寛容誘導抗原提示細胞による抗原提示の誘導によって自己免疫疾患を治療する方法
抗原提示細胞に対する抗体を使用して抗原提示細胞とＴ細胞を含む免疫細胞との相互作用を阻害することができる。該抗体にペプチドを結合させ、それによってこのようなペプチドに対する免疫応答を生じさせることができる。好ましくは、該抗体に結合するペプチドは、自己免疫に関わるものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
自己免疫疾患を治療し又は予防するために自己抗原に対する自然免疫寛容を発達させ且つ回復させることである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞仲介疾患のインスリン依存性糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）は、大きな健康上の問題であり、１．５百万人以上の米国人がこれに冒されている。この自己免疫疾患は、膵臓内にあるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞のＴ細胞仲介破壊によって生じる。インスリンによる治療にもかかわらず、Ｔ１ＤＭが原因の死亡率は過去２０年で増加してきている一方で、癌、心疾患及び脳卒中が原因の死亡率は減少してきている（Ｈｕｒｌｂｅｒｔ外，２００１）。さらに、腎症、末梢神経障害及び網膜症を含め外因性インスリンによる治療の合併症は非常に衰弱性である。
【０００３】
Ｔ１ＤＭはＴｈ１仲介疾患であるとみなされており、また、例えば、ＩＬ−４の全身投与によって免疫応答をＴｈ２型に移行させる初期介入は、病気の発症を予防することができる（Ｃａｍｅｒｏｎ外，１９９７）。エフェクターＴ細胞とＴｈ１とＴｈ２とのバランスは免疫寛容を維持する際に重要であり、そしてバランスの変化が自己免疫を生じさせ得る。しかしながら、自己免疫疾患からの防御は、Ｔｈ２細胞の固有の特性ではない。というのは、ＮＯＤマウスからのＴｈ２細胞株が疾患を転移させることも示されたからである（Ｐａｋｋａｌａ外，１９９７）。
【０００４】
免疫系は、自己寛容を維持するために複雑な方法で進化してきた。胸腺は、Ｔ細胞の重要な初期選択を与える。この選択は、胸腺中に存在する自己抗原に対して寛容なＴ細胞を末梢に伝える。しかしながら、多くの組織特異的蛋白質は、寛容を誘導するのに十分なレベルでは発現しない。例えば、おそらく低い親和性ではあるが、健康な被験者においてランゲルハンス島反応性Ｔ細胞が見出された（Ｌｏｈｍａｎ外，１９９６）。末梢性寛容のうちいくつかの機構は、自己反応性Ｔ細胞を調節下で維持するために胸腺において中心的な寛容機構を補完する。末梢性寛容の重要なメディエーターの一つが抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞（「ＤＣ」）及びマクロファージのようなＡＰＣは、他の細胞から自己抗原を捕獲し、そしてこれらのものを自己反応性Ｔ細胞に提示して調節Ｔ細胞の欠失、無感作及び／又は発生によってＴ細胞寛容を誘導する（Ｈｅａｔｈ ＆ Ｃａｒｂｏｎｅ，２００１）。現在の仮説は、定常状態の免疫系におけるＡＰＣのような未成熟ＡＰＣが、おそらくは共刺激分子の欠損のために、Ｔ細胞を活性化するのではなくむしろ寛容化させるというものである。Ｈａｗｉｇｅｒ外は、ＤＣ制限エンドサイト受容体であるＤＥＣ−２０５に対する抗体を使用してＤＣの主要組織適合クラスII（「ＭＨＣ II」）経路に抗原を向けた（Ｈａｗｉｇｅｒ外，２００１）。これらのＤＣによる抗原提示は、ＣＤ４+Ｔ細胞の短期の急激な増殖を刺激し、その後欠失し、そして受容者は、その後のペプチド免疫化に対する応答の欠如によって示されるように、抗原に対して寛容になった。対照的に、抗原ターゲティングが抗ＣＤ４０のような強力なＤＣ成熟刺激を伴ったときには、免疫が誘導された。
【０００５】
また、樹状細胞は、エフェクターＴ細胞の機能を抑制サイトカインを介して又は接触依存機構によって感化させる調節Ｔ細胞を発生させることによって末梢寛容を誘導することもできる（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ外，２００１；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ外，２０００；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００１）。調節Ｔ細胞を誘導させるための多数の異なるプロトコールが、一般に「部分最適」Ｔ細胞刺激の手段によって開発された。Ｔ細胞の部分最適刺激は、共刺激の非存在下での抗原提示によって、又は炎症によって、又はＴ細胞受容体若しくはその共受容体であるＣＤ４及びＣＤ８の部分的な妨害によって達成できる。調節Ｔ細胞の表現型及びその作用機構は異質である。多くのサプレッサー細胞はＣＤ４+ＣＤ２５+であるが、多くの状況においてはＣＤ４+ＣＤ２５-細胞が同様に有効であることがますます明らかになっている。調節Ｔ細胞母集団において同定されたその他のマーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲ及びＣＤ１０３（Ｌａｆａｉｌｌｅ ＆ Ｌａｆａｉｌｌｅ，２００２）が挙げられ、そしてＣＤ８+調節Ｔ細胞も報告された（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２）。いくつかの調節Ｔ細胞が、免疫抑制サイトカインであるインターロイキン（「ＩＬ」）−１０を産生することが示された（Ｗａｋｋａｃｈ外，２００１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２）が、口腔寛容によって誘導された調節Ｔ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０の他に、β型トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ−β」）の産生を特徴とした（Ｗｅｉｎｅｒ，２００１）。接触依存サプレッサー細胞は、ＴＧＦ−βの存在下にＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+ヒト末梢Ｔ細胞を活性化させることによって生じた（Ｙａｍｉｇａｗａ外，２００１）。調節Ｔ細胞の誘導は、Ｔ細胞受容体を介した刺激を必要とするが、それらの抑制効果は非抗原特異的であるように思われる（Ｔｈｏｒｔｏｎ ＆ Ｓｈｅｖａｃｈ，２０００）。
【０００６】
免疫調節Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて病原反応性Ｔ細胞を下方調節する際にある種の役割を果たすことが示された。前糖尿病マウスが免疫調節Ｔ細胞を宿し、しかもそれらの数又はそれらの機能的容量の減少が病気の進行に大きく寄与する事象であるという証拠がある（Ｓｅｍｐｅ外，１９９４）。同時転写実験から、前糖尿病マウスからのＣＤ４+Ｔ脾臓細胞が糖尿病誘発性細胞による免疫不全受容者への病気の転移を完全に妨げることが示された（Ｂｏｉｔａｒｄ外，１９８９；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ ＆ Ｃｏｏｋｅ，１９９０）。また、未成熟ＤＣによる調節Ｔ細胞の誘導は、ＮＯＤマウスモデルにおける病気の予防と相関があった（Ｈｕｇｅｓ外，２００２）。
【０００７】
ヒトでは、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）、熱ショック蛋白質（「ＨＳＰ」）６０又は蛋白質チロシンホスファターゼ様分子（「ＩＡ−２」）及びその他の不定β細胞抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞が説明されてきた（Ｒｏｅｐ外，１９９０；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，１９９２；Ｈｏｎｅｙｍａｎ外，１９９３；Ｒｅｉｊｏｎｅｎ外，２００２）。
【０００８】
ＧＡＤは、抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸の生合成酵素である（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ外，１９９０）。６５％の相同性を有する２種の別個のアイソホームであるＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７がクローン化された。ＧＡＤ６５はヒトでは優性のアイソホームであるが、ＧＡＤ６７はＮＯＤマウスにおける主要な形態であり、両者のアイソホームに対する抗体がヒトで検出される（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９２）。ＮＯＤマウスでは、抗ＧＡＤ抗体は、膵島炎の前又はそれと同時に且つその他のβ細胞抗原に対する抗体が現れる前に検出された。このタイミングは、ＧＡＤがこのモデルにおいてβ細胞の自己免疫を開始させる一次抗原であることを示唆する（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。糖尿病におけるＧＡＤの重要な役割についてのさらなる証拠は、糖尿病マウスの脾臓又は膵臓から単離されたＧＡＤ特異的Ｔ細胞が病気を実験未使用動物に転移させ得るという多くの研究室による観察に由来する（Ｒｏｈａｎｅ外，１９９５；Ｗｅｎ外，１９９８；Ｚｅｋｚｅｒ外，１９９８）。Ｔ１ＤＭの病因におけるＧＡＤの中心的な役割に関する議論の余地は残るものの、動物実験からの証拠は、この蛋白質の重要な役割を少なくとも示唆している。
【０００９】
若年期に精製ＧＡＤ６５によって胸腺内又は静脈内のいずれかで免疫化すると、ＮＯＤマウスにおいて膵臓β細胞に対するＴ細胞を寛容化させることができ、それによって膵島炎及び糖尿病を予防することができる（Ｔｉａｎ外，１９９６；Ｍａ外，１９９７）。また、ＧＡＤに対する寛容化は、ＨＳＰ６５のようなその他の抗原に対する免疫反応の発生を防止することもできた。ＧＡＤペプチドが寛容を誘導できることにさらなる研究が向けられた（Ｔｉｓｃｈ外，２００１；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）。また、糖尿病の発症からの防御は、静脈内、皮下、経口又は経鼻経路を介したインスリン又はＨＳＰ６５治療のいずれかによっても達成できる（Ｅｌｉａｓ外，１９９１；Ｅｌｉａｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｅｌｉａｓ外，１９９７；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，１９９０）。抗原特異的治療は、初期に施すときには発病を防止するのに非常に有効であるが、ほんの２、３の試みが進行しつつある病気の制御に成功しただけである（Ｅｌｉａｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｔｉａｎ外，１９９６）。
【００１０】
一般的なペプチド免疫化は、抗原提示細胞が該ペプチドを免疫を誘導する段階で提示するかどうかを制御できず又は免疫応答を寛容に移行させ得る抗原提示細胞では制御できないため、免疫刺激又は免疫抑制のいずれかを生じさせ得る。
【００１１】
免疫系を損なうと糖尿病の発症を予防することができる。ＦＫ５０６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＴＬＡ−４などのようなＴ細胞機能を抑制するありとあらゆる一般的な薬剤がＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を予防し又は遅らせることが示された（概説：Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｌｅｉｔｅｒ，１９９９）。しかしながら、これらの試薬のいずれも糖尿病誘発性Ｔ細胞に対して特異的ではなく、また、これらの大部分は病気の発症を予防することができるが、いったん病気が発症すると効果的ではない。臨床実験で試験されたシクロスポリンのような一般的な免疫抑制剤は、短期間では有効であった（Ｆｅｕｔｒｅｎ外，１９８８；Ｓｋｙｌｅｒ ＆ Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９９２）。しかしながら、免疫抑制の中断は即座の再発に至り、そして腎臓障害のような副作用が長期治療を妨げる（Ｐａｒｖｉｎｇ外，１９９９）。
【００１２】
糖尿病における抗原特異的治療の有効性を評価するための臨床試験が開始された。ＨＳＰ６０ｐ２７７ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）は、初期の糖尿病で試験された（Ｒａｚ外，２００１）。このペプチドによる多数の免疫化がこの病気の進行を緩やかにし、そしてこの結果を確認し且つ拡大するための大規模な研究が開始された。ヒトインスリンのβ鎖を不完全フロイントアジュバント、インスリンＢ９−２３の改変ペプチドリガンド及びＧＡＤと組み合わせて使用した臨床試験が進行中である。しかしながら、近年診断された糖尿病を経口インスリンで治療する試験は失敗し（Ｐｏｚｚｉｌｉ外，２０００；Ｃｈａｉｌｌｏｕｓ外，２０００）、そして非経口インスリン投与は非常に危険な状態にある前糖尿病を予防することに失敗した（糖尿病予防試験１型（ＤＰＴ）研究グループ，２００２）。失敗は、抗原の選択、抗原の投与量（Ｋｕｒｔｓ外，１９９９）、投与のタイミング及び経路を含むいくつかの要因による可能性があった。また、抗原療法は、いかなるタイプの免疫細胞が抗原を取り込むのかを制御することができない。マウスは制御された病原体フリーの条件下にあるが、臨床試験ではそういうわけにはいかない。細菌又はウイルスの同時感染が存在するときには、寛容よりもむしろプライミングが生じ得る。動物では、糖尿病は、ある種の条件下での抗原免疫化によって誘導され得た（Ｂｌａｎａ外，１９９６；Ｂｅｌｌｍａｎｎ外，１９９８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
免疫系がいかにして自己抗原に対する寛容を維持するのかという理解が過去数十年の間に実質的に深まってきたため、Ｔ１ＤＭを予防し又は治療するための近年の治療戦略は、β細胞抗原に対する免疫寛容を回復させることに向けられている。近年の免疫療法の戦略は、自己反応性Ｔ細胞を直接不活性化させること及び／又は調節能力を有するＴ細胞を誘導することのいずれかによってβ細胞抗原に対する寛容を誘導することに向けられている。調節Ｔ細胞の誘導は、多数の自己免疫疾患の治療のために期待できる手法であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
要約
本発明は、免疫寛容を誘導することによって自己免疫疾患を治療する方法に関する。免疫寛容は、自己抗原を抗原提示細胞に提示することによって誘導される。自己抗原は、抗原内在化受容体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、抗原提示細胞によって内在化され且つ該細胞上に提示されるが、これは自己反応性Ｔ細胞の抑制を生じさせる。
【００１５】
特に有用な具体例では、ここに記載される方法及び化合物は、特に、β細胞抗原、ＧＡＤ又はそれらのエピトープ、インスリン又はそのエピトープ、ＨＳＰ又はそのエピトープであることができる自己抗原に対する免疫寛容を誘導することによって糖尿病を治療するために使用される。この自己抗原は、抗原内在化受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、標的肝臓シヌソイド内皮細胞又は表面上にＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現するその他の寛容化ＡＰＣに内在化される。自己抗原は、この標的肝臓シヌソイド内皮細胞上に提示され、そして自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制する。
【００１６】
別の態様では、ペプチドに結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する抗体／ペプチド構築物を説明する。好ましくは、このペプチドは、抗原、さらに好ましくは自己抗原である。特に有用な具体例では、抗体／自己抗原構築物又はその部分は、抗原提示細胞によって内在化され、そしてこの自己抗原に対する免疫寛容が達成される。場合によっては、毒素が本発明の抗体と混合され、そして患者に投与される。この毒素が、例えば腫瘍細胞に対するものである場合には、本発明の抗体は、該毒素を該腫瘍細胞に向けさせ、それによって該毒素の投与を該腫瘍細胞に集中させるために使用される。
【００１７】
別の態様では、自己抗原に結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する改変抗体を組換えによって作製するための方法を説明する。
【００１８】
また、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＴ細胞のようなＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に関するものでもある。
【００１９】
別の態様では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌソイド細胞のような肝細胞に入るのを阻害し、そしてそれらがその他の細胞に感染するのを阻害する。いくつかの具体例では、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体をワクチンに使用することを包含する。
【００２０】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はヒト化抗体であることができる。その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はｓｃＦｖであることができる。
【００２１】
本発明のさらなる具体例は、上記のような組成物を使用した及び／又は方法を具体化した予防技術並びに診断技術に関するものである。また、薬剤として許容できるキャリア中に本願発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を含む組成物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
詳細な説明
本方法は、自己免疫疾患に関わる自己抗原又は自己ペプチドに対する免疫寛容を誘導する。
【００２３】
免疫寛容は、本発明に従って、抗体／自己抗原構築物（本明細書においては、時として「改変抗体」ともいう。）を被検体に投与することによって誘導される。この抗体／自己抗原構築物は、ある種の抗体に結合した自己抗原を包含する。
【００２４】
この抗体の成分は、任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する抗体であることができる。当業者であれば認識するであろうが、抗原提示細胞のタイプとしては、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、クッパー細胞及びＢ細胞が挙げられる。現在知られている受容体又は抗原提示細胞の中では、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール（Ｔｏｌｌ）受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体が挙げられる。特に有用な具体例では、この受容体は、ＳＴＴ抗体を内在化させるであろうものである。内在化が特定の受容体で生じるかどうかは、当業者に知られた技術を使用して実験によって決定できる。現在抗体の内在化を与えることが知られている受容体又は抗原提示細胞としては、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲが挙げられる。
【００２５】
抗体成分は、自然抗体（慣用技術を使用して単離される）又は当業者の認識範囲内にある組換え方法により合成によって調製される抗体であることができる。この抗体は、例えば、完全にヒトの抗体、ヒト以外の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は任意の方法（部位特異的修飾若しくは脱免疫化）で操作された前述のタイプの抗体のうち任意のものであることができる。抗体は、有利には、例えばファージディスプレイ及びパニング法のような当業者に知られた技術を使用して抗体ライブラリーから選択できる。
【００２６】
いったん選択されると、該抗体をコードする核酸は、例えば、それぞれ２００２年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／２５１０８５号及び２００１年１２月１０日に出願された米国特許出願第１０／０１４０１２号（これらの開示は引用によってここに加えるものとする）に記載された慣用のＰＣＲ及び増幅技術のような当業者に知られた技術を使用して増幅できる。
【００２７】
この開示に従って、自己抗原を抗体に結合させて抗体／自己抗原構築物を調製する。任意の自己抗原が使用できる。自己抗原は、天然に生じるものであることができ、そして当業者に知られた技術を使用して単離できる。別法では、この自己抗原のアミノ酸配列が知られている場合には、このものは既知の技術を使用して合成によって調製できる。好適な自己抗原としては、インスリン、ＧＡＤ、Ｈｓｐ、核抗原、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性蛋白質、ミエリン希突起膠細胞糖蛋白質、プロテオリピド蛋白質、ミエリン結合糖蛋白質、糸球体基底膜蛋白質及びチロトロピン受容体が挙げられる。特に有用な具体例では、自己抗原は、抗原提示細胞による提示に基づき免疫寛容を誘導するものである。
【００２８】
自己抗原は、任意の好適な方法によって抗体に結合できる。一つの特定の方法を後の実施例に示しているが、この開示は、抗体／自己抗原構築物を作製する任意の特定の方法に限定されるものではない。
【００２９】
自己抗原に対する免疫寛容を誘導する本方法は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を標的にし、且つ、自己抗原を抗体によってそれらの細胞に向ける。図１は、本発明に従う抗体／自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を概略的に示している。抗体は、標的細胞上の受容体を認識する。この抗体による自己抗原の送達に向けるために、これら２つのものを結合させる。本明細書はベクターのクローニングを使用することを記載しているが、この結合は、任意の方法によって達成され得る。抗体は、ユニークな抗体内在化受容体のみを標的にし、そしてこれに結合し、それによって所望の細胞型への抗原の送達を確実なものにする。
【００３０】
抗体が標的抗原内在化受容体に結合した後に、結合した自己抗原と抗体は、抗原提示細胞内に内在化される。自己抗原は、おそらくは該細胞内の主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）との自己抗原相互作用を介してＡＰＣの表面上に提示される。いったん自己抗原が共刺激能力を有するＡＰＣの表面上で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化されるようになり、そしてそれらの特異的な自己抗原を標的にし且つそれと反応し得る。ＡＰＣの表面に共刺激分子が存在しないことは、おそらくＴ細胞応答を制限させることに関わる。自己反応性エフェクターＴ細胞は、制限された数の抗原提示組織細胞のみを死滅させ得る。数種の標的細胞を死滅させた後に、このエフェクター細胞は死滅する。そのときに、自己抗原提示細胞が寛容化される。
【００３１】
本願発明の抗体／自己抗原構築物は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入若しくは病変内経路、局所又は以下に示すような徐放系による注射又は注入によって投与できる。この抗体／自己抗原構築物は、好ましくは、注入又は静脈内ボーラスによって連続的に投与される。局所的又は全身的な態様で該抗体／自己抗原構築物を投与できる。
【００３２】
抗体／自己抗原構築物は、薬剤として許容できるキャリアとの混合物で調製できる。本願発明の化合物の処方及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｎｅｃｅｓ」，Ｍａｃｋ出版社，ペンシルバニア州イーストン，最新版に見出され得る。この医薬組成物は、静脈内に又は鼻若しくは肺を介して、好ましくは液体又は粉末エーロゾル（凍結乾燥された）として投与され得る。また、この組成物は、非経口で又は皮下にも望み通りに投与され得る。全身に投与されるときに、この医薬組成物は、滅菌されており、発熱性物質を有しておらず、しかもｐＨ、等張性及び安定性について十分に考慮された非経口投与に許容できる溶液中にあるべきである。これらの条件は当業者に周知である。
