強心配糖体に耐性な非免疫原性の選択マーカー
強心配糖体（例えばウアバイン）に対して耐性の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１−サブユニットタンパク質、同様に、その製造方法および使用を開示する。強心配糖体への耐性は、アミノ酸６５〜１３３の間およびその中に位置する領域を変更することによって得られる。このような組換えタンパク質およびそれを発現する核酸コンストラクトは、遺伝子治療および調査用途において、選択マーカーとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、強心配糖体に対して耐性な組換えヒトタンパク質、特にウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット、および、それに対応する核酸コンストラクト、同様に、療法および調査におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、個体の１またはそれ以上の遺伝子発現を改変すること、または、異常な遺伝子を修正することのいずれかによって病気を治療するアプローチである。現在、薬物ではなくＤＮＡを投与することによって、多くの様々な病気が、遺伝子治療のための候補として調査されている。このような病気としては、遺伝的障害、例えば嚢胞性線維症、心臓血管疾患、様々な形態のガン、同様に、感染性の病気、例えばＡＩＤＳが挙げられる。エクスビボまたはインビボで遺伝子を細胞にトランスファーする際、遺伝子改変細胞が未改変細胞に対して選択的な利点を有さない場合、選択が必要なこともある。また、新規の遺伝子を摂取した細胞を患者にトランスファーする前に、それらの十分な増殖を確実にすることも望ましい。
【０００３】
遺伝子治療の実践的な使用は、様々な理由のために未だに限定されており、その理由の一つは、遺伝子トランスファー効率が低いことと、高濃度の、または純粋な遺伝子改変細胞群を得るために、インビトロで改変された細胞培養を選択することが必要なことである。従来、遺伝子改変細胞を選択するための様々なマーカー遺伝子が用いられてきた。これらは、２つの種類、すなわち細胞表面マーカー、および、代謝性の選択マーカーに分類される。
【０００４】
細胞表面マーカー遺伝子によって改変された細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または免疫磁気技術によって選択することができる。通常、細胞表面マーカーによれば、迅速な選択手順を実現することができるが、レトロウイルスのエンベロープ中のマーカータンパク質が標的細胞の原形質膜にトランスファーされることにより、導入後あまり早期に選択を実行すると、偽陽性の選択の危険が生じる。さらに、ＦＡＣＳは開放系であるため、滅菌状態を維持することが難しくなる。加えて、大量の細胞のソーティングは、相当な時間を要する。免疫磁気ソーティングの一般的な欠点は、遺伝子改変細胞の回収率が低いことである。導入遺伝子が高く発現される細胞のみが効率的にソーティングされる。低い回収率は大量の開始材料を必要とし、経済的に好ましくない。
【０００５】
代謝性の選択マーカーにより、効率的でバックグラウンドフリーな遺伝子改変細胞選択が可能であるが、通常、選択期間は長く、典型的には約１週間〜１０日間継続させる。また、選択物質は、直接的にＤＮＡにダメージを与えるものであってもよい。
【０００６】
さらに、非ヒト遺伝子または遺伝子フラグメントが、遺伝子改変細胞に対して免疫反応を引き起こすという大きな危険がある。従って、このような遺伝子で改変されたヒト細胞は、免疫系によって除去される可能性があるが、細胞表面マーカーの場合、これらは一般的にヒト由来であるため、免疫原性は通常問題にはならない。対照的に、代謝性の選択マーカーは、場合によっては非哺乳動物由来であり、免疫原性の問題が指摘されている。
【０００７】
現在の選択マーカーに関するその他の問題は、正常な細胞機能に与えるそれらの推定上の影響である。これは、細胞の形質転換に影響する可能性のある細胞の変更を引き起こす危険を提唱している。
【０００８】
Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、全ての哺乳動物細胞に存在するハウスキーピング酵素である。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、ナトリウムイオンを細胞外に輸送し、カリウムイオンを細胞内に輸送することによって（割合３：２で）細胞質膜を介した電気化学的な勾配を成り立たせている内在性膜タンパク質であり、これは、エネルギー源としてＡＴＰ加水分解を利用している。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの活性における変化は、多数の重要な細胞機能に効果を有する。膜で活性な最小限機能的な酵素は、α−サブユニットとβ−サブユニットからなる二量体である。ヒトおよびラットにおいて、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα−サブユニット遺伝子ファミリーの４種のアイソフォーム（α1、α2、α3およびα4）がクローニングされており、α1が強心配糖体に対して最も耐性を有するアイソフォームである。
【０００９】
強心配糖体は、天然に存在する化合物であり、哺乳動物の心臓の収縮力とリズムに影響を有することがわかっている。例えば、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）由来のジゴキシンおよびジギトキシン、および、一般的なジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）；カイソウ（Ｕｒｇｉｎｅａ（Ｓｃｉｌｌａ） ｍａｒｉｔｉｍｅ）由来のプロシラリジンＡ、ストロファンツス・グラツス（Ｓｔｒｏｐｈａｎｔｕｓ ｇｒａｔｕｓ）由来のウアバイン（Ｇ−ストロファンチン）；メイフラワー（リリー・オブ・ザ・バレー（Ｌｉｌｙ−ｏｆ−ｔｈｅ−ｖａｌｌｅｙ），コンバラナ・マジャリス（Ｃｏｎｖａｌｌａｎａ ｍａｊａｌｉｓ））由来のコンバラトキシン；および、珊瑚のパリトア・トキシア（Ｐａｌｙｔｈｏａ ｔｏｘｉｃａ）由来のパリトキシンが挙げられる。いずれの強心配糖体も、１またはそれ以上のグルコース様分子に結合したステロイド部分を含むと考えられている。
【００１０】
ウアバインは、上記の薬物群のメンバーの一つであり、α−サブユニットに結合し、酵素のＡＴＰアーゼとイオン輸送活性を阻害することが示されている。この説明では、強心配糖体の一例としてウアバインが用いられる。
【００１１】
上述したように、現在の選択方法は、細胞選択に悪い影響を与える数々の短所がある。従って、インビトロでの用途、同様に、高い効率で免疫原性が最小のヒトの遺伝子治療において使用するための、迅速な選択マーカーが必要である。また、このようなマーカーは、薬物の毒物学、毒性メカニズムの研究、インビトロで新規の薬物のスクリーニング等のための方法に広範な用途を有するとも予測される。
【００１２】
一つの本発明の目的は、このようなマーカー、同様に、その製造方法および使用を利用可能にすることである。さらなる目的、本発明によって提供される解決策、同様に、それらの利点は、以下の説明および実施例を研究すれば当業者にとって明白であると予想される。
【００１３】
ウアバイン感受性は、様々な哺乳動物種間で大きな違いが天然に存在する。ラットおよびマウスのＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、強心配糖体への高い耐性を示すが、ヒト、ヒツジ、サルおよびブタのタンパク質は高い感受性を有する（Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９６８２〜２９６８７，１９９６年）。早くも１９８８年に、ＰｒｉｃｅおよびＬｉｎｇｒｅｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１，２７：８４００〜８４０８）は、ヒツジタンパク質のウアバイン感受性に関与する決定因子は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰαサブユニットのアミノ末端半分に位置することを示唆している。様々な非ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの耐性を増加させるための数々の試みがなされてきたが、成功率はまちまちであり、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの高度に耐性の表現型は達成されていない。
【００１４】
