寄生虫疾患の処置のための特異的ヒストンの使用
本発明は、寄生虫疾患の処置、診断または予防のためのヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のいずれかの使用に関する。好ましくは、すべて４種のヒストンが組み合わされて使用される。もし１種のヒストンのみが使用される場合は、好ましくはヒストンＨ４が使用される。本発明の大きな利点は、１つの種によって惹起された寄生虫疾患が、その他の種由来のヒストンを使用して処置されてもよいことである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫疾患の処置、診断または予防のためのヒストンの使用に関する。特に、それは、そのような用途のためのヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の一種以上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライシュマニア原生動物は、それらの脊椎動物宿主の単核食細胞系統の細胞に感染する絶対細胞内寄生虫である。これらの寄生虫は、自己治癒性皮膚潰瘍から潜在的に致死性の内蔵感染までの範囲にわたるライシュマニア症、ヒトにおける種々の臨床発現を特徴とする１群の疾病、の病因作用物である（非特許文献１）。疾病の発現と感染の伝播は、感染宿主の遺伝的背景と免疫系の状態に応じて個人ごとに非常に異なる。
【０００３】
皮膚ライシュマニア症のマウス・モデルが幅広く使用されて、有効な予防接種に関する要件が探求された。ＤＮＡワクチンにおいてコードされているマウスに対する数種の抗原の投与は、ある場合には疾病の予防をもたらす（非特許文献２に総括されている）。タンパク質ＧＰ６３、ＬＡＣＫおよびＰＳＡ−２をコードしているＤＮＡによる予防接種は、Ｌ．マヨール（Ｌ．ｍａｊｏｒ）感染からマウスを防御した（例えば、非特許文献３参照）。さらにまた、タンパク質ＬＡＣＫ、ＬｍＳＴ１１およびＴＳＡを発現するプラスミドの組み合わせ物による免疫化は、Ｌ．マヨールによる低用量チャレンジに対して高度に有効であることが証明され（非特許文献４）、一方、システインプロテイナーゼＣＰａおよびＣＰｂをコードしている２種のプラスミドの混合物は、Ｌ．マヨールによる高用量チャレンジに対してＢＡＬＢ／ｃマウスを部分的に防御した（非特許文献５）。防御実験のほとんどは、実験室レベルでかつ動物モデルを用いることに限定される。かくして、実際の宿主動物では乏しい分野の研究しか存在しないので、候補物質が成功をもたらすワクチンであろうことの確定的な証明は存在しない。
【０００４】
良好な抗体価を生成する、すなわち免疫原性である抗原が、常にかつそれ自体で、疾病に対する防御を与えるとは限らないことを注意すべきである。これに対して、抗原に対するある種の抗体または細胞性応答は防御に関係しているかもしれないが、抗原に対する他の抗体または細胞性応答は、疾病の感受性および／または病勢悪化に関係していることもある。その上、アジュバントなしの抗原は抗体応答を起こすが、防御を与えないこともあるので、アジュバントは予防効果にはしばしば必須である。参照、例えば、Ｓｔａｃｅｙら（非特許文献６）は、可溶性ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）単独、ＳＬＡ＋ミョウバン、またはＳＬＡ＋免疫促進性ＣＧモチーフ（ＣｐＧ ＣＤＮ）を含有する非オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によるマウスの皮下予防接種が、予防接種されなかったマウスに較べて病勢悪化した疾病をもたらしたことを報告した。ＳＬＡ＋ＣｐＧ ＣＤＮを受けたマウスはＳＬＡを予防接種されたマウスに較べて高度に有意な防御効果を示し、そして予防接種されなかったマウスに較べて生存率を増進した。
【０００５】
種特異的エピトープを暗示する、ライシュマニア種における抗原の多様性は、個々の抗原に基づくワクチンの開発における１つの誘惑であるかもしれない（非特許文献２）。既知のＤＮＡワクチンは、ＤＮＡが得られた種に対してのみ防御する。Ｍｅｌｂｙおよび共同研究者は、非特許文献７において、ライシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
ｄｏｎｏｖａｎｉ）のタンパク質をコードしているｃＤＮＡ発現ライブラリーおよびサブライブラリーによる免疫化が、Ｌ．ドノバニによって惹起される疾病のＶＬ形態に対してマウスを防御したことを報告した。非特許文献８は、Ｌ．マヨール由来の免疫優性のＬＡＣＫ（活性化されたＣキナーゼに対するレセプターのライシュマニア同族体）寄生虫抗
原をコードしているＤＮＡによる予防接種が、ライシュマニア・マヨールに対する防御を与えることを報告した。非特許文献９は、この抗原がマウスにおいてＬ．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）に対しては防御を与えないことを示している。また彼らは、Ｌ．ドノバニｐ３６（ＬＡＣＫ）ＤＮＡワクチンは高度に免疫原性であるけれども、それが実験的内蔵ライシュマニア症に対して防御的ではないことを報告している。免疫原性分子が防御を与えない、すなわち、感染のクリアランスまたは臨床症候の解除をもたらさないというこの現象は、良好なワクチンを見い出すことへの挑戦の１つになる。もし免疫原性または抗原性分子が常に自動的に防御を与えるならば、ワクチンを見い出すことは容易であろう。１つ以上の種に対して使用できるワクチンを見い出すことは、なお一層の挑戦になる。
【非特許文献１】Ｈｅｒｗａｒｄｔ，Ｌａｎｃｅｔ（１９９９）３５４：１１９１
【非特許文献２】Ｈａｎｄｍａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）１４：２２９
【非特許文献３】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９５５）８４：１７３
【非特許文献４】Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１６６：５１２２
【非特許文献５】Ｒａｆａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９（２５−２６）：３３６９
【非特許文献６】Ｓｔａｃｅｙ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９９ Ａｕｇ；６７（８）：３７１９−２６
【非特許文献７】Ｍｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．（２０００）６８：５５９５
【非特許文献８】Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７７）１８６：１１３７
【非特許文献９】Ｍｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．（２００１）６９：４７１９
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、寄生虫疾患の処置、診断または予防のためのヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のいずれかの使用に関する。１つの実施態様では、Ｈ４のみが使用される。好ましくは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の２種以上が使用され、より好ましくは、これらのヒストンの３種以上が使用され、もっとも好ましくは、すべて４種のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４が使用される。
【０００７】
本発明の利点は、それが、比較的広範なスペクトルの疾病の処置のための薬物、すなわち、交差・種特異性を有する薬物の製造を可能にすることである。多くの寄生虫疾患においては、特異的な種に対して生成されたワクチンは、その特異的な種に対してのみ働く。このことがその場合になる寄生虫疾患の１つの例は、ライシュマニア症である。現在では、この疾病は薬物によって制御されるが、薬物処置は疾病の伝播を防げず、そして多くの場合に非常に有効とは言えない。
【０００８】
本発明の１つの態様では、ヒストンは寄生虫疾患の処置用の製薬学的組成物の製造のために使用される。
【０００９】
本発明の１つの実施態様では、この製薬学的組成物において、各ヒストンは等モル量において存在する。このことは、例えば、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂを含んでなる製薬学的調製物は、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌおよびＨ２ＢのＸｍｏｌ／ｌを含有することを意味する。
【００１０】
本発明のその他の実施態様では、製薬学的組成物におけるヒストンは非等モル量におい
て存在する。このことは、例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ３およびＨ４を含有する製薬学的調製物は、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌ、Ｈ３のＸｍｏｌ／ｌおよびＨ４のＹｍｏｌ／ｌを；あるいは例えば、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌ、Ｈ３のＹｍｏｌ／ｌおよびＨ４のＺｍｏｌ／ｌを含有してもよいことを意味する。好適な実施態様では、製薬学的組成物は主としてヒストンＨ４に基づく。
【００１１】
本発明の製薬学的組成物は、感染症と戦うヒトまたは動物の免疫系の能力を増強するために使用されてもよい。特に、それは、ヒトまたは動物被験者に投与するために使用されてもよい。製薬学的組成物は、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内または病巣内経路による注射または注入によって投与される。製薬学的組成物は当該技術分野における既知の慣用技術によって製薬学的に許容できる媒質または送達担体と組み合わされてもよい。非経口的に投与できる組成物の製造方法は、当該技術分野において周知であり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡを含む、種々の起源においてより詳細に記述されている。製薬学的組成物は、好ましくは、治療学的に有効な用量、すなわち、感染症と戦うヒトまたは動物の免疫系の能力を増強できる用量において投与される。
【００１２】
特に興味あるものは、ワクチンである製薬学的組成物である。ワクチンはタンパク質に基づくワクチンであってもよい。それは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の遺伝子によってコードされているタンパク質の１種以上、好ましくは２種以上を含有してもよい。このことは、タンパク質ワクチンが、例えばＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ４に基づくか、または例えばＨ２Ａ、Ｈ３またはＨ４、またはＨ２ＡおよびＨ３、またはＨ４のみに基づいてもよいことを意味する。好適な実施態様では、ワクチンはＨ４に基づく。
【００１３】
またワクチンはＤＮＡワクチンであってもよい。ＤＮＡワクチンはワクチンに存在する各ヒストンの遺伝子を含有してもよい。例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３に基づくＤＮＡワクチンは、ヒストンＨ２Ａをコードしている遺伝子、ヒストンＨ２Ｂをコードしている遺伝子およびヒストンＨ３をコードしている遺伝子を含有してもよい。あるいはまた、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３に基づくＤＮＡワクチンは、２つの遺伝子、例えば、両ヒストンＨ２ＡおよびＨ３をコードしている１つの遺伝子ならびにヒストンＨ２Ｂをコードしているその他の遺伝子を含有してもよい。あるいは、それは全３種のヒストンをコードしている１つの遺伝子を含有してもよい。これの応用では、１種以上のヒストンをコードしているそのような遺伝子はキメラ遺伝子と呼ばれる。