【００３３】
簡単に説明すると、本発明の抗体／自己抗原構築物の投与処方物は、貯蔵又は投与のために、所望の純度を有する化合物と生理的に許容できるキャリア、賦形剤又は安定剤とを混合させることによって調製される。このような材料は、使用される投与量及び濃度ではこれらの賦形剤に対して非毒性であり、しかもＴＲＩＳ・ＨＣｌ、燐酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及びその他の有機酸塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような酸化防止剤、ポリアルギニンのような低分子量（約１０残基以下）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのような蛋白質、ポリビニルピロリジノンのような親水性重合体、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンのようなアミノ酸、単糖、二糖及びその他の炭水化物（セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、マンニット又はソルビットのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ若しくはポリエチレングリコールのような非イオン界面活性剤を含むことができる。
【００３４】
生体内投与のために使用されるときに、抗体／自己抗原構築物処方物は滅菌された状態でなければならず、そして慣用の製薬手法に従って処方され得る。これは、凍結乾燥及び復元の前又は後に、滅菌濾過膜によって濾過することにより容易に達成される。この抗体は、通常、凍結乾燥形態又は溶液の状態で保存されるであろう。その他の賦形剤、例えば、胡麻油、落花生油若しくは綿実油のような天然の植物油又はオレイン酸エチルなどのような合成脂肪賦形剤が望ましいかもしれない。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などが、認められた製薬手法によって取り込まれ得る。
【００３５】
使用するのに好適な医薬組成物としては、１種以上の抗体／自己抗原構築物がそれらの意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より具体的には、治療上有効な量とは、病気を予防し、その症状を緩和し若しくは改善させる又は治療される被検体を延命させるのに有効な抗体の量を意味する。治療上有効な量の決定は、特にここに与えた詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内にある。治療上有効な投与量は、試験管内及び生体内方法を使用することによって決定できる。
【００３６】
治療に使用されるべき抗体／自己抗原構築物の有効量は、例えば、治療対象、投与経路及び患者の状態に依存するであろう。さらに、主治医は、病気の深刻さとタイプ、体重、性別、食事、投与の時間と経路、他の薬物療法及びその他の関連する臨床要因を含め、薬剤の作用を改変させることが知られている様々な要因を考慮する。従って、治療専門家は、最適な治療効果を得るために要求されるように、投与量を滴定し及び投与の経路を改変することが必要であろう。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで抗体／自己抗原を投与するであろう。この治療の進行は、慣用のアッセイ法によって容易に監視される。
【００３７】
任意の抗体／自己抗原構築物について、その治療上有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定できる。例えば、投与量を動物モデルに処方して細胞培養液中で決定されるようなＥＣ50を含む循環濃度範囲（例えば、細胞増殖又は細胞分化を促進させ又は阻害する試験分子の濃度）を達成することができる。このような情報を使用してヒトに有用な投与量をさらに正確に決定することができる。
【００３８】
ここで記載した抗体／自己抗原構築物の毒性及び治療上の効果は、例えば、ＬＤ50（母集団の５０％致死量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療上有効な量）を決定するための、細胞培養基又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定できる。毒性と治療効果との間の投与量比は治療指数であり、そしてこれはＬＤ50とＥＤ50との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイ法及び動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための所定の範囲の投与量を処方する際に使用できる。このような分子の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く有しないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。この投与量は、使用される剤形及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師によって患者の状態を考慮して選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ外，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第１章，１頁，１９７５を参照）。
【００３９】
投与量及び投与間隔を個々に調節して細胞増殖若しくは細胞分化を促進させ若しくは阻害するのに十分な抗体／自己抗原構築物の血漿レベル又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えることができる。このＭＥＣは、それぞれの抗体／自己抗原構築物に対して変化するであろうが、説明したアッセイ法を使用した試験管内データから推定できる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性及び投与経路に依存するであろう。しかしながら、ＨＰＬＣアッセイ法又はバイオアッセイ法を使用して血漿濃度を決定することができる。
【００４０】
また、投与間隔もＭＥＣ値を使用して決定することができる。抗体／自己抗原構築物分子は、その時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、もっとも好ましくは５０〜９０％にわたってＭＥＣ以上の血漿レベルを維持する方式を使用して投与されるべきである。
【００４１】
局所投与又は選択的摂取の場合には、抗体／自己抗原構築物の有効な局所濃度は、血漿濃度とは関連がない。
【００４２】
典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲又はそれ以上であることができる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで抗体／自己抗原構築物を投与するであろう。この治療の進行は、慣用のアッセイ法によって容易に監視される。
【００４３】
病気のタイプ及び深刻さに応じて、抗体／自己抗原構築物の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇが、例えば１回以上の別個の投与によるか又は連続注入によるかに関わらず、患者への投与の候補となる初期投与量であり得る。数日又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、治療は、病状の所望の抑制が生じ又は患者の状態の所望の改善が達成されるまで繰り返される。しかしながら、その他の用法・用量も有用であり得る。
【００４４】
特に有用な具体例では、本願発明の方法は、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞に対する免疫慣用を誘導することによって糖尿病を治療するために使用できる。これらの細胞の自己抗原は、所望の抗原内在化受容体を認識する抗体に結合する。本発明において使用するのに好適な自己抗原は、β細胞抗原、インスリンのエピトープ又はエピトープに相当するペプチド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）及び熱ショック蛋白質（「ＨＳＰ」）である。インスリン、ＧＡＤ及びＨＳＰからのエピトープを覆う一組のペプチドを抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合させることによって、Ｔ１ＤＭに関わる全ての主要な抗原に対する慣用を誘導することができる。その他の自己抗原は、当業者であれば周知・慣用であり、発見・使用できる。
【００４５】
抗原内在化受容体は、分化したＡＰＣ上に提示される。この方法について、選択される抗原内在化受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（樹状細胞特異的細胞間付着分子３−接着性非インテグリン関連受容体：dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin related receptor）である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓常駐抗原提示細胞である肝臓シヌソイド内皮細胞（「ＬＳＥＣ」）によって発現される（Ｐｏｈｌｍａｎｎ外，２００１）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、受容体結合蛋白質を内在化させ且つ抗原提示を促進させる病原体内在化受容体ファミリーに属する（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。ＬＳＥＣによる抗原の提示が抗原特異的慣用を生じさせることが示された（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。未成熟の免疫寛容状態から活性化状態に成熟し得るその他の樹状細胞型とは対照的に、肝臓シヌソイド細胞は、活性化抗原提示細胞に発達するように誘導され得ない（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するホモログであるヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮとも呼ばれる）は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対してアミノ酸レベルで７７％の同一性を示し、そして内在化受容体に対する特有のドメインを有する（Ｂａｓｈｉｒｏｖａ外，２００１；Ｓｏｉｌｌｅｕｘ外，２０００）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、ＬＳＥＣ上で高発現し、且つ、リンパ節マクロファージ様細胞の亜母集団でも見出されるが、ＤＣによっては発現しない。
【００４６】
本発明の目的上、用語「ＤＣ−ＳＩＧＮＲ」及び「Ｌ−ＳＩＧＮ」は区別なく使用する。
【００４７】
Ｃ型レクチンマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）は、近年、ＤＣ特異的受容体として同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣのトランス内皮移行を仲介するが、これは、一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用を開始させることによって一次免疫応答を可能にする（3Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００；2Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００）。また、ＤＣ−ＳＩＧＮは、炭水化物構造を介して病原体を認識する内在化抗原受容体としても作用する。ＤＣ−Ｔ細胞のクラスター形成及びＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割のほかに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣの感染及びその後のＴ細胞へのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びデングウイルスのようなウイルス、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonae）及びミコバクテリア・ツベルクロシス（Mycobacteria tuberculosis）のような細菌、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のような酵母並びにリーシュマニア・ピファノイ（Leishmania pifanoi）及びシストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）のような寄生虫の伝達に関わる主要な受容体である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲのネズミホモログであるｍＳＩＧＮＲＩは、迅速に内在化され且つプロセシングためのリソソームを標的とする抗体を捕捉する（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。アミノ酸配列に基づけば、ネズミｍＳＩＧＮＲ１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ、実際にはヒトＤＣ−ＳＩＧＮに相同的であり、そのため動物モデリング研究に有用である。
【００４８】
いくつかの具体例では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を調節、即ち抑制し又は高める。一具体例では、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、ＬＳＥＣのような抗原提示細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲ受容体部位に結合し、そしてＬＳＥＣとＴ細胞との間の相互作用を阻害する。より具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体との付着を妨害することによってＬＳＥＣとＴ細胞との付着を減少させる。
【００４９】
ここで使用するときに、「ＩＣＡＭ受容体」とは、ＩＣＡＭ−２受容体とＩＣＡＭ−３受容体の両方、特にＩＣＡＭ−３受容体を意味する。
【００５０】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮには結合しない。
【００５１】
その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌソイド細胞のような肝臓細胞に入るのをブロックし、しかもウイルスが他の細胞に感染するのをブロックする。
【００５２】
Ｔ細胞の抗原提示細胞への付着の妨害により、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用は、抗原提示細胞−Ｔ細胞クラスター形成、Ｔ細胞活性化及び抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触に依存するその他の相互作用に影響を与えるであろう。これらのその他の相互作用としては、抗原提示細胞とＴ細胞との細胞対細胞の直接接触又はかなりの接近が挙げられる。
【００５３】
その他の具体例では、本発明の抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、自己抗原ペプチドのようなペプチドに結合する。これらのペプチドは、ベクターを抗体フラグメントにグラフトさせること及び結合したベクター／抗体をクローン化させること又は化学的に結合させることを含め、任意の好適な方法によって抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合できる。ベクターを結合させる方法、クローン化の方法又は化学的に結合させる方法は当業者に周知である。
【００５４】
次いで、これらのペプチド、好ましくは自己抗原は、結合した抗体と共に、ＬＳＥＣに内在化される。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ外，１９８６）。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導させる（Ｋｎｏｌｌ外，１９９９）ことに加えて、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ８+Ｔ細胞に寛容を誘導し得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。ＬＳＥＣは、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプロセシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌ外，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官に移動しない。
【００５５】
この内在化は、ＭＨＣ相互作用を介して仲介されるＬＳＥＣに対する表面への自己抗原ペプチドの提示を促進させる。いったん自己抗原が共刺激能力を有するＬＳＥＣの表面上で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化された状態になり得る。これらのＴ細胞は、結合した自己抗原を標的にし且つそれと反応する。エフェクターＴ細胞は、少数のＬＳＥＣを死滅させ、そして共刺激分子がなければ死滅する。ＬＳＥＣによるこの自己抗原提示は、抗原特異的寛容を生じさせる。
【００５６】
肝臓は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのような多数の免疫寛容メディエーター並びに免疫寛容の発達を助成する分化ＡＰＣを有するユニークな微環境を有する（1Ｋｎｏｌｌｅ及びＧｅｒｋｅｎ，２０００）。肝臓の免疫寛容特性は、同種肝移植物がＭＨＣ障壁にわたって受け入れられ得るという知見によって裏付けられる（Ｃａｌｎｅ，１９６９）。さらに、門脈を介した抗原の適用は、おそらく抗原の全身適用よりも寛容に至る（Ｋａｍｅｉ外，１９９０）。肝臓を介した排出は、口腔免疫寛容誘導にとって不可欠であることが報告されている（Ｙａｎｇ外，１９９４）。肝血管を通過する血液は、まずクッパー細胞及びＬＳＥＣと接触する。肝臓シヌソイドを通る血流は遅いため、肝臓シヌソイド細胞集団と通過する白血球との接触が可能となる。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ外，１９８６）。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導する（3Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）ことに加えて、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ８+Ｔ細胞に寛容を誘導し得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外（Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外，２００２）は、Ｔｈ１、ＩＦＮ−γ産生ＴＣＲ形質転換細胞をマウスに注射すると、静脈内蛋白質免疫化後に、肝臓内でこれらの細胞によるＩＦＮ−γ産生の抑制及びＴｈ２細胞の促進を生じることを立証した。未成熟な寛容段階から免疫を開始させる成熟段階に分化し得るプロフェッショナル骨髄性ＡＰＣとは対照的に、ＬＳＥＣは、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプロセッシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官に移動しない。ＬＳＥＣは、寛容の誘導に特化した唯一のＡＰＣではない可能性がある。Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外は、近年、内因的に発現する自己抗原を提示することによって寛容を誘導した脾臓ＤＣの小さなサブセットを同定した（Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外，２００１）。全体的に、ＬＳＥＣは、寛容を誘導する目的でβ細胞抗原を提示するのに有利な細胞型であると思われる。
【００５７】
好ましい態様及び具体例を含め、本方法の実施は、次の実施例から容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単なる例示であり、決して限定するように解釈すべきではない。
【実施例】
【００５８】
例１：抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の取得
ファージディスプレイ技術を使用して、ｍＳＩＧＮＲ１を認識する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のパネルを同定した。ｓｃＦｖは、リンカーによって結合した可変軽鎖及び重鎖領域を含有する。それらの短い長さはこれらの抗体フラグメントを抗原結合のために非常に好適にし、また受容体に対する結合能力は保存されている。ウサギを組換えｍＳＩＧＮＲ１で免疫化し、そして国際公開第ＷＯ０２／４６４３６Ａ２号パンフレット（２００２年６月１３日発行）に記載されるファージディスプレイ用ベクターｐＲＬ４を使用してｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構築した。この特許文献の開示は引用によってここに加えるものとする。この系における抗体フラグメントは、ファージの遺伝子IIIコート蛋白質上に提示される。ｍＳＩＧＮＲ１を認識する抗体を、組換えｍＳＩＧＮＲ１上での４ラウンドの固相パニングによって単離した。６種の異なる抗体を同定した。これら６種の抗体のアミノ酸配列を図２Ａ及びＢに与えている（それぞれ、配列番号１〜６及び７〜１２）。全ての抗体は固相ＥＬＩＳＡでｍＳＩＧＮＲ１を認識し、そしてヒトＤＣ−ＳＩＧＮのネズミホモログであるｍＤＣ−ＳＩＧＮとの交差反応は全く観察されなかった。これらの抗体をＨＡ及びＨＩＳ6でエピトープ標識した。ｍＳＩＧＮＲ１とＤＣ−ＳＩＧＮＨＩＳの両方を３Ｔ３ＥＢＮＡ細胞によって産生させ、そしてニッケルカラムで精製した。
【００５９】
例２：細胞表面受容体への結合に基づき内在化される抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の同定
ｍＳＩＧＮＲ１を発現する細胞株のスクリーニング
ウサギマクロファージ細胞株のパネル（Ｐ３８８Ｄ１、１−１３．３５、ＷＥＨＩ−３及びＪ７７４）を標準的な方法によるＲＴ−ＰＣＲによってｍＳＩＧＮＲ１の発現に対してスクリーニングする。プライマーをｍＳＩＧＮＲ１のＧｅｎｂａｎｋ配列に基づきデザインし、これらのものをマウス器官のＲＴ−ＰＣＲで使用する。ｍＲＮＡレベルでｍＳＩＧＮＲ１を発現する細胞株を同定し、そして表面発現をＦＡＣＳ分析によって確認する。５×１０5個の細胞を、１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中で１μｇの抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体と共に氷上で１５分間、抗体の内在化を可能としない条件でインキュベートする。１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄した後に、結合した抗ｍＳＩＧＮＲ１をビオチニル化抗ＨＡ（ロシュ）、次いでＰＥ結合ストレプタビジン（ベクトン・ディキンソン）によって検出し、そして細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン）を使用して分析する。別法として、内在化を、肝臓シヌソイド内皮細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現することが知られている一次細胞で決定する。また、ＬＳＥＣ上でのｍＳＩＧＮＲ１の発現も上記のようなＦＡＣＳによって確認できるが、ただし、反応当たり１×１０5個の細胞のみを添加する。