ＵＳ６,３０９,８７４（Ｂｅｌｕｓａ）は、アミノ酸位置７９９および／または８０１における点突然変異を含み、非ヒト哺乳動物細胞系にトランスフェクトされたラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα1遺伝子に基づく選択システムを提唱している。
【００１５】
Ｃｏｐｐｉ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：２４９４〜２５０５，１９９９年）は、α1およびα2ラットアイソフォームのウアバイン親和性部分に隣接するＭ１−Ｍ２ループにおける電荷を有する残基の組合せの作用を研究した。彼等は、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのウアバイン感受性は、Ｍ１−Ｍ２ループに隣接する残基の同一性だけでなく、それらが導入される環境にも依存することを報告している。彼等はまた、これらの残基が、ウアバインが優先的に結合するＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのＥ２コンフォメーションを、不安定化するか、または、変更することによって、ウアバイン感受性に影響を与える可能性があることを示唆している。
【００１６】
Ｄｅ Ｆｕｓｃｏ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３：１９２〜１９６ ２００３年−２００３年１月２１日に出版）は、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα2サブユニットをコードする遺伝子における突然変異、および、それらと家族性片麻痺性偏頭痛２型との関連を研究した。突然変異α2およびβ2サブユニットのイオン輸送機能を調査するために、彼等は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ活性を用いた。第一の細胞外ループに２つのアミノ酸突然変異（Ｑ１１６ＲおよびＮ１２７Ｄ）を導入することによって、α2およびβ2サブユニットをウアバイン耐性にした。しかしながら、アミノ酸レベルでの、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼにおけるα1アイソフォームとα2アイソフォームとの相同性は低く（すなわちわずか約８７％）、それゆえに、α1遺伝子で同じ突然変異を起こすことによって、同じ望ましい作用が生じると推測することはできない。
【００１７】
Ａｉｎｔｓ等（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：９６９〜９７７，２００２年）は、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを用いた、ヒト細胞におけるウアバイン耐性の増加を達成したが、この場合、標的化した変異誘発によって７９９位のロイシンが、システインで置換されている。
【００１８】
Ｅｍａｎｕｅｌ等（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９：３７４４〜３７４９，１９８９年）は、差異的なウアバイン感受性に寄与するＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのαサブユニット内の決定因子を研究した。彼等は、ウアバイン耐性αサブユニットのｃＤＮＡと、ウアバイン感受性αサブユニットのｃＤＮＡとのキメラｃＤＮＡ分子を構築した。ヒトのα１サブユニットの５’末端を、ラットのα１のｃＤＮＡの５’末端で置換することによって、Ｅｍａｎｕｅｌ等は、アミノ末端に、ラットのα１サブユニットの１７２個のアミノ酸残基を含む組換えタンパク質を得た。このコンストラクトをアフリカミドリザルＣＶ−１細胞にトランスフェクトしたところ、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、１０-4Ｍウアバインに対して耐性であることが示された。しかしながら、このコンストラクトは、ヒト細胞にトランスフェクトされておらず、ヒト細胞における前記コンストラクトの機能性および免疫原性は、この研究から推定することはできない。このようなラット遺伝子から誘導された大規模な置換を含むコンストラクトは、ヒト細胞に高い免疫原性を付与する可能性が高く、従って、ヒトの遺伝子治療で用いるための選択マーカーとして適切ではない。
【００１９】
すなわち、これら従来技術は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに関する生物学では、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットにおけるウアバイン耐性の増加を付与するアミノ酸が同一であるという証拠を得ることができず、それゆえに、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１遺伝子を、ヒトの遺伝子治療のための効率的な選択マーカーに発展させることができるという証拠または提案を提供することに成功していないを説明している。すなわち、ヒトの遺伝子治療および調査で用いるための、非免疫原性の、迅速で信頼できる選択マーカーが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、高い強心配糖体耐性を有する組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質、特に、このような高い強心配糖体耐性を付与する組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットポリペプチドに関する。前記組換えタンパク質は、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに少なくとも９８％相同である。本組換えα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列の相違点は、配列番号１のヒトＮａ＋、Ｋ＋ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの番号６５〜１３３またはそれらの機能に同等な相同体に対応するアミノ酸の間およびその中に位置する。
【００２１】
添付された配列表（パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ）３．１ソフトウェアを用いて作製された）では、ヒト野生型Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに関するアミノ酸配列（配列番号１）、本発明の一実施形態に係る組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列（配列番号２）、および、前記タンパク質に対応する組換え核酸をコードする配列（配列番号３）を開示している。実施例で用いたプライマーは、配列番号４〜２１として開示されている。最小２個のアミノ酸置換を示すアミノ酸配列が、配列番号２３として開示されており、それに対応するコード配列は、配列番号２４として開示されており、いずれも本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００２２】
本発明のさらなる形態、およびそれらの利点は、以下の説明、実施例、図面および添付の請求項から明らかになると予想され、これらは参照により本発明に加入させる。
【００２３】
本発明を、以下の説明、実施例、および添付の図面でより詳細に説明する：
図１は、ウアバインで誘導された細胞死への耐性に関して試験したコンストラクトの概略図を示す。これらのコンストラクトを含むプラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａおよびＣＯＳ−７細胞を、１０μＭウアバイン中で、それぞれ２４時間および４日間インキュベートし、続いて、解析した。上から６個のコンストラクトは、ウアバインで誘導された細胞死への耐性を付与したが、その下の８個のコンストラクトは付与しなかった。
図２は、一時的なトランスフェクションの後、ウアバインを用いてＨｅＬａ細胞を選択した結果を図示する。トランスフェクションの２４時間後にウアバインを細胞に加えた。４８時間後、トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。次の日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を用いて解析した。細胞は、トランスフェクトされていない（コントロール）か、または、フレーム内にＥＧＦＰをコードするＣ１プラスミド、ラットＯｕａＲ（ｐＥＧＦＰＲ）、または、アミノ酸置換Ｑ１１８Ｒ、Ｎ１２９Ｄを有するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）でトランスフェクトされた。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明の明細書および請求項の文中で、用語「機能的に相同な」または「機能的に同等な」は、開示された配列との構造的な相同性は低いが、健康な生物または病気の生物のいずれかにおいて、インビボおよび／またはインビトロで相同な機能を示す配列特性を意味する場合があり、例えば同一または高度に類似した細胞の機能を有する同一または高度に類似したタンパク質をコードする配列特性を意味する。最も関連のある細胞の機能は、この場合強心配糖体への耐性の増大、および、免疫原性が低いこと、または免疫原性がないことである。