【００１４】
本発明によるＤＮＡワクチンにおける遺伝子は、典型的にはベクターにおいて存在することができる。適当なベクターの例は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５：６１７参照、そして限定されるものではないがｐｃＤＮＡ３およびｐｃＣＭＶを含む。
【００１５】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、良好に保存された核タンパク質であり、そしてそれらの配列は、当該技術分野において周知である、例えば、Ｒｅｑｕｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｒａｓｉｔｏｌ．（２０００）１６：２４６参照。したがって、製薬学的組成物の調製では、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、いかなる真核生物から得られてもよく、それが植物または動物であっても、それが哺乳類、爬虫類、魚類、昆虫類、またはすべての他の染色体を担持する生物、例えば原生動物由来であってもよい。好ましくは、ヒストンは進化樹においてこの疾病を惹起する生物に近い生物から得られる。したがって、ライシュマニア症のような寄生虫疾患の処置において使用されるヒストンの起源として特に興味あるのは、原生動物、特に、トリパノソーマ科のメンバー、例えばプラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、より特に、トリパノソーマ科の原生動物ライシュマニア属の異なる種である。
【００１６】
ワクチン中のＤＮＡは、タンパク質の発現のために適当であるすべてのＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡまたはｄｓＤＮＡであってもよいが、ゲノムＤＮＡまたはｓｓＤＮＡではない。また、ＤＮＡおよびタンパク質の同時または連続投与による１つのワクチン中にタンパク質およびＤＮＡの混合物が存在してもよい。また、ＲＮＡワクチンが使用されてもよいが、これらは投与されるべきＲＮＡを安定化するために安定化剤を必要とするであろう。
【００１７】
ライシュマニアの２０以上の既知の種が存在しており、これらは、Ｌ．マヨールを含む複合Ｌ．マヨール、Ｌ．チャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）、Ｌ．ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）およびＬ．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）を含む複合Ｌ．ドノバニ、Ｌ．アマゾネンシス（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）およびＬ．メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含む複合Ｌ．メキシカーナ、を含有する亜属ライシュマニアの種、ならびにＬ．ブラジリエンシス（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびＬ．ペルビアナ（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含む複合Ｌ．ブラジリエンシス、およびＬ．ガイアネンシス（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）およびＬ．パナメンシス（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含む複合Ｌ．ガイアネンシス、を含有する亜種ビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）を含む。特に興味あるプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種は、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびプラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である。
【００１８】
本発明の１つの実施態様では、１つの種由来のヒストンを含んでなる製薬学的組成物は、その他の種によって惹起される寄生虫疾患の処置用の薬物の製造のために使用される。
【００１９】
特に、属ライシュマニアからの１種によって惹起されるライシュマニア症は、その他のライシュマニア種由来のヒストンに基づく製薬学的組成物を使用することによって処置されてもよい。１つの実施態様では、Ｌ．マヨールによって惹起されるライシュマニア症は、Ｌ．インファンタム由来のヒストンを含んでなる組成物により成功裏に処置される。
【００２０】
あるいはまた、他の寄生虫疾患、例えばマラリアは、その他の種のヒストンに基づく、例えばＬ．インファンタムのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２種以上に基づく製薬学的組成物により成功裏に処置することができる。
【００２１】
その他の態様では、本発明は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上、しかし好ましくは２種以上に基づく診断剤を提供する。診断剤は、ヒストンのあるものまたはすべてと反応する患者の血清中に存在する抗体を認識するヒストンタンパク質であってもよい。本発明のヒストンタンパク質を含んでなる診断キットは、また本発明の一部である。ヒストンタンパク質は、各々、別々の容器において存在してもよい。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上、しかし好ましくは２種以上に加えて、またキットは、例えば対照反応のための、これらのタンパク質に対する抗体を別の容器に含有してもよい。
【００２２】
その他の態様では、本発明は、治療ワクチンとして機能することによって寄生虫の感染を予防する方法のために提供される。典型的には、感染と疾病の間には一定の期間が存在する。この場合、ワクチンは、感染の病理学的影響を中和する免疫応答を宿主に誘起することによって疾病を治癒できる薬物学的免疫生産物として作用するであろう。治療ワクチンは、治療ワクチンが感染または疾病を既に有する患者において防御を誘導する点で、予防ワクチンとは異なる。
【実施例１】
【００２３】
Ｌ．インファンタム由来のヒストンを含んでなるＤＮＡワクチンの製造
ライシュマニアのヒストンをコードしているＤＮＡワクチンがＬ．マヨールの感染に対してマウスを防御できるか否かを決定するために、Ｌ．インファンタムのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４遺伝子が、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下での発現のために、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３中にサブクローン化された。次いで、ライシュマニアヒストンの発現が、ｐｃＤＮＡ３構築物をトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞において調査された。プラスミドＤＮＡをトランスフェクトされた哺乳動物細胞による組み換えタンパク質の発現は、免疫系の刺激のための決定的条件である。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は３日間培養され、そしてライシュマニアヒストンの発現がウェスターンブロット解析によって調査された。
【００２４】
１．１ 哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３におけるｃＤＮＡのクローニング
ｐＣＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターにおけるライシュマニア・インファンタムの４つのコアヒストンの発現のために、４つの全長ｃＤＮＡクローンが使用された：Ｈ２Ａ（クローンｃＬ７２；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２０５（１）：２１１−６）；Ｈ２Ｂ（クローンＬｉＨ２Ｂ；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１１５（２）：３４２−９）；Ｈ３（クローンＬｉＢ６；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９４，１８：１２１９（２）：５３３−５）およびＨ４（クローンＬｉＨ４−１；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１１５（２）：３４２−９）。これらのｃＤＮＡクローンのすべては、Ｌ．インファンタム□ｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーから予め単離された。ｃＤＮＡクローンからのＥｃｏＲＩインサートがｐＣＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターの対応する切断部位においてサブクローン化された。ＤＮＡ型のそれらのｐｃＤＮＡ３組み換えプラスミドは、エンドトキシン不含のＧｉｇａ−調製用キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製された。
【００２５】
１．２ 哺乳動物細胞におけるライシュマニアヒストンの発現
ＤＮＡ構築物が機能的であり、そして前記タンパク質を発現することを確認するために、ＣＯＳ７細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）試薬（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を用い、製造者のプロトコールにしたがって、１．１項において調製された各ｐｃＤＮＡ３構築物２０□ｇをトランスフェクトされた。簡単に言えば、３ｘ１０６細胞が１００ｍｍプレートにおいて、Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地＋５％ＦＣＳに接種され、そしてそれらが５０〜７５％集密に達した時にトランスフェクトされた。トランスフェクション後７２時間に、細胞が収穫され、氷冷ＰＢＳで２回洗浄され、そして直ちにＬａｅｍｍｌｉバッファーの添加によって溶解された。同等数の細胞から得られたタンパク質がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分割され、そしてニトロセルロースメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に移された。ブロットは、内蔵ライシュマニア症（ＶＣＬ）を罹患しているイヌからの血清によりプローブされ、そして固定相におけるＨ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４タンパク質に対してアフィニティークロマトグラフィーによって精製された）またはｒＨ２Ａで免疫化されたウサギ。
【００２６】
結果は、トランスフェクトされた細胞が検出可能なレベルのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４タンパク質を発現したことを示した。
【００２７】
１．３ ｐＱＥ３０発現ベクターへのクローニング
組み換えタンパク質としてのＬ．インファンタムのヒストンの発現のために、コーディング領域が、鋳型として１．１からのｐｃＤＮＡ３構築物およびプライマーとして次のヌ
クレオチドを採用してＰＣＲ増幅された：