【００６０】
内在化の測定
いったんｍＳＩＧＮＲ１発現細胞株又は一次細胞型を同定したら、抗体パネルの内在化をＦＡＣＳ分析によって評価する。内在化がｍＳＩＧＮＲ１の結合に基づくことを示すために、ＪＡＷＳ１マウス樹状細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞株を含める。ビオチニル化抗ＨＡ抗体、次いでＰＥ結合ストレプタビジンを使用したそのままの浸透化細胞についての抗ｍＳＩＧＮＲ１検出を抗ＤＥＣ−２０５抗体について記載されるように比較する（Ｍａｈｎｋｅ外，２０００）。細胞株について１．５×１０6個細胞又は一次細胞について３×１０5個細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で３μｇのｍＳＩＧＮＲ１と共に２０分間にわたって４℃でインキュベートして内在化なしで抗体を表面に結合させる。結合しなかった抗体を４℃の１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄することによって除去する。それぞれの試料を３つに分ける。３分の１を４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして上記のように表面抗体を検出する。その他の３分の２を固定する前に３７℃で３０分間さらにインキュベートして内在化を可能にする。２分の１を抗ＨＡ及びストレプタビジンで直接検出し、残り２分の１を、０．１％（ｖ／ｗ）サポニン（シグマ・オールドリッチ）を含有するＰＢＳで細胞をインキュベートすることによって浸透化させる。内在化された抗体の量を、固定された細胞中の平均の蛍光度を固定され且つ浸透化された細胞で記録されたものから差し引くことによって算出する。３０分以内に最も高い内在化パーセンテージを有する抗体を、ペプチドを抗体に結合させるさらなる研究のために選択する。既存の無関係のウサギｓｃＦｖをネガティブコントロールとして使用し、近年ｍＳＩＧＮＲ１に結合することが示された市販のＥＲ−ＴＲ９抗体（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）をポジティブコントロールとして使用する。また、ＥＲ−ＴＲ９のＦａｂフラグメントもパパイン消化によって作製し、そして内在化について試験して二量体化が内在化の要件ではないことを確認する。所望ならば、このｓｃＦｖをＦａｂ'２又はＩｇＧに変換することができる。
【００６１】
別の具体例では、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーを、Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｍａｒｋｓのグループによって説明されるように、抗体を内在化させるためにパニングする（Ｐｏｕｌ外，２０００）。この具体例のために好適な方法を以下に概説する。
【００６２】
ｍＳＩＧＮＲ１ファージライブラリーからの内在化抗体の選択
ｍＳＩＧＮＲ１を発現させるために上記のように同定された５×１０6個の細胞を、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーからの１×１０12コロニー形成単位のファージであってそれらの表面上で３遺伝子蛋白質に融合した抗体フラグメントを提示するものと１．５時間にわたって４℃でインキュベートして内在化なしにファージを結合させる。ファージの結合後に、これらの細胞を燐酸緩衝生理食塩水で５回洗浄して非特異的に結合した又は弱く結合したファージを除去する。次いで、表面に結合したファージのエンドサイトーシスを可能にする一方で、細胞内でのファージの分解を回避するように、細胞を１５分間にわたって３７℃でインキュベートする。細胞の表面に結合したファージを除去するために、細胞を低ｐＨグリシン緩衝液で３回洗浄することによってストリップする。次いで、細胞をトリプシン処理し、そしてＰＢＳで洗浄してから高ｐＨトリエチルアミンで溶解させる。ファージを含有する細胞溶解物を使用してＥ．ｃｏｌｉに感染させて次の選択ラウンド用のファージを調製する。３ラウンドの選択の全てを実行する。細胞表面に結合したファージの力価（最初の低ｐＨグリシン洗浄で見出される）及び細胞内から回収されるファージの数をそれぞれのラウンドについて監視する。エンドサイトーシスを受けたファージの数の増加は、内在化するファージ抗体の選択がうまくいったことを示す。
【００６３】
内在化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントのいずれもｍＳＩＧＮＲ１に結合するのかどうかを決定するために、ラウンド３からの５００個のクローンを自動Ｑｐｉｘ（ジェネティクス）システムを使用して選択し、そしてＨｉＧｒｏｗシェーカー（ジーン・マシーン）で一晩ＳＢ培地入りの９６ウェルディッシュ中で生長させる。次の日に、ディッシュをスピンダウンし、そして上澄み液を自動Ｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｅｅｄｏｍ ２００（Ｔｅｃａｎ）システムを使用する固相ｍＳＩＧＮＲ１ ＥＬＩＳＡで試験する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１μｇのｍＳＩＧＮＲ／ｍＬ ＰＢＳで一晩４℃でコートする。翌日に、プレートを１％ＢＳＡでブロックし、次いで０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄する。コントロールのプレートを１％のＢＳＡでコートする。抗体を含有する上澄み液をｍＳＩＧＮＲ１又はＢＳＡ単独のウェルに１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中０．０５〜５μｇ／ｍＬの濃度で添加する。シェーカー上で室温で２時間振盪後に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄する。結合したｓｃＦｖの検出のために、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５マウスの腹水，ストラテジック・バイオソルーションズ，デラウェア）を１％のＢＳＡを有するＰＢＳでの１：１０００希釈で添加する。シェーカー上で室温で２時間振盪後に、プレートを再度洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（シグマ）を２時間にわたって添加する。３回以上洗浄した後に、結合した抗体をＳｉｇｍａ １０４（登録商標）基質を使用して検出する。これらのプレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で様々な時点で読む。
【００６４】
ＥＬＩＳＡにおいて正のシグナルを与えるクローンを制限酵素消化パターンによって特徴付ける。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ社製ミニプレップキットを使用して単離する。２μｇのＤＮＡを５ＵのＥｃｏＲIIで２時間にわたって３７℃で消化し、次いでこれらの試料を４％のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルに流す。パターンを比較し、そして配列を少量（約１００〜３００μｇ）で精製する。ｓｃＦｖを細菌の細胞周辺腔に適切にアセンブルし、そして分泌させる。ｓｃＦｖは、上澄み液又は細胞周辺腔のいずれかから単離できる。クローンを４リットルのＳＢ中で０．８のＯＤ600にまで生長させ、そして１ｍＭのイソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３〜４時間にわたって３０℃で誘導させて最適な量のｓｃＦｖを産生させる。細胞周辺腔から単鎖抗体を単離するために、細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロシュ）プロテアーゼ阻害剤が添加された冷却ＰＢＳに再懸濁し、そしてソニックス製Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０を使用して超音波処理する。次いで、細胞の破片をペレットにし、そして上澄み液をＡｋｔａ ＦＰＬＣ（ファルマシア）を使用してＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用する。抗体をイミダゾールで溶出させる。この方法は、一般に、約１００〜３００μｇの精製抗体／リットルを生じさせる。内毒素をＳａｒｔｏｒｉｕｓＱ１５フィルターにより濾過することによって除去する。これは、一般的に、ＬＡＬ試験（バイオ・ホイッタカーから購入できるアッセイ法）によって決定されるときに１０Ｕ／ｍＬ以下の内毒素を含有する抗体調製物を生じさせる。抗体を上記のように内在化について並びに固相ＥＬＩＳＡで組換えｍＳＩＧＮＲ１への結合について再度分析する。３０分以内に最も高い内在化パーセンテージ及び固相ＥＬＩＳＡにおいて良好なシグナル（１μｇ／ｍＬで１時間後に＞１０Ｄ）を有する抗体を選択してペプチド−抗体構築物を作製する。
【００６５】
例３：ＧＡＤペプチドの抗体への結合
ベクター及びクローニング戦略
最良の細菌産生ｓｃＦｖの同定後に、ほ乳類発現系への転換を行う。ほ乳類での発現は、好適なペプチドの二次修飾及び内毒素フリー産生を可能にする。図３に示されるような互換性のある制限部位を有するベクター（例えば、米国特許第６３５５２４５号に記載されるもの。この開示は、引用によってここに加えるものとする。）を使用する。ｐＲＬ４（上で説明した）内にある対象の抗体からのＤＮＡをＳｆｉで切断し、そしてＣＭＶプロモーターとほ乳類抗体リーダー配列とを含むＡｐｅｘ ３Ｐベクターに挿入する。対象のペプチドをコードするヌクレオチドを挿入するために、制限部位を抗体配列内には含まれない利用可能な部位（ＭＣＳ＝ＮａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢＳＡＢＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｒＢＩ、Ｘｈｏ、ＰｂｖＩＯＩ、ＳｐｈＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ）から選択する。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれの末端に好適な制限部位を有するＯｐｅｒｏｎによって合成し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して挿入する。得られた構築物は、ｓｃＦｖ、その後の選択された制限酵素によって決定されるスペーサー、その後のペプチド及びＨＩＳタグを含むであろう（図３）。配列を標準的な技術を使用して確認してから抗体産生用の３９３ＥＢＮＡ細胞にＤＮＡをトランスフェクトする。
【００６６】
ペプチドの選択
既知の糖尿病自己抗原であるインスリン、ｈｓｐ並びにＧＡＤ６５及び６７のペプチドのいずれもここに説明する方法で使用できることを理解すべきであるが、次の実験については、ＧＡＤを該ペプチドとして選択する。ＧＡＤ反応性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて検出される第１の自己反応性Ｔ細胞であり（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３；Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）、且つ、病気のプロセスに重要であることが示されている。さらに、ヒト及びネズミのＧＡＤは、９５％の相同性がある。脾臓ＮＯＤ Ｔ細胞によって認識されるエピトープが広く特徴付けられており（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）、多くの免疫優性ペプチドがＮＯＤマウスとＴ１ＤＭの患者において類似し、そしてこれは試験管内Ｔ細胞アッセイにおいて区別なく使用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。ＮＯＤマウスにおける初期の免疫応答は、ＧＡＤ６５のカルボキシ末端領域内の所定の領域（ペプチド５０９〜５２８、ペプチド５２４〜５４３）に対して向けられる（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。また、より後期のＴ細胞応答は、２００〜３００の間の他の領域並びに他の自己抗原にも向けられる。初期ＣＤ４ ＧＡＤ６５ Ｔ細胞エピトープのペプチド５２４〜５４３（ＳＲＬＳＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭＥＹＧＧＴ（配列番号１３）、マウス及びヒトで同一の配列）の一つ並びにより後期に生じるネズミＧＡＤ６５エピトープのペプチド２４７−２６６（ＮＭＹＡＭＬＩＡＲＹＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ（配列番号１４）、ヒトとマウスとで１アミノ酸の相違：下線）及びペプチド２９０−３０９（ＡＬＧＩＧＴＤＳＶＩＬＩＫＣＤＥＲＧＫ（配列番号１５）、マウスとヒトで同一の配列）の２つをこの実験でペプチドとして使用するために選択する。３種のエピトープの全てがＮＯＤの脾臓細胞内で自発的な増殖応答を誘導し得る。さらに、ペプチド２４７〜２６６及びペプチド２９０〜３０９によるペプチド免疫化は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発病を遅延させることが示された（Ｍａ外，１９９７；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）。ＣＤ４Ｔ細胞エピトープのほかに、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対する寛容も重要であることが報告されている（Ｑｕｉｎｎ外，２００１；Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ外，２０００）。ネガティブコントロールとして、抗体構築物を鶏卵リゾチームペプチド１１６〜１２４（ＫＧＴＤＶＱＡＷＩ）（配列番号１６）で作製する。次いで、試験管内研究において最も効果的なこれらのものからのペプチドを抗体構築物と様々な組み合わせで結合させ、そしてＮＯＤ糖尿病モデルで試験する。
【００６７】
例４：抗体−ペプチド構築物の作製及び精製
Ｔ細胞実験のために、ほぼ３００μｇのそれぞれの抗体構築物をＥＢＮＡ２９３ヒト胚性腎細胞内で産生させる。細胞を１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン及び２５０Ｕ／ｍＬのＧ４１８（シグマ）を有するＤＭＥＭ中で増殖させる。Ｔ１７５フラスコ中の細胞にＱｉａｇｅｎ製Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ試薬を使用して該メーカーの指示に従いＤＮＡをトランスフェクトする。３日後に培地を血清を有しない培地に交換する。４日目及び８日目に上澄み液を集め、細胞の破片を遠心分離によって除去し、そして透明な上澄み液をＡｋｔａ−ＦＰＬＣを使用してＮｉ−カラム上に充填する。抗体をイミダゾールで溶出させ、ＰＢＳに透析し、そして正確な寸法を１μｇをＳＤＳゲルに流すことによって確認する。
【００６８】
例５：ペプチド提示を生じさせるＬＳＥＣによる抗体−ペプチド構築物の内在化及びＴ細胞に及ぼすこの提示の影響
肝臓シヌソイド細胞を試験管内でペプチド−抗体構築物でターゲティングし、そしてこれらの細胞が若いＮＯＤ又はバルブ／ｃマウス由来のＴ細胞に表現型の変化を誘導し得るかどうかを決定する。
【００６９】
ネズミシヌソイド内皮細胞の単離
肝臓シヌソイド内皮細胞を生後３週間のＮＯＤ又は生後４〜６週間のバルブ／ｃマウスから単離する。Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌによって記載されるように（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ及びＢｏｅｌｓｔｅｒｌｉ，１９９５）、まずカルシウムをキレート化し且つ細胞−細胞接触を緩和するためのＥＧＴＡで門脈灌流し、その後細胞間マトリックスを分解させるための０．０５％コラゲナーゼＡハンクス緩衝液で灌流することによって細胞を得る。この灌流された肝臓をマウスから取り出し、そして角度付きの鉗子で穏やかに作業する。得られた粗細胞懸濁液を一連の金属シーブ（３０、５０、８０メッシュ）を通して濾過して大きな組織断片を除去する。シヌソイド細胞をメトリザミド勾配に基づく密度勾配遠心分離（１．０８９ｇ／ｃｍ3）によって実質組織細胞から分離し、その後２回の洗浄工程を実施して細胞の破片を除去する（3Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。この時点で、クッパー細胞と肝臓シヌソイド細胞との混合物が得られる。ＦＡＣＳ実験についてはこれで十分である。というのは、クッパー細胞は、クッパー細胞を認識する一方で肝臓シヌソイド細胞を認識しないＦ４／８０抗体を使用して肝臓シヌソイド内皮細胞から区別できるからである。しかしながら、Ｔ細胞及びペプチドとの同時培養実験については、クッパー細胞をＰＥ結合Ｆ４／８０（ＢＤファルミンゲン）、次いでＭｉｌｔｅｎｙｉ製抗ＰＥマイクロビーズで標識し、そしてメーカーの指示に従いＭＡＣＳカラム及びセパレーターを使用してこの標識細胞を磁気選別することによってクッパー細胞を除去する。残りの細胞集団を、１０％のウシ胎仔血清及び２％のグルタミンが添加されたダルベッコ製改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入りの９６ウェル組織培養プレート上に接種する。細胞集団の純度を、抗ｍＳＩＧＮＲ１及び抗Ｆ４／８０を使用した表面マーカーに対するＦＡＣＳ染色による単離後３日目に調査する。ｍＳＩＧＮＲ１はクッパー細胞上には存在しない（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。９０％の純度が実験を続行するのに十分であるとみなされる。実験当たり２個のマウスの肝臓を使用し、予期される収量は約２×１０7個の細胞である（Ｋｎｏｏｋ及びＳｌｅｙｓｔｅｒ，１９７６，マウスについて推定される収量）。
【００７０】
Ｔ細胞表現型アッセイ
Ｔ細胞アッセイは、ペプチド−抗体構築物が肝臓シヌソイド内皮細胞によるペプチドの提示を生じさせるかどうか及びペプチドの提示がＴ細胞の表現型の変化を誘導し得るかどうかを証明する。肝臓シヌソイド内皮細胞を平底マイクロタイタープレート内で１×１０5細胞／ウェルの密度で培養する。シヌソイド細胞を３日間にわたって保持した後に、ＣＤ４+Ｔ細胞を上記のように生後３週間及び生後８週間のＮＯＤマウス又は生後４〜６週間のバルブ／ｃマウスから精製し、そして１０4又は１０5細胞／ウェルで添加する。また、０．１〜５ｐｇ／ウェルの濃度でそれぞれの抗体−ペプチド構築物も添加する。ポジティブコントロールとして、それぞれのＧＡＤ及びコントロールのペプチド自体を含める。ペプチドをＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，カリフォルニア）で合成する。ネガティブコントロールのウェルは、Ｔ細胞単独又は肝臓シヌソイド単独を含む。
【００７１】
Ｔ細胞に対するＬＳＥＣによるペプチド提示について４つの見込まれる結果が存在する：（１）ＴＧＦ−Ｐ及び／又はＩＬ−１０とＩＬ−４の産生或いはＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられる調節Ｔ細胞の誘導、（２）Ｔ細胞の欠損又は（３）完全な欠落又は応答、（４）また、ペプチド提示は、応答を誘導する代わりに、Ｔｈ１細胞産生ＩＬ−２の刺激を生じさせることも考えられる。これらの可能性を区別するために、培地の上澄み（各１００ｐＬ）を２４時間及び４８時間目に集め、そして以下に説明するようにサイトカイン産生についてアッセイする。生後３週間のＴ細胞応答を生後８週間のＮＯＤマウスのＴ細胞並びにＧＡＤに対する自発的応答を示さないバルブ／ｃマウス由来Ｔ細胞と比較する。アッセイを３重に設定し、そして２回繰り返す。Ｔ細胞の混合物を使用するため、上澄み液におけるサイトカイン応答は、容易には確認できないかもしれない。しかしながら、細胞の混合物は、生体内での状況を反映し、そしてＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答は、全脾臓細胞を使用して確認される（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。
【００７２】
調節Ｔ細胞の誘導についてのより敏感な基準として、細胞を培養３日後にＦＡＣＳ分析によってＣＤ２５、ＣＤ４及びＣＤ６２Ｌ（Ｌａｆａｉｌｌｅ及びＬａｆａｉｌｌｅ，２００２）のような典型的な表面マーカーの発現について評価する。全ての試薬はＢＤ−ファルミンゲン社から購入できる。また、ＩＬ−４産生もＦＡＣＳによって分析する。以下に説明するようなＬＳＥＣ／ペプチド露出Ｔ細胞の潜在的な免疫抑制特性の機能試験がこの系における寛容誘導についての最終的な試験である。ＬＳＥＣによって提示されたペプチドが細胞死を誘導する可能性を、ロシュ製細胞死ＥＬＩＳＡキットを使用して該メーカーの指示に従い培地の上澄み液中で評価する。
【００７３】
脾臓細胞及びＣＤ４+Ｔ細胞の単離
ＮＯＤ又はバルブ／ｃマウスからの脾臓を滅菌環境中で取り出し、研究所において日常的に実行されるようにＰＢＳ中に置く。細胞を１８〜２１ゲージ針を使用して分離し、そしてより大きな断片を沈降させる。上澄み液を取り出し、そして２００Ｇで７分間遠心分離する。赤血球細胞を脾臓当たり５ｍＬの０．８３％ＮＨ4Ｃｌを使用して溶解させる。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで培地に再懸濁させる。ある種の実験については、全脾臓細胞を使用する。その他の実験については、ＣＤ４+Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ社製（カリフォルニア州オーバーン）ＣＤ４+Ｔ細胞単離キットを使用して該メーカーの指示に従い単離する。様々な細胞集団の磁気単離は、当業者の範囲内にある。一つの方法では、単離は、ＣＤ８ａ、ＣＤＩ１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、ＤＸ５及びＴｅｒ−１ １９に対するビオチン結合モノクローナル抗体のカクテルを使用する非ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇に基づく。単離された集団の純度をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、ＰＥ結合抗ＣＤ８、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１１ｂ及びｃｙ−５結合ＣＤ４５Ｒ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サンディエゴ）の混合物の染色によって評価する。予期される純度は７０％の収率で９０〜９５％である。少なくとも１×１０8個の細胞がマウス脾臓から得られ、そして脾臓細胞の約２５％がＣＤ４+であるから、１７５個の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルには十分な約１．７５×１０7個の細胞が得られ得る。
【００７４】
サイトカイン産生の測定
Ｔ細胞／ＬＳＥＣ同時培養の上澄み液中におけるＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｐ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２の存在を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって説明通りに決定する（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ及びＲｕｂｉｎ，１９９７）。全ての抗体のペアは、ＢＤ−ファルミンゲン社から購入できる。サイトカイン捕捉抗体をＰＢＳ中でプレート上に一晩４℃でコートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後に、培地の上澄み液とマウス組換えサイトカインの基準曲線とを加え、そしてシェーカー上で２時間室温でインキュベートする。プレートを再度洗浄し、そして結合したサイトカインをアルカリ性ホスファターゼ結合抗サイトカイン抗体で検出する。３回洗浄した後に、Ｓｉｇｍａ１０４（登録商標）基質を添加し、そしてこのプレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で様々な時点で読む。