【００２５】
本発明は、細胞培養実験および分子生物学、例えばヒト細胞の選択で用いるための、新規の効率的な選択マーカーに関する。本発明は、全ての細胞で天然に発現される遺伝子、すなわちＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子に基づく。正常なタンパク質活性の変更を最小化することによって、ヒトの遺伝子治療で用いるための効率的な選択マーカーを確立し、それにより、ウアバインで改変されていないヒト細胞を迅速に除去し、遺伝子改変細胞を効率的に回収することができる。天然に存在する遺伝子の変更を最小化することにより、本選択マーカーは、免疫原性をなくするか、または、免疫原性を極めて低くすることができる。
【００２６】
本発明は特に、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡのアミノ末端における最初の約１３０個、好ましくは最初の１３３個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、それに対応するラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの部分で置換した実験の結果に基づく。ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのラット相同体は、ウアバイン毒性への顕著に高い耐性を付与する。驚くべきことに、本発明者は、このキメラｃＤＮＡによってコードされたキメラα１−サブユニットは、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１に比べて、強心配糖体ウアバインに顕著に高い耐性を示すことを示した。キメラα１−サブユニットは、１０の位置においてヒトα１−サブユニットとは異なるアミノ酸をコードする。従って、タンパク質レベルでのキメラα１−サブユニットと野生型ヒトα１−サブユニットとの差は、１０個のアミノ酸置換である。
【００２７】
遺伝子改変細胞の選択に関する本発明の形態を考察すれば、本選択プロセスは、細胞質膜を通過するイオン輸送の阻害による、ウアバインでのヒト細胞の特異的な迅速な除去に基づくことが強調される。それゆえに、本選択プロセスは遺伝毒性ではなく、すなわちこれは、発明者の最良の知識において、実質的にヒト遺伝子に関して高いウアバイン耐性が初めて得られたことを示す。結果的に得られた前例のない耐性レベルにより、この突然変異遺伝子を、選択マーカーとして、未改変のヒト細胞の極めて迅速な除去に利用することを可能にする。このマーカーは、遺伝子治療用途において、ヒトの病気および能力障害のワイドアレイ、同様に、培養における細胞の遺伝学的改変に関する用途を有する可能性がある。
【００２８】
その上、この選択マーカーは、いわゆる自殺遺伝子、すなわち細胞死を誘導する遺伝子と共に有利に用いることができる。
【００２９】
本発明は、全ての細胞型において発現された遺伝子に基づいており、現在の選択／ソーティングマーカーにとって有利な選択システムを提供する。本発明の核酸コンストラクトによってコードされたアミノ酸配列が、ヒト野生型Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットと少なくとも９８％、好ましくは９９％超の相同性を有するため、免疫原性が起こる可能性は極めて低い。
【００３０】
さらなる利点は、ウアバインは、周知の比較的安価な医薬であり、病院で強心薬として広範に用いられていることである。ウアバインは、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの阻害剤としての作用以外の毒性作用は知られておらず、簡単な洗浄によって細胞培養物から迅速に除去することができ、偽陽性の選択を生じない。細胞培養環境におけるそれらの迅速な作用経過により、一時的にトランスフェクトされた細胞または安定して導入された細胞の迅速な選択が可能であり、簡単に言えば、選択が迅速であり、すなわちほとんどの細胞型で２４〜４８時間であり、偽陽性の結果を生じない。これらの特性により、このヒト突然変異コンストラクトを、臨床前および臨床分子医学で用いるのに好ましい選択マーカーとすることができる。
【００３１】
ウアバインは、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに細胞外で結合し、第一と第二の膜貫通領域との間のジャンクション（Ｈ１−Ｈ２ジャンクション）は、α１−サブユニットのウアバイン耐性レベルに強く影響を与えると考えられている。細胞外に露出したＨ１−Ｈ２ジャンクションは、アミノ酸番号１１８〜１２９（番号付けは、配列番号１またはそれらの機能的に同等な相同体に従って確立されている）を含み、最初の約１３０個のアミノ酸における５個の一致した種間の残基の差のうち４個はＨ１−Ｈ２ジャンクション内にあり、すなわち、配列番号１に記載のヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット配列におけるアミノ酸番号Ｑ１１８、Ａ１１９、Ｑ１２６およびＮ１２９、または、上記サブユニット配列の機能的に同等な相同体における対応するアミノ酸に対応する。また、Ｈ１−Ｈ２ジャンクションの端にある膜に結合した残基も、ウアバイン親和性に重要であると考えられている。
【００３２】
本発明の一つの形態は、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットであり、前記組換えタンパク質は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体であり、本組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのウアバイン耐性は、対応するヒトタンパク質より高い。
【００３３】
本発明者は、置換の位置が極めて重要であることを示した。その結果として、本発明の好ましい形態は、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットであり、ここにおいて、前記タンパク質と、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとの差は、最初の約１３０個のアミノ酸内に位置しており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３４】
本発明者によって行われた研究により、以下のことが実証された：前記タンパク質のα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列における差は、好ましくは、アミノ酸番号６５〜１３３の間およびその中に位置しており、最も好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０（Ｈ１−Ｈ２ジャンクションの端にある第一の膜に結合した残基も含む）の間およびその中に位置するアミノ酸の少なくとも１つに限定されており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。本発明の一実施形態において、前記タンパク質と、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大１０個のアミノ酸、より好ましくはアミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大４個のアミノ酸、最も好ましくはアミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なっており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３５】
一実施形態において、本組換えα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９の同一性、最も好ましくは突然変異Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄにおいて異なっており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３６】