Ｈ２Ａ遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣ−３’（コーディング領域の位置１〜１７）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＣ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ２Ｂ遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣ−３’（コーディング領域の位置１〜１７）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＡＣ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ３遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡ−３’（コーディング領域の位置１〜１９）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ４遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴ−３’（コーディング領域の位置１〜１９）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＡＣＡＧＧＡ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）。
【００２８】
下線のヌクレオチドは、ｐＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＰＣＲ生産物のクローニングを可能にするために包含されるＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を表す。得られるクローンはｐＱＥ−Ｈ２Ａ、ｐＱＥ−Ｈ２Ｂ、ｐＱＥ−Ｈ３およびｐＱＥ−Ｈ４と名付けられた。
【００２９】
１．４ Ｈｉｓ標識した組み換えタンパク質の発現および精製
Ｈｉｓ標識した組み換えタンパク質の発現および精製が、標準手順（Ｑｉａｇｅｎ）にしたがってエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ１５において実施された。タンパク質の誘導後、細菌が収穫され、そして変性条件下（８Ｍ尿素、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）で音波によって溶菌された：タンパク質の精製はＮＩ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）において実施された。組み換えタンパク質は、記述されたように（Ｓｈｉ，１９９７）アフィニティーカラムにおいて徐々に再生された。その後、組み換えタンパク質は０．３Ｍイミダゾールにより溶出された。溶出後、組み換えヒストンを含有する画分がプールされ、ＰＢＳに対して透析された。精製タンパク質は、ポリミキシン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を通過させて、エンドトキシンを除去した。残留エンドトキシンは、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅアッセイ（ＱＣＬ−１０００，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により測定された。
【実施例２】
【００３０】
ＤＮＡワクチンの免疫遺伝学的特性
２．１ 総ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）の調製
可溶性ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）は、ＰＢＳ中に再懸濁されたＬ．マヨールの定常期のプロマスティゴートの３回の凍結と融解サイクルによって調製された。細胞溶解の後、可溶性抗原は、遠心分離によって不溶性画分から分離された。
【００３１】
２．２ 免疫化および寄生虫のチャレンジ
免疫化実験は１０匹のマウス群において実施された。マウスは、両後脚四頭筋に２週間隔で３回筋肉内（ｉ．ｍ．）に、ＰＢＳの総容量１００□ｌ中１．１項で調製されたような各プラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３−Ｈ２Ａ、ｐｃＤＮＡ３−Ｈ２Ｂ、ｐｃＤＮＡ３−Ｈ３およびｐｃＤＮＡ３−Ｈ４）５０□ｇ（２５□ｇ／脚）を接種された。対照マウスは、同じスケジュールにしたがうが、各接種においてｐｃＤＮＡ３の２００□ｇまたはＰＢＳのみを接種された。各接種後１４日目に、マウスは眼窩叢の穿刺によって採血された。最終接種後４週目に、免疫マウスからの脾臓およびリンパ節（ＬＮ）が回収され、５匹の免疫マウスの群が、左後ろ足肉趾に注射された、培養された５ｘ１０４定常期のプロマスティゴートによりチャレンジされた。足肉趾の腫脹が週毎に測定され、そして反対側の対照足肉趾に対する感染された足肉趾の厚さの間の差異として与えられた。
【００３２】
２．３ 抗体価およびイソタイプの決定
血清サンプルが特異的な抗−ライシュマニアヒストンの抗体について分析された。簡単に言えば、標準ＥＬＩＳＡプレートが室温で一夜、ｒＨ２Ａ、ｒＨ２Ｂ、ｒＨ３およびｒＨ４（ＰＢＳ中１□ｇ／ｍｌ）またはＳＬＡ（ＰＢＳ中２□ｇ／ｍｌ）の１００□ｌでコートされた。血清の連続希釈がタイターを決定するために実施されたが、これは吸光度＞０．２を与える最大血清希釈ファクターの逆数として定義される。イソタイプに特異的な分析は、次に示す西洋ワサビペルオキシダーゼ共役の抗マウス免疫グロブリン（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）：抗ＩｇＧ１（１：１０００）および抗ＩｇＧ２ａ（１：５００）を用いて実施された。オルトフェニルジアミンジヒドロクロリド−ＯＰＤ−（Ｄｋｏ，Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が基質として使用された。１５分後、反応は１ＭＨ２ＳＯ４の１００□ｌの添加によって停止され、そして４５０ｎｍにおいて読み取られた。
【００３３】
２．４ 上澄液におけるサイトカインの測定
ＩＮＦ−□およびＩＬ−４の放出が、脾細胞およびＬＮＣｓの培養物の上澄液において測定された。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓およびリンパ節が頸椎脱臼後に無菌的に切除された。脾細胞およびリンパ節細胞の懸濁液が完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを補足されたＲＰＭＩ １６４０）に接種された。３ｘ１０６細胞が、ｒＨ２Ａ、ｒＨ２Ｂ、ｒＨ３およびｒＨ４（１２□ｇ／ｍｌ）、ウシ胸腺からのヒストン（ＳＩＧＭＡ）またはＣｏｎＡ（２□ｇ／ｍｌ）の存在下で３７℃で７２時間４８穴プレートに接種された。サイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎ ｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）によって決定された。
【００３４】
２．５ 寄生虫の定量
寄生虫の数は限界希釈によって、感染された脚からの膝窩筋リンパ節および脾臓において決定された（Ｂｕｕｆｆｅｔ，ｅｔ ａｌ，１９９５）。組織がホモジナイズされ、そしてＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地＋２０％ＦＣＳを含有する９６穴平底ミクロタイタープレートにおいて連続的に希釈された。リンパ節当たりの生存寄生虫数は、プロマスティゴートが２６℃で７日培養まで生育できる最大希釈から決定された。
【００３５】
２．６ 統計学的解析
統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって実施された。差異はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされた。
【００３６】
２．７ ＤＮＡワクチンによる予防接種後の抗体応答
ｃＤＮＡの免疫原性を研究するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ライシュマニア・インファンタムのヒストンをコードしている１．１項で調製された４種のプラスミド（各ｃＤＮＡの５０□ｇ）の混合物により２週毎に２または３回筋肉内に免疫化された。これらの抗原に特異的な抗体が、最終免疫化後の２週目に評価された。特異抗体は、２回の接種後のＥＬＩＳＡによっては検出されなかったが、ＩｇＧ抗体は第３回の接種後に低いタイターで検出可能になった。ＩｇＧ２ａは、すべての場合において抗体の顕著なイソタイプであった。また、ＩｇＧ１抗体のわずかな産生のみが、Ｈ２Ａ応答Ｈ４ヒストンに対して検出された。
【００３７】
２．８ ＤＮＡワクチンによる予防接種後のＴ細胞応答
予防接種後のＴ細胞応答を測定するために、脾臓単核細胞およびリンパ節細胞（ＬＮＣ）が最終のＤＮＡ免疫化後４週目に得られ、そして１．４項において調製された組み換えタンパク質によりイン・ビトロで刺激された。インキュベーション３日後、上澄液が収穫され、そして両ＩＦＮ□およびＩＬ−４についてアッセイされた。
【００３８】
免疫マウスでは、組み換えヒストンタンパク質が、両脾細胞とＬＮＣ細胞において、対照で見い出された量よりも大きい量においてＩＦＮ−□の産生を刺激したことが観察された。ＩＬ−４のヒストン−特異的産生は培養物のいずれの上澄液においても検出できなかった。
【００３９】
２．９ ＩＬ−１２依存性の分析
Ｌ．インファンタムのヒストン遺伝子を有するＤＮＡ予防接種によってマウスにおいて誘起された免疫応答およびＬ．マヨールによるチャレンジ後のその進化を、より詳細に特徴決定するために、予防接種マウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γの抗原−特異的産生がアッセイされた。Ｌ．マヨール感染後２５日目には、予防接種マウス由来の脾細胞は、対照マウス由来の脾細胞よりも多くのヒストン−特異的ＩＦＮ−γを産生し続けた。興味あることに、ＳＬＡ媒介のＩＦＮ−γの産生は、対照からの脾細胞に較べて、予防接種マウス由来の脾細胞において２倍高かった。ＩＦＮ−γのＩＬ−１２依存の産生は、Ｌ．マヨール感染の制御に関連する主なメカニズムであり、培養物への抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体の添加が、予防接種マウス由来の脾細胞におけるＩＦＮ−γの産生を実質的に抑制するか否かが調査された。ＩＦＮ−γ産生の抑制は、使用された４種の異なる刺激（Ｌ．インファンタムのヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４）について８０％以上であることが見い出された。このことは、ヒストン−特異的ＩＦＮ−γの産生がＩＬ−１２依存性であり、そしてさらに、ＩＬ−１２のイン・ビトロ産生がライシュマニアのヒストンによって脾細胞において刺激されることをまた示している。
【００４０】
２．１０ ＩＦＮ−γの産生におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の関与
ＩＦＮ−γの産生に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的寄与が決定された。すべての群の脾細胞からのＩＦＮ−γ産生のヒストン媒介の刺激は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体の培養物への添加によって実質的に抑制された。しかしながら、培養物への抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加は、予防接種されたマウスの脾細胞においてのみＩＦＮ−γ分泌の低下を誘導し、そしてイン・ビトロでは、ヒストンＨ２ＡまたはＨ３のいずれによっても刺激された。かくして、ライシュマニアのヒストンＨ２ＡまたはＨ３をコードしている遺伝子を有するＤＮＡ予防接種は、他の２種のヒストン遺伝子（Ｈ２ＢおよびＨ４）よりも強くＣＤ８細胞を初回感作すると思われる。
【００４１】