【００７５】
例６：ＬＳＥＣ上に提示されたＧＡＤペプチドさらされたＴ細胞がその後にＧＡＤを提示するプロフェッショナルＡＰＣによる自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得るかどうかの評価
さらなる実験において、肝臓シヌソイド内皮細胞上のペプチドに３日間にわたってさらされたＴ細胞が脾臓プロフェッショナルＡＰＣ上に提示されるペプチドによる自己反応性Ｔ細胞の活性化を負に調節し得るかどうかを試験する。試験管内で調節特性を有するＴ細胞が誘導される可能性が多数の研究所によって示されている（Ｗａｋｋａｃｈ外，２００１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２；Ｔｈｏｒｔｏｎ及びＳｈｅｖａｃｈ，１９９８）。免疫抑制特性は、免疫刺激が正常に観察される培養系に調節Ｔ細胞を添加することによって試験できる。ＡＰＣとＴ細胞の両方を含む生後７週間のＮＯＤマウス由来の脾臓細胞へのＧＡＤペプチドの添加は、強力な増殖応答によって示されるような免疫活性化系を与える。調節Ｔ細胞の添加は、この応答を排除させる。１０5又は１０6個の脾臓細胞をＬＳＥＣ及びペプチド結合抗体にさらされたＴ細胞を含有するウェル当たり０．１、１又は１０μｍのペプチドと共に添加する。コントロールのウェルは、脾臓細胞をペプチド単独及びＬＳＥＣ+Ｔ細胞単独と共に含む。さらに、推定される調節Ｔ細胞が増殖に有意に寄与することを排除するために、コントロールのウェルは、放射線照射を受けた脾臓細胞（６００ＲＡＤ、Ｊｏｅ ＡｇｕｉｌｅｒａによるＵＣＳＤ照射サービス施設で実行される）と、予めＬＳＥＣにさらされたＴ細胞と、ペプチド−抗体構築物とをも含む。放射線照射を受けた脾臓細胞は抗原を提示できるが、増殖はしない。１μＣｉ3Ｈ−チミジンを増殖のための読み取りとして新たに合成されたＤＮＡを標識するための７２時間培養期間の最後の１６時間の間にそれぞれのウェルに添加する。細胞をパッカード社製Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して採取し、そして取り込まれた3Ｈ−ヒスチジンをＴｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード）を使用して評価する。脾臓細胞及び予めＬＳＥＣ+ペプチドにさらされたＴ細胞を含有する培地中での3Ｈチミジンの取り込みが脾臓細胞培地と比較して減少する場合には、Ｔ細胞は、調節特性によってうまく誘導されている。ペプチド結合抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体がＮＯＤマウスにおいて調節Ｔ細胞を誘導し得るかどうか、また病気が停止し得るかどうかも試験する。
【００７６】
例７
マウスの抗ヒトＬ−ＳＩＧＮ抗体を組換えファージ技術を使用して同定した。組換えヒトＬ−ＳＩＧＮで免疫化されたマウスの重鎖及び軽鎖の組み合わせから得られたマウスライブラリー（ＩｇＧ１ｋ及びＩｇＧ２ａｋ）をＷＯ０３／０２５２０２に開示された方法によって調製した（その内容は、引用によってここに加えるものとする）。いったん調製したら、これらのライブラリーをまずヒトＤＣ−ＳＩＧＮ上でパニングしてＤＣ−ＳＩＧＮと交差反応する抗体を除去した。結合していない上澄み液をＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応するクローンを選択するために使用した。これらの２つのライブラリー（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）のそれぞれについて９５個のコロニー（３６／ラウンド）の全てを誘導し、そして抗体産生及びそれらのＬ−ＳＩＧＮとの反応性を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に説明すると、抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩＳＡプレート上に５００ｎｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＬ−ＳＩＧＮを添加した。プレートをＰＢＳで洗浄した後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベートした後に、プレートを３回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体を２時間にわたって添加した。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用して評価した。
【００７７】
これらのクローンの大部分は、抗体がファージ上に良好に結合（ＯＤ405＞１．０）していることを示した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａライブラリーの両方からのいくつかのクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとの積極的な反応性を示した。結果を図４及び５に示す：図４は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１クローンとの反応性を表している。図５は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を表している。
【００７８】
例８
ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応するクローンを同定するために、バックグラウンドの５倍以上のＯＤ値を有する例７からのクローンの全てを選択してそれらのヒトＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩＳＡプレート上で５００ｎｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＤＣ−ＳＩＧＮを添加した。プレートをＰＢＳで洗浄した後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベートした後に、プレートを３回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体を２時間にわたって添加した。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用して評価した。
【００７９】
ＩｇＧ１ライブラリーからの１０個のクローン及びＩｇＧ２ａライブラリーからの３個のクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応することが分かった（ＤＣ−ＳＩＧＮに対して５〜１０倍高いＯＤ値）。結果を図６及び７に示す：図６は、Ｌ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１ポジティブクローンとの反応性を示している。図７は、Ｌ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を示している。
【００８０】
例９
ヒトＬ−ＳＩＧＮのみと反応するものとして同定された１３個のクローンと、例８において同定されたようなＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮの両方と強く反応する９個のクローンとの配列を解読してユニーククローンの数を決定した。配列は、当業者に周知の技術によって決定した。これらのクローンの配列を図８及び９に示す：重鎖クローンについての配列を図８Ａ〜８Ｃに示しており（配列番号１７〜３６）、軽鎖クローンについての配列を図９Ａ〜９Ｂに示している（配列番号３７〜５５）。
【００８１】
配列決定の結果から、軽鎖と比較してさらに多様な重鎖の群が明らかになった。また、これらの抗体クローンの多様性を異なる軽鎖と同一の重鎖とを交差対合させることによっても高めた。Ｌ−ＳＩＧＮと反応する５個のユニーククローンの全てを同定し、そしてクローンをそれらのアミノ酸配列の類似性に基づき分類した（以下の表１参照）。
【００８２】
【表１】
【００８３】
配列決定のために選択されたクローンとＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性（ＯＤ値）を以下の表２に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
図８に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＬＧＧＬ（配列番号５６）；ＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号５７）；ＧＬＦＹＧＹＡＷＦＮ（配列番号５８）のうちの一つを有することが分かった。図９に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＱＱＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号５９）；ＱＱＳＮＥＤＰＲＴ（配列番号６０）；ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号６１）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号６２）のうちの一つを有することが分かった。
【００８６】
例１０
上の例７からの追加のクローンを、例７に記載した手順を使用して、それらのものがＬ−ＳＩＧＮに結合する能力について試験した。配列は、当業者に周知の技術によって決定した。これらの追加のクローンについての配列を図１０に示す（配列番号６３〜８２）。図１０に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の５個の追加の重鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＰＳＤＮＳＹＡＷＦＡ（配列番号８３）；ＱＡＴＴＴＡＦＤ（配列番号８４）；ＴＡＴＡＬＳＴＭＤ（配列番号８５）；ＮＤＹＹＷＧＦＧ（配列番号８６）；ＴＡＴＡＬＹＴＭＤ（配列番号８７）；及びＥＦＴＴＫＡＬＤ（配列番号８８）のうちの一つを有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＭＩＤＰＳＮＳＥＡＲＬＮＱＲＦＫＤ（配列番号８９）；ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号９０）；ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９１）；ＶＩＷＲＧＧＮＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（配列番号９２）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９３）；ＮＩＤＰＹＹＧＧＳＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９４）；及びＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号９５）のうちの一つを有することが分かった。
【００８７】
表３は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ１ｋ抗体クローンを示している。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表４は、追加のＩｇＧ１ｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに組換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示している。
【００９０】
【表４】
【００９１】
図１１に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加のクローンを同定した（配列番号９６〜１１５）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＹＨＲＳＰＱＴ（配列番号１１６）；ＣＱＱＦＴＳＳＰＳ（配列番号１１７）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１１８）；ＱＱＹＳＧＹＰＧＴ（配列番号１１９）；ＨＱＹＨＲＳＰＰＭＴ（配列番号１２０）；ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１２１）；ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号１２２）；ＱＱＮＮＥＤＰＰＴ（配列番号１２３）；ＱＱＹＳＧＹＳＬＴ（配列番号１２４）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＭＬＴ（配列番号１２５）；ＱＱＹＧＧＹＰＬＴ（配列番号１２６）；ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２７）；ＱＱＹＳＧＳＰＬＴ（配列番号１２８）のうちの一つを有するＩｇＧ１ｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＳＴＳＮＬＡＳＧ（配列番号１２９）；ＬＡＳＮＬＥＳＧ（配列番号１３０）；ＳＴＳＮＱＡＰＧ（配列番号１３１）；ＷＡＳＴＲＨＴＧ（配列番号１３２）のうちの一つを有することが分かった。
【００９２】
表５は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ２ａｋ抗体クローンを示している。
【００９３】
【表５】
【００９４】
表６は、追加のＩｇＧ２ａｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに組換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示している。
【００９５】
【表６】
【００９６】
図１２に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の重鎖クローンを同定した（配列番号１３３〜１５４）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＴＲＥＦＴＴＫＡＬＤ（配列番号１５５）；ＴＲＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号１５６）；ＡＲＴＡＴＡＬＹＴＭＤ（配列番号１５７）；ＬＲＴＬＰＣＩ（配列番号１５８）；ＳＲＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号１５９）；ＡＲＱＬＸＸＹＦＸＭＤ（配列番号１６０）のうちの一つを有するＩｇＧ２ａｋ重鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６１）；ＮＩＤＰＹＹＤＳＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６２）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６３）；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６４）；ＸＦＸＴＤＷＦＹＸＴ（配列番号１６５）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６６）；ＴＩＳＳＧＧＧＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６７）；ＸＩＹＰＧＴＤＮＴＹＹＮＥＸＦＫＧ（配列番号１６８）のうちの一つを有することが分かった。
【００９７】
図１３に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の軽鎖クローンを同定した（配列番号１６９〜１８９）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１９０）；ＳＧＹＰＬＴＦＧＳ（配列番号１９１）；ＨＲＳＰＰＭＴＦＧ（配列番号１９２）；ＱＱＮＮＥＤＰＦＴ（配列番号１９３）；ＹＳＧＹＰＬＴＦＧ（配列番号１９４）；ＮＴＬＰＬＴＦＧ（配列番号１９５）；ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号１９６）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴＦ（配列番号１９７）のうちの一つを有するＩｇＧ２ａｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１９８）；ＬＡＳＮＬＥＦ（配列番号１９９）；ＮＬＡＳＧＶＰ（配列番号２００）；ＮＬＡＳＧＶ（配列番号２０１）；ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２０２）のうちの一つを有することが分かった。
【００９８】
次の文献は、引用によってここに加えるものとする。
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【００９９】
上記記載は限定であると解釈すべきではなく、好ましい具体例の単なる例示であると解釈すべきである。当業者であれば、この開示の範囲及び精神内でその他の改変を考えるであろう。
【０１００】
ここに開示された具体例に対する様々な変更をなし得ることが理解されるであろう。例えば、当業者であれば認識するであろうが、ここに記載された特定の配列を、抗体又は抗体フラグメントの機能性に必ずしも悪影響を及ぼすことなく僅かに変更することができる。例えば、抗体配列における単一の又は複数のアミノ酸の置換を、抗体又はフラグメントの機能性を破壊することなく高い頻度でなし得る。従って、ここに記載される特定の抗体に対して７０％以上の相同性を有する抗体は、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。特に有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体に対して約８０％以上の相同性を有する抗体が予期される。その他の有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体に対して約９０％以上の相同性を有する抗体が予期される。従って、上記記載は、限定と解釈すべきでなく、好ましい具体例の単なる例示と解釈すべきである。当業者であれば、本発明の範囲及び精神内で様々な変更を考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明に従う抗体／自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を示す概略図である。
【図２Ａ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号１〜６）を示す図である。
【図２Ｂ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号７〜１２）を示す図である。
【図３】抗体ペプチド構築物産生用ベクターの一部分の概略図である。
【図４】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図５】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図６】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図７】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図８Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｃ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図９Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図９Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図１０】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号６３〜８２）を示す図である。
【図１１】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号４６〜２２６）を示す図である。
【図１２】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１３３〜１５４）を示す図である。
【図１３】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１６９〜１８９）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
自己免疫疾患を治療し又は予防するために自己抗原に対する自然免疫寛容を発達させ且つ回復させることである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞仲介疾患のインスリン依存性糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）は、大きな健康上の問題であり、１．５百万人以上の米国人がこれに冒されている。この自己免疫疾患は、膵臓内にあるランゲルハンス島のインスリン産生β細胞のＴ細胞仲介破壊によって生じる。インスリンによる治療にもかかわらず、Ｔ１ＤＭが原因の死亡率は過去２０年で増加してきている一方で、癌、心疾患及び脳卒中が原因の死亡率は減少してきている（Ｈｕｒｌｂｅｒｔ外，２００１）。さらに、腎症、末梢神経障害及び網膜症を含め外因性インスリンによる治療の合併症は非常に衰弱性である。
【０００３】
Ｔ１ＤＭはＴｈ１仲介疾患であるとみなされており、また、例えば、ＩＬ−４の全身投与によって免疫応答をＴｈ２型に移行させる初期介入は、病気の発症を予防することができる（Ｃａｍｅｒｏｎ外，１９９７）。エフェクターＴ細胞とＴｈ１とＴｈ２とのバランスは免疫寛容を維持する際に重要であり、そしてバランスの変化が自己免疫を生じさせ得る。しかしながら、自己免疫疾患からの防御は、Ｔｈ２細胞の固有の特性ではない。というのは、ＮＯＤマウスからのＴｈ２細胞株が疾患を転移させることも示されたからである（Ｐａｋｋａｌａ外，１９９７）。
【０００４】
免疫系は、自己寛容を維持するために複雑な方法で進化してきた。胸腺は、Ｔ細胞の重要な初期選択を与える。この選択は、胸腺中に存在する自己抗原に対して寛容なＴ細胞を末梢に伝える。しかしながら、多くの組織特異的蛋白質は、寛容を誘導するのに十分なレベルでは発現しない。例えば、おそらく低い親和性ではあるが、健康な被験者においてランゲルハンス島反応性Ｔ細胞が見出された（Ｌｏｈｍａｎ外，１９９６）。末梢性寛容のうちいくつかの機構は、自己反応性Ｔ細胞を調節下で維持するために胸腺において中心的な寛容機構を補完する。末梢性寛容の重要なメディエーターの一つが抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）である。樹状細胞（「ＤＣ」）及びマクロファージのようなＡＰＣは、他の細胞から自己抗原を捕獲し、そしてこれらのものを自己反応性Ｔ細胞に提示して調節Ｔ細胞の欠失、無感作及び／又は発生によってＴ細胞寛容を誘導する（Ｈｅａｔｈ ＆ Ｃａｒｂｏｎｅ，２００１）。現在の仮説は、定常状態の免疫系におけるＡＰＣのような未成熟ＡＰＣが、おそらくは共刺激分子の欠損のために、Ｔ細胞を活性化するのではなくむしろ寛容化させるというものである。Ｈａｗｉｇｅｒ外は、ＤＣ制限エンドサイト受容体であるＤＥＣ−２０５に対する抗体を使用してＤＣの主要組織適合クラスII（「ＭＨＣ II」）経路に抗原を向けた（Ｈａｗｉｇｅｒ外，２００１）。これらのＤＣによる抗原提示は、ＣＤ４+Ｔ細胞の短期の急激な増殖を刺激し、その後欠失し、そして受容者は、その後のペプチド免疫化に対する応答の欠如によって示されるように、抗原に対して寛容になった。対照的に、抗原ターゲティングが抗ＣＤ４０のような強力なＤＣ成熟刺激を伴ったときには、免疫が誘導された。
【０００５】
