定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）
本発明は、シークエンシングが直面している幾つかの難題に取り組むための新規アプローチ、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳＴＭ）を提供し、研究および診断用途に改善をもたらす。この方法は、溶解（ヌクレアーゼのみ）保護アッセイを用いて、シークエンシング用の核酸、例えばＤＮＡプローブを作成するものであり、該プローブを遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要とすることなく、遺伝子の同定を可能にすることができ、および／または該プローブを実験特異的タグにカップリングさせることができ、それによって異なる患者からのサンプルを単一ランに統合することができる。本開示ｑＮＰＳは、固定されたかまたは不溶性のサンプルのシークエンシングを可能にし、研究および発見ツールとしてならびに診断試験として利用可能にする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、核酸ターゲットの同定および検出の際に定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）を行うための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、シークエンシングを用いて生物学的サンプルからの核酸を分析するための組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、シークエンシングが直面している幾つかの難題に取り組むための新規アプローチ、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳＴＭ）を提供し、研究および診断用途に改善をもたらす。この方法は、溶解（ヌクレアーゼのみ）保護アッセイを用いて、シークエンシング用のＤＮＡ（または他の合成）プローブを作成するものであり、該プローブをそれら自体シークエンシングすることができ、または（ａ）遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要とすることなく、遺伝子の同定を可能にすることができ、および／もしくは（ｂ）実験特異的タグにカップリングさせて、異なる患者からのサンプルを単一ランに統合させることができる。本開示ｑＮＰＳは、固定されたまたは不溶性のサンプルならびにすべてのタイプの他のサンプルのシークエンシングを可能にし、研究および発見ツールとしてならびに診断試験として利用可能にする。
【０００３】
現行のシステム（例えば、４５４、Ｓｏｌｅｘａ、ＳＯＬＩＤ）および次世代プラットホーム（例えば、一分子シークエンシング）でのシークエンシング方法をさらに開示する。ｑＮＰＳは、数ある中でも、ｉ）低コスト／少ないサンプルをもたらす；ｉｉ）高いサンプルスループットをもたらす；ｉｉｉ）シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する；ｉｖ）他のバックグラウンド（例えば宿主からの病原体）遺伝子からの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシングを可能にする；ｖ）バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ ＳＮＰ、ＤＮＡメチル化、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、突然変異などのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する；ｖｉ）すべてのサンプルタイプからの、特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、または固定され細胞内染色され分類されたサンプル、からのシークエンシングを可能にする；およびｖｉｉ）シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブまたはそのプローブによって保護されたターゲット配列だけへと大きく単純化する、研究および診断のための的を絞ったまたは目標を定めたシークエンシング能力を提供する。
【０００４】
動物組織および臨床サンプルは、概して、パラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）組織の形態での固定により保存される。従って、組織遺伝子発現およびＤＮＡの商業的に実現可能な診断アッセイは、ＦＦＰＥを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式および臨床転帰は公知である。従って、ＦＦＰＥサンプルは、診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、非常に貴重な資源に相当する。
【０００５】
幾つかの難題に研究および診断用途のシークエンシングは直面している。本開示定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）法は、溶解（ヌクレアーゼのみ）保護アッセイを用いて、シークエンシング用の（例えばＤＮＡ）プローブを作成するものであり、該プローブを直接シークエンシングすることができ、または例えば、（ｉ）遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要することなく測定される遺伝子配列の同定を可能にすることができ、および／もしくは（ｉｉ）実験特異的タグ、別個のサンプルそれぞれについて１つの一意的タグ、にカップリングさせて（異なる患者からの、または異なる治療もしくは実験からの）異なるサンプルを単一シークエンシングランに統合することができるが、シークエンシングした後にそれらのサンプルは依然として区別可能である。ｑＮＰＳは、数ある中でも、ｉ）低コスト／少ないサンプルをもたらす；ｉｉ）高いサンプルスループットをもたらす；ｉｉｉ）シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する；ｉｖ）非ターゲット遺伝子または遺伝子配列のバックグラウンドからの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシング（例えば、宿主組織からの病原体遺伝子のシークエンシング、または宿主組織ゲノムの干渉を伴わない移植組織のシークエンシングを含む）を可能にする；ｖ）バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ ＳＮＰ、ＤＮＡメチル化、すべてのＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡを含む）、突然変異または他のヌクレオチドターゲットのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する；ｖｉ）すべてのサンプル（特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織、またはグルタルアルデヒド固定組織、例えば固定され細胞内染色され分類された細胞を含む）からのシークエンシングを可能にする；およびｖｉｉ）シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブだけへと大きく単純化する、シークエンシング能力を提供する。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、例えば４５４、ＳｏｌｉｄおよびＳｏｌｅｘａシークエンサーの現世代のための、ならびに一分子シークエンサーおよびそれ以降の次世代のためのプローブおよび方法を提供する。これらのシステムの多くは、多数のサンプルを並行してシークエンシングさせる多数のチャンネルを有するが、シークエンシングラン１回あたりのコストは、＄７，０００から＄９，０００であり、このランは少なくとも数日続き得る。ＰａｃＢｉｏなどの一分子シークエンサーは、＄１００から＄２００／サンプルの範囲でコストを提示し得るが、サンプル調製コストを加えると、これはまだ高い。サンプルあたりのコストを下げてサンプルスループットを増す方策は、それぞれの実験からシークエンシングされる分子を同定するためにシークエンシング可能な「タグ」−「実験用タグ」と呼ぶ−を使用して、マルチチャンネルシークエンサーのそれぞれのチャンネル内で、それぞれのシークエンシングランで多数のサンプルを試験する方策である。配列読み取り長さを短くすることで効率を増すことができる。遺伝子全体もしくは遺伝子フラグメントではなくヌクレアーゼ保護プローブだけのシークエンシング、またはターゲット配列を同定するための短い一意的遺伝子タグの使用により、シークエンシングを用いて遺伝子レベルまたは存在を同定および定量する（しかし遺伝子配列内の未知の差を同定しない）用途について、この効率が達成される。遺伝子タグの使用は、ヌクレアーゼ保護プローブ設計も単純化する。シークエンシングに利用できる端が一意的である必要がないからである。しかし、ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブによって保護されるターゲットオリゴヌクレオチドを、遺伝子タグを使用せずに直接シークエンシングしてもよい。この場合、ターゲット配列内の変異の存在も、それらが結果としてヌクレアーゼ保護プローブのＳ１切断または部分的加水分解を生じさせ、その結果、部分的プローブ配列パターンが生ずる場合、または前記ターゲットオリゴヌクレオチドの保護された部分がシークエンシングされるとき、同定することができる。このプロセスを、突然変異（単数または複数）の同定を含むように設計することもできる。このことをここでさらに論ずる。
【０００７】
シークエンシングは、人に一定の疾患の素因を与え得るまたは有害な薬物代謝を警告し得るゲノムＤＮＡの差を同定するために非常に効果的である。しかし、例えば、臨床的に意義のあるサンプルタイプからの遺伝子発現、ｍｉＲＮＡレベルならびにＤＮＡメチル化状態および他の突然変異の評定を必要とするであろう、患者の状態を同定するおよび治療に対する応答を予測する診断に有用なシークエンシング方法を実現するために、まだ大量の開発が残っている。遺伝子シークエンシング会社は、ますます低コストでゲノムのシークエンシングを提供するという彼らの商業的探究の中でこの領域に的を絞ってこなかった。
【０００８】
固定、例えばパラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）、組織からのシークエンシングは、問題が多く、困難であるとされてきたが、臨床サンプルは、概して固定のよりＦＦＰＥ組織の形態で保存される。従って、関心が、推定バイオマーカーもしくは疾患および薬物メカニズムを同定することであるにせよ、または組織遺伝子発現およびＤＮＡの商業的に実現可能な診断アッセイのための基礎の開発およびその後の適用であるにせよ、そのアッセイは、ＦＦＰＥを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式およびＦＦＰＥドナーの臨床患者転帰は公知である。従って、ＦＦＰＥおよび他の固定サンプルは、薬物ターゲット、疾病マーカーおよび経路ならびに診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、または疾患進行もしくは薬物活性と関連づけられる遺伝子およびメチル化状態発現の変化または突然変異を同定するための、非常に貴重な資源に相当する。ＦＦＰＥからのＤＮＡおよびＲＮＡのシーケンシングは、シークエンシングにとって問題があるばかりでなく、アレイベースの方法およびＰＣＲにとっても問題があり、おそらく同じ理由のため−−ゲノムＤＮＡの有意な部分、およびトランスクリプトームＲＮＡは、組織に架橋される。プロセッシングおよび分析のために、この架橋を逆転させ、ターゲット遺伝子を回収しなければならない。ＦＦＰＥから回収される全ＲＮＡは、固定に起因するにせよ、ＦＦＰＥからのＲＮＡの抽出プロセスに起因するにせよ、概して一部は分解される。研究の場では、分析のために分解されすぎるサンプルは単に廃棄される場合があるが、診断の場では、患者のサンプルの廃棄は許容され得ない。従って、シークエンシング力を認識した上で、研究の場または特に診断の場でＦＦＰＥに適用することは、かなり難題である。研究からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織についてのそれぞれの情報内容は、正確かつ単純な分析法を待って、これらのサンプルの膨大な保管庫の中にしまい込まれたままである。上述のことすべてが、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどおよびこれらの配列内の突然変異、すべてにあてはまる。
【０００９】
シークエンシング用途に突きつけられるもう１つの難題は、サンプルあたりのコストである。現在、シークエンシングランには＄７，０００から＄１０，０００の費用がかかり得る。要求が、異なる患者サンプルのシークエンシングであるにせよ、異なる実験からのサンプルのシークエンシングであるにせよ、それぞれ別々に試験すると、たとえ異なるサンプルを（例えば、４５４またはＳｏｌｅｘａ）計器のそれぞれのチャンネルで試験したとしても、サンプルあたりのコストは、〜＄１，０００である。本開示発明は、それぞれの分子に取り付けた実験用タグを用いて、異なる実験または患者サンプルを同じ計器チャンネル内での単一ランに統合する能力を提供する。これらをシークエンシングして、互いから単一のシークエンシングサンプルに統合された単一の実験または患者サンプルそれぞれからのすべての分子を一意的に同定する。例えば、１００人の患者のサンプル（異なる一意的実験用タグでそれぞれにマークを付けた、それぞれの患者サンプルからのｑＮＰＳ生成物）を単一の、例えば３日のランに統合することにより、サンプルあたりのシークエンシングコストは、たった〜＄１０となる。１００の遺伝子／サンプルを測定するためのこのレベルでのコストであれば、サンプルをプロセッシングする（例えば、それを採集する、それをプロセッシングするなど）コストを加えた後でさえ、診断試験および日常的実験またはスクリーニングアッセイは手の届くものになる。
【００１０】
実験用タグの使用は、コスト／サンプルを低減するばかりでなく、例えば、単一チャンネル内での単一ランでシークエンシングされる１００または１，０００の異なる実験を可能にすることにより、高いサンプルスループットも可能にする。例えば、１チャンネルにつき１００のサンプルをプールすると、８，０００のサンプルを８チャンネルシークエンサーの単一ランで試験することができるだろう。これは、例えば、多くの遺伝子ターゲット／サンプルにわたって、ハイスループットスクリーニングの適用を可能にする。
【００１１】
ｑＮＰＳプロセスのもう１つの利点は、結果として生ずる単純化されたデータ分析である。ターゲット分子のみをヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズさせるため、サンプル中の残存ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、破壊され、（例えば、それらにライゲートされたシークエンシングアダプター分子を有さないことにより）シークエンシングに利用不能にされ、その結果、シークエンシングされるヌクレアーゼ保護プローブまたはそれらの保護ターゲットオリゴヌクレオチドの定量的セットのみが残る。これらのプローブおよびターゲットの配列は公知であるため、参照配列データベースは、もっぱらこれらの配列から成ればよく、ゲノム全体から成る必要はない。さらに、遺伝子識別子タグの標準セットがシークエンシングされるＮＰＰ付加生成物に組み込まれている場合には、シークエンシング情報のデコンボリューションがさらにいっそう単純化される。本質的に、配列分析を、合成ヌクレアーゼ保護プローブおよび誘導されるシークエンシング可能付加生成物またはターゲットオリゴヌクレオチドの同定既知配列または部分配列それぞれの数の「計数」、および該ターゲットオリゴヌクレオチドの配列内の任意の差の同定に縮小することができる。
【００１２】
これのさらなる利点は、微量分子をシークエンシングすることができる点、または例えば、病原体からのターゲット分子を、宿主ゲノムの煩わしいシークエンシングを伴わずに宿主組織からシークエンシングすることができる点である。まさに同じく重要なこととして、シークエンシングを用いて発現遺伝子レベルを定量的に測定するとき、細胞１個につき１つだけのコピーというレベルで測定される遺伝子ばかりでなく何千ものコピー／細胞というレベルで発現される遺伝子を測定できることが重要である。ゲノム全体のバックグラウンドを排除すること、および関心のあるターゲット遺伝子にのみ的を絞ること、および実際にターゲット遺伝子自体を短い配列（例えば、５０塩基のヌクレアーゼ保護プローブ）にまたはさらに短い遺伝子識別子タグに短縮することによって、シークエンシングの効率を増加させ、存在度が非常に異なる遺伝子を測定するダイナミックレンジを増加させる。
【００１３】
ヌクレアーゼ保護プローブのみのシークエンシング、または遺伝子識別子タグの使用は、読み取り時間を短縮して、シークエンシング結果をはるかに速く得ることを可能にする。
【００１４】
また、ｑＮＰＳプロトコルは、サンプルの溶解を利用し、抽出または（例えば、遺伝子発現のために）逆転写を必要としないため、それを完全にかつ簡単に自動化することができる。これは、ハイスループットスクリーニングにとって必要不可欠であり、診断アッセイまたは一般的な実験室アッセイに役立つものでもある。さらに、溶解サンプルは、すべてのターゲット分子、例えばすべてのｍＲＮＡおよびすべてのｍｉＲＮＡ、を含有する。抽出プロトコルは、これらのうちの一方もしくは他方の一部を失うことが多く、またはＤＮＡからのＲＮＡの分離を必要とする。明瞭であるように、ｑＮＰＳを、（例えば）精製されたＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをはじめとする、任意のサンプルで行うことができる。
【００１５】
すべてのタイプのターゲット分子をｑＮＰＳによって測定することができる。例は、ＤＮＡ、ＤＮＡ一塩基多型（ＳＮＰ）、メチル化ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡ発現、ｍＲＮＡＳＮＰ、ｍｉＲＮＡレベル、ｒＲＮＡレベル、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、遺伝子融合または他の突然変異、タンパク質結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびまたｃＤＮＡなどである。たとえターゲット分子自体を決してシークエンシングすることができず、多くの場合、最も好ましくはそれらが破壊されるとしても、ヌクレアーゼ保護プローブをハイブリダイズさせるように設計することができるあらゆるものをシークエンシングによって定量および同定することができる。ヌクレアーゼ保護プローブは、ターゲット分子をシークエンシングのためにヌクレアーゼから保護するので、遺伝子タグおよび実験用タグをヌクレアーゼ保護プローブにではなくターゲット分子に取り付けてもよい。いずれにせよ、ターゲット分子は、その後は場合により重要でなく、ＮＰＰも同様である。
【００１６】
シークエンシング
本明細書において用いる場合の「シークエンシング」は、非分岐生体高分子の一次構造（または一次配列）を決定することを意味する。シークエンシングは、シークエンシングされる分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド、の大量の原子レベル構造を簡潔に要約する配列として知られている記号線形描写をもたらす。分子が、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡまたはＤＮＡなどである場合、シークエンシングを用いて、ヌクレオチドレベルでその分子についての情報を得ることができ、その後、その情報を、分子それ自体および／またはそれによってコードされたポリペプチドについての様々な二次情報の解読に用いることができる。
【００１７】
ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子であるとき、その分子の不安定性およびヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）分解しやすいその傾向のため、サンプルを先ず逆転写してＤＮＡフラグメントを作成することが従来望ましく、その後、本明細書において説明する方法のいずれかによってそれらをシークエンシングすることができる。これは、依然として本発明の選択肢である。しかし、ｑＮＰＳは、逆転写の必要を無くし、その代り、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ活性によりターゲットＲＮＡ配列を相補的ＤＮＡプローブ配列に変換する。当該技術分野において承知されているように、ＲＮＡをコードする遺伝子配列ではなくＲＮＡ分子をシークエンシングすることが時として望ましい。ＲＮＡ分子は、それらのＤＮＡテンプレートと必ずしも共線でないからである。また、一部の生物はＲＮＡ、例えばＲＮＡウイルス、である。例えば、イントロン切り出しおよびスプライシングは、２つのポリヌクレオチド種間の非線形性の一因となる２つの事象である。本発明の他の実施形態では、当該技術分野において公知であるさらなる方法を用いて、細胞または組織の全トランスクリプトームを分析することができる。
【００１８】
任意のシークエンシング方法を本発明において用いることができる。
【００１９】
ＤＮＡシークエンシングは、所定のＤＮＡフラグメントのヌクレオチド順序を決定するプロセスである。今までのところ、殆どのＤＮＡシークエンシングは、（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｓａｎｇｅｒによって開発された）連鎖停止法を用いて行われている。この技術は、修飾ヌクレオチド基質を使用するＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を用いる。チェーン・ターミネーター・シークエンシングでは、テンプレートＤＮＡ上の特定の部位で、そのテンプレートのその領域に相補的な短いオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用することによって、伸長を開始する。ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを複製する酵素）を使用してそのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する。前記プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて、４つのデオキシヌクレオチド塩基（ＤＮＡ結合性ブロック）を低濃度の連鎖停止性ヌクレオチド（最も一般的にはジ−デオキシヌクレオチド）と一緒に含める。ＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止性ヌクレオチドの制限組み込みは、結果として、その特定のヌクレオチドを用いる位置だけが停止されている一連の関連ＤＮＡフラグメントを生じさせる。その後、それらのフラグメントを、スラブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動、またはより一般的に今は、粘稠ポリマーが充填された細いガラス管（キャピラリー）での電気泳動によってサイズ分けする。
【００２０】
プライマーの標識付けの代案は、代わりにターミネーターを標識付けすることであり、「ダイ・ターミネーター・シークエンシング」と一般に呼ばれる。このアプローチの主な利点は、標識プライマーアプローチで必要とされる４つではなく、単一の反応で完全シークエンシングセットを行うことができる点である。これは、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素でそれぞれのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを標識することによって果たされる。この方法は、ダイプライマーアプローチより容易であり、安価であり、迅速である。
【００２１】
パイロシークエンシングは、数ある中でもＢｉｏｔａｇｅ（ロー・スループット・シークエンシング用）および４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハイ・スループット・シークエンシング用）によって商品化されている。後者のプラットホームは、単一の機械を用いて７時間のランでおおよそ１００メガ塩基をシークエンシングする。（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されている）アレイベースの方法では、一本鎖ＤＮＡをビーズにアニールし、ＥｍＰＣＲによって増幅する。その後、これらのＤＮＡ結合ビーズをＡＴＰの存在下で光を生じさせる酵素と共に光ファイバーチップ上のウエルに配置する。このチップ上の遊離ヌクレオチドを洗浄すると、ヌクレオチドがそれらの相補的塩基対と連結してＡＴＰが作成されるので、光が生成される。１つ（以上）のヌクレオチドの付加の結果、光シグナルを発生させる反応が生じ、この光シグナルがその計器内のＣＣＤカメラによって記録される。シグナル強度は、１回のヌクレオチドフローで組み込まれるヌクレオチド、例えばホモポリマーストレッチ、の数に比例する。
【００２２】
現行シークエンサー（Ｓｏｌｅｘａ、４５４、Ｓｏｌｉｄ）は、シークエンシングチップまたはビーズ上にターゲット配列を捕捉して増幅した後、シークエンシングする。次世代一分子シークエンシングは、捕捉後の増幅を用いない。アダプター配列またはポリＡテールを捕捉に用いる。あるいは、捕捉工程がないことがある。その代り、（例えば、）捕捉されたポリメラーゼを使用して、通過オリゴヌクレオチドを捕捉し、シークエンシングすることができる。
【００２３】
４５４またはＳｏｌｅｘａによるシークエンシングは、ＤＮＡのランダムフラグメント化によって果たされるライブラリー調製、続いて共通アダプター配列のインビトロライゲーションを概して含む。ｑＮＰＳについては、ＤＮＡのランダムフラグメント化工程を迂回することができ、アダプター配列のインビトロライゲーションは、ヌクレアーゼ保護プローブへのものである場合もあり、またはヌクレアーゼ保護プローブのため遺伝子タグもしくは実験用タグへのものである場合もある。ＳｈｅｎｄｕｒｅおよびＪｉ（２００８）は、シークエンシング方法を総説しており、以下は、４５４およびＳｏｌｅｘａシステムの簡単な要約である。４５４およびＳｏｌｅｘａについては、それぞれエマルジョンＰＣＲまたはブリッジＰＣＲを用いる、シークエンシングフィーチャーとして役立つクローン的クラスター化アプリコンの作成。これらの方法に共通することは、任意の所定の単一ライブラリー分子に由来するＰＣＲアンプリコンが、最終的に、平面支持体上の単一の位置（Ｓｏｌｅｘａ、インサイチューポロニー、ブリッジＰＣＲ）、または回収してアレイにすること（エマルジョンＰＣＲ）ができるマイクロメートルスケールのビーズの表面（４５４、エマルジョンＰＣＲ）、いずれかに空間的にクラスター化されることである。前記シークエンシングプロセス自体は、酵素由来の生化学と画像化に基づくデータ獲得との交互サイクルから成る。これらのプラットホームは、合成によるシークエンシング、すなわちプライマー処理テンプレートの連続伸長、に依存する。酵素的インターロゲーションと画像化の連続反復を用いて、それぞれのアレイフィーチャーについての連続シークエンシング読み取りを蓄積する。それぞれのサイクルでの全アレイの（例えば、ポリメラーゼによって組み込まれた蛍光標識ヌクレオチドの）画像化によって、データを獲得する。
【００２４】
４５４については、シークエンシングプライマーを万能アダプターに、未知配列またはｑＮＰＳシークエンシング可能付加生成物、例えばヌクレアーゼ保護プローブまたは遺伝子もしくは実験用タグ、の始点に隣接する適切な位置および配向でハイブリダイズさせる。アンプリコン担持ビーズをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ポリメラーゼおよび一本鎖結合タンパク質と共にプレインキュベートし、その後、ピコリットルスケールウエルの微細化アレイ上にウエルあたり一ビーズで置き、それによってこの生化学をアレイベースのシークエンシングと互換性のあるものにする。パイロシークエンシングにも必要とされる固定化酵素（ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）を担持する、より小さいビーズも添加する。シークエンシング中、その準順序アレイの一方の側面は、シークエンシング試薬を導入および除去するためのフローセルとして機能する。他方の側面は、ＣＣＤベースのシグナル検出のための光ファイバー束に結合している。それぞれのサイクルで、一種類の非標識ヌクレオチドを導入する。この導入が組み込みを生じさせる結果となる配列については、ピロリン酸塩がＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって遊離されて光のバーストを発生させ、それをＣＣＤによって特定のアレイ座標について検出する。多数のサイクルにわたって、検出される組み込み事象のパターンが、個々のビーズによって表されるテンプレートの配列を明らかにする。
【００２５】
Ｓｏｌｅｘａについては、増幅シークエンシングフィーチャーをブリッジＰＣＲによって作成する。フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの両方がフレキシブルリンカーによって固体支持体に係留されるので、増幅中にいずれの単一テンプレート分子から生ずるすべてのアンプリコンもアレイ上の単一の物理的位置に固定化され、クラスター化されたままである。ブリッジＰＣＲは、Ｂｓｔポリメラーゼでの伸長とホルムアミドでの変性の交互サイクルに依存する点で、多少、非従来的である。結果として生ずる「クラスター」は、それぞれ、〜１，０００のクローナルアンプリコンから成る。数百万のクラスターを、単一のフローセル上にある８つの独立した「レーン」内の区別可能な位置に増幅することができる（ので、８つの独立した実験を同じ計器ラン中に並行してシークエンシングすることができる）。クラスター作成後、アンプリコンは線形化であり、シークエンシングプライマーが、関心のある領域に隣接する万能アダプター配列にハイブリダイズされる。それぞれの配列インターロゲーションサイクルは、修飾ＤＮＡポリメラーゼおよび４つのヌクレオチドの混合物での一塩基伸長から成る。これらのヌクレオチドは、３’ヒドロキシル位置の化学的切断可能部分が、それぞれのサイクルにおいて一塩基組み込みのみを発生させる点、および同じく化学的切断可能な４つの蛍光標識のうちの１つが、それぞれのヌクレオチドの素性に対応する点で、「可逆的ターミネーター」である。一塩基伸長および４チャンネルでの画像の獲得後、両方のグループの化学的切断が次のサイクルのために構成する。３６ｂｐ以下の読み取り長さが、現在、日常的に実行されている。これは、ｑＮＰＳ付加生成物についてのターゲット長を規定する（７シークエンシング開始および実験用タグ塩基、１０から１５塩基のジェネリック捕捉配列２、および５遺伝子タグ塩基）。
【００２６】
他のシークエンシング方法が開発されるまたは開発されるであろうが、当業者には、ｑＮＰＳプローブ、遺伝子タグおよび実験用タグならびに類似のシークエンシング可能付加生成物（下で論ずるとおり）がこれらのシステムでのシークエンシングに適するであろうことがわかるはずである。
【００２７】
ｑＮＰＳ
ｑＮＰＳは、ヌクレアーゼ保護工程、ならびに（必要に応じて）保護しているターゲット分子からヌクレアーゼ保護プローブを解離させる、およびＲＮＡの場合にはＲＮＡターゲットを加水分解する、塩基での処理を用いることにより、組織溶解産物（または精製されたＲＮＡもしくはＤＮＡ）からの不安定なＲＮＡまたは他のターゲット分子を、架橋されているときでさえ、捕捉または分離を伴わずに溶解状態で回収することができる安定な一本鎖ＤＮＡターゲット（ヌクレアーゼ保護プローブ）に化学量論的に変換するために定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを用いる、シークエンシングに対する基本的に異なるアプローチである。Ｓ１ヌクレアーゼ加水分解後に残存するヌクレアーゼ保護プローブの量を、その後、シークエンシングによって決定し、このシークエンシングは、該プローブ自体のシークエンシングおよび言及した部分的プローブ配列の検出を含む場合がある。現在、このヌクレアーゼ保護アッセイの生成物（一般に、ｑＮＰＡＴＭと呼ばれる、Ｈ．Ｔ．Ｇ．，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ ８５７０６）は、高感度のアレイベースの読み出しを用いて測定されており、このようにしてそれぞれのターゲット遺伝子のレベルの測定値を提供している。例えば、米国特許第６，２３２，０６６号、米国特許第６，２３８，８６９号、ＷＯ ２００８−１２１９２７を参照のこと（これらは、それら全体が参照により本明細書に援用されている）。多数の出版物にもｑＮＰＡの用途が記載されている（Ａｌｔａｒら、２２０８および２００９、Ｋｒｉｓら、Ｍａｒｔｅｌら２００２および２００４、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｒｉｍｓｚａら、Ｓａｗａｄａら、ならびにＳｅｌｉｇｍａｎｎら）。ｑＮＰＳアッセイを多くの異なる方策で構成することができるが、すべてが、シークエンシングされる中心的付加生成物としてヌクレアーゼ反応（例えば、Ｓ１消化）を生き残るＮＰＰを生成する概念、またはＮＰＰもしくは言及した残存ヌクレアーゼ保護プローブ配列および従ってターゲット遺伝子を特異的に同定および定量するためにその一部もしくはすべてをシークエンシングすることができる付加生成物を生産する概念を用いる。前記プロセスは、ヌクレアーゼ保護プローブによって測定されるターゲット遺伝子部分のまたは同じ遺伝子をターゲットにする多数のヌクレアーゼ保護プローブ間の任意の変化の存在も同定する。
【００２８】
ｑＮＰＳアッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の生成は、ｑＮＰＡについて発表された方法（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００７；Ｍａｒｔｅｌら２００２および２００４）と同様の、図１に図示するように行われる。このアッセイは、異なるターゲットそれぞれに対して特異的であるように設計された１つ以上の異なるヌクレアーゼ保護プローブを含む。従って、１００の遺伝子の測定には、１００の異なるヌクレアーゼ保護プローブ、遺伝子１つにつき１つ、または数百の異なるＮＰＰ、幾つか／遺伝子、の設計および合成が必要である。これらは、最も好ましくはＤＮＡから構成され、長さが約１０から約１００または約２００以上の塩基であり得るが、さらに好ましくは長さが２０から７５塩基、および最も好ましくは長さが２０から５０塩基であり得る。図１工程１は、サンプルとヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）への溶解試薬の大過剰での添加を図示する。この図には、一種類のターゲット分子（ＲＮＡ）およびヌクレアーゼ保護プローブしか図示されていないが、１つのＲＮＡターゲット分子は組織に架橋しているように（「Ｘ」により）示されており、もう１つは可溶性であるように示されている。抽出された（または精製された）ＲＮＡまたは他のターゲット分子でこのアッセイをランすることもできる。前記プローブは、ターゲット分子に特異的であり、同様のＴｍを有するが、シークエンシングによってこれらのプローブを区別することを可能にするために十分一意的な配列を有するように、または遺伝子タグを取り付けるための特異的ハイブリダイゼーションを支持するように設計される。サンプルを好ましくは９５℃付近または約１０５℃でおおよそ１０分間加熱してターゲット分子を変性させ、それによってそれらを一本鎖にし、ハイブリダイゼーションに利用できるようにする。温度とバッファー組成物の組み合わせが一本鎖ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡの形成につながらない限り、異なる変性溶液を使用してこの変性温度を変更することができる。次に、サンプルを指定温度で一定の期間（例えば、５０−ｍｅｒヌクレアーゼ保護プローブについては、６０℃で６時間）インキュベートして、ターゲット分子へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）またはヌクレアーゼのカクテルを添加し、インキュベーションを（例えば、５０−ｍｅｒヌクレアーゼ保護プローブについては５０℃で６０分間）行い、この時間の間に、ヌクレアーゼは、ターゲット分子にハイブリダイズしていない（および従って未保護である）すべての過剰なヌクレアーゼ保護プローブ、サンプル中のすべての非ターゲット分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、およびターゲット分子のオーバーハング一本鎖領域を破壊し、ならびに所望される場合には、ターゲット配列と対合していない塩基でそのプローブを切断し、それによって理論量のターゲット分子／ヌクレアーゼ保護プローブデュプレックス（工程２）または部分的プローブデュプレックス（言及した非対合が存在する場合）が残る。下記参照。この図において、「Ｘ」は、固定から起こる組織へのターゲット分子の架橋を表す。ヌクレアーゼ保護プローブは、架橋を逆転させる必要なく架橋ターゲット分子にハイブリダイズする。非対合塩基をもたらす単一ヌクレオチドの差が切断されないように条件を選択することができ、またはハイブリダイズしたヌクレアーゼ保護プローブの端までの非対合塩基だけを切断するヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼを使用することができる。
【００２９】
ヌクレアーゼ処理後、前記プローブは、架橋ターゲット分子配列と依然として会合していることがある。しかし、工程３において塩基を添加し、サンプルを９５℃に加熱する。これは、ターゲット分子／ヌクレアーゼ保護プローブ二量体を解離させ、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブが一本鎖状態で残り、およびＲＮＡの場合にはＲＮＡターゲット分子を加水分解する。
【００３０】
ｑＮＰＳの場合、この時点の後の工程は、ヌクレアーゼ保護プローブがどのようにシークエンシングされることになるのかによって、様々であり得る。ＮＰＰから形成される異なる付加生成物を連続図で図示する。遺伝子タグおよび実験用タグを使用すべきでない場合には、プローブを、シークエンシングシステムに適するアダプター分子と直接ライゲートすることができ（または例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｔｄｔ、を使用して、ポリＡテールを付加させることができ）、およびシークエンシングに用いることができる（図２Ａ）。図１（工程４から８）および図２は、ハイブリダイゼーションを可能にする温度でのそれぞれのヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰量のタグリンカーの添加（およびとのインキュベーション）を図示する。幾つかの可能なシークエンシング可能付加生成物をタグリンカーの使用に基づいて形成することができる。例えば、タグリンカーの２５塩基を、１つの特異的ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端と相補的であるように設計することができ、従って、それらはそのプローブにハイブリダイズすることとなる（工程４）。前記タグリンカーの残部を、遺伝子タグ配列（図２Ｂ）および／または（場合により）実験用タグ配列のジェネリック（もしくは実験特異的配列）部分（図２Ｃ）、または実験用タグのジェネリック（もしくは特異的）部分のみ（図２Ｄ）を、過剰量のこれらのタグの添加（図１工程５）、続いての、タグリンカーへのそれらのハイブリダイゼーションを可能にする温度でのインキュベーションの後にハイブリダイズする（および従って、ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に捕捉する）ように設計することができる。これらの工程を組み合わせることができ、または別々に行うことができることに留意すること。シークエンサーが、シークエンシングすべき分子の一端または両端にアダプター捕捉配列を必要とする場合、タグリンカーをヌクレアーゼ保護プローブの完全長に、およびさらにその（例えば、５’）アダプター配列に相補的である配列を含むように、伸長することができる。しかし、さらに好ましくは、ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端にハイブリダイズする、および５’アダプター配列に相補的である配列を含有する、第二アダプターリンカーを付加させ（工程６）、その後、そのアダプター配列を付加させる（工程７）。この同じ場合、遺伝子タグまたは実験用タグを、どちらが３’の最後から二番目の（ｐｅｎｔ−ｕｌｔｉｍａｔｅ）配列であろうと、シークエンシングのために３’アダプター配列と共に合成することができる。完全付加生成物を一緒にハイブリダイズした後、角矢印によって図１（工程８）および図２に図示するように、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ（または例えばＰｉｎｏら、Ｌｕｔａｙら、Ｓｃｈａｂａｒｏｖａら、または米国特許第７，０３３，７５３号によって記載されているような、非酵素的化学）を用いて、配列を互いにライゲートして、完全シークエンシング可能付加生成物を形成することができる。この方法において、シークエンシングされることとなるターゲットＲＮＡ、ＤＮＡなどに由来するすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび（例えば、酵素的または非酵素的）ライゲーションによって組み立てされたならびにアダプター配列または（例えば酵素的）ポリアデニル化によってシークエンシングチップ上への捕捉用に調製された合成物である。図示されているシークエンシング可能付加生成物はＮＰＰを含有するが、当業者には、その代わりにタグリンカー含有付加生成物をシークエンシングされる付加生成物として調製（シークエンシング可能付加生成物として調製）できること、または破壊されないならば、ターゲットオリゴヌクレオチドをシークエンシング可能付加生成物として調製できることがわかるであろう。ターゲットオリゴヌクレオチドが、シークエンシングされる、またはシークエンシング可能付加生成物を含む場合には、ＮＰＰは、シークエンシング不能成分（ｎｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、例えばＬＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ペプチド核酸、アプタマーなど、から成り得る。両端にアダプターを有するシークエンシング可能付加生成物を、それが（例えば、第二ヌクレアーゼ反応によって）切断されると２つのシークエンシング可能付加生成物をもたらすように、調製することができる。
【００３１】
シークエンシング可能付加生成物にポリＡ（またはポリＴ）捕捉配列を取り付ける方策は非常に沢山ある。１つは、（例えば、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｔｄｔ、を使用して）酵素的にである。もう１つは、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションによる。三番目は、単純に、シークエンシング可能付加生成物を停止させる３’オリゴヌクレオチド上への合成による。理想的には、シークエンシング可能付加生成物のみをシークエンシング媒体に結合させ、副生成物を削除する。例えば、図３または４に図示するアダプター配列は、ポリＡであり得、クリーンアップは、ゲルまたはヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）により得る。ヌクレアーゼクリーンアップの場合、保護用配列は、ポリＴを含有するだろう。
【００３２】
実験用タグの使用は、あるサンプルと別のものとの区別である。工程１から５は、それぞれのサンプルについて別個のアッセイ（例えば、マイクロプレートの別個のウエル）の中で行われるだろうが、タグリンカーは、実験用タグのジェネリック配列も捕捉するように設計されており（図２Ｃ参照）、該実験用タグ（例えば、３’アダプター配列も含有する）は、工程５の後に付加されることとなり、その後、工程６から８まではすべて、別個の実験または別個の患者サンプルをはっきり区別する別個の反応容器内で行われる。それぞれの実験用タグに付加されるジェネリック配列ではなく特定の実験用タグ配列に対する相補的配列を含有する種々のタグリンカーを実験用タグごとに合成し、それによって実験用タグの長さをちょうどその実験特異的配列に短縮することができることは、当業者にはわかるはずである。実験用タグ（または遺伝子タグと実験用タグ）のライゲーション後、実験用タグの配列により、そのシークエンシングされた付加生成物がどの反応に、またはどの患者に由来するかが同定されるであろうから、別個のサンプルを併せることができ、そのため、ゲル精製（または実際の分離を必要としない他の精製またはクリーンアップ方法）の場合には、シークエンシングラン１回につき１つのゲル（またはクリーンアップまたは精製反応またはプロセス）しかランする必要がない。
【００３３】
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでのライゲーションは、作用する５’リン酸塩を必要とする。概して、オリゴヌクレオチドは５’リン酸塩なしで合成されるが、合成中に５’リン酸塩を付加させることができる。従って、アダプターリンカーおよびタグリンカーを、互いに接しているが５’リン酸塩がないように合成すると、それらは互いにライゲートされることとならず、その結果、例えばその後のクリーンアップが助長される。（合成に加えて）リン酸塩をオリゴヌクレオチドに付加させるもう１つの方策は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰの使用である。
【００３４】
非酵素的方法をはじめとする他のライゲーション方法を用いてもよい。しかし、ライゲーションは、必須工程ではない。ＮＰＰのタグリンカーおよびタグとのハイブリダイゼーション（すなわち、ヌクレアーゼ保護プローブの一部として組み込まれたタグを相補的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｏｅｏｔｉｄｅ）によって保護することができる場合）が、ヌクレアーゼ耐性であるまたは精製可能である複合体を形成する場合、ライゲーションは必要ない。前記タグが既にＮＰＰに組み込まれており、ＮＰＰおよび従ってターゲットＤＮＡまたはＲＮＡの量を反映することとなるからであり、ならびにＮＰＰが、および従って、シークエンシングされたときはターゲットＤＮＡ／ＲＮＡが、シークエンシングの時点でそれがＮＰＰから分離されていなかったとしても、前記タグにより同定されることとなるからである。
【００３５】
前の工程すべてが、ゲル精製または他の分離方法（分離が必要または所望される場合）まで分離のない、試薬添加およびインキュベーションを表す。過剰量のそれぞれの試薬が反応混合物中に残存し（例えば、図１のそれぞれの成長付加生成物の左側に図示するとおり）、不完全付加生成物、例えば、ヌクレアーゼ保護プローブではなくタグ分子とタグリンカーのハイブリダイゼーションからの結果、またはアダプター分子のアダプターリンカーへの、しかしまたヌクレアーゼ保護プローブを含まない複合体での、ハイブリダイゼーションからの結果、も残存する。この時点で、幾つかの次の工程が可能であり、それらのうちの１つだけを図示する（ゲル精製）。
【００３６】
好ましい次の工程は、シークエンシングビーズまたはチップ上への捕捉前の混合物のクリーンアップである。ヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズするアダプターリンカーおよびタグリンカーの配列を幾つかの塩基によって分離する場合（付加生成物組み立て後に酵素的にリン酸塩を付加させる場合）、またはそれらが（それらが互いに接していたとしても）リン酸化されない場合、それらは互いにライゲートされないだろう。その後、すべての実験物または患者サンプルの反応混合物を一緒にプールし、加熱してまたは別様に変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを作り、そのシークエンシング可能付加生成物を、例えばその相当長い長さに基づいてゲル電気泳動によって、精製することができる。当該技術分野において公知のまたは当該技術分野から適応されるクリーンアップを果たすための他の手段を利用することもできる。
【００３７】
図２Ｂから２Ｅは、アダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。代わりに、それらをこれらの配列を用いず、シークエンシングチップ上への何らかの他の捕捉形態、またはシークエンシングのための調製を用いて調製してもよい。例えば、代わりに、ポリＡテールをシークエンシング可能付加生成物の３’末端に合成してもよい。相補鎖をポリアデニル化しないことを所望する場合には、例えば、３’アミノ残基または３’炭素（例えば、Ｃ３）スペーサーを有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、その配列の３’末端をブロックすることができる。これは、シークエンシング可能付加生成物の一部としてのターゲットそれ自体またはターゲットの生合成誘導体ではなく、シークエンシング可能付加生成物を調製するために合成配列を使用することの利点である。一部のシークエンシングシステムは、例えば、係留されたポリメラーゼもしくはオリゴヌクレオチド結合部分によって、あるいは化学的または電気もしくは電気化学的手段によって、シークエンシング可能付加生成物を直接捕捉することができ、従って、このシークエンシング可能付加生成物は、特異的アダプターまたは捕捉配列もしくは部分を必要としない。
【００３８】
シークエンシングのための反応生成物の好ましいクリーンアップ方法は、第二ヌクレアーゼ消化を、例えば再びＳ１ヌクレアーゼの使用により、行う方法である。実験用タグ／アダプター配列をライゲーション前に付加させる１つの事例において、ならびにアダプターリンカーおよびタグリンカー（一方の５’末端がリン酸化されている）を互いに接するように設計し、相補的３’実験用タグ／アダプター配列を、実験用タグ／３’アダプター配列へのハイブリダイゼーション後にそれをタグリンカーにライゲートすることができるように付加させる場合、ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物とリンカー／保護用相補的配列（それぞれ）の両方が、該リンカーが該ヌクレアーゼ保護プローブを会合すると、互いにライゲートして、互いにハイブリダイズした２つの完全付加生成物を形成することとなる（図３Ａ）。これら２つの付加生成物より短いすべての付加生成物の解離をもたらす温度でのＳ１ヌクレアーゼでの処理は、すべての他の化学種（それらの一部を図３Ａに図示する）を破壊し、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブを含有するシークエンシング可能付加生成物、およびリンカー付加生成物だけが残る。変性されると、適切な捕捉アダプター配列を有する付加生成物（ヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物）のみがシークエンシングチップまたはビーズ上に捕捉されることとなり、リンカー含有付加生成物は、洗い落されることとなる。この「二重Ｓ１」アプローチの利点は、付加生成物がシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されるまで分離工程がない点である。図４Ａは、タグリンカーが、実験用タグ（ＥＴ）可変配列（ＶＳ）（シークエンシングされたときにそのウエルまたは実験を一意的に同定する配列）に相補的な残基にイノシンを含有し、および次に３’アダプターに相補的な配列（３’Ａｃｏｍｐ）を含有する、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物を形成するための異なるスキームを図示する。この同じイノシン含有リンカーを、上で説明したシークエンシング可能付加生成物（図１および２）を形成するために、および（アダプター配列の使用ではなく）ポリアデニル化を必要とする場合に、あるいはゲル精製または他の分離もしくは精製方法を用いる場合に、使用することができるだろう。図４Ｂは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、５’アダプタータグ／タグリンカー／３’アダプター相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。Ｈｅｌｉｃｏｓ一分子シークエンシング法などの、増幅を必要としないシステムを用いるシークエンシングの場合、ポリＡテールを取り付ける必要があり得る。図４ＣおよびＤは、クリーンアップのためにゲル精製を（例えば、ポリアデニル化前に）用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。両方の場合、ＮＰＰ自体をシークエンシングしないので、適切な遺伝子タグおよび実験用タグをＮＰＰにハイブリダイズさせてそれらを互いにライゲートできるようにするためにタグリンカーしか必要としない。ヌクレアーゼ工程後、ポリＡテール（ｔｒａｉｌ）を３’末端に酵素的に合成する。これは、結果として、タグリンカーの３’末端でポリＡテールを合成させることができるので、それもシークエンシングされることとなり、またはタグリンカーの３’末端がブロックされている場合には、ポリＡテールがＮＰＰ含有付加生成物上でのみ合成されることとなる。ＮＰＰを全部または一部シークエンシングして、ターゲット遺伝子を同定する場合；ポリＡテールまたはアダプター（必要に応じて）をＮＰＰに直接取り付けることができ、または実験用タグおよび／またはタグリンカーによって取り付けてそれらのシークエンシングを可能にすることができる。ＮＰＰがターゲット（例えば）ＤＮＡにハイブリダイズする場合、およびそのシステムがＮＰＰの直接シークエンシングを用いる場合、ＮＰＰ保護（例えば、ＤＮＡ）ターゲット配列もシークエンシングすることができ、ならびにＮＰＰと同時におよび同じ様式でのシークエンシングのために修飾することができる。同様に、ＮＰＰを含有するシークエンシング可能付加生成物を形成するように構築された一切の相補的リンカーを並行して処理することができ、シークエンシング可能付加生成物に変換することもできる。これらの事例では、その後２つの相補的配列を検出、同定および計数することとなり、その結果、プロセスに一定のレベルの冗長性がもたらされる。
【００３９】
当業者は、シークエンシング前に反応混合物をクリーンアップするための他の方法、例えば、ゲル精製、またはビオチン／アビジン捕捉および遊離、またはキャピラリー電気泳動、または多数の分離もしくはクリーンアップ方法のいずれかの使用、を考え出すことができる。例えば、シークエンシングのために、ヌクレアーゼ保護プローブをビオチン化しまたはヌクレアーゼ保護プローブに他のハプテン（ｈａｐｔａｎ）を取り付け、アビジンまたは抗ハプテン（ｈａｐｔａｎ）被覆ビーズまたは表面に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。同様に、シークエンシングのために、ライゲートされたヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物を相補的オリゴヌクレオチド上に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。前記捕捉オリゴヌクレオチドは、特に特異的である必要はない。ｑＮＰＳプロセスは、ゲノムまたはトランスクリプトームの大部分を排除し、ターゲットにハイブリダイズされたＮＰＰのみを残すからであり、および特異性がシークエンシングレベルで決定されることとなるためである。
【００４０】
当業者は、ヌクレアーゼ保護プローブを含有する付加生成物ではなく、リンカー複合体をクリーンアップし、シークエンシングできることもわかるはずである。従って、シークエンシング可能付加生成物は、ＮＰＰにハイブリダイズするものである場合があり、またはＮＰＰに由来する。これらの付加生成物の２つの例を図５に図示するが、他のものを構成してもよい。図５Ａは、前の図および論述と同じＮＰＰを使用を図示するものであるが、この場合は、３’アダプターとＮＰＰに対する相補的配列とオーバーハング遺伝子タグ配列とを含有するオリゴヌクレオチドを付加させ、このオーバーハング遺伝子タグ配列は、ジェネリック配列内で終わり、そしてまたそのジェネリック配列が実験用タグリンカーを捕捉する。そしてまた、この実験用タグリンカーが、５’アダプター配列も含有する実験用タグを捕捉する。ヌクレアーゼクリーンアップを用いることとなる場合、保護用５’アダプター配列プローブを付加させる必要がある。ポリＡテールをシークエンシングに必要とする場合には、前記アダプター配列を必要としないので、含める必要がない。図５Ｂは、３’から５’へのものであるヌクレアーゼ保護プローブの使用を図示する。この構築物は、前の図に図示した、または前の論述の中で説明した、および後で言及する、任意の付加生成物のために用いることができる。遺伝子タグを使用するのではなく、ＮＰＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、リンカー）の部分をシークエンシングして遺伝子を同定してもよい。当業者には、ＮＰＰを含有するまたはしないシークエンシング用の付加生成物いずれかを生じさせる結果となるプローブのこれらの配置に関する非常に多くの変形および組み合わせがあることがわかるであろう。
【００４１】
シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物であって第二ヌクレアーゼ反応からの生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、１つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。シークエンシング可能付加生成物を含む、またはシークエンシング可能付加生成物の組み立てに使用される、合成オリゴヌクレオチドを、ポリＡ配列のライゲーションまたは付加などの酵素的または非酵素的修飾を可能にするように、または可能にしないように、調製することができる。それらは、天然または非天然ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸、またはＬＮＡ、またはペプチド核酸、またはＰＮＡなど）を含有する場合がある。シークエンシング前にそれらを溶液中でのもしくは表面上での増幅に付すことができ、またはヌクレアーゼ保護工程の前に増幅を行うことができる。
【００４２】
４５４またはＳｏｌｅｘａプラットホームでのシークエンシングについては、シークエンシング可能付加生成物を、先ず、捕捉および増幅しなければならない。これは、概して、ポリメラーゼ反応を必要とする。ｑＮＰＳに使用される典型的な溶解バッファーは、Ｓ１活性を可能にする上に、ヌクレアーゼを変性してＲＮＡの破壊を防止するように、およびハイブリダイゼーションを助長するように設計されたものである。このタイプの溶液は、ポリメラーゼ活性を阻害することができ、従って、チップを最初に洗浄しない限り増幅を阻害することができる。洗浄を用いて、捕捉アダプター配列を有さないヌクレオチドを除去することもできる。
【００４３】
シークエンシングが捕捉のためにポリＡテールを利用する場合、これは、３’末端でポリＡ残基を伸長するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）を使用してクリーンアップ後に合成することができる。リンカー含有付加生成物、またはシークエンシングを意図していない付加生成物、の３’末端がポリＡテールで伸長されないようにするために、タグリンカーの３’残基を、ポリアデニル化を支持しない残基または修飾残基で修飾することができる（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００４４】
ヌクレアーゼ保護プローブを含有する適切に設計された付加生成物および他の情報含有配列でのリバースシークエンシングを用いることができること、または前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物の代わりに、ヌクレアーゼ保護プローブに対する相補的配列（場合によっては「リンカー」と呼ばれる）および付加生成物構築物を、該相補的付加生成物が適切に設計されている限り（例えば、図５参照）、または例えば本出願において前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物について記載するように、シークエンシングすることができることは、当業者にはわかるはずである。
【００４５】
９５℃での（例えばｑＮＰＡ）溶解バッファー中でのインキュベーションは、ＲＮＡをハイブリダイゼーションに利用できるようにするが、この溶解産物のＰＣＲは、結果としてＤＮＡの増幅を生じさせる場合があり、これは、溶解産物中にゲノムＤＮＡがある場合があり、まさしく、ＮＰＰのハイブリダイゼーションのために十分に変性されないことを明示する。１０５℃でのインキュベーションは、ゲノムＤＮＡをＮＰＰプローブハイブリダイゼーションに利用できるようにする。１０５℃でインキュベーション後のＳ１（ヌクレアーゼ）プロセッシングは、すべてのハイブリダイズしていないＤＮＡならびにハイブリダイズしていなＲＮＡおよびＮＰＰを破壊する。ＮＰＰの３’または５’配列に相補的な配列を有する適切に設計されたリンカープローブの使用により、アダプターを一本鎖ＮＰＰにハイブリダイズし、ライゲートするため、Ｓ１加水分解を逃れるいずれの（例えば、二本鎖）ＤＮＡ（またはさらに言えばＲＮＡ）も、それらにライゲートされたアダプターを有するはずがなく、従って、４５４およびＳｏｌｅｘａタイプのシークエンサーによって用いられるシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されないだろうし、シークエンシングされないだろう。ＮＰＰ相補的オリゴヌクレオチドをシークエンシングする場合には、少なくとも１つのアダプターをその配列の一部として直接組み込むことができ、従って、アダプター配列が、Ｓ１加水分解を逃れたかもしれないＤＮＡにライゲートされる可能性はない。ゲル（または他の）精製では、ＤＮＡを、ライゲートされた付加生成物から分離することができ、従って、シークエンシングの前に除去することができる。ポリＡテールを実験用タグに（または実験用タグを使用しない場合には遺伝子タグに、または実験用タグおよび遺伝子タグを使用しない場合にはＮＰＰに）付加させる一分子シークエンシングについては、いずれのＤＮＡも、シークエンシング付加生成物のゲル精製を用いる場合のようにそれが最初に（ポリアデニル化前に）分離されない限り、または例えば、例えば１０５℃での溶解、続いてＮＰＰハイブリダイゼーションおよびその後、適切な条件下でのヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）工程を用いる場合のように最初に破壊されない限り、ポリアデニル化することができる。このプロトコルでは、ＮＰＰがｍＲＮＡのスプライス接合部をターゲットにできるため、（ｍＲＮＡの測定に干渉し得る）ＤＮＡは測定されないだろう。
【００４６】
ｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）も測定できるが、この場合、ＮＰＰは、ｍｉＲＮＡ長にマッチする（例えば）約２２塩基の長さしかないであろう。メチル化が起こったまたは起こっていない部位に塩基ミスマッチを作ることにより、および相補的イノシン残基の賢明な使用により、ミスマッチ塩基残基を切断するさらなるヌクレアーゼまたは制限酵素の使用により、ＤＮＡメチル化ばかりでなくＤＮＡおよび発現されたＳＮＰも測定することができる。ＮＰＰによって保護されたこれらの付加生成物の直接シークエンシングも可能である。例えば、ＳＮＰが発生し得る配列に対するＮＰＰの使用；一塩基ミスマッチが切断されない条件、およびその後、生き残ったＤＮＡターゲット配列をハイブリダイゼーションのＴｍより上でのインキュベーションによりＮＰＰから解離させることができる条件下でのＳ１で処理；続いて、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズしてアダプターの適切な付加を可能にする大過剰のリンカーの添加（解離されたＮＰＰは、この大過剰のリンカーによって再会合が競合的に防止されることとなる）などによって、ＤＮＡ ＳＮＰをシークエンシングして、ターゲットＤＮＡ自体を、所望される場合には実験用タグと共に、含むシークエンシング可能付加生成物を作ることができる。この修飾では、ＮＰＰは、第一ヌクレアーゼ工程中、ターゲットＤＮＡを確実に保護するために保護された配列内にＳＮＰ部位または多数のＳＮＰもしくは突然変異部位に相補的なイノシン（単数もしくは複数）を含有することがあり、および同様に、ヌクレアーゼクリーンアップ工程を用いる場合、リンカーオリゴヌクレオチドは、確実に保護するためにイノシンを含有することがある。あるいは、突然変異している可能性のある塩基（単数または複数）を有するＮＰＰプローブを使用することができる。加えて、野生型配列ＮＰＰをヌクレアーゼによりＳＮＰまたは突然変異ミスマッチで切断するとき、ＮＰＰの特定の配列をプロセッシングし、シークエンシングして、突然変異の存在および位置を同定することができる。いずれのミスマッチも（例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、またはエンドヌクレアーゼであまりストリンジェントでない条件により、または決断に多数の隣接ミスマッチを必要とするヌクレアーゼを使用することにより）切断および加水分解されない条件下で、ターゲット（例えば、ＤＮＡ）含有突然変異領域を選択するためにＮＰＰを使用する場合には、そのターゲット（例えば、ＤＮＡ）をプロセッシングし、シークエンシングして、その突然変異を正確に決定することができる。
【００４７】
シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためにアダプターとして使用することができる、または遺伝子タグもしくは実験用タグとして役立つ、非ターゲットオリゴヌクレオチド配列をＮＰＰに、それを合成する際に、直接組み込むことも可能である。この非ターゲット配列は、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズせず、通常はヌクレアーゼによって切断されるだろう。しかし、ＮＰＰのこの非ターゲット配列と相補的オリゴヌクレオチドを（ヌクレアーゼ工程の前だが、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有するサンプルにＮＰＰを付加させる前、付加させると同時、または付加させた後、いずれかに）ハイブリダイズさせる場合には、ヌクレアーゼで処理するとき、すべての塩基が相補的塩基にハイブリダイズされるので、非ターゲットＮＰＰ配列を保護し、ＮＰＰは、インタクトなままであろう。ＮＰＰの核酸ターゲット配列と非ターゲット配列の間に単一のハイブリダイズされていない塩基があったとしてもこれが当てはまるように、条件を修飾することができる。この方法は、ライゲーション反応を一切用いずにシークエンシングチップ上に捕捉し、シークエンシングすることができる直接シークエンシング可能なＮＰＰ付加生成物を、必要とされるアダプター配列を取り付けて、生産することができる。当業者は、短い非ターゲット配列／相補的配列デュプレックスを除去するためにシークエンシング前に反応をクリーンアップする方法を設計することができる。例えば、塩基中でヌクレアーゼ後サンプルを加熱してデュプレックスを解離させ、その後、ＮＰＰの非ターゲット配列と核酸ターゲット特異的配列の一部（例えば、最初の２５塩基）とに相補的である、過剰なオリゴヌクレオチドを添加する。その後、この長いほうのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズできるが、短いほうの非ターゲット配列相補的オリゴヌクレオチドはできない温度でハイブリダイズを行うと、第二ヌクレアーゼ反応後、核酸ターゲットにハイブリダイズしたＮＰＰのみを含有する調製品が得られる。その後、これを加熱してその解離を生じさせて、シークエンシングチップに付加させることができ、そこでそのアダプター配列によってそれを捕捉し、シークエンシングすることができる。
