸と同等の化学的安定性を有するフィラメント状の集合体を形成する。ＡＤＦ−４フィラメントおよび天然のしおり糸の間の類似性は、ＡＤＦ−４が、しおり糸における構造上の「中心的存在」であり、その化学的および物理的な強度をもたらすことを示唆している。糸の形成は速くなければならない（天然の巻き取り速度で１〜１０ｃｍ／ｓ）ので（１９）、シルク形成のためにはＡＤＦ−４などの容易に集合する化合物が不可欠である。しかし、ＡＤＦ−４の会合しやすさは、分泌腺中における早すぎる重合を避けるためには、紡糸ドープ内において他の因子が必要となる可能性が高いことを暗示している。これらの因子は、リン酸化およびグリコシル化などの翻訳後修飾である可能性が高い。加えて、ＡＤＦ−４の溶解性は、共分泌されて同じくドープ中に蓄えられているタンパク質によって影響されることもありうる。ＡＤＦ−３は、昆虫細胞の細胞質内ではＡＤＦ−４の溶解性に影響を与えなかったが、それでもクモの分泌腺からの分泌中または分泌後には、ＡＤＦ−４の溶解性の調節において重要な役割を果たす可能性がある。クモの分泌腺細胞の分泌経路において、および分泌腺の内腔において存在する特定の条件が、しおり糸の集合体を制御するＡＤＦ−３とＡＤＦ−４との間の相互作用に導く可能性がある。
【００１１】
スパイダーシルクを将来のポリマー設計のためのベンチマークとみなすことができるが、それは、スパイダーシルクの素晴らしい性質のためだけではなく、好ましくは、経済的にかつ環境にやさしい方法で、水性の溶媒から周囲温度および圧力下で製造される可能性があるからである。しかし、主要な障害は、天然のシルク繊維生成過程に合致させるわれわれの能力にある。本願において提供される結果は、クモのしおり糸タンパク質、たとえばＡｒａｎｅｕｓのしおり糸の２つの主要成分、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の機能および相互作用を解明するための必須の基礎を構成する。このような知識は、組換えタンパク質から糸を紡糸するために、および新世代の繊維状材料を製造するために不可欠である。
【００１２】
本発明との関連では、主要瓶状腺（ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｇｌａｎｄ）から得られるクモのしおり糸タンパク質を生成する、以下の段階を含む方法を使用することができる。
【００１３】
ａ）１つまたは複数のクモのしおり糸タンパク質をコードしている核酸配列を準備する工程、
ｂ）ａ）において準備された核酸配列を昆虫の細胞中に導入する工程、
ｃ）ドラグラインタンパク質（ｄｒａｇｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させる工程、および
ｄ）前記ドラグラインタンパク質を取り出す工程。
【００１４】
こうして、前述したように、本方法によって提供される主な有利性は、クモのしおり糸タンパク質のための発現系、すなわち昆虫細胞中での発現を準備することにある。意外にも、前記で説明したように、昆虫細胞におけるこれらのタンパク質の発現が、他の細胞たとえば細菌細胞や哺乳類細胞のような他の細胞における発現よりも優れていることが分かった。この改良は性質、すなわち力学的性質および類似のもの、ならびにクモのしおり糸タンパク質の収量に等しく影響する。
【００１５】
例として、参考文献１６の方法によれば４ｍｇ／Ｌ細胞が得られたが、これは糸に紡ぐことができなかった。参考文献１８においては、２５ｍｇ／Ｌ細胞が得られた（糸は得られたが、品質は悪かった）。本方法によれば、＞３０ｍｇ／Ｌ細胞（自己集合性の安定な糸）を得ることができた。
【００１６】
前記方法の段階ａ）において得られた核酸配列によってコードされるドラグラインタンパク質は、好ましくは球形網のクモ（Ａｒａｎｅｉｄａｅ）のドラグラインタンパク質から選択される。
【００１７】
そのようなドラグラインタンパク質は、以下のクモの１つまたは複数から得ることができる。Ａｒａｃｈｎｕｒａ ｈｉｇｇｉｎｓｉ、Ａｒａｎｅｕｓ ｃｉｒｃｕｌｉｓｓｐａｒｓｕｓ、Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ、Ａｒｇｉｏｐｅ ｐｉｃｔａ、Ｂａｎｄｅｄ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、Ｂａｔｉｋ Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌａ ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、Ｂｅｃｃａｒｉ’ｓ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｂｅｃｃａｒｉｉ）、Ｂｉｒｄ−ｄｒｏｐｐｉｎｇ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｅｌａｅｎｉａ ｅｘｃａｖａｔａ）、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−Ｗｉｔｅ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｋｕｈｌｉｉ）、Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｕｒａｎｔｉａ）、Ｂｏｌａｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ ｆｕｒｃａｔｕｓ）、Ｂｏｌａｓ Ｓｐｉｄｅｒｓ−Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ ｍａｇｎｉｆｉｃｕｓ）、Ｂｒｏｗｎ Ｓａｉｌｏｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｎａｕｔｉｃａ）、Ｂｒｏｗｎ−Ｌｅｇｇｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｒｕｆｏｆｅｍｏｒａｔａ）、Ｃａｐｐｅｄ Ｂｌａｃｋ −Ｈｅａｄｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｚｙｇｉｅｌｌａ ｃａｌｙｐｔｒａｔａ）、Ｃｏｍｍｏｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ ｄｅｈａａｎｉ）、Ｃｏｍｍｏｎ Ｏｒｂ Ｗｅａｖｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｏｘａｎｃｅｎｓｉｓ）、Ｃｒａｂ−ｌｉｋｅ Ｓｐｉｎｙ Ｏｒｂ Ｗｅａｖｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ（ｅｌｉｐｓｏｉｄｅｓ））、Ｃｕｒｖｅｄ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ａｒｃｕａｔａ）、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｍｏｌｕｃｃｅｎｓｉｓ、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｐａｒｎａｓｉａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ ｃｏｎｉｆｅｒａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ ｔｕｒｒｉｇｅｒａ、Ｄｏｒｉａ’ｓ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｄｏｒｉａｅ）、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｐｏｔｔｅｄ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｍａｍｍｏｓａ）、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｔａｉｌｅｄ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｅｘａｎｔｈｅｍａｔｉｃａ）、Ａｃｕｌｅｐｅｒｉａ ｃｅｒｏｐｅｇｉａ、Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ ｐｕｓｔｕｌｏｓａ、Ｆｌａｔ Ａｎｅｐｓｉｏｎ（Ａｎｅｐｓｉｏｎ ｄｅｐｒｅｓｓｉｕｍ）、Ｆｏｕｒ−ｓｐｉｎｅｄ Ｊｅｗｅｌ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｑｕａｄｒｉｓｐｉｎｏｓａ）、Ｇａｒｄｅｎ Ｏｒｂ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ ｔｒａｎｓｍａｒｉｎａ）、Ｇｉａｎｔ Ｌｉｃｈｅｎ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ａｒａｎｅｕｓ ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｂ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｃｕｌａｔａ）、Ｈａｓｓｅｌｔ’ｓ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｈａｓｓｅｌｔｉｉ）、Ｔｅｇｅｎａｒｉａ ａｔｒｉｃａ、Ｈｅｕｒｏｄｅｓ ｔｕｒｒｉｔａ、Ｉｓｌａｎｄ Ｃｙｃｌｏｓａ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｃｌｏｓａ ｉｎｓｕｌａｎａ）、Ｊｅｗｅｌ ｏｒ Ｓｐｉｎｙ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｓｔｒａｃａｎｔｈａ ｍｉｎａｘ）、Ｋｉｄｎｅｙ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒａｎｅｕｓ ｍｉｔｉｆｉｃｕｓ）、Ｌａｇｌａｉｓｅ’ｓ Ｇａｒｄｅｎ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｅｒｉｏｖｉｘｉａ ｌａｇｌａｉｓｅｉ）、Ｌｏｎｇ−Ｂｅｌｌｉｅｄ Ｃｙｃｌｏｓａ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｃｌｏｓａ ｂｉｆｉｄａ）、Ｍａｌａｂａｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｍａｌａｂａｒｅｎｓｉｓ）、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｕｒｅｄ Ｓｔ Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｔｒｅｅ−Ｔｒｕｎｋ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｈｅｒｅｎｎｉａ ｏｒｎａｔｉｓｓｉｍａ）、Ｏｖａｌ Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｅｍｕｌａ）、Ｒｅｄ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｔｅｎｔ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ ｈｉｒｔａ）、Ｓａｉｎｔ Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、Ｓｃａｒｌｅｔ Ａｃｕｓｉｌａｓ（Ａｃｕｓｉｌａｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、Ｓｉｌｖｅｒ Ａｒｇｉｏｐｅ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｒｇｅｎｔａｔａ）、Ｓｐｉｎｙｂａｃｋｅｄ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｓｐｏｔｔｅｄ Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ（Ｎｅｏｓｃｏｎａ ｄｏｍｉｃｉｌｉｏｒｕｍ）、Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｅｔｈｅｒｉａ）、Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗ’ｓ Ｃｒｏｓｓ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｇｉｏｐｅ Ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、Ｔｒｅｅ−Ｓｔｕｍｐ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐｏｌｔｙｓ ｉｌｌｅｐｉｄｕｓ）、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ Ｓｐｉｄｅｒ Ａｒｋｙｓ ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ Ｓｐｉｄｅｒ（Ａｒｋｙｓ ｌａｎｃｅａｒｉｕｓ）、Ｔｗｏ−ｓｐｉｎｅｄ Ｓｐｉｄｅｒ（Ｐｏｅｃｉｌｏｐａｃｈｙｓ ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ）、Ｎｅｐｈｉｌａ種、たとえば、Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓおよびさらに多くのもの（他のクモ種については下記も参照のこと）。Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｍａｔｕｓが最も好ましい。
【００１８】
好ましくは、この方法によって生成されるドラグラインタンパク質は、野生型ドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐ Ｉ、および／またはＭａＳｐ ＩＩである。用語ＡＤＦ−３／−４は、Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓによって生成されるＭａＳｐタンパク質（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄａｍａｔｕｓフィブロイン−３／−４）との関連で使用される。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の両方のタンパク質は、ＭａＳｐ ＩＩタンパク質（主要な瓶状スピドロインＩＩ（ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ＩＩ））の部類に入る。
【００１９】
これによって（すなわち、単独または他のタンパク質と共に）生成することができる他のスパイダーシルクタンパク質およびそのデータベース・アクセス番号を以下に挙げる。
スピドロイン２［Ａｒａｎｅｕｓ ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ］ｇｉ｜２９１１２７２
主要な瓶状腺しおり糸タンパク質−１［オニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｖｅｔｒｉｃｏｓｕｓ）］ｇｉ│２７２２８９５７
主要な瓶状腺しおり糸タンパク質−２［オニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）］ｇｉ│２７２２８９５９
瓶状スピドロイン１［マダガスカルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）］ｇｉ│１３５６２００６
主要な瓶状スピドロイン１［Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ│１３５６２０１０
主要な瓶状スピドロイン１［ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）］ｇｉ│１３５６１９９８
主要な瓶状スピドロイン１［Ａｒｇｉｏｐｅ ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ］ｇｉ│１３５６１９８４
主要な瓶状スピドロイン１［キマダラコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｕｒａｎｔｉａ）］ｇｉ│１３５６１９７６
しおり糸タンパク質スピドロイン２［ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ）］ｇｉ│１６９７４７９１
主要な瓶状スピドロイン２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ│１３５６２０１２
主要な瓶状スピドロイン２［マダガスカルジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）］ｇｉ│１３５６２００８
主要な瓶状スピドロイン２［ハイイロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ）］ｇｉ│１３５６２００２
本発明は、特に以下の態様および実施形態を対象とする。
【００２０】
第１の態様によれば、本発明は、配列番号１または２の核酸配列あるいはこれらの核酸配列の変異体によってコードされるクモのドラグラインタンパク質を対象とし、中程度に厳しい条件下において変異体が配列番号１または２の配列を含む核酸とハイブリッド形成するか、あるいは遺伝子コードの縮退に起因する核酸の変更であって、配列番号１または２として前記アミノ酸と同じ、もしくは機能的に等価なアミノ酸をコードする核酸の変更を変異体が含むならば、変異体は、配列番号１または２の配列と比較して１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失を有するものと定義される。
【００２１】
用語「核酸配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列のことをいう。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本願においてはヌクレオチドのヘテロポリマーのことをいうために相互交換可能に使用される。
【００２２】
本願で使用されるハイブリッド形成の厳密性は、ハイブリッド形成下ではポリヌクレオチドの２本鎖が安定である条件のことをいう。当業者には知られているように、２本鎖の安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度との関数である（たとえば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９年）、参照）。当業者は、ハイブリッド形成させるために使用される厳密性のレベルを容易に変更することができる。
【００２３】
本願において使用する「中程度に厳しい条件」は、ＤＮＡが、このＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性を有する相補的な核酸と結合することを可能にする条件のことをいう。ＤＮＡと約９０％を超える同一性を有する相補的な核酸が特に好ましい。好ましくは、中程度に厳しい条件は、ホルムアミド５０％、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃におけるハイブリッド形成に続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳによる６５℃における洗浄と等価な条件である。
【００２４】
本発明においては、２つの異なる種類、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４のコード配列が検討されていることに注意する。第１に、すでに公表されているＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の配列（本願では、「野生型」配列）および、第２に、配列番号１（ＡＤＦ−３）および２（ＡＤＦ−４）によってコードされるこれらの変異体である。野生型配列はすでに公表されており、アクセッション番号Ｕ４７８５５およびＵ４７８５６（配列番号３および４）によって入手可能である。
