宿主細胞から標的細胞へのギャップジャンクションを介したＤＮＡまたはＲＮＡの送達、及びアンチセンスまたはｓｉＲＮＡのための細胞ベースの送達システム
ａ）オリゴヌクレオチドまたはプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを発現するプラスミド、またはその発現産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法。
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを発現するプラスミド、またはその発現産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2003年12月17日に出願された米国仮特許出願第60/530,555号の利益と優先権を享受する。
【０００２】
ここに開示される本発明は、合衆国政府、特にＮＨＬＢＩ、及びＮＩＨ（ＧＭＳ）による基金により、それぞれ登録番号ＨＬ−２８９５８及びＧＭ−５５２６３の下で少なくとも部分的に発明された。それ故合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本願を通じて、各種の出版物が、脚注内でまたはカッコ内で明細書中で参照されている。これらの出版物は全体において、本発明が関連する技術分野の従来技術をより十分に記載するために、本願に参考としてここに取り込まれる。これらの参考文献についての完全な出展の引用は、特許請求の範囲に先行して、本明細書の末尾で見出されるであろう。
【０００４】
共通に所有される先行技術である2003年1月15日に出願された米国特許出願第10/342,506号（特許文献１）、及びここで参考として取り込まれる出版物（非特許文献１及び２）に記載されている通り、幹細胞は標的組織とギャップジャンクションを形成するために使用されている。そのような幹細胞は、遺伝子産物または小分子を送達することによって、標的組織の活性に影響することができる。しかしながら、アンチセンスＲＮＡ、またはＤＮＡの形態のヌクレオチドは、標的組織に対して宿主細胞(例えばヒトの間葉幹細胞(ｈＭＳＣ))によって送達されてはいない。
【特許文献１】米国特許出願第10/342,506号
【非特許文献１】Plotnikov AN, Shlapakova IN, Danilo P Jr, Herron A, Potapova I, Lu Z, Valiunas V, Doronin S, Brink PR, Robinson RB, Cohen IS, Rosen MR: Human mesenchymal stem cells transfected with HCN2 as a gene delivery system to induce pacemaker function in canine heart. Circulation 108: IV-547, 2003
【非特許文献２】Valiunas等, 2002 Cardiac gap junction channels show quantitative differences in selectivity. Cir. Res. 91: 104-111
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明によれば、操作された細胞がＲＮＡを標的細胞に送達させるために使用できるため、ＲＮＡはギャップジャンクションを通過できる。
【０００６】
本発明によれば、ドナー細胞に対する蛍光タグ化オリゴヌクレオチドの単一電極送達によって示され、ギャップジャンクション介在性の連絡を介する標的細胞に対するそれらの輸送が測定されるように、一本鎖であれ二本鎖であれオリゴヌクレオチドは、ＨＥＬＡ細胞ペアにおいてＣｘ４３によって形成されるギャップジャンクションを通過できる。従って本発明は、ギャップジャンクションを形成するいずれかのドナー細胞を使用する、標的細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそのペプチド産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【０００９】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達する工程を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、ＲＮＡまたはＲＮＡのためのプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１１】
本発明によれば、ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達する工程を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、遺伝子活性の下流調節が所望される有用な治療を提供する（例えばガン）。
【００１３】
ＲＮＡまたはアンチセンスの標的細胞への送達が裸のプラスミドによって実施される従来法と比較して、本発明では、前記送達は細胞を介して実施され、トランスフェクション頻度はすっと高いはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１５】
前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるＲＮＡであっても良く、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドに転写されても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであっても良く、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドであって良く、またはそのようなｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドを生産するＤＮＡまたはＲＮＡであっても良い。前記プラスミドは、ｓｉＲＮＡをコードしても良い。前記オリゴヌクレオチドは、１２−２４のメンバーを含んで良い。前記ドナー細胞は、ヒトの間葉幹細胞であっても良い。前記ドナー細胞は、コネキシンタンパク質を含む細胞、またはコネキシンタンパク質を含むように操作された細胞であっても良い。前記標的細胞は、シンシチウム組織を含む細胞であっても良く、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞、またはシンシチウムガン細胞であっても良い。前記標的細胞は、白血球細胞であっても良い。
【００１６】
前記ギャップジャンクションチャンネルは、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、及びコネキシン３７の一つ以上からなっても良い。
【００１７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそのペプチド産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達する工程を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１９】