本発明に係る組換えタンパク質は、高いウアバイン耐性を示し、好ましくは、前記タンパク質は、ウアバイン濃度が少なくとも１０-7Ｍで、ウアバイン耐性である。より好ましくは、前記タンパク質は、ウアバイン濃度が少なくとも１０-5Ｍで、最も好ましくは、少なくとも１０-3Ｍで、ウアバイン耐性である。
【００３７】
本発明は、上記で定義した組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にするものであって、さらに本発明は、前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体、好ましくは、配列番号２３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を含むことを特徴とする組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にする。
【００３８】
本発明のその他の形態は、上記で定義したように、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットと少なくとも９８％の相同性を有する組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする核酸コンストラクトであり、特に、コードされたアミノ酸配列は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、配列番号１またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体の番号６５〜１３３に対応するアミノ酸の間およびその中に位置するアミノ酸残基において異なる核酸コンストラクトである。本コンストラクトは、細胞中で発現されると、強心配糖体およびその他のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ阻害剤、特に、これらに限定されないが、ウアバイン、ジゴキシンおよびジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンのいずれか１種への高い耐性を付与する。
【００３９】
本発明の一実施形態によれば、本核酸コンストラクトは、配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等な相同体を含む。
【００４０】
本発明はまた、上記で定義したような組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの新規の製造方法も利用可能にする。この方法において、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、アミノ酸レベルで対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに少なくとも９８％相同な組換えタンパク質を生産するように改変され、前記改変は、配列番号１またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体のアミノ酸番号６５〜１３３の間およびその中に位置するアミノ酸置換である。
【００４１】
本発明の方法の一実施形態によれば、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、コード配列中に少なくとも１つの部位特異的突然変異が導入されるように改変され、それによって、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に含まれるアミノ酸に関する少なくとも１個のアミノ酸が置換され、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１の配列またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００４２】
本発明に係る方法のその他の実施形態によれば、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、タンパク質のアミノ酸配列に特定の変化が導入されるように改変され、前記変化は、コード配列中の最大１０個の部位特異的突然変異からなり、それによって、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が置換され、より好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が最大４個置換され、最も好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が最大２個置換され、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００４３】
本発明の方法の一実施形態において、本組換えα１−サブユニットは、それに対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１８および１２９（配列の番号付けは、配列番号１またはそれらの機能的に同等な相同体の対応するアミノ酸に従っている）、最も好ましくは置換Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄにおいて異なるように改変される。対応する配列は、配列番号２３（タンパク質）および配列番号２４（コード配列）として添付されている。
【００４４】
本発明の方法のその他の実施形態によれば、本組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットは、細胞で発現された際に、少なくとも１０-7Ｍのウアバインに対して耐性を付与する。好ましくは、本核酸コンストラクトは、少なくとも１０-5、より好ましくは、少なくとも１０-3Ｍのウアバインに対して耐性を付与する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットが、その他の強心配糖体、および、その他のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ阻害剤、例えば、これらに限定されないが、ジゴキシンおよびジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンへの耐性を付与する方法に関する。
【００４６】
さらに本発明は、組換え強心配糖体耐性マーカー（例えば上記で定義したウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット）が、インビトロでの遺伝子改変細胞の選択方法で用いられている遺伝子治療法における工程を利用可能にする。
【００４７】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択方法は当業者周知である。通常、このような方法は、以下の工程を含んでもよい：第一に、細胞培養培地中で、安定な培養細胞系、または、ドナーまたは患者由来の初発のヒト細胞を増殖させること、である。第二に、天然もしくは合成の核酸または改変された核酸、またはそれらの類似体の形態での、遺伝子のトランスファー、すなわち遺伝情報のトランスファーを、電気的、化学または生物学的手段、例えばエレクトロポレーション、トランスフェクションまたはウイルス遺伝子トランスファー（導入）によって行うこと、である。しかしながら、これは、細胞分画でしか遺伝子トランスファーが起こらない。
【００４８】
従って、第三の工程として、分離（例えば化学的な選択）によって、結果生じた遺伝子改変細胞群を未改変細胞から単離する必要がある：また、トランスファーされた遺伝学的材料は、治療上活性な遺伝子を含むことに加えて、毒性物質への耐性を付与する選択可能な遺伝子、または、毒性濃度における医薬も含む。選択は、改変された、および、未改変の細胞の混合物を、毒性物質または物質の混合物に接触させることによって行われる。このような物質によって、未改変細胞において細胞死が誘導されるが、遺伝子改変細胞群では誘導されない。従って、選択後に、純粋な遺伝子改変細胞群が得られる。
【００４９】
本発明によれば、毒性物質として、ウアバインのような強心配糖体が用いられ、トランスファーされる遺伝学的材料としては、本発明で開示されたウアバイン耐性を付与する組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットをコードする核酸配列が挙げられる。
【００５０】
