小さなＲＮＡ分子を定量するための方法
一態様において、本発明は、ＤＮＡ分子を作製するために、ミクロＲＮＡ分子を増幅するための方法、組成物及びキットを提供する。この方法は、それぞれ、（ａ）標的ミクロＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子を作製するためにプライマー伸長を使用する工程；並びに（ｂ）前記ＤＮＡ分子を増幅して増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する工程を含む。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小さなＲＮＡ分子を増幅及び定量するための方法、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を阻害するように機能する進化的に保存されたプロセスである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−６；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：４５７−６７）。ＲＮＡｉの現象は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）中に最初に記載され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注入は、このｄｓＲＮＡに相補的なｍＲＮＡの効率的な配列特異的遺伝子発現停止をもたらした（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：８０６−１１）。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子発現停止（ＰＴＧＳ）と称される現象として植物中にも記載されており、ウイルス防御機構として使用されていると思われる（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３４０−４；Ｂｒｉｇｎｅｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：６７３９−４６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＆ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−２）。
【０００３】
ＰＴＧＳを制御する分子がより長いｄｓＲＮＡから加工された短いＲＮＡであることを示唆する初期の証拠は、植物中のより長いｄｓＲＮＡに由来する２１から２２の短いヌクレオチドｄｓＲＮＡの同定であった（Ｈａｍｉｌｔｏｎ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−２）。この観察は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の胚抽出物中においても繰り返され、ＲＮアーゼＩＩＩ型酵素（Ｄｉｃｅｒ）によって、長いｄｓＲＮＡが２１から２５ヌクレオチドの短いＲＮＡへ加工されることが見出された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−８８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５：１８８−２００）。これらの観察から、Ｅｌｂａｓｈｉｒ他は、合成２１から２５のヌクレオチドの合成ｄｓＲＮＡがドロソフィラ胚の可溶化液及び哺乳動物細胞培養中で遺伝子発現を特異的に阻害するように機能するかどうかを調べた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ． ２０：６８７７−８８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５：１８８−２００）。Ｅｌｂａｓｈｉｒ他は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インターフェロン応答の誘導なしに、哺乳動物細胞培養中で遺伝子発現を特異的に阻害する能力を有することを示した。
【０００４】
これらの観察から、ヘアピンｓｉＲＮＡを作製するプラスミドを基礎とするシステムなど、哺乳動物細胞培養中の特異的遺伝子の発現を低下又は喪失させるための技術が開発されるに至った（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−３；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７６：９４８−５８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４４３−８；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４０４−８）。ｓｉＲＮＡ分子は、特定のタンパク質の発現をインビボで阻害するために、細胞中へ導入することもできる（例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４）参照）。
【０００５】
ｓｉＲＮＡ分子は、特異的タンパク質の発現を阻害するための治療剤としても、病状に関与するタンパク質の発現を制御するように機能するｓｉＲＮＡ分子の活性に影響を及ぼす薬物に対する標的としても有望である。このような治療剤を開発する上での第一の工程は、生物内の様々な細胞種中での特定のｓｉＲＮＡ分子の量を測定することにより、体内でのｓｉＲＮＡ発現の「地図」を作成することである。さらに、所定の刺激に応答した又は病状における、特定の細胞種中での特異的ｓｉＲＮＡ分子の量の変化を測定することが有用である。
【０００６】
低ＲＮＡ分子は、定量することが困難である。例えば、小ＲＮＡ分子を増幅及び測定するためのＰＣＲの使用に関して、多くのＰＣＲプライマーは小ＲＮＡ分子より長いので、小ＲＮＡ分子と大幅に重複し、プライマー伸長及びＰＣＲ増幅反応のために使用される温度で小ＲＮＡ分子へ選択的にハイブリッド形成するプライマーを設計することが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ４０９、２００１年、ｐｐ．３６３−６
【非特許文献２】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２００３年、ｐｐ．４５７−６７
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ ３９７、１９９８年、ｐｐ．８０６−１１
【非特許文献４】Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、１９９０年、ｐｐ．３４０−４
【非特許文献５】Ｂｒｉｇｎｅｔｉ他、ＥＭＢＯ Ｊ．１７、１９９８年、ｐｐ．６７３９−４６
【非特許文献６】Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＆ ＢａｕｌｃｏｍｂｅＳｃｉｅｎｃｅ ２８６、１９９９年、ｐｐ．９５０−２
【非特許文献７】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ４１１、２００１年、ｐｐ．４９４−８
【非特許文献８】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．２０、２００１年、ｐｐ．６８７７−８８
【非特許文献９】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５、２００１年、ｐｐ．１８８−２００
【非特許文献１０】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６、２００２年、ｐｐ．５５０−３
【非特許文献１１】Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７６、２００２年、ｐｐ．９４８−５８
【非特許文献１２】Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、２００２年、ｐｐ．１４４３−８
【非特許文献１３】Ｐａｕｌ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、２００２年、ｐｐ．４０４−８
【非特許文献１４】Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，他、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）、２００４年、ｐｐ．１７３−１７８
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。キットは、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な少なくとも１つのプライマーの組を含み、プライマーの組は、（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー（伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡにハイブリッド形成する第一の部分及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を有する第二の部分を含む。）；（２）伸長プライマー上のハイブリッド形成配列にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー並びに（３）ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含み、前記少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８からなる群から選択される。一実施形態において、ユニバーサルフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの少なくとも１つは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む少なくとも１つの核酸分子を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、生物から得た試料中の類似の配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記二一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；並びに（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ｃＤＮＡ分子を作製するために、ミクロＲＮＡ分子を増幅するための方法を提供する。この方法は、（ａ）プライマー伸長を用いて、標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；並びに（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程を含む。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。本発明を実施する際には、通例、個別のミクロＲＮＡ分子の多数（例えば、何百万）が試料（例えば、生きた細胞から単離されたＲＮＡ分子の溶液）中において増幅される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、生物から得た試料中の標的ミクロＲＮＡの量を測定するための方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する工程を含み、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）プライマー伸長を用いて、前記試料中の前記標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（２）ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために前記第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；及び（３）前記増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程を含む方法によって測定される。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号１から配列番号４９９の配列からなる核酸プライマー分子を提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な１つ又はそれ以上のプライマーの組を含み、各プライマーの組が（１）標的ミクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー、（２）ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー及び（３）前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリッド形成する第一の部分と及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を含む第二の部分とを含む。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む。キットの幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。本発明のキットは、本発明の方法の様々な実施形態を実施するために使用し得る。
【００１６】
本発明の方法、組成物及びキットは、例えば、生物中の細胞の異なる種類中の特異的ミクロＲＮＡ分子を定量するために有用であり、又は、例えば、刺激に応答した（例えば、薬物の投与に応答した）生きた細胞中の特異的ミクロＲＮＡの量の変化を測定するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の前記態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるようになるので、より容易に理解されるようになる。
【図１】図１は、本発明の代表的な方法のフローチャートを示している。
【図２】図２は、実施例３に記載されているように、ミクロＲＮＡ標的であるｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４の検出に対して特異的なアッセイのための標準曲線をグラフとして図示している。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１２４の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１５０の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記記載に従い、一態様において、本発明は、ｃＤＮＡ分子を作製するために、ミクロＲＮＡ分子を増幅するための方法を提供する。この方法は、（ａ）標的ミクロＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子を作製するためにプライマー伸長を使用する工程；並びに（ｂ）前記ＤＮＡ分子を増幅して増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する工程を含む。この方法の幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００１９】
本明細書において使用される「鍵型核酸分子」（ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）分子と略称される。）という用語は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む核酸分子を表す。２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分の例及びこのような部分を含むＬＮＡの例は、例えば、「Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（２）：７４−８１（２００３）」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００２０】
本明細書において使用される「ミクロＲＮＡ」という用語は、２１ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの範囲の長さを有するＲＮＡ分子を表す。幾つかのミクロＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、生きた細胞中で遺伝子発現を制御するように機能する。
【００２１】
本発明の代表的な方法。図１は、本発明の代表的な方法のフローチャートを示す。図１に示されている方法において、ミクロＲＮＡは相補的な第一のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートである。第一のＤＮＡ分子の合成は、伸長プライマーによって開始され、従って、第一のＤＮＡ分子は伸長プライマー及び新たに合成されたＤＮＡ（図１中において、点線によって表される。）を含む。ＤＮＡの合成は、逆転写酵素によって触媒される。
【００２２】
伸長プライマーは、第一の部分（図１中で、ＦＰと略称されている。）及び第二の部分（図１中で、ＳＰと略称されている。）を含む。第一の部分はミクロＲＮＡ標的テンプレートにハイブリッド形成し、第二の部分は、以下に記載されているように、ユニバーサルフォワードプライマーとハイブリッド形成する核酸配列を含む。
【００２３】
第一のＤＮＡ分子に相補的な第二のＤＮＡ分子を作製するために、定量的なポリメラーゼ連鎖反応が使用される。第二のＤＮＡ分子の合成は、標的の第一のＤＮＡ分子の一部に特異的にハイブリッド形成するように選択された配列を有するリバースプライマーによって開始される。従って、リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子以外の核酸分子に対してハイブリッド形成しない。
【００２４】
リバースプライマーは、伸長プライマーと重複しないリバースプライマーの一部の中に位置する少なくとも１つのＬＮＡ分子を場合によって含み得る。図１において、ＬＮＡ分子は、影付きの楕円によって表されている。
【００２５】
ユニバーサルフォワードプライマーは、第二のＤＮＡ分子の３’末端に対してハイブリッド形成し、第三のＤＮＡ分子の合成を開始する。図１には、単一のミクロＲＮＡ分子、単一の第一のＤＮＡ分子、単一の第二のＤＮＡ分子、単一の第三のＤＮＡ分子並びに単一の伸長、フォワード及びリバースプライマーが示されているが、通例、本発明の実施は、前記核酸分子の各々の多数のコピー（例えば、何百万のコピー）を含む反応混合物を使用することが理解される。
【００２６】
ここで、本発明の方法の工程を、より詳しく考察する。
【００２７】
テンプレートとして有用なミクロＲＮＡ分子の調製。本発明の方法におけるテンプレートとして有用なミクロＲＮＡ分子は、あらゆる生物（例えば、哺乳動物などの真核生物）又はその一部（臓器、組織及び／又は各細胞（培養された細胞を含む。）を含む。）から単離することができる。ミクロＲＮＡを含むあらゆる適切なＲＮＡ調製物（全細胞ＲＮＡなど）を使用することができる。
【００２８】
ＲＮＡは、細胞の溶解及び細胞中に含有されるタンパク質の変性を含む手順によって細胞から単離され得る。興味深い細胞には、野生型細胞、薬物に曝露された野生型細胞、被修飾細胞及び薬物に曝露された被修飾細胞が含まれる。
【００２９】
ＤＮＡの幾つか又は全てを除去するために、さらなる工程を使用し得る。核を除去し、従って、細胞ＤＮＡの大部分を除去するために、非イオン性界面活性剤後に微小遠心を用いて細胞の溶解を達成し得る。一実施形態において、ＤＮＡからＲＮＡを分離するために、チオシアン酸グアニジニウム溶解後に、ＣｓＣｌ遠心を用いて、関心を有する様々な種類の細胞からＲＮＡが抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９参照）。ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、有機抽出によって、例えば、熱いフェノール又はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて実施することもできる。
【００３０】
所望であれば、溶解緩衝液にＲＮアーゼ阻害剤を添加し得る。同様に、ある種の細胞種に関しては、タンパク質変性／消化工程をプロトコールに付加することが望ましい場合があり得る。
【００３１】
ＲＮＡの試料は、それぞれの異なるミクロＲＮＡ分子が異なるヌクレオチド配列を有する、複数の異なるミクロＲＮＡ分子を含むことができる。特定の実施形態において、ＲＮＡ試料中のミクロＲＮＡ分子は、少なくとも１００の異なるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡ試料のミクロＲＮＡ分子は、少なくとも５００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００又は１００，０００の異なるヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明の方法は、あらゆるミクロＲＮＡの存在を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／で、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネット上に公表されている。）中に記載されているように、「ｍｉＲＢアーゼ配列データベース」などのデータベース中に記載されているミクロＲＮＡ標的の１つ又はそれ以上を検出するために使用され得る。典型的なミクロＲＮＡ標的のリストは、以下の参考文献：Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２（９）：７３５−９（２００２）中にも記載されている。
【００３３】
テンプレートとしてミクロＲＮＡ分子を用いたＤＮＡ分子の合成。本発明の方法の実施において、ミクロＲＮＡ標的分子と相補的であり、並びに伸長プライマー及び新たに合成されたＤＮＡ（伸長プライマーは、新たに合成されたＤＮＡの合成を開始する。）から構成される第一のＤＮＡ分子が合成される。各第一のＤＮＡ分子は、完全なミクロＲＮＡ標的分子又はその一部に対して相補的であり得るが、各第一のＤＮＡ分子は、通例、完全なミクロＲＮＡ標的分子に対して相補的である。従って、本発明の方法を実施する際には、それぞれ標的ミクロＲＮＡ分子の全部又は一部に対して相補的である各ＤＮＡ分子を含む第一のＤＮＡ分子の集団が合成される。