【００４８】
感度増加が望まれる場合、ターゲットオリゴヌクレオチドまたはそれに由来する生成物を増幅することができ、またはＮＰＰ生成物を先ずＰＣＲもしくは他の形態の酵素的増幅に付すことができる。その後、その得られた生成物を、非増幅ＮＰＰ生成物と同じ様式でシークエンシング用に調製することができ、または増幅プロセス中に遺伝子タグおよび／もしくは実験用タグ、および／もしくはアダプター配列を、例えばプライマーおよび伸長構築物の一部として組み込むことができる。増幅を必要としないときであっても、１または２サイクルのＰＣＲまたは酵素的反応を行って、遺伝子タグ、および／または実験用タグ、および／またはアダプターを取り付けることができる。その後の生合成工程（単数または複数）によってＮＰＰから作成される付加生成物も、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物またはＮＰＰに相補的な付加生成物の作成について説明したものなどのハイブリダイゼーション反応によって、完成させることができる。クリーンアップは、ゲルもしくは他の精製方法による場合があり、あるいは十分に保護して、その後のＳ１（もしくは他のヌクレアーゼ）反応または当該技術分野において公知のもしくは当該技術分野から適応される他の手段による場合がある。
【００４９】
もう１つのタイプのＮＰＰは、Ｐａｄｌｏｃｋ（ＰａｄＰ）または環状ＤＮＡプローブに類似した（例えば、ＢａｎｅｒらまたはＰｒｉｎｓらによって記載されている構築物に類似した）、環状プローブである。ＰａｄＰシークエンシング可能付加生成物を図９に図示する。このＰａｄＰ構築物は、サンプル中のターゲットへのプローブのハイブリダイゼーション後に（例えば）エキソヌクレアーゼを使用しても切断されない、アダプターおよびタグを含有するように構築することができる。例えば、ＰａｄＰプローブは、５’アダプターを含有し、およびターゲットにハイブリダイズする約１０から約３０または約５０または約１００または約２００塩基をその３’末端に含有するように合成することができる。スペーサー領域、次に制限ヌクレアーゼ部位、次に５’遺伝子タグ、次に、ライゲーションを支持するためにその５’末端がリン酸化されている、ターゲット（別の約１０、または約３０、または約５０または約１００または約２００塩基）にハイブリダイズするＰａｄＰプローブの残部があり得る。従って、ターゲットにハイブリダイズすると（工程１）ＰａｄＰプローブの２つの半分がライゲートされて環状ＤＮＡを形成することができる。サイクリングにより、これを増幅することができる（工程２）。ライゲーション後、そのミックスを約９５℃に加熱して、環状プローブをターゲット（例えば、ＲＮＡ）から解離させることができ、その後、温度を低下させて、過剰なプローブを、この場合は増幅テンプレートとして役立つターゲット（例えば、ＲＮＡ）に再びハイブリダイズさせることができ、その後、ライゲーションの後、温度を再び上昇させて、約３０サイクルの１シリーズにつき約３０コピーの環状プローブ／ターゲットテンプレートＲＮＡを生成する。工程３では、エキソヌクレアーゼを使用して、過剰なＰａｄＰを含めてすべての線状ＤＮＡ（および例えばターゲットＲＮＡ）を破壊し、環状ＰａｄＰプローブのみを残す。工程４は、所望される場合には実験用タグを付けるプロセスを開始し、先ず制限酵素で処理して環状ＤＮＡプローブを開き、次にタグリンカーを使用して実験用タグをハイブリダイズし、ライゲートさせる。ＰａｄＰプローブを形成するために用いる実験条件は説明した。
【００５０】
直接シークエンシングすることができるＮＰＰ構築物を設計することができる、「直接ヌクレアーゼプローブシークエンシング（ＤＮＰＳ）」と呼ばれる方法。１つのそのような構築物を図１に図示する。ヌクレアーゼ保護プローブを直接シークエンシングする場合であって、シークエンシングのためにアダプター配列を付加させるまたはポリＡテールもしくは他の捕捉分子を付加させる現行の商業的方法を用いる場合、Ｓ１生成物を直接シークエンシングすることができる。しかし、リンカーの使用によって付加生成物をライゲートする場合、アダプター、遺伝子タグ、実験用タグまたは他の配列の付加のために、過剰なタグプローブ、アダプターまたはリンカーをシークエンシング前に「クリーンアップ」工程で排除する必要があり得る。幾つかの戦略を用いることができる。最も簡単な戦略は、シークエンシングすることとなるライゲートされた付加生成物（例えば、プローブと検出リンカーと実験用タグと遺伝子タグと必要に応じてアダプターとの複合体）の融解温度（Ｔｍ）より下だが、完全付加生成物自体ではなく、リンカーおよび該付加生成物の成分と複合体を形成しているリンカーの融解温度より上の温度でのインキュベーションである。このようにして、それらは融解分離し、ハイブリダイズされていないリンカー、実験用および遺伝子タグと共に、Ｓ１（または他のヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼカクテル）によって破壊される。その後、例えば９５℃への加熱により、またはプロテイナーゼＫの使用により酵素的に、または阻害剤の使用により、（例えば）Ｓ１活性を破壊する。この「２工程」ヌクレアーゼ保護アプローチは、シークエンシング表面に捕捉する時点まで、一切の分離工程を伴わない添加のみのプロセスであるプロトコルをもたらす結果となる。
【００５１】
遺伝子のシークエンシング、およびヌクレアーゼ保護プローブのシークエンシングによる存在度の決定を、ヌクレアーゼ保護プローブ全体をシークエンシングすることなく行うことができる。末端２から約７または約２５塩基の組み合わせが、測定されるそれぞれの遺伝子について一意的な配列を表すようにヌクレアーゼ保護プローブの３’末端を選択する場合には、これが、遺伝子を同定するためにシークエンシングを必要とするヌクレアーゼ保護プローブのすべてであり、およびシークエンシングされたそのような付加生成物の数を計数することにより、サンプル中のそれぞれの遺伝子の量である。実験用タグ（実験ごとに異なるもの）をヌクレアーゼ保護プローブに追加して、多数の実験物のｑＮＰＡ生成物をシークエンシングのために一緒にプールすることを可能にすることができる。
【００５２】
スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の例、ならびにヌクレアーゼ保護工程完了後の結果を図６Ａに図示する。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。これらの一塩基修飾は、発現されたＳＮＰを検出するためにＲＮａｓｅなどのさらなる酵素の活性を利用することにより、またはメチル化ＤＮＡ部位を検出するために重亜硫酸塩処理、その後のウラシルＤＮＡグリコシル化の併用効果を利用することによって検出することができる。当業者には、ＤＮＡ ＳＮＰをシークエンシングによって同様に検出および測定することができる方法がわかるはずである。それぞれの場合、ターゲット遺伝子またはターゲット遺伝子のすべての変異体に共通の対照配列を、関心のある（突然変異またはメチル化している可能性のある）部位に特異的なプローブと共に設計する。特定のスプライス接合部、欠失されることがある特定のエキソン、または特定の遺伝子融合体にハイブリダイズするようにプローブを設計することもできる。赤色「ｘ」は、保護されていない、従って、例えばＳ１によって分解されるプローブ配列、またはターゲット配列が切断される、従ってヌクレアーゼ保護プローブが融解して外れ、Ｓ１によって破壊されるであろう場所を示す。単一のミスマッチ塩基のみの場合、例えば、ＲＮａｓｅなどのＳ１に、または単一塩基を切断する別の酵素の使用に、さらなる酵素（単数または複数）を加える必要があり得る。当業者には、これらの切断を行うために単独で使用するまたは併用することができる非常に多くの酵素、修飾酵素、または分子が分かるであろう。ヌクレアーゼ保護プローブを（本発明の他の箇所で説明する方法を用いて）実験用タグの付加によりさらに修飾して、多数の実験からのサンプルを単一シークエンシングランに統合させることができる。シークエンシングアダプター配列をヌクレアーゼ保護プローブに（または、実験用タグを用いる場合、その実験用タグ自体がその３’末端にアダプター配列を有するように合成されていないならば、その実験用タグにも）ライゲートすることができる。ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端をその合成中にリン酸化することができ、その後、そのヌクレアーゼ保護プローブの５’塩基（例えば、２５塩基）にハイブリダイズするリンカーであって、５’アダプター配列にハイブリダイズする相補的配列を有するリンカーを使用し、このようにして、（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して）それを共にライゲートすることができるアダプターをヌクレアーゼ保護プローブの５’末端に追加することができる。あるいは、ＡＴＰの付加および適切なＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）の使用により、自己リン酸化およびライゲートすることができる。３’アダプターについては、アダプター自体をリン酸化することができ、ならびにリンカーを、ヌクレアーゼ保護プローブの３’塩基（例えば、２５塩基）にハイブリダイズするように、および３’アダプターに対する相補的配列を含有するように設計することができるので、そのリンカーがヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に、該プローブへのそのライゲーションを可能にする様式で、ハイブリダイズされ、並置される。適切な条件下では、代りに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを使用して５’末端をリン酸化し、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートすることができる。他の適切な条件下では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ自体をリン酸化してライゲートすることができる。ポリＡテールをヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に付加させることが必要な場合は、Ｔｄｔを使用してそれを付加させることができる。
【００５３】
好ましい方法では、野生型と変異体の間で相同であるターゲット遺伝子の配列を測定する、またはＤＮＡメチル化を測定する場合にはメチル化を受けない、１つ（以上）のヌクレアーゼ保護プローブがあり、そして次に、突然変異またはＤＮＡメチル化部位に対して設計された第二プローブがある。従って、全レベルを決定することができ、突然変異の割合も決定することができる。
【００５４】
ターゲット遺伝子の様々な領域に対するプローブを作製し、その後、ｑＮＰＡ反応からそれらのプローブをシークエンシングすることにより、ｑＮＰＳを使用して未知の変異体を簡単に検出することもできる。実験用タグを含む構築物に前記プローブを組み込むことができ、シークエンシングのためにその付加生成物にアダプター配列を組み込むことができる。ミスマッチしている塩基を切断するためにおよび所望される場合にはＳＮＰを検出するために１つの酵素または酵素の組み合わせのヌクレアーゼ活性を利用することができる。それらの塩基が、ヌクレアーゼ保護プローブの端のほうに位置する場合には、切断温度ですべての短い鎖が融解してなくなり、破壊されて、短縮されたプローブ配列が残ることとなる。プローブの中央のほうの場合には、すべての配列が融解分解し、破壊されることとなるように条件を常例的に設計することができる。あるいは、ＳＮＰまたは幾つかのミスマッチ塩基がヌクレアーゼ保護プローブの中央領域内に位置する場合、ヌクレアーゼ保護プローブを切断するが融解して外れない条件を用いることができ、このときはシークエンシングによって特定の突然変異部位が同定されることとなる。同じ遺伝子に対して多数のプローブを使用することにより、プローブ数を比較して、突然変異が存在する場所を同定することができる。このシナリオでは、必要アダプターのライゲーションを、それぞれのプラットホームでのシークエンシングに今日用いられている様式で行うことができる。残存するヌクレアーゼ保護プローブ端の配列が判らず、従って、アダプターリンカー配列を設計することはできない。あるいは、イノシン配列にハイブリダイズするヌクレアーゼ保護プローブ端を有するアダプターを使用することができる−この場合、該ヌクレアーゼ保護プローブの末端の特定の組成を知る必要はない。あるいは、アダプター修飾プロセスを、他の箇所で説明するように行うことができる。アダプターがインタクトＮＰＰに正確にライゲートされ、従って、これらだけがシークエンシングされることとなる。
【００５５】
与えるすべての実施例において、少しでも必要があれば、これらの実施例において様々な事例に関して説明するリンカーおよびプロセスを使用せずに、当該技術分野において公知のまたはシークエンシングのために実施されている方法を用いて、アダプター配列、ポリＡ配列、または他の必要捕捉分子（単数もしくは複数）を遺伝子タグまたは実験用タグと共にＮＰＰまたは付加生成物に付加させることができる。
【００５６】
一分子シークエンサーについては、アダプター配列を全く必要とせずに、または３’末端のアダプター（もしくは捕捉）配列のみを用いて、実験用および遺伝子タグを有するもしくは有さないヌクレアーゼ保護プローブ、または３’捕捉配列を取り付けたプローブをシークエンシングすることができる。実験識別子および遺伝子識別子タグを取り付けるために、ライゲーション工程（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用）、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓなどの次世代シークエンサーのために）、１つだけのアダプター配列の（例えば、３’末端での）取り付け、またはポリＡテールの取り付けまたは合成が必要であることがあり、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするために、（例えば）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）を（例えば）使用するポリＡテールの３’末端での伸長、または別の万能捕捉配列もしくは分子の取り付けが必要とされる。本発明においてここおよび他の箇所で説明する構築物は、すべて、そのような機器使用でのシークエンシングのために調製することができる。図２、４および５は、シークエンサーの同じラン／チャンネル内での実験を多重化するために、および遺伝子識別子タグを使用して、必要とされる読み取り長さを縮小するために設計された構築物を図示する。タグを取り付けるために、ヌクレアーゼ保護工程３から５を行った後に（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用する）ライゲーション工程、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓなどの次世代シークエンサーのために）、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）、または適切なアダプター分子を使用する、ポリＡテールの３’末端での伸長が必要である。溶解バッファーがこれらの工程のいずれかを阻害する場合には、逆転写およびＰＣＲを可能にする希釈バッファーを使用できることに留意すること。アレイベースのアッセイの検出リンカーを使用して、ヌクレアーゼ保護プローブに実験用タグを連結させる。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、前記プローブおよびタグを互いにライゲートする。遺伝子識別子タグも組み込むことができ、ことによると配列読み取りを１０塩基（ちょうど２つのタグ）に低減することができる。あるいは、ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端がそれぞれの遺伝子について一意的である（例えば、３’末端の５から７塩基の配列が一意的である）ようにターゲット遺伝子配列領域を選択することにより、測定したそれぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングしなければならないのはこの領域だけである。
【００５７】
ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡに相補的でないタグを（例えば、合成により）ＮＰＰに直接組み込むことができ、ヌクレアーゼ工程の間に相補的オリゴヌクレオチド配列によって保護することができ、そのためそれは加水分解されないであろうし、またはヌクレアーゼによる加水分解に対して耐性でありさらに依然としてシークエンシング可能である配列からそれを構成することができる。ターゲット配列までの隣接するオリゴヌクレオチドのタグシークエンシングによって、ＮＰＰ構築物中に非対合塩基がない限り、ヌクレアーゼ切断を防止することができる。
【００５８】
シークエンシングによりｑＮＰＡアッセイの検出工程を行うことの利点としては、例えば組織などの固相からの、抽出なしでの素性のシークエンシング；多数のサンプルのそれぞれについての別々の検出操作の必要の回避−すべてを１つの溶液で同時に行うことができる；プローブ間の弱い交差反応の回避、例えば、高濃度の検出リンカーの使用のため；ＳＮＰ決定向上；などが挙げられる。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明は、以下の態様に備えるものである：
態様１：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有しない。
【００６０】
態様２：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有せず、生合成工程を用いて形成されたものでもない。
【００６１】
態様３：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
【００６２】
態様４：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物であって第二ヌクレアーゼ反応の生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
【００６３】
態様５：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、１つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。
【００６４】
態様６：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、合成オリゴヌクレオチドの使用によって形成する。
【００６５】
態様７：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、合成オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーション反応の使用によって形成する。
【００６６】
態様８：７におけるようなシークエンシング可能付加生成物であって、該シークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために用いられるライゲーション反応の使用からさらに形成されるものであるシークエンシング可能付加生成物。
【００６７】
態様９：ＮＰＰに基づいて組み立てられたまたはＮＰＰが組み込まれているシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
【００６８】
態様１０：酵素的修飾、例えばポリＡ配列のライゲーションまたは付加、を可能にするようにまたは可能にしないように調製されたおよび非天然ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸またはペプチド核酸など）を含有するまたは含有しないシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
【００６９】
態様１１：シークエンシング前に溶液中または表面上での増幅に付されるＮＰＰを含有するまたはＮＰＰに基づいて組み立てられたシークエンシング可能付加生成物。
【００７０】
態様１２：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、この配列（例えば、遺伝子タグ）を使用して該付加生成物を同定することができ、従って該ターゲットオリゴヌクレオチドを同定することができるものであるシークエンシング可能付加生成物（単数または複数）。
【００７１】
態様１３：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、（この配列、例えば実験用タグ）を使用して、該ターゲットオリゴヌクレオチドを含有する反応を同定することができ、従って、多数の反応物をプールすることおよび同時にシークエンシングすることを可能にするものであるシークエンシング可能付加生成物（単数または複数）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
本発明の様々な特徴および付随の利点は、添付の図面と共に考慮するとよりよく判るようになるので、さらに十分に理解されるであろう。該図面中の同様の参照記号は、幾つかの図を通して同じまたは同様の部分を示し、および該図面は、下記のとおりのものである。
【図１】図１は、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）アッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の生成の概略図である。任意の必要アクセプター配列（青色）を有する遺伝子（または実験用）タグを取り付けるためのリンカー（緑色）の使用を図示し、後に最終的にライゲートされる、ＮＰＰの他端にアダプター（赤色）を付加させるための別のリンカー（紫色）の使用も図示する。それぞれの場合、シークエンシング可能付加生成物が形成されるばかりでなく、過剰なリンカー、アダプターおよびタグ配列も蓄積する。そのシークエンシング可能付加生成物を他の短い配列から分離するためのゲル精製の使用を図示する。
【図２】図２は、シークエンシングのためのＮＰＰのプロセッシングを図示する。図２Ａは、ポリＡ付加またはアダプター配列付加を含む、後のプロセッシングにおける２つの可能性を図示する。図２Ｂから２Ｅは、遺伝子タグ、実験用タグ、およびまたはアダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。
【図３】図３は、ｑＮＰＳプローブ、およびシークエンシングに有用である付加生成物のタグ付け、およびクリーンアップのためのヌクレアーゼ工程の使用の概略を示す。曲がり矢は、ライゲーション点を示す。シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物およびその相補体を作成する。略語表は、シークエンシング可能付加生成物を形成するために使用する異なるオリゴヌクレオチドを定義するものである。
【図４】図４は、シークエンシング可能付加生成物の代替組み立て方法を図示する。図４Ａは、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物を形成するための異なるスキームを図示しており、この場合、タグリンカーは、実験用タグ（ＥＴ）可変配列（ＶＳ）（シークエンシングしたときにウエルまたは実験を一意的に識別する配列）に相補的な残基にイノシンを含有し、次に３’アダプターに相補的な配列（３’Ａｃｏｍｐ）を含有する。図４Ｂは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、５’アダプタータグ／タグリンカー／３’アダプター（ａｃａｐｔｏｒ）相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。図４ＣおよびＤは、クリーンアップのためにゲル精製を（例えば、ポリアデニル化前に）用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。
【図５】図５は、ＮＰＰを含有するおよび含有しないシークエンシング可能付加生成物を図示する。
【図６Ａ】図６は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図６Ａ凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でｍＲＮＡを測定するためのプローブ。（共通エキソン１）および２つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための（エキソン１／２接合部）、この接合部は、エキソン１からエキソン２までである場合があり、またはエキソン１からエキソン３までである場合がある；またはエキソンを測定するための（２および３）、これらのうちの一方（エキソン２）が欠失されることがある；を、野生型（左）および突然変異（この場合はエキソン２が欠失している）について図示する。赤色「ｘ」Ｓ１によって示す、エキソン２の欠失が、エキソン２についてのプローブのＳ１による完全破壊、およびエキソン１／２スプライス接合部についてのプローブのエキソン２に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。図６Ｂ凡例。発現ＳＮＰを測定するためのプローブ（左パネル）またはメチル化ＤＮＡ部位を測定するためのプローブ（右パネル）を図示する。発現ＳＮＰの場合、２つの可能性、野生型またはＳＮＰ、を図示する。２つのプローブ、対照領域のためのもの（１）、そのプローブの中央に位置するＳＮＰを有するもの（２）、を使用する。ＲＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅ）での処理によりＳＮＰにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ（今はそれぞれの端にちょうど２５塩基）はＳ１反応に用いる５０−ｍｅｒ Ｔｍで融解して外れ、Ｓ１によって破壊される。メチル化ＤＮＡについて、同じ２プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないＣをＵに変換してミスマッチを作り、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いてそのＤＮＡを切断するため、プローブは融解して外れ、Ｓ１によって破壊されることとなる。
【図６Ｂ】図６は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図６Ａ凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でｍＲＮＡを測定するためのプローブ。（共通エキソン１）および２つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための（エキソン１／２接合部）、この接合部は、エキソン１からエキソン２までである場合があり、またはエキソン１からエキソン３までである場合がある；またはエキソンを測定するための（２および３）、これらのうちの一方（エキソン２）が欠失されることがある；を、野生型（左）および突然変異（この場合はエキソン２が欠失している）について図示する。赤色「ｘ」Ｓ１によって示す、エキソン２の欠失が、エキソン２についてのプローブのＳ１による完全破壊、およびエキソン１／２スプライス接合部についてのプローブのエキソン２に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。図６Ｂ凡例。発現ＳＮＰを測定するためのプローブ（左パネル）またはメチル化ＤＮＡ部位を測定するためのプローブ（右パネル）を図示する。発現ＳＮＰの場合、２つの可能性、野生型またはＳＮＰ、を図示する。２つのプローブ、対照領域のためのもの（１）、そのプローブの中央に位置するＳＮＰを有するもの（２）、を使用する。ＲＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅ）での処理によりＳＮＰにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ（今はそれぞれの端にちょうど２５塩基）はＳ１反応に用いる５０−ｍｅｒ Ｔｍで融解して外れ、Ｓ１によって破壊される。メチル化ＤＮＡについて、同じ２プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないＣをＵに変換してミスマッチを作り、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いてそのＤＮＡを切断するため、プローブは融解して外れ、Ｓ１によって破壊されることとなる。
【図７】図７は、ｑＮＰＡプロセスの最後に生成される溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。図７凡例。Ｓａｎｇｅｒシークエンシング法、ＡＢＩ ３７００、を用いた。線状ＤＮＡサンプル（〜２．５ｋｂ ＰＣＲ）をシークエンシングのための必要プライマー（Ｔ７Ｆ）と共にアリゾナ大学コアシークエンシング施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙ）に付託した。希釈バッファー（ｑＤｉｌ）の添加を伴うまたは伴わないｑＮＰＡ溶解バッファーを２倍から２０倍希釈した。ｑＤｉｌを１：１添加し、２倍希釈物を生じさせた。それぞれの希釈を２回繰り返した。同じ希釈をリバースプライマーでも繰り返した（結果は示さない）。シークエンシングのために、２．５μＬの５０ｎｇ／μＬのＤＮＡを１５μＬの総反応混合物量で混合した。これにより６倍希釈が説明される。赤色、配列なし、薄緑色５０〜１００ｂｐ配列、濃緑色５００〜６００ｂｐ配列。
【図８】図８は、ＣＴ値の等価性を実証するために抽出ＲＮＡに対してマッチした溶解産物を測定したＰＣＲの結果を図示する。この場合、サンプルから精製したＲＮＡまたは同じサンプルからのｑＬｙｓｉｓ産物のＰＣＲを行って、異なる細胞サンプル混合物の大きなセットにわたって３つの遺伝子とハウスキーパー遺伝子ＧＡＰＤＨを測定した。それぞれのデータ点は、３回の反復試験の平均である。それぞれの混合物を３回の異なる実験で試験した。ＧＡＰＤＨについてのＣＴ値を引くことによって、ＣＴ値を正規化した。精製されたＲＮＡは、ｑＬｙｓｉｓサンプルに求められる希釈率に合わせたものであり、およびＰａｄＰシークエンシング可能プローブを作成するために必要な工程の順序を示す。遺伝子タグおよび５’アダプターは、制限部位と共に、原ＰａｄＰプローブの一部である。そのプローブをターゲットＲＮＡ全体にわたってライゲートして、環状ＤＮＡを形成し、その後、これを開き、実験用タグおよび３’アダプターをハイブリダイズし、ライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。
【図９】図９は、ＰａｄＰシークエンシング可能付加生成物の作成方法の代表図を示す。遺伝子タグおよび５’アダプターは、制限部位と共に、原線状プローブの一部である。このプローブは、該プローブの５’および３’末端が隣接塩基にハイブリダイズされるようにターゲット核酸にハイブリダイズし、従って、核酸テンプレート上で互いにライゲートされて環状（例えば、ＤＮＡ）プローブを形成することができる。その後、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）を添加して、ハイブリダイズされていない核酸ターゲットおよび過剰な線状プローブを破壊する。その後、プローブを核酸ターゲットから（例えば、塩基中で加熱して）分離し、ヌクレアーゼ活性を破壊する。その環状プローブを開き、所望される場合には実験用タグおよび必要に応じて３’アダプターをハイブリダイズおよびライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。線状プローブの核酸ターゲットへのハイブリダイゼーション、環状プローブを形成するためのライゲーション、および核酸ターゲットからの解離というプロセスを、循環加熱によって多サイクル繰り返して、解離を生じさせる。過剰な線状プローブのため、温度が降下すると線状プローブはハイブリダイズし、そしてまたライゲートされ、その後、次の高温サイクルによって遊離され得る。このようにして環状プローブ量を増幅させた後、ヌクレアーゼ加水分解工程を行う。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
さらに詳述せずとも、当業者は、前の説明を用いて、以下の本発明をその最大範囲まで利用できると考えられる。従って、以下の特定の好ましい実施形態は、単なる例証と解釈され、いかなる点においても、本開示の残部を制限するものとは解釈されない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