最後に、Ｌ．インファンタムのヒストンをコードしている遺伝子を有するＤＮＡ予防接種によってマウスに誘起された防御に関連する免疫状況にさらなる洞察を与えるために、ＬＮＣにおいてＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、防御研究の最後に細胞内サイトカイン染色によって調査された（８匹の対照マウスおよび１０匹の予防接種マウス）。ＩＦＮ−γを産生する両ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の頻度は、対照におけるよりも予防接種マウスにおいて高かった。かくして、これらのデータは、Ｌ．マヨール感染に対する防御がライシュマニアのヒストンを用いるＤＮＡ予防接種によって達成され、予防接種マウスにおいて、ＩＦＮ−γを産生するＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）の増進された頻度と相関されることを直接的に支持する。
【００４２】
これらの結果は、免疫マウスの血清における著量のＩｇＧ２ａ抗体と一致し、そしてＨ
２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４ヒストン遺伝子を用いるＤＮＡ免疫化がこれらの抗原に対するＴｈ１様免疫応答を優先的に誘起したことを示している。さらなる試験実験（実施例３参照）は、遺伝子が防御効果をまた有するか否かを示さねばならない。
【実施例３】
【００４３】
ライシュマニア・インファンタムのヒストンをコードしているＤＮＡワクチンによって誘導されるライシュマニア・マヨールに対する防御
免疫原性実験は、ヒストンによるＤＮＡ免疫が、特異的なＴｈ１様免疫応答の誘導の引き金を引いたことを明らかにしたので、次に、Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４遺伝子を用いるｃＤＮＡ免疫原性レジメが、Ｌ．マヨールによるマウスの感染に対して防御を提供できるか否かという問題が尋ねられた。
【００４４】
３．１ Ｌ．インファンタム由来のヒストンをコードしているＤＮＡワクチンがＬ．マヨールによる感染に対して防御する
７匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群が、１．１項において調製されたような各ヒストン−ＤＮＡ構築物５０□ｇを、２週間隔で前述のように２または３回筋肉内に接種された。対照は、同じ方法において、ヒストン遺伝子のｃＤＮＡクローニングについて使用されたエンプティーベクターの２００□ｇまたはＰＢＳのみを接種された。最終ＤＮＡ免疫化の後４週目に、マウスは、２．１項において調製されたようなＬ．マヨールの培養５ｘ１０４定常期プロマスティゴート形態により左足肉趾にチャレンジされた。足肉趾の腫脹が週毎に測定された。
【００４５】
図１Ａに示された結果は、ヒストン遺伝子によるＤＮＡ予防接種が感染に対して防御を誘導したが、ベクターのみでは誘導しなかったことを示している。予防接種されたマウスにおける足肉趾の腫脹では明らかな遅延が観察された。すべての場合、免疫マウスは、対照（感染後８週目において約５ｍｍ）よりも比較的制御された炎症（同じ週において約１ｍｍ）を示した。感染経過中に７マウス中４匹では、いかなる病巣も観察されなかった。この実験は類似の結果をもって再現された。
【００４６】
３．２ ヒストンをコードしているＤＮＡワクチンによる予防接種後の脾臓およびリンパ節の寄生虫負荷
低下された足肉趾の腫脹が脾臓および膝窩筋リンパ節における寄生虫負荷と相関するか否かを決定するために、マウスは、予防接種されたマウス群の感染後１０週目および対照の感染後８週目に安楽死された。予防接種マウスは対照において決定された負荷よりも有意に低い寄生虫負荷を示した（図１Ｂ）。注目すべきは、寄生虫のビセラリゼーション（内蔵への負荷（ｖｉｓｃｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ））は対照（ｐｃＤＮＡ３）において同質に観察されたが、予防接種マウスでは、寄生虫負荷は低く、そして若干の場合には、寄生虫は検出されなかった。これらのデータすべては、予防接種マウスはＬ．マヨールによって誘導される皮膚ライシュマニア症を制御していることを示唆する。
【実施例４】
【００４７】
個々の形態におけるヒストンによる免疫化
これまでの実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるライシュマニア・インファンタムのヒストン（Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４）に関する遺伝子を含有する真核生物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３のＤＮＡ混合物の注射が、Ｌ．マヨール感染の制御をもたらす特異的なＴｈ１免疫応答を誘導することを示した。本実施例では、別々に投与されたヌクレオソームＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４をコードしているこれらのｐｃＤＮＡ３の各々１種による遺伝的免疫化の効果が研究された。実験条件は前記のとおりであった。
【００４８】
その結果は、すべての場合に、各ヒストンｐｃＤＮＡ３の投与が、エンプティーｐｃＤ
ＮＡ３により免疫化された対照マウスと較べて、可溶性ライシュマニア抗原ＳＬＡに対する低い体液性応答およびヒストンに対する限定的な体液性応答（主として抗体ＩｇＧ２ａによって占められる）に付随して、Ｌ．マヨール感染後９週に両ＩＬ−４およびＩＬ−１０ Ｔｈ２サイトカインの減少を誘導することを示している。さらに加えて、対照マウスにおける脾細胞の増殖分析からの結果は、分裂促進因子ＣｏｎＡ、ＬＰＳに対して、そしてＳＬＡに対して減少した細胞性免疫応答の存在を示す。感染経過中に予防接種されたマウスは、対照マウスに較べて足肉趾の腫脹の遅延と、そして膝窩筋リンパ節における低い寄生虫負荷を表した。結論として、ライシュマニアのヌクレオソームヒストンをコードしている各ヒストンｐｃＤＮＡ３の投与は、Ｌ．マヨール感染によって誘導されるＴｈ２−作動性応答を低下させ、これが脾臓における低いＩＬ−４とＩＬ−１０の産生、ならびにマウスの皮膚ライシュマニア症に対する防御と相関される低い体液性応答をもたらす。また、この結果は、ライシュマニアのヒストンの中で、Ｈ４を用いるＤＮＡ免疫が、皮膚ライシュマニア症に対する防御免疫を誘導することにもっとも有効であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】（Ａ）ヒストン遺伝子プールの３用量により予防接種されたマウスにおける防御。ライシュマニアのヒストン・遺伝子および対照（ｐｃＤＮＡ３またはＰＢＳ）を接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスが、左後ろ足肉趾（ｆｏｏｔｐａｄ）に注射された５ｘ１０４のＬ．マヨールのプロマスティゴートによりチャレンジされた。肉趾の腫脹は、反対側の未感染肉趾に対する感染肉趾の厚さの間の差異として表される。週毎の足肉趾の測定値は平均足肉趾スコア±ＳＤを表す。ＤＮＡ免疫されたマウスにおけるＬ．マヨールのチャレンジは、実質的に同じ結果をもつ２つの異なる実験を表す。＊４週目では、対照とワクチン接種されたマウスの足肉趾の腫脹間の差異は有意であった（ｐ＜０．００１）。（Ｂ）対照（ｐｃＤＮＡ３）における感染後８週目およびワクチン接種（ｐｃＤＮＡ３−ヒストン）における１０週目の脾臓およびリンパ節における寄生虫負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）。細胞懸濁液は、感染脚の膝窩筋リンパ節および脾臓から作成された。生存寄生虫数は、限界希釈によって決定された。結果は、組織当たりの寄生虫総数の平均値±ＳＤとして表された（ｌｏｇ１０として表される）。対照とワクチン接種されたマウスとの間の＊差異は、両脾臓および膝窩筋リンパ節において有意であった（ｐ＜０．００１）。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫疾患の処置、診断または予防のためのヒストンの使用に関する。特に、それは、そのような用途のためのヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の一種以上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライシュマニア原生動物は、それらの脊椎動物宿主の単核食細胞系統の細胞に感染する絶対細胞内寄生虫である。これらの寄生虫は、自己治癒性皮膚潰瘍から潜在的に致死性の内蔵感染までの範囲にわたるライシュマニア症、ヒトにおける種々の臨床発現を特徴とする１群の疾病、の病因作用物である（非特許文献１）。疾病の発現と感染の伝播は、感染宿主の遺伝的背景と免疫系の状態に応じて個人ごとに非常に異なる。
【０００３】
皮膚ライシュマニア症のマウス・モデルが幅広く使用されて、有効な予防接種に関する要件が探求された。ＤＮＡワクチンにおいてコードされているマウスに対する数種の抗原の投与は、ある場合には疾病の予防をもたらす（非特許文献２に総括されている）。タンパク質ＧＰ６３、ＬＡＣＫおよびＰＳＡ−２をコードしているＤＮＡによる予防接種は、Ｌ．マヨール（Ｌ．ｍａｊｏｒ）感染からマウスを防御した（例えば、非特許文献３参照）。さらにまた、タンパク質ＬＡＣＫ、ＬｍＳＴ１１およびＴＳＡを発現するプラスミドの組み合わせ物による免疫化は、Ｌ．マヨールによる低用量チャレンジに対して高度に有効であることが証明され（非特許文献４）、一方、システインプロテイナーゼＣＰａおよびＣＰｂをコードしている２種のプラスミドの混合物は、Ｌ．マヨールによる高用量チャレンジに対してＢＡＬＢ／ｃマウスを部分的に防御した（非特許文献５）。防御実験のほとんどは、実験室レベルでかつ動物モデルを用いることに限定される。かくして、実際の宿主動物では乏しい分野の研究しか存在しないので、候補物質が成功をもたらすワクチンであろうことの確定的な証明は存在しない。
【０００４】
良好な抗体価を生成する、すなわち免疫原性である抗原が、常にかつそれ自体で、疾病に対する防御を与えるとは限らないことを注意すべきである。これに対して、抗原に対するある種の抗体または細胞性応答は防御に関係しているかもしれないが、抗原に対する他の抗体または細胞性応答は、疾病の感受性および／または病勢悪化に関係していることもある。その上、アジュバントなしの抗原は抗体応答を起こすが、防御を与えないこともあるので、アジュバントは予防効果にはしばしば必須である。参照、例えば、Ｓｔａｃｅｙら（非特許文献６）は、可溶性ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）単独、ＳＬＡ＋ミョウバン、またはＳＬＡ＋免疫促進性ＣＧモチーフ（ＣｐＧ ＣＤＮ）を含有する非オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）によるマウスの皮下予防接種が、予防接種されなかったマウスに較べて病勢悪化した疾病をもたらしたことを報告した。ＳＬＡ＋ＣｐＧ ＣＤＮを受けたマウスはＳＬＡを予防接種されたマウスに較べて高度に有意な防御効果を示し、そして予防接種されなかったマウスに較べて生存率を増進した。
【０００５】
種特異的エピトープを暗示する、ライシュマニア種における抗原の多様性は、個々の抗原に基づくワクチンの開発における１つの誘惑であるかもしれない（非特許文献２）。既知のＤＮＡワクチンは、ＤＮＡが得られた種に対してのみ防御する。Ｍｅｌｂｙおよび共同研究者は、非特許文献７において、ライシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ
ｄｏｎｏｖａｎｉ）のタンパク質をコードしているｃＤＮＡ発現ライブラリーおよびサブライブラリーによる免疫化が、Ｌ．ドノバニによって惹起される疾病のＶＬ形態に対してマウスを防御したことを報告した。非特許文献８は、Ｌ．マヨール由来の免疫優性のＬＡＣＫ（活性化されたＣキナーゼに対するレセプターのライシュマニア同族体）寄生虫抗