【００３４】
第一のＤＮＡ分子の合成は、逆転写酵素によって触媒される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ−ＲＴ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＲＴ）から得られるものなどの第一のＤＮＡ分子を合成するために、あらゆる逆転写酵素分子を使用することができる。この段階で合成される二本鎖ｃＤＮＡの量を最小限に抑えるために、ＲＮアーゼＨ活性を欠如する逆転写酵素（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， １６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ６４８２， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２００８によって販売されるＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＩＴＭ）が好ましい。また、ミクロＲＮＡ標的分子へのプライマーのハイブリッド形成を可能としながら、ＤＮＡ合成反応が可能な限り高温で行われ得るように、逆転写酵素分子は、好ましくは熱安定的であるべきである。
【００３５】
第一のＤＮＡ分子の合成を開始する。第一のＤＮＡ分子の合成は、伸長プライマーを用いて開始される。典型的には、伸長プライマーの長さは、１０個のヌクレオチドから１００個のヌクレオチド（２０から３５ヌクレオチドなど）の範囲にある。伸長プライマーの核酸配列は、合成された各ＤＮＡの配列中に取り込まれる。伸長プライマーは、ミクロＲＮＡ分子の一部にハイブリッド形成する第一の部分を含む。典型的には、伸長プライマーの第一の部分は伸長プライマーの３’末端を含む。典型的には、伸長プライマーの第一の部分は、１０ヌクレオチドから１２ヌクレオチドなど、６ヌクレオチドから２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、伸長プライマーの第一の部分は、３ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００３６】
伸長プライマーは、１８から２５ヌクレオチドの長さを典型的に有する第二の部分も含む。例えば、伸長プライマーの第二の部分は、２０ヌクレオチド長であり得る。伸長プライマーの第二の部分は、伸長プライマーの第一の部分の５’側に位置する。伸長プライマーの第二の部分は、ユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の少なくとも一部を含む。例えば、伸長プライマーの第二の部分は、ユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の全てを含むことが可能であり、又はユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の単一ヌクレオチドを含むことができる（フォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の残りの部分は、例えば、伸長プライマーの第一の部分中に位置し得る。）。伸長プライマーの第二の部分の典型的な核酸配列は、５’ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ３’（配列番号１）である。
【００３７】
ＤＮＡ分子の増幅。本発明の方法を実施する際には、第一のＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、酵素的に増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応を開始するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーが使用される。リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子の一部に対して特異的にハイブリッド形成するように選択された核酸配列を含む。
【００３８】
リバースプライマーは、通例、１０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、リバースプライマーは、１２ヌクレオチドから２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。リバースプライマーのヌクレオチド配列は、所定のハイブリッド形成条件下で、特異的な標的ヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成するように選択される。リバースプライマー及び伸長プライマーは何れも、ＰＣＲ反応混合物中に存在するので、融点（Ｔｍ）が少なくとも５０℃であるように、リバースプライマーは十分に長くすべきであるが、「プライマー二量体」の形成を引き起こし得る伸長プライマーとの大規模な重複が存在するほど長くすべきではない。リバースプライマーが伸長プライマーとハイブリッドを形成し、ＤＮＡ合成のための基質として伸長プライマーを使用するときに、及び伸長プライマーがリバースプライマーとハイブリッドを形成し、ＤＮＡ合成のための基質としてリバースプライマーを使用するときに、「プライマー二量体」が形成される。「プライマー二量体」の形成を避けるために、リバースプライマーと伸長プライマーは６ヌクレオチドを超えて互いに重複しないように通例設計される。少なくとも５０℃のＴｍを有するリバースプライマーを作製することが可能でなく、リバースプライマー及び伸長プライマーが６ヌクレオチドを超えて重複していなければ、リバースプライマーの長さを長くし（オリゴヌクレオチド長が増加するにつれて、通例、Ｔｍは増加するので）、伸長プライマーの長さを減少させることが好ましい。
【００３９】
リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子に相補的である第二のＤＮＡ分子の合成を開始する。ユニバーサルフォワードプライマーは、第一のＤＮＡ分子の全ての中に取り込まれた伸長プライマーの第二の部分に対して相補的な第二のＤＮＡ分子の一部とハイブリッドを形成する。ユニバーサルフォワードプライマーは、第三のＤＮＡ分子の合成を開始させる。ユニバーサルフォワードプライマーは、通例、１６ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマーは、１６ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ユニバーサルフォワードプライマーは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含み得る。幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマーは、１から２５の鍵型核酸分子を含む。典型的なユニバーサルフォワードプライマーの核酸配列が、配列番号１３に記載されている。
【００４０】
一般に、ポリメラーゼ連鎖反応の間の増幅サイクルの数が増加するほど、得られる増幅されたＤＮＡの量は増加する。他方、増幅サイクルが多すぎると（例えば、３５を超える増幅サイクル）、非標的二本鎖ＤＮＡの意図せぬ誤った増幅がもたらされ得る。従って、幾つかの実施形態において、増幅サイクルの望ましい数は、１と４５の間の増幅サイクル（１から２５の増幅サイクルなど、又は５から１５の増幅サイクルなど、又は１０の増幅サイクルなど）である。
【００４１】
ＬＮＡ分子の使用及びプライマーハイブリッド形成条件の選択。基質分子上の相補的配列へのプライマー分子の特異的ハイブリッド形成を促進するハイブリッド形成条件が選択される。伸長プライマーの１２ヌクレオチドの第一の部分のミクロＲＮＡへのハイブリッド形成に関して、特異的ハイブリッド形成は５０℃の温度で起こることが見出された。同様に、相補的なＤＮＡ分子への２０ヌクレオチドのユニバーサルフォワードプライマーのハイブリッド形成及び相補的なＤＮＡ分子への（１２から２０ヌクレオチドの範囲の（１４から１６ヌクレオチドなど）長さを有する）リバースプライマーのハイブリッド形成は５０℃の温度で起こることが見出された。例として、それぞれが５０℃から６０℃の範囲のハイブリッド形成温度を有する伸長、リバース及びユニバーサルフォワードプライマーを設計することがしばしば望ましい。
【００４２】
幾つかの実施形態において、伸長プライマー、リバースプライマー及びユニバーサルフォワードプライマーの１つ又はそれ以上のＴｍを少なくとも５０℃まで上昇させるために、前記プライマーの少なくとも１つの中にＬＮＡ分子を取り込ませることができる。標的の第一のＤＮＡ分子にハイブリッド形成するが、伸長プライマーにはハイブリッド形成しないリバースプライマーの部分は、通例、１０ヌクレオチド長以下であるので、この部分の中にＬＮＡ分子を取り込ませることは有用であり得る。例えば、標的の第一のＤＮＡ分子にハイブリッド形成するが、伸長プライマーにはハイブリッド形成しないリバースプライマーの前記部分は、少なくとも１つの鍵型核酸分子（例えば、１から２５の鍵型核酸分子）を含み得る。幾つかの実施形態において、２つ又は３つの鍵型核酸分子は、リバースプライマーの５’末端から最初の８つのヌクレオチドの中に含まれる。
【００４３】
Ｔｍを所望の温度に上昇させるために、特異的なプライマー中に取り込まれなければならないＬＮＡ残基の数は、プライマーの長さ及びプライマーのヌクレオチド組成に主として依存する。プライマー中の１つ又はそれ以上のＬＮＡのＴｍに対する効果を測定するためのツールは、Ｅｘｉｑｏｎ， Ｂｙｇｓｔｕｂｂｅｎ ９， ＤＫ−２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ， Ｄｅｎｍａｒｋのインターネットウェブサイト上で入手可能である。
【００４４】
本発明の実施に際して使用されるプライマーの何れにも、１つ又はそれ以上のＬＮＡを含めることが可能であるが、ＬＮＡが伸長プライマー中に取り込まれた場合に、ｃＤＮＡの合成の効率が低いことが見出された。理論に拘泥することを望むものではないが、ＬＮＡは、逆転写酵素の活性を阻害し得る。
【００４５】
増幅されたＤＮＡ分子の量を検出及び測定する。蛍光性分子などの検出可能なマーカー分子の存在によって、増幅されたＤＮＡ分子を検出及び定量することができる。例えば、本発明の方法のＰＣＲ増幅工程の間に、優先的に又は専ら二本鎖ＤＮＡへ結合する色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）の存在によって、増幅されたＤＮＡ分子を検出及び定量することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．（２９８５１ Ｗｉｌｌｏｗ Ｃｒｅｅｋ Ｒｏａｄ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ ９７４０２）は、ＳＹＢＲグリーン色素を含む定量的ＰＣＲ反応混合物を販売している。さらなる例として、リアルタイムＰＣＲの間に産生された二本鎖ＤＮＡを標識するために使用することができる別の色素（「ＢＥＢＯ」と称される。）が、「Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１ （８）：ｅ４５ （Ａｐｒｉｌ １５， ２００３）」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）によって記載される。同じく、例として、本発明の方法のＰＣＲ増幅工程を開始させるために、蛍光色素と消光物質を含むフォワード及び／又はリバースプライマーを使用することができる。ＰＣＲの間の標識されたプライマーの伸長後に起こる蛍光色素と消光物質の物理的な分離によって、蛍光色素は蛍光を発することが可能となり、ＰＣＲ増幅産物の量を測定するために、蛍光を使用することができる。蛍光色素と消光物質を含む市販のプライマーの例には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー及びＵｎｉｐｒｉｍｅｒが含まれ、何れもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．によって販売されている。
【００４６】
本発明の代表的な使用。本発明は、ミクロＲＮＡ標的分子からｃＤＮＡ分子を作製するのに有用である。当初材料中の標的ミクロＲＮＡ分子の量の測定値を与えるＤＮＡ分子の量を測定することができる。例えば、生きた細胞中の特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量を測定するために、本発明の方法を使用することができる。同じく例として、生体内の異なる細胞種中の特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量を測定することにより、体内の特異的なミクロＲＮＡ分子の分布の「地図」を作成するために、本発明を使用することができる。同じく例として、生きた細胞の集団の薬物での処理への応答など、刺激に応答した特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量の変化を測定するために、本発明を使用することができる。
【００４７】
従って、別の態様において、本発明は、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡの量を測定するための（すなわち、生物のミクロＲＮＡ「地図」を作成するための）方法を提供する。本発明のこの態様の方法はそれぞれ、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する工程を含み、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）生物の細胞種から単離された標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製するためにプライマー伸長を使用する工程；（２）ＤＮＡ分子を増幅して、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する工程；及び（３）増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程を含む方法によって測定される。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。増幅されたＤＮＡ分子の測定された量は、例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体（例えば、フロッピディスク）などの電気的形態の照会可能なデータベース中に格納することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、前記方法は、生物から得た試料中の類似配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別するために使用することができ、前記方法は以下の工程を有する。（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記第二のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの分子の第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）。同一でないミクロＲＮＡ標的の領域とハイブリッド形成するように、第一及び第二の伸長プライマーの遺伝子特異的領域を設計することによって、１つ、２つ、３つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なるミクロＲＮＡ標的を識別するために、この方法を使用し得る。
【００４９】
別の態様において、本発明は、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号１から配列番号４９９の配列からなる核酸プライマー分子を提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００５０】
別の態様において、本発明は、表８に示されているように、配列番号５００から配列番号９６５からなる核酸プライマーの組を提供する。本発明のプライマー分子の組は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、ヒト、マウス及びラットから得たミクロＲＮＡ標的分子を検出するために使用することができる。
【００５１】
別の態様において、本発明は、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な１つ又はそれ以上のプライマーの組を含み、各プライマーの組が（１）標的ミクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー、（２）ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー及び（３）前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリッド形成する第一の部分と及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を含む第二の部分とを含む。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む。キットの幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００５２】
本明細書中に記載されている方法に従って、あらゆる哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するために、キットに含めるための伸長プライマー、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマーを設計し得る。ヒト標的ミクロＲＮＡ標的分子の非限定的な例及び典型的な標的特異的伸長プライマー及びリバースプライマーが、下表１、表２及び表６中に列記されている。マウス標的ミクロＲＮＡ標的分子の非限定的な例及び典型的な標的特異的伸長プライマー及びリバースプライマーが、下表７中に列記されている。ユニバーサルフォワードプライマーの非限定的な例は、配列番号１３に記載されている。
【００５３】
ある種の実施形態において、キットは、各々５０℃から６０℃の範囲のハイブリッド形成温度を有する選択された標的ミクロＲＮＡ分子に対する伸長プライマー、リバース及びユニバーサルフォワードプライマーを含むプライマーの組を含む。
【００５４】
ある種の実施形態において、キットは、複数の哺乳動物ミクロＲＮＡ標的（２つのミクロＲＮＡ標的から最大数百のミクロＲＮＡ標的など）を検出するために使用され得る複数のプライマーの組を含む。
【００５５】
ある種の実施形態において、キットは、以下のヒトミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０２ａ＊、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０２ｂ＊、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３＊、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４５０、ｍｉＲ−４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ、ｌｅｔ７ｉ、ｍｉＲ−３７６ａ及びｍｉＲ−３７７。上記ミクロＲＮＡ標的の配列は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／で、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＷＷＷから公表されている。）中に記載されているように、「ｍｉＲＢアーゼ配列データベース」中に提供されている。
【００５６】
キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、下表１、表２及び表６中に挙げられている。
【００５７】
別の実施形態において、キットは、以下のヒトミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ３６３、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ３７９、ｍｉＲ４１０、ｍｉＲ４１２、ｍｉＲ４２４、ｍｉＲ４２９、ｍｉＲ４３１、ｍｉＲ４４９、ｍｉＲ４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ及びｌｅｔ７ｉ。キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、下表１、表２及び表６中に挙げられている。
【００５８】
別の実施形態において、キットは、以下のヒト、マウス又はラットミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８。
【００５９】
キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、表８に挙げられている。
【００６０】
別の実施形態において、キットは、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号２から配列番号４９３からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６１】
別の実施形態において、キットは、表６中に示されている配列番号４７、４８、４９、５０、５５、５６、８１、８２、８３、８４、９１、９２、１０３、１０４、１２３、１２４、１４５、１４６、１９３、１９４、１９７、１９８、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３９、２４０、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２７７、２７８、２８５、２８６、２８７、２８８、２９３、２９４、３０１、３０２、３０９、３１０、３１１、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３５９、３６０、３６９、３７０、３８９、３９０、３９３、３９４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１５、４１６、４１９、４２０、４２１、４２２、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４６１及び４６２からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６２】