また、樹状細胞は、エフェクターＴ細胞の機能を抑制サイトカインを介して又は接触依存機構によって感化させる調節Ｔ細胞を発生させることによって末梢寛容を誘導することもできる（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ外，２００１；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ外，２０００；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００１）。調節Ｔ細胞を誘導させるための多数の異なるプロトコールが、一般に「部分最適」Ｔ細胞刺激の手段によって開発された。Ｔ細胞の部分最適刺激は、共刺激の非存在下での抗原提示によって、又は炎症によって、又はＴ細胞受容体若しくはその共受容体であるＣＤ４及びＣＤ８の部分的な妨害によって達成できる。調節Ｔ細胞の表現型及びその作用機構は異質である。多くのサプレッサー細胞はＣＤ４+ＣＤ２５+であるが、多くの状況においてはＣＤ４+ＣＤ２５-細胞が同様に有効であることがますます明らかになっている。調節Ｔ細胞母集団において同定されたその他のマーカーとしては、ＣＤ６２Ｌ、ＧＩＴＲ及びＣＤ１０３（Ｌａｆａｉｌｌｅ ＆ Ｌａｆａｉｌｌｅ，２００２）が挙げられ、そしてＣＤ８+調節Ｔ細胞も報告された（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，２００２）。いくつかの調節Ｔ細胞が、免疫抑制サイトカインであるインターロイキン（「ＩＬ」）−１０を産生することが示された（Ｗａｋｋａｃｈ外，２００１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２）が、口腔寛容によって誘導された調節Ｔ細胞は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１０の他に、β型トランスフォーミング増殖因子（「ＴＧＦ−β」）の産生を特徴とした（Ｗｅｉｎｅｒ，２００１）。接触依存サプレッサー細胞は、ＴＧＦ−βの存在下にＣＤ４+ＣＤ４５ＲＡ+ヒト末梢Ｔ細胞を活性化させることによって生じた（Ｙａｍｉｇａｗａ外，２００１）。調節Ｔ細胞の誘導は、Ｔ細胞受容体を介した刺激を必要とするが、それらの抑制効果は非抗原特異的であるように思われる（Ｔｈｏｒｔｏｎ ＆ Ｓｈｅｖａｃｈ，２０００）。
【０００６】
免疫調節Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて病原反応性Ｔ細胞を下方調節する際にある種の役割を果たすことが示された。前糖尿病マウスが免疫調節Ｔ細胞を宿し、しかもそれらの数又はそれらの機能的容量の減少が病気の進行に大きく寄与する事象であるという証拠がある（Ｓｅｍｐｅ外，１９９４）。同時転写実験から、前糖尿病マウスからのＣＤ４+Ｔ脾臓細胞が糖尿病誘発性細胞による免疫不全受容者への病気の転移を完全に妨げることが示された（Ｂｏｉｔａｒｄ外，１９８９；Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ ＆ Ｃｏｏｋｅ，１９９０）。また、未成熟ＤＣによる調節Ｔ細胞の誘導は、ＮＯＤマウスモデルにおける病気の予防と相関があった（Ｈｕｇｅｓ外，２００２）。
【０００７】
ヒトでは、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）、熱ショック蛋白質（「ＨＳＰ」）６０又は蛋白質チロシンホスファターゼ様分子（「ＩＡ−２」）及びその他の不定β細胞抗原に応答する自己反応性Ｔ細胞が説明されてきた（Ｒｏｅｐ外，１９９０；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，１９９２；Ｈｏｎｅｙｍａｎ外，１９９３；Ｒｅｉｊｏｎｅｎ外，２００２）。
【０００８】
ＧＡＤは、抑制性神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸の生合成酵素である（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ外，１９９０）。６５％の相同性を有する２種の別個のアイソホームであるＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７がクローン化された。ＧＡＤ６５はヒトでは優性のアイソホームであるが、ＧＡＤ６７はＮＯＤマウスにおける主要な形態であり、両者のアイソホームに対する抗体がヒトで検出される（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９２）。ＮＯＤマウスでは、抗ＧＡＤ抗体は、膵島炎の前又はそれと同時に且つその他のβ細胞抗原に対する抗体が現れる前に検出された。このタイミングは、ＧＡＤがこのモデルにおいてβ細胞の自己免疫を開始させる一次抗原であることを示唆する（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。糖尿病におけるＧＡＤの重要な役割についてのさらなる証拠は、糖尿病マウスの脾臓又は膵臓から単離されたＧＡＤ特異的Ｔ細胞が病気を実験未使用動物に転移させ得るという多くの研究室による観察に由来する（Ｒｏｈａｎｅ外，１９９５；Ｗｅｎ外，１９９８；Ｚｅｋｚｅｒ外，１９９８）。Ｔ１ＤＭの病因におけるＧＡＤの中心的な役割に関する議論の余地は残るものの、動物実験からの証拠は、この蛋白質の重要な役割を少なくとも示唆している。
【０００９】
若年期に精製ＧＡＤ６５によって胸腺内又は静脈内のいずれかで免疫化すると、ＮＯＤマウスにおいて膵臓β細胞に対するＴ細胞を寛容化させることができ、それによって膵島炎及び糖尿病を予防することができる（Ｔｉａｎ外，１９９６；Ｍａ外，１９９７）。また、ＧＡＤに対する寛容化は、ＨＳＰ６５のようなその他の抗原に対する免疫反応の発生を防止することもできた。ＧＡＤペプチドが寛容を誘導できることにさらなる研究が向けられた（Ｔｉｓｃｈ外，２００１；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）。また、糖尿病の発症からの防御は、静脈内、皮下、経口又は経鼻経路を介したインスリン又はＨＳＰ６５治療のいずれかによっても達成できる（Ｅｌｉａｓ外，１９９１；Ｅｌｉａｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｅｌｉａｓ外，１９９７；Ａｔｋｉｎｓｏｎ外，１９９０）。抗原特異的治療は、初期に施すときには発病を防止するのに非常に有効であるが、ほんの２、３の試みが進行しつつある病気の制御に成功しただけである（Ｅｌｉａｓ ＆ Ｃｏｈｅｎ，１９９４；Ｔｉａｎ外，１９９６）。
【００１０】
一般的なペプチド免疫化は、抗原提示細胞が該ペプチドを免疫を誘導する段階で提示するかどうかを制御できず又は免疫応答を寛容に移行させ得る抗原提示細胞では制御できないため、免疫刺激又は免疫抑制のいずれかを生じさせ得る。
【００１１】
免疫系を損なうと糖尿病の発症を予防することができる。ＦＫ５０６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＴＬＡ−４などのようなＴ細胞機能を抑制するありとあらゆる一般的な薬剤がＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発症を予防し又は遅らせることが示された（概説：Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｌｅｉｔｅｒ，１９９９）。しかしながら、これらの試薬のいずれも糖尿病誘発性Ｔ細胞に対して特異的ではなく、また、これらの大部分は病気の発症を予防することができるが、いったん病気が発症すると効果的ではない。臨床実験で試験されたシクロスポリンのような一般的な免疫抑制剤は、短期間では有効であった（Ｆｅｕｔｒｅｎ外，１９８８；Ｓｋｙｌｅｒ ＆ Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９９２）。しかしながら、免疫抑制の中断は即座の再発に至り、そして腎臓障害のような副作用が長期治療を妨げる（Ｐａｒｖｉｎｇ外，１９９９）。
【００１２】
糖尿病における抗原特異的治療の有効性を評価するための臨床試験が開始された。ＨＳＰ６０ｐ２７７ペプチド（ＤｉａＰｅｐ２７７）は、初期の糖尿病で試験された（Ｒａｚ外，２００１）。このペプチドによる多数の免疫化がこの病気の進行を緩やかにし、そしてこの結果を確認し且つ拡大するための大規模な研究が開始された。ヒトインスリンのβ鎖を不完全フロイントアジュバント、インスリンＢ９−２３の改変ペプチドリガンド及びＧＡＤと組み合わせて使用した臨床試験が進行中である。しかしながら、近年診断された糖尿病を経口インスリンで治療する試験は失敗し（Ｐｏｚｚｉｌｉ外，２０００；Ｃｈａｉｌｌｏｕｓ外，２０００）、そして非経口インスリン投与は非常に危険な状態にある前糖尿病を予防することに失敗した（糖尿病予防試験１型（ＤＰＴ）研究グループ，２００２）。失敗は、抗原の選択、抗原の投与量（Ｋｕｒｔｓ外，１９９９）、投与のタイミング及び経路を含むいくつかの要因による可能性があった。また、抗原療法は、いかなるタイプの免疫細胞が抗原を取り込むのかを制御することができない。マウスは制御された病原体フリーの条件下にあるが、臨床試験ではそういうわけにはいかない。細菌又はウイルスの同時感染が存在するときには、寛容よりもむしろプライミングが生じ得る。動物では、糖尿病は、ある種の条件下での抗原免疫化によって誘導され得た（Ｂｌａｎａ外，１９９６；Ｂｅｌｌｍａｎｎ外，１９９８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
免疫系がいかにして自己抗原に対する寛容を維持するのかという理解が過去数十年の間に実質的に深まってきたため、Ｔ１ＤＭを予防し又は治療するための近年の治療戦略は、β細胞抗原に対する免疫寛容を回復させることに向けられている。近年の免疫療法の戦略は、自己反応性Ｔ細胞を直接不活性化させること及び／又は調節能力を有するＴ細胞を誘導することのいずれかによってβ細胞抗原に対する寛容を誘導することに向けられている。調節Ｔ細胞の誘導は、多数の自己免疫疾患の治療のために期待できる手法であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
要約
本発明は、免疫寛容を誘導することによって自己免疫疾患を治療する方法に関する。免疫寛容は、自己抗原を抗原提示細胞に提示することによって誘導される。自己抗原は、抗原内在化受容体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、抗原提示細胞によって内在化され且つ該細胞上に提示されるが、これは自己反応性Ｔ細胞の抑制を生じさせる。
【００１５】
特に有用な具体例では、ここに記載される方法及び化合物は、特に、β細胞抗原、ＧＡＤ又はそれらのエピトープ、インスリン又はそのエピトープ、ＨＳＰ又はそのエピトープであることができる自己抗原に対する免疫寛容を誘導することによって糖尿病を治療するために使用される。この自己抗原は、抗原内在化受容体であるＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する抗体に結合する。自己抗原は、標的肝臓シヌソイド内皮細胞又は表面上にＤＣ−ＳＩＧＮＲを発現するその他の寛容化ＡＰＣに内在化される。自己抗原は、この標的肝臓シヌソイド内皮細胞上に提示され、そして自己反応性Ｔ細胞の増殖を抑制する。
【００１６】
別の態様では、ペプチドに結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する抗体／ペプチド構築物を説明する。好ましくは、このペプチドは、抗原、さらに好ましくは自己抗原である。特に有用な具体例では、抗体／自己抗原構築物又はその部分は、抗原提示細胞によって内在化され、そしてこの自己抗原に対する免疫寛容が達成される。場合によっては、毒素が本発明の抗体と混合され、そして患者に投与される。この毒素が、例えば腫瘍細胞に対するものである場合には、本発明の抗体は、該毒素を該腫瘍細胞に向けさせ、それによって該毒素の投与を該腫瘍細胞に集中させるために使用される。
【００１７】
別の態様では、自己抗原に結合した抗原提示細胞上の受容体に対する抗体を含有する改変抗体を組換えによって作製するための方法を説明する。
【００１８】
また、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＴ細胞のようなＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体に関するものでもある。
【００１９】
別の態様では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌソイド細胞のような肝細胞に入るのを阻害し、そしてそれらがその他の細胞に感染するのを阻害する。いくつかの具体例では、本発明は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体をワクチンに使用することを包含する。
【００２０】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はヒト化抗体であることができる。その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体はｓｃＦｖであることができる。
【００２１】
本発明のさらなる具体例は、上記のような組成物を使用した及び／又は方法を具体化した予防技術並びに診断技術に関するものである。また、薬剤として許容できるキャリア中に本願発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体を含む組成物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
詳細な説明
本方法は、自己免疫疾患に関わる自己抗原又は自己ペプチドに対する免疫寛容を誘導する。
【００２３】
免疫寛容は、本発明に従って、抗体／自己抗原構築物（本明細書においては、時として「改変抗体」ともいう。）を被検体に投与することによって誘導される。この抗体／自己抗原構築物は、ある種の抗体に結合した自己抗原を包含する。
【００２４】
この抗体の成分は、任意の抗原提示細胞上の任意の受容体に結合する抗体であることができる。当業者であれば認識するであろうが、抗原提示細胞のタイプとしては、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、クッパー細胞及びＢ細胞が挙げられる。現在知られている受容体又は抗原提示細胞の中では、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール（Ｔｏｌｌ）受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体が挙げられる。特に有用な具体例では、この受容体は、ＳＴＴ抗体を内在化させるであろうものである。内在化が特定の受容体で生じるかどうかは、当業者に知られた技術を使用して実験によって決定できる。現在抗体の内在化を与えることが知られている受容体又は抗原提示細胞としては、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲが挙げられる。
【００２５】
抗体成分は、自然抗体（慣用技術を使用して単離される）又は当業者の認識範囲内にある組換え方法により合成によって調製される抗体であることができる。この抗体は、例えば、完全にヒトの抗体、ヒト以外の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は任意の方法（部位特異的修飾若しくは脱免疫化）で操作された前述のタイプの抗体のうち任意のものであることができる。抗体は、有利には、例えばファージディスプレイ及びパニング法のような当業者に知られた技術を使用して抗体ライブラリーから選択できる。
【００２６】
いったん選択されると、該抗体をコードする核酸は、例えば、それぞれ２００２年９月１９日に出願された米国特許出願第１０／２５１０８５号及び２００１年１２月１０日に出願された米国特許出願第１０／０１４０１２号（これらの開示は引用によってここに加えるものとする）に記載された慣用のＰＣＲ及び増幅技術のような当業者に知られた技術を使用して増幅できる。
【００２７】
この開示に従って、自己抗原を抗体に結合させて抗体／自己抗原構築物を調製する。任意の自己抗原が使用できる。自己抗原は、天然に生じるものであることができ、そして当業者に知られた技術を使用して単離できる。別法では、この自己抗原のアミノ酸配列が知られている場合には、このものは既知の技術を使用して合成によって調製できる。好適な自己抗原としては、インスリン、ＧＡＤ、Ｈｓｐ、核抗原、アセチルコリン受容体、ミエリン塩基性蛋白質、ミエリン希突起膠細胞糖蛋白質、プロテオリピド蛋白質、ミエリン結合糖蛋白質、糸球体基底膜蛋白質及びチロトロピン受容体が挙げられる。特に有用な具体例では、自己抗原は、抗原提示細胞による提示に基づき免疫寛容を誘導するものである。
【００２８】
自己抗原は、任意の好適な方法によって抗体に結合できる。一つの特定の方法を後の実施例に示しているが、この開示は、抗体／自己抗原構築物を作製する任意の特定の方法に限定されるものではない。
【００２９】
自己抗原に対する免疫寛容を誘導する本方法は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）を標的にし、且つ、自己抗原を抗体によってそれらの細胞に向ける。図１は、本発明に従う抗体／自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を概略的に示している。抗体は、標的細胞上の受容体を認識する。この抗体による自己抗原の送達に向けるために、これら２つのものを結合させる。本明細書はベクターのクローニングを使用することを記載しているが、この結合は、任意の方法によって達成され得る。抗体は、ユニークな抗体内在化受容体のみを標的にし、そしてこれに結合し、それによって所望の細胞型への抗原の送達を確実なものにする。
【００３０】
抗体が標的抗原内在化受容体に結合した後に、結合した自己抗原と抗体は、抗原提示細胞内に内在化される。自己抗原は、おそらくは該細胞内の主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）との自己抗原相互作用を介してＡＰＣの表面上に提示される。いったん自己抗原が共刺激能力を有するＡＰＣの表面上で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化されるようになり、そしてそれらの特異的な自己抗原を標的にし且つそれと反応し得る。ＡＰＣの表面に共刺激分子が存在しないことは、おそらくＴ細胞応答を制限させることに関わる。自己反応性エフェクターＴ細胞は、制限された数の抗原提示組織細胞のみを死滅させ得る。数種の標的細胞を死滅させた後に、このエフェクター細胞は死滅する。そのときに、自己抗原提示細胞が寛容化される。
【００３１】
本願発明の抗体／自己抗原構築物は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入若しくは病変内経路、局所又は以下に示すような徐放系による注射又は注入によって投与できる。この抗体／自己抗原構築物は、好ましくは、注入又は静脈内ボーラスによって連続的に投与される。局所的又は全身的な態様で該抗体／自己抗原構築物を投与できる。
【００３２】
抗体／自己抗原構築物は、薬剤として許容できるキャリアとの混合物で調製できる。本願発明の化合物の処方及び投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｎｅｃｅｓ」，Ｍａｃｋ出版社，ペンシルバニア州イーストン，最新版に見出され得る。この医薬組成物は、静脈内に又は鼻若しくは肺を介して、好ましくは液体又は粉末エーロゾル（凍結乾燥された）として投与され得る。また、この組成物は、非経口で又は皮下にも望み通りに投与され得る。全身に投与されるときに、この医薬組成物は、滅菌されており、発熱性物質を有しておらず、しかもｐＨ、等張性及び安定性について十分に考慮された非経口投与に許容できる溶液中にあるべきである。これらの条件は当業者に周知である。
【００３３】
簡単に説明すると、本発明の抗体／自己抗原構築物の投与処方物は、貯蔵又は投与のために、所望の純度を有する化合物と生理的に許容できるキャリア、賦形剤又は安定剤とを混合させることによって調製される。このような材料は、使用される投与量及び濃度ではこれらの賦形剤に対して非毒性であり、しかもＴＲＩＳ・ＨＣｌ、燐酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及びその他の有機酸塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような酸化防止剤、ポリアルギニンのような低分子量（約１０残基以下）のペプチド、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのような蛋白質、ポリビニルピロリジノンのような親水性重合体、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニンのようなアミノ酸、単糖、二糖及びその他の炭水化物（セルロース若しくはその誘導体、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）、ＥＤＴＡのようなキレート化剤、マンニット又はソルビットのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ若しくはポリエチレングリコールのような非イオン界面活性剤を含むことができる。
【００３４】
生体内投与のために使用されるときに、抗体／自己抗原構築物処方物は滅菌された状態でなければならず、そして慣用の製薬手法に従って処方され得る。これは、凍結乾燥及び復元の前又は後に、滅菌濾過膜によって濾過することにより容易に達成される。この抗体は、通常、凍結乾燥形態又は溶液の状態で保存されるであろう。その他の賦形剤、例えば、胡麻油、落花生油若しくは綿実油のような天然の植物油又はオレイン酸エチルなどのような合成脂肪賦形剤が望ましいかもしれない。緩衝剤、防腐剤、酸化防止剤などが、認められた製薬手法によって取り込まれ得る。
【００３５】
使用するのに好適な医薬組成物としては、１種以上の抗体／自己抗原構築物がそれらの意図された目的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が挙げられる。より具体的には、治療上有効な量とは、病気を予防し、その症状を緩和し若しくは改善させる又は治療される被検体を延命させるのに有効な抗体の量を意味する。治療上有効な量の決定は、特にここに与えた詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内にある。治療上有効な投与量は、試験管内及び生体内方法を使用することによって決定できる。
【００３６】
治療に使用されるべき抗体／自己抗原構築物の有効量は、例えば、治療対象、投与経路及び患者の状態に依存するであろう。さらに、主治医は、病気の深刻さとタイプ、体重、性別、食事、投与の時間と経路、他の薬物療法及びその他の関連する臨床要因を含め、薬剤の作用を改変させることが知られている様々な要因を考慮する。従って、治療専門家は、最適な治療効果を得るために要求されるように、投与量を滴定し及び投与の経路を改変することが必要であろう。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで抗体／自己抗原を投与するであろう。この治療の進行は、慣用のアッセイ法によって容易に監視される。
【００３７】
任意の抗体／自己抗原構築物について、その治療上有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイ法から推定できる。例えば、投与量を動物モデルに処方して細胞培養液中で決定されるようなＥＣ50を含む循環濃度範囲（例えば、細胞増殖又は細胞分化を促進させ又は阻害する試験分子の濃度）を達成することができる。このような情報を使用してヒトに有用な投与量をさらに正確に決定することができる。
【００３８】
ここで記載した抗体／自己抗原構築物の毒性及び治療上の効果は、例えば、ＬＤ50（母集団の５０％致死量）及びＥＤ50（母集団の５０％に治療上有効な量）を決定するための、細胞培養基又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定できる。毒性と治療効果との間の投与量比は治療指数であり、そしてこれはＬＤ50とＥＤ50との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す分子が好ましい。これらの細胞培養アッセイ法及び動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための所定の範囲の投与量を処方する際に使用できる。このような分子の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く有しないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。この投与量は、使用される剤形及び使用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師によって患者の状態を考慮して選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ外，「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，第１章，１頁，１９７５を参照）。