原をコードしているＤＮＡによる予防接種が、ライシュマニア・マヨールに対する防御を与えることを報告した。非特許文献９は、この抗原がマウスにおいてＬ．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）に対しては防御を与えないことを示している。また彼らは、Ｌ．ドノバニｐ３６（ＬＡＣＫ）ＤＮＡワクチンは高度に免疫原性であるけれども、それが実験的内蔵ライシュマニア症に対して防御的ではないことを報告している。免疫原性分子が防御を与えない、すなわち、感染のクリアランスまたは臨床症候の解除をもたらさないというこの現象は、良好なワクチンを見い出すことへの挑戦の１つになる。もし免疫原性または抗原性分子が常に自動的に防御を与えるならば、ワクチンを見い出すことは容易であろう。１つ以上の種に対して使用できるワクチンを見い出すことは、なお一層の挑戦になる。
【非特許文献１】Ｈｅｒｗａｒｄｔ，Ｌａｎｃｅｔ（１９９９）３５４：１１９１
【非特許文献２】Ｈａｎｄｍａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）１４：２２９
【非特許文献３】Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９５５）８４：１７３
【非特許文献４】Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１６６：５１２２
【非特許文献５】Ｒａｆａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９（２５−２６）：３３６９
【非特許文献６】Ｓｔａｃｅｙ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９９ Ａｕｇ；６７（８）：３７１９−２６
【非特許文献７】Ｍｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．（２０００）６８：５５９５
【非特許文献８】Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７７）１８６：１１３７
【非特許文献９】Ｍｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．（２００１）６９：４７１９
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、寄生虫疾患の処置、診断または予防のためのヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のいずれかの使用に関する。１つの実施態様では、Ｈ４のみが使用される。好ましくは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の２種以上が使用され、より好ましくは、これらのヒストンの３種以上が使用され、もっとも好ましくは、すべて４種のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４が使用される。
【０００７】
本発明の利点は、それが、比較的広範なスペクトルの疾病の処置のための薬物、すなわち、交差・種特異性を有する薬物の製造を可能にすることである。多くの寄生虫疾患においては、特異的な種に対して生成されたワクチンは、その特異的な種に対してのみ働く。このことがその場合になる寄生虫疾患の１つの例は、ライシュマニア症である。現在では、この疾病は薬物によって制御されるが、薬物処置は疾病の伝播を防げず、そして多くの場合に非常に有効とは言えない。
【０００８】
本発明の１つの態様では、ヒストンは寄生虫疾患の処置用の製薬学的組成物の製造のために使用される。
【０００９】
本発明の１つの実施態様では、この製薬学的組成物において、各ヒストンは等モル量において存在する。このことは、例えば、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂを含んでなる製薬学的調製物は、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌおよびＨ２ＢのＸｍｏｌ／ｌを含有することを意味する。
【００１０】
本発明のその他の実施態様では、製薬学的組成物におけるヒストンは非等モル量におい
て存在する。このことは、例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ３およびＨ４を含有する製薬学的調製物は、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌ、Ｈ３のＸｍｏｌ／ｌおよびＨ４のＹｍｏｌ／ｌを；あるいは例えば、Ｈ２ＡのＸｍｏｌ／ｌ、Ｈ３のＹｍｏｌ／ｌおよびＨ４のＺｍｏｌ／ｌを含有してもよいことを意味する。好適な実施態様では、製薬学的組成物は主としてヒストンＨ４に基づく。
【００１１】
本発明の製薬学的組成物は、感染症と戦うヒトまたは動物の免疫系の能力を増強するために使用されてもよい。特に、それは、ヒトまたは動物被験者に投与するために使用されてもよい。製薬学的組成物は、好ましくは非経口的に、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内または病巣内経路による注射または注入によって投与される。製薬学的組成物は当該技術分野における既知の慣用技術によって製薬学的に許容できる媒質または送達担体と組み合わされてもよい。非経口的に投与できる組成物の製造方法は、当該技術分野において周知であり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．ＡＲ Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡを含む、種々の起源においてより詳細に記述されている。製薬学的組成物は、好ましくは、治療学的に有効な用量、すなわち、感染症と戦うヒトまたは動物の免疫系の能力を増強できる用量において投与される。
【００１２】
特に興味あるものは、ワクチンである製薬学的組成物である。ワクチンはタンパク質に基づくワクチンであってもよい。それは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の遺伝子によってコードされているタンパク質の１種以上、好ましくは２種以上を含有してもよい。このことは、タンパク質ワクチンが、例えばＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ４に基づくか、または例えばＨ２Ａ、Ｈ３またはＨ４、またはＨ２ＡおよびＨ３、またはＨ４のみに基づいてもよいことを意味する。好適な実施態様では、ワクチンはＨ４に基づく。
【００１３】
またワクチンはＤＮＡワクチンであってもよい。ＤＮＡワクチンはワクチンに存在する各ヒストンの遺伝子を含有してもよい。例えば、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３に基づくＤＮＡワクチンは、ヒストンＨ２Ａをコードしている遺伝子、ヒストンＨ２Ｂをコードしている遺伝子およびヒストンＨ３をコードしている遺伝子を含有してもよい。あるいはまた、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびＨ３に基づくＤＮＡワクチンは、２つの遺伝子、例えば、両ヒストンＨ２ＡおよびＨ３をコードしている１つの遺伝子ならびにヒストンＨ２Ｂをコードしているその他の遺伝子を含有してもよい。あるいは、それは全３種のヒストンをコードしている１つの遺伝子を含有してもよい。これの応用では、１種以上のヒストンをコードしているそのような遺伝子はキメラ遺伝子と呼ばれる。
【００１４】
本発明によるＤＮＡワクチンにおける遺伝子は、典型的にはベクターにおいて存在することができる。適当なベクターの例は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５：６１７参照、そして限定されるものではないがｐｃＤＮＡ３およびｐｃＣＭＶを含む。
【００１５】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、良好に保存された核タンパク質であり、そしてそれらの配列は、当該技術分野において周知である、例えば、Ｒｅｑｕｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｒａｓｉｔｏｌ．（２０００）１６：２４６参照。したがって、製薬学的組成物の調製では、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、いかなる真核生物から得られてもよく、それが植物または動物であっても、それが哺乳類、爬虫類、魚類、昆虫類、またはすべての他の染色体を担持する生物、例えば原生動物由来であってもよい。好ましくは、ヒストンは進化樹においてこの疾病を惹起する生物に近い生物から得られる。したがって、ライシュマニア症のような寄生虫疾患の処置において使用されるヒストンの起源として特に興味あるのは、原生動物、特に、トリパノソーマ科のメンバー、例えばプラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、より特に、トリパノソーマ科の原生動物ライシュマニア属の異なる種である。
【００１６】
ワクチン中のＤＮＡは、タンパク質の発現のために適当であるすべてのＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡまたはｄｓＤＮＡであってもよいが、ゲノムＤＮＡまたはｓｓＤＮＡではない。また、ＤＮＡおよびタンパク質の同時または連続投与による１つのワクチン中にタンパク質およびＤＮＡの混合物が存在してもよい。また、ＲＮＡワクチンが使用されてもよいが、これらは投与されるべきＲＮＡを安定化するために安定化剤を必要とするであろう。
【００１７】
ライシュマニアの２０以上の既知の種が存在しており、これらは、Ｌ．マヨールを含む複合Ｌ．マヨール、Ｌ．チャガシ（Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ）、Ｌ．ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）およびＬ．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）を含む複合Ｌ．ドノバニ、Ｌ．アマゾネンシス（Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）およびＬ．メキシカーナ（Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）を含む複合Ｌ．メキシカーナ、を含有する亜属ライシュマニアの種、ならびにＬ．ブラジリエンシス（Ｌ．ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）およびＬ．ペルビアナ（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎａ）を含む複合Ｌ．ブラジリエンシス、およびＬ．ガイアネンシス（Ｌ．ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）およびＬ．パナメンシス（Ｌ．ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）を含む複合Ｌ．ガイアネンシス、を含有する亜種ビアンニア（Ｖｉａｎｎｉａ）を含む。特に興味あるプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種は、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびプラスモジウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）である。
【００１８】
本発明の１つの実施態様では、１つの種由来のヒストンを含んでなる製薬学的組成物は、その他の種によって惹起される寄生虫疾患の処置用の薬物の製造のために使用される。
【００１９】
特に、属ライシュマニアからの１種によって惹起されるライシュマニア症は、その他のライシュマニア種由来のヒストンに基づく製薬学的組成物を使用することによって処置されてもよい。１つの実施態様では、Ｌ．マヨールによって惹起されるライシュマニア症は、Ｌ．インファンタム由来のヒストンを含んでなる組成物により成功裏に処置される。