別の実施形態において、キットは、表８に示されているように配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６３】
本発明のキットは、プライマー伸長及び増幅反応のための試薬も提供することができる。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、以下の成分の１つ又はそれ以上をさらに含み得る。逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、Ｔｒｉｓ緩衝液、カリウム塩（例えば、塩化カリウム）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ；ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。
【００６４】
様々な実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅工程の間に、二本鎖ＤＮＡへ優先的に又は専ら結合する検出試薬（ＳＹＢＲグリーン色素又はＢＥＢＯ色素など）を含み得る。他の実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅産物の量を測定するための蛍光色素及び消光物質を含むフォワード及び／又はリバースプライマーを含み得る。
【００６５】
キットは、１つ又はそれ以上の哺乳動物のミクロＲＮＡ標的の検出及び定量においてキットを使用するための指示書を場合によって含む。高情報量様式で機械的な取り扱いをするのに好ましくは有用である適切な収容具の中に、キットを場合によって提供することもできる。
【００６６】
以下の実施例は、現時点で、本発明を実施するために想定されている最良の形態を例示するものに過ぎず、発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６７】
本実施例は、ミクロＲＮＡ標的分子からＤＮＡ分子を作製するための本発明の代表的な方法を記載する。
【００６８】
プライマー伸長は、（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素を使用し、酵素とともに提供された指針に従って）以下のようにして実施された。
【００６９】
以下の反応混合物を氷上で調製した。
１０ｍＭｄＮＴＰ１μＬ
２μＭ伸長プライマー１μＬ
標的テンプラート１から５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」４μＬ
０．１ＭＤＴＴ１μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）酵素１μＬ
２０μＬになるように水
【００７０】
５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間、混合物を温置し、次いで、室温まで冷却し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００７１】
ＰＣＲサイクル数の関数として、二本鎖ＰＣＲアンプリコンのＳＹＢＲ（Ｒ）緑色蛍光をモニタリングすることによって、ＡＢＩ ７９００ ＨＴＳ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。典型的なＰＣＲ反応混合物１０μＬは、以下のものを含有した。
２×ＳＹＢＲ（Ｒ）グリーンマスターミックス（ＡＢＩ）５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー０．８μＬ
水１．４μＬ
標的テンプレート（１０倍希釈されたＲＴ反応）２．０μＬ
【００７２】
標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定した。
【００７３】
前記方法は、全ＲＮＡの試料中に存在する内在ミクロＲＮＡを定量するための１１のプライマー伸長ＰＣＲアッセイにおいて首尾よく使用された。これら１１のアッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマーのＤＮＡ配列が、表１に示されている。
【００７４】
【表１】
【００７５】
このアッセイは、２ｎＭから２０ｆＭの濃度範囲でミクロＲＮＡを検出することが可能であった。アッセイは、合成ミクロＲＮＡの少なくとも２ｎＭの濃度（＞１，０００，０００コピー／細胞）まで線形であった。
【実施例２】
【００７６】
本実施例は、１２から３塩基対の長さの範囲の遺伝子特異的領域を有するミクロＲＮＡアッセイのための一連の伸長プライマーを用いた、プライマー伸長によって媒介される効率的なｃＤＮＡ合成に対する最少配列要件の評価を記載する。
【００７７】
プライマー伸長反応。標的分子ｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５を用いて、プライマー伸長を以下のように行った。１ｎＭＲＮＡ（１００，０００コピー／細胞）になるように、１００ｎｇ／μＬ全酵母ＲＮＡを加えたＴＥゼロ中に標的テンプレートｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５を希釈した。１００ｎｇ／μＬ全酵母ＲＮＡを加えたＴＥゼロを用いて、無テンプレート対照（ＮＴＣ）を調製した。
【００７８】
ｍｉＲ−１９５（配列番号２５から３４）に対する一連の伸長プライマー及びｍｉＲ−２１５に対する一連の伸長プライマー（配列番号３５から４４）（これらの配列は、下表２に示されている。）を用いて、（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素を使用し、酵素とともに提供されていた指針に従って）逆転写酵素反応を以下のように実施した。
【００７９】
以下の反応混合物を氷上で調製した。
セット１：無テンプレート対照
水３７．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ１２．５μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ１２．５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１２．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素１２．５μＬ
１μｇ／μＬＨｅｌａ細胞全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）１２．５μＬ
＋２μＭ伸長プライマー５０μＬ
＋ＴＥゼロ５０μＬ＋酵母ＲＮＡ
セット２：スパイク添加（Ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）テンプレート
水３７．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ１２．５μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ１２．５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１２．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）１２．５μＬ
１μｇ／μＬＨｅｌａ細胞全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）１２．５μＬ
＋２μＭ伸長プライマー５０μＬ
＋１０倍ずつ系列希釈された１ｎＭＲＮＡ標的テンプレート（ｍｉＲ−１９５又はｍｉＲ−２１５）５０μＬ
【００８０】
５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間、反応を温置し、４℃まで冷却し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００８１】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応。逆転写後、ＰＣＲサイクル数の関数として、二本鎖ＰＣＲアンプリコンのＳＹＢＲ（Ｒ）緑色蛍光をモニタリングすることによって、ＡＢＩ ７９００ ＨＴＳ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた定量的リアルタイム（ｑＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの４つ組み測定を行った。以下の反応混合物を調製した。
２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＡＢＩ）５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー（ｍｉＲ−１９５ＲＰ：配列番号４５又はｍｉＲ２１５ＲＰ：配列番号４６）０．８μＬ
水１．４μＬ
標的テンプレート（１０倍希釈されたｍｉＲ−１９５又はｍｉＲ−２１５ＲＴ反応）２．０μＬ
【００８２】
製造業者が推奨する条件を用いて、各試料に対して４つ組みで、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を作成した。ｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５アッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマーのＤＮＡ配列が、下表２に示されている。ｍｉＲ−１９５に対するアッセイの結果が下表３に示されており、ｍｉＲ−２１５に対するアッセイの結果が下表４に示されている。
【００８３】
【表２】
【００８４】
結果：
ミクロＲＮＡ標的テンプレートを含有するアッセイ中において蛍光が検出されたサイクル数として定義されるサイクル閾値（Ｃｔ）値によって、各アッセイの感度を測定した。このＣｔ値が低いほど（例えば、サイクルの数が少ないほど）、アッセイの感度がより高かった。ミクロＲＮＡ試料に対して、テンプレートを含有する試料及び無テンプレート対照は何れも、最終的に検出閾値を超えるが、テンプレートを加えた試料はずっと低いサイクル数で閾値を越えることが一般に観察された。デルタＣｔ値は、テンプレート含有試料及び無テンプレート対照間のサイクル数（Ｃｔ）の差であり、アッセイのダイナミックレンジの指標としての役割を果たす。高いダイナミックレンジを有するアッセイは、極めて低いミクロＲＮＡコピー数の測定を可能とする。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイの望ましい特徴には、高い感度（低いＣｔ値）及び標的テンプレートを含有する試料と無テンプレートバックグランド対照試料のシグナル間の広いダイナミック範囲（デルタＣｔ＞１２）が含まれる。
【００８５】
１２ヌクレオチドから３ヌクレオチドまでのサイズ範囲の遺伝子特異的部分を有する伸長プライマーを使用するｍｉＲ１９５及びｍｉＲ２１５アッセイの結果が、それぞれ、下表３及び表４に示されている。これらの実験の結果は、最短３ヌクレオチドの遺伝子特異的反応開始配列がテンプレート特異的な反応開始を示すことを予想外に示している。ｍｉＲ−１９５アッセイの組（表３に示されている。）及びｍｉＲ−２１５アッセイの組（表４に示されている。）の何れに関しても、アッセイの両方の組に対するダイナミックレンジ（デルタＣｔ）は、８ヌクレオチド長以上の遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに対してかなり一貫していることを結果は示している。アッセイのダイナミックレンジ（デルタＣｔ）は、８ヌクレオチド未満の遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに対して減少し始め、ｍｉＲ−１９５アッセイ中では７ヌクレオチド未満及びｍｉＲ−２１５アッセイ中では６ヌクレオチド未満で、アッセイ特異性が低下する。ｍｉＲ−２１５試料の融点分析は、３ヌクレオチドにおいてさえ、テンプレートを加えた試料中に特異的ＰＣＲ産物が存在することを示した（データは図示せず。）。総合すると、これらのデータは、伸長プライマーの遺伝子特異的領域は、理想的には、８ヌクレオチド以上であるが、最短で３ヌクレオチドの長さであり得ることを示している。
【００８６】
【表３】
【表４】
【実施例３】
【００８７】
本実施例は、ヒトミクロＲＮＡ発現パターンの定量的分析のために設計されたアッセイ及びプライマーの組を記載する。
【００８８】
プライマーの設計：
ミクロＲＮＡ標的テンプレート：本明細書中に記載されている標的テンプレートの配列は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。
【００８９】
伸長プライマー：（１）ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡへ転化するために、（２）ｃＤＮＡ分子の一端に、「ユニバーサル」ＰＣＲ結合部位（配列番号１）を導入するために、及び（３）ｃＤＮＡの長さを延長して、ｑＰＣＲによるその後のモニタリングを容易にするために、ｃＤＮＡを形成し、その後に定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅を行うためのミクロＲＮＡのプライマー伸長用の遺伝子特異的プライマーを設計した。
【００９０】
リバースプライマー：包括的ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）と組み合わせて、プライマーによって伸長された完全長ｃＤＮＡを定量するために、修飾されていないリバースプライマー及び鍵型核酸（ＬＮＡ）を含有するリバースプライマー（ＲＰ）を設計した。鍵型核酸含有リバースプライマーに関して、表６に挙げられている典型的なリバースプライマー配列中に以下に示されているように、リバースプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の８ヌクレオチド内において、２つ又は３つのＬＮＡ修飾された塩基を置換した。最高の量によってプライマーの予想Ｔｍを上昇させるために、ＬＮＡ塩基の置換を選択し、好ましくは５５℃以下であるように、選択されたプライマーの最終予想Ｔｍを指定した。
【００９１】
典型的なプライマーの組を用いるアッセイを記載する例。ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４の検出が以下に記載されている。
【００９２】
プライマー伸長反応：以下のように、ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４に対応するＤＮＡテンプレートを用いて、プライマー伸長を実施した。ＴＥゼロ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７，６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）＋１００ｎｇ／μＬ酵母全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中の０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ及び１ｐＭ希釈になるように、ＤＮＡテンプレートを希釈した。
【００９３】
以下のプライマーを用いて、逆転写酵素反応を行った。
伸長プライマー（５００ｎＭになるように希釈）
ｍｉＲ−９５ＧＳＰ ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡ（配列番号１２３）
ｍｉＲ−４２４ＧＳＰ ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＴ（配列番号４１５）
リバースプライマー：（１０ｍＭになるように希釈）
ｍｉＲ−９５ ＲＰ４ ＴＴ＋ＣＡＡＣ＋ＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡ（配列番号１２４）
ｍｉＲ−４２４ＲＰ２ Ｃ＋ＡＧ＋ＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴ（配列番号４１６）
逆転写（反応当り）：
水２μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）２μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）０．５μＬ
伸長プライマー２μＬ＋テンプレート希釈２μＬ
【００９４】
反応を混合し、５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間温置し、４℃まで冷却し、ＴＥゼロで１０倍希釈した。
【００９５】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応（反応当り）：
２×ＳＹＢＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）５μＬ
水１．４μＬ
ユニバーサルプライマー（ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３））０．８μＬ
上から得られた希釈された逆転写（ＲＴ）産物２．０μＬ。
【００９６】
製造業者が推奨する条件を用いて、各試料に対して４つ組みで、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を作成した。代表的なｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４アッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマー並びに２１２の異なるヒトミクロＲＮＡテンプレートに対するプライマーの組のＤＮＡ配列が、下表６に示されている。高いダイナミックレンジで高感度アッセイを達成するために大規模な検査と設計の改変を必要とするアッセイ用のプライマーの組が、プライマー名の後に＃記号を付して表６に示されている。
【００９７】
結果：
表５は、図２に示されているグラフ中にプロットされている、ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４アッセイから得られたＣｔ値（４つの試料からの平均）を示している。勾配（列６）、切片（列７）及び背景（列８）として表記されている表６中に示されたアッセイパラメータの重要性を説明するための代表例として、これらのアッセイの結果が挙げられている。
【００９８】
表５に示されているように、様々な濃度の各テンプレートに対するＣｔ値が記載されている。図２に示されているように、各アッセイに対する標準曲線を作成するために、テンプレート濃度（ｙ軸）の関数として、Ｃｔ値（ｘ軸）がプロットされる。勾配及び切片は、各ミクロＲＮＡに対して、コピー数／細胞の推定を可能とするアッセイ測定の特徴を規定する。例えば、ｍｉＲ−９５アッセイに対して、全ＲＮＡ入力５０μｇに対するＣｔ値をプロットすると、それぞれ、−０．３５６９及び９．６５５の勾配及び切片で、標準曲線が作成される。これらの標準曲線のパラメータが未知の試料のＣｔ（ｘ）に対して適用されると、ｌｏｇ１０（コピー／全ＲＮＡ２０ｐｇ）（ｙ）が得られる。平均的な細胞は全ＲＮＡ２０ｐｇを与えるので、これらの測定は、ミクロＲＮＡのコピー数／細胞に等しい。バックグラウンドは、試料中で測定できる最少のコピー数の推計を与え、この式中に無テンプレート対照（ＮＴＣ）値を挿入することによって計算される。本実施例では、表６に示されているように、ｍｉＲ−９５は、ＲＮＡ入力５０μｇで、１．６８コピー／２０ｐｇのバックグラウンドを与える。
【００９９】
表６にさらに示されているように、ＬＮＡを含有しないリバースプライマーも、本発明の方法に従って使用され得る。例えば、配列番号４９４から４９９参照。リバースプライマー配列番号４９４から４９９を含有する非ＬＮＡを用いたアッセイの感度及びダイナミックレンジは、ＬＮＡ含有リバースプライマーを用いて、対応するアッセイと類似の結果を与えた。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【実施例４】
【０１０２】
本実施例は、マウスｍｉＲＮＡ発現パターンの定量的分析のために設計されたアッセイ及びプライマーを記載する。
【０１０３】
方法：表７に記載されている代表的なマウスミクロＲＮＡ標的テンプレートは、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。下表７に示されているように、マウスミクロＲＮＡテンプレートは、対応するヒトミクロＲＮＡテンプレートと完全に同一であり、重複配列中が同一で、末端が異なり、又はヒトミクロＲＮＡ配列と比べて、１つ若しくはそれ以上の塩基対の変化を含有する。対応するヒトテンプレートと同一であり、又は対応するヒトテンプレートと同一の重複配列を有するマウスミクロＲＮＡテンプレートは、表７に示されているように、ヒトミクロＲＮＡテンプレートに対して設計された同じプライマーの組を用いてアッセイすることができる。対応するヒトテンプレートと比べて１つ又はそれ以上の塩基対の変化を有するマウスミクロＲＮＡテンプレートに対して、マウスミクロＲＮＡを検出するために特異的にプライマーセットの組が設計され、これらのプライマーは表７に記載されている。マウスミクロＲＮＡテンプレートを検出するための伸長プライマー反応及び定量的ＰＣＲ反応は、実施例３に記載されているように実施し得る。
【０１０４】
【表７】
【実施例５】
【０１０５】
本実施例は、本発明の実施形態に従う方法を用いて、１２の異なる組織から単離された全ＲＮＡ中の３つのミクロＲＮＡに対する発現プロファイルの検出及び分析を記載している。
【０１０６】
方法：以下の組織から単離されたプライマー伸長反応１０μＬ当りＦｉｒｓｔ Ｃｈｏｉｃｅ全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）０．５μｇを用いて、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡテンプレートの定量的分析を測定した。脳、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ、卵巣、骨格筋、脾臓、胸腺及び子宮。以下のＰＣＲプライマーを使用し、実施例３に上述されているように、プライマー伸長酵素及び定量的ＰＣＲ反応を実施した。
【０１０７】
ｍｉＲ−１テンプレート
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣ（配列番号４７）
リバースプライマー：Ｔ＋Ｇ＋ＧＡＡ＋ＴＧ＋ＴＡＡＡＧＡＡＧＴ（配列番号４８）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