【００３９】
投与量及び投与間隔を個々に調節して細胞増殖若しくは細胞分化を促進させ若しくは阻害するのに十分な抗体／自己抗原構築物の血漿レベル又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えることができる。このＭＥＣは、それぞれの抗体／自己抗原構築物に対して変化するであろうが、説明したアッセイ法を使用した試験管内データから推定できる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性及び投与経路に依存するであろう。しかしながら、ＨＰＬＣアッセイ法又はバイオアッセイ法を使用して血漿濃度を決定することができる。
【００４０】
また、投与間隔もＭＥＣ値を使用して決定することができる。抗体／自己抗原構築物分子は、その時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、もっとも好ましくは５０〜９０％にわたってＭＥＣ以上の血漿レベルを維持する方式を使用して投与されるべきである。
【００４１】
局所投与又は選択的摂取の場合には、抗体／自己抗原構築物の有効な局所濃度は、血漿濃度とは関連がない。
【００４２】
典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲又はそれ以上であることができる。典型的には、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで抗体／自己抗原構築物を投与するであろう。この治療の進行は、慣用のアッセイ法によって容易に監視される。
【００４３】
病気のタイプ及び深刻さに応じて、抗体／自己抗原構築物の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇが、例えば１回以上の別個の投与によるか又は連続注入によるかに関わらず、患者への投与の候補となる初期投与量であり得る。数日又はそれ以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、治療は、病状の所望の抑制が生じ又は患者の状態の所望の改善が達成されるまで繰り返される。しかしながら、その他の用法・用量も有用であり得る。
【００４４】
特に有用な具体例では、本願発明の方法は、膵臓内のランゲルハンス島のインスリン産生β細胞に対する免疫慣用を誘導することによって糖尿病を治療するために使用できる。これらの細胞の自己抗原は、所望の抗原内在化受容体を認識する抗体に結合する。本発明において使用するのに好適な自己抗原は、β細胞抗原、インスリンのエピトープ又はエピトープに相当するペプチド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）及び熱ショック蛋白質（「ＨＳＰ」）である。インスリン、ＧＡＤ及びＨＳＰからのエピトープを覆う一組のペプチドを抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合させることによって、Ｔ１ＤＭに関わる全ての主要な抗原に対する慣用を誘導することができる。その他の自己抗原は、当業者であれば周知・慣用であり、発見・使用できる。
【００４５】
抗原内在化受容体は、分化したＡＰＣ上に提示される。この方法について、選択される抗原内在化受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ（樹状細胞特異的細胞間付着分子３−接着性非インテグリン関連受容体：dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin related receptor）である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、肝臓常駐抗原提示細胞である肝臓シヌソイド内皮細胞（「ＬＳＥＣ」）によって発現される（Ｐｏｈｌｍａｎｎ外，２００１）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、受容体結合蛋白質を内在化させ且つ抗原提示を促進させる病原体内在化受容体ファミリーに属する（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。ＬＳＥＣによる抗原の提示が抗原特異的慣用を生じさせることが示された（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。未成熟の免疫寛容状態から活性化状態に成熟し得るその他の樹状細胞型とは対照的に、肝臓シヌソイド細胞は、活性化抗原提示細胞に発達するように誘導され得ない（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮに対するホモログであるヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ（Ｌ−ＳＩＧＮとも呼ばれる）は、ＤＣ−ＳＩＧＮに対してアミノ酸レベルで７７％の同一性を示し、そして内在化受容体に対する特有のドメインを有する（Ｂａｓｈｉｒｏｖａ外，２００１；Ｓｏｉｌｌｅｕｘ外，２０００）。ＤＣ−ＳＩＧＮＲは、ＬＳＥＣ上で高発現し、且つ、リンパ節マクロファージ様細胞の亜母集団でも見出されるが、ＤＣによっては発現しない。
【００４６】
本発明の目的上、用語「ＤＣ−ＳＩＧＮＲ」及び「Ｌ−ＳＩＧＮ」は区別なく使用する。
【００４７】
Ｃ型レクチンマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）は、近年、ＤＣ特異的受容体として同定された。ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣのトランス内皮移行を仲介するが、これは、一過性のＤＣ−Ｔ細胞相互作用を開始させることによって一次免疫応答を可能にする（3Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００；2Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２０００）。また、ＤＣ−ＳＩＧＮは、炭水化物構造を介して病原体を認識する内在化抗原受容体としても作用する。ＤＣ−Ｔ細胞のクラスター形成及びＴ細胞応答の開始におけるその顕著な役割のほかに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＣの感染及びその後のＴ細胞へのＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、エボラウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びデングウイルスのようなウイルス、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonae）及びミコバクテリア・ツベルクロシス（Mycobacteria tuberculosis）のような細菌、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のような酵母並びにリーシュマニア・ピファノイ（Leishmania pifanoi）及びシストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）のような寄生虫の伝達に関わる主要な受容体である。ＤＣ−ＳＩＧＮＲのネズミホモログであるｍＳＩＧＮＲＩは、迅速に内在化され且つプロセシングためのリソソームを標的とする抗体を捕捉する（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。アミノ酸配列に基づけば、ネズミｍＳＩＧＮＲ１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ、実際にはヒトＤＣ−ＳＩＧＮに相同的であり、そのため動物モデリング研究に有用である。
【００４８】
いくつかの具体例では、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を調節、即ち抑制し又は高める。一具体例では、抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、ＬＳＥＣのような抗原提示細胞の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮＲ受容体部位に結合し、そしてＬＳＥＣとＴ細胞との間の相互作用を阻害する。より具体的には、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮＲとＴ細胞の表面上のＩＣＡＭ受容体との付着を妨害することによってＬＳＥＣとＴ細胞との付着を減少させる。
【００４９】
ここで使用するときに、「ＩＣＡＭ受容体」とは、ＩＣＡＭ−２受容体とＩＣＡＭ−３受容体の両方、特にＩＣＡＭ−３受容体を意味する。
【００５０】
いくつかの具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ＤＣ−ＳＩＧＮには結合しない。
【００５１】
その他の具体例では、本発明のＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体は、ウイルスが肝臓シヌソイド細胞のような肝臓細胞に入るのをブロックし、しかもウイルスが他の細胞に感染するのをブロックする。
【００５２】
Ｔ細胞の抗原提示細胞への付着の妨害により、ＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体の使用は、抗原提示細胞−Ｔ細胞クラスター形成、Ｔ細胞活性化及び抗原提示細胞とＴ細胞との間の接触に依存するその他の相互作用に影響を与えるであろう。これらのその他の相互作用としては、抗原提示細胞とＴ細胞との細胞対細胞の直接接触又はかなりの接近が挙げられる。
【００５３】
その他の具体例では、本発明の抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体は、自己抗原ペプチドのようなペプチドに結合する。これらのペプチドは、ベクターを抗体フラグメントにグラフトさせること及び結合したベクター／抗体をクローン化させること又は化学的に結合させることを含め、任意の好適な方法によって抗ＤＣ−ＳＩＧＮＲ抗体に結合できる。ベクターを結合させる方法、クローン化の方法又は化学的に結合させる方法は当業者に周知である。
【００５４】
次いで、これらのペプチド、好ましくは自己抗原は、結合した抗体と共に、ＬＳＥＣに内在化される。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ外，１９８６）。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導させる（Ｋｎｏｌｌ外，１９９９）ことに加えて、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ８+Ｔ細胞に寛容を誘導し得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。ＬＳＥＣは、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプロセシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌ外，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官に移動しない。
【００５５】
この内在化は、ＭＨＣ相互作用を介して仲介されるＬＳＥＣに対する表面への自己抗原ペプチドの提示を促進させる。いったん自己抗原が共刺激能力を有するＬＳＥＣの表面上で発現すると、ナイーブ自己反応性Ｔ細胞は活性化された状態になり得る。これらのＴ細胞は、結合した自己抗原を標的にし且つそれと反応する。エフェクターＴ細胞は、少数のＬＳＥＣを死滅させ、そして共刺激分子がなければ死滅する。ＬＳＥＣによるこの自己抗原提示は、抗原特異的寛容を生じさせる。
【００５６】
肝臓は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのような多数の免疫寛容メディエーター並びに免疫寛容の発達を助成する分化ＡＰＣを有するユニークな微環境を有する（1Ｋｎｏｌｌｅ及びＧｅｒｋｅｎ，２０００）。肝臓の免疫寛容特性は、同種肝移植物がＭＨＣ障壁にわたって受け入れられ得るという知見によって裏付けられる（Ｃａｌｎｅ，１９６９）。さらに、門脈を介した抗原の適用は、おそらく抗原の全身適用よりも寛容に至る（Ｋａｍｅｉ外，１９９０）。肝臓を介した排出は、口腔免疫寛容誘導にとって不可欠であることが報告されている（Ｙａｎｇ外，１９９４）。肝血管を通過する血液は、まずクッパー細胞及びＬＳＥＣと接触する。肝臓シヌソイドを通る血流は遅いため、肝臓シヌソイド細胞集団と通過する白血球との接触が可能となる。ＬＳＥＣは、ＭＨＣII、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような抗原提示に必要な表面分子を有する（Ｌｏｈｓｅ外，１９９６；Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ外，１９８６）。ナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に調節表現型を誘導する（3Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）ことに加えて、ＬＳＥＣは、外因性抗原を交差提示することによってＣＤ８+Ｔ細胞に寛容を誘導し得る（Ｌｉｍｍｅｒ外，２０００）。Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外（Ｋｌｕｇｅｗｉｔｚ外，２００２）は、Ｔｈ１、ＩＦＮ−γ産生ＴＣＲ形質転換細胞をマウスに注射すると、静脈内蛋白質免疫化後に、肝臓内でこれらの細胞によるＩＦＮ−γ産生の抑制及びＴｈ２細胞の促進を生じることを立証した。未成熟な寛容段階から免疫を開始させる成熟段階に分化し得るプロフェッショナル骨髄性ＡＰＣとは対照的に、ＬＳＥＣは、ＭＨＣの下方調節及びエンドソームプロセッシングの妨害によってＴＮＦ−α及び内毒素として刺激に応答する（2Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。さらに、ＬＳＥＣは、肝臓からリンパ器官に移動しない。ＬＳＥＣは、寛容の誘導に特化した唯一のＡＰＣではない可能性がある。Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外は、近年、内因的に発現する自己抗原を提示することによって寛容を誘導した脾臓ＤＣの小さなサブセットを同定した（Ｐｕｇｌｉｅｓｅ外，２００１）。全体的に、ＬＳＥＣは、寛容を誘導する目的でβ細胞抗原を提示するのに有利な細胞型であると思われる。
【００５７】
好ましい態様及び具体例を含め、本方法の実施は、次の実施例から容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単なる例示であり、決して限定するように解釈すべきではない。
【実施例】
【００５８】
例１：抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の取得
ファージディスプレイ技術を使用して、ｍＳＩＧＮＲ１を認識する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のパネルを同定した。ｓｃＦｖは、リンカーによって結合した可変軽鎖及び重鎖領域を含有する。それらの短い長さはこれらの抗体フラグメントを抗原結合のために非常に好適にし、また受容体に対する結合能力は保存されている。ウサギを組換えｍＳＩＧＮＲ１で免疫化し、そして国際公開第ＷＯ０２／４６４３６Ａ２号パンフレット（２００２年６月１３日発行）に記載されるファージディスプレイ用ベクターｐＲＬ４を使用してｓｃＦｖ抗体ライブラリーを構築した。この特許文献の開示は引用によってここに加えるものとする。この系における抗体フラグメントは、ファージの遺伝子IIIコート蛋白質上に提示される。ｍＳＩＧＮＲ１を認識する抗体を、組換えｍＳＩＧＮＲ１上での４ラウンドの固相パニングによって単離した。６種の異なる抗体を同定した。これら６種の抗体のアミノ酸配列を図２Ａ及びＢに与えている（それぞれ、配列番号１〜６及び７〜１２）。全ての抗体は固相ＥＬＩＳＡでｍＳＩＧＮＲ１を認識し、そしてヒトＤＣ−ＳＩＧＮのネズミホモログであるｍＤＣ−ＳＩＧＮとの交差反応は全く観察されなかった。これらの抗体をＨＡ及びＨＩＳ6でエピトープ標識した。ｍＳＩＧＮＲ１とＤＣ−ＳＩＧＮＨＩＳの両方を３Ｔ３ＥＢＮＡ細胞によって産生させ、そしてニッケルカラムで精製した。
【００５９】
例２：細胞表面受容体への結合に基づき内在化される抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体の同定
ｍＳＩＧＮＲ１を発現する細胞株のスクリーニング
ウサギマクロファージ細胞株のパネル（Ｐ３８８Ｄ１、１−１３．３５、ＷＥＨＩ−３及びＪ７７４）を標準的な方法によるＲＴ−ＰＣＲによってｍＳＩＧＮＲ１の発現に対してスクリーニングする。プライマーをｍＳＩＧＮＲ１のＧｅｎｂａｎｋ配列に基づきデザインし、これらのものをマウス器官のＲＴ−ＰＣＲで使用する。ｍＲＮＡレベルでｍＳＩＧＮＲ１を発現する細胞株を同定し、そして表面発現をＦＡＣＳ分析によって確認する。５×１０5個の細胞を、１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ中で１μｇの抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体と共に氷上で１５分間、抗体の内在化を可能としない条件でインキュベートする。１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含有するＰＢＳで２回洗浄した後に、結合した抗ｍＳＩＧＮＲ１をビオチニル化抗ＨＡ（ロシュ）、次いでＰＥ結合ストレプタビジン（ベクトン・ディキンソン）によって検出し、そして細胞をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン）を使用して分析する。別法として、内在化を、肝臓シヌソイド内皮細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現することが知られている一次細胞で決定する。また、ＬＳＥＣ上でのｍＳＩＧＮＲ１の発現も上記のようなＦＡＣＳによって確認できるが、ただし、反応当たり１×１０5個の細胞のみを添加する。
【００６０】
内在化の測定
いったんｍＳＩＧＮＲ１発現細胞株又は一次細胞型を同定したら、抗体パネルの内在化をＦＡＣＳ分析によって評価する。内在化がｍＳＩＧＮＲ１の結合に基づくことを示すために、ＪＡＷＳ１マウス樹状細胞のようなｍＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞株を含める。ビオチニル化抗ＨＡ抗体、次いでＰＥ結合ストレプタビジンを使用したそのままの浸透化細胞についての抗ｍＳＩＧＮＲ１検出を抗ＤＥＣ−２０５抗体について記載されるように比較する（Ｍａｈｎｋｅ外，２０００）。細胞株について１．５×１０6個細胞又は一次細胞について３×１０5個細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で３μｇのｍＳＩＧＮＲ１と共に２０分間にわたって４℃でインキュベートして内在化なしで抗体を表面に結合させる。結合しなかった抗体を４℃の１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄することによって除去する。それぞれの試料を３つに分ける。３分の１を４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして上記のように表面抗体を検出する。その他の３分の２を固定する前に３７℃で３０分間さらにインキュベートして内在化を可能にする。２分の１を抗ＨＡ及びストレプタビジンで直接検出し、残り２分の１を、０．１％（ｖ／ｗ）サポニン（シグマ・オールドリッチ）を含有するＰＢＳで細胞をインキュベートすることによって浸透化させる。内在化された抗体の量を、固定された細胞中の平均の蛍光度を固定され且つ浸透化された細胞で記録されたものから差し引くことによって算出する。３０分以内に最も高い内在化パーセンテージを有する抗体を、ペプチドを抗体に結合させるさらなる研究のために選択する。既存の無関係のウサギｓｃＦｖをネガティブコントロールとして使用し、近年ｍＳＩＧＮＲ１に結合することが示された市販のＥＲ−ＴＲ９抗体（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）をポジティブコントロールとして使用する。また、ＥＲ−ＴＲ９のＦａｂフラグメントもパパイン消化によって作製し、そして内在化について試験して二量体化が内在化の要件ではないことを確認する。所望ならば、このｓｃＦｖをＦａｂ'２又はＩｇＧに変換することができる。
【００６１】
別の具体例では、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーを、Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｍａｒｋｓのグループによって説明されるように、抗体を内在化させるためにパニングする（Ｐｏｕｌ外，２０００）。この具体例のために好適な方法を以下に概説する。
【００６２】
ｍＳＩＧＮＲ１ファージライブラリーからの内在化抗体の選択
ｍＳＩＧＮＲ１を発現させるために上記のように同定された５×１０6個の細胞を、ｍＳＩＧＮＲ１ライブラリーからの１×１０12コロニー形成単位のファージであってそれらの表面上で３遺伝子蛋白質に融合した抗体フラグメントを提示するものと１．５時間にわたって４℃でインキュベートして内在化なしにファージを結合させる。ファージの結合後に、これらの細胞を燐酸緩衝生理食塩水で５回洗浄して非特異的に結合した又は弱く結合したファージを除去する。次いで、表面に結合したファージのエンドサイトーシスを可能にする一方で、細胞内でのファージの分解を回避するように、細胞を１５分間にわたって３７℃でインキュベートする。細胞の表面に結合したファージを除去するために、細胞を低ｐＨグリシン緩衝液で３回洗浄することによってストリップする。次いで、細胞をトリプシン処理し、そしてＰＢＳで洗浄してから高ｐＨトリエチルアミンで溶解させる。ファージを含有する細胞溶解物を使用してＥ．ｃｏｌｉに感染させて次の選択ラウンド用のファージを調製する。３ラウンドの選択の全てを実行する。細胞表面に結合したファージの力価（最初の低ｐＨグリシン洗浄で見出される）及び細胞内から回収されるファージの数をそれぞれのラウンドについて監視する。エンドサイトーシスを受けたファージの数の増加は、内在化するファージ抗体の選択がうまくいったことを示す。
【００６３】
内在化されたｓｃＦｖ抗体フラグメントのいずれもｍＳＩＧＮＲ１に結合するのかどうかを決定するために、ラウンド３からの５００個のクローンを自動Ｑｐｉｘ（ジェネティクス）システムを使用して選択し、そしてＨｉＧｒｏｗシェーカー（ジーン・マシーン）で一晩ＳＢ培地入りの９６ウェルディッシュ中で生長させる。次の日に、ディッシュをスピンダウンし、そして上澄み液を自動Ｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｅｅｄｏｍ ２００（Ｔｅｃａｎ）システムを使用する固相ｍＳＩＧＮＲ１ ＥＬＩＳＡで試験する。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１μｇのｍＳＩＧＮＲ／ｍＬ ＰＢＳで一晩４℃でコートする。翌日に、プレートを１％ＢＳＡでブロックし、次いで０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄する。コントロールのプレートを１％のＢＳＡでコートする。抗体を含有する上澄み液をｍＳＩＧＮＲ１又はＢＳＡ単独のウェルに１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中０．０５〜５μｇ／ｍＬの濃度で添加する。シェーカー上で室温で２時間振盪後に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄する。結合したｓｃＦｖの検出のために、抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５マウスの腹水，ストラテジック・バイオソルーションズ，デラウェア）を１％のＢＳＡを有するＰＢＳでの１：１０００希釈で添加する。シェーカー上で室温で２時間振盪後に、プレートを再度洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（シグマ）を２時間にわたって添加する。３回以上洗浄した後に、結合した抗体をＳｉｇｍａ １０４（登録商標）基質を使用して検出する。これらのプレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で様々な時点で読む。