【００２０】
あるいはまた、他の寄生虫疾患、例えばマラリアは、その他の種のヒストンに基づく、例えばＬ．インファンタムのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２種以上に基づく製薬学的組成物により成功裏に処置することができる。
【００２１】
その他の態様では、本発明は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上、しかし好ましくは２種以上に基づく診断剤を提供する。診断剤は、ヒストンのあるものまたはすべてと反応する患者の血清中に存在する抗体を認識するヒストンタンパク質であってもよい。本発明のヒストンタンパク質を含んでなる診断キットは、また本発明の一部である。ヒストンタンパク質は、各々、別々の容器において存在してもよい。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上、しかし好ましくは２種以上に加えて、またキットは、例えば対照反応のための、これらのタンパク質に対する抗体を別の容器に含有してもよい。
【００２２】
その他の態様では、本発明は、治療ワクチンとして機能することによって寄生虫の感染を予防する方法のために提供される。典型的には、感染と疾病の間には一定の期間が存在する。この場合、ワクチンは、感染の病理学的影響を中和する免疫応答を宿主に誘起することによって疾病を治癒できる薬物学的免疫生産物として作用するであろう。治療ワクチンは、治療ワクチンが感染または疾病を既に有する患者において防御を誘導する点で、予防ワクチンとは異なる。
【実施例１】
【００２３】
Ｌ．インファンタム由来のヒストンを含んでなるＤＮＡワクチンの製造
ライシュマニアのヒストンをコードしているＤＮＡワクチンがＬ．マヨールの感染に対してマウスを防御できるか否かを決定するために、Ｌ．インファンタムのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４遺伝子が、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下での発現のために、真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３中にサブクローン化された。次いで、ライシュマニアヒストンの発現が、ｐｃＤＮＡ３構築物をトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞において調査された。プラスミドＤＮＡをトランスフェクトされた哺乳動物細胞による組み換えタンパク質の発現は、免疫系の刺激のための決定的条件である。トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞は３日間培養され、そしてライシュマニアヒストンの発現がウェスターンブロット解析によって調査された。
【００２４】
１．１ 哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３におけるｃＤＮＡのクローニング
ｐＣＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターにおけるライシュマニア・インファンタムの４つのコアヒストンの発現のために、４つの全長ｃＤＮＡクローンが使用された：Ｈ２Ａ（クローンｃＬ７２；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２，２０５（１）：２１１−６）；Ｈ２Ｂ（クローンＬｉＨ２Ｂ；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１１５（２）：３４２−９）；Ｈ３（クローンＬｉＢ６；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９４，１８：１２１９（２）：５３３−５）およびＨ４（クローンＬｉＨ４−１；Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１１５（２）：３４２−９）。これらのｃＤＮＡクローンのすべては、Ｌ．インファンタム□ｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーから予め単離された。ｃＤＮＡクローンからのＥｃｏＲＩインサートがｐＣＤＮＡ３哺乳動物発現ベクターの対応する切断部位においてサブクローン化された。ＤＮＡ型のそれらのｐｃＤＮＡ３組み換えプラスミドは、エンドトキシン不含のＧｉｇａ−調製用キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製された。
【００２５】
１．２ 哺乳動物細胞におけるライシュマニアヒストンの発現
ＤＮＡ構築物が機能的であり、そして前記タンパク質を発現することを確認するために、ＣＯＳ７細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）試薬（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を用い、製造者のプロトコールにしたがって、１．１項において調製された各ｐｃＤＮＡ３構築物２０□ｇをトランスフェクトされた。簡単に言えば、３ｘ１０６細胞が１００ｍｍプレートにおいて、Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地＋５％ＦＣＳに接種され、そしてそれらが５０〜７５％集密に達した時にトランスフェクトされた。トランスフェクション後７２時間に、細胞が収穫され、氷冷ＰＢＳで２回洗浄され、そして直ちにＬａｅｍｍｌｉバッファーの添加によって溶解された。同等数の細胞から得られたタンパク質がドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分割され、そしてニトロセルロースメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）に移された。ブロットは、内蔵ライシュマニア症（ＶＣＬ）を罹患しているイヌからの血清によりプローブされ、そして固定相におけるＨ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４タンパク質に対してアフィニティークロマトグラフィーによって精製された）またはｒＨ２Ａで免疫化されたウサギ。
【００２６】
結果は、トランスフェクトされた細胞が検出可能なレベルのＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４タンパク質を発現したことを示した。
【００２７】
１．３ ｐＱＥ３０発現ベクターへのクローニング
組み換えタンパク質としてのＬ．インファンタムのヒストンの発現のために、コーディング領域が、鋳型として１．１からのｐｃＤＮＡ３構築物およびプライマーとして次のヌ
クレオチドを採用してＰＣＲ増幅された：
Ｈ２Ａ遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣ−３’（コーディング領域の位置１〜１７）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＣ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ２Ｂ遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣ−３’（コーディング領域の位置１〜１７）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＡＣ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ３遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＧＡ−３’（コーディング領域の位置１〜１９）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＧＧＣＧＣＴＣＡＣＣＧＣＧＣＡ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）；
Ｈ４遺伝子では（センス５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴ−３’（コーディング領域の位置１〜１９）；アンチセンス５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＡＣＡＧＧＡ−３’（コーディング領域の位置に対して逆および相補的）。
【００２８】
下線のヌクレオチドは、ｐＱＥ３０発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）においてＰＣＲ生産物のクローニングを可能にするために包含されるＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を表す。得られるクローンはｐＱＥ−Ｈ２Ａ、ｐＱＥ−Ｈ２Ｂ、ｐＱＥ−Ｈ３およびｐＱＥ−Ｈ４と名付けられた。
【００２９】
１．４ Ｈｉｓ標識した組み換えタンパク質の発現および精製
Ｈｉｓ標識した組み換えタンパク質の発現および精製が、標準手順（Ｑｉａｇｅｎ）にしたがってエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｍ１５において実施された。タンパク質の誘導後、細菌が収穫され、そして変性条件下（８Ｍ尿素、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）で音波によって溶菌された：タンパク質の精製はＮＩ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）において実施された。組み換えタンパク質は、記述されたように（Ｓｈｉ，１９９７）アフィニティーカラムにおいて徐々に再生された。その後、組み換えタンパク質は０．３Ｍイミダゾールにより溶出された。溶出後、組み換えヒストンを含有する画分がプールされ、ＰＢＳに対して透析された。精製タンパク質は、ポリミキシン−アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を通過させて、エンドトキシンを除去した。残留エンドトキシンは、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｎｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅアッセイ（ＱＣＬ−１０００，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）により測定された。
【実施例２】
【００３０】
ＤＮＡワクチンの免疫遺伝学的特性
２．１ 総ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）の調製
可溶性ライシュマニア抗原（ＳＬＡ）は、ＰＢＳ中に再懸濁されたＬ．マヨールの定常期のプロマスティゴートの３回の凍結と融解サイクルによって調製された。細胞溶解の後、可溶性抗原は、遠心分離によって不溶性画分から分離された。
【００３１】
２．２ 免疫化および寄生虫のチャレンジ
免疫化実験は１０匹のマウス群において実施された。マウスは、両後脚四頭筋に２週間隔で３回筋肉内（ｉ．ｍ．）に、ＰＢＳの総容量１００□ｌ中１．１項で調製されたような各プラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３−Ｈ２Ａ、ｐｃＤＮＡ３−Ｈ２Ｂ、ｐｃＤＮＡ３−Ｈ３およびｐｃＤＮＡ３−Ｈ４）５０□ｇ（２５□ｇ／脚）を接種された。対照マウスは、同じスケジュールにしたがうが、各接種においてｐｃＤＮＡ３の２００□ｇまたはＰＢＳのみを接種された。各接種後１４日目に、マウスは眼窩叢の穿刺によって採血された。最終接種後４週目に、免疫マウスからの脾臓およびリンパ節（ＬＮ）が回収され、５匹の免疫マウスの群が、左後ろ足肉趾に注射された、培養された５ｘ１０４定常期のプロマスティゴートによりチャレンジされた。足肉趾の腫脹が週毎に測定され、そして反対側の対照足肉趾に対する感染された足肉趾の厚さの間の差異として与えられた。