ｍｉＲ−１２４テンプレート：
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣ（配列番号１４９）
リバースプライマー：Ｔ＋ＴＡ＋ＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＴ（配列番号１５０）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
ｍｉＲ−１５０テンプレート：
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＧＴＡ（配列番号２１３）
リバースプライマー：Ｔ＋ＣＴ＋ＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧ（配列番号２１４）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
結果。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１５０に対する発現プロファイルが、それぞれ、図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示されている。図３Ａから３Ｃ中のデータは、全ＲＮＡ１０ｐｇ当りのミクロＲＮＡコピーの単位（ｙ軸）で表されている。通例、ヒト細胞株は、細胞当りの全ＲＮＡ１０ｐｇ以下を与えるので、これらの単位を選択した。従って、示されているデータは、細胞当りのミクロＲＮＡコピーの推計である。ｘ軸上の数は、以下の組織に対応する。（１）脳、（２）心臓、（３）腸、（４）腎臓、（５）肝臓、（６）肺、（７）リンパ、（８）卵巣、（９）骨格筋、（１０）脾臓、（１１）胸腺及び（１２）子宮。
【０１０８】
以前の報告と合致して、（図３Ａに示されているように）横紋筋特異的発現の極めて高いレベルがｍｉＲ−１に対して見出され、（図３Ｂに示されているように）脳発現の高いレベルがｍｉＲ−１２４に対して見出された（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ９：１７５−１７９，２００３参照）。定量的分析によって、これらのミクロＲＮＡは、細胞当り１０から数１０万のコピーで存在することが明らかとなる。これらのデータは、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１２４レベルの定量的ノーザンブロットの推計と合致している（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４３３：７６９−７７３，２００５参照）。図３Ｃに示されているように、ｍｉＲ−１５０は、免疫に関連するリンパ節、胸腺及び脾臓試料中で高度に発現されていることが見出され、同じく以前の知見と合致していた（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ７７：２４１−２４７， ２００５参照）。
【実施例６】
【０１０９】
本実施例は、興味を有する哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのプライマーの選択及び検証について記載する。
【０１１０】
論拠：単一の試料中の複数のミクロＲＮＡ標的を検出するために複数のアッセイ（すなわち、多重ＰＣＲ）を実施するためには、単一のユニバーサルプライマーを用いて、一般的な緩衝系中において、均一な逆転写酵素とＰＣＲサイクル条件下でアッセイが機能することが重要である。指定された反応条件下で良好に機能する所望のミクロＲＮＡ標的に対して有用なプライマーの組を同定するために、以下のプライマー設計原理及び高情報量アッセイを使用した。
【０１１１】
プライマーの設計：
実施例２に記載されているように、本発明の方法を用いて哺乳動物のミクロＲＮＡ標的を検出するためのアッセイの感度は、サイクル閾値（Ｃｔ）の値によって測定され得る。Ｃｔ値が低いほど（例えば、サイクルの数が少ないほど）、アッセイの感受性がより高い。デルタＣｔ値は、テンプレート含有試料と無テンプレート対照との間のサイクル数（Ｃｔ）の差であり、アッセイのダイナミックレンジの指標としての役割を果たす。高いダイナミックレンジを有するアッセイは、極めて低いミクロＲＮＡコピー数の測定を可能とする。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイの望ましい特徴には、高い感度（低いＣｔ値）（好ましくは、約１０から約２０などの、約５から約２５の範囲）及び標的テンプレートを含有する試料と無テンプレートバックグラウンド対照試料のシグナル間の広いダイナミックレンジ（好ましくは、デルタＣｔ１２以上など、約１０から３５の範囲）が含まれる。
【０１１２】
ミクロＲＮＡ標的テンプレート：代表的な哺乳動物のミクロＲＮＡ標的テンプレート（ｈ＝ヒト、ｒ＝ラット、ｍ＝マウス）が表９に挙げられており（配列番号９６６から配列番号１０４３）、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。
【０１１３】
伸長プライマー：
実施例１から５に記載されているようにして得られた経験的データは、主として、遺伝子特異的（ＧＳ）伸長プライマーが本明細書中に記載されている方法を用いて哺乳動物のミクロＲＮＡ標的を検出するためのアッセイのダイナミックレンジを決定することを示唆する。実施例２に記載されているように、検査されるアッセイのダイナミックレンジ（デルタＣｔ）及び特異性は、６から７未満のヌクレオチドの遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに関して減少することが決定された。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイを最適化するために、興味が持たれるミクロＲＮＡ標的と重複する７から１０のヌクレオチドを有する伸長プライマーを設計した。表９中に列記されているミクロＲＮＡ標的に対する典型的な伸長プライマーが、表８に挙げられている（配列番号５００から配列番号９６５）。これらの典型的な伸長プライマーは、興味が持たれるミクロＲＮＡ標的と重複する７から１０ヌクレオチドの遺伝子特異的（ＧＳ）領域を有する。
【０１１４】
リバースプライマー：
包括的ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）と組み合わせて、プライマーによって伸長された完全長ｃＤＮＡを定量するために、修飾されていない及び鍵型核酸（ＬＮＡ）を含有するリバースプライマーを設計した。実施例１から５に記載されているようにして得られたデータに基づいて、リバースプライマーの設計がＰＣＲ反応の効率に寄与することが決定され、リバースプライマーが長いほど、ＰＣＲの成績が向上することが観察された。しかしながら、伸長プライマーとの重複が長いほど、バックグラウンドが高くなることも観察された。従って、非特異的バックグラウンドシグナルを低下させるために、伸長プライマーの遺伝子特異的部分との重複を最小限に抑えながら可能な限り長くリバースプライマーを設計した。
【０１１５】
さらに、実施例３に記載されているように、プライマーの予想Ｔｍを上昇させるように、ＬＮＡ塩基の置換を選択することができ、通例、２つ又は３つのＬＮＡ塩基置換がリバースプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端から最初の８つのヌクレオチド内において置換する。表９に列記されているミクロＲＮＡ標的に対する典型的なリバースプライマーが、表８に挙げられている。これらの典型的なリバースプライマーはＬＮＡ塩基置換（ヌクレオチドの前の「＋」記号がＬＮＡ置換を表す。）を含有するが、この特徴は場合によって存在するものであり、必須ではない。
【０１１６】
所望の標的に対するプライマーの選択及び検証：
アッセイオリゴヌクレオチドの選択は、以下のように、２段階で行われる。
【０１１７】
１）プライマーの設計は、上記原理を用いて決定した。典型的には、興味が持たれる各ミクロＲＮＡ標的に対して、４つの伸長プライマーの候補及び２つのリバースプライマーの候補を設計した。各組の伸長プライマーは、３’末端において、それぞれ、７、８、９及び１０ヌクレオチドだけ遺伝子特異的領域と重複している。これらの設計原理に従って設計された典型的プライマーが、表９に列記されているミクロＲＮＡ標的に対して表８に挙げられている。
【０１１８】
候補プライマーの組を検証するためのアッセイの設計（アッセイ＃１）：
ミクロＲＮＡ標的：
典型的な標的ミクロＲＮＡｍｉＲ−４９５は、表９において「ｈｍｒ」−ｍｉＲ−４９５の表記によって示されているように、ヒト（ｈ）、マウス（ｍ）及びラット（ｒ）にわたって保存されたＲＮＡ標的配列（配列番号９６６）を有する。従って、この標的配列に対して設計されたプライマーは、ヒト、マウス及びラットから得られた試料中のｍｉＲ−４９５を検出するのに有用であると予想される。
【０１１９】
ミクロＲＮＡｍｉＲ−４９５標的ＲＮＡ配列：５’ＡＡＡＣＡＡＡＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＵＵＣＵＵ３’（配列番号９６６）
【０１２０】
【化１】
【０１２１】
２）実施例２に記載されているアッセイ法を用いて、定量的ＰＣＲアッセイの高い感度と高いダイナミックレンジを示す対を見出すために、上記のように設計されたプライマーを調べた。ＤＮＡテンプレートの存在又は不存在下で、プライマーの全ての組み合わせを調べることによって、標的ミクロＲＮＡに対して伸長プライマーとリバースプライマーの最適な組み合わせを決定した。ＲＮＡより分解される可能性がより低いので、オリゴ対を調べるために、ＲＮＡテンプレートよりむしろＤＮＡを使用することが好ましい。分解されたテンプレートは、誤った結論を与えるアッセイデータをもたらす。従って、ＨＰＬＣによって精製されたＤＮＡテンプレート分子が好ましい。
【０１２２】
表８は、（表９に示されている）７８のミクロＲＮＡ標的に対する検出アッセイにおいて使用するための典型的なプライマーの組を示す。ヒト（ｈ）、マウス（ｍ）及びラット（ｒ）ミクロＲＮＡ又は１つ若しくはそれ以上の種から得られたミクロＲＮＡを特異的に検出するように、これらのアッセイにおいて使用するための候補プライマーを設計した。例えば、「ｈｍｒ」という接頭辞が付されているアッセイは、３つ全ての種内に完全に保存されたミクロＲＮＡを検出するように設計されているのに対して、「ｍｒ」という接頭辞はマウスとラット間で保存されているが、ヒトでは保存されていないミクロＲＮＡを検出するようにアッセイが設計されていることを意味する。プラス（＋）記号が前に付されているヌクレオチドは、場合によって鍵型であり得る（ＬＮＡ）。表９は、各アッセイに対するミクロＲＮＡ標的配列を示している。
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
【表９】
【０１２５】
アッセイフォーマット：
以下のように、表８中に上記されている幾つかの候補プライマーの組を、高情報量アッセイ検査形式で検査した。
【０１２６】
各検査アッセイ（例えば、表８中に列記されているアッセイ＃７５、＃７６、＃７７及び＃７８）は、９６ウェルプレートの４×４ウェル中で行われ（９６ウェルプレート当り６つのアッセイ）、これにより、各標的に対して最適なプライマー対を迅速に決定することが可能となった。
【０１２７】
各アッセイに対して、４つの候補伸長（ＧＳ）プライマーの各々を、９６ウェルプレートの別個の列中において検査した。テンプレートを加えて（１ｎＭＤＮＡ）又は除いて（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｎｇ／μＬ酵母全ＲＮＡ）、２つのリバースプライマーの各々を検査した。逆転写後、２つ組みの無テンプレート対照とテンプレート試料の一方の組をリバースプライマー１（ＲＰ１）に対して、他方をリバースプライマー２（ＲＰ２）に対して検査した。
【０１２８】
逆転写酵素アッセイの条件：
ＲＴマスターミックス６μＬを９６ウェルの全てに添加した。
０．５μＭＧＳプライマー２μＬを、４つの連続するウェルに添加した。
ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）中の酵母ＲＮＡを、全ての奇数番号のウェルに添加し、予め希釈されたＤＮＡテンプレートを偶数番号のウェルに添加した。
【０１２９】
試料をよく混合し、逆転写酵素段階を実施した後、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）８０μＬで希釈した。
【０１３０】
ユニバーサルプライマーに加えて適切なリバースプライマーを含有するウェル当り８μＬのＰＣＲ混合物が予め搭載された３８４ウェルのＰＣＲプレートの４つ組みウェル中に、逆転写混合物２μＬを移した。
【０１３１】
３８４プレートと適合するリアルタイムＰＣＲ装置上で、定量的ＰＣＲ反応の結果を評価した。
【０１３２】
０．０１のベースライン閾値に基づいて、ＰＣＲ反応に対するＣｔ値を測定した。感度（１ｎＭテンプレートのＣｔ値）及びダイナミックレンジ（無テンプレート対照のＣｔから１ｎＭテンプレートのＣｔを差し引いたもの）を、各アッセイ中で各プライマー対に対して測定した。表８に列記されている典型的なアッセイ＃７５、＃７６、＃７７及び＃７８の結果が、下表１０に示されている。
【０１３３】
【表１０】
【０１３４】
優れた感度（例えば、５と２５の間の好ましい範囲）及びダイナミックレンジ（例えば、１０と３５の間の好ましい範囲）の特徴に基づいて、最適なプライマー対を同定した。表１０に上記されているように、ｍｉＲ−１９４：ＧＳ８（配列番号９４６）及びＲＰ１（配列番号９４８）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び１７のダイナミックレンジを有していた。ｍｉＲ−１：ＧＳ１０（配列番号４７）及びＲＰ２（配列番号４８）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び１５のダイナミックレンジを有していた。ｍｉＲ−２０６：ＧＳ７（配列番号９５３）及びＲＰ２（配列番号９５５）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び２０のダイナミックレンジを有していた。同じく表１０に示されているように、ＧＳプライマーは、ＧＳ９からＧＳ８に至る（（バックグラウンドの減少によって生じる）ダイナミックレンジの著しい増加によって示されるように）特異性を調節する（例えば、ｍｉＲ−１９４参照）。
【０１３５】
表８に列記されているさらなる典型的プライマー又は本明細書中に記載されている設計原理を用いて設計された他の候補プライマーなどの、上記原理に基づいて設計された候補プライマーは、上記スクリーニング法を用いて検査され得る。分解されたテンプレートに伴う問題を回避するために、ＨＰＬＣによって精製されたテンプレートを使用することにより、アッセイをさらに最適化し得る。
【０１３６】
１、２又は３つのヌクレオチドの変化のみが配列中で互いに異なるミクロＲＮＡは、本明細書中に記載されている設計原理及び方法に従って設計されたプライマーの使用を通じて、互いに容易に区別できることも決定された。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態を例示し、説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明に様々な変化を施し得ることが理解される。
【０１３８】
独占的な権利又は特権が請求されている本発明の実施形態は、以下のように定義される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小さなＲＮＡ分子を増幅及び定量するための方法、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を阻害するように機能する進化的に保存されたプロセスである（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）， Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−６；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：４５７−６７）。ＲＮＡｉの現象は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）中に最初に記載され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注入は、このｄｓＲＮＡに相補的なｍＲＮＡの効率的な配列特異的遺伝子発現停止をもたらした（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：８０６−１１）。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子発現停止（ＰＴＧＳ）と称される現象として植物中にも記載されており、ウイルス防御機構として使用されていると思われる（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３４０−４；Ｂｒｉｇｎｅｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：６７３９−４６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＆ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−２）。
【０００３】
ＰＴＧＳを制御する分子がより長いｄｓＲＮＡから加工された短いＲＮＡであることを示唆する初期の証拠は、植物中のより長いｄｓＲＮＡに由来する２１から２２の短いヌクレオチドｄｓＲＮＡの同定であった（Ｈａｍｉｌｔｏｎ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−２）。この観察は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の胚抽出物中においても繰り返され、ＲＮアーゼＩＩＩ型酵素（Ｄｉｃｅｒ）によって、長いｄｓＲＮＡが２１から２５ヌクレオチドの短いＲＮＡへ加工されることが見出された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−８８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５：１８８−２００）。これらの観察から、Ｅｌｂａｓｈｉｒ他は、合成２１から２５のヌクレオチドの合成ｄｓＲＮＡがドロソフィラ胚の可溶化液及び哺乳動物細胞培養中で遺伝子発現を特異的に阻害するように機能するかどうかを調べた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ． ２０：６８７７−８８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５：１８８−２００）。Ｅｌｂａｓｈｉｒ他は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、インターフェロン応答の誘導なしに、哺乳動物細胞培養中で遺伝子発現を特異的に阻害する能力を有することを示した。
【０００４】
これらの観察から、ヘアピンｓｉＲＮＡを作製するプラスミドを基礎とするシステムなど、哺乳動物細胞培養中の特異的遺伝子の発現を低下又は喪失させるための技術が開発されるに至った（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：５５０−３；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７６：９４８−５８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１４４３−８；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４０４−８）。ｓｉＲＮＡ分子は、特定のタンパク質の発現をインビボで阻害するために、細胞中へ導入することもできる（例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）：１７３−１７８（２００４）参照）。
【０００５】
ｓｉＲＮＡ分子は、特異的タンパク質の発現を阻害するための治療剤としても、病状に関与するタンパク質の発現を制御するように機能するｓｉＲＮＡ分子の活性に影響を及ぼす薬物に対する標的としても有望である。このような治療剤を開発する上での第一の工程は、生物内の様々な細胞種中での特定のｓｉＲＮＡ分子の量を測定することにより、体内でのｓｉＲＮＡ発現の「地図」を作成することである。さらに、所定の刺激に応答した又は病状における、特定の細胞種中での特異的ｓｉＲＮＡ分子の量の変化を測定することが有用である。
【０００６】
低ＲＮＡ分子は、定量することが困難である。例えば、小ＲＮＡ分子を増幅及び測定するためのＰＣＲの使用に関して、多くのＰＣＲプライマーは小ＲＮＡ分子より長いので、小ＲＮＡ分子と大幅に重複し、プライマー伸長及びＰＣＲ増幅反応のために使用される温度で小ＲＮＡ分子へ選択的にハイブリッド形成するプライマーを設計することが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ４０９、２００１年、ｐｐ．３６３−６
【非特許文献２】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２００３年、ｐｐ．４５７−６７
【非特許文献３】Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ ３９７、１９９８年、ｐｐ．８０６−１１
【非特許文献４】Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、１９９０年、ｐｐ．３４０−４
【非特許文献５】Ｂｒｉｇｎｅｔｉ他、ＥＭＢＯ Ｊ．１７、１９９８年、ｐｐ．６７３９−４６
【非特許文献６】Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＆ ＢａｕｌｃｏｍｂｅＳｃｉｅｎｃｅ ２８６、１９９９年、ｐｐ．９５０−２
【非特許文献７】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ４１１、２００１年、ｐｐ．４９４−８
【非特許文献８】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、ＥＭＢＯ Ｊ．２０、２００１年、ｐｐ．６８７７−８８
【非特許文献９】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７５、２００１年、ｐｐ．１８８−２００