【００６４】
ＥＬＩＳＡにおいて正のシグナルを与えるクローンを制限酵素消化パターンによって特徴付ける。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ社製ミニプレップキットを使用して単離する。２μｇのＤＮＡを５ＵのＥｃｏＲIIで２時間にわたって３７℃で消化し、次いでこれらの試料を４％のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルに流す。パターンを比較し、そして配列を少量（約１００〜３００μｇ）で精製する。ｓｃＦｖを細菌の細胞周辺腔に適切にアセンブルし、そして分泌させる。ｓｃＦｖは、上澄み液又は細胞周辺腔のいずれかから単離できる。クローンを４リットルのＳＢ中で０．８のＯＤ600にまで生長させ、そして１ｍＭのイソプロピル−ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で３〜４時間にわたって３０℃で誘導させて最適な量のｓｃＦｖを産生させる。細胞周辺腔から単鎖抗体を単離するために、細胞ペレットを、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロシュ）プロテアーゼ阻害剤が添加された冷却ＰＢＳに再懸濁し、そしてソニックス製Ｖｉｂｒａ−ｃｅｌｌ ＶＣ７５０を使用して超音波処理する。次いで、細胞の破片をペレットにし、そして上澄み液をＡｋｔａ ＦＰＬＣ（ファルマシア）を使用してＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに適用する。抗体をイミダゾールで溶出させる。この方法は、一般に、約１００〜３００μｇの精製抗体／リットルを生じさせる。内毒素をＳａｒｔｏｒｉｕｓＱ１５フィルターにより濾過することによって除去する。これは、一般的に、ＬＡＬ試験（バイオ・ホイッタカーから購入できるアッセイ法）によって決定されるときに１０Ｕ／ｍＬ以下の内毒素を含有する抗体調製物を生じさせる。抗体を上記のように内在化について並びに固相ＥＬＩＳＡで組換えｍＳＩＧＮＲ１への結合について再度分析する。３０分以内に最も高い内在化パーセンテージ及び固相ＥＬＩＳＡにおいて良好なシグナル（１μｇ／ｍＬで１時間後に＞１０Ｄ）を有する抗体を選択してペプチド−抗体構築物を作製する。
【００６５】
例３：ＧＡＤペプチドの抗体への結合
ベクター及びクローニング戦略
最良の細菌産生ｓｃＦｖの同定後に、ほ乳類発現系への転換を行う。ほ乳類での発現は、好適なペプチドの二次修飾及び内毒素フリー産生を可能にする。図３に示されるような互換性のある制限部位を有するベクター（例えば、米国特許第６３５５２４５号に記載されるもの。この開示は、引用によってここに加えるものとする。）を使用する。ｐＲＬ４（上で説明した）内にある対象の抗体からのＤＮＡをＳｆｉで切断し、そしてＣＭＶプロモーターとほ乳類抗体リーダー配列とを含むＡｐｅｘ ３Ｐベクターに挿入する。対象のペプチドをコードするヌクレオチドを挿入するために、制限部位を抗体配列内には含まれない利用可能な部位（ＭＣＳ＝ＮａｅＩ、ＦｓｅＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢＳＡＢＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｒＢＩ、Ｘｈｏ、ＰｂｖＩＯＩ、ＳｐｈＩ、ＮｓｉＩ、ＸｂａＩ）から選択する。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれの末端に好適な制限部位を有するＯｐｅｒｏｎによって合成し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して挿入する。得られた構築物は、ｓｃＦｖ、その後の選択された制限酵素によって決定されるスペーサー、その後のペプチド及びＨＩＳタグを含むであろう（図３）。配列を標準的な技術を使用して確認してから抗体産生用の３９３ＥＢＮＡ細胞にＤＮＡをトランスフェクトする。
【００６６】
ペプチドの選択
既知の糖尿病自己抗原であるインスリン、ｈｓｐ並びにＧＡＤ６５及び６７のペプチドのいずれもここに説明する方法で使用できることを理解すべきであるが、次の実験については、ＧＡＤを該ペプチドとして選択する。ＧＡＤ反応性Ｔ細胞は、ＮＯＤマウスにおいて検出される第１の自己反応性Ｔ細胞であり（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３；Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）、且つ、病気のプロセスに重要であることが示されている。さらに、ヒト及びネズミのＧＡＤは、９５％の相同性がある。脾臓ＮＯＤ Ｔ細胞によって認識されるエピトープが広く特徴付けられており（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）、多くの免疫優性ペプチドがＮＯＤマウスとＴ１ＤＭの患者において類似し、そしてこれは試験管内Ｔ細胞アッセイにおいて区別なく使用されてきた（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。ＮＯＤマウスにおける初期の免疫応答は、ＧＡＤ６５のカルボキシ末端領域内の所定の領域（ペプチド５０９〜５２８、ペプチド５２４〜５４３）に対して向けられる（Ｋａｕｆｍａｎ外，１９９３）。また、より後期のＴ細胞応答は、２００〜３００の間の他の領域並びに他の自己抗原にも向けられる。初期ＣＤ４ ＧＡＤ６５ Ｔ細胞エピトープのペプチド５２４〜５４３（ＳＲＬＳＫＶＡＰＶＩＫＡＲＭＭＥＹＧＧＴ（配列番号１３）、マウス及びヒトで同一の配列）の一つ並びにより後期に生じるネズミＧＡＤ６５エピトープのペプチド２４７−２６６（ＮＭＹＡＭＬＩＡＲＹＫＭＦＰＥＶＫＥＫＧ（配列番号１４）、ヒトとマウスとで１アミノ酸の相違：下線）及びペプチド２９０−３０９（ＡＬＧＩＧＴＤＳＶＩＬＩＫＣＤＥＲＧＫ（配列番号１５）、マウスとヒトで同一の配列）の２つをこの実験でペプチドとして使用するために選択する。３種のエピトープの全てがＮＯＤの脾臓細胞内で自発的な増殖応答を誘導し得る。さらに、ペプチド２４７〜２６６及びペプチド２９０〜３０９によるペプチド免疫化は、ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発病を遅延させることが示された（Ｍａ外，１９９７；Ｔｉｓｃｈ外，１９９９；Ｚｅｃｈｅｌ外，１９９８）。ＣＤ４Ｔ細胞エピトープのほかに、ＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対する寛容も重要であることが報告されている（Ｑｕｉｎｎ外，２００１；Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ外，２０００）。ネガティブコントロールとして、抗体構築物を鶏卵リゾチームペプチド１１６〜１２４（ＫＧＴＤＶＱＡＷＩ）（配列番号１６）で作製する。次いで、試験管内研究において最も効果的なこれらのものからのペプチドを抗体構築物と様々な組み合わせで結合させ、そしてＮＯＤ糖尿病モデルで試験する。
【００６７】
例４：抗体−ペプチド構築物の作製及び精製
Ｔ細胞実験のために、ほぼ３００μｇのそれぞれの抗体構築物をＥＢＮＡ２９３ヒト胚性腎細胞内で産生させる。細胞を１０％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン及び２５０Ｕ／ｍＬのＧ４１８（シグマ）を有するＤＭＥＭ中で増殖させる。Ｔ１７５フラスコ中の細胞にＱｉａｇｅｎ製Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ試薬を使用して該メーカーの指示に従いＤＮＡをトランスフェクトする。３日後に培地を血清を有しない培地に交換する。４日目及び８日目に上澄み液を集め、細胞の破片を遠心分離によって除去し、そして透明な上澄み液をＡｋｔａ−ＦＰＬＣを使用してＮｉ−カラム上に充填する。抗体をイミダゾールで溶出させ、ＰＢＳに透析し、そして正確な寸法を１μｇをＳＤＳゲルに流すことによって確認する。
【００６８】
例５：ペプチド提示を生じさせるＬＳＥＣによる抗体−ペプチド構築物の内在化及びＴ細胞に及ぼすこの提示の影響
肝臓シヌソイド細胞を試験管内でペプチド−抗体構築物でターゲティングし、そしてこれらの細胞が若いＮＯＤ又はバルブ／ｃマウス由来のＴ細胞に表現型の変化を誘導し得るかどうかを決定する。
【００６９】
ネズミシヌソイド内皮細胞の単離
肝臓シヌソイド内皮細胞を生後３週間のＮＯＤ又は生後４〜６週間のバルブ／ｃマウスから単離する。Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌによって記載されるように（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ及びＢｏｅｌｓｔｅｒｌｉ，１９９５）、まずカルシウムをキレート化し且つ細胞−細胞接触を緩和するためのＥＧＴＡで門脈灌流し、その後細胞間マトリックスを分解させるための０．０５％コラゲナーゼＡハンクス緩衝液で灌流することによって細胞を得る。この灌流された肝臓をマウスから取り出し、そして角度付きの鉗子で穏やかに作業する。得られた粗細胞懸濁液を一連の金属シーブ（３０、５０、８０メッシュ）を通して濾過して大きな組織断片を除去する。シヌソイド細胞をメトリザミド勾配に基づく密度勾配遠心分離（１．０８９ｇ／ｃｍ3）によって実質組織細胞から分離し、その後２回の洗浄工程を実施して細胞の破片を除去する（3Ｋｎｏｌｌｅ外，１９９９）。この時点で、クッパー細胞と肝臓シヌソイド細胞との混合物が得られる。ＦＡＣＳ実験についてはこれで十分である。というのは、クッパー細胞は、クッパー細胞を認識する一方で肝臓シヌソイド細胞を認識しないＦ４／８０抗体を使用して肝臓シヌソイド内皮細胞から区別できるからである。しかしながら、Ｔ細胞及びペプチドとの同時培養実験については、クッパー細胞をＰＥ結合Ｆ４／８０（ＢＤファルミンゲン）、次いでＭｉｌｔｅｎｙｉ製抗ＰＥマイクロビーズで標識し、そしてメーカーの指示に従いＭＡＣＳカラム及びセパレーターを使用してこの標識細胞を磁気選別することによってクッパー細胞を除去する。残りの細胞集団を、１０％のウシ胎仔血清及び２％のグルタミンが添加されたダルベッコ製改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）入りの９６ウェル組織培養プレート上に接種する。細胞集団の純度を、抗ｍＳＩＧＮＲ１及び抗Ｆ４／８０を使用した表面マーカーに対するＦＡＣＳ染色による単離後３日目に調査する。ｍＳＩＧＮＲ１はクッパー細胞上には存在しない（1Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ外，２００２）。９０％の純度が実験を続行するのに十分であるとみなされる。実験当たり２個のマウスの肝臓を使用し、予期される収量は約２×１０7個の細胞である（Ｋｎｏｏｋ及びＳｌｅｙｓｔｅｒ，１９７６，マウスについて推定される収量）。
【００７０】
Ｔ細胞表現型アッセイ
Ｔ細胞アッセイは、ペプチド−抗体構築物が肝臓シヌソイド内皮細胞によるペプチドの提示を生じさせるかどうか及びペプチドの提示がＴ細胞の表現型の変化を誘導し得るかどうかを証明する。肝臓シヌソイド内皮細胞を平底マイクロタイタープレート内で１×１０5細胞／ウェルの密度で培養する。シヌソイド細胞を３日間にわたって保持した後に、ＣＤ４+Ｔ細胞を上記のように生後３週間及び生後８週間のＮＯＤマウス又は生後４〜６週間のバルブ／ｃマウスから精製し、そして１０4又は１０5細胞／ウェルで添加する。また、０．１〜５ｐｇ／ウェルの濃度でそれぞれの抗体−ペプチド構築物も添加する。ポジティブコントロールとして、それぞれのＧＡＤ及びコントロールのペプチド自体を含める。ペプチドをＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，カリフォルニア）で合成する。ネガティブコントロールのウェルは、Ｔ細胞単独又は肝臓シヌソイド単独を含む。
【００７１】
Ｔ細胞に対するＬＳＥＣによるペプチド提示について４つの見込まれる結果が存在する：（１）ＴＧＦ−Ｐ及び／又はＩＬ−１０とＩＬ−４の産生或いはＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ６２Ｌの発現によって特徴付けられる調節Ｔ細胞の誘導、（２）Ｔ細胞の欠損又は（３）完全な欠落又は応答、（４）また、ペプチド提示は、応答を誘導する代わりに、Ｔｈ１細胞産生ＩＬ−２の刺激を生じさせることも考えられる。これらの可能性を区別するために、培地の上澄み（各１００ｐＬ）を２４時間及び４８時間目に集め、そして以下に説明するようにサイトカイン産生についてアッセイする。生後３週間のＴ細胞応答を生後８週間のＮＯＤマウスのＴ細胞並びにＧＡＤに対する自発的応答を示さないバルブ／ｃマウス由来Ｔ細胞と比較する。アッセイを３重に設定し、そして２回繰り返す。Ｔ細胞の混合物を使用するため、上澄み液におけるサイトカイン応答は、容易には確認できないかもしれない。しかしながら、細胞の混合物は、生体内での状況を反映し、そしてＧＡＤ特異的Ｔ細胞応答は、全脾臓細胞を使用して確認される（Ｔｉｓｃｈ外，１９９３）。
【００７２】
調節Ｔ細胞の誘導についてのより敏感な基準として、細胞を培養３日後にＦＡＣＳ分析によってＣＤ２５、ＣＤ４及びＣＤ６２Ｌ（Ｌａｆａｉｌｌｅ及びＬａｆａｉｌｌｅ，２００２）のような典型的な表面マーカーの発現について評価する。全ての試薬はＢＤ−ファルミンゲン社から購入できる。また、ＩＬ−４産生もＦＡＣＳによって分析する。以下に説明するようなＬＳＥＣ／ペプチド露出Ｔ細胞の潜在的な免疫抑制特性の機能試験がこの系における寛容誘導についての最終的な試験である。ＬＳＥＣによって提示されたペプチドが細胞死を誘導する可能性を、ロシュ製細胞死ＥＬＩＳＡキットを使用して該メーカーの指示に従い培地の上澄み液中で評価する。
【００７３】
脾臓細胞及びＣＤ４+Ｔ細胞の単離
ＮＯＤ又はバルブ／ｃマウスからの脾臓を滅菌環境中で取り出し、研究所において日常的に実行されるようにＰＢＳ中に置く。細胞を１８〜２１ゲージ針を使用して分離し、そしてより大きな断片を沈降させる。上澄み液を取り出し、そして２００Ｇで７分間遠心分離する。赤血球細胞を脾臓当たり５ｍＬの０．８３％ＮＨ4Ｃｌを使用して溶解させる。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで培地に再懸濁させる。ある種の実験については、全脾臓細胞を使用する。その他の実験については、ＣＤ４+Ｔ細胞をＭｉｌｔｅｎｙｉ社製（カリフォルニア州オーバーン）ＣＤ４+Ｔ細胞単離キットを使用して該メーカーの指示に従い単離する。様々な細胞集団の磁気単離は、当業者の範囲内にある。一つの方法では、単離は、ＣＤ８ａ、ＣＤＩ１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、ＤＸ５及びＴｅｒ−１ １９に対するビオチン結合モノクローナル抗体のカクテルを使用する非ＣＤ４+Ｔ細胞の枯渇に基づく。単離された集団の純度をＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、ＰＥ結合抗ＣＤ８、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１１ｂ及びｃｙ−５結合ＣＤ４５Ｒ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，カリフォルニア州サンディエゴ）の混合物の染色によって評価する。予期される純度は７０％の収率で９０〜９５％である。少なくとも１×１０8個の細胞がマウス脾臓から得られ、そして脾臓細胞の約２５％がＣＤ４+であるから、１７５個の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルには十分な約１．７５×１０7個の細胞が得られ得る。
【００７４】
サイトカイン産生の測定
Ｔ細胞／ＬＳＥＣ同時培養の上澄み液中におけるＩＬ−１０、ＴＧＦ−Ｐ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２の存在を標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって説明通りに決定する（Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ及びＲｕｂｉｎ，１９９７）。全ての抗体のペアは、ＢＤ−ファルミンゲン社から購入できる。サイトカイン捕捉抗体をＰＢＳ中でプレート上に一晩４℃でコートする。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後に、培地の上澄み液とマウス組換えサイトカインの基準曲線とを加え、そしてシェーカー上で２時間室温でインキュベートする。プレートを再度洗浄し、そして結合したサイトカインをアルカリ性ホスファターゼ結合抗サイトカイン抗体で検出する。３回洗浄した後に、Ｓｉｇｍａ１０４（登録商標）基質を添加し、そしてこのプレートをＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用してＯＤ405で様々な時点で読む。
【００７５】
例６：ＬＳＥＣ上に提示されたＧＡＤペプチドさらされたＴ細胞がその後にＧＡＤを提示するプロフェッショナルＡＰＣによる自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害し得るかどうかの評価
さらなる実験において、肝臓シヌソイド内皮細胞上のペプチドに３日間にわたってさらされたＴ細胞が脾臓プロフェッショナルＡＰＣ上に提示されるペプチドによる自己反応性Ｔ細胞の活性化を負に調節し得るかどうかを試験する。試験管内で調節特性を有するＴ細胞が誘導される可能性が多数の研究所によって示されている（Ｗａｋｋａｃｈ外，２００１；Ｂａｒｒａｔ外，２００２；Ｔｈｏｒｔｏｎ及びＳｈｅｖａｃｈ，１９９８）。免疫抑制特性は、免疫刺激が正常に観察される培養系に調節Ｔ細胞を添加することによって試験できる。ＡＰＣとＴ細胞の両方を含む生後７週間のＮＯＤマウス由来の脾臓細胞へのＧＡＤペプチドの添加は、強力な増殖応答によって示されるような免疫活性化系を与える。調節Ｔ細胞の添加は、この応答を排除させる。１０5又は１０6個の脾臓細胞をＬＳＥＣ及びペプチド結合抗体にさらされたＴ細胞を含有するウェル当たり０．１、１又は１０μｍのペプチドと共に添加する。コントロールのウェルは、脾臓細胞をペプチド単独及びＬＳＥＣ+Ｔ細胞単独と共に含む。さらに、推定される調節Ｔ細胞が増殖に有意に寄与することを排除するために、コントロールのウェルは、放射線照射を受けた脾臓細胞（６００ＲＡＤ、Ｊｏｅ ＡｇｕｉｌｅｒａによるＵＣＳＤ照射サービス施設で実行される）と、予めＬＳＥＣにさらされたＴ細胞と、ペプチド−抗体構築物とをも含む。放射線照射を受けた脾臓細胞は抗原を提示できるが、増殖はしない。１μＣｉ3Ｈ−チミジンを増殖のための読み取りとして新たに合成されたＤＮＡを標識するための７２時間培養期間の最後の１６時間の間にそれぞれのウェルに添加する。細胞をパッカード社製Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒを使用して採取し、そして取り込まれた3Ｈ−ヒスチジンをＴｏｐｃｏｕｎｔ（パッカード）を使用して評価する。脾臓細胞及び予めＬＳＥＣ+ペプチドにさらされたＴ細胞を含有する培地中での3Ｈチミジンの取り込みが脾臓細胞培地と比較して減少する場合には、Ｔ細胞は、調節特性によってうまく誘導されている。ペプチド結合抗ｍＳＩＧＮＲ１抗体がＮＯＤマウスにおいて調節Ｔ細胞を誘導し得るかどうか、また病気が停止し得るかどうかも試験する。
【００７６】
例７
マウスの抗ヒトＬ−ＳＩＧＮ抗体を組換えファージ技術を使用して同定した。組換えヒトＬ−ＳＩＧＮで免疫化されたマウスの重鎖及び軽鎖の組み合わせから得られたマウスライブラリー（ＩｇＧ１ｋ及びＩｇＧ２ａｋ）をＷＯ０３／０２５２０２に開示された方法によって調製した（その内容は、引用によってここに加えるものとする）。いったん調製したら、これらのライブラリーをまずヒトＤＣ−ＳＩＧＮ上でパニングしてＤＣ−ＳＩＧＮと交差反応する抗体を除去した。結合していない上澄み液をＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応するクローンを選択するために使用した。これらの２つのライブラリー（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ）のそれぞれについて９５個のコロニー（３６／ラウンド）の全てを誘導し、そして抗体産生及びそれらのＬ−ＳＩＧＮとの反応性を捕捉ＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に説明すると、抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩＳＡプレート上に５００ｎｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＬ−ＳＩＧＮを添加した。プレートをＰＢＳで洗浄した後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベートした後に、プレートを３回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体を２時間にわたって添加した。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用して評価した。
【００７７】
これらのクローンの大部分は、抗体がファージ上に良好に結合（ＯＤ405＞１．０）していることを示した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａライブラリーの両方からのいくつかのクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとの積極的な反応性を示した。結果を図４及び５に示す：図４は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１クローンとの反応性を表している。図５は、ヒトＬ−ＳＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を表している。
【００７８】
例８
ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応するクローンを同定するために、バックグラウンドの５倍以上のＯＤ値を有する例７からのクローンの全てを選択してそれらのヒトＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性をＥＬＩＳＡによって試験した。抗ヒトＦｃ（Ｃａｌｔａｇ）をＥＬＩＳＡプレート上で５００ｎｇ／ｍＬで一晩コートした。これらのプレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックし、次いで２μｇ／ｍＬの組換えＤＣ−ＳＩＧＮを添加した。プレートをＰＢＳで洗浄した後に、上澄み液を添加した。室温で１２時間インキュベートした後に、プレートを３回洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼ結合抗Ｆａｂ抗体を２時間にわたって添加した。ＳｉｇｍａＳ基質の添加後のシグナルをＥＬＩＳＡ読み取り装置（モレキュラー・デバイセズ）を使用して評価した。
【００７９】
ＩｇＧ１ライブラリーからの１０個のクローン及びＩｇＧ２ａライブラリーからの３個のクローンは、ヒトＬ−ＳＩＧＮとユニークに反応することが分かった（ＤＣ−ＳＩＧＮに対して５〜１０倍高いＯＤ値）。結果を図６及び７に示す：図６は、Ｌ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ１ポジティブクローンとの反応性を示している。図７は、Ｌ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとＩｇＧ２ａクローンとの反応性を示している。