さらに、本発明は、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程を利用可能にし、ここにおいて、インビトロまたはインビボでの研究のための方法に、組換え強心配糖体耐性マーカー（例えば、上記で定義したウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット）が用いられる。
【００５１】
インビトロでの毒性研究方法は当業者周知である。一般的に、このような方法は、例えば、細胞膜のイオンチャンネルに作用することによって、細胞質膜を通過する電気化学的な勾配とイオンの恒常性に影響を与える物質を用いた、細胞死の誘導に関する研究を含んでもよい。このような研究において、試験細胞を細胞培養で成長させ、細胞の様々な試験物質に対する反応を記録した。本発明によれば、試験細胞は、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットコンストラクトを発現するように改変され、細胞の生存率と、細胞の化学シグナル伝達反応パターンにおける変化が記録される。
【００５２】
さらに、本発明は、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究で用いるための、上記で定義したウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にする。
【００５３】
当業者であれば、様々な薬理学的な研究のための方法は既知であり、文献や、本発明の説明および実施例で開示された情報に基づきこのような方法を改変することができる。一般的に、このような研究は、化学的な刺激または遺伝子トランスファーによる細胞の代謝における変化の誘導を含む。このような方法の一例において、以下の工程が含まれる；第一に、試験細胞を細胞培養で成長させること、および、試験物質または遺伝子操作に対する細胞の反応を記録すること。本発明によれば、上記細胞は、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットコンストラクトを発現するように改変され、細胞の機能のパターンおける変化が記録される。薬理学的な研究はまた、インビボで行なわれうる。
【００５４】
本発明はまた、上記で定義した核酸コンストラクト、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を包含し、ここにおいて、前記コンストラクトは、遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する。このようなトランスファーベクターは、好ましくはプラスミド、ウイルスベクター、またはそれらのあらゆるハイブリッドコンストラクトである。
【００５５】
さらに、本発明の特定の実施形態は、上記で定義したこのような核酸コンストラクト、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を含む、遺伝子改変された、天然の、部分的または完全に合成の細胞である。好ましくは前記細胞は、真核細胞、または、ヒトキメラ細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００５６】
さらに、本発明の特定の実施形態は、キャリアー（例えばエキソゾームおよびリポソーム）、またはそれらの機能的な同等物によってトランスファーされた、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを発現する細胞である。
【００５７】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５８】
１．材料および方法
１．１ コンストラクトおよびプラスミド
野生型ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１をコードするプラスミド（ｐＣＭＶＯｕａｂ’）を、ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入した。ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡを、プラスミド（ｐｈＮＫＡａ１）として、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｎｇｒｅｌに提供してもらった（Ｄｅｐｔ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｕｎｉｖ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，シンシナティ，オハイオ州）。部位特異的変異誘発によって、ｐＣＭＶＯｕａｂｒ中のＬ−７９９をシステインに突然変異させ、ＯｕａＲと命名した（Ａｉｎｔｓ等，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：９６９〜９７７，２００２年）。ｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲ（ｐＥＧＦＰＲ）は、ｐＣＭＶ−ＯｕａＲからのＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３のＡｐａＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入することによって作製された（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），パロアルト，カリフォルニア州）。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡα１プラスミド（ｐＥＧＦＰＨ）を、ｐｈＮＫＡα１からのＮｃｏＩ（充填）−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック，パロアルト，カリフォルニア州）中のＳｍａＩとＸｂａＩとの間に挿入することによって作製した。いずれの場合も、挿入されたタンパク質とＥＧＦＰとの間で、フレーム内融合していた。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡα１−ＰＸ（Ｈ３Ｒ）キメラ融合遺伝子を、ヌクレオチド配列ＰｆｕＭＩ−ＸｂａＩを、ｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲの相同フラグメントで置換することによって作製した。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡａ１−ＰＶ（Ｈ３Ｒ４Ｈ）およびｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡａ１−ＶＸ（Ｈ４Ｒ）キメラ融合遺伝子を、ヌクレオチド配列ＰｆｕＭＩ−ＰｐｕＭＩ、および、ＰｐｕＭＩ−ＸｂａＩを、それぞれｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲの相同フラグメントで置換することによって作製した。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の５’末端においてキメラを作製するため、ＯｕａＲのセグメントを以下のプライマーで増幅した：
ＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＣＧＧＧＧＴＣＧＴＧＣ（フォワード）（配列番号４）、
ＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴ（フォワード）（配列番号５）、
ＡＡＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡＧＧ（リバース）（配列番号６）、
ＡＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣ（リバース）（配列番号７）、および、
ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡ（リバース）（配列番号８）。
【００５９】
ｐＥＧＦＰＨのセグメントを以下のプライマーで増幅した：
ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴ（フォワード）（配列番号９）、
ＣＣＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＴ（フォワード）（配列番号１０）、
ＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣ（フォワード）（配列番号−１１）、
ＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡ（リバース）（配列番号１２）、および、
ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴ（リバース）（配列番号１３）。