【非特許文献１０】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６、２００２年、ｐｐ．５５０−３
【非特許文献１１】Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７６、２００２年、ｐｐ．９４８−５８
【非特許文献１２】Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、２００２年、ｐｐ．１４４３−８
【非特許文献１３】Ｐａｕｌ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、２００２年、ｐｐ．４０４−８
【非特許文献１４】Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，他、Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）、２００４年、ｐｐ．１７３−１７８
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。キットは、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な少なくとも１つのプライマーの組を含み、プライマーの組は、（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー（伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡにハイブリッド形成する第一の部分及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を有する第二の部分を含む。）；（２）伸長プライマー上のハイブリッド形成配列にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー並びに（３）ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含み、前記少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８からなる群から選択される。一実施形態において、ユニバーサルフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの少なくとも１つは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む少なくとも１つの核酸分子を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明は、生物から得た試料中の類似の配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記二一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；並びに（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ｃＤＮＡ分子を作製するために、ミクロＲＮＡ分子を増幅するための方法を提供する。この方法は、（ａ）プライマー伸長を用いて、標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；並びに（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程を含む。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。本発明を実施する際には、通例、個別のミクロＲＮＡ分子の多数（例えば、何百万）が試料（例えば、生きた細胞から単離されたＲＮＡ分子の溶液）中において増幅される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、生物から得た試料中の標的ミクロＲＮＡの量を測定するための方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する工程を含み、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）プライマー伸長を用いて、前記試料中の前記標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（２）ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために前記第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；及び（３）前記増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程を含む方法によって測定される。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明は、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号１から配列番号４９９の配列からなる核酸プライマー分子を提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な１つ又はそれ以上のプライマーの組を含み、各プライマーの組が（１）標的ミクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー、（２）ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー及び（３）前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリッド形成する第一の部分と及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を含む第二の部分とを含む。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む。キットの幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。本発明のキットは、本発明の方法の様々な実施形態を実施するために使用し得る。
【００１６】
本発明の方法、組成物及びキットは、例えば、生物中の細胞の異なる種類中の特異的ミクロＲＮＡ分子を定量するために有用であり、又は、例えば、刺激に応答した（例えば、薬物の投与に応答した）生きた細胞中の特異的ミクロＲＮＡの量の変化を測定するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の前記態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるようになるので、より容易に理解されるようになる。
【図１】図１は、本発明の代表的な方法のフローチャートを示している。
【図２】図２は、実施例３に記載されているように、ミクロＲＮＡ標的であるｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４の検出に対して特異的なアッセイのための標準曲線をグラフとして図示している。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１２４の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例５に記載されているように、１２の組織から単離された全ＲＮＡの集合にわたるｍｉＲ−１５０の発現特性を示すヒストグラムプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記記載に従い、一態様において、本発明は、ｃＤＮＡ分子を作製するために、ミクロＲＮＡ分子を増幅するための方法を提供する。この方法は、（ａ）標的ミクロＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子を作製するためにプライマー伸長を使用する工程；並びに（ｂ）前記ＤＮＡ分子を増幅して増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する工程を含む。この方法の幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００１９】
本明細書において使用される「鍵型核酸分子」（ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）分子と略称される。）という用語は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む核酸分子を表す。２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分の例及びこのような部分を含むＬＮＡの例は、例えば、「Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（２）：７４−８１（２００３）」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。
【００２０】
本明細書において使用される「ミクロＲＮＡ」という用語は、２１ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの範囲の長さを有するＲＮＡ分子を表す。幾つかのミクロＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子）は、生きた細胞中で遺伝子発現を制御するように機能する。
【００２１】
本発明の代表的な方法。図１は、本発明の代表的な方法のフローチャートを示す。図１に示されている方法において、ミクロＲＮＡは相補的な第一のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートである。第一のＤＮＡ分子の合成は、伸長プライマーによって開始され、従って、第一のＤＮＡ分子は伸長プライマー及び新たに合成されたＤＮＡ（図１中において、点線によって表される。）を含む。ＤＮＡの合成は、逆転写酵素によって触媒される。
【００２２】
伸長プライマーは、第一の部分（図１中で、ＦＰと略称されている。）及び第二の部分（図１中で、ＳＰと略称されている。）を含む。第一の部分はミクロＲＮＡ標的テンプレートにハイブリッド形成し、第二の部分は、以下に記載されているように、ユニバーサルフォワードプライマーとハイブリッド形成する核酸配列を含む。
【００２３】
第一のＤＮＡ分子に相補的な第二のＤＮＡ分子を作製するために、定量的なポリメラーゼ連鎖反応が使用される。第二のＤＮＡ分子の合成は、標的の第一のＤＮＡ分子の一部に特異的にハイブリッド形成するように選択された配列を有するリバースプライマーによって開始される。従って、リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子以外の核酸分子に対してハイブリッド形成しない。
【００２４】
リバースプライマーは、伸長プライマーと重複しないリバースプライマーの一部の中に位置する少なくとも１つのＬＮＡ分子を場合によって含み得る。図１において、ＬＮＡ分子は、影付きの楕円によって表されている。
【００２５】
ユニバーサルフォワードプライマーは、第二のＤＮＡ分子の３’末端に対してハイブリッド形成し、第三のＤＮＡ分子の合成を開始する。図１には、単一のミクロＲＮＡ分子、単一の第一のＤＮＡ分子、単一の第二のＤＮＡ分子、単一の第三のＤＮＡ分子並びに単一の伸長、フォワード及びリバースプライマーが示されているが、通例、本発明の実施は、前記核酸分子の各々の多数のコピー（例えば、何百万のコピー）を含む反応混合物を使用することが理解される。
【００２６】
ここで、本発明の方法の工程を、より詳しく考察する。
【００２７】
テンプレートとして有用なミクロＲＮＡ分子の調製。本発明の方法におけるテンプレートとして有用なミクロＲＮＡ分子は、あらゆる生物（例えば、哺乳動物などの真核生物）又はその一部（臓器、組織及び／又は各細胞（培養された細胞を含む。）を含む。）から単離することができる。ミクロＲＮＡを含むあらゆる適切なＲＮＡ調製物（全細胞ＲＮＡなど）を使用することができる。
【００２８】
ＲＮＡは、細胞の溶解及び細胞中に含有されるタンパク質の変性を含む手順によって細胞から単離され得る。興味深い細胞には、野生型細胞、薬物に曝露された野生型細胞、被修飾細胞及び薬物に曝露された被修飾細胞が含まれる。
【００２９】
ＤＮＡの幾つか又は全てを除去するために、さらなる工程を使用し得る。核を除去し、従って、細胞ＤＮＡの大部分を除去するために、非イオン性界面活性剤後に微小遠心を用いて細胞の溶解を達成し得る。一実施形態において、ＤＮＡからＲＮＡを分離するために、チオシアン酸グアニジニウム溶解後に、ＣｓＣｌ遠心を用いて、関心を有する様々な種類の細胞からＲＮＡが抽出される（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９参照）。ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、有機抽出によって、例えば、熱いフェノール又はフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて実施することもできる。
【００３０】
所望であれば、溶解緩衝液にＲＮアーゼ阻害剤を添加し得る。同様に、ある種の細胞種に関しては、タンパク質変性／消化工程をプロトコールに付加することが望ましい場合があり得る。
【００３１】
ＲＮＡの試料は、それぞれの異なるミクロＲＮＡ分子が異なるヌクレオチド配列を有する、複数の異なるミクロＲＮＡ分子を含むことができる。特定の実施形態において、ＲＮＡ試料中のミクロＲＮＡ分子は、少なくとも１００の異なるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、ＲＮＡ試料のミクロＲＮＡ分子は、少なくとも５００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００又は１００，０００の異なるヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
本発明の方法は、あらゆるミクロＲＮＡの存在を検出するために使用され得る。例えば、本発明の方法は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／で、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネット上に公表されている。）中に記載されているように、「ｍｉＲＢアーゼ配列データベース」などのデータベース中に記載されているミクロＲＮＡ標的の１つ又はそれ以上を検出するために使用され得る。典型的なミクロＲＮＡ標的のリストは、以下の参考文献：Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２（９）：７３５−９（２００２）中にも記載されている。
【００３３】
テンプレートとしてミクロＲＮＡ分子を用いたＤＮＡ分子の合成。本発明の方法の実施において、ミクロＲＮＡ標的分子と相補的であり、並びに伸長プライマー及び新たに合成されたＤＮＡ（伸長プライマーは、新たに合成されたＤＮＡの合成を開始する。）から構成される第一のＤＮＡ分子が合成される。各第一のＤＮＡ分子は、完全なミクロＲＮＡ標的分子又はその一部に対して相補的であり得るが、各第一のＤＮＡ分子は、通例、完全なミクロＲＮＡ標的分子に対して相補的である。従って、本発明の方法を実施する際には、それぞれ標的ミクロＲＮＡ分子の全部又は一部に対して相補的である各ＤＮＡ分子を含む第一のＤＮＡ分子の集団が合成される。
【００３４】
第一のＤＮＡ分子の合成は、逆転写酵素によって触媒される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ−ＲＴ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＲＴ）から得られるものなどの第一のＤＮＡ分子を合成するために、あらゆる逆転写酵素分子を使用することができる。この段階で合成される二本鎖ｃＤＮＡの量を最小限に抑えるために、ＲＮアーゼＨ活性を欠如する逆転写酵素（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， １６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ６４８２， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２００８によって販売されるＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩＩＴＭ）が好ましい。また、ミクロＲＮＡ標的分子へのプライマーのハイブリッド形成を可能としながら、ＤＮＡ合成反応が可能な限り高温で行われ得るように、逆転写酵素分子は、好ましくは熱安定的であるべきである。
【００３５】
第一のＤＮＡ分子の合成を開始する。第一のＤＮＡ分子の合成は、伸長プライマーを用いて開始される。典型的には、伸長プライマーの長さは、１０個のヌクレオチドから１００個のヌクレオチド（２０から３５ヌクレオチドなど）の範囲にある。伸長プライマーの核酸配列は、合成された各ＤＮＡの配列中に取り込まれる。伸長プライマーは、ミクロＲＮＡ分子の一部にハイブリッド形成する第一の部分を含む。典型的には、伸長プライマーの第一の部分は伸長プライマーの３’末端を含む。典型的には、伸長プライマーの第一の部分は、１０ヌクレオチドから１２ヌクレオチドなど、６ヌクレオチドから２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、伸長プライマーの第一の部分は、３ヌクレオチドから２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００３６】
伸長プライマーは、１８から２５ヌクレオチドの長さを典型的に有する第二の部分も含む。例えば、伸長プライマーの第二の部分は、２０ヌクレオチド長であり得る。伸長プライマーの第二の部分は、伸長プライマーの第一の部分の５’側に位置する。伸長プライマーの第二の部分は、ユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の少なくとも一部を含む。例えば、伸長プライマーの第二の部分は、ユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の全てを含むことが可能であり、又はユニバーサルフォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の単一ヌクレオチドを含むことができる（フォワードプライマーに対するハイブリッド形成部位の残りの部分は、例えば、伸長プライマーの第一の部分中に位置し得る。）。伸長プライマーの第二の部分の典型的な核酸配列は、５’ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ３’（配列番号１）である。
【００３７】
ＤＮＡ分子の増幅。本発明の方法を実施する際には、第一のＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、酵素的に増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応を開始するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーが使用される。リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子の一部に対して特異的にハイブリッド形成するように選択された核酸配列を含む。
【００３８】
リバースプライマーは、通例、１０ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、リバースプライマーは、１２ヌクレオチドから２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。リバースプライマーのヌクレオチド配列は、所定のハイブリッド形成条件下で、特異的な標的ヌクレオチド配列に対してハイブリッド形成するように選択される。リバースプライマー及び伸長プライマーは何れも、ＰＣＲ反応混合物中に存在するので、融点（Ｔｍ）が少なくとも５０℃であるように、リバースプライマーは十分に長くすべきであるが、「プライマー二量体」の形成を引き起こし得る伸長プライマーとの大規模な重複が存在するほど長くすべきではない。リバースプライマーが伸長プライマーとハイブリッドを形成し、ＤＮＡ合成のための基質として伸長プライマーを使用するときに、及び伸長プライマーがリバースプライマーとハイブリッドを形成し、ＤＮＡ合成のための基質としてリバースプライマーを使用するときに、「プライマー二量体」が形成される。「プライマー二量体」の形成を避けるために、リバースプライマーと伸長プライマーは６ヌクレオチドを超えて互いに重複しないように通例設計される。少なくとも５０℃のＴｍを有するリバースプライマーを作製することが可能でなく、リバースプライマー及び伸長プライマーが６ヌクレオチドを超えて重複していなければ、リバースプライマーの長さを長くし（オリゴヌクレオチド長が増加するにつれて、通例、Ｔｍは増加するので）、伸長プライマーの長さを減少させることが好ましい。
【００３９】
リバースプライマーは、第一のＤＮＡ分子に相補的である第二のＤＮＡ分子の合成を開始する。ユニバーサルフォワードプライマーは、第一のＤＮＡ分子の全ての中に取り込まれた伸長プライマーの第二の部分に対して相補的な第二のＤＮＡ分子の一部とハイブリッドを形成する。ユニバーサルフォワードプライマーは、第三のＤＮＡ分子の合成を開始させる。ユニバーサルフォワードプライマーは、通例、１６ヌクレオチドから１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマーは、１６ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ユニバーサルフォワードプライマーは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含み得る。幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマーは、１から２５の鍵型核酸分子を含む。典型的なユニバーサルフォワードプライマーの核酸配列が、配列番号１３に記載されている。
【００４０】
一般に、ポリメラーゼ連鎖反応の間の増幅サイクルの数が増加するほど、得られる増幅されたＤＮＡの量は増加する。他方、増幅サイクルが多すぎると（例えば、３５を超える増幅サイクル）、非標的二本鎖ＤＮＡの意図せぬ誤った増幅がもたらされ得る。従って、幾つかの実施形態において、増幅サイクルの望ましい数は、１と４５の間の増幅サイクル（１から２５の増幅サイクルなど、又は５から１５の増幅サイクルなど、又は１０の増幅サイクルなど）である。