本発明によれば、ＲＮＡまたはＲＮＡのためのプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００２０】
本発明によれば、ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達する工程を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【実施例】
【００２１】
本発明は、ギャップジャンクションチャンネルを通じてオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ断片）を通過させる方法を提供する。これは、コネキシン４３（Ｃｘ４３）からなるギャップジャンクションチャンネルをＨｅＬａ細胞系で使用した実験で示される。
【００２２】
前記実験は、規定された長さのＤＮＡまたはＲＮＡ配列のようなオリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションチャンネルを通過できることを測定した。ＤＮＡまたはＲＮＡは、０．９−１．０ｎｍのマイナーな直径で溶液中でアルファヘリックスを形成する。１２−２４のメンバーのサイズ範囲のオリゴヌクレオチドが特に興味深い。より小さい断片に破壊できない独特の配列のＤＮＡを、オリゴ配列の製造に長けている会社であるMorpholino社製の蛍光プローブでタグ化した。
【００２３】
前記実験は、１２のメンバーのオリゴヌクレオチド、１６のメンバーのオリゴヌクレオチド、及び２４のメンバーのオリゴヌクレオチドで実施した。その結果、全ての３種の一本鎖形態は、Ｃｘ４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過することが示された（図１Ａ、Ｂ、及びＣ）。更に、二つの１２のメンバーの相補体をハイブリダイズさせて二本鎖形態を産生し、その通過を測定した（図１Ｄ）。二本鎖形態は、そのマイナーな直径がわずかにのみ増大している。
【００２４】
図２Ａは、Ｘ軸がオリゴヌクレオチドの長さであるデータの要約を示す。ハイブリダイズした１２のメンバーのオリゴヌクレオチドは、Ｘ軸上の配列に外挿する。Ｙ軸は、供給源細胞に対してオリゴヌクレオチドを送達した１２分後の、受容者細胞（図１の実施例のすべてにおいて左側の細胞）における蛍光タグの相対強度である。各オリゴヌクレオチドについて、個々の実験から由来する値は、各オリゴヌクレオチドについての平均値及び標準偏差に沿って示される。数多くの実験において、ジャンクションのコンダクタンスと蛍光的にラベルされたオリゴヌクレオチドの輸送を同時にモニターした。
【００２５】
図２Ｂは、Ｘ軸のジャンクションのコンダクタンスと、Ｙ軸の蛍光タグの相対強度の関係を表すグラフである。比較のため、Ｃｘ43ギャップジャンクションチャンネルを通過するLucifer Yellowについてのコンダクタンス−強度の関係が示されている(Valiunas等, 2002)（非特許文献２）。全ての場合で、一つの細胞から別の細胞への移動速度を表す相対強度は、受容者細胞におけるLusifer Yellow蛍光強度の５−１０倍小さい。この小さい移動速度は、オリゴヌクレオチドのロッド様寸法と一致し、そのマイナーな直径は１．０ｎｍであり、Lusifer Yellowより溶液中で移動が少ない。
【００２６】
これらの観察は、ギャップジャンクションチャンネルが、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいずれかの他の同様な寸法の分子のような分子についての送達ポートとして実行可能であることを示す。
【００２７】
我々は以前に、ｈＭＳＣが互いに標的細胞とギャップジャンクションを形成することを示した。更に、エレクトロポレーションにより幹細胞にプラスミドを乗せることができることも以前に示した。本発明の結果は、別の標的細胞（これは潜在的なドナーまたは標的細胞としてｈＭＳＣを含む）とギャップジャンクションを形成するいずれかのドナー細胞タイプが、ＲＮＡまたはＤＮＡを送達するためのビヒクルとして使用できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する１２のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｂは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する１６のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｃは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する２４のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｄは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する２４のメンバーの二本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図２】図２Ａは、ｘ軸が、オリゴヌクレオチドの長さであり、ｙ軸が、供給源細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達後１２分の受容者細胞（図１の実施例のすべてにおいて左側の細胞）における蛍光タグの相対強度であるデータの要約を示すグラフである。図２Ｂは、ｘ軸のジャンクションのコンダクタンスと、ｙ軸の蛍光タグの相対強度の関係を表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本願は、2003年12月17日に出願された米国仮特許出願第60/530,555号の利益と優先権を享受する。
【０００２】
ここに開示される本発明は、合衆国政府、特にＮＨＬＢＩ、及びＮＩＨ（ＧＭＳ）による基金により、それぞれ登録番号ＨＬ−２８９５８及びＧＭ−５５２６３の下で少なくとも部分的に発明された。それ故合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
本願を通じて、各種の出版物が、脚注内でまたはカッコ内で明細書中で参照されている。これらの出版物は全体において、本発明が関連する技術分野の従来技術をより十分に記載するために、本願に参考としてここに取り込まれる。これらの参考文献についての完全な出展の引用は、特許請求の範囲に先行して、本明細書の末尾で見出されるであろう。
【０００４】
共通に所有される先行技術である2003年1月15日に出願された米国特許出願第10/342,506号（特許文献１）、及びここで参考として取り込まれる出版物（非特許文献１及び２）に記載されている通り、幹細胞は標的組織とギャップジャンクションを形成するために使用されている。そのような幹細胞は、遺伝子産物または小分子を送達することによって、標的組織の活性に影響することができる。しかしながら、アンチセンスＲＮＡ、またはＤＮＡの形態のヌクレオチドは、標的組織に対して宿主細胞(例えばヒトの間葉幹細胞(ｈＭＳＣ))によって送達されてはいない。
【特許文献１】米国特許出願第10/342,506号