【００６０】
以下のプライマー：
ＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣ（フォワード）（配列番号１４）
が両方のコンストラクトに用いられた。交差点は、遺伝子の５’末端から３９０ｂｐおよび９００ｂｐの位置であった。ＰＣＲでクローニングされたキメラコンストラクトは、以下の通りである：Ｈ１Ｒ、Ｒ１Ｈ、Ｒ１Ｈ４Ｒ、Ｒ１Ｈ３Ｒ、Ｒ１Ｈ３Ｒ４Ｈ、Ｈ１Ｒ２Ｈ３Ｒ、Ｈ１Ｒ２Ｈ３Ｒ４Ｈ、Ｈ１Ｒ２Ｈ４Ｒ、Ｒ１Ｈ２Ｒ。
【００６１】
Ｈ＝ヒト、Ｒ ＝ラット、１＝第一の交差点まで、２＝第二の交差点まで、３＝ＰｆｕＭＩ制限部位の後、４＝ＰｐｕＭＩ制限部位の後。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、ワンショット（Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン）の形質転換によって、製造元が提供したプロトコールに従って増幅した。これら細菌から、キアプレップ・ミニプレップ（Ｑｕｉａｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いて、製造元により供給されたプロトコールに従ってプラスミドを精製した。ＰＣＲコンストラクトをプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位から切り出し、ゲルで精製した。このフラグメントを、ＥＧＦＰ−Ｃ１またはＥＧＦＰ−Ｃ３プラスミド（クロンテック，パロアルト，カリフォルニア州）中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＥＧＦＰとフレーム内で融合させた。ラット遺伝子配列の５’末端を有する全てのコンストラクトをＥＧＦＰ−Ｃ３プラスミドに挿入し、ヒト配列の５’末端を有するコンストラクトをＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドに挿入した。これらのプラスミドをワンショットＥ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン）で増幅し、キアプレップ・ミニプレップ（キアゲン）を用いて精製した。コンストラクトを制限酵素マッピングと部分的な配列解析によって確認した。
【００６２】
１．２ トランスフェクションおよびウアバイン毒性分析
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州）を、１０％の熱で不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）で培養した。トランスフェクションのために、フージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）６ 試薬（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム（Ｒｏｃｈｅ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ドイツ）を、製造元の説明に従って用いた。簡単に言えば、細胞培養培地（１００μｌ）中で、プラスミドＤＮＡ（１０5個の細胞あたり２μｇ）と試薬（５μｌ）とを混合し、１５分間インキュベートした後、細胞に加えた。２４時間後に、ウアバインを最終濃度が１０μＭになるように各ウェルに加えた。２４時間インキュベートした後に、細胞の生存率 を記録した。
【００６３】
上述のように、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州）を培養し、トランスフェクトした。１０μＭウアバイン中で４８時間インキュベートした後に、細胞を、ＰＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で２回洗浄し、０．０２５％ブタトリプシンを含む塩類溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で１５分間インキュベートした。ＦＢＳ添加によりトリプシンを不活性化した。１０μＭウアバイン中で細胞を再びインキュベートした。４８時間インキュベートした後、細胞の生存率を記録した。
【００６４】
２．結果
２．１ 細胞内での局在
トランスフェクションプロセスと突然変異タンパク質の細胞内での局在をモニターするために、ＥＧＦＰ−キメラヒト／ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１融合遺伝子を構築した。ＣＯＳ−７およびＨｅＬａ細胞の、ｐＥＧＦＰ−キメラ融合遺伝子でのトランスフェクションにより、融合タンパク質の細胞膜への局在が起こった。トランスフェクション実験におけるポジティブコントロールとして、ｐＥＧＦＰＲを用いた。ｐＥＧＦＰＨ発現は、ＣＯＳ−７細胞にウアバイン耐性を付与しなかった。その上、ｐＥＧＦＰＨのトランスフェクションによってＨｅＬａで天然に発現されたヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１遺伝子の過剰発現は、ウアバイン感受性に影響を与えなかった。コントロール、ｐＥＧＦＰＲ、ｐＥＧＦＰＨ、同様に、キメラＥＧＦＰ融合タンパク質は、細胞膜に局在しており、ＧＦＰ蛍光で検出することができた。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１発現の翻訳後調節は、その同起源のβサブユニットのレベルによって制御される。トランスフェクトされた細胞において、プラスミドによってコードされたタンパク質は、βサブユニットに関して内因性αサブユニットと競合し、アセンブルされていないα−サブユニットは迅速に分解する（ＳｈａｎｂａｋｙおよびＰｒｅｓｓｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９５年，７３：２６１〜２６８）。
【００６５】
２．２ ウアバイン感受性
トランスフェクトされたキメラｃＤＮＡのウアバイン毒性に対する感受性をインビトロで測定した。１０μＭウアバインは、野生型ＨｅＬａおよびＣＯＳ−７の細胞死を誘導するが、ラットＯｕａＲコンストラクトは、ウアバイン耐性を付与し、この α１−サブユニットを発現するＨｅＬａおよびＣＯＳ−７を生存させる。ウアバインで２４時間インキュベートした後に、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の生存率を記録した。４８時間インキュベートした後に、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の生存率を記録し、その後、トリプシン処理し、１０μＭウアバインとさらに４８時間接触させた。ラット配列のキメラｃＤＮＡの５’末端を有するキメラｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞は、１０μＭウアバインに対して耐性であったが、ヒト配列の５’末端を有するコンストラクトでトランスフェクトされた細胞は、ｃＤＮＡの残りの部分の構成に関わらず、ウアバインで誘導された細胞死によって死滅した（図１）。ポジティブコントロール（ｐＥＧＦＰＲ）は、トランスフェクトされた細胞へ耐性を付与したが、ネガティブコントロール（ｐＥＧＦＰＨ）および未導入の細胞は、ウアバインと摂取させることによって除去された。それゆえに、１０μＭウアバイン耐性の表現型に重要なアミノ酸は、キメラα１−サブユニットのアミノ末端内に、より正確には最初の１２９のアミノ酸内に位置する。ウアバイン結合部位は、細胞外表面上の膜に近接していると推測される。従って、本発明者は、Ｈ１−Ｈ２ジャンクション内、および、その端にあるアミノ酸は、ラット−ヒトキメラα１−サブユニットタンパク質の、１０μＭウアバイン耐性の表現型に関して特定の重要性があると考えている。
【００６６】
優先権を主張した年に追加された実験部分
３．材料および方法
３．１ 部位特異的変異誘発
ｐＥＧＦＰＨを、テンプレートとして用いて、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｎ１２９Ｄを作製した。以下のプライマーを用いて、オーバーラップするセグメントを作製し、それらを連結させ、ＰＣＲによって増幅した；
ＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴ（Ｑ１１８Ｒフォワード）（配列番号１５）、
ＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡ（Ｑ１１８Ｒリバース）（配列番号１６）、
ＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓフォワード）（配列番号１７）、
ＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓリバース）（配列番号１８）、
ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧ（Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄフォワード）（配列番号１９）、
ＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ（Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄリバース）（配列番号２０）、
ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧ（Ｎ１２９Ｄフォワード）（配列番号２１）、
ＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ（Ｎ１２９Ｄリバース）（配列番号２２）。
【００６７】
上記の１または２個のアミノ酸置換をコードするｃＤＮＡを、テンプレートとして用いて、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ）、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ）、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）およびＨ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｎ１２９Ｄ）を作製し、再度、上記のプライマーを用いた。これらのコンストラクトを、キメラｃＤＮＡに関して説明したように、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングした。これらクローンのＡｃｃＩで切り出されたフラグメント（突然変異領域を含む）を、ＡｃｃＩで切断したｐＥＧＦＰＨに挿入し、置換した。最終的なｃＤＮＡは以下の通り；ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｎ１２９Ｄ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ ｐＥＧＦＰＨ−Ｎ１２９Ｄ。これらのコンストラクトは、キメラｃＤＮＡに関して説明したように、形質転換によって増幅して製造された。制限酵素マッピングと部分的な配列解析により、突然変異したｃＤＮＡを確認した。
【００６８】
３．２ 細胞系
ヒト上皮ガンＨｅＬａ（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州，米国）、フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）ＧＰ（リンパ芽球Ｃ１Ｒ−ｓＢ７）は、Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（スタンフォード，カリフォルニア州，米国）のＧ．Ｎｏｌａｎ博士の許可のもとにＡＴＣＣから得て、ＧａＬＶエンベロープを有するマウスレトロウイルス生産細胞系ＰＧ１３を、ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）グルタマックス−１と、１０％の熱で不活性化されたウシ胎仔血清（ギブコ）中で培養した。増殖するために、細胞をＰＢＳ（ギブコ）で２回洗浄し、０．０２５％ブタトリプシンを含む塩類溶液（シグマ）中で約５分間インキュベートした。ＦＢＳの添加によってトリプシンを不活性化した。
【００６９】
３．３ ＤＮＡトランスフェクションおよびウアバイン毒性分析
トランスフェクションのために、フージーン６試薬（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム，ドイツ）を、製造元の説明書に従って用いた。簡単に言えば、体積１００μｌの細胞培養培地 ＤＭＥＭグルタマックス中で、プラスミドＤＮＡ（１０5個の細胞あたり２μｇ）と試薬（５μｌ）とを混合し、１５分間インキュベートした後に、細胞に加えた。ウアバイン（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を、１０ｍＭのストック溶液として、ＤＭＥＭに溶解させた。選択実験には、１０〜５００μＭが用いられた。トランスフェクションの２４時間後に、ウアバインを細胞に加えた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（ロシュ）を製造元の説明書に従って用いて、細胞の生存を分光光度法によって定量した。
【００７０】
３．４ レトロウイルスベクターコンストラクト
マルチクローニング部位を含むｐＭＰ７１−ＥＧＦＰからの７００ｂｐのＮｈｅＩ；ＸｈｏＩ３’−ＬＴＲフラグメントを、ＳＦ９１MCSにおけるＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＭＰ９１MCSを作製した。レトロウイルスベクターｐＭＰ９１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断したベクターｐＭＰ９１MCS、ｐＧＣ１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）のＨｉｎｄＩＩＩ；ＢｇｌＩＩフラグメント、および、ｐＧＣ３−Ｒ１stＨからのＢｇｌＩＩ；ＳａｌＩフラグメント（ＰＣＲで停止コドンの下流に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）の３点ＤＮＡライゲーションとして作製した。
【００７１】
３．５ ウイルス上清の製造
一時的なフェニックスＧＰのトランスフェクションによって、組換えレトロウイルスベクターを製造した。６−ウェルプレート中１０００００個の濃度で細胞をプレーティングした。次の日、フージーン６試薬を上記のプロトコールに従って用いて、細胞を、ベクタープラスミド（３．７５μｇ）およびｐＭＤＧ（０．７５μｇ）（Ｄ．Ｔｒｏｎｏ，Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ提供，水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする）でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、上清を回収し、ろ過し、アリコートにして−７０℃で凍結した。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターを用いて、ＰＧ１３ＧＡＬＶ−偽型生産細胞プールを製造した。ＰＧ１３細胞を、６−ウェルプレート中に約２３０００個でプレーティングし、ＶＳＶ−Ｇ（１ｍｌ）を用いて導入した。ポリブレンを、濃度４〜８μｇ／ｍｌで用いた。６日間連続して、６回の導入を行った。生産細胞プールを拡張し、これを用いて上清を製造した。上清を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、凍結した。
【００７２】
３．６ ＨｅＬａの導入と選択
ＨｅＬａを、６−ウェルプレートに密度１０5／ウェルで播いた。ＰＧ１３生産細胞プール（約５０００ＴＵ／ｍｌ）から回収された、凍結ｐＭＰ９１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）の上清（２００μｌ）を３７℃に温め、上記細胞に加えた。また、８μｇ／ｍｌのポリブレンを加えた。導入の２４時間後に、ウアバインを、濃度１０μＭで、この培養液に加えた。ウアバイン選択の４８時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、導入され、選択された細胞を、ウアバイン非含有培地で増殖させた。
【００７３】
４．結果
４．１ ヒトタンパク質の操作されたウアバイン耐性