【００４１】
ＬＮＡ分子の使用及びプライマーハイブリッド形成条件の選択。基質分子上の相補的配列へのプライマー分子の特異的ハイブリッド形成を促進するハイブリッド形成条件が選択される。伸長プライマーの１２ヌクレオチドの第一の部分のミクロＲＮＡへのハイブリッド形成に関して、特異的ハイブリッド形成は５０℃の温度で起こることが見出された。同様に、相補的なＤＮＡ分子への２０ヌクレオチドのユニバーサルフォワードプライマーのハイブリッド形成及び相補的なＤＮＡ分子への（１２から２０ヌクレオチドの範囲の（１４から１６ヌクレオチドなど）長さを有する）リバースプライマーのハイブリッド形成は５０℃の温度で起こることが見出された。例として、それぞれが５０℃から６０℃の範囲のハイブリッド形成温度を有する伸長、リバース及びユニバーサルフォワードプライマーを設計することがしばしば望ましい。
【００４２】
幾つかの実施形態において、伸長プライマー、リバースプライマー及びユニバーサルフォワードプライマーの１つ又はそれ以上のＴｍを少なくとも５０℃まで上昇させるために、前記プライマーの少なくとも１つの中にＬＮＡ分子を取り込ませることができる。標的の第一のＤＮＡ分子にハイブリッド形成するが、伸長プライマーにはハイブリッド形成しないリバースプライマーの部分は、通例、１０ヌクレオチド長以下であるので、この部分の中にＬＮＡ分子を取り込ませることは有用であり得る。例えば、標的の第一のＤＮＡ分子にハイブリッド形成するが、伸長プライマーにはハイブリッド形成しないリバースプライマーの前記部分は、少なくとも１つの鍵型核酸分子（例えば、１から２５の鍵型核酸分子）を含み得る。幾つかの実施形態において、２つ又は３つの鍵型核酸分子は、リバースプライマーの５’末端から最初の８つのヌクレオチドの中に含まれる。
【００４３】
Ｔｍを所望の温度に上昇させるために、特異的なプライマー中に取り込まれなければならないＬＮＡ残基の数は、プライマーの長さ及びプライマーのヌクレオチド組成に主として依存する。プライマー中の１つ又はそれ以上のＬＮＡのＴｍに対する効果を測定するためのツールは、Ｅｘｉｑｏｎ， Ｂｙｇｓｔｕｂｂｅｎ ９， ＤＫ−２９５０ Ｖｅｄｂａｅｋ， Ｄｅｎｍａｒｋのインターネットウェブサイト上で入手可能である。
【００４４】
本発明の実施に際して使用されるプライマーの何れにも、１つ又はそれ以上のＬＮＡを含めることが可能であるが、ＬＮＡが伸長プライマー中に取り込まれた場合に、ｃＤＮＡの合成の効率が低いことが見出された。理論に拘泥することを望むものではないが、ＬＮＡは、逆転写酵素の活性を阻害し得る。
【００４５】
増幅されたＤＮＡ分子の量を検出及び測定する。蛍光性分子などの検出可能なマーカー分子の存在によって、増幅されたＤＮＡ分子を検出及び定量することができる。例えば、本発明の方法のＰＣＲ増幅工程の間に、優先的に又は専ら二本鎖ＤＮＡへ結合する色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）の存在によって、増幅されたＤＮＡ分子を検出及び定量することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．（２９８５１ Ｗｉｌｌｏｗ Ｃｒｅｅｋ Ｒｏａｄ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ ９７４０２）は、ＳＹＢＲグリーン色素を含む定量的ＰＣＲ反応混合物を販売している。さらなる例として、リアルタイムＰＣＲの間に産生された二本鎖ＤＮＡを標識するために使用することができる別の色素（「ＢＥＢＯ」と称される。）が、「Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１ （８）：ｅ４５ （Ａｐｒｉｌ １５， ２００３）」（参照により、本明細書中に組み込まれる。）によって記載される。同じく、例として、本発明の方法のＰＣＲ増幅工程を開始させるために、蛍光色素と消光物質を含むフォワード及び／又はリバースプライマーを使用することができる。ＰＣＲの間の標識されたプライマーの伸長後に起こる蛍光色素と消光物質の物理的な分離によって、蛍光色素は蛍光を発することが可能となり、ＰＣＲ増幅産物の量を測定するために、蛍光を使用することができる。蛍光色素と消光物質を含む市販のプライマーの例には、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー及びＵｎｉｐｒｉｍｅｒが含まれ、何れもＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．によって販売されている。
【００４６】
本発明の代表的な使用。本発明は、ミクロＲＮＡ標的分子からｃＤＮＡ分子を作製するのに有用である。当初材料中の標的ミクロＲＮＡ分子の量の測定値を与えるＤＮＡ分子の量を測定することができる。例えば、生きた細胞中の特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量を測定するために、本発明の方法を使用することができる。同じく例として、生体内の異なる細胞種中の特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量を測定することにより、体内の特異的なミクロＲＮＡ分子の分布の「地図」を作成するために、本発明を使用することができる。同じく例として、生きた細胞の集団の薬物での処理への応答など、刺激に応答した特異的なミクロＲＮＡ分子（例えば、特異的なｓｉＲＮＡ分子）の量の変化を測定するために、本発明を使用することができる。
【００４７】
従って、別の態様において、本発明は、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡの量を測定するための（すなわち、生物のミクロＲＮＡ「地図」を作成するための）方法を提供する。本発明のこの態様の方法はそれぞれ、生物内の複数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する工程を含み、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）生物の細胞種から単離された標的ミクロＲＮＡ分子に相補的な第一のＤＮＡ分子を作製するためにプライマー伸長を使用する工程；（２）ＤＮＡ分子を増幅して、増幅されたＤＮＡ分子を作製するために、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用する工程；及び（３）増幅されたＤＮＡ分子の量を測定する工程を含む方法によって測定される。この方法の幾つかの実施形態において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。増幅されたＤＮＡ分子の測定された量は、例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体（例えば、フロッピディスク）などの電気的形態の照会可能なデータベース中に格納することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態において、前記方法は、生物から得た試料中の類似配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別するために使用することができ、前記方法は以下の工程を有する。（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記第二のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの分子の第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）。同一でないミクロＲＮＡ標的の領域とハイブリッド形成するように、第一及び第二の伸長プライマーの遺伝子特異的領域を設計することによって、１つ、２つ、３つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なるミクロＲＮＡ標的を識別するために、この方法を使用し得る。
【００４９】
別の態様において、本発明は、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号１から配列番号４９９の配列からなる核酸プライマー分子を提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、哺乳動物のミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして使用することができる。
【００５０】
別の態様において、本発明は、表８に示されているように、配列番号５００から配列番号９６５からなる核酸プライマーの組を提供する。本発明のプライマー分子の組は、本明細書中に記載されている本発明の方法を用いて、ヒト、マウス及びラットから得たミクロＲＮＡ標的分子を検出するために使用することができる。
【００５１】
別の態様において、本発明は、標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な１つ又はそれ以上のプライマーの組を含み、各プライマーの組が（１）標的ミクロＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー、（２）ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー及び（３）前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリッド形成する第一の部分と及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を含む第二の部分とを含む。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む。キットの幾つかの実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも１つは、少なくとも１つの鍵型核酸分子を含む。
【００５２】
本明細書中に記載されている方法に従って、あらゆる哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを検出するために、キットに含めるための伸長プライマー、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマーを設計し得る。ヒト標的ミクロＲＮＡ標的分子の非限定的な例及び典型的な標的特異的伸長プライマー及びリバースプライマーが、下表１、表２及び表６中に列記されている。マウス標的ミクロＲＮＡ標的分子の非限定的な例及び典型的な標的特異的伸長プライマー及びリバースプライマーが、下表７中に列記されている。ユニバーサルフォワードプライマーの非限定的な例は、配列番号１３に記載されている。
【００５３】
ある種の実施形態において、キットは、各々５０℃から６０℃の範囲のハイブリッド形成温度を有する選択された標的ミクロＲＮＡ分子に対する伸長プライマー、リバース及びユニバーサルフォワードプライマーを含むプライマーの組を含む。
【００５４】
ある種の実施形態において、キットは、複数の哺乳動物ミクロＲＮＡ標的（２つのミクロＲＮＡ標的から最大数百のミクロＲＮＡ標的など）を検出するために使用され得る複数のプライマーの組を含む。
【００５５】
ある種の実施形態において、キットは、以下のヒトミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０２ａ＊、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０２ｂ＊、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３＊、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４５０、ｍｉＲ−４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ、ｌｅｔ７ｉ、ｍｉＲ−３７６ａ及びｍｉＲ−３７７。上記ミクロＲＮＡ標的の配列は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／で、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトのＷＷＷから公表されている。）中に記載されているように、「ｍｉＲＢアーゼ配列データベース」中に提供されている。
【００５６】
キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、下表１、表２及び表６中に挙げられている。
【００５７】
別の実施形態において、キットは、以下のヒトミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ３６３、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ３７９、ｍｉＲ４１０、ｍｉＲ４１２、ｍｉＲ４２４、ｍｉＲ４２９、ｍｉＲ４３１、ｍｉＲ４４９、ｍｉＲ４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ及びｌｅｔ７ｉ。キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、下表１、表２及び表６中に挙げられている。
【００５８】
別の実施形態において、キットは、以下のヒト、マウス又はラットミクロＲＮＡ標的テンプレートの少なくとも１つ又はそれ以上を検出することができる１つ又はそれ以上のプライマーの組を含む。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８。
【００５９】
キットのこの実施形態に従って使用するための典型的なプライマーが、表８に挙げられている。
【００６０】
別の実施形態において、キットは、表１、表２、表６及び表７に示されているように、配列番号２から配列番号４９３からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６１】
別の実施形態において、キットは、表６中に示されている配列番号４７、４８、４９、５０、５５、５６、８１、８２、８３、８４、９１、９２、１０３、１０４、１２３、１２４、１４５、１４６、１９３、１９４、１９７、１９８、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３９、２４０、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２７７、２７８、２８５、２８６、２８７、２８８、２９３、２９４、３０１、３０２、３０９、３１０、３１１、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３５９、３６０、３６９、３７０、３８９、３９０、３９３、３９４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１５、４１６、４１９、４２０、４２１、４２２、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４６１及び４６２からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６２】
別の実施形態において、キットは、表８に示されているように配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００６３】
本発明のキットは、プライマー伸長及び増幅反応のための試薬も提供することができる。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、以下の成分の１つ又はそれ以上をさらに含み得る。逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、Ｔｒｉｓ緩衝液、カリウム塩（例えば、塩化カリウム）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ；ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。
【００６４】
様々な実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅工程の間に、二本鎖ＤＮＡへ優先的に又は専ら結合する検出試薬（ＳＹＢＲグリーン色素又はＢＥＢＯ色素など）を含み得る。他の実施形態において、キットは、ＰＣＲ増幅産物の量を測定するための蛍光色素及び消光物質を含むフォワード及び／又はリバースプライマーを含み得る。
【００６５】
キットは、１つ又はそれ以上の哺乳動物のミクロＲＮＡ標的の検出及び定量においてキットを使用するための指示書を場合によって含む。高情報量様式で機械的な取り扱いをするのに好ましくは有用である適切な収容具の中に、キットを場合によって提供することもできる。
【００６６】
以下の実施例は、現時点で、本発明を実施するために想定されている最良の形態を例示するものに過ぎず、発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６７】
本実施例は、ミクロＲＮＡ標的分子からＤＮＡ分子を作製するための本発明の代表的な方法を記載する。
【００６８】
プライマー伸長は、（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素を使用し、酵素とともに提供された指針に従って）以下のようにして実施された。
【００６９】
以下の反応混合物を氷上で調製した。
１０ｍＭｄＮＴＰ１μＬ
２μＭ伸長プライマー１μＬ
標的テンプラート１から５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」４μＬ
０．１ＭＤＴＴ１μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１μＬ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）酵素１μＬ
２０μＬになるように水
【００７０】
５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間、混合物を温置し、次いで、室温まで冷却し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００７１】
ＰＣＲサイクル数の関数として、二本鎖ＰＣＲアンプリコンのＳＹＢＲ（Ｒ）緑色蛍光をモニタリングすることによって、ＡＢＩ ７９００ ＨＴＳ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。典型的なＰＣＲ反応混合物１０μＬは、以下のものを含有した。
２×ＳＹＢＲ（Ｒ）グリーンマスターミックス（ＡＢＩ）５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー０．８μＬ
水１．４μＬ
標的テンプレート（１０倍希釈されたＲＴ反応）２．０μＬ
【００７２】
標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定した。
【００７３】
前記方法は、全ＲＮＡの試料中に存在する内在ミクロＲＮＡを定量するための１１のプライマー伸長ＰＣＲアッセイにおいて首尾よく使用された。これら１１のアッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマーのＤＮＡ配列が、表１に示されている。
【００７４】
【表１】
【００７５】
このアッセイは、２ｎＭから２０ｆＭの濃度範囲でミクロＲＮＡを検出することが可能であった。アッセイは、合成ミクロＲＮＡの少なくとも２ｎＭの濃度（＞１，０００，０００コピー／細胞）まで線形であった。
【実施例２】
【００７６】
本実施例は、１２から３塩基対の長さの範囲の遺伝子特異的領域を有するミクロＲＮＡアッセイのための一連の伸長プライマーを用いた、プライマー伸長によって媒介される効率的なｃＤＮＡ合成に対する最少配列要件の評価を記載する。
【００７７】
プライマー伸長反応。標的分子ｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５を用いて、プライマー伸長を以下のように行った。１ｎＭＲＮＡ（１００，０００コピー／細胞）になるように、１００ｎｇ／μＬ全酵母ＲＮＡを加えたＴＥゼロ中に標的テンプレートｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５を希釈した。１００ｎｇ／μＬ全酵母ＲＮＡを加えたＴＥゼロを用いて、無テンプレート対照（ＮＴＣ）を調製した。
【００７８】
ｍｉＲ−１９５（配列番号２５から３４）に対する一連の伸長プライマー及びｍｉＲ−２１５に対する一連の伸長プライマー（配列番号３５から４４）（これらの配列は、下表２に示されている。）を用いて、（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素を使用し、酵素とともに提供されていた指針に従って）逆転写酵素反応を以下のように実施した。
【００７９】
以下の反応混合物を氷上で調製した。
セット１：無テンプレート対照
水３７．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ１２．５μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ１２．５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１２．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素１２．５μＬ
１μｇ／μＬＨｅｌａ細胞全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）１２．５μＬ
＋２μＭ伸長プライマー５０μＬ
＋ＴＥゼロ５０μＬ＋酵母ＲＮＡ
セット２：スパイク添加（Ｓｐｉｋｅ−ｉｎ）テンプレート
水３７．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ１２．５μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ１２．５μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ１２．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）１２．５μＬ
１μｇ／μＬＨｅｌａ細胞全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）１２．５μＬ