【００２５】
前記で説明したように、シルク繊維は、液晶ポリマーに似た無定形の弾性セグメントによって間隔を空けられたβシートの結晶領域を有する。これらの２つのセグメントは、異なる遺伝子によってコードされる２つの異なるタンパク質、ＭａＳｐ Ｉ（主要な瓶状スピドロインＩ）およびＭａＳｐ ＩＩ（主要な瓶状スピドロインＩＩ）によって表される。
【００２６】
本発明の核酸配列は、好ましくはＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（配列番号１および２）またはこれらの変異体である。配列番号３および４は、対応する野生型配列のアミノ酸配列を示す。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、構成要素が前記で定義されたタンパク質の１つまたは複数あるいは該タンパク質の変異体の１つとして定義されるポリマーからなるスパイダーシルクタンパク質を提供する。本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の挿入、欠失および置換によって、本願において開示される配列とは異なるすべての配列をも包含する。
【００２８】
好ましくは、アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造および／または化学的性質を有する他の１つのアミノ酸によって置き換えることの結果、すなわち保守的なアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて行われてもよい。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ、極性天然アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００２９】
「挿入」または「欠失」は、通常約１〜５個のアミノ酸の範囲、好ましくは約１、２、または３個のアミノ酸である。アミノ酸の追加は、通常１００個以下であり、好ましくは８０個以下であり、より好ましくは５０個以下であり、最も好ましくは２０個以下であり、本発明のタンパク質上に延長／または中に挿入される。本発明においては、本願で開示されるタンパク質の力学的および他の特性にマイナスの影響を与えないアミノ酸の追加だけが検討されることに注意する。
【００３０】
許される変異は、タンパク質へのアミノ酸の挿入、欠失、または置換を、組換えＤＮＡ技法を使用して体系的に行い、得られた組換え変異体の活性を分析することによって実験的に決定されてもよい。これは、当業者に対して、日常的実験を超えるものを要求しない。
【００３１】
好ましい一実施形態によれば、前記で定義された核酸配列の１つまたは複数がベクターに収容される。好ましくは、このベクターは、上記で定義された１つまたは複数のドラグラインタンパク質および１つまたは複数の調節配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。そのような調節配列は、好ましくはプロモーターｐ１０および／またはポリヘドリンを含んでもよいが、他の後期および極めて後期のバキュロウイルス・プロモーターも同様に使用することができる。
【００３２】
ベクターは、より好ましくはウイルスベクター、最も好ましくはバキュロウイルスベクター系またはワクシニアウイルスベクター系である。他のウイルスベクター系が本発明において使用されてもよい。場合によっては、ベクターの改変が必要なこともある。他のウイルスベクターの例は、アデノウイルスおよびすべてのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、たとえば狂犬病、麻疹、ＲＳＶ等である。
【００３３】
昆虫細胞としては、鱗翅目昆虫細胞が好ましくは使用され、より好ましくはツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの細胞およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）からの細胞が使用される。最も好ましくは、昆虫細胞はＳｆ９、Ｓｆ２１またはｈｉｇｈ ｆｉｖｅ細胞である。
【００３４】
昆虫細胞の発現系の一つの利点は、たとえばバクテリア系に関しては、生成されたタンパク質がグリコシル化されており、したがって微生物による分解の標的であるという事実にある。この特徴は、たとえば医療分野において、シルクタンパク質のインビボ使用が意図されるときは常に重要である。インビボ使用では生物分解が望ましい。この特徴は、特に縫合材料ならびに創縫合システムおよび創傷被覆システムにおいて用途を見出す可能性がある。
【００３５】
他の好ましい一実施形態によれば、発現されるドラグラインタンパク質は、野生型のＡＤＦ−４または配列番号２によってコードされたＡＤＦ−４だけである。
一つの代替物として、発現されたドラグラインタンパク質は、野生型ＡＤＦ−３または配列番号１の核酸によってドラグラインタンパク質としてコードされたアミノ酸だけである。
【００３６】
本発明者らは、意外にも先行技術の信念とは対照的に、２つの周知の主要なドラグラインタンパク質の１つだけ（好ましくはＡＤＦ−４）が、しおり糸の作成および集合のために必要であることを見出した。したがって、しおり糸の作成のすでに知られている方法は、当業において周知の２つではなく、しおり糸の調製のための１つだけの成分を使用することによって大幅に簡単化することができる。このように、ＡＤＦ−３だけ、好ましくはＡＤＦ−４だけからなるしおり糸が本発明の好ましい一実施形態である。
【００３７】
ＭａＳｐ Ｉ類は、アミノ酸プロリンの含有量によってＭａｓｐ ＩＩと区別することができる。ＭａＳｐ ＩＩ類の中には、他には正式の部分範囲は存在しない。しかし、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は、アミノ酸グルタミンの含有量およびポリアラニン領域の間隔と長さとによって互いに異なっている。したがって、当業者は、ＭａＳｐ ＩＩ中のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に相当する領域をそれぞれ容易に判定することができる。
【００３８】
好ましくは、前記ドラグラインタンパク質の発現は分泌発現によって起こる。詳細については実施例を参照されたい。あるいは、発現は細胞質における生成によって起こる。実施例に示すように、発現のために使用した昆虫細胞中に存在する条件は、前記で述べたように、スパイダーシルクタンパク質が高濃度および高品質で発現され、さらにそれらのタンパク質の糸への自己集合が、すでに細胞質中で、なんらそれ以上の生成段階なしに起こるという驚くべき結果に導いた。
【００３９】
本発明の状況においては、以下の段階を含むクモのドラグラインタンパク質の糸の製造方法を使用することができる。
ａ）前記で定義されたクモのドラグラインタンパク質を発現させる工程、
ｂ）該タンパク質を取り出す工程、および
ｃ）該タンパク質を適当な方法によって糸に紡糸する工程。
【００４０】
段階ｃ）においては、当業に周知の紡糸方法が使用されてもよい。たとえば、スパイダーシルクタンパク質のドープ溶液は、糸疣（出糸突起）を通して押し出されてバイオフィラメントを形成する。得られたバイオフィラメントは、引き出されたり、延伸されたりすることができる。バイオフィラメント中に結晶性および無定形の両方の分子配列が存在するときはいつでも、引き出しまたは延伸は、分子を配向させるのに十分なせん断応力を与えて分子をフィラメントの壁に対してより並行にし、バイオフィラメントの引張り強度および靭性を高める。
【００４１】
ドープ溶液は、１つまたは複数のクモ種からのシルクタンパク質、またはさまざまなシルク生成属からのシルクタンパク質の混合物、たとえばクモおよびカイコガ（Ｂ．ｍｏｒｉ）からのシルクタンパク質の混合物を含有してもよい。最も好ましい実施形態においては、シルクタンパク質は、Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓまたはＡ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓからのしおり糸、特にタンパク質ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩ、ＡＤＦ−３、およびＡＤＦ−４である。代替実施形態においては、ドープ溶液は、シルクタンパク質と、１つまたは複数の合成ポリマーあるいは天然または合成バイオフィラメントタンパク質との混合物を含有する。
【００４２】
好ましくは、ドープ溶液は、少なくとも１、５、１０、１５重量／容積（ｗ／ｖ）％シルクタンパク質である。より好ましくは、ドープ溶液は、約２０ｗ／ｖ％、２５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％、３５ｗ／ｖ％、４０ｗ／ｖ％、４５ｗ／ｖ％、または５０ｗ／ｖ％シルクタンパク質である。好ましい実施形態においては、ドープ溶液は、実質的に純粋なスパイダーシルクタンパク質を含有する。好ましい実施形態においては、ドープのｐＨは約６．９である。
【００４３】
「ドープ溶液」は任意の液体混合物を意味しており、この液体混合物はシルクタンパク質を含有しており、かつバイオフィラメントの形成またはフィルムのキャスティングのために押し出され易い。ドープ溶液はまた、タンパク質モノマーに加えて、たとえばダイマー、トリマー、およびテトラマーを含む、より高い秩序の集合体を含有してもよい。通常、ドープ溶液はｐＨ４．０〜１２．０の水性溶液であり、４０ｗ／ｖ％未満の有機物またはカオトロピック剤を有する。好ましくは、ドープ溶液は有機溶媒またはカオトロピック剤を何も含有しないが、溶液の保存性、安定性、または作業性を高めるための添加物を含有してもよい。
【００４４】
「フィラメント」は、顕微鏡的な長さから１マイルあるいはそれ以上の長さにわたる、不定の長さの繊維を意味する。シルクは天然のフィラメントであり、例としてナイロンおよびポリエステルは合成フィラメントである。
【００４５】