【００８０】
例９
ヒトＬ−ＳＩＧＮのみと反応するものとして同定された１３個のクローンと、例８において同定されたようなＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮの両方と強く反応する９個のクローンとの配列を解読してユニーククローンの数を決定した。配列は、当業者に周知の技術によって決定した。これらのクローンの配列を図８及び９に示す：重鎖クローンについての配列を図８Ａ〜８Ｃに示しており（配列番号１７〜３６）、軽鎖クローンについての配列を図９Ａ〜９Ｂに示している（配列番号３７〜５５）。
【００８１】
配列決定の結果から、軽鎖と比較してさらに多様な重鎖の群が明らかになった。また、これらの抗体クローンの多様性を異なる軽鎖と同一の重鎖とを交差対合させることによっても高めた。Ｌ−ＳＩＧＮと反応する５個のユニーククローンの全てを同定し、そしてクローンをそれらのアミノ酸配列の類似性に基づき分類した（以下の表１参照）。
【００８２】
【表１】
【００８３】
配列決定のために選択されたクローンとＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性（ＯＤ値）を以下の表２に示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
図８に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の重鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＬＧＧＬ（配列番号５６）；ＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号５７）；ＧＬＦＹＧＹＡＷＦＮ（配列番号５８）のうちの一つを有することが分かった。図９に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＱＱＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号５９）；ＱＱＳＮＥＤＰＲＴ（配列番号６０）；ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号６１）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号６２）のうちの一つを有することが分かった。
【００８６】
例１０
上の例７からの追加のクローンを、例７に記載した手順を使用して、それらのものがＬ−ＳＩＧＮに結合する能力について試験した。配列は、当業者に周知の技術によって決定した。これらの追加のクローンについての配列を図１０に示す（配列番号６３〜８２）。図１０に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する抗体の５個の追加の重鎖ＣＤＲ３領域は、次のアミノ酸配列：ＰＳＤＮＳＹＡＷＦＡ（配列番号８３）；ＱＡＴＴＴＡＦＤ（配列番号８４）；ＴＡＴＡＬＳＴＭＤ（配列番号８５）；ＮＤＹＹＷＧＦＧ（配列番号８６）；ＴＡＴＡＬＹＴＭＤ（配列番号８７）；及びＥＦＴＴＫＡＬＤ（配列番号８８）のうちの一つを有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＭＩＤＰＳＮＳＥＡＲＬＮＱＲＦＫＤ（配列番号８９）；ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号９０）；ＮＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９１）；ＶＩＷＲＧＧＮＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（配列番号９２）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９３）；ＮＩＤＰＹＹＧＧＳＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号９４）；及びＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号９５）のうちの一つを有することが分かった。
【００８７】
表３は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ１ｋ抗体クローンを示している。
【００８８】
【表３】
【００８９】
表４は、追加のＩｇＧ１ｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに組換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示している。
【００９０】
【表４】
【００９１】
図１１に示されるように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加のクローンを同定した（配列番号９６〜１１５）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＹＨＲＳＰＱＴ（配列番号１１６）；ＣＱＱＦＴＳＳＰＳ（配列番号１１７）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号１１８）；ＱＱＹＳＧＹＰＧＴ（配列番号１１９）；ＨＱＹＨＲＳＰＰＭＴ（配列番号１２０）；ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号１２１）；ＱＱＹＳＳＹＰＦＴ（配列番号１２２）；ＱＱＮＮＥＤＰＰＴ（配列番号１２３）；ＱＱＹＳＧＹＳＬＴ（配列番号１２４）；ＱＱＹＳＧＹＰＬＭＬＴ（配列番号１２５）；ＱＱＹＧＧＹＰＬＴ（配列番号１２６）；ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１２７）；ＱＱＹＳＧＳＰＬＴ（配列番号１２８）のうちの一つを有するＩｇＧ１ｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＳＴＳＮＬＡＳＧ（配列番号１２９）；ＬＡＳＮＬＥＳＧ（配列番号１３０）；ＳＴＳＮＱＡＰＧ（配列番号１３１）；ＷＡＳＴＲＨＴＧ（配列番号１３２）のうちの一つを有することが分かった。
【００９２】
表５は、Ｌ−ＳＩＧＮを発現する細胞との反応性に基づき選択された追加のＩｇＧ２ａｋ抗体クローンを示している。
【００９３】
【表５】
【００９４】
表６は、追加のＩｇＧ２ａｋ抗体クローンと、Ｌ−ＳＩＧＮ（相乗平均蛍光度）並びに組換えＬ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮ蛋白質（ＯＤ値）を発現する細胞との反応性を示している。
【００９５】
【表６】
【００９６】
図１２に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の重鎖クローンを同定した（配列番号１３３〜１５４）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＴＲＥＦＴＴＫＡＬＤ（配列番号１５５）；ＴＲＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号１５６）；ＡＲＴＡＴＡＬＹＴＭＤ（配列番号１５７）；ＬＲＴＬＰＣＩ（配列番号１５８）；ＳＲＥＦＴＴＫＡＭＤ（配列番号１５９）；ＡＲＱＬＸＸＹＦＸＭＤ（配列番号１６０）のうちの一つを有するＩｇＧ２ａｋ重鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＴＩＳＳＧＧＳＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６１）；ＮＩＤＰＹＹＤＳＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６２）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６３）；ＴＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６４）；ＸＦＸＴＤＷＦＹＸＴ（配列番号１６５）；ＮＦＤＰＹＹＧＶＩＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１６６）；ＴＩＳＳＧＧＧＦＴＹＹＰＤＮＶＫＧ（配列番号１６７）；ＸＩＹＰＧＴＤＮＴＹＹＮＥＸＦＫＧ（配列番号１６８）のうちの一つを有することが分かった。
【００９７】
図１３に示すように、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合する追加の軽鎖クローンを同定した（配列番号１６９〜１８９）。これらのクローンは、次のアミノ酸配列：ＱＱＮＮＥＤＰＹＴ（配列番号１９０）；ＳＧＹＰＬＴＦＧＳ（配列番号１９１）；ＨＲＳＰＰＭＴＦＧ（配列番号１９２）；ＱＱＮＮＥＤＰＦＴ（配列番号１９３）；ＹＳＧＹＰＬＴＦＧ（配列番号１９４）；ＮＴＬＰＬＴＦＧ（配列番号１９５）；ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号１９６）；ＬＱＮＮＥＤＰＹＴＦ（配列番号１９７）のうちの一つを有するＩｇＧ２ａｋ軽鎖ＣＤＲ３領域を有することが分かった。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲに結合したこれらのクローンのＣＤＲ２領域は、次のアミノ酸配列：ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１９８）；ＬＡＳＮＬＥＦ（配列番号１９９）；ＮＬＡＳＧＶＰ（配列番号２００）；ＮＬＡＳＧＶ（配列番号２０１）；ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２０２）のうちの一つを有することが分かった。
【００９８】
次の文献は、引用によってここに加えるものとする。
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【００９９】
上記記載は限定であると解釈すべきではなく、好ましい具体例の単なる例示であると解釈すべきである。当業者であれば、この開示の範囲及び精神内でその他の改変を考えるであろう。
【０１００】
ここに開示された具体例に対する様々な変更をなし得ることが理解されるであろう。例えば、当業者であれば認識するであろうが、ここに記載された特定の配列を、抗体又は抗体フラグメントの機能性に必ずしも悪影響を及ぼすことなく僅かに変更することができる。例えば、抗体配列における単一の又は複数のアミノ酸の置換を、抗体又はフラグメントの機能性を破壊することなく高い頻度でなし得る。従って、ここに記載される特定の抗体に対して７０％以上の相同性を有する抗体は、本発明の範囲内にあることを理解すべきである。特に有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体に対して約８０％以上の相同性を有する抗体が予期される。その他の有用な具体例では、ここに記載された特定の抗体に対して約９０％以上の相同性を有する抗体が予期される。従って、上記記載は、限定と解釈すべきでなく、好ましい具体例の単なる例示と解釈すべきである。当業者であれば、本発明の範囲及び精神内で様々な変更を考えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明に従う抗体／自己抗原構築物と抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞との相互作用を示す概略図である。
【図２Ａ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の重鎖アミノ酸配列（配列番号１〜６）を示す図である。
【図２Ｂ】ウサギ抗ｍＳＩＧＮＲ１ｓｃＦｖ抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号７〜１２）を示す図である。
【図３】抗体ペプチド構築物産生用ベクターの一部分の概略図である。
【図４】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図５】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図６】ＩｇＧ１クローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図７】ＩｇＧ２ａクローンとヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲ及びＤＣ−ＳＩＧＮとの反応性を示す本発明に従う試験管内実験の結果についてのグラフ図である。
【図８Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図８Ｃ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１７〜３６）を示す図である。
【図９Ａ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図９Ｂ】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号３７〜５５）を示す図である。
【図１０】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号６３〜８２）を示す図である。
【図１１】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号４６〜２２６）を示す図である。
【図１２】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の重鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１３３〜１５４）を示す図である。
【図１３】ＤＣ−ＳＩＧＮＲと反応する追加の軽鎖クローンのアミノ酸配列（配列番号１６９〜１８９）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の治療方法であって、
抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合した自己抗原を含有する抗体／自己抗原構築物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項２】
糖尿病の治療方法であって、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される自己抗原であって抗原提示細胞受容体に対する抗体に結合したものを含有する抗体／自己抗原構築物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、糖尿病の治療方法。
【請求項３】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原受容体を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲよりなる群から選択される抗原内在化受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される自己抗原を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体がＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞上の受容体に対する抗体をある種のペプチドに結合させてなる抗体／ペプチド構築物。
【請求項９】
ペプチドが自己抗原である、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１０】
抗体が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞上の受容体に対するものである、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１１】
抗体が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対するものである、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１２】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される、請求項９に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１３】
抗体に結合した毒素をさらに含む、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１４】
抗体に結合した毒素が腫瘍細胞毒素に対するものである、請求項１３に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１５】
請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
抗原提示細胞の受容体に対する抗体を自己抗原に結合させることを含む、組換えによって改変抗体を作製するための方法。
【請求項１７】
自己抗原を樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自己抗原をＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対する抗体に結合させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項２３】
ウイルスが肝細胞に入るのを阻害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項２５】
請求項２３に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項１】
自己免疫疾患の治療方法であって、
抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合した自己抗原を含有する抗体／自己抗原構築物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項２】
糖尿病の治療方法であって、
グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される自己抗原であって抗原提示細胞受容体に対する抗体に結合したものを含有する抗体／自己抗原構築物を準備し、
該抗体／自己抗原構築物を被検体に投与すること
を含む、糖尿病の治療方法。
【請求項３】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原受容体を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ及びＤＣ−ＳＩＧＮＲよりなる群から選択される抗原内在化受容体に対する抗体を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
抗体／自己抗原構築物を準備する段階が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される自己抗原を含有する抗体／自己抗原構築物を準備することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体がＤＣ−ＳＩＧＮＲ又はＤＣ−ＳＩＧＮＲの変異体を認識する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞上の受容体に対する抗体をある種のペプチドに結合させてなる抗体／ペプチド構築物。
【請求項９】
ペプチドが自己抗原である、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１０】
抗体が、樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞上の受容体に対するものである、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１１】
抗体が、ＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対するものである、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１２】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される、請求項９に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１３】
抗体に結合した毒素をさらに含む、請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１４】
抗体に結合した毒素が腫瘍細胞毒素に対するものである、請求項１３に記載の抗体／ペプチド構築物。
【請求項１５】
請求項８に記載の抗体／ペプチド構築物及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
抗原提示細胞の受容体に対する抗体を自己抗原に結合させることを含む、組換えによって改変抗体を作製するための方法。
【請求項１７】
自己抗原を樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞のクッパー細胞及びＢ細胞よりなる群から選択される抗原提示細胞の受容体に対する抗体に結合させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
自己抗原をＤＥＣ−２０５、マンノース受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＭＨＣ、トール受容体、ランゲリン、アシアロ糖蛋白質受容体、β−グルカン受容体、Ｃ型レクチン受容体及び樹状細胞免疫受容体よりなる群から選択される受容体に対する抗体に結合させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
自己抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＧＡＤのエピトープ、インスリン、インスリンのエピトープ、熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）、ＨＳＰのエピトープ及びβ細胞抗原よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＣ−ＳＩＧＮＲ発現細胞とＩＣＡＭ発現細胞との相互作用を妨害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項２３】
ウイルスが肝細胞に入るのを阻害するＤＣ−ＳＩＧＮＲに対する抗体。
【請求項２４】
請求項２３に記載の抗体を含むワクチン。
【請求項２５】
請求項２３に記載の抗体及び薬剤として許容できるキャリアを含む組成物。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図９Ａ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図９Ａ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００６−５２１３８７（Ｐ２００６−５２１３８７Ａ）
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９０７４（Ｐ２００６−５０９０７４）
【出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６５７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５４３
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６５７０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９１５４３
【国際公開日】平成１６年１０月２８日（２００４．１０．２８）
【出願人】（５０３１０２６７４）アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (51)
【Ｆターム（参考）】
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