ｑＮＰＡアッセイのために用いる溶解バッファーを、酵素を不活性化し、ＲＮＡの分解を防止するが、ハイブリダイゼーション希釈バッファーへの制限希釈後、それがＳ１活性を可能にし、ストリンジェントな特異性を有するハイブリダイゼーションを可能にするように設計する。しかし、溶解バッファー成分は、逆転写およびポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性の阻害は、例えば、そのバッファーが除去されない限り、または阻害活性が希釈されてなくならない限り、または阻害活性が中和されない限り、ＰＣＲ成功を妨げ得る。希釈バッファーを、ヌクレアーゼアッセイが完了した後に添加して、溶解および他のバッファーの阻害活性を中和することができる。図７は、ｑＮＰＡプロセスの最後に生成される、溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。水への１０倍希釈が、シークエンシングの成功を可能にする。しかし、水ではなく、中和希釈バッファー（ｑＤｉｌ）を希釈に用いると、水からシークエンシングされた転写産物の場合と同じシークエンシング結果（５００から６００塩基対の読み取り長さ）を生じさせるために４倍の希釈しか必要としない。しかし、中和ｑＤｉｌ希釈バッファーの使用は、ちょうど２倍希釈後にシークエンシングを可能にしたが、その読み取り長さは５０から１００塩基対に低減され、従って、成功はしたが、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーによる影響を受けた。ターゲットＤＮＡのＰＣＲをシークエンシング前に必要とするシステムについて、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーからの干渉もあり得ることを認識することにより、本発明者らは、細胞から調製したｃＤＮＡを、同じ細胞から調製しｑＤｉｌ希釈バッファーで希釈した溶解産物に対して使用して、ＰＣＲの効率を試験した。ＧＡＰＤＨに正規化した３つの遺伝子を測定したところ、混合物全体にわたって差はなかった（図８）。相関は、０．９７であった。
【００７５】
（実施例２）
スプライス接合部またはエキソン、ならびにターゲット遺伝子の他の領域に特異的なＮＰＰを設計したので、それぞれの場合、該プローブは、トランスクリプトーム中の単一遺伝子においてしか見いだされない配列に対して特異的である。ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブの一部分についての直接シークエンシング（直接ヌクレアーゼ保護プローブシークエンシング、またはＤＮＰＳ）を可能にするために、理想的には、最初の５、１０、２０または３０の３’塩基は、それらのシークエンシングによって１つだけの遺伝子が一意的に同定されるほどに特異的である。ヌクレアーゼ反応後、残存プローブを、前に説明したおよび下で説明するような必要アダプターまたは捕捉配列または分子を含有するシークエンシング付加生成物にそれらを組み込むことによって、シークエンシング用に調製する。代替方法では、実験用タグを３’末端に付加させる。さらにもう１つの方法では、遺伝子タグを３’末端に付加させるので、ヌクレアーゼ保護プローブ配列自体をシークエンシングする必要がなく、プローブの３’末端がトランスクリプトーム中の１つだけの遺伝子に特異的である必要もない。さらにもう１つのプロトコルでは、遺伝子タグおよび実験用タグ両方を付加生成物に組み込んでシークエンシングする。さらにもう１つの実施例では、ＮＰＰに対する相補的配列、およびシークエンシング可能付加生成物を、前に説明したおよび下で説明する方法によって調製する。
【００７６】
（実施例３）
遺伝子タグおよび実験用タグを有するＮＰＰ含有付加生成物の構築。この方法の利点は、タグハイブリダイゼーション工程が、すべての未変性物（例えば、ＲＮＡ）を破壊するＳ１および塩基工程の後に続くため、正しいタグがそれ自体の相補体にハイブリダイズし、別のタグの相補体にハイブリダイズしないことを保証する特異性しか必要とされない点である。同様に、ヌクレアーゼ保護プローブしかターゲット特異的である必要がない。プローブ自体をシークエンシングしない。代わりに、遺伝子タグを、遺伝子を同定するためにシークエンシングされるエンティティーである付加生成物に組み込み、その後、該遺伝子タグが特異的にハイブリダイズするその特異的ヌクレアーゼ保護プローブによって該遺伝子を測定する。ＦＦＰＥを用いてｑＮＰＡを行う標準的なプロトコル（３、４）に従って、ヌクレアーゼ保護プローブのカクテルの存在下、プロテイナーゼｋを添加した溶解バッファーでサンプルを溶解する。３０分間、３７℃での初期インキュベーション後、サンプルを９５℃に加熱し、その後、冷却し、５５℃で２時間インキュベートして、プローブをそれらのそれぞれのターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。その後、Ｓ１ヌクレアーゼを添加して、ターゲットにハイブリダイズしていない過剰なプローブ、およびプローブにハイブリダイズしていないＲＮＡを加水分解し、ターゲット／プローブデュプレックスを残す。６０分のインキュベーション後、塩基を添加し、サンプルを９５℃で１０分間加熱して、プローブ／ＲＮＡデュプレックスを解離させ、ターゲットＲＮＡ配列を加水分解する。そのサンプルを中和し、その後、３’タグリンカーのカクテルを添加し、該リンカーは、それぞれが、１つの特異的プローブの３’２５塩基配列に相補的な特異的２５塩基配列を有し、および１つの遺伝子識別子タグに特異的な配列を含有する。第二の事例では、前記タグリンカーは、１セットの実験用タグに共通の５’末端配列に特異的にハイブリダイズする、ジェネリックである遺伝子タグ配列に対して３’側に配列も含有した。前記遺伝子タグ配列は、多数の設計から成り得るが、この事例では、シークエンシングされない遺伝子タグの５’末端配列に相補的であった配列、および次に、それぞれの遺伝子タグに一意的であり、それぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングされるそれぞれの遺伝子タグの３’末端配列である、７塩基タグ配列から成った。前記タグリンカーの３’末端配列が実験用タグにもハイブリダイズする場合、その実験用タグの５’相補的配列は、すべての実験用タグについて同じである。それぞれの異なる実験用タグを添加して、個々の実験ヌクレアーゼ保護反応を分離する（例えば、サンプルを別々にアッセイする）ので、「誤った」実験用タグがハイブリダイズする可能性がない。この場合、それぞれのサンプルをマイクロプレートの別個のウエルで調製し、異なる実験用タグを各ウエルに添加する。タグリンカー、遺伝子タグおよび実験用タグの添加は連続的であり得るが、この実施例ではすべてを一緒に添加し、タグリンカーを、Ｓ１ヌクレアーゼ保護反応を生き残るように、ヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰に添加するが、すべてのタグリンカーがそのタグ配列自体で飽和されるように、添加する遺伝子タグおよび添加する実験用タグの量に対しては制限濃度で添加する。遺伝子タグおよび実験用タグを、すべて、それらの５’末端でリン酸化する。加えて、実験用タグは、Ｓｏｌｅｘａシークエンシングチップ上の３’捕捉配列に相補的なアダプター配列をその３’末端に含有する。ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端もリン酸化する。３’タグリンカーおよびタグを添加すると同時に５’アダプターリンカーのカクテルを添加し、このリンカーは、それぞれのプローブの５’末端に相補的な遺伝子配列とＳｏｌｅｘａシークエンシングチップの５’捕捉配列によって捕捉される５’アダプター配列に相補的な５’配列とを含有する配列から構成される。同時に、５’アダプター配列自体を５’アダプターリンカーより多く添加する。５０℃でのインキュベーション後、すべてについて適切なハイブリダイゼーションを行って、図２Ｅｘｘに図示する付加生成物を形成し、その後、（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して）ライゲーション反応を行う。その後、反応混合物をゲルで泳動させ、高分子量バンドを切り出し、Ｓｏｌｅｘａチップに適用し、増幅し、シークエンシングする。この実施例において、遺伝子タグは、２つの同一遺伝子同定配列から成り、その結果、それぞれの遺伝子の同定のためにシークエンシングの冗長性をもたらされる。加えて、タグリンカーのハイブリダイゼーションに使用する実験用タグの５’末端は、１つ置きの位置にＬＮＡを含有し、その結果、この配列内のそれらの多数の塩基のためにより高いＴｍをもたらされるので、実験用タグおよび遺伝子タグをシークエンシングするために必要とされる読み取り長さができる限り短くなるようにそれをできるだけ短く保つ。
【００７７】
（実施例４）
ゲル精製を用いなかったことを除き、実施例３において説明した同じプロセスを行った。代わりに、図３に図示するように、５’リン酸化アダプターリンカーおよび５’リン酸化タグリンカーを使用し、ならびにその反応に加える実験用タグおよび３’アダプター配列に相補的であるオリゴヌクレオチドをそれぞれの反応に加える。従って、ライゲーション工程を行うと、この短いオリゴヌクレオチドはタグリンカーにライゲートされるため、完全にハイブリダイズされ、ライゲートされた付加生成物には、１００塩基より短い配列はない。その後、「クリーンアップ」反応として、その反応混合物をＳ１ヌクレアーゼと共に６５℃でインキュベートする。このインキュベーション温度で、その完全付加生成物の成分のＴｍは、いずれの部分も融解して外れずＳ１によって加水分解されないようなＴｍであるが、過剰なタグリンカーとそれぞれのタグ（ライゲートされたタグは５０塩基未満であるので）および過剰な５’アダプターとアダプターリンカーの間のハイブリダイゼーションにより、それらはＳ１によって加水分解するほどに融解される。その後、このＳ１反応を生き残った付加生成物を９５℃に加熱して、それを融解して保護リンカーからなくし、Ｓ１活性を破壊し、その後、その付加生成物をＳｏｌｅｘａチップ上に捕捉し、増幅し、シークエンシングする。
【００７８】
（実施例５）
例えばＨｅｌｉｃｏｓｅシステム用の、シークエンシング媒体上にシークエンシング可能付加生成物を捕捉するためにポリＡテールを利用するシステムでのシークエンシングのための付加生成物を構築する実施例を行う。３’アダプターのない、図２Ｃに図示する付加生成物を構築する。ゲル精製クリーンアップ後に、Ｔｄｔを使用してこの付加生成物をその３’末端でポリアデニル化する。この同じ付加生成物を調製し、Ｔｄｔ反応前にＳ１ヌクレアーゼによってクリーンアップし、その後、シークエンシングする。あるいは、Ｔｄｔを使用して実験用タグの一部として合成したポリＡ３’アダプターを有する、図２Ｃに図示する付加生成物を構築し、この生成物をゲル精製によってクリーンアップした後、シークエンシングする。ポリＴ相補的配列を使用して、ポリＡテールを保護し、Ｓ１ヌクレアーゼを利用してその付加生成物をクリーンアップした後、シークエンシングする。
【００７９】
（実施例６）
サンプルとして全血を使用して、実施例４の実験を行う。この全血を２ｘ（二倍濃度）溶解バッファーと１：１混合し、１０分間９５℃に加熱し、その後、微量遠心管で遠心分離して集塊を除去する。その後、実施例４において説明したようなｑＮＰＳに上清を付す。
【００８０】
（実施例７）
ウイルスに感染したヒト細胞のサンプルを使用して、実施例４を行う。使用するプローブを、ウイルス遺伝子を測定するために設計する。結果は、望ましくない配列情報によるシークエンシングしたサンプルの干渉または「クラッター」なしに他の種の混合物の中の任意の種からの遺伝子を測定する一例として、ヒト遺伝子のバックグラウンドでウイルス遺伝子を選択的に測定する能力を明示する。
【００８１】
（実施例８）
未分化Ｔｈｐ−１細胞ならびに分化およびＬＰＳ刺激Ｔｐｈ−１細胞からの溶解産物の混合物から成る一連のサンプルを使用して、実施例４の実験を行う。
【００８２】
（実施例９）
サンプルを溶解し、９５℃でインキュベートし、続いてＮＰＰとハイブリダイズさせ、Ｓ１で処理し、タグリンカー、遺伝子タグ、実験用タグを付加させ、ハイブリダイズさせ、ライゲートし、その後、１０５℃でインキュベートし、続いて実験用タグを添加して、ＬＮＡを含有する配列を保護し、３７℃でインキュベートして、２０塩基以上のライゲートされた付加生成物相補的オリゴヌクレオチド配列（過剰なタグリンカー、遺伝子タグ、および実験用タグ、および実験用タグ保護配列がまだ存在するだろう）を再びハイブリダイゼーションさせ、続いて、Ｓ１で加水分解し、その後、ポリアデニル化し、最後にゲル電気泳動によってクリーンアップ、その後、シークエンシングする。（タグリンカーをハイブリダイズさせることができる）相補的ＤＮＡの１つだけのコピーをシークエンシングし、これは、実験用または遺伝子タグを含有しない。そのため１００の遺伝子を測定する場合、この相補的ＤＮＡの１００分子／細胞のみをバックグラウンドとしてシークエンシングし、これらの配列は、一切遺伝子タグまたは実験用タグ配列情報を含有しない。
【００８３】
（実施例１０）
ターゲット核酸に相補的な塩基の配列に加えて、シークエンシングチップ上に捕捉するための捕捉アダプター配列としての役割を果たすことができる非ターゲット配列、または遺伝子タグとしての役割を果たすことができる配列、または実験用タグとしての役割を果たすことができる配列、またはこれらの機能の幾つかを組み込む配列を含有する、ＮＰＰを合成する。このＮＰＰを、このＮＰＰの非ターゲット配列に相補的である過剰なオリゴヌクレオチドと併せ、それらを互いにハイブリダイズさせることができるようにインキュベートする。その後、この混合物を、ターゲット核酸を含有するサンプルに添加し、ハイブリダイゼーションの後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して、標準的ｑＮＰＡプロトコルを行う。塩基であって、それらにハイブリダイズした相補的塩基を、ＮＰＰの核酸ターゲットにハイブリダイズした部分と非ターゲット相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした部分の間に有さない塩基が無いため、核酸ターゲットにハイブリダイズしたＮＰＰは、Ｓ１ヌクレアーゼによって切断されず、むしろインタクトのままであり、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていないそのＮＰＰは、保護された非ターゲット配列の地点まで加水分解される。塩基中で加熱した後、非ターゲット配列とターゲットオリゴヌクレオチド配列の一部分の両方にわたる相補的オリゴヌクレオチドを添加し、ＮＰＰ含有相補的ヌクレアーゼターゲット配列のみがハイブリダイズし、より短い非ターゲット配列保護オリゴヌクレオチドも生き残っている非配列ＮＰＰ配列フラグメントもハイブリダイズすることができない温度で、競合的にＮＰＰにハイブリダイズさせる。その後、第二Ｓ１ヌクレアーゼ処理を行い、そしてその後、シークエンシングチップへの捕捉のために必要な配列を有する、生き残っているＮＰＰを、シークエンシングすることができる。このプロトコルは、アダプター配列を取り付けるためのライゲーションを一切必要としない。それが合成ＮＰＰ付加生成物の一部であるからである。
【００８４】
前記実施例を、前記実施例において用いたものの代わりに本発明の一般的にまたは具体的に説明した反応体および／または操作条件を用いることによって繰り返して、同様に成功することができる。
【００８５】
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に突きとめることができ、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修飾を施して本発明を様々な使用法および条件に適応させることができる。引用したすべての出版物および特許は参照により本明細書に援用されている。
【００８６】
【数１】
【００８７】
【数２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、核酸ターゲットの同定および検出の際に定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）を行うための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、シークエンシングを用いて生物学的サンプルからの核酸を分析するための組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、シークエンシングが直面している幾つかの難題に取り組むための新規アプローチ、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳＴＭ）を提供し、研究および診断用途に改善をもたらす。この方法は、溶解（ヌクレアーゼのみ）保護アッセイを用いて、シークエンシング用のＤＮＡ（または他の合成）プローブを作成するものであり、該プローブをそれら自体シークエンシングすることができ、または（ａ）遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要とすることなく、遺伝子の同定を可能にすることができ、および／もしくは（ｂ）実験特異的タグにカップリングさせて、異なる患者からのサンプルを単一ランに統合させることができる。本開示ｑＮＰＳは、固定されたまたは不溶性のサンプルならびにすべてのタイプの他のサンプルのシークエンシングを可能にし、研究および発見ツールとしてならびに診断試験として利用可能にする。
【０００３】
現行のシステム（例えば、４５４、Ｓｏｌｅｘａ、ＳＯＬＩＤ）および次世代プラットホーム（例えば、一分子シークエンシング）でのシークエンシング方法をさらに開示する。ｑＮＰＳは、数ある中でも、ｉ）低コスト／少ないサンプルをもたらす；ｉｉ）高いサンプルスループットをもたらす；ｉｉｉ）シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する；ｉｖ）他のバックグラウンド（例えば宿主からの病原体）遺伝子からの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシングを可能にする；ｖ）バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ ＳＮＰ、ＤＮＡメチル化、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、突然変異などのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する；ｖｉ）すべてのサンプルタイプからの、特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、または固定され細胞内染色され分類されたサンプル、からのシークエンシングを可能にする；およびｖｉｉ）シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブまたはそのプローブによって保護されたターゲット配列だけへと大きく単純化する、研究および診断のための的を絞ったまたは目標を定めたシークエンシング能力を提供する。
【０００４】
動物組織および臨床サンプルは、概して、パラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）組織の形態での固定により保存される。従って、組織遺伝子発現およびＤＮＡの商業的に実現可能な診断アッセイは、ＦＦＰＥを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式および臨床転帰は公知である。従って、ＦＦＰＥサンプルは、診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、非常に貴重な資源に相当する。
【０００５】
幾つかの難題に研究および診断用途のシークエンシングは直面している。本開示定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）法は、溶解（ヌクレアーゼのみ）保護アッセイを用いて、シークエンシング用の（例えばＤＮＡ）プローブを作成するものであり、該プローブを直接シークエンシングすることができ、または例えば、（ｉ）遺伝子特異的タグにカップリングさせて、該ヌクレアーゼ保護プローブ自体のシークエンシングを必要することなく測定される遺伝子配列の同定を可能にすることができ、および／もしくは（ｉｉ）実験特異的タグ、別個のサンプルそれぞれについて１つの一意的タグ、にカップリングさせて（異なる患者からの、または異なる治療もしくは実験からの）異なるサンプルを単一シークエンシングランに統合することができるが、シークエンシングした後にそれらのサンプルは依然として区別可能である。ｑＮＰＳは、数ある中でも、ｉ）低コスト／少ないサンプルをもたらす；ｉｉ）高いサンプルスループットをもたらす；ｉｉｉ）シークエンシングラン時間を短縮し、データ分析を単純化する；ｉｖ）非ターゲット遺伝子または遺伝子配列のバックグラウンドからの干渉を伴わないターゲット遺伝子の効率的なシークエンシング（例えば、宿主組織からの病原体遺伝子のシークエンシング、または宿主組織ゲノムの干渉を伴わない移植組織のシークエンシングを含む）を可能にする；ｖ）バイオマーカーとして有用である遺伝子発現、発現される一塩基多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ ＳＮＰ、ＤＮＡメチル化、すべてのＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡを含む）、突然変異または他のヌクレオチドターゲットのシグネチャセットの正確な測定の仕方を提供する；ｖｉ）すべてのサンプル（特に、固定された組織、例えばホルマリン固定組織、またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織、またはグルタルアルデヒド固定組織、例えば固定され細胞内染色され分類された細胞を含む）からのシークエンシングを可能にする；およびｖｉｉ）シークエンシングされるサンプルの複雑さを遺伝子全体からヌクレアーゼ保護プローブだけへと大きく単純化する、シークエンシング能力を提供する。
【０００６】
１つの態様において、本発明は、例えば４５４、ＳｏｌｉｄおよびＳｏｌｅｘａシークエンサーの現世代のための、ならびに一分子シークエンサーおよびそれ以降の次世代のためのプローブおよび方法を提供する。これらのシステムの多くは、多数のサンプルを並行してシークエンシングさせる多数のチャンネルを有するが、シークエンシングラン１回あたりのコストは、＄７，０００から＄９，０００であり、このランは少なくとも数日続き得る。ＰａｃＢｉｏなどの一分子シークエンサーは、＄１００から＄２００／サンプルの範囲でコストを提示し得るが、サンプル調製コストを加えると、これはまだ高い。サンプルあたりのコストを下げてサンプルスループットを増す方策は、それぞれの実験からシークエンシングされる分子を同定するためにシークエンシング可能な「タグ」−「実験用タグ」と呼ぶ−を使用して、マルチチャンネルシークエンサーのそれぞれのチャンネル内で、それぞれのシークエンシングランで多数のサンプルを試験する方策である。配列読み取り長さを短くすることで効率を増すことができる。遺伝子全体もしくは遺伝子フラグメントではなくヌクレアーゼ保護プローブだけのシークエンシング、またはターゲット配列を同定するための短い一意的遺伝子タグの使用により、シークエンシングを用いて遺伝子レベルまたは存在を同定および定量する（しかし遺伝子配列内の未知の差を同定しない）用途について、この効率が達成される。遺伝子タグの使用は、ヌクレアーゼ保護プローブ設計も単純化する。シークエンシングに利用できる端が一意的である必要がないからである。しかし、ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブによって保護されるターゲットオリゴヌクレオチドを、遺伝子タグを使用せずに直接シークエンシングしてもよい。この場合、ターゲット配列内の変異の存在も、それらが結果としてヌクレアーゼ保護プローブのＳ１切断または部分的加水分解を生じさせ、その結果、部分的プローブ配列パターンが生ずる場合、または前記ターゲットオリゴヌクレオチドの保護された部分がシークエンシングされるとき、同定することができる。このプロセスを、突然変異（単数または複数）の同定を含むように設計することもできる。このことをここでさらに論ずる。
【０００７】
シークエンシングは、人に一定の疾患の素因を与え得るまたは有害な薬物代謝を警告し得るゲノムＤＮＡの差を同定するために非常に効果的である。しかし、例えば、臨床的に意義のあるサンプルタイプからの遺伝子発現、ｍｉＲＮＡレベルならびにＤＮＡメチル化状態および他の突然変異の評定を必要とするであろう、患者の状態を同定するおよび治療に対する応答を予測する診断に有用なシークエンシング方法を実現するために、まだ大量の開発が残っている。遺伝子シークエンシング会社は、ますます低コストでゲノムのシークエンシングを提供するという彼らの商業的探究の中でこの領域に的を絞ってこなかった。
【０００８】
固定、例えばパラフィン包埋ホルマリン固定（ＦＦＰＥ）、組織からのシークエンシングは、問題が多く、困難であるとされてきたが、臨床サンプルは、概して固定のよりＦＦＰＥ組織の形態で保存される。従って、関心が、推定バイオマーカーもしくは疾患および薬物メカニズムを同定することであるにせよ、または組織遺伝子発現およびＤＮＡの商業的に実現可能な診断アッセイのための基礎の開発およびその後の適用であるにせよ、そのアッセイは、ＦＦＰＥを使用できなければならない。さらに、何百万ものそのようなサンプルが診療センターおよび病院に保管されており、対応する処置様式およびＦＦＰＥドナーの臨床患者転帰は公知である。従って、ＦＦＰＥおよび他の固定サンプルは、薬物ターゲット、疾病マーカーおよび経路ならびに診断バイオマーカーを迅速かつ効率的に同定する、そしてその後、予後判定および診断アッセイを開発および検証するための、または疾患進行もしくは薬物活性と関連づけられる遺伝子およびメチル化状態発現の変化または突然変異を同定するための、非常に貴重な資源に相当する。ＦＦＰＥからのＤＮＡおよびＲＮＡのシーケンシングは、シークエンシングにとって問題があるばかりでなく、アレイベースの方法およびＰＣＲにとっても問題があり、おそらく同じ理由のため−−ゲノムＤＮＡの有意な部分、およびトランスクリプトームＲＮＡは、組織に架橋される。プロセッシングおよび分析のために、この架橋を逆転させ、ターゲット遺伝子を回収しなければならない。ＦＦＰＥから回収される全ＲＮＡは、固定に起因するにせよ、ＦＦＰＥからのＲＮＡの抽出プロセスに起因するにせよ、概して一部は分解される。研究の場では、分析のために分解されすぎるサンプルは単に廃棄される場合があるが、診断の場では、患者のサンプルの廃棄は許容され得ない。従って、シークエンシング力を認識した上で、研究の場または特に診断の場でＦＦＰＥに適用することは、かなり難題である。研究からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織についてのそれぞれの情報内容は、正確かつ単純な分析法を待って、これらのサンプルの膨大な保管庫の中にしまい込まれたままである。上述のことすべてが、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどおよびこれらの配列内の突然変異、すべてにあてはまる。
【０００９】
シークエンシング用途に突きつけられるもう１つの難題は、サンプルあたりのコストである。現在、シークエンシングランには＄７，０００から＄１０，０００の費用がかかり得る。要求が、異なる患者サンプルのシークエンシングであるにせよ、異なる実験からのサンプルのシークエンシングであるにせよ、それぞれ別々に試験すると、たとえ異なるサンプルを（例えば、４５４またはＳｏｌｅｘａ）計器のそれぞれのチャンネルで試験したとしても、サンプルあたりのコストは、〜＄１，０００である。本開示発明は、それぞれの分子に取り付けた実験用タグを用いて、異なる実験または患者サンプルを同じ計器チャンネル内での単一ランに統合する能力を提供する。これらをシークエンシングして、互いから単一のシークエンシングサンプルに統合された単一の実験または患者サンプルそれぞれからのすべての分子を一意的に同定する。例えば、１００人の患者のサンプル（異なる一意的実験用タグでそれぞれにマークを付けた、それぞれの患者サンプルからのｑＮＰＳ生成物）を単一の、例えば３日のランに統合することにより、サンプルあたりのシークエンシングコストは、たった〜＄１０となる。１００の遺伝子／サンプルを測定するためのこのレベルでのコストであれば、サンプルをプロセッシングする（例えば、それを採集する、それをプロセッシングするなど）コストを加えた後でさえ、診断試験および日常的実験またはスクリーニングアッセイは手の届くものになる。
【００１０】
実験用タグの使用は、コスト／サンプルを低減するばかりでなく、例えば、単一チャンネル内での単一ランでシークエンシングされる１００または１，０００の異なる実験を可能にすることにより、高いサンプルスループットも可能にする。例えば、１チャンネルにつき１００のサンプルをプールすると、８，０００のサンプルを８チャンネルシークエンサーの単一ランで試験することができるだろう。これは、例えば、多くの遺伝子ターゲット／サンプルにわたって、ハイスループットスクリーニングの適用を可能にする。
【００１１】
ｑＮＰＳプロセスのもう１つの利点は、結果として生ずる単純化されたデータ分析である。ターゲット分子のみをヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズさせるため、サンプル中の残存ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、破壊され、（例えば、それらにライゲートされたシークエンシングアダプター分子を有さないことにより）シークエンシングに利用不能にされ、その結果、シークエンシングされるヌクレアーゼ保護プローブまたはそれらの保護ターゲットオリゴヌクレオチドの定量的セットのみが残る。これらのプローブおよびターゲットの配列は公知であるため、参照配列データベースは、もっぱらこれらの配列から成ればよく、ゲノム全体から成る必要はない。さらに、遺伝子識別子タグの標準セットがシークエンシングされるＮＰＰ付加生成物に組み込まれている場合には、シークエンシング情報のデコンボリューションがさらにいっそう単純化される。本質的に、配列分析を、合成ヌクレアーゼ保護プローブおよび誘導されるシークエンシング可能付加生成物またはターゲットオリゴヌクレオチドの同定既知配列または部分配列それぞれの数の「計数」、および該ターゲットオリゴヌクレオチドの配列内の任意の差の同定に縮小することができる。
【００１２】
これのさらなる利点は、微量分子をシークエンシングすることができる点、または例えば、病原体からのターゲット分子を、宿主ゲノムの煩わしいシークエンシングを伴わずに宿主組織からシークエンシングすることができる点である。まさに同じく重要なこととして、シークエンシングを用いて発現遺伝子レベルを定量的に測定するとき、細胞１個につき１つだけのコピーというレベルで測定される遺伝子ばかりでなく何千ものコピー／細胞というレベルで発現される遺伝子を測定できることが重要である。ゲノム全体のバックグラウンドを排除すること、および関心のあるターゲット遺伝子にのみ的を絞ること、および実際にターゲット遺伝子自体を短い配列（例えば、５０塩基のヌクレアーゼ保護プローブ）にまたはさらに短い遺伝子識別子タグに短縮することによって、シークエンシングの効率を増加させ、存在度が非常に異なる遺伝子を測定するダイナミックレンジを増加させる。
【００１３】
ヌクレアーゼ保護プローブのみのシークエンシング、または遺伝子識別子タグの使用は、読み取り時間を短縮して、シークエンシング結果をはるかに速く得ることを可能にする。
【００１４】
また、ｑＮＰＳプロトコルは、サンプルの溶解を利用し、抽出または（例えば、遺伝子発現のために）逆転写を必要としないため、それを完全にかつ簡単に自動化することができる。これは、ハイスループットスクリーニングにとって必要不可欠であり、診断アッセイまたは一般的な実験室アッセイに役立つものでもある。さらに、溶解サンプルは、すべてのターゲット分子、例えばすべてのｍＲＮＡおよびすべてのｍｉＲＮＡ、を含有する。抽出プロトコルは、これらのうちの一方もしくは他方の一部を失うことが多く、またはＤＮＡからのＲＮＡの分離を必要とする。明瞭であるように、ｑＮＰＳを、（例えば）精製されたＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをはじめとする、任意のサンプルで行うことができる。
【００１５】
すべてのタイプのターゲット分子をｑＮＰＳによって測定することができる。例は、ＤＮＡ、ＤＮＡ一塩基多型（ＳＮＰ）、メチル化ＤＮＡレベル、ｍＲＮＡ発現、ｍＲＮＡＳＮＰ、ｍｉＲＮＡレベル、ｒＲＮＡレベル、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、遺伝子融合または他の突然変異、タンパク質結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびまたｃＤＮＡなどである。たとえターゲット分子自体を決してシークエンシングすることができず、多くの場合、最も好ましくはそれらが破壊されるとしても、ヌクレアーゼ保護プローブをハイブリダイズさせるように設計することができるあらゆるものをシークエンシングによって定量および同定することができる。ヌクレアーゼ保護プローブは、ターゲット分子をシークエンシングのためにヌクレアーゼから保護するので、遺伝子タグおよび実験用タグをヌクレアーゼ保護プローブにではなくターゲット分子に取り付けてもよい。いずれにせよ、ターゲット分子は、その後は場合により重要でなく、ＮＰＰも同様である。
【００１６】
シークエンシング
本明細書において用いる場合の「シークエンシング」は、非分岐生体高分子の一次構造（または一次配列）を決定することを意味する。シークエンシングは、シークエンシングされる分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド、の大量の原子レベル構造を簡潔に要約する配列として知られている記号線形描写をもたらす。分子が、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡまたはＤＮＡなどである場合、シークエンシングを用いて、ヌクレオチドレベルでその分子についての情報を得ることができ、その後、その情報を、分子それ自体および／またはそれによってコードされたポリペプチドについての様々な二次情報の解読に用いることができる。
【００１７】
ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子であるとき、その分子の不安定性およびヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ）分解しやすいその傾向のため、サンプルを先ず逆転写してＤＮＡフラグメントを作成することが従来望ましく、その後、本明細書において説明する方法のいずれかによってそれらをシークエンシングすることができる。これは、依然として本発明の選択肢である。しかし、ｑＮＰＳは、逆転写の必要を無くし、その代り、ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ活性によりターゲットＲＮＡ配列を相補的ＤＮＡプローブ配列に変換する。当該技術分野において承知されているように、ＲＮＡをコードする遺伝子配列ではなくＲＮＡ分子をシークエンシングすることが時として望ましい。ＲＮＡ分子は、それらのＤＮＡテンプレートと必ずしも共線でないからである。また、一部の生物はＲＮＡ、例えばＲＮＡウイルス、である。例えば、イントロン切り出しおよびスプライシングは、２つのポリヌクレオチド種間の非線形性の一因となる２つの事象である。本発明の他の実施形態では、当該技術分野において公知であるさらなる方法を用いて、細胞または組織の全トランスクリプトームを分析することができる。
【００１８】
任意のシークエンシング方法を本発明において用いることができる。
【００１９】
ＤＮＡシークエンシングは、所定のＤＮＡフラグメントのヌクレオチド順序を決定するプロセスである。今までのところ、殆どのＤＮＡシークエンシングは、（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｓａｎｇｅｒによって開発された）連鎖停止法を用いて行われている。この技術は、修飾ヌクレオチド基質を使用するＤＮＡ合成反応の配列特異的停止を用いる。チェーン・ターミネーター・シークエンシングでは、テンプレートＤＮＡ上の特定の部位で、そのテンプレートのその領域に相補的な短いオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用することによって、伸長を開始する。ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを複製する酵素）を使用してそのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する。前記プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて、４つのデオキシヌクレオチド塩基（ＤＮＡ結合性ブロック）を低濃度の連鎖停止性ヌクレオチド（最も一般的にはジ−デオキシヌクレオチド）と一緒に含める。ＤＮＡポリメラーゼによる連鎖停止性ヌクレオチドの制限組み込みは、結果として、その特定のヌクレオチドを用いる位置だけが停止されている一連の関連ＤＮＡフラグメントを生じさせる。その後、それらのフラグメントを、スラブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動、またはより一般的に今は、粘稠ポリマーが充填された細いガラス管（キャピラリー）での電気泳動によってサイズ分けする。
【００２０】
プライマーの標識付けの代案は、代わりにターミネーターを標識付けすることであり、「ダイ・ターミネーター・シークエンシング」と一般に呼ばれる。このアプローチの主な利点は、標識プライマーアプローチで必要とされる４つではなく、単一の反応で完全シークエンシングセットを行うことができる点である。これは、異なる波長で蛍光を発する別個の蛍光色素でそれぞれのジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーターを標識することによって果たされる。この方法は、ダイプライマーアプローチより容易であり、安価であり、迅速である。
【００２１】
パイロシークエンシングは、数ある中でもＢｉｏｔａｇｅ（ロー・スループット・シークエンシング用）および４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハイ・スループット・シークエンシング用）によって商品化されている。後者のプラットホームは、単一の機械を用いて７時間のランでおおよそ１００メガ塩基をシークエンシングする。（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって商品化されている）アレイベースの方法では、一本鎖ＤＮＡをビーズにアニールし、ＥｍＰＣＲによって増幅する。その後、これらのＤＮＡ結合ビーズをＡＴＰの存在下で光を生じさせる酵素と共に光ファイバーチップ上のウエルに配置する。このチップ上の遊離ヌクレオチドを洗浄すると、ヌクレオチドがそれらの相補的塩基対と連結してＡＴＰが作成されるので、光が生成される。１つ（以上）のヌクレオチドの付加の結果、光シグナルを発生させる反応が生じ、この光シグナルがその計器内のＣＣＤカメラによって記録される。シグナル強度は、１回のヌクレオチドフローで組み込まれるヌクレオチド、例えばホモポリマーストレッチ、の数に比例する。
【００２２】
現行シークエンサー（Ｓｏｌｅｘａ、４５４、Ｓｏｌｉｄ）は、シークエンシングチップまたはビーズ上にターゲット配列を捕捉して増幅した後、シークエンシングする。次世代一分子シークエンシングは、捕捉後の増幅を用いない。アダプター配列またはポリＡテールを捕捉に用いる。あるいは、捕捉工程がないことがある。その代り、（例えば、）捕捉されたポリメラーゼを使用して、通過オリゴヌクレオチドを捕捉し、シークエンシングすることができる。
【００２３】
４５４またはＳｏｌｅｘａによるシークエンシングは、ＤＮＡのランダムフラグメント化によって果たされるライブラリー調製、続いて共通アダプター配列のインビトロライゲーションを概して含む。ｑＮＰＳについては、ＤＮＡのランダムフラグメント化工程を迂回することができ、アダプター配列のインビトロライゲーションは、ヌクレアーゼ保護プローブへのものである場合もあり、またはヌクレアーゼ保護プローブのため遺伝子タグもしくは実験用タグへのものである場合もある。ＳｈｅｎｄｕｒｅおよびＪｉ（２００８）は、シークエンシング方法を総説しており、以下は、４５４およびＳｏｌｅｘａシステムの簡単な要約である。４５４およびＳｏｌｅｘａについては、それぞれエマルジョンＰＣＲまたはブリッジＰＣＲを用いる、シークエンシングフィーチャーとして役立つクローン的クラスター化アプリコンの作成。これらの方法に共通することは、任意の所定の単一ライブラリー分子に由来するＰＣＲアンプリコンが、最終的に、平面支持体上の単一の位置（Ｓｏｌｅｘａ、インサイチューポロニー、ブリッジＰＣＲ）、または回収してアレイにすること（エマルジョンＰＣＲ）ができるマイクロメートルスケールのビーズの表面（４５４、エマルジョンＰＣＲ）、いずれかに空間的にクラスター化されることである。前記シークエンシングプロセス自体は、酵素由来の生化学と画像化に基づくデータ獲得との交互サイクルから成る。これらのプラットホームは、合成によるシークエンシング、すなわちプライマー処理テンプレートの連続伸長、に依存する。酵素的インターロゲーションと画像化の連続反復を用いて、それぞれのアレイフィーチャーについての連続シークエンシング読み取りを蓄積する。それぞれのサイクルでの全アレイの（例えば、ポリメラーゼによって組み込まれた蛍光標識ヌクレオチドの）画像化によって、データを獲得する。
【００２４】
４５４については、シークエンシングプライマーを万能アダプターに、未知配列またはｑＮＰＳシークエンシング可能付加生成物、例えばヌクレアーゼ保護プローブまたは遺伝子もしくは実験用タグ、の始点に隣接する適切な位置および配向でハイブリダイズさせる。アンプリコン担持ビーズをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ポリメラーゼおよび一本鎖結合タンパク質と共にプレインキュベートし、その後、ピコリットルスケールウエルの微細化アレイ上にウエルあたり一ビーズで置き、それによってこの生化学をアレイベースのシークエンシングと互換性のあるものにする。パイロシークエンシングにも必要とされる固定化酵素（ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼ）を担持する、より小さいビーズも添加する。シークエンシング中、その準順序アレイの一方の側面は、シークエンシング試薬を導入および除去するためのフローセルとして機能する。他方の側面は、ＣＣＤベースのシグナル検出のための光ファイバー束に結合している。それぞれのサイクルで、一種類の非標識ヌクレオチドを導入する。この導入が組み込みを生じさせる結果となる配列については、ピロリン酸塩がＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼによって遊離されて光のバーストを発生させ、それをＣＣＤによって特定のアレイ座標について検出する。多数のサイクルにわたって、検出される組み込み事象のパターンが、個々のビーズによって表されるテンプレートの配列を明らかにする。
【００２５】
Ｓｏｌｅｘａについては、増幅シークエンシングフィーチャーをブリッジＰＣＲによって作成する。フォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーの両方がフレキシブルリンカーによって固体支持体に係留されるので、増幅中にいずれの単一テンプレート分子から生ずるすべてのアンプリコンもアレイ上の単一の物理的位置に固定化され、クラスター化されたままである。ブリッジＰＣＲは、Ｂｓｔポリメラーゼでの伸長とホルムアミドでの変性の交互サイクルに依存する点で、多少、非従来的である。結果として生ずる「クラスター」は、それぞれ、〜１，０００のクローナルアンプリコンから成る。数百万のクラスターを、単一のフローセル上にある８つの独立した「レーン」内の区別可能な位置に増幅することができる（ので、８つの独立した実験を同じ計器ラン中に並行してシークエンシングすることができる）。クラスター作成後、アンプリコンは線形化であり、シークエンシングプライマーが、関心のある領域に隣接する万能アダプター配列にハイブリダイズされる。それぞれの配列インターロゲーションサイクルは、修飾ＤＮＡポリメラーゼおよび４つのヌクレオチドの混合物での一塩基伸長から成る。これらのヌクレオチドは、３’ヒドロキシル位置の化学的切断可能部分が、それぞれのサイクルにおいて一塩基組み込みのみを発生させる点、および同じく化学的切断可能な４つの蛍光標識のうちの１つが、それぞれのヌクレオチドの素性に対応する点で、「可逆的ターミネーター」である。一塩基伸長および４チャンネルでの画像の獲得後、両方のグループの化学的切断が次のサイクルのために構成する。３６ｂｐ以下の読み取り長さが、現在、日常的に実行されている。これは、ｑＮＰＳ付加生成物についてのターゲット長を規定する（７シークエンシング開始および実験用タグ塩基、１０から１５塩基のジェネリック捕捉配列２、および５遺伝子タグ塩基）。
【００２６】
他のシークエンシング方法が開発されるまたは開発されるであろうが、当業者には、ｑＮＰＳプローブ、遺伝子タグおよび実験用タグならびに類似のシークエンシング可能付加生成物（下で論ずるとおり）がこれらのシステムでのシークエンシングに適するであろうことがわかるはずである。
【００２７】
ｑＮＰＳ
ｑＮＰＳは、ヌクレアーゼ保護工程、ならびに（必要に応じて）保護しているターゲット分子からヌクレアーゼ保護プローブを解離させる、およびＲＮＡの場合にはＲＮＡターゲットを加水分解する、塩基での処理を用いることにより、組織溶解産物（または精製されたＲＮＡもしくはＤＮＡ）からの不安定なＲＮＡまたは他のターゲット分子を、架橋されているときでさえ、捕捉または分離を伴わずに溶解状態で回収することができる安定な一本鎖ＤＮＡターゲット（ヌクレアーゼ保護プローブ）に化学量論的に変換するために定量的ヌクレアーゼ保護アッセイを用いる、シークエンシングに対する基本的に異なるアプローチである。Ｓ１ヌクレアーゼ加水分解後に残存するヌクレアーゼ保護プローブの量を、その後、シークエンシングによって決定し、このシークエンシングは、該プローブ自体のシークエンシングおよび言及した部分的プローブ配列の検出を含む場合がある。現在、このヌクレアーゼ保護アッセイの生成物（一般に、ｑＮＰＡＴＭと呼ばれる、Ｈ．Ｔ．Ｇ．，Ｉｎｃ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ ８５７０６）は、高感度のアレイベースの読み出しを用いて測定されており、このようにしてそれぞれのターゲット遺伝子のレベルの測定値を提供している。例えば、米国特許第６，２３２，０６６号、米国特許第６，２３８，８６９号、ＷＯ ２００８−１２１９２７を参照のこと（これらは、それら全体が参照により本明細書に援用されている）。多数の出版物にもｑＮＰＡの用途が記載されている（Ａｌｔａｒら、２２０８および２００９、Ｋｒｉｓら、Ｍａｒｔｅｌら２００２および２００４、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｒｉｍｓｚａら、Ｓａｗａｄａら、ならびにＳｅｌｉｇｍａｎｎら）。ｑＮＰＳアッセイを多くの異なる方策で構成することができるが、すべてが、シークエンシングされる中心的付加生成物としてヌクレアーゼ反応（例えば、Ｓ１消化）を生き残るＮＰＰを生成する概念、またはＮＰＰもしくは言及した残存ヌクレアーゼ保護プローブ配列および従ってターゲット遺伝子を特異的に同定および定量するためにその一部もしくはすべてをシークエンシングすることができる付加生成物を生産する概念を用いる。前記プロセスは、ヌクレアーゼ保護プローブによって測定されるターゲット遺伝子部分のまたは同じ遺伝子をターゲットにする多数のヌクレアーゼ保護プローブ間の任意の変化の存在も同定する。
【００２８】
ｑＮＰＳアッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の生成は、ｑＮＰＡについて発表された方法（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００７；Ｍａｒｔｅｌら２００２および２００４）と同様の、図１に図示するように行われる。このアッセイは、異なるターゲットそれぞれに対して特異的であるように設計された１つ以上の異なるヌクレアーゼ保護プローブを含む。従って、１００の遺伝子の測定には、１００の異なるヌクレアーゼ保護プローブ、遺伝子１つにつき１つ、または数百の異なるＮＰＰ、幾つか／遺伝子、の設計および合成が必要である。これらは、最も好ましくはＤＮＡから構成され、長さが約１０から約１００または約２００以上の塩基であり得るが、さらに好ましくは長さが２０から７５塩基、および最も好ましくは長さが２０から５０塩基であり得る。図１工程１は、サンプルとヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）への溶解試薬の大過剰での添加を図示する。この図には、一種類のターゲット分子（ＲＮＡ）およびヌクレアーゼ保護プローブしか図示されていないが、１つのＲＮＡターゲット分子は組織に架橋しているように（「Ｘ」により）示されており、もう１つは可溶性であるように示されている。抽出された（または精製された）ＲＮＡまたは他のターゲット分子でこのアッセイをランすることもできる。前記プローブは、ターゲット分子に特異的であり、同様のＴｍを有するが、シークエンシングによってこれらのプローブを区別することを可能にするために十分一意的な配列を有するように、または遺伝子タグを取り付けるための特異的ハイブリダイゼーションを支持するように設計される。サンプルを好ましくは９５℃付近または約１０５℃でおおよそ１０分間加熱してターゲット分子を変性させ、それによってそれらを一本鎖にし、ハイブリダイゼーションに利用できるようにする。温度とバッファー組成物の組み合わせが一本鎖ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡの形成につながらない限り、異なる変性溶液を使用してこの変性温度を変更することができる。次に、サンプルを指定温度で一定の期間（例えば、５０−ｍｅｒヌクレアーゼ保護プローブについては、６０℃で６時間）インキュベートして、ターゲット分子へのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする。ヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）またはヌクレアーゼのカクテルを添加し、インキュベーションを（例えば、５０−ｍｅｒヌクレアーゼ保護プローブについては５０℃で６０分間）行い、この時間の間に、ヌクレアーゼは、ターゲット分子にハイブリダイズしていない（および従って未保護である）すべての過剰なヌクレアーゼ保護プローブ、サンプル中のすべての非ターゲット分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、およびターゲット分子のオーバーハング一本鎖領域を破壊し、ならびに所望される場合には、ターゲット配列と対合していない塩基でそのプローブを切断し、それによって理論量のターゲット分子／ヌクレアーゼ保護プローブデュプレックス（工程２）または部分的プローブデュプレックス（言及した非対合が存在する場合）が残る。下記参照。この図において、「Ｘ」は、固定から起こる組織へのターゲット分子の架橋を表す。ヌクレアーゼ保護プローブは、架橋を逆転させる必要なく架橋ターゲット分子にハイブリダイズする。非対合塩基をもたらす単一ヌクレオチドの差が切断されないように条件を選択することができ、またはハイブリダイズしたヌクレアーゼ保護プローブの端までの非対合塩基だけを切断するヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼを使用することができる。
【００２９】
ヌクレアーゼ処理後、前記プローブは、架橋ターゲット分子配列と依然として会合していることがある。しかし、工程３において塩基を添加し、サンプルを９５℃に加熱する。これは、ターゲット分子／ヌクレアーゼ保護プローブ二量体を解離させ、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブが一本鎖状態で残り、およびＲＮＡの場合にはＲＮＡターゲット分子を加水分解する。
【００３０】
ｑＮＰＳの場合、この時点の後の工程は、ヌクレアーゼ保護プローブがどのようにシークエンシングされることになるのかによって、様々であり得る。ＮＰＰから形成される異なる付加生成物を連続図で図示する。遺伝子タグおよび実験用タグを使用すべきでない場合には、プローブを、シークエンシングシステムに適するアダプター分子と直接ライゲートすることができ（または例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｔｄｔ、を使用して、ポリＡテールを付加させることができ）、およびシークエンシングに用いることができる（図２Ａ）。図１（工程４から８）および図２は、ハイブリダイゼーションを可能にする温度でのそれぞれのヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰量のタグリンカーの添加（およびとのインキュベーション）を図示する。幾つかの可能なシークエンシング可能付加生成物をタグリンカーの使用に基づいて形成することができる。例えば、タグリンカーの２５塩基を、１つの特異的ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端と相補的であるように設計することができ、従って、それらはそのプローブにハイブリダイズすることとなる（工程４）。前記タグリンカーの残部を、遺伝子タグ配列（図２Ｂ）および／または（場合により）実験用タグ配列のジェネリック（もしくは実験特異的配列）部分（図２Ｃ）、または実験用タグのジェネリック（もしくは特異的）部分のみ（図２Ｄ）を、過剰量のこれらのタグの添加（図１工程５）、続いての、タグリンカーへのそれらのハイブリダイゼーションを可能にする温度でのインキュベーションの後にハイブリダイズする（および従って、ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に捕捉する）ように設計することができる。これらの工程を組み合わせることができ、または別々に行うことができることに留意すること。シークエンサーが、シークエンシングすべき分子の一端または両端にアダプター捕捉配列を必要とする場合、タグリンカーをヌクレアーゼ保護プローブの完全長に、およびさらにその（例えば、５’）アダプター配列に相補的である配列を含むように、伸長することができる。しかし、さらに好ましくは、ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端にハイブリダイズする、および５’アダプター配列に相補的である配列を含有する、第二アダプターリンカーを付加させ（工程６）、その後、そのアダプター配列を付加させる（工程７）。この同じ場合、遺伝子タグまたは実験用タグを、どちらが３’の最後から二番目の（ｐｅｎｔ−ｕｌｔｉｍａｔｅ）配列であろうと、シークエンシングのために３’アダプター配列と共に合成することができる。完全付加生成物を一緒にハイブリダイズした後、角矢印によって図１（工程８）および図２に図示するように、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ（または例えばＰｉｎｏら、Ｌｕｔａｙら、Ｓｃｈａｂａｒｏｖａら、または米国特許第７，０３３，７５３号によって記載されているような、非酵素的化学）を用いて、配列を互いにライゲートして、完全シークエンシング可能付加生成物を形成することができる。この方法において、シークエンシングされることとなるターゲットＲＮＡ、ＤＮＡなどに由来するすべてのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションおよび（例えば、酵素的または非酵素的）ライゲーションによって組み立てされたならびにアダプター配列または（例えば酵素的）ポリアデニル化によってシークエンシングチップ上への捕捉用に調製された合成物である。図示されているシークエンシング可能付加生成物はＮＰＰを含有するが、当業者には、その代わりにタグリンカー含有付加生成物をシークエンシングされる付加生成物として調製（シークエンシング可能付加生成物として調製）できること、または破壊されないならば、ターゲットオリゴヌクレオチドをシークエンシング可能付加生成物として調製できることがわかるであろう。ターゲットオリゴヌクレオチドが、シークエンシングされる、またはシークエンシング可能付加生成物を含む場合には、ＮＰＰは、シークエンシング不能成分（ｎｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｂｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、例えばＬＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ペプチド核酸、アプタマーなど、から成り得る。両端にアダプターを有するシークエンシング可能付加生成物を、それが（例えば、第二ヌクレアーゼ反応によって）切断されると２つのシークエンシング可能付加生成物をもたらすように、調製することができる。
【００３１】
シークエンシング可能付加生成物にポリＡ（またはポリＴ）捕捉配列を取り付ける方策は非常に沢山ある。１つは、（例えば、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、Ｔｄｔ、を使用して）酵素的にである。もう１つは、ハイブリダイゼーションおよびライゲーションによる。三番目は、単純に、シークエンシング可能付加生成物を停止させる３’オリゴヌクレオチド上への合成による。理想的には、シークエンシング可能付加生成物のみをシークエンシング媒体に結合させ、副生成物を削除する。例えば、図３または４に図示するアダプター配列は、ポリＡであり得、クリーンアップは、ゲルまたはヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）により得る。ヌクレアーゼクリーンアップの場合、保護用配列は、ポリＴを含有するだろう。
【００３２】
実験用タグの使用は、あるサンプルと別のものとの区別である。工程１から５は、それぞれのサンプルについて別個のアッセイ（例えば、マイクロプレートの別個のウエル）の中で行われるだろうが、タグリンカーは、実験用タグのジェネリック配列も捕捉するように設計されており（図２Ｃ参照）、該実験用タグ（例えば、３’アダプター配列も含有する）は、工程５の後に付加されることとなり、その後、工程６から８まではすべて、別個の実験または別個の患者サンプルをはっきり区別する別個の反応容器内で行われる。それぞれの実験用タグに付加されるジェネリック配列ではなく特定の実験用タグ配列に対する相補的配列を含有する種々のタグリンカーを実験用タグごとに合成し、それによって実験用タグの長さをちょうどその実験特異的配列に短縮することができることは、当業者にはわかるはずである。実験用タグ（または遺伝子タグと実験用タグ）のライゲーション後、実験用タグの配列により、そのシークエンシングされた付加生成物がどの反応に、またはどの患者に由来するかが同定されるであろうから、別個のサンプルを併せることができ、そのため、ゲル精製（または実際の分離を必要としない他の精製またはクリーンアップ方法）の場合には、シークエンシングラン１回につき１つのゲル（またはクリーンアップまたは精製反応またはプロセス）しかランする必要がない。
【００３３】
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでのライゲーションは、作用する５’リン酸塩を必要とする。概して、オリゴヌクレオチドは５’リン酸塩なしで合成されるが、合成中に５’リン酸塩を付加させることができる。従って、アダプターリンカーおよびタグリンカーを、互いに接しているが５’リン酸塩がないように合成すると、それらは互いにライゲートされることとならず、その結果、例えばその後のクリーンアップが助長される。（合成に加えて）リン酸塩をオリゴヌクレオチドに付加させるもう１つの方策は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰの使用である。
【００３４】
非酵素的方法をはじめとする他のライゲーション方法を用いてもよい。しかし、ライゲーションは、必須工程ではない。ＮＰＰのタグリンカーおよびタグとのハイブリダイゼーション（すなわち、ヌクレアーゼ保護プローブの一部として組み込まれたタグを相補的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｏｅｏｔｉｄｅ）によって保護することができる場合）が、ヌクレアーゼ耐性であるまたは精製可能である複合体を形成する場合、ライゲーションは必要ない。前記タグが既にＮＰＰに組み込まれており、ＮＰＰおよび従ってターゲットＤＮＡまたはＲＮＡの量を反映することとなるからであり、ならびにＮＰＰが、および従って、シークエンシングされたときはターゲットＤＮＡ／ＲＮＡが、シークエンシングの時点でそれがＮＰＰから分離されていなかったとしても、前記タグにより同定されることとなるからである。
【００３５】
前の工程すべてが、ゲル精製または他の分離方法（分離が必要または所望される場合）まで分離のない、試薬添加およびインキュベーションを表す。過剰量のそれぞれの試薬が反応混合物中に残存し（例えば、図１のそれぞれの成長付加生成物の左側に図示するとおり）、不完全付加生成物、例えば、ヌクレアーゼ保護プローブではなくタグ分子とタグリンカーのハイブリダイゼーションからの結果、またはアダプター分子のアダプターリンカーへの、しかしまたヌクレアーゼ保護プローブを含まない複合体での、ハイブリダイゼーションからの結果、も残存する。この時点で、幾つかの次の工程が可能であり、それらのうちの１つだけを図示する（ゲル精製）。
【００３６】
好ましい次の工程は、シークエンシングビーズまたはチップ上への捕捉前の混合物のクリーンアップである。ヌクレアーゼ保護プローブにハイブリダイズするアダプターリンカーおよびタグリンカーの配列を幾つかの塩基によって分離する場合（付加生成物組み立て後に酵素的にリン酸塩を付加させる場合）、またはそれらが（それらが互いに接していたとしても）リン酸化されない場合、それらは互いにライゲートされないだろう。その後、すべての実験物または患者サンプルの反応混合物を一緒にプールし、加熱してまたは別様に変性させて一本鎖オリゴヌクレオチドを作り、そのシークエンシング可能付加生成物を、例えばその相当長い長さに基づいてゲル電気泳動によって、精製することができる。当該技術分野において公知のまたは当該技術分野から適応されるクリーンアップを果たすための他の手段を利用することもできる。
【００３７】
図２Ｂから２Ｅは、アダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。代わりに、それらをこれらの配列を用いず、シークエンシングチップ上への何らかの他の捕捉形態、またはシークエンシングのための調製を用いて調製してもよい。例えば、代わりに、ポリＡテールをシークエンシング可能付加生成物の３’末端に合成してもよい。相補鎖をポリアデニル化しないことを所望する場合には、例えば、３’アミノ残基または３’炭素（例えば、Ｃ３）スペーサーを有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、その配列の３’末端をブロックすることができる。これは、シークエンシング可能付加生成物の一部としてのターゲットそれ自体またはターゲットの生合成誘導体ではなく、シークエンシング可能付加生成物を調製するために合成配列を使用することの利点である。一部のシークエンシングシステムは、例えば、係留されたポリメラーゼもしくはオリゴヌクレオチド結合部分によって、あるいは化学的または電気もしくは電気化学的手段によって、シークエンシング可能付加生成物を直接捕捉することができ、従って、このシークエンシング可能付加生成物は、特異的アダプターまたは捕捉配列もしくは部分を必要としない。
【００３８】
シークエンシングのための反応生成物の好ましいクリーンアップ方法は、第二ヌクレアーゼ消化を、例えば再びＳ１ヌクレアーゼの使用により、行う方法である。実験用タグ／アダプター配列をライゲーション前に付加させる１つの事例において、ならびにアダプターリンカーおよびタグリンカー（一方の５’末端がリン酸化されている）を互いに接するように設計し、相補的３’実験用タグ／アダプター配列を、実験用タグ／３’アダプター配列へのハイブリダイゼーション後にそれをタグリンカーにライゲートすることができるように付加させる場合、ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物とリンカー／保護用相補的配列（それぞれ）の両方が、該リンカーが該ヌクレアーゼ保護プローブを会合すると、互いにライゲートして、互いにハイブリダイズした２つの完全付加生成物を形成することとなる（図３Ａ）。これら２つの付加生成物より短いすべての付加生成物の解離をもたらす温度でのＳ１ヌクレアーゼでの処理は、すべての他の化学種（それらの一部を図３Ａに図示する）を破壊し、その結果、ヌクレアーゼ保護プローブを含有するシークエンシング可能付加生成物、およびリンカー付加生成物だけが残る。変性されると、適切な捕捉アダプター配列を有する付加生成物（ヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物）のみがシークエンシングチップまたはビーズ上に捕捉されることとなり、リンカー含有付加生成物は、洗い落されることとなる。この「二重Ｓ１」アプローチの利点は、付加生成物がシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されるまで分離工程がない点である。図４Ａは、タグリンカーが、実験用タグ（ＥＴ）可変配列（ＶＳ）（シークエンシングされたときにそのウエルまたは実験を一意的に同定する配列）に相補的な残基にイノシンを含有し、および次に３’アダプターに相補的な配列（３’Ａｃｏｍｐ）を含有する、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物を形成するための異なるスキームを図示する。この同じイノシン含有リンカーを、上で説明したシークエンシング可能付加生成物（図１および２）を形成するために、および（アダプター配列の使用ではなく）ポリアデニル化を必要とする場合に、あるいはゲル精製または他の分離もしくは精製方法を用いる場合に、使用することができるだろう。図４Ｂは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、５’アダプタータグ／タグリンカー／３’アダプター相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。Ｈｅｌｉｃｏｓ一分子シークエンシング法などの、増幅を必要としないシステムを用いるシークエンシングの場合、ポリＡテールを取り付ける必要があり得る。図４ＣおよびＤは、クリーンアップのためにゲル精製を（例えば、ポリアデニル化前に）用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。両方の場合、ＮＰＰ自体をシークエンシングしないので、適切な遺伝子タグおよび実験用タグをＮＰＰにハイブリダイズさせてそれらを互いにライゲートできるようにするためにタグリンカーしか必要としない。ヌクレアーゼ工程後、ポリＡテール（ｔｒａｉｌ）を３’末端に酵素的に合成する。これは、結果として、タグリンカーの３’末端でポリＡテールを合成させることができるので、それもシークエンシングされることとなり、またはタグリンカーの３’末端がブロックされている場合には、ポリＡテールがＮＰＰ含有付加生成物上でのみ合成されることとなる。ＮＰＰを全部または一部シークエンシングして、ターゲット遺伝子を同定する場合；ポリＡテールまたはアダプター（必要に応じて）をＮＰＰに直接取り付けることができ、または実験用タグおよび／またはタグリンカーによって取り付けてそれらのシークエンシングを可能にすることができる。ＮＰＰがターゲット（例えば）ＤＮＡにハイブリダイズする場合、およびそのシステムがＮＰＰの直接シークエンシングを用いる場合、ＮＰＰ保護（例えば、ＤＮＡ）ターゲット配列もシークエンシングすることができ、ならびにＮＰＰと同時におよび同じ様式でのシークエンシングのために修飾することができる。同様に、ＮＰＰを含有するシークエンシング可能付加生成物を形成するように構築された一切の相補的リンカーを並行して処理することができ、シークエンシング可能付加生成物に変換することもできる。これらの事例では、その後２つの相補的配列を検出、同定および計数することとなり、その結果、プロセスに一定のレベルの冗長性がもたらされる。
【００３９】