「バイオフィラメント」は、組換え技術によって作られたスパイダーシルクタンパク質を含むタンパク質から作られた（たとえば、紡糸された）フィラメントを意味する。
スパイダーシルクタンパク質繊維を紡糸する方法に関するより詳細な情報は、２００３年７月２４日発行の国際公開第０３０６００９９号パンフレット（カラツァスら（Ｋａｒａｔｚａｓ ｅｔ ａｌ．））で見出すことができ、これを参照により本願に援用する。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号１および／または２の核酸もしくは変異体によってコードされるアミノ酸配列を含む、クモのドラグラインタンパク質またはしおり糸を包含する。
好ましい実施形態においては、クモのドラグラインタンパク質／しおり糸は、ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−４または配列番号２の核酸によってコードされるアミノ酸だけを含む。
【００４７】
あるいは、クモのドラグラインタンパク質／しおり糸は、ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−３または配列番号１の核酸によってコードされるアミノ酸だけを含む。
【００４８】
他の態様によれば、本発明は、本願において前記で定義されたタンパク質を含む、またはタンパク質からなるゲルまたはフォームを提供する。そのようなフォームおよびゲルの作り方は、実施例において見出すことができ、後記の「スパイダーシルク由来のタンパク質の集合体」の項を参照されたい。
【００４９】
さらに本発明は、前記で定義された本発明のタンパク質を含む、またはそれからなる、インプラントおよびステントのための被覆を対象とする。この被覆は、それぞれの用途に応じて可溶性タンパク質、フィルム、ゲル、フォーム、ナノ線維、および糸で作ることができる。一般に、セラミック、金属、プラスチック、その他の非生物材料に対するタンパク質被覆は非生物表面を「隠蔽し」、身体の炎症反応または拒絶反応を防ぐ。タンパク質の被覆は、非生物材料を取り囲む細胞の結合を可能にする。さらに、これまでステントグラフト器具において使用されてきたものよりも、本質的にさらに生体適合性であるこれらのグラフト材料を選択することによって、インプラント関連炎症の軽減を達成することができる。ＰＥＴポリエステルおよびナイロンなどの従来のグラフト材料は、その材料に生体血管内でのより速い可溶化の傾向があることを示す高い可溶化因子を有し、したがってより炎症反応を起こし易い。
【００５０】
本発明の材料は、ステントグラフト用途において使用される従来の他のポリマー材料について観察される炎症反応を抑制するという望ましい特徴を示す。
本発明はさらに、前記で規定されたタンパク質、糸または繊維および、クモ起源ではなく好ましくは植物由来の材料または繊維である他の材料または繊維を含む、糸または繊維を提供する。たとえば、スパイダーシルクタンパク質および綿の混合繊維は有利であるかもしれない。
【００５１】
その他の使用される繊維としては、１つまたは複数のナイロン、ａｒａｍｉｄｅ、ケブラー、ウール、炭素繊維、コラーゲン繊維、セルロース、ケラチン繊維、エラスチン繊維、ガムなどが挙げられる。
【００５２】
野生型ＡＤＦ−４を唯一のドラグラインタンパク質としてコードしている核酸を含むベクター、または配列番号１および／または配列番号２の核酸を含むベクターが、本発明において更なる態様として提供される。
【００５３】
更なる態様においては、１つまたは複数のドラグラインタンパク質、好ましくはドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（野生型）、ＡＤＦ−３（配列番号１）および／またはＡＤＦ−４（配列番号２）をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクターが提供される。
【００５４】
すでに前記で説明したように、本願において定義されるタンパク質／糸は、バイオテクノロジー、および／または医療分野において、好ましくは創縫合システムまたは創傷被覆システム、神経外科または眼科手術において使用される縫合材料の製造のために使用されることができる。
【００５５】
意外にも、本発明のタンパク質ならびに繊維、糸およびこれらから作られる他の材料は、抗微生物性、特に抗菌性を示す。これらの固有の生物分解性を念頭に置くと、これらは、ヒトまたは動物におけるインビボ用途に対して最適の特徴を有する。このように、本発明のタンパク質およびそれらから得られる材料を使用することによって、手術中の身体に対する有害な影響を最小限にすることができ、追加の手術を避けることができ、かつ手術後の回復の加速が可能である。
【００５６】
さらに、タンパク質／糸は、好ましくは代用材料、好ましくは人工軟骨材料または人工腱材料の製造に使用されてもよい。
他の使用は、人工代用品、好ましくは人工代用肺の安定化のための使用である。
【００５７】
加えて、本発明の糸／繊維は、医療用接着テープ、植皮、代用靭帯、外科用網などの医療用品の製造において、および衣料用織物、防弾ベストの内張り、容器用織物、バッグまたは財布用ストラップ、ケーブル、ロープ、接着性結束材、非接着性結束材、紐用材料、乗り物カバーおよび部品、建設材料、コンクリート、塗料、ポリシロキサン、耐候性材料、フレキシブル・パーティション材料、スポーツ器具などの広い範囲の工業製品および商業製品において、また、高い引張り強さおよび弾力性が望まれる特徴である繊維または織物の、事実上ほとんどあらゆる用途において使用可能である。他の形態の安定な繊維製品の適合性および用途、たとえばドライスプレー塗料、ビーズ様粒子、または他の組成物との混合物における用途も本発明において意図されている。
【００５８】
別途に定義しない限り、本願において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明に関する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本願において言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体を参照により援用する。紛争の場合は、定義を含む本願が統御する。加えて、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定的であることを意図するものではない。
【００５９】
ここで、本発明を以下の実施例および添付の図面によって例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
実施例
本願において提供される改良は、ニワオニグモ（ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）のしおり糸の２つの主要な成分を同時に発現させて研究するという着想に基づいていた。昆虫はクモと同じ門に属することから、本発明者らは、昆虫細胞株Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ（ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来）を、ベクターとしてバキュロウイルスを使用するａｄｆ−３およびａｄｆ−４の発現のために選択した。ａｄｆ−３およびａｄｆ−４の部分的ｃＤＮＡを含有している組換えバキュロウイルスを生成した（１４）。合成をモニターするために、両方のタンパク質をＨｉｓ６−Ｔａｇと共に準備した。ｔａｇに起因する人為的な影響を排除するために、Ｈｉｓ６−Ｔａｇを伴わない変形も使用した。
【００６１】
組換えウイルスを、細胞質中でスパイダーシルクタンパク質を生成するためのＳｆ９細胞を感染させるために使用した。３日間培養後、感染細胞を超音波処理によって溶解し、不溶の細胞内容物を沈降によって可溶物質から分離した。免疫ブロットによる分析前に、沈降物をグアニジウムチオシアネート（ＧｄｍＳＣＮ）に溶解した。
【００６２】
ＡＤＦ−３の大部分は可溶であることが見出され、ＡＤＦ−４は、使用した条件下で感染の３日後には、ほとんど完全に不溶であり（図１Ａ）、Ｈｉｓ６−Ｔａｇの存在とは無関係であった（図４Ａ）。意外にも、ａｄｆ−４（配列番号２）発現細胞内の集合体を詳しく調べると、細胞質全体に輪になったフィラメントが見られたが、大部分の細胞はただ１つまたは少数の均一な幅のフィラメントを含有していた（図１Ｂ）。これと対比して、対照ウイルスまたはａｄｆ−３（配列番号１）をコードしているウイルスで感染させた細胞は、決してそのようなフィラメントを生成しなかった（図４Ｃ、Ｄ）。抗Ｈｉｓ６抗体を使用して感染させた細胞について行った免疫蛍光法はフィラメントの特有の着色を示し、したがって、フィラメントはＡＤＦ−４からなることを裏付けた（図１Ｂ）。
【００６３】
次に、本発明者らは、ＡＤＦ−３とＡＤＦ−４とが一緒に集合してフィラメントになることができるかどうかを詳細に調べた。本発明者らは、ｐＦａｓｔｂａｃＤＵＡＬドナープラスミドを使用して、異なる独立のプロモーター下でａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の両方を含有している組換えバキュロウイルスを生成した。このウイルスでＳｆ９細胞を感染させた結果、両方のタンパク質が合成され、ＡＤＦ−４単独の合成によって形成されるフィラメントと比較して類似の外観を示すタンパク質フィラメントが形成された（図４Ｂ）。興味深いことに、二重発現系において集合したフィラメントは完全にＡＤＦ−４によって形成されており、組み込まれたり安定に会合したりしているＡＤＦ−３はなかった（図１Ｃ、データは示していない）。
【００６４】
この見かけ上の自己集合が、ＡＤＦ−４の性質だけによるものか、あるいはその他の因子または修飾が関与しているかを調べるために、本発明者らはＨｉｓ６−ＡＤＦ−４の分泌形態をコードする組換えバキュロウイルスを創出した。細胞をこのウイルスで感染させると、細胞の培地中でのＡＤＦ−４の蓄積に至った（図１Ｄ）。免疫蛍光法は、分泌された小胞を含有しているＡＤＦ−４が感染細胞の表面に多量にあること明らかにした（図１Ｅ）。特に印象的なことは、本発明者らは、ホスト細胞室内にも培地中にもＡＤＦ−４フィラメントの形成をまったく観察しなかったことである。
【００６５】