【００３２】
２．３ 抗体価およびイソタイプの決定
血清サンプルが特異的な抗−ライシュマニアヒストンの抗体について分析された。簡単に言えば、標準ＥＬＩＳＡプレートが室温で一夜、ｒＨ２Ａ、ｒＨ２Ｂ、ｒＨ３およびｒＨ４（ＰＢＳ中１□ｇ／ｍｌ）またはＳＬＡ（ＰＢＳ中２□ｇ／ｍｌ）の１００□ｌでコートされた。血清の連続希釈がタイターを決定するために実施されたが、これは吸光度＞０．２を与える最大血清希釈ファクターの逆数として定義される。イソタイプに特異的な分析は、次に示す西洋ワサビペルオキシダーゼ共役の抗マウス免疫グロブリン（Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｉｌｂｕｒｇ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）：抗ＩｇＧ１（１：１０００）および抗ＩｇＧ２ａ（１：５００）を用いて実施された。オルトフェニルジアミンジヒドロクロリド−ＯＰＤ−（Ｄｋｏ，Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が基質として使用された。１５分後、反応は１ＭＨ２ＳＯ４の１００□ｌの添加によって停止され、そして４５０ｎｍにおいて読み取られた。
【００３３】
２．４ 上澄液におけるサイトカインの測定
ＩＮＦ−□およびＩＬ−４の放出が、脾細胞およびＬＮＣｓの培養物の上澄液において測定された。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓およびリンパ節が頸椎脱臼後に無菌的に切除された。脾細胞およびリンパ節細胞の懸濁液が完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを補足されたＲＰＭＩ １６４０）に接種された。３ｘ１０６細胞が、ｒＨ２Ａ、ｒＨ２Ｂ、ｒＨ３およびｒＨ４（１２□ｇ／ｍｌ）、ウシ胸腺からのヒストン（ＳＩＧＭＡ）またはＣｏｎＡ（２□ｇ／ｍｌ）の存在下で３７℃で７２時間４８穴プレートに接種された。サイトカイン産生は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎ ｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）によって決定された。
【００３４】
２．５ 寄生虫の定量
寄生虫の数は限界希釈によって、感染された脚からの膝窩筋リンパ節および脾臓において決定された（Ｂｕｕｆｆｅｔ，ｅｔ ａｌ，１９９５）。組織がホモジナイズされ、そしてＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地＋２０％ＦＣＳを含有する９６穴平底ミクロタイタープレートにおいて連続的に希釈された。リンパ節当たりの生存寄生虫数は、プロマスティゴートが２６℃で７日培養まで生育できる最大希釈から決定された。
【００３５】
２．６ 統計学的解析
統計学的解析はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって実施された。差異はＰ＜０．０５の場合に有意と見なされた。
【００３６】
２．７ ＤＮＡワクチンによる予防接種後の抗体応答
ｃＤＮＡの免疫原性を研究するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ライシュマニア・インファンタムのヒストンをコードしている１．１項で調製された４種のプラスミド（各ｃＤＮＡの５０□ｇ）の混合物により２週毎に２または３回筋肉内に免疫化された。これらの抗原に特異的な抗体が、最終免疫化後の２週目に評価された。特異抗体は、２回の接種後のＥＬＩＳＡによっては検出されなかったが、ＩｇＧ抗体は第３回の接種後に低いタイターで検出可能になった。ＩｇＧ２ａは、すべての場合において抗体の顕著なイソタイプであった。また、ＩｇＧ１抗体のわずかな産生のみが、Ｈ２Ａ応答Ｈ４ヒストンに対して検出された。
【００３７】
２．８ ＤＮＡワクチンによる予防接種後のＴ細胞応答
予防接種後のＴ細胞応答を測定するために、脾臓単核細胞およびリンパ節細胞（ＬＮＣ）が最終のＤＮＡ免疫化後４週目に得られ、そして１．４項において調製された組み換えタンパク質によりイン・ビトロで刺激された。インキュベーション３日後、上澄液が収穫され、そして両ＩＦＮ□およびＩＬ−４についてアッセイされた。
【００３８】
免疫マウスでは、組み換えヒストンタンパク質が、両脾細胞とＬＮＣ細胞において、対照で見い出された量よりも大きい量においてＩＦＮ−□の産生を刺激したことが観察された。ＩＬ−４のヒストン−特異的産生は培養物のいずれの上澄液においても検出できなかった。
【００３９】
２．９ ＩＬ−１２依存性の分析
Ｌ．インファンタムのヒストン遺伝子を有するＤＮＡ予防接種によってマウスにおいて誘起された免疫応答およびＬ．マヨールによるチャレンジ後のその進化を、より詳細に特徴決定するために、予防接種マウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γの抗原−特異的産生がアッセイされた。Ｌ．マヨール感染後２５日目には、予防接種マウス由来の脾細胞は、対照マウス由来の脾細胞よりも多くのヒストン−特異的ＩＦＮ−γを産生し続けた。興味あることに、ＳＬＡ媒介のＩＦＮ−γの産生は、対照からの脾細胞に較べて、予防接種マウス由来の脾細胞において２倍高かった。ＩＦＮ−γのＩＬ−１２依存の産生は、Ｌ．マヨール感染の制御に関連する主なメカニズムであり、培養物への抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体の添加が、予防接種マウス由来の脾細胞におけるＩＦＮ−γの産生を実質的に抑制するか否かが調査された。ＩＦＮ−γ産生の抑制は、使用された４種の異なる刺激（Ｌ．インファンタムのヒストンＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４）について８０％以上であることが見い出された。このことは、ヒストン−特異的ＩＦＮ−γの産生がＩＬ−１２依存性であり、そしてさらに、ＩＬ−１２のイン・ビトロ産生がライシュマニアのヒストンによって脾細胞において刺激されることをまた示している。
【００４０】
２．１０ ＩＦＮ−γの産生におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の関与
ＩＦＮ−γの産生に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的寄与が決定された。すべての群の脾細胞からのＩＦＮ−γ産生のヒストン媒介の刺激は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体の培養物への添加によって実質的に抑制された。しかしながら、培養物への抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加は、予防接種されたマウスの脾細胞においてのみＩＦＮ−γ分泌の低下を誘導し、そしてイン・ビトロでは、ヒストンＨ２ＡまたはＨ３のいずれによっても刺激された。かくして、ライシュマニアのヒストンＨ２ＡまたはＨ３をコードしている遺伝子を有するＤＮＡ予防接種は、他の２種のヒストン遺伝子（Ｈ２ＢおよびＨ４）よりも強くＣＤ８細胞を初回感作すると思われる。
【００４１】
最後に、Ｌ．インファンタムのヒストンをコードしている遺伝子を有するＤＮＡ予防接種によってマウスに誘起された防御に関連する免疫状況にさらなる洞察を与えるために、ＬＮＣにおいてＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、防御研究の最後に細胞内サイトカイン染色によって調査された（８匹の対照マウスおよび１０匹の予防接種マウス）。ＩＦＮ−γを産生する両ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の頻度は、対照におけるよりも予防接種マウスにおいて高かった。かくして、これらのデータは、Ｌ．マヨール感染に対する防御がライシュマニアのヒストンを用いるＤＮＡ予防接種によって達成され、予防接種マウスにおいて、ＩＦＮ−γを産生するＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）の増進された頻度と相関されることを直接的に支持する。
【００４２】
これらの結果は、免疫マウスの血清における著量のＩｇＧ２ａ抗体と一致し、そしてＨ
２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４ヒストン遺伝子を用いるＤＮＡ免疫化がこれらの抗原に対するＴｈ１様免疫応答を優先的に誘起したことを示している。さらなる試験実験（実施例３参照）は、遺伝子が防御効果をまた有するか否かを示さねばならない。
【実施例３】
【００４３】
ライシュマニア・インファンタムのヒストンをコードしているＤＮＡワクチンによって誘導されるライシュマニア・マヨールに対する防御
免疫原性実験は、ヒストンによるＤＮＡ免疫が、特異的なＴｈ１様免疫応答の誘導の引き金を引いたことを明らかにしたので、次に、Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４遺伝子を用いるｃＤＮＡ免疫原性レジメが、Ｌ．マヨールによるマウスの感染に対して防御を提供できるか否かという問題が尋ねられた。
【００４４】
３．１ Ｌ．インファンタム由来のヒストンをコードしているＤＮＡワクチンがＬ．マヨールによる感染に対して防御する
７匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群が、１．１項において調製されたような各ヒストン−ＤＮＡ構築物５０□ｇを、２週間隔で前述のように２または３回筋肉内に接種された。対照は、同じ方法において、ヒストン遺伝子のｃＤＮＡクローニングについて使用されたエンプティーベクターの２００□ｇまたはＰＢＳのみを接種された。最終ＤＮＡ免疫化の後４週目に、マウスは、２．１項において調製されたようなＬ．マヨールの培養５ｘ１０４定常期プロマスティゴート形態により左足肉趾にチャレンジされた。足肉趾の腫脹が週毎に測定された。
【００４５】
図１Ａに示された結果は、ヒストン遺伝子によるＤＮＡ予防接種が感染に対して防御を誘導したが、ベクターのみでは誘導しなかったことを示している。予防接種されたマウスにおける足肉趾の腫脹では明らかな遅延が観察された。すべての場合、免疫マウスは、対照（感染後８週目において約５ｍｍ）よりも比較的制御された炎症（同じ週において約１ｍｍ）を示した。感染経過中に７マウス中４匹では、いかなる病巣も観察されなかった。この実験は類似の結果をもって再現された。
【００４６】
３．２ ヒストンをコードしているＤＮＡワクチンによる予防接種後の脾臓およびリンパ節の寄生虫負荷
低下された足肉趾の腫脹が脾臓および膝窩筋リンパ節における寄生虫負荷と相関するか否かを決定するために、マウスは、予防接種されたマウス群の感染後１０週目および対照の感染後８週目に安楽死された。予防接種マウスは対照において決定された負荷よりも有意に低い寄生虫負荷を示した（図１Ｂ）。注目すべきは、寄生虫のビセラリゼーション（内蔵への負荷（ｖｉｓｃｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ））は対照（ｐｃＤＮＡ３）において同質に観察されたが、予防接種マウスでは、寄生虫負荷は低く、そして若干の場合には、寄生虫は検出されなかった。これらのデータすべては、予防接種マウスはＬ．マヨールによって誘導される皮膚ライシュマニア症を制御していることを示唆する。
【実施例４】
【００４７】
個々の形態におけるヒストンによる免疫化
これまでの実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるライシュマニア・インファンタムのヒストン（Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４）に関する遺伝子を含有する真核生物発現プラスミドｐｃＤＮＡ３のＤＮＡ混合物の注射が、Ｌ．マヨール感染の制御をもたらす特異的なＴｈ１免疫応答を誘導することを示した。本実施例では、別々に投与されたヌクレオソームＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３およびＨ４をコードしているこれらのｐｃＤＮＡ３の各々１種による遺伝的免疫化の効果が研究された。実験条件は前記のとおりであった。