当業者は、シークエンシング前に反応混合物をクリーンアップするための他の方法、例えば、ゲル精製、またはビオチン／アビジン捕捉および遊離、またはキャピラリー電気泳動、または多数の分離もしくはクリーンアップ方法のいずれかの使用、を考え出すことができる。例えば、シークエンシングのために、ヌクレアーゼ保護プローブをビオチン化しまたはヌクレアーゼ保護プローブに他のハプテン（ｈａｐｔａｎ）を取り付け、アビジンまたは抗ハプテン（ｈａｐｔａｎ）被覆ビーズまたは表面に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。同様に、シークエンシングのために、ライゲートされたヌクレアーゼ保護プローブ付加生成物を相補的オリゴヌクレオチド上に捕捉し、洗浄し、その後、遊離させることができる。前記捕捉オリゴヌクレオチドは、特に特異的である必要はない。ｑＮＰＳプロセスは、ゲノムまたはトランスクリプトームの大部分を排除し、ターゲットにハイブリダイズされたＮＰＰのみを残すからであり、および特異性がシークエンシングレベルで決定されることとなるためである。
【００４０】
当業者は、ヌクレアーゼ保護プローブを含有する付加生成物ではなく、リンカー複合体をクリーンアップし、シークエンシングできることもわかるはずである。従って、シークエンシング可能付加生成物は、ＮＰＰにハイブリダイズするものである場合があり、またはＮＰＰに由来する。これらの付加生成物の２つの例を図５に図示するが、他のものを構成してもよい。図５Ａは、前の図および論述と同じＮＰＰを使用を図示するものであるが、この場合は、３’アダプターとＮＰＰに対する相補的配列とオーバーハング遺伝子タグ配列とを含有するオリゴヌクレオチドを付加させ、このオーバーハング遺伝子タグ配列は、ジェネリック配列内で終わり、そしてまたそのジェネリック配列が実験用タグリンカーを捕捉する。そしてまた、この実験用タグリンカーが、５’アダプター配列も含有する実験用タグを捕捉する。ヌクレアーゼクリーンアップを用いることとなる場合、保護用５’アダプター配列プローブを付加させる必要がある。ポリＡテールをシークエンシングに必要とする場合には、前記アダプター配列を必要としないので、含める必要がない。図５Ｂは、３’から５’へのものであるヌクレアーゼ保護プローブの使用を図示する。この構築物は、前の図に図示した、または前の論述の中で説明した、および後で言及する、任意の付加生成物のために用いることができる。遺伝子タグを使用するのではなく、ＮＰＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、リンカー）の部分をシークエンシングして遺伝子を同定してもよい。当業者には、ＮＰＰを含有するまたはしないシークエンシング用の付加生成物いずれかを生じさせる結果となるプローブのこれらの配置に関する非常に多くの変形および組み合わせがあることがわかるであろう。
【００４１】
シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残る生成物であって第二ヌクレアーゼ反応からの生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物をテンプレートとして用いる。シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、１つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。シークエンシング可能付加生成物を含む、またはシークエンシング可能付加生成物の組み立てに使用される、合成オリゴヌクレオチドを、ポリＡ配列のライゲーションまたは付加などの酵素的または非酵素的修飾を可能にするように、または可能にしないように、調製することができる。それらは、天然または非天然ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸、またはＬＮＡ、またはペプチド核酸、またはＰＮＡなど）を含有する場合がある。シークエンシング前にそれらを溶液中でのもしくは表面上での増幅に付すことができ、またはヌクレアーゼ保護工程の前に増幅を行うことができる。
【００４２】
４５４またはＳｏｌｅｘａプラットホームでのシークエンシングについては、シークエンシング可能付加生成物を、先ず、捕捉および増幅しなければならない。これは、概して、ポリメラーゼ反応を必要とする。ｑＮＰＳに使用される典型的な溶解バッファーは、Ｓ１活性を可能にする上に、ヌクレアーゼを変性してＲＮＡの破壊を防止するように、およびハイブリダイゼーションを助長するように設計されたものである。このタイプの溶液は、ポリメラーゼ活性を阻害することができ、従って、チップを最初に洗浄しない限り増幅を阻害することができる。洗浄を用いて、捕捉アダプター配列を有さないヌクレオチドを除去することもできる。
【００４３】
シークエンシングが捕捉のためにポリＡテールを利用する場合、これは、３’末端でポリＡ残基を伸長するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）を使用してクリーンアップ後に合成することができる。リンカー含有付加生成物、またはシークエンシングを意図していない付加生成物、の３’末端がポリＡテールで伸長されないようにするために、タグリンカーの３’残基を、ポリアデニル化を支持しない残基または修飾残基で修飾することができる（図４Ｃおよび４Ｄ）。
【００４４】
ヌクレアーゼ保護プローブを含有する適切に設計された付加生成物および他の情報含有配列でのリバースシークエンシングを用いることができること、または前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物の代わりに、ヌクレアーゼ保護プローブに対する相補的配列（場合によっては「リンカー」と呼ばれる）および付加生成物構築物を、該相補的付加生成物が適切に設計されている限り（例えば、図５参照）、または例えば本出願において前記ヌクレアーゼ保護プローブ含有付加生成物について記載するように、シークエンシングすることができることは、当業者にはわかるはずである。
【００４５】
９５℃での（例えばｑＮＰＡ）溶解バッファー中でのインキュベーションは、ＲＮＡをハイブリダイゼーションに利用できるようにするが、この溶解産物のＰＣＲは、結果としてＤＮＡの増幅を生じさせる場合があり、これは、溶解産物中にゲノムＤＮＡがある場合があり、まさしく、ＮＰＰのハイブリダイゼーションのために十分に変性されないことを明示する。１０５℃でのインキュベーションは、ゲノムＤＮＡをＮＰＰプローブハイブリダイゼーションに利用できるようにする。１０５℃でインキュベーション後のＳ１（ヌクレアーゼ）プロセッシングは、すべてのハイブリダイズしていないＤＮＡならびにハイブリダイズしていなＲＮＡおよびＮＰＰを破壊する。ＮＰＰの３’または５’配列に相補的な配列を有する適切に設計されたリンカープローブの使用により、アダプターを一本鎖ＮＰＰにハイブリダイズし、ライゲートするため、Ｓ１加水分解を逃れるいずれの（例えば、二本鎖）ＤＮＡ（またはさらに言えばＲＮＡ）も、それらにライゲートされたアダプターを有するはずがなく、従って、４５４およびＳｏｌｅｘａタイプのシークエンサーによって用いられるシークエンシングビーズまたはチップ上に捕捉されないだろうし、シークエンシングされないだろう。ＮＰＰ相補的オリゴヌクレオチドをシークエンシングする場合には、少なくとも１つのアダプターをその配列の一部として直接組み込むことができ、従って、アダプター配列が、Ｓ１加水分解を逃れたかもしれないＤＮＡにライゲートされる可能性はない。ゲル（または他の）精製では、ＤＮＡを、ライゲートされた付加生成物から分離することができ、従って、シークエンシングの前に除去することができる。ポリＡテールを実験用タグに（または実験用タグを使用しない場合には遺伝子タグに、または実験用タグおよび遺伝子タグを使用しない場合にはＮＰＰに）付加させる一分子シークエンシングについては、いずれのＤＮＡも、シークエンシング付加生成物のゲル精製を用いる場合のようにそれが最初に（ポリアデニル化前に）分離されない限り、または例えば、例えば１０５℃での溶解、続いてＮＰＰハイブリダイゼーションおよびその後、適切な条件下でのヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１）工程を用いる場合のように最初に破壊されない限り、ポリアデニル化することができる。このプロトコルでは、ＮＰＰがｍＲＮＡのスプライス接合部をターゲットにできるため、（ｍＲＮＡの測定に干渉し得る）ＤＮＡは測定されないだろう。
【００４６】
ｍｉＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）も測定できるが、この場合、ＮＰＰは、ｍｉＲＮＡ長にマッチする（例えば）約２２塩基の長さしかないであろう。メチル化が起こったまたは起こっていない部位に塩基ミスマッチを作ることにより、および相補的イノシン残基の賢明な使用により、ミスマッチ塩基残基を切断するさらなるヌクレアーゼまたは制限酵素の使用により、ＤＮＡメチル化ばかりでなくＤＮＡおよび発現されたＳＮＰも測定することができる。ＮＰＰによって保護されたこれらの付加生成物の直接シークエンシングも可能である。例えば、ＳＮＰが発生し得る配列に対するＮＰＰの使用；一塩基ミスマッチが切断されない条件、およびその後、生き残ったＤＮＡターゲット配列をハイブリダイゼーションのＴｍより上でのインキュベーションによりＮＰＰから解離させることができる条件下でのＳ１で処理；続いて、ターゲットＤＮＡにハイブリダイズしてアダプターの適切な付加を可能にする大過剰のリンカーの添加（解離されたＮＰＰは、この大過剰のリンカーによって再会合が競合的に防止されることとなる）などによって、ＤＮＡ ＳＮＰをシークエンシングして、ターゲットＤＮＡ自体を、所望される場合には実験用タグと共に、含むシークエンシング可能付加生成物を作ることができる。この修飾では、ＮＰＰは、第一ヌクレアーゼ工程中、ターゲットＤＮＡを確実に保護するために保護された配列内にＳＮＰ部位または多数のＳＮＰもしくは突然変異部位に相補的なイノシン（単数もしくは複数）を含有することがあり、および同様に、ヌクレアーゼクリーンアップ工程を用いる場合、リンカーオリゴヌクレオチドは、確実に保護するためにイノシンを含有することがある。あるいは、突然変異している可能性のある塩基（単数または複数）を有するＮＰＰプローブを使用することができる。加えて、野生型配列ＮＰＰをヌクレアーゼによりＳＮＰまたは突然変異ミスマッチで切断するとき、ＮＰＰの特定の配列をプロセッシングし、シークエンシングして、突然変異の存在および位置を同定することができる。いずれのミスマッチも（例えば、エキソヌクレアーゼを使用して、またはエンドヌクレアーゼであまりストリンジェントでない条件により、または決断に多数の隣接ミスマッチを必要とするヌクレアーゼを使用することにより）切断および加水分解されない条件下で、ターゲット（例えば、ＤＮＡ）含有突然変異領域を選択するためにＮＰＰを使用する場合には、そのターゲット（例えば、ＤＮＡ）をプロセッシングし、シークエンシングして、その突然変異を正確に決定することができる。
【００４７】
シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためにアダプターとして使用することができる、または遺伝子タグもしくは実験用タグとして役立つ、非ターゲットオリゴヌクレオチド配列をＮＰＰに、それを合成する際に、直接組み込むことも可能である。この非ターゲット配列は、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズせず、通常はヌクレアーゼによって切断されるだろう。しかし、ＮＰＰのこの非ターゲット配列と相補的オリゴヌクレオチドを（ヌクレアーゼ工程の前だが、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有するサンプルにＮＰＰを付加させる前、付加させると同時、または付加させた後、いずれかに）ハイブリダイズさせる場合には、ヌクレアーゼで処理するとき、すべての塩基が相補的塩基にハイブリダイズされるので、非ターゲットＮＰＰ配列を保護し、ＮＰＰは、インタクトなままであろう。ＮＰＰの核酸ターゲット配列と非ターゲット配列の間に単一のハイブリダイズされていない塩基があったとしてもこれが当てはまるように、条件を修飾することができる。この方法は、ライゲーション反応を一切用いずにシークエンシングチップ上に捕捉し、シークエンシングすることができる直接シークエンシング可能なＮＰＰ付加生成物を、必要とされるアダプター配列を取り付けて、生産することができる。当業者は、短い非ターゲット配列／相補的配列デュプレックスを除去するためにシークエンシング前に反応をクリーンアップする方法を設計することができる。例えば、塩基中でヌクレアーゼ後サンプルを加熱してデュプレックスを解離させ、その後、ＮＰＰの非ターゲット配列と核酸ターゲット特異的配列の一部（例えば、最初の２５塩基）とに相補的である、過剰なオリゴヌクレオチドを添加する。その後、この長いほうのオリゴヌクレオチドはハイブリダイズできるが、短いほうの非ターゲット配列相補的オリゴヌクレオチドはできない温度でハイブリダイズを行うと、第二ヌクレアーゼ反応後、核酸ターゲットにハイブリダイズしたＮＰＰのみを含有する調製品が得られる。その後、これを加熱してその解離を生じさせて、シークエンシングチップに付加させることができ、そこでそのアダプター配列によってそれを捕捉し、シークエンシングすることができる。
【００４８】
感度増加が望まれる場合、ターゲットオリゴヌクレオチドまたはそれに由来する生成物を増幅することができ、またはＮＰＰ生成物を先ずＰＣＲもしくは他の形態の酵素的増幅に付すことができる。その後、その得られた生成物を、非増幅ＮＰＰ生成物と同じ様式でシークエンシング用に調製することができ、または増幅プロセス中に遺伝子タグおよび／もしくは実験用タグ、および／もしくはアダプター配列を、例えばプライマーおよび伸長構築物の一部として組み込むことができる。増幅を必要としないときであっても、１または２サイクルのＰＣＲまたは酵素的反応を行って、遺伝子タグ、および／または実験用タグ、および／またはアダプターを取り付けることができる。その後の生合成工程（単数または複数）によってＮＰＰから作成される付加生成物も、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物またはＮＰＰに相補的な付加生成物の作成について説明したものなどのハイブリダイゼーション反応によって、完成させることができる。クリーンアップは、ゲルもしくは他の精製方法による場合があり、あるいは十分に保護して、その後のＳ１（もしくは他のヌクレアーゼ）反応または当該技術分野において公知のもしくは当該技術分野から適応される他の手段による場合がある。
【００４９】
もう１つのタイプのＮＰＰは、Ｐａｄｌｏｃｋ（ＰａｄＰ）または環状ＤＮＡプローブに類似した（例えば、ＢａｎｅｒらまたはＰｒｉｎｓらによって記載されている構築物に類似した）、環状プローブである。ＰａｄＰシークエンシング可能付加生成物を図９に図示する。このＰａｄＰ構築物は、サンプル中のターゲットへのプローブのハイブリダイゼーション後に（例えば）エキソヌクレアーゼを使用しても切断されない、アダプターおよびタグを含有するように構築することができる。例えば、ＰａｄＰプローブは、５’アダプターを含有し、およびターゲットにハイブリダイズする約１０から約３０または約５０または約１００または約２００塩基をその３’末端に含有するように合成することができる。スペーサー領域、次に制限ヌクレアーゼ部位、次に５’遺伝子タグ、次に、ライゲーションを支持するためにその５’末端がリン酸化されている、ターゲット（別の約１０、または約３０、または約５０または約１００または約２００塩基）にハイブリダイズするＰａｄＰプローブの残部があり得る。従って、ターゲットにハイブリダイズすると（工程１）ＰａｄＰプローブの２つの半分がライゲートされて環状ＤＮＡを形成することができる。サイクリングにより、これを増幅することができる（工程２）。ライゲーション後、そのミックスを約９５℃に加熱して、環状プローブをターゲット（例えば、ＲＮＡ）から解離させることができ、その後、温度を低下させて、過剰なプローブを、この場合は増幅テンプレートとして役立つターゲット（例えば、ＲＮＡ）に再びハイブリダイズさせることができ、その後、ライゲーションの後、温度を再び上昇させて、約３０サイクルの１シリーズにつき約３０コピーの環状プローブ／ターゲットテンプレートＲＮＡを生成する。工程３では、エキソヌクレアーゼを使用して、過剰なＰａｄＰを含めてすべての線状ＤＮＡ（および例えばターゲットＲＮＡ）を破壊し、環状ＰａｄＰプローブのみを残す。工程４は、所望される場合には実験用タグを付けるプロセスを開始し、先ず制限酵素で処理して環状ＤＮＡプローブを開き、次にタグリンカーを使用して実験用タグをハイブリダイズし、ライゲートさせる。ＰａｄＰプローブを形成するために用いる実験条件は説明した。
【００５０】
直接シークエンシングすることができるＮＰＰ構築物を設計することができる、「直接ヌクレアーゼプローブシークエンシング（ＤＮＰＳ）」と呼ばれる方法。１つのそのような構築物を図１に図示する。ヌクレアーゼ保護プローブを直接シークエンシングする場合であって、シークエンシングのためにアダプター配列を付加させるまたはポリＡテールもしくは他の捕捉分子を付加させる現行の商業的方法を用いる場合、Ｓ１生成物を直接シークエンシングすることができる。しかし、リンカーの使用によって付加生成物をライゲートする場合、アダプター、遺伝子タグ、実験用タグまたは他の配列の付加のために、過剰なタグプローブ、アダプターまたはリンカーをシークエンシング前に「クリーンアップ」工程で排除する必要があり得る。幾つかの戦略を用いることができる。最も簡単な戦略は、シークエンシングすることとなるライゲートされた付加生成物（例えば、プローブと検出リンカーと実験用タグと遺伝子タグと必要に応じてアダプターとの複合体）の融解温度（Ｔｍ）より下だが、完全付加生成物自体ではなく、リンカーおよび該付加生成物の成分と複合体を形成しているリンカーの融解温度より上の温度でのインキュベーションである。このようにして、それらは融解分離し、ハイブリダイズされていないリンカー、実験用および遺伝子タグと共に、Ｓ１（または他のヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼカクテル）によって破壊される。その後、例えば９５℃への加熱により、またはプロテイナーゼＫの使用により酵素的に、または阻害剤の使用により、（例えば）Ｓ１活性を破壊する。この「２工程」ヌクレアーゼ保護アプローチは、シークエンシング表面に捕捉する時点まで、一切の分離工程を伴わない添加のみのプロセスであるプロトコルをもたらす結果となる。
【００５１】
遺伝子のシークエンシング、およびヌクレアーゼ保護プローブのシークエンシングによる存在度の決定を、ヌクレアーゼ保護プローブ全体をシークエンシングすることなく行うことができる。末端２から約７または約２５塩基の組み合わせが、測定されるそれぞれの遺伝子について一意的な配列を表すようにヌクレアーゼ保護プローブの３’末端を選択する場合には、これが、遺伝子を同定するためにシークエンシングを必要とするヌクレアーゼ保護プローブのすべてであり、およびシークエンシングされたそのような付加生成物の数を計数することにより、サンプル中のそれぞれの遺伝子の量である。実験用タグ（実験ごとに異なるもの）をヌクレアーゼ保護プローブに追加して、多数の実験物のｑＮＰＡ生成物をシークエンシングのために一緒にプールすることを可能にすることができる。
【００５２】
スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の例、ならびにヌクレアーゼ保護工程完了後の結果を図６Ａに図示する。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。これらの一塩基修飾は、発現されたＳＮＰを検出するためにＲＮａｓｅなどのさらなる酵素の活性を利用することにより、またはメチル化ＤＮＡ部位を検出するために重亜硫酸塩処理、その後のウラシルＤＮＡグリコシル化の併用効果を利用することによって検出することができる。当業者には、ＤＮＡ ＳＮＰをシークエンシングによって同様に検出および測定することができる方法がわかるはずである。それぞれの場合、ターゲット遺伝子またはターゲット遺伝子のすべての変異体に共通の対照配列を、関心のある（突然変異またはメチル化している可能性のある）部位に特異的なプローブと共に設計する。特定のスプライス接合部、欠失されることがある特定のエキソン、または特定の遺伝子融合体にハイブリダイズするようにプローブを設計することもできる。赤色「ｘ」は、保護されていない、従って、例えばＳ１によって分解されるプローブ配列、またはターゲット配列が切断される、従ってヌクレアーゼ保護プローブが融解して外れ、Ｓ１によって破壊されるであろう場所を示す。単一のミスマッチ塩基のみの場合、例えば、ＲＮａｓｅなどのＳ１に、または単一塩基を切断する別の酵素の使用に、さらなる酵素（単数または複数）を加える必要があり得る。当業者には、これらの切断を行うために単独で使用するまたは併用することができる非常に多くの酵素、修飾酵素、または分子が分かるであろう。ヌクレアーゼ保護プローブを（本発明の他の箇所で説明する方法を用いて）実験用タグの付加によりさらに修飾して、多数の実験からのサンプルを単一シークエンシングランに統合させることができる。シークエンシングアダプター配列をヌクレアーゼ保護プローブに（または、実験用タグを用いる場合、その実験用タグ自体がその３’末端にアダプター配列を有するように合成されていないならば、その実験用タグにも）ライゲートすることができる。ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端をその合成中にリン酸化することができ、その後、そのヌクレアーゼ保護プローブの５’塩基（例えば、２５塩基）にハイブリダイズするリンカーであって、５’アダプター配列にハイブリダイズする相補的配列を有するリンカーを使用し、このようにして、（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して）それを共にライゲートすることができるアダプターをヌクレアーゼ保護プローブの５’末端に追加することができる。あるいは、ＡＴＰの付加および適切なＤＮＡリガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）の使用により、自己リン酸化およびライゲートすることができる。３’アダプターについては、アダプター自体をリン酸化することができ、ならびにリンカーを、ヌクレアーゼ保護プローブの３’塩基（例えば、２５塩基）にハイブリダイズするように、および３’アダプターに対する相補的配列を含有するように設計することができるので、そのリンカーがヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に、該プローブへのそのライゲーションを可能にする様式で、ハイブリダイズされ、並置される。適切な条件下では、代りに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを使用して５’末端をリン酸化し、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートすることができる。他の適切な条件下では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ自体をリン酸化してライゲートすることができる。ポリＡテールをヌクレアーゼ保護プローブの３’末端に付加させることが必要な場合は、Ｔｄｔを使用してそれを付加させることができる。
【００５３】
好ましい方法では、野生型と変異体の間で相同であるターゲット遺伝子の配列を測定する、またはＤＮＡメチル化を測定する場合にはメチル化を受けない、１つ（以上）のヌクレアーゼ保護プローブがあり、そして次に、突然変異またはＤＮＡメチル化部位に対して設計された第二プローブがある。従って、全レベルを決定することができ、突然変異の割合も決定することができる。
【００５４】
ターゲット遺伝子の様々な領域に対するプローブを作製し、その後、ｑＮＰＡ反応からそれらのプローブをシークエンシングすることにより、ｑＮＰＳを使用して未知の変異体を簡単に検出することもできる。実験用タグを含む構築物に前記プローブを組み込むことができ、シークエンシングのためにその付加生成物にアダプター配列を組み込むことができる。ミスマッチしている塩基を切断するためにおよび所望される場合にはＳＮＰを検出するために１つの酵素または酵素の組み合わせのヌクレアーゼ活性を利用することができる。それらの塩基が、ヌクレアーゼ保護プローブの端のほうに位置する場合には、切断温度ですべての短い鎖が融解してなくなり、破壊されて、短縮されたプローブ配列が残ることとなる。プローブの中央のほうの場合には、すべての配列が融解分解し、破壊されることとなるように条件を常例的に設計することができる。あるいは、ＳＮＰまたは幾つかのミスマッチ塩基がヌクレアーゼ保護プローブの中央領域内に位置する場合、ヌクレアーゼ保護プローブを切断するが融解して外れない条件を用いることができ、このときはシークエンシングによって特定の突然変異部位が同定されることとなる。同じ遺伝子に対して多数のプローブを使用することにより、プローブ数を比較して、突然変異が存在する場所を同定することができる。このシナリオでは、必要アダプターのライゲーションを、それぞれのプラットホームでのシークエンシングに今日用いられている様式で行うことができる。残存するヌクレアーゼ保護プローブ端の配列が判らず、従って、アダプターリンカー配列を設計することはできない。あるいは、イノシン配列にハイブリダイズするヌクレアーゼ保護プローブ端を有するアダプターを使用することができる−この場合、該ヌクレアーゼ保護プローブの末端の特定の組成を知る必要はない。あるいは、アダプター修飾プロセスを、他の箇所で説明するように行うことができる。アダプターがインタクトＮＰＰに正確にライゲートされ、従って、これらだけがシークエンシングされることとなる。
【００５５】
与えるすべての実施例において、少しでも必要があれば、これらの実施例において様々な事例に関して説明するリンカーおよびプロセスを使用せずに、当該技術分野において公知のまたはシークエンシングのために実施されている方法を用いて、アダプター配列、ポリＡ配列、または他の必要捕捉分子（単数もしくは複数）を遺伝子タグまたは実験用タグと共にＮＰＰまたは付加生成物に付加させることができる。
【００５６】
一分子シークエンサーについては、アダプター配列を全く必要とせずに、または３’末端のアダプター（もしくは捕捉）配列のみを用いて、実験用および遺伝子タグを有するもしくは有さないヌクレアーゼ保護プローブ、または３’捕捉配列を取り付けたプローブをシークエンシングすることができる。実験識別子および遺伝子識別子タグを取り付けるために、ライゲーション工程（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用）、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓなどの次世代シークエンサーのために）、１つだけのアダプター配列の（例えば、３’末端での）取り付け、またはポリＡテールの取り付けまたは合成が必要であることがあり、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするために、（例えば）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）を（例えば）使用するポリＡテールの３’末端での伸長、または別の万能捕捉配列もしくは分子の取り付けが必要とされる。本発明においてここおよび他の箇所で説明する構築物は、すべて、そのような機器使用でのシークエンシングのために調製することができる。図２、４および５は、シークエンサーの同じラン／チャンネル内での実験を多重化するために、および遺伝子識別子タグを使用して、必要とされる読み取り長さを縮小するために設計された構築物を図示する。タグを取り付けるために、ヌクレアーゼ保護工程３から５を行った後に（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用する）ライゲーション工程、続いてクリーンアップ、およびその後、必要に応じて（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓなどの次世代シークエンサーのために）、シークエンシングチップ上への捕捉を可能にするためのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）、または適切なアダプター分子を使用する、ポリＡテールの３’末端での伸長が必要である。溶解バッファーがこれらの工程のいずれかを阻害する場合には、逆転写およびＰＣＲを可能にする希釈バッファーを使用できることに留意すること。アレイベースのアッセイの検出リンカーを使用して、ヌクレアーゼ保護プローブに実験用タグを連結させる。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、前記プローブおよびタグを互いにライゲートする。遺伝子識別子タグも組み込むことができ、ことによると配列読み取りを１０塩基（ちょうど２つのタグ）に低減することができる。あるいは、ヌクレアーゼ保護プローブの３’末端がそれぞれの遺伝子について一意的である（例えば、３’末端の５から７塩基の配列が一意的である）ようにターゲット遺伝子配列領域を選択することにより、測定したそれぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングしなければならないのはこの領域だけである。
【００５７】
ターゲットＤＮＡまたはＲＮＡに相補的でないタグを（例えば、合成により）ＮＰＰに直接組み込むことができ、ヌクレアーゼ工程の間に相補的オリゴヌクレオチド配列によって保護することができ、そのためそれは加水分解されないであろうし、またはヌクレアーゼによる加水分解に対して耐性でありさらに依然としてシークエンシング可能である配列からそれを構成することができる。ターゲット配列までの隣接するオリゴヌクレオチドのタグシークエンシングによって、ＮＰＰ構築物中に非対合塩基がない限り、ヌクレアーゼ切断を防止することができる。
【００５８】
シークエンシングによりｑＮＰＡアッセイの検出工程を行うことの利点としては、例えば組織などの固相からの、抽出なしでの素性のシークエンシング；多数のサンプルのそれぞれについての別々の検出操作の必要の回避−すべてを１つの溶液で同時に行うことができる；プローブ間の弱い交差反応の回避、例えば、高濃度の検出リンカーの使用のため；ＳＮＰ決定向上；などが挙げられる。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明は、以下の態様に備えるものである：
態様１：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有しない。
【００６０】
態様２：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ターゲットオリゴヌクレオチドを含有せず、生合成工程を用いて形成されたものでもない。
【００６１】
態様３：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
【００６２】
態様４：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、ヌクレアーゼ反応を生き残った生成物であって第二ヌクレアーゼ反応の生成物である生成物を含む、または該生成物に由来する、または該生成物のテンプレートとして使用される。
【００６３】
態様５：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、１つ以上のヌクレアーゼ反応の生成物である、または該生成物に由来する。
【００６４】
態様６：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、合成オリゴヌクレオチドの使用によって形成する。
【００６５】
態様７：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）は、合成オリゴヌクレオチドおよびハイブリダイゼーション反応の使用によって形成する。
【００６６】
態様８：７におけるようなシークエンシング可能付加生成物であって、該シークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために用いられるライゲーション反応の使用からさらに形成されるものであるシークエンシング可能付加生成物。
【００６７】
態様９：ＮＰＰに基づいて組み立てられたまたはＮＰＰが組み込まれているシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
【００６８】
態様１０：酵素的修飾、例えばポリＡ配列のライゲーションまたは付加、を可能にするようにまたは可能にしないように調製されたおよび非天然ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸またはペプチド核酸など）を含有するまたは含有しないシークエンシング可能付加生成物を含むまたは該シークエンシング可能付加生成物を組み立てるために使用される合成オリゴヌクレオチド。
【００６９】
態様１１：シークエンシング前に溶液中または表面上での増幅に付されるＮＰＰを含有するまたはＮＰＰに基づいて組み立てられたシークエンシング可能付加生成物。
【００７０】
態様１２：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、この配列（例えば、遺伝子タグ）を使用して該付加生成物を同定することができ、従って該ターゲットオリゴヌクレオチドを同定することができるものであるシークエンシング可能付加生成物（単数または複数）。
【００７１】
態様１３：シークエンシング可能付加生成物（単数または複数）であって、ターゲットオリゴヌクレオチドの量を定量的に反映する量のシークエンシング可能付加生成物の生成後に取り付けられる配列を含有し、（この配列、例えば実験用タグ）を使用して、該ターゲットオリゴヌクレオチドを含有する反応を同定することができ、従って、多数の反応物をプールすることおよび同時にシークエンシングすることを可能にするものであるシークエンシング可能付加生成物（単数または複数）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