シルク糸の形成は、一般にはタンパク質の濃度に加えてその他の因子にも依存する。興味深いことには、Ｓｆ９細胞の細胞内のｐＨ６．３は、シルク糸の集合前の紡糸ドープ中のｐＨに相当する（１９）。ＡＤＦ−４フィラメント集合形成に必要な、細胞質環境中の他の因子はまだよく分かっていない。ＡＤＦ−４のインビトロ自己集合性の詳しい調査は、その他の因子の重要性を強調した。フィラメントを６Ｍ ＧｄｍＳＣＮ中に溶解させることによって可溶性のＡＤＦ−４を容易に得た。溶解したＡＤＦ−４は、ＧｄｍＳＣＮを透析または希釈によって取り除くと、急速に集合体となった。しかし、インビトロで形成されたＡＤＦ−４集合体は線維状の構造を示さず、またＳｆ９細胞内部で形成されるＡＤＦ−４フィラメントの化学的安定性も示さなかった（下記および図４Ｅ、Ｆ参照）。前記の知見は詳細な細胞質環境の重要性を示唆しており、これには他の、まだ解明されていない、自己集合の制御のために重要な細胞質因子が含まれていると思われる。
【００６６】
本発明者らは次に、ＡＤＦ−４フィラメントの形態を特徴付けた。フィラメントの直径は２００ｎｍ〜１μｍの範囲であるが、それぞれの単一フィラメントについては、直径は一定であることを見出した。さらに、フィラメントは１００μｍまでの長さを示し、しばしば末端が結び目、枝分かれであるかまたは閉じた円を形成していた（図２Ａ、Ｄ、Ｅ）。フィラメントは滑らかな表面を示し、しばしばナノファイバー（直径〜５ｎｍ）および他のタンパク質集合体を伴っていた（図２）。免疫ブロッティング法および免疫電子顕微鏡は、フィラメントおよび会合した集合体形態がＡＤＦ−４で構成されていることを示した（図２Ｃ、３Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続く銀着色によって視覚化されたフィラメント中には、ＡＤＦ−４以外には他の豊富なタンパク質を検出することができなかった（図３Ａ）。細胞当たりのフィラメントの数が少ないこと、およびほとんど全部の細胞内ＡＤＦ−４が集合体中に動員されることは、Ｓｆ９細胞中のＡＤＦ−４の自己集合が核から始まる過程である可能性が高いことを示唆しており、これは以前にカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のシルクの紡糸過程についても提案されている（２０）。
【００６７】
Ｓｆ９細胞中で形成されるフィラメントの寸法は細胞の容積によって制約されるようであり、これらのフィラメントは通常、シルク糸について行われる力学的な力の測定のためには短すぎるものとなる（２１）。しかし、本発明者らは、濡れた、または乾燥したＡＤＦ−４フィラメントの化学的な安定性を、ニワオニグモ（Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の天然しおり糸と比較して解析することができた。しおり糸は、多くの変性剤中に不溶であると報告されてきた（２２）。２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および８Ｍの尿素の適用は、３０秒の暴露後にＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸の構造に対して明らかに影響しない（図３、データは示していない）。フィラメントの、６Ｍの塩化グアニジウム（ＧｄｍＣｌ）中への浸漬は、ＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸のいずれの可溶化にも至らなかったが、しおり糸の膨潤には至った。このような膨潤は、以前に水性溶液中に浸漬されたスパイダーシルクについて記載されている繊維の超収縮（２１）に起因すると考えられ、これは非晶質マトリックス中の水素結合の再形成（組換え）の結果である（２１）。前記で言及した変性剤とは対照的に、６ＭのＧｄｍＳＣＮの１つの小滴が、数秒間以内にＡＤＦ−４フィラメントもしおり糸も同様に完全に溶解させた（図３）。その結果、本発明者らは、両方の構造が特定の変性剤に対する化学的抵抗性の原因となる同じ分子相互作用を持つと結論している。
【００６８】
方法
プラスミド構築
配列番号１および２のｃＤＮＡを、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ドナープラスミド中にクローン化した。ペプチドタグをコードする配列を遺伝子断片の５’末端に設けた。Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質については、遺伝子をホストベクターからＳｐｅＩ／ＸｈｏＩを使用して切除し、同程度に消化したｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ＨＴａでライゲートした。Ｔ７−タグ付き（２３）タンパク質については、遺伝子をまずノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）からのｐＥＴ２１中に、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを使用してクローン化した。次に、Ｔ７−Ｔａｇをコードしている領域を含む挿入部分をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切除し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１でライゲートした。ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）を共発現させるために、両方の遺伝子をｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬ中にクローン化し、Ｔ７−ＴａｇおよびＳ−Ｔａｇをコードしている配列を設けた（２４）。ａｄｆ−４（配列番号２）遺伝子をｐＥＴ２１−ａｄｆ−４（配列番号２）からＢｇ１ＩＩ／ＸｈｏＩで切除し、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで開裂されたｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬでライゲートした。２つの合成オリゴヌクレオチド（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、Ｓ−Ｔａｇをコードしている配列を設けるようにアニールし、これが結果的にＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ適合性の２本の１本鎖を有する２本鎖ＤＮＡをもたらす。
５’−ＣＴＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
５’−ＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＣＣＧＧＧ−３’（配列番号６）
Ｔ７−Ｔａｇをコードしている領域を除去するために、ｐＥＴ２１−ａｄｆ−３（配列番号１）をＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩで消化した。次いで、Ｓ−ｔａｇをコードしているＤＮＡでベクターをライゲートした。ＸｈｏＩ／ＸｍａＩを使用して、Ｓ−タグ付きａｄｆ−３（配列番号１）をｐＦａｓＢａｃ（商標）ＤＵＡＬ−ａｄｆ−４（配列番号：２）中にクローン化した。この二重構造において、ａｄｆ−３およびａｄｆ−４は、独立のｐ１０（２５）プロモーターおよびポリヘドリン（２６）プロモーターの制御下にあった。ミツバチ・メリチンの分泌シグナルをコードしている配列を、テンプレートとしてのｐＭＩＢ／Ｖ５−ＨｉｓＡベクターおよびＣｐｏｌ制限サイトを含有している下記のプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。
５’−ＣＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＡＣ（配列番号７）
５’−ＣＣＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＧＡＴＧＴＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号８）
得られたＰＣＲ生成物をＣｐｏ１で切断し、同様に消化されたｐＦａｓｔＢａｃ（商標）ＨＴａ−ａｄｆ−４（配列番号２）中にライゲートした。ポジティブクローンの配向および正確性をシークエンシングによって調べた。
【００６９】
細胞培養
Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）：ＡＴＣＣ＃：ＣＲＬ−１７１１）細胞を、ＢＩＯＩＮＳＥＣＴ−１無血清昆虫細胞培地（バイオロジカル・インダストリー社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中に２７℃で繁殖させた。Ｓｆ９細胞を、６ウエルプレート中のカバースリップ上の単層で、または８０ｒｐｍで撹拌されているシェーカーフラスコ中でのいずれかで培養した。
【００７０】
バキュロウイルス含有組換えａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の生成
組換えバクミドを生成するために、バクミド（バキュロウイルス・シャトルベクター・プラスミド）およびヘルパープラスミドを含有している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０ＢＡＣのコンピテント細胞を製造者の指示（インビトロジュン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従って使用した。バクミドへの遺伝子の挿入をＰＣＲによって検証した。ＥＳＣＯＲＴ導入試薬（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して、Ｓｆ９細胞に組換えバクミドＤＮＡを６ウエルプレート中で導入した。細胞を２７℃で５時間培養し、リンスしてからさらに７２時間培養した。培地を集めて遠心分離し、ウイルスを含有している上澄みをプラーク測定法によって滴定した。
【００７１】
ａｄｆ−３およびａｄｆ−４の発現