【非特許文献１】Plotnikov AN, Shlapakova IN, Danilo P Jr, Herron A, Potapova I, Lu Z, Valiunas V, Doronin S, Brink PR, Robinson RB, Cohen IS, Rosen MR: Human mesenchymal stem cells transfected with HCN2 as a gene delivery system to induce pacemaker function in canine heart. Circulation 108: IV-547, 2003
【非特許文献２】Valiunas等, 2002 Cardiac gap junction channels show quantitative differences in selectivity. Cir. Res. 91: 104-111
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明によれば、操作された細胞がＲＮＡを標的細胞に送達させるために使用できるため、ＲＮＡはギャップジャンクションを通過できる。
【０００６】
本発明によれば、ドナー細胞に対する蛍光タグ化オリゴヌクレオチドの単一電極送達によって示され、ギャップジャンクション介在性の連絡を介する標的細胞に対するそれらの輸送が測定されるように、一本鎖であれ二本鎖であれオリゴヌクレオチドは、ＨＥＬＡ細胞ペアにおいてＣｘ４３によって形成されるギャップジャンクションを通過できる。従って本発明は、ギャップジャンクションを形成するいずれかのドナー細胞を使用する、標的細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【０００８】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそのペプチド産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【０００９】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達する工程を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、ＲＮＡまたはＲＮＡのためのプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１１】
本発明によれば、ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達する工程を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、遺伝子活性の下流調節が所望される有用な治療を提供する（例えばガン）。
【００１３】
ＲＮＡまたはアンチセンスの標的細胞への送達が裸のプラスミドによって実施される従来法と比較して、本発明では、前記送達は細胞を介して実施され、トランスフェクション頻度はすっと高いはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドの産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１５】
前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるＲＮＡであっても良く、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドに転写されても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであっても良く、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドであって良く、またはそのようなｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡであっても良い。前記オリゴヌクレオチドは、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドを生産するＤＮＡまたはＲＮＡであっても良い。前記プラスミドは、ｓｉＲＮＡをコードしても良い。前記オリゴヌクレオチドは、１２−２４のメンバーを含んで良い。前記ドナー細胞は、ヒトの間葉幹細胞であっても良い。前記ドナー細胞は、コネキシンタンパク質を含む細胞、またはコネキシンタンパク質を含むように操作された細胞であっても良い。前記標的細胞は、シンシチウム組織を含む細胞であっても良く、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞、またはシンシチウムガン細胞であっても良い。前記標的細胞は、白血球細胞であっても良い。
【００１６】
前記ギャップジャンクションチャンネルは、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、及びコネキシン３７の一つ以上からなっても良い。
【００１７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそのペプチド産物を、ドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達する工程を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法を提供する。
【００１９】
本発明によれば、ＲＮＡまたはＲＮＡのためのプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【００２０】
本発明によれば、ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程、及びドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡをドナー細胞から標的細胞に送達する工程を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法を提供する。
【実施例】
【００２１】
本発明は、ギャップジャンクションチャンネルを通じてオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ断片）を通過させる方法を提供する。これは、コネキシン４３（Ｃｘ４３）からなるギャップジャンクションチャンネルをＨｅＬａ細胞系で使用した実験で示される。
【００２２】
前記実験は、規定された長さのＤＮＡまたはＲＮＡ配列のようなオリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションチャンネルを通過できることを測定した。ＤＮＡまたはＲＮＡは、０．９−１．０ｎｍのマイナーな直径で溶液中でアルファヘリックスを形成する。１２−２４のメンバーのサイズ範囲のオリゴヌクレオチドが特に興味深い。より小さい断片に破壊できない独特の配列のＤＮＡを、オリゴ配列の製造に長けている会社であるMorpholino社製の蛍光プローブでタグ化した。
【００２３】