【００４８】
その結果は、すべての場合に、各ヒストンｐｃＤＮＡ３の投与が、エンプティーｐｃＤ
ＮＡ３により免疫化された対照マウスと較べて、可溶性ライシュマニア抗原ＳＬＡに対する低い体液性応答およびヒストンに対する限定的な体液性応答（主として抗体ＩｇＧ２ａによって占められる）に付随して、Ｌ．マヨール感染後９週に両ＩＬ−４およびＩＬ−１０ Ｔｈ２サイトカインの減少を誘導することを示している。さらに加えて、対照マウスにおける脾細胞の増殖分析からの結果は、分裂促進因子ＣｏｎＡ、ＬＰＳに対して、そしてＳＬＡに対して減少した細胞性免疫応答の存在を示す。感染経過中に予防接種されたマウスは、対照マウスに較べて足肉趾の腫脹の遅延と、そして膝窩筋リンパ節における低い寄生虫負荷を表した。結論として、ライシュマニアのヌクレオソームヒストンをコードしている各ヒストンｐｃＤＮＡ３の投与は、Ｌ．マヨール感染によって誘導されるＴｈ２−作動性応答を低下させ、これが脾臓における低いＩＬ−４とＩＬ−１０の産生、ならびにマウスの皮膚ライシュマニア症に対する防御と相関される低い体液性応答をもたらす。また、この結果は、ライシュマニアのヒストンの中で、Ｈ４を用いるＤＮＡ免疫が、皮膚ライシュマニア症に対する防御免疫を誘導することにもっとも有効であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】（Ａ）ヒストン遺伝子プールの３用量により予防接種されたマウスにおける防御。ライシュマニアのヒストン・遺伝子および対照（ｐｃＤＮＡ３またはＰＢＳ）を接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスが、左後ろ足肉趾（ｆｏｏｔｐａｄ）に注射された５ｘ１０４のＬ．マヨールのプロマスティゴートによりチャレンジされた。肉趾の腫脹は、反対側の未感染肉趾に対する感染肉趾の厚さの間の差異として表される。週毎の足肉趾の測定値は平均足肉趾スコア±ＳＤを表す。ＤＮＡ免疫されたマウスにおけるＬ．マヨールのチャレンジは、実質的に同じ結果をもつ２つの異なる実験を表す。＊４週目では、対照とワクチン接種されたマウスの足肉趾の腫脹間の差異は有意であった（ｐ＜０．００１）。（Ｂ）対照（ｐｃＤＮＡ３）における感染後８週目およびワクチン接種（ｐｃＤＮＡ３−ヒストン）における１０週目の脾臓およびリンパ節における寄生虫負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）。細胞懸濁液は、感染脚の膝窩筋リンパ節および脾臓から作成された。生存寄生虫数は、限界希釈によって決定された。結果は、組織当たりの寄生虫総数の平均値±ＳＤとして表された（ｌｏｇ１０として表される）。対照とワクチン接種されたマウスとの間の＊差異は、両脾臓および膝窩筋リンパ節において有意であった（ｐ＜０．００１）。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の少なくとも一種の使用。
【請求項２】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の２種以上が使用される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
４種のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４のすべてが使用される、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ヒストンＨ４が、寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のために、使用されるヒストンであるか、または使用されるヒストンの混合物中に包含されているヒストンである、請求項１〜３記載の使用。
【請求項５】
各ヒストンが当モル量で存在する、請求項２〜４記載の使用。
【請求項６】
薬物がワクチンである、請求項１〜５記載の使用。
【請求項７】
ワクチンが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上を含有するタンパク質に基づくワクチンである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ワクチンが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の少なくとも１種をコードしている１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡワクチンである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上の遺伝子が１種以上のベクターに挿入される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ワクチンが２種以上のヒストンをコードしているキメラ遺伝子を含有する、請求項６〜９記載の使用。
【請求項１１】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上をコードしている１種以上のヌクレオチドを含んでなるベクターの使用。
【請求項１２】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上に対して向けられた抗体の使用。
【請求項１３】
ヒストンがライシュマニア・インファンタムから得られる、請求項１〜１２記載の使用。
【請求項１４】
寄生虫疾患がライシュマニア症またはマラリアである、請求項１〜１３記載の使用。
【請求項１５】
寄生虫疾患が、ヒストンが由来する種とは異なる種によって惹起される、請求項１〜１４記載の使用。
【請求項１６】
寄生虫疾患が、Ｌ．マヨール、Ｌ．インファンタムによるか、またはプラスモジウムの種によって惹起される、請求項１〜１５記載の使用。
【請求項１７】
製薬学的に許容しうるアジュバントおよび／または担体に加えて、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、またはこれらのヒストンをコードしている遺伝子、の１種以上を
含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１８】
製薬学的に許容しうるアジュバントおよび／または担体に加えて、ヒストンＨ４またはこのヒストンをコードしている遺伝子を含有する、請求項１７記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の少なくとも１種、および場合によっては、これらのヒストンに対する抗体を含んでなる、診断作用物またはキット。
【請求項１】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の少なくとも一種の使用。
【請求項２】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の２種以上が使用される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
４種のヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４のすべてが使用される、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ヒストンＨ４が、寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のために、使用されるヒストンであるか、または使用されるヒストンの混合物中に包含されているヒストンである、請求項１〜３記載の使用。
【請求項５】
各ヒストンが当モル量で存在する、請求項２〜４記載の使用。
【請求項６】
薬物がワクチンである、請求項１〜５記載の使用。
【請求項７】
ワクチンが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上を含有するタンパク質に基づくワクチンである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
ワクチンが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の少なくとも１種をコードしている１種以上の遺伝子を含有するＤＮＡワクチンである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の１種以上の遺伝子が１種以上のベクターに挿入される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ワクチンが２種以上のヒストンをコードしているキメラ遺伝子を含有する、請求項６〜９記載の使用。
【請求項１１】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上をコードしている１種以上のヌクレオチドを含んでなるベクターの使用。
【請求項１２】
寄生虫疾患の処置、診断または予防用の薬物の製造のための、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４の１種以上に対して向けられた抗体の使用。
【請求項１３】
ヒストンがライシュマニア・インファンタムから得られる、請求項１〜１２記載の使用。
【請求項１４】
寄生虫疾患がライシュマニア症またはマラリアである、請求項１〜１３記載の使用。
【請求項１５】
寄生虫疾患が、ヒストンが由来する種とは異なる種によって惹起される、請求項１〜１４記載の使用。
【請求項１６】
寄生虫疾患が、Ｌ．マヨール、Ｌ．インファンタムによるか、またはプラスモジウムの種によって惹起される、請求項１〜１５記載の使用。
【請求項１７】
製薬学的に許容しうるアジュバントおよび／または担体に加えて、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、またはこれらのヒストンをコードしている遺伝子、の１種以上を
含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１８】
製薬学的に許容しうるアジュバントおよび／または担体に加えて、ヒストンＨ４またはこのヒストンをコードしている遺伝子を含有する、請求項１７記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の少なくとも１種、および場合によっては、これらのヒストンに対する抗体を含んでなる、診断作用物またはキット。
【公表番号】特表２００７−５１４６５３（Ｐ２００７−５１４６５３Ａ）
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８９９９（Ｐ２００６−５３８９９９）
【出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４０７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４３０１
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５０６１５３９７４）シー・ビー・エフ・レテイ・エス・エル・ウニペルソナル (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００４０７８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４３０１
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５０６１５３９７４）シー・ビー・エフ・レテイ・エス・エル・ウニペルソナル (2)
【Ｆターム（参考）】
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