０．１〜１０の範囲のさまざまな感染多重度（ＭＯＩ）でＳｆ９細胞（３×１０６細胞／ｍＬ）を組換えウイルスに感染させた。感染（ＰＩ）３日後、５００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞を集めた。
【００７２】
ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の検出および溶解性
細胞を１．２×１０７細胞／ｍＬでｐＨ７．５の１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。１２５，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって、可溶成分と不溶成分とを分離した。その後の分析のために、ペレットを６ＭのＧｄｍＳＣＮに再懸濁し、８Ｍの尿素に対して透析した。細胞１．５×１０５個からの上澄み液およびペレットを、還元性条件下でトリス−グリシンポリアクリルアミド１０％のゲル上に載せてＰＶＤＦ膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））へブロットした。マウス抗Ｈｉｓ６モノクロナール抗体（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１：１０，０００）またはマウス抗Ｔ７モノクロナール抗体（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１：１０，０００）および抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼ共役体（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１：５，０００）を二次抗体として使用して、スパイダーシルクタンパク質を検出した。Ｓタグ付きＡＤＦ−３を直接検出するために、Ｓタンパク質パーオキシダーゼ共役体（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、１：５，０００）を使用した。
【００７３】
免疫細胞化学
カバースリップ上で５０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、組換えウイルスをＭＯＩ＝１０で含有しているａｄｆ−３（配列番号１）またはａｄｆ−４（配列番号２）で感染させた。３日間培養後、ＰＩ細胞を−２０℃のメタノールで固定した。カバースリップを、１：３００で希釈したマウス抗Ｈｉｓ６モノクロナール抗体（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、続いて１：５００で希釈したＴｅｘａｓ Ｒｅｄ共役抗マウス二次ＩｇＧとともに培養した。細胞をＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察し、画像をＭａｇｎａｆｉｒｅ ＳＰカメラで撮影するか、または共焦点顕微鏡によって解析した。
【００７４】
ＡＤＦ−４糸の精製
細胞を、１．２×１０７細胞／ｍＬでｐＨ７．５の１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳに再懸濁し、ドデシル硫酸ナトリウム２ｗ／ｖ％を加え、続いて９５℃で５分間のインキュベーションによって溶解させた。糸を５，０００×ｇで沈降させ、続いて８Ｍの尿素および２回蒸留した水で洗浄した。
【００７５】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
精製されたフィラメントを２回蒸留した水に再懸濁し、分割したてのマイカ上で３分間インキュベートするか（ＡＦＭ）、またはＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）プラスチックのカバースリップ（ナルジェン ヌンク社（Ｎａｌｇｅｎ Ｎｕｎｃ））上に載せた（ＳＥＭ）。ＡＦＭのために、Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ ＳＰＭ（ビーコ社（Ｖｅｅｃｏ））を使用する接触方式の画像化の前に、試料を２回蒸留した水で４回リンスして風乾した。ＳＥＭのために、溶液を除去した後に試料を風乾し、金層で真空被覆してからＪＳＭ−５９００ＬＶ（ジェール社（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．））によって２０ｋＶで解析した。ＴＥＭ（ジェール社（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．））解析のために、フォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）で被覆したグリッド上にフィラメントを吸着させてから酢酸ウラニルで負染色した。免疫染色のために、繊維をマウス抗Ｈｉｓ６抗体でインキュベートし、続いて１８ｎｍの金共役ヤギ抗マウスＩｇＧで標識した。
【００７６】
Ｈｉｓ６−ｔａｇを含まない糸の形成
Ｈｉｓ６−ｔａｇのフィラメント形成に対する起こりえる影響を排除するために、Ｔ７−タグ付きＡＤＦ−４をＳｆ９細胞中で合成した。Ｔ７タグ付きＡＤＦ−４フィラメント形成は、明らかにＨｉｓ６タグ付きＡＤＦ−４のそれと区別できなかった（図４Ａ）。
【００７７】
ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）共発現細胞における糸の形成
ａｄｆ−３およびａｄｆ−４を共発現するＳｆ９細胞においては、ＡＤＦ−４だけを生成する細胞において形成されるフィラメントと比較して明らかに区別のつかない形態を示すフィラメントを検出することができた（図４Ｂ）。
【００７８】
Ｓｆ９細胞におけるａｄｆ−３（配列番号１）の発現
免疫細胞化学は、ａｄｆ−３（配列番号１）発現細胞中に複数の蛍光焦点を示したが、フィラメント様の構造は観察できなかった（図４Ｃ、Ｄ）。重要なことに、Ｓｆ９細胞中で合成されたＡＤＦ−３の大部分が可溶性であった。したがって、焦点の形成は、タンパク質の集合というよりも細胞成分（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）の蓄積を表していた。
【００７９】
ＡＤＦ−４のインビトロ集合
ＡＤＦ−４は、変性剤の透析による除去直後または水性緩衝液中への希釈後に集合した。得られた集合体は線維状の形態を示さなかった（図４Ｅ）。化学的安定性の試験は、細胞質ゾル中に形成されるＡＤＦ−４フィラメントと比較して、インビトロ形成された集合体は２％ＳＤＳまたは８Ｍの尿素中に可溶であることを示した（図４Ｆ）。
【００８０】
スパイダーシルク由来のタンパク質の集合
以下の実験を実施して、スパイダーシルク配列ＡＤＦ−３（配列番号１）またはＡＤＦ−４（配列番号２）由来のタンパク質を形態学的に異なる形態に集合させることができることを実証した。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に基づくタンパク質を、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００４年、４３巻、１３６０４〜１１３６２頁（２７）に記載されているように、水溶液中で構成、製造および調製した。別途に言及しない限り、タンパク質溶液は、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）ｐＨ８．０を含有していた。
【００８１】
１．球
直径が０．５〜２μｍの範囲の直径を示すタンパク質球（図５ａ）を、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質の０．２ｗ／ｖ％溶液に０．８Ｍの硫酸アンモニウムを加えることによって生成した。
【００８２】
２．ナノ線維
直径が０．７〜４ｎｍのナノ線維（図５ｂ）を、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質の１ｗ／ｖ％溶液を室温で２週間インキュベートすることによって形成した。
【００８３】
３．微細線維
微細線維を形成するために、ＡＤＦ−３に基づくタンパク質の２５ｗ／ｖ％溶液５〜１０μＬを、ｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸カリウムにゆっくり安定な１滴を形成させながら注入した。１分間インキュベーションした後、タンパク質の滴をピンセットで溶液から取り出した。空気中でさらに１分間インキュベーションした後、第２のピンセットを使用してタンパク質の滴からタンパク質の線維を約２ｃｍ／ｓの速度で引き出すことができた。この線維は、直径４μｍの円形断面を示した（図５ｃ、ｄ）。
【００８４】
４．泡
２．５ｍＭのアンモニウムパーオキソジサルフェート（ＡＰＳ）、１００μＭのトリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕｂｐｙ）およびＡＤＦ−３に基づくタンパク質１０ｗ／ｖ％またはＡＤＦ−４に基づくタンパク質２ｗ／ｖ％を含有している溶液からタンパク質の泡（図５ｅ、ｆ）を生成した。このタンパク質溶液を空気で泡立てた。得られた泡構造を安定させるために、タンパク質をタングステン・ランプからの可視光に１分間露光させた（２８）。次に泡を９５℃で乾燥した。
【００８５】
５．ゲル
濃度１ｗ／ｖ％のＡＤＦ−４に基づくナノ線維（第２項参照）はゲル様の外観を示したが、これは撹拌またはせん断によって容易に崩壊させることができた。ゲルの力学的性質を改善するために、ＡＰＳおよびＲｕｂｐｙを拡散によってゲル中に入れて最終濃度が１０ｍＭのＡＰＳおよび１００μＭのＲｕｂｐｙとなるようにした。光誘起架橋（第４項参照）後、寸法安定性のゲルを得ることができた（図５ｇ）。
【００８６】
６．フィルム
ＡＤＦ−３由来のタンパク質を、１，１，１，３，３，３、−ヘキサフルオル−２−プロパノール中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。２００μＬの溶液をポリスチレンの表面（約２０ｃｍ２）に展開させた。溶媒の蒸発後、透明なタンパク質フィルムを引き剥がすことができた（図６参照）。