前記実験は、１２のメンバーのオリゴヌクレオチド、１６のメンバーのオリゴヌクレオチド、及び２４のメンバーのオリゴヌクレオチドで実施した。その結果、全ての３種の一本鎖形態は、Ｃｘ４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過することが示された（図１Ａ、Ｂ、及びＣ）。更に、二つの１２のメンバーの相補体をハイブリダイズさせて二本鎖形態を産生し、その通過を測定した（図１Ｄ）。二本鎖形態は、そのマイナーな直径がわずかにのみ増大している。
【００２４】
図２Ａは、Ｘ軸がオリゴヌクレオチドの長さであるデータの要約を示す。ハイブリダイズした１２のメンバーのオリゴヌクレオチドは、Ｘ軸上の配列に外挿する。Ｙ軸は、供給源細胞に対してオリゴヌクレオチドを送達した１２分後の、受容者細胞（図１の実施例のすべてにおいて左側の細胞）における蛍光タグの相対強度である。各オリゴヌクレオチドについて、個々の実験から由来する値は、各オリゴヌクレオチドについての平均値及び標準偏差に沿って示される。数多くの実験において、ジャンクションのコンダクタンスと蛍光的にラベルされたオリゴヌクレオチドの輸送を同時にモニターした。
【００２５】
図２Ｂは、Ｘ軸のジャンクションのコンダクタンスと、Ｙ軸の蛍光タグの相対強度の関係を表すグラフである。比較のため、Ｃｘ43ギャップジャンクションチャンネルを通過するLucifer Yellowについてのコンダクタンス−強度の関係が示されている(Valiunas等, 2002)（非特許文献２）。全ての場合で、一つの細胞から別の細胞への移動速度を表す相対強度は、受容者細胞におけるLusifer Yellow蛍光強度の５−１０倍小さい。この小さい移動速度は、オリゴヌクレオチドのロッド様寸法と一致し、そのマイナーな直径は１．０ｎｍであり、Lusifer Yellowより溶液中で移動が少ない。
【００２６】
これらの観察は、ギャップジャンクションチャンネルが、サイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいずれかの他の同様な寸法の分子のような分子についての送達ポートとして実行可能であることを示す。
【００２７】
我々は以前に、ｈＭＳＣが互いに標的細胞とギャップジャンクションを形成することを示した。更に、エレクトロポレーションにより幹細胞にプラスミドを乗せることができることも以前に示した。本発明の結果は、別の標的細胞（これは潜在的なドナーまたは標的細胞としてｈＭＳＣを含む）とギャップジャンクションを形成するいずれかのドナー細胞タイプが、ＲＮＡまたはＤＮＡを送達するためのビヒクルとして使用できることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する１２のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｂは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する１６のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｃは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する２４のメンバーの一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。図１Ｄは、コネキシン４３からなるギャップジャンクションチャンネルを通過する２４のメンバーの二本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。
【図２】図２Ａは、ｘ軸が、オリゴヌクレオチドの長さであり、ｙ軸が、供給源細胞に対するオリゴヌクレオチドの送達後１２分の受容者細胞（図１の実施例のすべてにおいて左側の細胞）における蛍光タグの相対強度であるデータの要約を示すグラフである。図２Ｂは、ｘ軸のジャンクションのコンダクタンスと、ｙ軸の蛍光タグの相対強度の関係を表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）オリゴヌクレオチドまたはプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを発現するプラスミド、またはその発現産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがギャップジャンクションを横切ることができるＲＮＡ、またはギャップジャンクションを横切ることができるペプチドに転写できるＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはそのようなｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドを生産するＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミドがｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが１２−２４ヌクレオチド、好ましくは１８−２２ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナー細胞がヒトの間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナー細胞が、コネキシンタンパク質を含む細胞、またはコネキシンタンパク質を含むように操作された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞がシンシチウム組織に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記シンシチウム組織中の細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞、及びシンシチウムガン細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細胞が白血球細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４３からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４０からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４５からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン３２からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン３７からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ギャップジャンクションチャンネルが、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、及びコネキシン３７の少なくとも二つからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそれから発現されるペプチド産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法。
【請求項２１】
ａ）オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法。
【請求項２２】