本発明の様々な特徴および付随の利点は、添付の図面と共に考慮するとよりよく判るようになるので、さらに十分に理解されるであろう。該図面中の同様の参照記号は、幾つかの図を通して同じまたは同様の部分を示し、および該図面は、下記のとおりのものである。
【図１】図１は、定量的ヌクレアーゼ保護シークエンシング（ｑＮＰＳ）アッセイのためのサンプルからのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の生成の概略図である。任意の必要アクセプター配列（青色）を有する遺伝子（または実験用）タグを取り付けるためのリンカー（緑色）の使用を図示し、後に最終的にライゲートされる、ＮＰＰの他端にアダプター（赤色）を付加させるための別のリンカー（紫色）の使用も図示する。それぞれの場合、シークエンシング可能付加生成物が形成されるばかりでなく、過剰なリンカー、アダプターおよびタグ配列も蓄積する。そのシークエンシング可能付加生成物を他の短い配列から分離するためのゲル精製の使用を図示する。
【図２】図２は、シークエンシングのためのＮＰＰのプロセッシングを図示する。図２Ａは、ポリＡ付加またはアダプター配列付加を含む、後のプロセッシングにおける２つの可能性を図示する。図２Ｂから２Ｅは、遺伝子タグ、実験用タグ、およびまたはアダプター配列を有する付加生成物の調製を図示する。
【図３】図３は、ｑＮＰＳプローブ、およびシークエンシングに有用である付加生成物のタグ付け、およびクリーンアップのためのヌクレアーゼ工程の使用の概略を示す。曲がり矢は、ライゲーション点を示す。シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物およびその相補体を作成する。略語表は、シークエンシング可能付加生成物を形成するために使用する異なるオリゴヌクレオチドを定義するものである。
【図４】図４は、シークエンシング可能付加生成物の代替組み立て方法を図示する。図４Ａは、シークエンシング可能ＮＰＰ付加生成物を形成するための異なるスキームを図示しており、この場合、タグリンカーは、実験用タグ（ＥＴ）可変配列（ＶＳ）（シークエンシングしたときにウエルまたは実験を一意的に識別する配列）に相補的な残基にイノシンを含有し、次に３’アダプターに相補的な配列（３’Ａｃｏｍｐ）を含有する。図４Ｂは、ライゲーションを必要としない、および合成により作製することができる、５’アダプタータグ／タグリンカー／３’アダプター（ａｃａｐｔｏｒ）相補的配列を兼備する単一合成物の使用を図示する。図４ＣおよびＤは、クリーンアップのためにゲル精製を（例えば、ポリアデニル化前に）用いることができる、または図示されているようにポリアデニル化、捕捉およびシークエンシング前にクリーンアップのためにヌクレアーゼ工程を用いることができる、このプロセスについてのスキームを図示する。
【図５】図５は、ＮＰＰを含有するおよび含有しないシークエンシング可能付加生成物を図示する。
【図６Ａ】図６は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図６Ａ凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でｍＲＮＡを測定するためのプローブ。（共通エキソン１）および２つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための（エキソン１／２接合部）、この接合部は、エキソン１からエキソン２までである場合があり、またはエキソン１からエキソン３までである場合がある；またはエキソンを測定するための（２および３）、これらのうちの一方（エキソン２）が欠失されることがある；を、野生型（左）および突然変異（この場合はエキソン２が欠失している）について図示する。赤色「ｘ」Ｓ１によって示す、エキソン２の欠失が、エキソン２についてのプローブのＳ１による完全破壊、およびエキソン１／２スプライス接合部についてのプローブのエキソン２に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。図６Ｂ凡例。発現ＳＮＰを測定するためのプローブ（左パネル）またはメチル化ＤＮＡ部位を測定するためのプローブ（右パネル）を図示する。発現ＳＮＰの場合、２つの可能性、野生型またはＳＮＰ、を図示する。２つのプローブ、対照領域のためのもの（１）、そのプローブの中央に位置するＳＮＰを有するもの（２）、を使用する。ＲＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅ）での処理によりＳＮＰにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ（今はそれぞれの端にちょうど２５塩基）はＳ１反応に用いる５０−ｍｅｒ Ｔｍで融解して外れ、Ｓ１によって破壊される。メチル化ＤＮＡについて、同じ２プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないＣをＵに変換してミスマッチを作り、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いてそのＤＮＡを切断するため、プローブは融解して外れ、Ｓ１によって破壊されることとなる。
【図６Ｂ】図６は、スプライス接合部、エキソンおよび突然変異をシークエンシングおよび定量することができる方法の描写を提供する。図６Ａ凡例。遺伝子のすべての変異体に共通である領域でｍＲＮＡを測定するためのプローブ。（共通エキソン１）および２つのエキソン間のスプライス接合部を測定するための（エキソン１／２接合部）、この接合部は、エキソン１からエキソン２までである場合があり、またはエキソン１からエキソン３までである場合がある；またはエキソンを測定するための（２および３）、これらのうちの一方（エキソン２）が欠失されることがある；を、野生型（左）および突然変異（この場合はエキソン２が欠失している）について図示する。赤色「ｘ」Ｓ１によって示す、エキソン２の欠失が、エキソン２についてのプローブのＳ１による完全破壊、およびエキソン１／２スプライス接合部についてのプローブのエキソン２に特異的な半分の破壊を生じさせる結果となることに留意すること。一塩基多型（ＳＮＰ）およびメチル化ＤＮＡをシークエンシングすることができる方法の例を図６Ｂに図示する。図６Ｂ凡例。発現ＳＮＰを測定するためのプローブ（左パネル）またはメチル化ＤＮＡ部位を測定するためのプローブ（右パネル）を図示する。発現ＳＮＰの場合、２つの可能性、野生型またはＳＮＰ、を図示する。２つのプローブ、対照領域のためのもの（１）、そのプローブの中央に位置するＳＮＰを有するもの（２）、を使用する。ＲＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅ）での処理によりＳＮＰにおけるミスマッチを切断し、その後、プローブ（今はそれぞれの端にちょうど２５塩基）はＳ１反応に用いる５０−ｍｅｒ Ｔｍで融解して外れ、Ｓ１によって破壊される。メチル化ＤＮＡについて、同じ２プローブ戦略を用いるが、最初に重亜硫酸塩を用いてメチル化されていないＣをＵに変換してミスマッチを作り、次にウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いてそのＤＮＡを切断するため、プローブは融解して外れ、Ｓ１によって破壊されることとなる。
【図７】図７は、ｑＮＰＡプロセスの最後に生成される溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。図７凡例。Ｓａｎｇｅｒシークエンシング法、ＡＢＩ ３７００、を用いた。線状ＤＮＡサンプル（〜２．５ｋｂ ＰＣＲ）をシークエンシングのための必要プライマー（Ｔ７Ｆ）と共にアリゾナ大学コアシークエンシング施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ ｃｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙ）に付託した。希釈バッファー（ｑＤｉｌ）の添加を伴うまたは伴わないｑＮＰＡ溶解バッファーを２倍から２０倍希釈した。ｑＤｉｌを１：１添加し、２倍希釈物を生じさせた。それぞれの希釈を２回繰り返した。同じ希釈をリバースプライマーでも繰り返した（結果は示さない）。シークエンシングのために、２．５μＬの５０ｎｇ／μＬのＤＮＡを１５μＬの総反応混合物量で混合した。これにより６倍希釈が説明される。赤色、配列なし、薄緑色５０〜１００ｂｐ配列、濃緑色５００〜６００ｂｐ配列。
【図８】図８は、ＣＴ値の等価性を実証するために抽出ＲＮＡに対してマッチした溶解産物を測定したＰＣＲの結果を図示する。この場合、サンプルから精製したＲＮＡまたは同じサンプルからのｑＬｙｓｉｓ産物のＰＣＲを行って、異なる細胞サンプル混合物の大きなセットにわたって３つの遺伝子とハウスキーパー遺伝子ＧＡＰＤＨを測定した。それぞれのデータ点は、３回の反復試験の平均である。それぞれの混合物を３回の異なる実験で試験した。ＧＡＰＤＨについてのＣＴ値を引くことによって、ＣＴ値を正規化した。精製されたＲＮＡは、ｑＬｙｓｉｓサンプルに求められる希釈率に合わせたものであり、およびＰａｄＰシークエンシング可能プローブを作成するために必要な工程の順序を示す。遺伝子タグおよび５’アダプターは、制限部位と共に、原ＰａｄＰプローブの一部である。そのプローブをターゲットＲＮＡ全体にわたってライゲートして、環状ＤＮＡを形成し、その後、これを開き、実験用タグおよび３’アダプターをハイブリダイズし、ライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。
【図９】図９は、ＰａｄＰシークエンシング可能付加生成物の作成方法の代表図を示す。遺伝子タグおよび５’アダプターは、制限部位と共に、原線状プローブの一部である。このプローブは、該プローブの５’および３’末端が隣接塩基にハイブリダイズされるようにターゲット核酸にハイブリダイズし、従って、核酸テンプレート上で互いにライゲートされて環状（例えば、ＤＮＡ）プローブを形成することができる。その後、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）を添加して、ハイブリダイズされていない核酸ターゲットおよび過剰な線状プローブを破壊する。その後、プローブを核酸ターゲットから（例えば、塩基中で加熱して）分離し、ヌクレアーゼ活性を破壊する。その環状プローブを開き、所望される場合には実験用タグおよび必要に応じて３’アダプターをハイブリダイズおよびライゲートし、それによってシークエンシングのための付加生成物を調製する。線状プローブの核酸ターゲットへのハイブリダイゼーション、環状プローブを形成するためのライゲーション、および核酸ターゲットからの解離というプロセスを、循環加熱によって多サイクル繰り返して、解離を生じさせる。過剰な線状プローブのため、温度が降下すると線状プローブはハイブリダイズし、そしてまたライゲートされ、その後、次の高温サイクルによって遊離され得る。このようにして環状プローブ量を増幅させた後、ヌクレアーゼ加水分解工程を行う。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
さらに詳述せずとも、当業者は、前の説明を用いて、以下の本発明をその最大範囲まで利用できると考えられる。従って、以下の特定の好ましい実施形態は、単なる例証と解釈され、いかなる点においても、本開示の残部を制限するものとは解釈されない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
ｑＮＰＡアッセイのために用いる溶解バッファーを、酵素を不活性化し、ＲＮＡの分解を防止するが、ハイブリダイゼーション希釈バッファーへの制限希釈後、それがＳ１活性を可能にし、ストリンジェントな特異性を有するハイブリダイゼーションを可能にするように設計する。しかし、溶解バッファー成分は、逆転写およびポリメラーゼ活性を阻害する。ポリメラーゼ活性の阻害は、例えば、そのバッファーが除去されない限り、または阻害活性が希釈されてなくならない限り、または阻害活性が中和されない限り、ＰＣＲ成功を妨げ得る。希釈バッファーを、ヌクレアーゼアッセイが完了した後に添加して、溶解および他のバッファーの阻害活性を中和することができる。図７は、ｑＮＰＡプロセスの最後に生成される、溶解およびハイブリダイゼーションバッファー溶液にスパイクされた転写産物のシークエンシング成功を図示する。水への１０倍希釈が、シークエンシングの成功を可能にする。しかし、水ではなく、中和希釈バッファー（ｑＤｉｌ）を希釈に用いると、水からシークエンシングされた転写産物の場合と同じシークエンシング結果（５００から６００塩基対の読み取り長さ）を生じさせるために４倍の希釈しか必要としない。しかし、中和ｑＤｉｌ希釈バッファーの使用は、ちょうど２倍希釈後にシークエンシングを可能にしたが、その読み取り長さは５０から１００塩基対に低減され、従って、成功はしたが、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーによる影響を受けた。ターゲットＤＮＡのＰＣＲをシークエンシング前に必要とするシステムについて、溶解およびハイブリダイゼーションバッファーからの干渉もあり得ることを認識することにより、本発明者らは、細胞から調製したｃＤＮＡを、同じ細胞から調製しｑＤｉｌ希釈バッファーで希釈した溶解産物に対して使用して、ＰＣＲの効率を試験した。ＧＡＰＤＨに正規化した３つの遺伝子を測定したところ、混合物全体にわたって差はなかった（図８）。相関は、０．９７であった。
【００７５】
（実施例２）
スプライス接合部またはエキソン、ならびにターゲット遺伝子の他の領域に特異的なＮＰＰを設計したので、それぞれの場合、該プローブは、トランスクリプトーム中の単一遺伝子においてしか見いだされない配列に対して特異的である。ヌクレアーゼ保護プローブまたは該プローブの一部分についての直接シークエンシング（直接ヌクレアーゼ保護プローブシークエンシング、またはＤＮＰＳ）を可能にするために、理想的には、最初の５、１０、２０または３０の３’塩基は、それらのシークエンシングによって１つだけの遺伝子が一意的に同定されるほどに特異的である。ヌクレアーゼ反応後、残存プローブを、前に説明したおよび下で説明するような必要アダプターまたは捕捉配列または分子を含有するシークエンシング付加生成物にそれらを組み込むことによって、シークエンシング用に調製する。代替方法では、実験用タグを３’末端に付加させる。さらにもう１つの方法では、遺伝子タグを３’末端に付加させるので、ヌクレアーゼ保護プローブ配列自体をシークエンシングする必要がなく、プローブの３’末端がトランスクリプトーム中の１つだけの遺伝子に特異的である必要もない。さらにもう１つのプロトコルでは、遺伝子タグおよび実験用タグ両方を付加生成物に組み込んでシークエンシングする。さらにもう１つの実施例では、ＮＰＰに対する相補的配列、およびシークエンシング可能付加生成物を、前に説明したおよび下で説明する方法によって調製する。
【００７６】
（実施例３）
遺伝子タグおよび実験用タグを有するＮＰＰ含有付加生成物の構築。この方法の利点は、タグハイブリダイゼーション工程が、すべての未変性物（例えば、ＲＮＡ）を破壊するＳ１および塩基工程の後に続くため、正しいタグがそれ自体の相補体にハイブリダイズし、別のタグの相補体にハイブリダイズしないことを保証する特異性しか必要とされない点である。同様に、ヌクレアーゼ保護プローブしかターゲット特異的である必要がない。プローブ自体をシークエンシングしない。代わりに、遺伝子タグを、遺伝子を同定するためにシークエンシングされるエンティティーである付加生成物に組み込み、その後、該遺伝子タグが特異的にハイブリダイズするその特異的ヌクレアーゼ保護プローブによって該遺伝子を測定する。ＦＦＰＥを用いてｑＮＰＡを行う標準的なプロトコル（３、４）に従って、ヌクレアーゼ保護プローブのカクテルの存在下、プロテイナーゼｋを添加した溶解バッファーでサンプルを溶解する。３０分間、３７℃での初期インキュベーション後、サンプルを９５℃に加熱し、その後、冷却し、５５℃で２時間インキュベートして、プローブをそれらのそれぞれのターゲットｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。その後、Ｓ１ヌクレアーゼを添加して、ターゲットにハイブリダイズしていない過剰なプローブ、およびプローブにハイブリダイズしていないＲＮＡを加水分解し、ターゲット／プローブデュプレックスを残す。６０分のインキュベーション後、塩基を添加し、サンプルを９５℃で１０分間加熱して、プローブ／ＲＮＡデュプレックスを解離させ、ターゲットＲＮＡ配列を加水分解する。そのサンプルを中和し、その後、３’タグリンカーのカクテルを添加し、該リンカーは、それぞれが、１つの特異的プローブの３’２５塩基配列に相補的な特異的２５塩基配列を有し、および１つの遺伝子識別子タグに特異的な配列を含有する。第二の事例では、前記タグリンカーは、１セットの実験用タグに共通の５’末端配列に特異的にハイブリダイズする、ジェネリックである遺伝子タグ配列に対して３’側に配列も含有した。前記遺伝子タグ配列は、多数の設計から成り得るが、この事例では、シークエンシングされない遺伝子タグの５’末端配列に相補的であった配列、および次に、それぞれの遺伝子タグに一意的であり、それぞれの遺伝子を同定するためにシークエンシングされるそれぞれの遺伝子タグの３’末端配列である、７塩基タグ配列から成った。前記タグリンカーの３’末端配列が実験用タグにもハイブリダイズする場合、その実験用タグの５’相補的配列は、すべての実験用タグについて同じである。それぞれの異なる実験用タグを添加して、個々の実験ヌクレアーゼ保護反応を分離する（例えば、サンプルを別々にアッセイする）ので、「誤った」実験用タグがハイブリダイズする可能性がない。この場合、それぞれのサンプルをマイクロプレートの別個のウエルで調製し、異なる実験用タグを各ウエルに添加する。タグリンカー、遺伝子タグおよび実験用タグの添加は連続的であり得るが、この実施例ではすべてを一緒に添加し、タグリンカーを、Ｓ１ヌクレアーゼ保護反応を生き残るように、ヌクレアーゼ保護プローブに対して過剰に添加するが、すべてのタグリンカーがそのタグ配列自体で飽和されるように、添加する遺伝子タグおよび添加する実験用タグの量に対しては制限濃度で添加する。遺伝子タグおよび実験用タグを、すべて、それらの５’末端でリン酸化する。加えて、実験用タグは、Ｓｏｌｅｘａシークエンシングチップ上の３’捕捉配列に相補的なアダプター配列をその３’末端に含有する。ヌクレアーゼ保護プローブの５’末端もリン酸化する。３’タグリンカーおよびタグを添加すると同時に５’アダプターリンカーのカクテルを添加し、このリンカーは、それぞれのプローブの５’末端に相補的な遺伝子配列とＳｏｌｅｘａシークエンシングチップの５’捕捉配列によって捕捉される５’アダプター配列に相補的な５’配列とを含有する配列から構成される。同時に、５’アダプター配列自体を５’アダプターリンカーより多く添加する。５０℃でのインキュベーション後、すべてについて適切なハイブリダイゼーションを行って、図２Ｅｘｘに図示する付加生成物を形成し、その後、（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して）ライゲーション反応を行う。その後、反応混合物をゲルで泳動させ、高分子量バンドを切り出し、Ｓｏｌｅｘａチップに適用し、増幅し、シークエンシングする。この実施例において、遺伝子タグは、２つの同一遺伝子同定配列から成り、その結果、それぞれの遺伝子の同定のためにシークエンシングの冗長性をもたらされる。加えて、タグリンカーのハイブリダイゼーションに使用する実験用タグの５’末端は、１つ置きの位置にＬＮＡを含有し、その結果、この配列内のそれらの多数の塩基のためにより高いＴｍをもたらされるので、実験用タグおよび遺伝子タグをシークエンシングするために必要とされる読み取り長さができる限り短くなるようにそれをできるだけ短く保つ。
【００７７】
（実施例４）
ゲル精製を用いなかったことを除き、実施例３において説明した同じプロセスを行った。代わりに、図３に図示するように、５’リン酸化アダプターリンカーおよび５’リン酸化タグリンカーを使用し、ならびにその反応に加える実験用タグおよび３’アダプター配列に相補的であるオリゴヌクレオチドをそれぞれの反応に加える。従って、ライゲーション工程を行うと、この短いオリゴヌクレオチドはタグリンカーにライゲートされるため、完全にハイブリダイズされ、ライゲートされた付加生成物には、１００塩基より短い配列はない。その後、「クリーンアップ」反応として、その反応混合物をＳ１ヌクレアーゼと共に６５℃でインキュベートする。このインキュベーション温度で、その完全付加生成物の成分のＴｍは、いずれの部分も融解して外れずＳ１によって加水分解されないようなＴｍであるが、過剰なタグリンカーとそれぞれのタグ（ライゲートされたタグは５０塩基未満であるので）および過剰な５’アダプターとアダプターリンカーの間のハイブリダイゼーションにより、それらはＳ１によって加水分解するほどに融解される。その後、このＳ１反応を生き残った付加生成物を９５℃に加熱して、それを融解して保護リンカーからなくし、Ｓ１活性を破壊し、その後、その付加生成物をＳｏｌｅｘａチップ上に捕捉し、増幅し、シークエンシングする。
【００７８】
（実施例５）
例えばＨｅｌｉｃｏｓｅシステム用の、シークエンシング媒体上にシークエンシング可能付加生成物を捕捉するためにポリＡテールを利用するシステムでのシークエンシングのための付加生成物を構築する実施例を行う。３’アダプターのない、図２Ｃに図示する付加生成物を構築する。ゲル精製クリーンアップ後に、Ｔｄｔを使用してこの付加生成物をその３’末端でポリアデニル化する。この同じ付加生成物を調製し、Ｔｄｔ反応前にＳ１ヌクレアーゼによってクリーンアップし、その後、シークエンシングする。あるいは、Ｔｄｔを使用して実験用タグの一部として合成したポリＡ３’アダプターを有する、図２Ｃに図示する付加生成物を構築し、この生成物をゲル精製によってクリーンアップした後、シークエンシングする。ポリＴ相補的配列を使用して、ポリＡテールを保護し、Ｓ１ヌクレアーゼを利用してその付加生成物をクリーンアップした後、シークエンシングする。
【００７９】
（実施例６）
サンプルとして全血を使用して、実施例４の実験を行う。この全血を２ｘ（二倍濃度）溶解バッファーと１：１混合し、１０分間９５℃に加熱し、その後、微量遠心管で遠心分離して集塊を除去する。その後、実施例４において説明したようなｑＮＰＳに上清を付す。
【００８０】
（実施例７）
ウイルスに感染したヒト細胞のサンプルを使用して、実施例４を行う。使用するプローブを、ウイルス遺伝子を測定するために設計する。結果は、望ましくない配列情報によるシークエンシングしたサンプルの干渉または「クラッター」なしに他の種の混合物の中の任意の種からの遺伝子を測定する一例として、ヒト遺伝子のバックグラウンドでウイルス遺伝子を選択的に測定する能力を明示する。
【００８１】
（実施例８）
未分化Ｔｈｐ−１細胞ならびに分化およびＬＰＳ刺激Ｔｐｈ−１細胞からの溶解産物の混合物から成る一連のサンプルを使用して、実施例４の実験を行う。
【００８２】
（実施例９）
サンプルを溶解し、９５℃でインキュベートし、続いてＮＰＰとハイブリダイズさせ、Ｓ１で処理し、タグリンカー、遺伝子タグ、実験用タグを付加させ、ハイブリダイズさせ、ライゲートし、その後、１０５℃でインキュベートし、続いて実験用タグを添加して、ＬＮＡを含有する配列を保護し、３７℃でインキュベートして、２０塩基以上のライゲートされた付加生成物相補的オリゴヌクレオチド配列（過剰なタグリンカー、遺伝子タグ、および実験用タグ、および実験用タグ保護配列がまだ存在するだろう）を再びハイブリダイゼーションさせ、続いて、Ｓ１で加水分解し、その後、ポリアデニル化し、最後にゲル電気泳動によってクリーンアップ、その後、シークエンシングする。（タグリンカーをハイブリダイズさせることができる）相補的ＤＮＡの１つだけのコピーをシークエンシングし、これは、実験用または遺伝子タグを含有しない。そのため１００の遺伝子を測定する場合、この相補的ＤＮＡの１００分子／細胞のみをバックグラウンドとしてシークエンシングし、これらの配列は、一切遺伝子タグまたは実験用タグ配列情報を含有しない。
【００８３】
（実施例１０）
ターゲット核酸に相補的な塩基の配列に加えて、シークエンシングチップ上に捕捉するための捕捉アダプター配列としての役割を果たすことができる非ターゲット配列、または遺伝子タグとしての役割を果たすことができる配列、または実験用タグとしての役割を果たすことができる配列、またはこれらの機能の幾つかを組み込む配列を含有する、ＮＰＰを合成する。このＮＰＰを、このＮＰＰの非ターゲット配列に相補的である過剰なオリゴヌクレオチドと併せ、それらを互いにハイブリダイズさせることができるようにインキュベートする。その後、この混合物を、ターゲット核酸を含有するサンプルに添加し、ハイブリダイゼーションの後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して、標準的ｑＮＰＡプロトコルを行う。塩基であって、それらにハイブリダイズした相補的塩基を、ＮＰＰの核酸ターゲットにハイブリダイズした部分と非ターゲット相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした部分の間に有さない塩基が無いため、核酸ターゲットにハイブリダイズしたＮＰＰは、Ｓ１ヌクレアーゼによって切断されず、むしろインタクトのままであり、ターゲットオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしていないそのＮＰＰは、保護された非ターゲット配列の地点まで加水分解される。塩基中で加熱した後、非ターゲット配列とターゲットオリゴヌクレオチド配列の一部分の両方にわたる相補的オリゴヌクレオチドを添加し、ＮＰＰ含有相補的ヌクレアーゼターゲット配列のみがハイブリダイズし、より短い非ターゲット配列保護オリゴヌクレオチドも生き残っている非配列ＮＰＰ配列フラグメントもハイブリダイズすることができない温度で、競合的にＮＰＰにハイブリダイズさせる。その後、第二Ｓ１ヌクレアーゼ処理を行い、そしてその後、シークエンシングチップへの捕捉のために必要な配列を有する、生き残っているＮＰＰを、シークエンシングすることができる。このプロトコルは、アダプター配列を取り付けるためのライゲーションを一切必要としない。それが合成ＮＰＰ付加生成物の一部であるからである。
【００８４】
前記実施例を、前記実施例において用いたものの代わりに本発明の一般的にまたは具体的に説明した反応体および／または操作条件を用いることによって繰り返して、同様に成功することができる。
【００８５】
上述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に突きとめることができ、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および修飾を施して本発明を様々な使用法および条件に適応させることができる。引用したすべての出版物および特許は参照により本明細書に援用されている。
【００８６】
【数１】
【００８７】
【数２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、および
（ｉｖ）該ＮＰＰ、その相補体、または該ＮＰＰもしくは該相補体が組み込まれている分子をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＰＰを結合形態または遊離形態で検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ターゲットが、固定されているか、または架橋されているか、または不溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットが、核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）分子もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＭＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、またはウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはトランスフェクトＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡ分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＰＰが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）もしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）分子であるか、または非天然塩基を含むＬＮＡもしくはＰＮＡもしくはポリヌクレオチドを含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸であり、かつ工程（ｉｉ）が、任意の結合していないＮＰＰを有効に排除するためのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼカクテルでの処理を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲットが、核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲットが、非天然塩基を場合により含むＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターゲットＲＮＡ分子が、完全ＮＰＰ分子またはその一部分にハイブリダイズする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＰＰが、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）ＤＮＡまたは分岐（ｂＤＮＡ）ＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エンドヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡ分子であり、かつ前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、ＤＮＡａｓｅおよびＲＮＡａｓｅである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エキソヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的サンプルが、固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的サンプルが、ターゲット分子の架橋を生じさせる薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲットが、架橋されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸ターゲットを検出するための方法であって、
（ｉ）該サンプルと該核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸分子である少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを、該ターゲットの該ＮＰＰへの結合を助長するために十分な条件下で、接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上のヌクレアーゼに曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰを含有する付加生成物を増幅する工程、および
（ｖ）該ＮＰＰをシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項２５】
前記ターゲットが、不溶性であるか、または固定されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記不溶性核酸が、架橋ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｖＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＰＰが、ｓｓＤＮＡまたはｂＤＮＡまたはアプタマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡであり、かつ工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡであり、かつ工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
Ｓｏｌｅｘａシークエンシング、４５４シークエンシング、連鎖停止シークエンシング、ダイターミネーションシークエンシング、またはパイロシークエンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
一分子シークエンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＣＲ増幅を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲット分子が、抽出を伴わずに検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲット分子が、可溶化を伴わずに検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲット分子をテンプレートとして使用して、ＮＰＰを生合成により生産させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮＰＰまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＰＰまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰおよび該ＮＰＰにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、
（ｉｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰに対する相補体、または該ターゲット、または該ＮＰＰもしくは該ターゲットもしくは該ＮＰＰに対する該相補体を含有する付加生成物を場合により増幅する工程、および
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ターゲット、または該ＮＰＰに対する該相補体、または該ＮＰＰもしくは該ターゲットもしくは該ＮＰＰに対する該相補体を含有する該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項４０】
前記ターゲット分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、またはウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはトランスフェクトＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含むか、または部分的にもしくは完全にペプチド核酸により構成されるか、または部分的にもしくは完全にＬＮＡもしくは非天然塩基もしくは修飾塩基から構成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＰＰが、シークエンシング不能成分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）と、
第一タグであって、該ＮＰＰの３’末端から該タグ配列の５’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により、
該第一タグの３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む、シークエンシング可能付加生成物。
【請求項４６】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物であって、前記ＮＰＰの遊離３’末端から伸びるかもしくは前記第一および前記第二タグ配列を含有するＮＰＰ付加生成物の３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプターをさらに含むか、または該付加生成物の最後から二番目のタグ配列の３’末端を含む、シークエンシング可能付加生成物。
【請求項４７】
前記第一タグおよび前記第二タグが、独立して、遺伝子タグおよび実験用タグである、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項４８】
前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項４９】
前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５０】
実験用タグを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５１】
実験用タグと前記アダプターとの両方を含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５２】
前記ＮＰＰもしくは１つ以上のタグ配列を含有する前記ＮＰＰ付加生成物の遊離５’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプター、および／または該ＮＰＰもしくは該ＮＰＰ付加生成物の３’末端におけるアダプターをさらに含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５３】
前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５４】
前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５５】
前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５６】
両方のアダプターを有する付加生成物を含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５７】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の３’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグの５’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該ＮＰＰにハイブリダイズさせる工程；
遺伝子タグ配列または実験用タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ、および存在する場合には前記第二タグを該ＮＰＰに場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。
【請求項５８】
前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために３’末端にアダプター配列を含有する、請求項５６に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５９】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の３’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグに対する相補的配列および前記第二タグの５’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該ＮＰＰにハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ配列および該第二タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ配列を該ＮＰＰに、該第二タグ配列を該第一タグ配列に、場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。
【請求項６０】
前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために３’末端にアダプター配列を含有する、請求項５９に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項６１】
請求項５９に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
５’末端に前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の５’末端に対する相補的配列を有し、かつ３’末端にアダプター配列の３’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、ハイブリダイズさせる工程；
該アダプター配列を該リンカーの該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該アダプター配列を該ＮＰＰにライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
をさらに含む、方法。
【請求項６２】
請求項５７に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
（ｉ）前記ＮＰＰまたは前記ターゲットを該ＮＰＰに対する第一プライマーを使用して増幅する工程；
（ｉｉ）該第一増幅工程の生成物に第二プライマーを場合によりハイブリダイズさせる工程であって、該第二プライマーは、アダプター配列を場合により含む、工程、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の生成物をさらに増幅してシークエンシング可能付加生成物を生成させる工程
をさらに含む、方法。
【請求項６３】
線状ＮＰＰの一部として遺伝子タグ配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６４】
線状ＮＰＰの一部として実験用タグ配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６５】
線状ＮＰＰの一部としてアダプター配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６６】
線状ＮＰＰの一部として１つ以上のタグ配列および／またはアダプター配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６７】
線状ＮＰＰにライゲートされる実験用タグをさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６８】
前記ターゲットに対して相補的でないが、前記ヌクレアーゼ工程中に相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるので、該ターゲットに結合しているＮＰＰから加水分解も切断もされない配列を有するＮＰＰをさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６９】
請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、ライゲーション工程後に、該シークエンシング可能付加生成物以外の付加生成物を除去するために精製またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼのカクテルとのインキュベーションをさらに含む、方法。
【請求項７０】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと少なくとも１つの線状ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程であって、該ＮＰＰの末端は、該ターゲットに特異的に結合し、ここで、該ＮＰＰの５’末端および３’末端は、該ターゲットの隣接塩基にハイブリダイズされる、工程、
（ｉｉ）該ＮＰＰをライゲートして、環状オリゴヌクレオチドを形成する工程、
（ｉｉｉ）該環状ＮＰＰを場合により解離させ、線状ＮＰＰの第二分子を該ターゲットにハイブリダイズさせ、ライゲートする工程、
（ｉｖ）（ｉｖ）を連続サイクルで場合により繰り返す工程、
（ｖ）ヌクレアーゼを添加して、該サンプル中のすべての線状一本鎖オリゴヌクレオチドを破壊する工程、
（ｖｉ）該環状ＮＰＰを切断して、該ＮＰＰを線状化する工程、および
（ｖｉｉ）該線状ＮＰＰをシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項７１】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと、該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程；
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰおよび該ＮＰＰにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程；
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程；
（ｉｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰに対する相補体、または該ターゲット、または
生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）と、
第一タグであって、該ＮＰＰの３’末端から該タグ配列の５’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により
該第一タグの３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む付加生成物を、場合により増幅する工程；および
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ターゲット、または該ＮＰＰに対する該相補体、または該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項１】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、および
（ｉｖ）該ＮＰＰ、その相補体、または該ＮＰＰもしくは該相補体が組み込まれている分子をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＮＰＰを結合形態または遊離形態で検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ターゲットが、固定されているか、または架橋されているか、または不溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ターゲットが、核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）分子もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＭＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、またはウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはトランスフェクトＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡ分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＰＰが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）もしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）分子であるか、または非天然塩基を含むＬＮＡもしくはＰＮＡもしくはポリヌクレオチドを含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸であり、かつ工程（ｉｉ）が、任意の結合していないＮＰＰを有効に排除するためのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼカクテルでの処理を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターゲットが、核酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターゲットが、非天然塩基を場合により含むＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターゲットＲＮＡ分子が、完全ＮＰＰ分子またはその一部分にハイブリダイズする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＰＰが、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）ＤＮＡまたは分岐（ｂＤＮＡ）ＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エンドヌクレアーゼ、およびエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡ分子であり、かつ前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、ＤＮＡａｓｅおよびＲＮＡａｓｅである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼまたは前記ヌクレアーゼカクテルが、エキソヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的サンプルが、固定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的サンプルが、ターゲット分子の架橋を生じさせる薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲットが、架橋されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
生物学的サンプル中の少なくとも１つの核酸ターゲットを検出するための方法であって、
（ｉ）該サンプルと該核酸ターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸分子である少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを、該ターゲットの該ＮＰＰへの結合を助長するために十分な条件下で、接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上のヌクレアーゼに曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰを含有する付加生成物を増幅する工程、および
（ｖ）該ＮＰＰをシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項２５】
前記ターゲットが、不溶性であるか、または固定されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記不溶性核酸が、架橋ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｖＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＮＰＰが、ｓｓＤＮＡまたはｂＤＮＡまたはアプタマーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡであり、かつ工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、ＤＮＡａｓｅ、ＲＮＡａｓｅ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＰＰが、ＤＮＡであり、かつ工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｉｉ）における前記ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
Ｓｏｌｅｘａシークエンシング、４５４シークエンシング、連鎖停止シークエンシング、ダイターミネーションシークエンシング、またはパイロシークエンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
一分子シークエンシングを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＣＲ増幅を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ターゲット分子が、抽出を伴わずに検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ターゲット分子が、可溶化を伴わずに検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲット分子をテンプレートとして使用して、ＮＰＰを生合成により生産させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＮＰＰまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＰＰまたはその一部分に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをシークエンシングする工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程、
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰおよび該ＮＰＰにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程、
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程、
（ｉｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰに対する相補体、または該ターゲット、または該ＮＰＰもしくは該ターゲットもしくは該ＮＰＰに対する該相補体を含有する付加生成物を場合により増幅する工程、および
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ターゲット、または該ＮＰＰに対する該相補体、または該ＮＰＰもしくは該ターゲットもしくは該ＮＰＰに対する該相補体を含有する該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項４０】
前記ターゲット分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、または非天然塩基を場合により含有するアンチセンスヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、葉緑体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ）、またはウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはトランスフェクトＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＰＰが、前記ターゲットに特異的に結合する核酸を含むか、または部分的にもしくは完全にペプチド核酸により構成されるか、または部分的にもしくは完全にＬＮＡもしくは非天然塩基もしくは修飾塩基から構成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＰＰが、シークエンシング不能成分を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）と、
第一タグであって、該ＮＰＰの３’末端から該タグ配列の５’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により、
該第一タグの３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む、シークエンシング可能付加生成物。
【請求項４６】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物であって、前記ＮＰＰの遊離３’末端から伸びるかもしくは前記第一および前記第二タグ配列を含有するＮＰＰ付加生成物の３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプターをさらに含むか、または該付加生成物の最後から二番目のタグ配列の３’末端を含む、シークエンシング可能付加生成物。
【請求項４７】
前記第一タグおよび前記第二タグが、独立して、遺伝子タグおよび実験用タグである、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項４８】
前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項４９】
前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５０】
実験用タグを含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５１】
実験用タグと前記アダプターとの両方を含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５２】
前記ＮＰＰもしくは１つ以上のタグ配列を含有する前記ＮＰＰ付加生成物の遊離５’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含むアダプター、および／または該ＮＰＰもしくは該ＮＰＰ付加生成物の３’末端におけるアダプターをさらに含む、請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５３】
前記遺伝子タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５４】
前記遺伝子タグ、前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５５】
前記実験用タグおよび前記アダプターを含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５６】
両方のアダプターを有する付加生成物を含む、請求項５２に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５７】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の３’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグの５’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該ＮＰＰにハイブリダイズさせる工程；
遺伝子タグ配列または実験用タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ、および存在する場合には前記第二タグを該ＮＰＰに場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。
【請求項５８】
前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために３’末端にアダプター配列を含有する、請求項５６に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項５９】
請求項４５に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の３’末端に対する相補的配列を有し、かつ前記第一タグに対する相補的配列および前記第二タグの５’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、該ＮＰＰにハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ配列および該第二タグ配列を該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該第一タグ配列を該ＮＰＰに、該第二タグ配列を該第一タグ配列に、場合によりライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
を含む、方法。
【請求項６０】
前記最後から二番目のタグが、シークエンシングプラットホーム上への捕捉のために３’末端にアダプター配列を含有する、請求項５９に記載のシークエンシング可能付加生成物。
【請求項６１】
請求項５９に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
５’末端に前記ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）の５’末端に対する相補的配列を有し、かつ３’末端にアダプター配列の３’末端に対する相補的配列を有するリンカーを、ハイブリダイズさせる工程；
該アダプター配列を該リンカーの該相補的配列にハイブリダイズさせる工程；
該アダプター配列を該ＮＰＰにライゲートして該シークエンシング可能付加生成物を作る工程
をさらに含む、方法。
【請求項６２】
請求項５７に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、
（ｉ）前記ＮＰＰまたは前記ターゲットを該ＮＰＰに対する第一プライマーを使用して増幅する工程；
（ｉｉ）該第一増幅工程の生成物に第二プライマーを場合によりハイブリダイズさせる工程であって、該第二プライマーは、アダプター配列を場合により含む、工程、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の生成物をさらに増幅してシークエンシング可能付加生成物を生成させる工程
をさらに含む、方法。
【請求項６３】
線状ＮＰＰの一部として遺伝子タグ配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６４】
線状ＮＰＰの一部として実験用タグ配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６５】
線状ＮＰＰの一部としてアダプター配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６６】
線状ＮＰＰの一部として１つ以上のタグ配列および／またはアダプター配列をさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６７】
線状ＮＰＰにライゲートされる実験用タグをさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６８】
前記ターゲットに対して相補的でないが、前記ヌクレアーゼ工程中に相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるので、該ターゲットに結合しているＮＰＰから加水分解も切断もされない配列を有するＮＰＰをさらに含む、請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法。
【請求項６９】
請求項６２に記載のシークエンシング可能付加生成物を作製するための方法であって、ライゲーション工程後に、該シークエンシング可能付加生成物以外の付加生成物を除去するために精製またはヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼのカクテルとのインキュベーションをさらに含む、方法。
【請求項７０】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと少なくとも１つの線状ヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程であって、該ＮＰＰの末端は、該ターゲットに特異的に結合し、ここで、該ＮＰＰの５’末端および３’末端は、該ターゲットの隣接塩基にハイブリダイズされる、工程、
（ｉｉ）該ＮＰＰをライゲートして、環状オリゴヌクレオチドを形成する工程、
（ｉｉｉ）該環状ＮＰＰを場合により解離させ、線状ＮＰＰの第二分子を該ターゲットにハイブリダイズさせ、ライゲートする工程、
（ｉｖ）（ｉｖ）を連続サイクルで場合により繰り返す工程、
（ｖ）ヌクレアーゼを添加して、該サンプル中のすべての線状一本鎖オリゴヌクレオチドを破壊する工程、
（ｖｉ）該環状ＮＰＰを切断して、該ＮＰＰを線状化する工程、および
（ｖｉｉ）該線状ＮＰＰをシークエンシングする工程
を含む、方法。
【請求項７１】
生物学的サンプル中の少なくとも１つのターゲットを検出する方法であって、
（ｉ）該サンプルと、該ターゲットに特異的に結合する少なくとも１つのヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）とを接触させる工程；
（ｉｉ）任意の結合していないＮＰＰおよび該ＮＰＰにハイブリダイズされないターゲットを排除するために有効である条件下で、該サンプルを１つ以上の試薬に曝露する工程；
（ｉｉｉ）該結合したＮＰＰを該ターゲットから場合により分離する工程；
（ｉｖ）該ＮＰＰ、または該ＮＰＰに対する相補体、または該ターゲット、または
生物学的ターゲットにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含むヌクレアーゼ保護プローブ（ＮＰＰ）と、
第一タグであって、該ＮＰＰの３’末端から該タグ配列の５’末端を経て伸びるポリヌクレオチド配列を含む、第一タグと、場合により
該第一タグの３’末端から伸びるポリヌクレオチド配列を含む第二タグと
を含む付加生成物を、場合により増幅する工程；および
（ｖ）該ＮＰＰ、または該ターゲット、または該ＮＰＰに対する該相補体、または該付加生成物をシークエンシングする工程
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５０９８６３（Ｐ２０１３−５０９８６３Ａ）
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３７２１３（Ｐ２０１２−５３７２１３）
【出願日】平成２２年１１月３日（２０１０．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５２８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６８６３
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１２１１２６２２）エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２１日（２０１３．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３日（２０１０．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５２８９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５６８６３
【国際公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【出願人】（５１２１１２６２２）エイチティージー モレキュラー ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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