【００８７】
参考文献
1. J. M. Gosline, P. A. Guerette, C. S. Ortlepp, K. N. Savage, J.Exp.Biol. 202 Pt 23, 3295-3303 (1999).
2. J. Warwicker, J.Mol.Biol. 2, 350-362 (1960).
3. A. H. Simmons, E. Ray, L. W. Jelinski, Macromolecules 27, 5235-5237 (1994).
4. A. D. Parkhe, S. K. Seeley, K. Gardner, L. Thompson, R. V. Lewis, J. MoI. Recognit. 10, 1-6 (1997).
5. J. D. van Beek, S. Hess, F. Vollrath, B. H. Meier, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 99, 10266-10271 (2002).
6. D. H. Hijirida et al, Biophys. J. 71 , 3442-3447 (1996).
7. K. Kerkam, C. Viney, D. Kaplan, S. Lombardi, Nature 349, 596-598 (1991).
8. D. P. Knight and F. Vollrath, Proc.R.Soc.Lond. 519-523 (1999).
9. D. P. Knight and F. Vollrath, Naturwissenschaften 88, 179-182 (2001).
10. F. Vollrath, D. Knight, X. W. Hu, Proc.R.Soc.Lond B Biol. ScL 265, 817-820 (1998).
11. E. K. Tillinghast, S. F. Chase, M. A. Townley, J.Insect Physiol. 30, 591-596 (1984).
12. D. P. Knight, M. M. Knight, F. Vollrath, InU. Biol. Macromol. 27, 205-210 (2000).
13. S. Winkler and D. L. Kaplan, J. Biot[beta]chnol. 74, 85-93 (2000).
14. P. A. Guerette, D. G. Ginzinger, B. H. Weber, J. M. Gosline, Science 272, 112-1 15 (1996).
15. J. Gatesy, C. Hayashi, D. Motriuk, J. Woods, R. Lewis, Science 291 , 2603-2605 (2001). 16. S. Arcidiacono, C. Mello, D. Kaplan, S. Cheley, H. Bayley, Appl. Microbiol.Biotechnol. 49, 31 -38 ( 1998).
17. J. Scheller, K. H. Guhrs, F. Grosse, U. Conrad, Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
18. A. Lazaris et al., Science 295, 472-476 (2002).
19. V. Vachon, M. J. Paradis, M. Marsolais, J. L. Schwartz, R. Laprade, Biochemistry 34, 15157-15164 (1995).
20. G. Li et al., Eiir.J.Biochem. 268, 6600-6606 (2001).
21. Z. Shao, R. J. Young, F. Vollrath, InU MolMacromol 24, 295-300 (1999).
22. S. Lombardi and D. Kaplan, J.Arachnol. 18, 297-306 (1990).
23. Kroll, D. J. et al. DNA Cell Biol. 12, 441-453 (1993).
24. Kim, J. S. & Raines, R. T. Protein ScL 2, 348-356 (1993).
25. Knebel, D., Lubbert, H. & Doerfler, W. EMBO J. 4, 1301-1306 (1985).
26. Smith, G. E., Summers, M. D. & Fraser, M. J. MoI. Cell Biol 3, 2156-2165 (1983).
27. Huemmerich, D., Helsen, C.W., Oschmann, J., Rudolph, R. & Scheibel, T. Biochemistry 43, 13604-13612 (2004)
28. Fancy, D.A. & Kodadek, T. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 96, 6020-6024 (1999)
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】Ｓｆ９細胞におけるａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の発現。（Ａ）合成後のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の溶解性。細胞溶解物の可溶性（Ｓ）成分および不溶性（Ｐ）成分は沈降により分離した。抗Ｈｉｓ６抗体を用いる免疫ブロット法でタンパク質を検出した。（Ｂ）ａｄｆ−４発現細胞中のフィラメントの光学顕微鏡観察（上段パネル）および免疫細胞化学後の蛍光顕微鏡観察（中段パネル）。さらに、別の細胞の免疫細胞化学後の共焦点蛍光画像を下段のパネルに示している。スケールバー：１０μｍ。（Ｃ）共合成ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の溶解性。可溶性（Ｓ）細胞成分は、不溶性（Ｐ）細胞成分から沈降により分離した。ウエスタンブロット後にＳタンパク質−パーオキシダーゼ共役体を用いてＡＤＦ−３を検出し、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＡＤＦ−４を検出した。（Ｄ）懸濁液中のＳｆ９細胞をｍｅｌ−Ｈｉｓ６−ａｄｆ−４ウイルスに感染させた。表示された時間（感染後の日数）に、細胞数が６×１０４相当のアリコートを培地から取り出して細胞を取り除き、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に掛け、続いて免疫ブロットした。（Ｅ）ｍｅｌ−ｈｉｓ６−ａｄｆ−４ウイルスに３日間感染させた細胞を免疫蛍光測定に掛けた。細胞表面の分泌小胞を明瞭に検出することができた。スケールバー：１０μｍ。
【図２】ＡＤＦ−４フィラメントおよび集合体の形態。（Ａ）精製フィラメントの走査型電子顕微鏡観察。スケールバー：５μｍ。（Ｂ）精製フィラメントの透過型電子顕微鏡観察。スケールバー：５００ｎｍ。（Ｃ）精製フィラメントのマウス抗Ｈｉｓ６抗体に続いて抗マウス抗体結合金を使用した免疫電子顕微鏡観察。スケールバー：５００ｎｍ。（Ｄ、Ｅ）原子間力顕微鏡観察（ＡＭＦ）：（Ｄ）高さ画像（ｈｅｉｇｈｔ ｉｍａｇｅ）（Ｅ）偏差画像。フィラメントの高さは０．７μｍ。スケールバー：５μｍ。
【図３】ＡＤＦ−４フィラメントおよびしおり糸の化学的安定性。（Ａ）ＡＤＦ−４フィラメントは、示されているように変性された。未溶解のフィラメントおよび集合体はゲルに入らなかった。溶解したＡＤＦ−４を、抗Ｈｉｓ６抗体を使用する免疫ブロットによって検出された。６Ｍ ＧｄｍＳＣＮで処理した試料をまた銀着色した（ＧｄｍＳＣＮ／Ｓ）。（Ｂ）マイカ上の風乾ＡＤＦ−４フィラメントおよびポリプロピレン上のしおり糸を、示されている各溶液約０．１μＬを用いて３０秒間インキュベートした。水でリンス後、試料を光学顕微鏡によって観察した。スケールバー：２５μｍ。
【図４】（Ａ）Ｓｆ９細胞内で形成されるＨｉｓ６−ｔａｇを含まないＡＤＦ−４フィラメントを光学顕微鏡によって視覚化した。（Ｂ）ａｄｆ−３（配列番号１）およびａｄｆ−４（配列番号２）の二重発現後に得られたフィラメントの形態を走査型電子顕微鏡によって詳細に調べた。（Ｃ）ａｄｆ−３（配列番号１）を発現するＳｆ９細胞を光学顕微鏡によって画像化した。（Ｄ）ＡＤＦ−３の細胞内位置決定。ａｄｆ−３（配列番号１）ウイルスで３日間感染させた細胞を免疫蛍光分析に掛けた。（Ｅ）走査型電子顕微鏡によって視覚化された、インビトロ再生後に形成されたＡＤＦ−４集合体。（Ｆ）インビトロで形成されたＡＤＦ−４集合体の化学的安定性。示されている変性剤による処理後、可溶化されたＡＤＦ−３を免疫ブロットによって検出した。スケールバー：５μｍ（Ｂ、Ｅ）および１０μｍ（Ａ、Ｃ、Ｄ）。
【図５】スパイダーシルクタンパク質の集合形態。（Ａ）走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって視覚化された、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質によって形成された球。（Ｂ）原子間力顕微鏡によって視覚化された、ＡＤＦ−４に基づくタンパク質によって形成されたナノ線維（高さ情報（ｈｅｉｇｈｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））。（Ｃ、Ｄ）ＳＥＭによって観察された、ＡＤＭ−３に基づくタンパク質によって形成された微細線維（Ｃ）。線維の切断およびその後の断面の視覚化のためにはＧａ＋イオンビームを使用した（Ｄ）。（Ｅ）ＡＤＦ−３に基づくタンパク質溶液から発生した泡。（Ｆ）ＡＤＦ−４に基づく溶液から発生した泡。（Ｇ）ＡＤＦ−４ナノ線維によって形成された架橋ゲル。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４は、それぞれ配列番号１および２に相当する。