ａ）ＲＮＡまたはＲＮＡに転写可能なプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡまたはプラスミドをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法。
【請求項２３】
ａ）ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡまたはプラスミドをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法。
【請求項１】
ａ）オリゴヌクレオチドまたはプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチド、前記オリゴヌクレオチドを発現するプラスミド、またはその発現産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを発現するプラスミドを標的細胞に送達する方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがギャップジャンクションを横切ることができるＲＮＡ、またはギャップジャンクションを横切ることができるペプチドに転写できるＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはそのようなｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを生産するｃＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、ギャップジャンクションを横切ることができるペプチドを生産するＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミドがｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが１２−２４ヌクレオチド、好ましくは１８−２２ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナー細胞がヒトの間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナー細胞が、コネキシンタンパク質を含む細胞、またはコネキシンタンパク質を含むように操作された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞がシンシチウム組織に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記シンシチウム組織中の細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、結合組織細胞、及びシンシチウムガン細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細胞が白血球細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４３からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４０からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン４５からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン３２からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ギャップジャンクションチャンネルがコネキシン３７からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ギャップジャンクションチャンネルが、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、及びコネキシン３７の少なくとも二つからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）オリゴヌクレオチドをヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をヒトの間葉幹細胞または他のドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドまたはそれから発現されるペプチド産物をドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドを標的細胞に送達する方法。
【請求項２１】
ａ）オリゴヌクレオチドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞がシンシチウム標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、シンシチウム標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記オリゴヌクレオチドをドナー細胞からシンシチウム標的細胞に送達させる工程
を含む、オリゴヌクレオチドをシンシチウム標的細胞に送達する方法。
【請求項２２】
ａ）ＲＮＡまたはＲＮＡに転写可能なプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＲＮＡまたはプラスミドをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、ＲＮＡを標的細胞に送達する方法。
【請求項２３】
ａ）ＤＮＡまたはＤＮＡをコードするプラスミドをドナー細胞に導入する工程；及び
ｂ）ドナー細胞が標的細胞とギャップジャンクションチャンネルを形成する条件下で、標的細胞をドナー細胞と接触させて、前記ＤＮＡまたはプラスミドをドナー細胞から標的細胞に送達させる工程
を含む、ＤＮＡを標的細胞に送達する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５１４４４５（Ｐ２００７−５１４４４５Ａ）
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４５４８９（Ｐ２００６−５４５４８９）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２５０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１１１
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４２５０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５９１１１
【国際公開日】平成１７年６月３０日（２００５．６．３０）
【出願人】（３０６０１８４５７）ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク (25)
【出願人】（５０３０３５９９２）ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク (7)
【Ｆターム（参考）】
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