＋２μＭ伸長プライマー５０μＬ
＋１０倍ずつ系列希釈された１ｎＭＲＮＡ標的テンプレート（ｍｉＲ−１９５又はｍｉＲ−２１５）５０μＬ
【００８０】
５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間、反応を温置し、４℃まで冷却し、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００８１】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応。逆転写後、ＰＣＲサイクル数の関数として、二本鎖ＰＣＲアンプリコンのＳＹＢＲ（Ｒ）緑色蛍光をモニタリングすることによって、ＡＢＩ ７９００ ＨＴＳ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた定量的リアルタイム（ｑＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの４つ組み測定を行った。以下の反応混合物を調製した。
２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（ＡＢＩ）５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー（ｍｉＲ−１９５ＲＰ：配列番号４５又はｍｉＲ２１５ＲＰ：配列番号４６）０．８μＬ
水１．４μＬ
標的テンプレート（１０倍希釈されたｍｉＲ−１９５又はｍｉＲ−２１５ＲＴ反応）２．０μＬ
【００８２】
製造業者が推奨する条件を用いて、各試料に対して４つ組みで、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を作成した。ｍｉＲ−１９５及びｍｉＲ−２１５アッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマーのＤＮＡ配列が、下表２に示されている。ｍｉＲ−１９５に対するアッセイの結果が下表３に示されており、ｍｉＲ−２１５に対するアッセイの結果が下表４に示されている。
【００８３】
【表２】
【００８４】
結果：
ミクロＲＮＡ標的テンプレートを含有するアッセイ中において蛍光が検出されたサイクル数として定義されるサイクル閾値（Ｃｔ）値によって、各アッセイの感度を測定した。このＣｔ値が低いほど（例えば、サイクルの数が少ないほど）、アッセイの感度がより高かった。ミクロＲＮＡ試料に対して、テンプレートを含有する試料及び無テンプレート対照は何れも、最終的に検出閾値を超えるが、テンプレートを加えた試料はずっと低いサイクル数で閾値を越えることが一般に観察された。デルタＣｔ値は、テンプレート含有試料及び無テンプレート対照間のサイクル数（Ｃｔ）の差であり、アッセイのダイナミックレンジの指標としての役割を果たす。高いダイナミックレンジを有するアッセイは、極めて低いミクロＲＮＡコピー数の測定を可能とする。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイの望ましい特徴には、高い感度（低いＣｔ値）及び標的テンプレートを含有する試料と無テンプレートバックグランド対照試料のシグナル間の広いダイナミック範囲（デルタＣｔ＞１２）が含まれる。
【００８５】
１２ヌクレオチドから３ヌクレオチドまでのサイズ範囲の遺伝子特異的部分を有する伸長プライマーを使用するｍｉＲ１９５及びｍｉＲ２１５アッセイの結果が、それぞれ、下表３及び表４に示されている。これらの実験の結果は、最短３ヌクレオチドの遺伝子特異的反応開始配列がテンプレート特異的な反応開始を示すことを予想外に示している。ｍｉＲ−１９５アッセイの組（表３に示されている。）及びｍｉＲ−２１５アッセイの組（表４に示されている。）の何れに関しても、アッセイの両方の組に対するダイナミックレンジ（デルタＣｔ）は、８ヌクレオチド長以上の遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに対してかなり一貫していることを結果は示している。アッセイのダイナミックレンジ（デルタＣｔ）は、８ヌクレオチド未満の遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに対して減少し始め、ｍｉＲ−１９５アッセイ中では７ヌクレオチド未満及びｍｉＲ−２１５アッセイ中では６ヌクレオチド未満で、アッセイ特異性が低下する。ｍｉＲ−２１５試料の融点分析は、３ヌクレオチドにおいてさえ、テンプレートを加えた試料中に特異的ＰＣＲ産物が存在することを示した（データは図示せず。）。総合すると、これらのデータは、伸長プライマーの遺伝子特異的領域は、理想的には、８ヌクレオチド以上であるが、最短で３ヌクレオチドの長さであり得ることを示している。
【００８６】
【表３】
【表４】
【実施例３】
【００８７】
本実施例は、ヒトミクロＲＮＡ発現パターンの定量的分析のために設計されたアッセイ及びプライマーの組を記載する。
【００８８】
プライマーの設計：
ミクロＲＮＡ標的テンプレート：本明細書中に記載されている標的テンプレートの配列は、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。
【００８９】
伸長プライマー：（１）ＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡへ転化するために、（２）ｃＤＮＡ分子の一端に、「ユニバーサル」ＰＣＲ結合部位（配列番号１）を導入するために、及び（３）ｃＤＮＡの長さを延長して、ｑＰＣＲによるその後のモニタリングを容易にするために、ｃＤＮＡを形成し、その後に定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅を行うためのミクロＲＮＡのプライマー伸長用の遺伝子特異的プライマーを設計した。
【００９０】
リバースプライマー：包括的ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）と組み合わせて、プライマーによって伸長された完全長ｃＤＮＡを定量するために、修飾されていないリバースプライマー及び鍵型核酸（ＬＮＡ）を含有するリバースプライマー（ＲＰ）を設計した。鍵型核酸含有リバースプライマーに関して、表６に挙げられている典型的なリバースプライマー配列中に以下に示されているように、リバースプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の８ヌクレオチド内において、２つ又は３つのＬＮＡ修飾された塩基を置換した。最高の量によってプライマーの予想Ｔｍを上昇させるために、ＬＮＡ塩基の置換を選択し、好ましくは５５℃以下であるように、選択されたプライマーの最終予想Ｔｍを指定した。
【００９１】
典型的なプライマーの組を用いるアッセイを記載する例。ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４の検出が以下に記載されている。
【００９２】
プライマー伸長反応：以下のように、ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４に対応するＤＮＡテンプレートを用いて、プライマー伸長を実施した。ＴＥゼロ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７，６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）＋１００ｎｇ／μＬ酵母全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中の０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ及び１ｐＭ希釈になるように、ＤＮＡテンプレートを希釈した。
【００９３】
以下のプライマーを用いて、逆転写酵素反応を行った。
伸長プライマー（５００ｎＭになるように希釈）
ｍｉＲ−９５ＧＳＰ ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡ（配列番号１２３）
ｍｉＲ−４２４ＧＳＰ ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＴ（配列番号４１５）
リバースプライマー：（１０ｍＭになるように希釈）
ｍｉＲ−９５ ＲＰ４ ＴＴ＋ＣＡＡＣ＋ＧＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＡ（配列番号１２４）
ｍｉＲ−４２４ＲＰ２ Ｃ＋ＡＧ＋ＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴ（配列番号４１６）
逆転写（反応当り）：
水２μＬ
「５×ｃＤＮＡ緩衝液」（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）２μＬ
０．１ｍＭＤＴＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
１０ｍＭｄＮＴＰ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）０．５μＬ
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｒ）逆転写酵素（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）０．５μＬ
伸長プライマー２μＬ＋テンプレート希釈２μＬ
【００９４】
反応を混合し、５０℃で３０分間、次いで、８５℃で５分間温置し、４℃まで冷却し、ＴＥゼロで１０倍希釈した。
【００９５】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応（反応当り）：
２×ＳＹＢＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）５μＬ
水１．４μＬ
ユニバーサルプライマー（ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３））０．８μＬ
上から得られた希釈された逆転写（ＲＴ）産物２．０μＬ。
【００９６】
製造業者が推奨する条件を用いて、各試料に対して４つ組みで、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃１５秒、６０℃６０秒）の４０サイクルを通じて反応をモニターし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を作成した。代表的なｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４アッセイにおいて使用された伸長プライマー、ユニバーサルフォワードプライマー配列及びＬＮＡ置換されたリバースプライマー並びに２１２の異なるヒトミクロＲＮＡテンプレートに対するプライマーの組のＤＮＡ配列が、下表６に示されている。高いダイナミックレンジで高感度アッセイを達成するために大規模な検査と設計の改変を必要とするアッセイ用のプライマーの組が、プライマー名の後に＃記号を付して表６に示されている。
【００９７】
結果：
表５は、図２に示されているグラフ中にプロットされている、ｍｉＲ−９５及びｍｉＲ−４２４アッセイから得られたＣｔ値（４つの試料からの平均）を示している。勾配（列６）、切片（列７）及び背景（列８）として表記されている表６中に示されたアッセイパラメータの重要性を説明するための代表例として、これらのアッセイの結果が挙げられている。
【００９８】
表５に示されているように、様々な濃度の各テンプレートに対するＣｔ値が記載されている。図２に示されているように、各アッセイに対する標準曲線を作成するために、テンプレート濃度（ｙ軸）の関数として、Ｃｔ値（ｘ軸）がプロットされる。勾配及び切片は、各ミクロＲＮＡに対して、コピー数／細胞の推定を可能とするアッセイ測定の特徴を規定する。例えば、ｍｉＲ−９５アッセイに対して、全ＲＮＡ入力５０μｇに対するＣｔ値をプロットすると、それぞれ、−０．３５６９及び９．６５５の勾配及び切片で、標準曲線が作成される。これらの標準曲線のパラメータが未知の試料のＣｔ（ｘ）に対して適用されると、ｌｏｇ１０（コピー／全ＲＮＡ２０ｐｇ）（ｙ）が得られる。平均的な細胞は全ＲＮＡ２０ｐｇを与えるので、これらの測定は、ミクロＲＮＡのコピー数／細胞に等しい。バックグラウンドは、試料中で測定できる最少のコピー数の推計を与え、この式中に無テンプレート対照（ＮＴＣ）値を挿入することによって計算される。本実施例では、表６に示されているように、ｍｉＲ−９５は、ＲＮＡ入力５０μｇで、１．６８コピー／２０ｐｇのバックグラウンドを与える。
【００９９】
表６にさらに示されているように、ＬＮＡを含有しないリバースプライマーも、本発明の方法に従って使用され得る。例えば、配列番号４９４から４９９参照。リバースプライマー配列番号４９４から４９９を含有する非ＬＮＡを用いたアッセイの感度及びダイナミックレンジは、ＬＮＡ含有リバースプライマーを用いて、対応するアッセイと類似の結果を与えた。
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【実施例４】
【０１０２】
本実施例は、マウスｍｉＲＮＡ発現パターンの定量的分析のために設計されたアッセイ及びプライマーを記載する。
【０１０３】
方法：表７に記載されている代表的なマウスミクロＲＮＡ標的テンプレートは、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。下表７に示されているように、マウスミクロＲＮＡテンプレートは、対応するヒトミクロＲＮＡテンプレートと完全に同一であり、重複配列中が同一で、末端が異なり、又はヒトミクロＲＮＡ配列と比べて、１つ若しくはそれ以上の塩基対の変化を含有する。対応するヒトテンプレートと同一であり、又は対応するヒトテンプレートと同一の重複配列を有するマウスミクロＲＮＡテンプレートは、表７に示されているように、ヒトミクロＲＮＡテンプレートに対して設計された同じプライマーの組を用いてアッセイすることができる。対応するヒトテンプレートと比べて１つ又はそれ以上の塩基対の変化を有するマウスミクロＲＮＡテンプレートに対して、マウスミクロＲＮＡを検出するために特異的にプライマーセットの組が設計され、これらのプライマーは表７に記載されている。マウスミクロＲＮＡテンプレートを検出するための伸長プライマー反応及び定量的ＰＣＲ反応は、実施例３に記載されているように実施し得る。
【０１０４】
【表７】
【実施例５】
【０１０５】
本実施例は、本発明の実施形態に従う方法を用いて、１２の異なる組織から単離された全ＲＮＡ中の３つのミクロＲＮＡに対する発現プロファイルの検出及び分析を記載している。
【０１０６】
方法：以下の組織から単離されたプライマー伸長反応１０μＬ当りＦｉｒｓｔ Ｃｈｏｉｃｅ全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）０．５μｇを用いて、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡテンプレートの定量的分析を測定した。脳、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ、卵巣、骨格筋、脾臓、胸腺及び子宮。以下のＰＣＲプライマーを使用し、実施例３に上述されているように、プライマー伸長酵素及び定量的ＰＣＲ反応を実施した。
【０１０７】
ｍｉＲ−１テンプレート
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣ（配列番号４７）
リバースプライマー：Ｔ＋Ｇ＋ＧＡＡ＋ＴＧ＋ＴＡＡＡＧＡＡＧＴ（配列番号４８）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
ｍｉＲ−１２４テンプレート：
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣ（配列番号１４９）
リバースプライマー：Ｔ＋ＴＡ＋ＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＴ（配列番号１５０）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
ｍｉＲ−１５０テンプレート：
伸長プライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＧＴＡ（配列番号２１３）
リバースプライマー：Ｔ＋ＣＴ＋ＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧ（配列番号２１４）
フォワードプライマー：ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３）
結果。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４及びｍｉＲ−１５０に対する発現プロファイルが、それぞれ、図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示されている。図３Ａから３Ｃ中のデータは、全ＲＮＡ１０ｐｇ当りのミクロＲＮＡコピーの単位（ｙ軸）で表されている。通例、ヒト細胞株は、細胞当りの全ＲＮＡ１０ｐｇ以下を与えるので、これらの単位を選択した。従って、示されているデータは、細胞当りのミクロＲＮＡコピーの推計である。ｘ軸上の数は、以下の組織に対応する。（１）脳、（２）心臓、（３）腸、（４）腎臓、（５）肝臓、（６）肺、（７）リンパ、（８）卵巣、（９）骨格筋、（１０）脾臓、（１１）胸腺及び（１２）子宮。
【０１０８】
以前の報告と合致して、（図３Ａに示されているように）横紋筋特異的発現の極めて高いレベルがｍｉＲ−１に対して見出され、（図３Ｂに示されているように）脳発現の高いレベルがｍｉＲ−１２４に対して見出された（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ９：１７５−１７９，２００３参照）。定量的分析によって、これらのミクロＲＮＡは、細胞当り１０から数１０万のコピーで存在することが明らかとなる。これらのデータは、ｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１２４レベルの定量的ノーザンブロットの推計と合致している（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４３３：７６９−７７３，２００５参照）。図３Ｃに示されているように、ｍｉＲ−１５０は、免疫に関連するリンパ節、胸腺及び脾臓試料中で高度に発現されていることが見出され、同じく以前の知見と合致していた（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ ７７：２４１−２４７， ２００５参照）。
【実施例６】
【０１０９】
本実施例は、興味を有する哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのプライマーの選択及び検証について記載する。
【０１１０】
論拠：単一の試料中の複数のミクロＲＮＡ標的を検出するために複数のアッセイ（すなわち、多重ＰＣＲ）を実施するためには、単一のユニバーサルプライマーを用いて、一般的な緩衝系中において、均一な逆転写酵素とＰＣＲサイクル条件下でアッセイが機能することが重要である。指定された反応条件下で良好に機能する所望のミクロＲＮＡ標的に対して有用なプライマーの組を同定するために、以下のプライマー設計原理及び高情報量アッセイを使用した。
【０１１１】
プライマーの設計：
実施例２に記載されているように、本発明の方法を用いて哺乳動物のミクロＲＮＡ標的を検出するためのアッセイの感度は、サイクル閾値（Ｃｔ）の値によって測定され得る。Ｃｔ値が低いほど（例えば、サイクルの数が少ないほど）、アッセイの感受性がより高い。デルタＣｔ値は、テンプレート含有試料と無テンプレート対照との間のサイクル数（Ｃｔ）の差であり、アッセイのダイナミックレンジの指標としての役割を果たす。高いダイナミックレンジを有するアッセイは、極めて低いミクロＲＮＡコピー数の測定を可能とする。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイの望ましい特徴には、高い感度（低いＣｔ値）（好ましくは、約１０から約２０などの、約５から約２５の範囲）及び標的テンプレートを含有する試料と無テンプレートバックグラウンド対照試料のシグナル間の広いダイナミックレンジ（好ましくは、デルタＣｔ１２以上など、約１０から３５の範囲）が含まれる。
【０１１２】
ミクロＲＮＡ標的テンプレート：代表的な哺乳動物のミクロＲＮＡ標的テンプレート（ｈ＝ヒト、ｒ＝ラット、ｍ＝マウス）が表９に挙げられており（配列番号９６６から配列番号１０４３）、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１」及び「Ｇｒｉｆｆｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４」に記載されているように、「ｍｉＲＢａｓｅ配列データベース」中のＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからインターネットを通じて公開されており、アクセスすることが可能である。
【０１１３】
伸長プライマー：
実施例１から５に記載されているようにして得られた経験的データは、主として、遺伝子特異的（ＧＳ）伸長プライマーが本明細書中に記載されている方法を用いて哺乳動物のミクロＲＮＡ標的を検出するためのアッセイのダイナミックレンジを決定することを示唆する。実施例２に記載されているように、検査されるアッセイのダイナミックレンジ（デルタＣｔ）及び特異性は、６から７未満のヌクレオチドの遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーに関して減少することが決定された。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイを最適化するために、興味が持たれるミクロＲＮＡ標的と重複する７から１０のヌクレオチドを有する伸長プライマーを設計した。表９中に列記されているミクロＲＮＡ標的に対する典型的な伸長プライマーが、表８に挙げられている（配列番号５００から配列番号９６５）。これらの典型的な伸長プライマーは、興味が持たれるミクロＲＮＡ標的と重複する７から１０ヌクレオチドの遺伝子特異的（ＧＳ）領域を有する。
【０１１４】
リバースプライマー：