【図６】本発明のスパイダーシルクタンパク質から作成されたフィルム。ＡＤＦ−３由来のタンパク質を、１，１，１，３，３，３、−ヘキサフルオル−２−プロパノール中に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。この溶液２００μＬをポリスチレンの表面（約２０ｃｍ２）上に展開した。溶媒の蒸発後、透明のタンパク質フィルムを引き剥がすことができた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２の核酸配列によって、あるいはこれらの核酸配列の変異体によってコードされるアミノ酸を含むクモのドラグラインタンパク質であって、中程度に厳しい条件下において変異体が配列番号１または２の配列を含む核酸とハイブリッド形成するか、あるいは遺伝子コードの縮退に起因する核酸の変更であって、配列番号１または２として前記アミノ酸と同じ、もしくは機能的に等価なアミノ酸をコードする核酸の変更を変異体が含むならば、変異体は、配列番号１または２の配列と比較して１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失を有するものと定義されるクモのドラグラインタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のクモのドラグラインタンパク質を含む、クモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項３】
ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−４、配列番号２の核酸によってコードされるアミノ酸、または配列番号４のアミノ酸だけを含む請求項１または請求項２に記載のクモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項４】
ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−３、配列番号１の核酸によってコードされるアミノ酸、または配列番号３のアミノ酸だけを含む請求項１または請求項２に記載のクモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項５】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなるゲルまたはフォーム。
【請求項６】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなる、インプラントおよびステントの被覆。
【請求項７】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸および他の繊維を含み、該繊維はクモ起源のものではなく、好ましくは植物起源の繊維または合成繊維である糸または繊維。
【請求項８】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなるフィルム。
【請求項９】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載の糸／タンパク質を使用して得られる創縫合システム、創傷被覆システム、縫合材料、代用材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料。
【請求項１０】
野生型のＡＤＦ−３および／またはＡＤＦ−４を唯一のドラグラインタンパク質としてコードする核酸、または配列番号１および／または配列番号２の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
１つまたは複数のドラグラインタンパク質、好ましくはドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（野生型）、ＡＤＦ−３（配列番号１）および／またはＡＤＦ−４（配列番号２）をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクター。
【請求項１２】
技術、バイオテクノロジー、および／または医療の分野における請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１３】
創縫合システムまたは創傷被覆システムの製造、好ましくは縫合材料の製造、より好ましくは神経外科または眼科手術における使用を意図する縫合材料の製造のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１４】
代用材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料の製造のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１５】
人工代用物、好ましくは人工代用肺の安定化のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１】
配列番号１または２の核酸配列によって、あるいはこれらの核酸配列の変異体によってコードされるアミノ酸を含むクモのドラグラインタンパク質であって、中程度に厳しい条件下において変異体が配列番号１または２の配列を含む核酸とハイブリッド形成するか、あるいは遺伝子コードの縮退に起因する核酸の変更であって、配列番号１または２として前記アミノ酸と同じ、もしくは機能的に等価なアミノ酸をコードする核酸の変更を変異体が含むならば、変異体は、配列番号１または２の配列と比較して１つまたは複数の置換、挿入および／または欠失を有するものと定義されるクモのドラグラインタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のクモのドラグラインタンパク質を含む、クモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項３】
ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−４、配列番号２の核酸によってコードされるアミノ酸、または配列番号４のアミノ酸だけを含む請求項１または請求項２に記載のクモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項４】
ドラグラインタンパク質として、野生型ＡＤＦ−３、配列番号１の核酸によってコードされるアミノ酸、または配列番号３のアミノ酸だけを含む請求項１または請求項２に記載のクモのドラグラインタンパク質またはクモのしおり糸。
【請求項５】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなるゲルまたはフォーム。
【請求項６】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなる、インプラントおよびステントの被覆。
【請求項７】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸および他の繊維を含み、該繊維はクモ起源のものではなく、好ましくは植物起源の繊維または合成繊維である糸または繊維。
【請求項８】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質を含む、または請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質からなるフィルム。
【請求項９】
請求項１から請求項４の一項または複数項に記載の糸／タンパク質を使用して得られる創縫合システム、創傷被覆システム、縫合材料、代用材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料。
【請求項１０】
野生型のＡＤＦ−３および／またはＡＤＦ−４を唯一のドラグラインタンパク質としてコードする核酸、または配列番号１および／または配列番号２の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
１つまたは複数のドラグラインタンパク質、好ましくはドラグラインタンパク質ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４（野生型）、ＡＤＦ−３（配列番号１）および／またはＡＤＦ−４（配列番号２）をコードする核酸を含むバキュロウイルスベクター。
【請求項１２】
技術、バイオテクノロジー、および／または医療の分野における請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１３】
創縫合システムまたは創傷被覆システムの製造、好ましくは縫合材料の製造、より好ましくは神経外科または眼科手術における使用を意図する縫合材料の製造のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１４】
代用材料、好ましくは人工の軟骨または腱の材料の製造のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【請求項１５】
人工代用物、好ましくは人工代用肺の安定化のための請求項１から請求項４の一項または複数項に記載のタンパク質／糸の使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０７２６０（Ｐ２００８−５０７２６０Ａ）
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１７２０２（Ｐ２００７−５１７２０２）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２８２７
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０６４２６０３０）
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＣＨＮＩＳＣＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＭＵＥＮＣＨＥＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００６７９９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２８２７
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０６４２６０３０）
【氏名又は名称原語表記】ＴＥＣＨＮＩＳＣＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＭＵＥＮＣＨＥＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]