包括的ユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）と組み合わせて、プライマーによって伸長された完全長ｃＤＮＡを定量するために、修飾されていない及び鍵型核酸（ＬＮＡ）を含有するリバースプライマーを設計した。実施例１から５に記載されているようにして得られたデータに基づいて、リバースプライマーの設計がＰＣＲ反応の効率に寄与することが決定され、リバースプライマーが長いほど、ＰＣＲの成績が向上することが観察された。しかしながら、伸長プライマーとの重複が長いほど、バックグラウンドが高くなることも観察された。従って、非特異的バックグラウンドシグナルを低下させるために、伸長プライマーの遺伝子特異的部分との重複を最小限に抑えながら可能な限り長くリバースプライマーを設計した。
【０１１５】
さらに、実施例３に記載されているように、プライマーの予想Ｔｍを上昇させるように、ＬＮＡ塩基の置換を選択することができ、通例、２つ又は３つのＬＮＡ塩基置換がリバースプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端から最初の８つのヌクレオチド内において置換する。表９に列記されているミクロＲＮＡ標的に対する典型的なリバースプライマーが、表８に挙げられている。これらの典型的なリバースプライマーはＬＮＡ塩基置換（ヌクレオチドの前の「＋」記号がＬＮＡ置換を表す。）を含有するが、この特徴は場合によって存在するものであり、必須ではない。
【０１１６】
所望の標的に対するプライマーの選択及び検証：
アッセイオリゴヌクレオチドの選択は、以下のように、２段階で行われる。
【０１１７】
１）プライマーの設計は、上記原理を用いて決定した。典型的には、興味が持たれる各ミクロＲＮＡ標的に対して、４つの伸長プライマーの候補及び２つのリバースプライマーの候補を設計した。各組の伸長プライマーは、３’末端において、それぞれ、７、８、９及び１０ヌクレオチドだけ遺伝子特異的領域と重複している。これらの設計原理に従って設計された典型的プライマーが、表９に列記されているミクロＲＮＡ標的に対して表８に挙げられている。
【０１１８】
候補プライマーの組を検証するためのアッセイの設計（アッセイ＃１）：
ミクロＲＮＡ標的：
典型的な標的ミクロＲＮＡｍｉＲ−４９５は、表９において「ｈｍｒ」−ｍｉＲ−４９５の表記によって示されているように、ヒト（ｈ）、マウス（ｍ）及びラット（ｒ）にわたって保存されたＲＮＡ標的配列（配列番号９６６）を有する。従って、この標的配列に対して設計されたプライマーは、ヒト、マウス及びラットから得られた試料中のｍｉＲ−４９５を検出するのに有用であると予想される。
【０１１９】
ミクロＲＮＡｍｉＲ−４９５標的ＲＮＡ配列：５’ＡＡＡＣＡＡＡＣＡＵＧＧＵＧＣＡＣＵＵＣＵＵ３’（配列番号９６６）
【０１２０】
【化１】
【０１２１】
２）実施例２に記載されているアッセイ法を用いて、定量的ＰＣＲアッセイの高い感度と高いダイナミックレンジを示す対を見出すために、上記のように設計されたプライマーを調べた。ＤＮＡテンプレートの存在又は不存在下で、プライマーの全ての組み合わせを調べることによって、標的ミクロＲＮＡに対して伸長プライマーとリバースプライマーの最適な組み合わせを決定した。ＲＮＡより分解される可能性がより低いので、オリゴ対を調べるために、ＲＮＡテンプレートよりむしろＤＮＡを使用することが好ましい。分解されたテンプレートは、誤った結論を与えるアッセイデータをもたらす。従って、ＨＰＬＣによって精製されたＤＮＡテンプレート分子が好ましい。
【０１２２】
表８は、（表９に示されている）７８のミクロＲＮＡ標的に対する検出アッセイにおいて使用するための典型的なプライマーの組を示す。ヒト（ｈ）、マウス（ｍ）及びラット（ｒ）ミクロＲＮＡ又は１つ若しくはそれ以上の種から得られたミクロＲＮＡを特異的に検出するように、これらのアッセイにおいて使用するための候補プライマーを設計した。例えば、「ｈｍｒ」という接頭辞が付されているアッセイは、３つ全ての種内に完全に保存されたミクロＲＮＡを検出するように設計されているのに対して、「ｍｒ」という接頭辞はマウスとラット間で保存されているが、ヒトでは保存されていないミクロＲＮＡを検出するようにアッセイが設計されていることを意味する。プラス（＋）記号が前に付されているヌクレオチドは、場合によって鍵型であり得る（ＬＮＡ）。表９は、各アッセイに対するミクロＲＮＡ標的配列を示している。
【０１２３】
【表８】
【０１２４】
【表９】
【０１２５】
アッセイフォーマット：
以下のように、表８中に上記されている幾つかの候補プライマーの組を、高情報量アッセイ検査形式で検査した。
【０１２６】
各検査アッセイ（例えば、表８中に列記されているアッセイ＃７５、＃７６、＃７７及び＃７８）は、９６ウェルプレートの４×４ウェル中で行われ（９６ウェルプレート当り６つのアッセイ）、これにより、各標的に対して最適なプライマー対を迅速に決定することが可能となった。
【０１２７】
各アッセイに対して、４つの候補伸長（ＧＳ）プライマーの各々を、９６ウェルプレートの別個の列中において検査した。テンプレートを加えて（１ｎＭＤＮＡ）又は除いて（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｎｇ／μＬ酵母全ＲＮＡ）、２つのリバースプライマーの各々を検査した。逆転写後、２つ組みの無テンプレート対照とテンプレート試料の一方の組をリバースプライマー１（ＲＰ１）に対して、他方をリバースプライマー２（ＲＰ２）に対して検査した。
【０１２８】
逆転写酵素アッセイの条件：
ＲＴマスターミックス６μＬを９６ウェルの全てに添加した。
０．５μＭＧＳプライマー２μＬを、４つの連続するウェルに添加した。
ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）中の酵母ＲＮＡを、全ての奇数番号のウェルに添加し、予め希釈されたＤＮＡテンプレートを偶数番号のウェルに添加した。
【０１２９】
試料をよく混合し、逆転写酵素段階を実施した後、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．６、０．１ｍＭＥＤＴＡ）８０μＬで希釈した。
【０１３０】
ユニバーサルプライマーに加えて適切なリバースプライマーを含有するウェル当り８μＬのＰＣＲ混合物が予め搭載された３８４ウェルのＰＣＲプレートの４つ組みウェル中に、逆転写混合物２μＬを移した。
【０１３１】
３８４プレートと適合するリアルタイムＰＣＲ装置上で、定量的ＰＣＲ反応の結果を評価した。
【０１３２】
０．０１のベースライン閾値に基づいて、ＰＣＲ反応に対するＣｔ値を測定した。感度（１ｎＭテンプレートのＣｔ値）及びダイナミックレンジ（無テンプレート対照のＣｔから１ｎＭテンプレートのＣｔを差し引いたもの）を、各アッセイ中で各プライマー対に対して測定した。表８に列記されている典型的なアッセイ＃７５、＃７６、＃７７及び＃７８の結果が、下表１０に示されている。
【０１３３】
【表１０】
【０１３４】
優れた感度（例えば、５と２５の間の好ましい範囲）及びダイナミックレンジ（例えば、１０と３５の間の好ましい範囲）の特徴に基づいて、最適なプライマー対を同定した。表１０に上記されているように、ｍｉＲ−１９４：ＧＳ８（配列番号９４６）及びＲＰ１（配列番号９４８）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び１７のダイナミックレンジを有していた。ｍｉＲ−１：ＧＳ１０（配列番号４７）及びＲＰ２（配列番号４８）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び１５のダイナミックレンジを有していた。ｍｉＲ−２０６：ＧＳ７（配列番号９５３）及びＲＰ２（配列番号９５５）に対して最適なプライマー対が同定され、１３の感度及び２０のダイナミックレンジを有していた。同じく表１０に示されているように、ＧＳプライマーは、ＧＳ９からＧＳ８に至る（（バックグラウンドの減少によって生じる）ダイナミックレンジの著しい増加によって示されるように）特異性を調節する（例えば、ｍｉＲ−１９４参照）。
【０１３５】
表８に列記されているさらなる典型的プライマー又は本明細書中に記載されている設計原理を用いて設計された他の候補プライマーなどの、上記原理に基づいて設計された候補プライマーは、上記スクリーニング法を用いて検査され得る。分解されたテンプレートに伴う問題を回避するために、ＨＰＬＣによって精製されたテンプレートを使用することにより、アッセイをさらに最適化し得る。
【０１３６】
１、２又は３つのヌクレオチドの変化のみが配列中で互いに異なるミクロＲＮＡは、本明細書中に記載されている設計原理及び方法に従って設計されたプライマーの使用を通じて、互いに容易に区別できることも決定された。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態を例示し、説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、本発明に様々な変化を施し得ることが理解される。
【０１３８】
独占的な権利又は特権が請求されている本発明の実施形態は、以下のように定義される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのキット。
【請求項２】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１のキット。
【請求項３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む、請求項１のキット。
【請求項４】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な少なくとも１つのプライマーの組を含む少なくとも１つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットであって、前記プライマーの組が、
（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー（伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡにハイブリッド形成する第一の部分及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を有する第二の部分を含む。）；
（２）伸長プライマー上のハイブリッド形成配列にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー並びに
（３）ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含み、
少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８からなる群から選択される、キット。
【請求項６】
ユニバーサルフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの少なくとも１つが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
伸長プライマーが１０から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
伸長プライマーの第一の部分が３から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項９】
伸長プライマーの第二の部分が１８から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１０】
伸長プライマーの第二の部分が配列番号１の核酸配列を含む核酸配列を有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１１】
ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーが１６から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１２】
ユニバーサルフォワードプライマーが配列番号１３に示されている核酸配列からなる、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
リバースＰＣＲプライマーが１０から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１４】
リバースＰＣＲプライマーが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む１から２５の核酸分子を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡがヒトミクロＲＮＡである、請求項５に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡがマウスミクロＲＮＡである、請求項５に記載のキット。
【請求項１７】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１８】
生物から得た試料中の類似の配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別する方法であって、
（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；
（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；
（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記二一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；
（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；並びに
（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）
を含む、方法。
【請求項１】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、少なくとも１つの哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのキット。
【請求項２】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１のキット。
【請求項３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む、請求項１のキット。
【請求項４】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される哺乳動物のミクロＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
標的ミクロＲＮＡの検出に対して特異的な少なくとも１つのプライマーの組を含む少なくとも１つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットであって、前記プライマーの組が、
（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を作製するための伸長プライマー（伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡにハイブリッド形成する第一の部分及びユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーに対するハイブリッド形成配列を有する第二の部分を含む。）；
（２）伸長プライマー上のハイブリッド形成配列にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー並びに
（３）ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリッド形成するように選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含み、
少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８ｂ、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９１ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ｂ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３５１、ｍｉＲ−３６２、ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４５５、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−４８９、ｍｉＲ−４９０、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−５００、ｍｉＲ−５０１、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１９ａ、ｍｉＲ−５１９ｂ、ｍｉＲ−５１９ｃ、ｍｉＲ−５１９ｄ、ｍｉＲ−５２０ａ、ｍｉＲ−５２０ｂ、ｍｉＲ−５２０ｄ、ｍｉＲ−５２０ｅ、ｍｉＲ−５２０ｆ、ｍｉＲ−５３２、ｍｉＲ−５３９、ｍｉＲ−５４２−３ｐ、ｍｉＲ−５４２−５ｐ、ｍｉＲ−６１５、ｍｉＲ−６５２、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−６７５−５ｐ、ｍｉＲ−６９９、ｍｉＲ−７２１及びｍｉＲ−７５８からなる群から選択される、キット。
【請求項６】
ユニバーサルフォワード及びリバースＰＣＲプライマーの少なくとも１つが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む少なくとも１つの核酸分子を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
伸長プライマーが１０から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
伸長プライマーの第一の部分が３から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項９】
伸長プライマーの第二の部分が１８から２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１０】
伸長プライマーの第二の部分が配列番号１の核酸配列を含む核酸配列を有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１１】
ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーが１６から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１２】
ユニバーサルフォワードプライマーが配列番号１３に示されている核酸配列からなる、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
リバースＰＣＲプライマーが１０から１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項５に記載のキット。
【請求項１４】
リバースＰＣＲプライマーが、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む１から２５の核酸分子を含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１５】
少なくとも１つの哺乳動物の標的ミクロＲＮＡがヒトミクロＲＮＡである、請求項５に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１つの標的ミクロＲＮＡがマウスミクロＲＮＡである、請求項５に記載のキット。
【請求項１７】
配列番号５００から配列番号９６５からなる群から選択される少なくとも１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１８】
生物から得た試料中の類似の配列を有する２つ又はそれ以上の哺乳動物の標的ミクロＲＮＡを識別する方法であって、
（ａ）第一のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第一の伸長プライマーを用いて、前記第一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第一のＤＮＡ分子を作製する工程；
（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第一のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡ分子の第一の集団を作製するために、第一のＤＮＡ分子を増幅する工程；
（ｃ）第二のミクロＲＮＡ分子に対して特異的な第二の伸長プライマーを用いて、前記二一のミクロＲＮＡ分子に対して相補的な第二のＤＮＡ分子を作製する工程；
（ｄ）ユニバーサルフォワードプライマー及び第二のリバースプライマーを用いて、増幅されたＤＮＡの第二の集団を作製するために、第二のＤＮＡ分子を増幅する工程；並びに
（ｅ）増幅されたＤＮＡ分子の第一及び第二の集団の量を測定する工程（第一及び第二の伸長プライマー又は第一及び第二のリバースプライマーは、標的ミクロＲＮＡに相補的な部分中において、１つ又はそれ以上のヌクレオチドが異なっている。）
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５３３５０１（Ｐ２０１０−５３３５０１Ａ）
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１７１７８（Ｐ２０１０−５１７１７８）
【出願日】平成２０年７月１８日（２００８．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０４３０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２４３３
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０５４４１９０４）ロゼッタ インファーマティックス エルエルシー (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１８日（２００８．７．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０４３０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１２４３３
【国際公開日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【出願人】（５０５４４１９０４）ロゼッタ インファーマティックス エルエルシー (9)
【Ｆターム（参考）】
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