本発明者は、キメララット−ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の、ｃＤＮＡのウアバイン耐性の増加に関与する重要なアミノ酸を決定することを計画した。ウアバイン結合部位は、細胞外表面上の膜に近接していると推測される。それゆえに、本発明者は、Ｈ１−Ｈ２ジャンクション内の、および、それに隣接するアミノ酸が、１０μＭウアバイン耐性の表現型に関する特定の重要性を有する可能性があると仮定した。Ｈ１−Ｈ２ジャンクション（位置番号１１８〜１２９，ヒトアミノ酸配列）内の４つの位置が、ヒトのα１−サブユニット配列とラットのα１−サブユニット配列で異なるため、本発明者は、これらの位置（Ｑ１１８、Ａ１１９、Ｑ１２６、およびＮ１２９）が、キメララット−ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡのウアバイン耐性に重要であると推測した。ヒトｃＤＮＡにおいて、これらの位置のアミノ酸を、ヒトからラットに、Ｑ１１８Ｒ、Ａ１１９Ｓ、Ｑ１２６Ｐ、Ｎ１２９Ｄのように置換することによって、これらのうちどれが、組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの、１０μＭウアバインに対する耐性を増加させるのに必要であり、かつ十分であるかを評価することができる。アミノ酸置換を、ＰＣＲ技術を用いた部位特異的変異誘発によって作製した。突然変異遺伝子は、以下の通り：Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、および、Ｈ−Ｎ１２９Ｄ。キメラｃＤＮＡで説明した方法を用いる、突然変異ヒトｃＤＮＡを、ＧＣ１プラスミド中でＥＧＦＰとフレーム内で融合させた。
【００７４】
４．２ ヒト細胞系のトランスフェクションおよび選択
ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦＰ突然変異ヒトｃＤＮＡを有するプラスミドでトランスフェクトし、続いて、トランスフェクションの２４時間後に、１０μＭウアバイン中で２４時間インキュベートした。突然変異遺伝子Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ，Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ、および、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄは、ウアバイン耐性を付与したが、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、および、Ｈ−Ｎ１２９Ｄは、耐性が付与されなかった。結論として、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の１０μＭウアバイン耐性を付与するためには、２つの位置；Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄでの置換が必要であり、かつ十分である。最小限に突然変異させたヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１により、どの程度ウアバイン耐性が付与されたかを決定するために、用量応答分析を行った。ＨｅＬａ細胞を、プラスミドｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、または、ｐＥＧＦＰＲで一時的にトランスフェクトした。２４時間で、細胞は、ウアバインで選択するのに十分な量の融合遺伝子を発現した。このトランスフェクトされた細胞を、様々な濃度のウアバイン（１０〜５００μＭ）で２４時間選択し、続いて、ウアバイン非含有培地にトランスファーし、ＷＳＴ−１増殖性物質を用いて定量した。結果を図２に示す。ウアバインの２４時間後に、コントロールおよびトランスフェクトされていない細胞は除去したが、ラットＯｕａＲ、または、ヒトＱ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ置換Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１ｃＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされた細胞は、１０および１０μＭウアバイン濃度で生存した。５００μＭウアバインは、突然変異ヒトコンストラクトでトランスフェクトされた細胞にとって毒性であり、また、ラットＯｕａＲでトランスフェクトされた細胞にとっても概して多少の毒性を有することを示した。死細胞片と、ウアバイン選択中に解離した細胞を洗浄し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。解離した細胞と死細胞片からは、生存細胞は観察されなかった（データ示さず）。
【００７５】
４．３ レトロウイルスベクターの製造および遺伝子トランスファー
我々は、ＰＧ１３のＭＰ９１Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄレトロウイルス生産細胞プールを用いて、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９ＤのｃＤＮＡを標的ＨｅＬａ細胞に導入することができた。重複感染度（ＭＯＩ）は＜０．０５であった。それゆえに、導入された細胞が、細胞あたり１超のレトロウイルスコピーを統合する可能性は極めて低い。純粋な導入された細胞群を得るために、導入の２４時間後に、１０μＭウアバインを４８時間加えた。選択された細胞群をさらに拡張し、ウアバイン非含有成長培地で増殖させた。プラスミドＤＮＡでの一時的なトランスフェクションにより、細胞あたり数千に至る遺伝子コピーがトランスファーされ、導入遺伝子の高発現が起こる。この実験において、たった１つの遺伝子コピーでも、１０μＭウアバイン耐性を付与するのに十分な量でＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９ＤのｃＤＮＡを発現させることがわかった。
【００７６】
本発明者が当座認識している最良の形態を構成する好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、当業者であれば様々な変化および改変が明白であり、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に添付された請求項の記載に従ってなされ得るものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ウアバインで誘導された細胞死への耐性に関して試験したコンストラクトの概略図を示す。
【図２】一時的なトランスフェクションの後、ウアバインを用いてＨｅＬａ細胞を選択した結果を図示する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に、強心配糖体に対して耐性な組換えヒトタンパク質、特にウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット、および、それに対応する核酸コンストラクト、同様に、療法および調査におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、個体の１またはそれ以上の遺伝子発現を改変すること、または、異常な遺伝子を修正することのいずれかによって病気を治療するアプローチである。現在、薬物ではなくＤＮＡを投与することによって、多くの様々な病気が、遺伝子治療のための候補として調査されている。このような病気としては、遺伝的障害、例えば嚢胞性線維症、心臓血管疾患、様々な形態のガン、同様に、感染性の病気、例えばＡＩＤＳが挙げられる。エクスビボまたはインビボで遺伝子を細胞にトランスファーする際、遺伝子改変細胞が未改変細胞に対して選択的な利点を有さない場合、選択が必要なこともある。また、新規の遺伝子を摂取した細胞を患者にトランスファーする前に、それらの十分な増殖を確実にすることも望ましい。
【０００３】
遺伝子治療の実践的な使用は、様々な理由のために未だに限定されており、その理由の一つは、遺伝子トランスファー効率が低いことと、高濃度の、または純粋な遺伝子改変細胞群を得るために、インビトロで改変された細胞培養を選択することが必要なことである。従来、遺伝子改変細胞を選択するための様々なマーカー遺伝子が用いられてきた。これらは、２つの種類、すなわち細胞表面マーカー、および、代謝性の選択マーカーに分類される。
【０００４】
細胞表面マーカー遺伝子によって改変された細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または免疫磁気技術によって選択することができる。通常、細胞表面マーカーによれば、迅速な選択手順を実現することができるが、レトロウイルスのエンベロープ中のマーカータンパク質が標的細胞の原形質膜にトランスファーされることにより、導入後あまり早期に選択を実行すると、偽陽性の選択の危険が生じる。さらに、ＦＡＣＳは開放系であるため、滅菌状態を維持することが難しくなる。加えて、大量の細胞のソーティングは、相当な時間を要する。免疫磁気ソーティングの一般的な欠点は、遺伝子改変細胞の回収率が低いことである。導入遺伝子が高く発現される細胞のみが効率的にソーティングされる。低い回収率は大量の開始材料を必要とし、経済的に好ましくない。
【０００５】
代謝性の選択マーカーにより、効率的でバックグラウンドフリーな遺伝子改変細胞選択が可能であるが、通常、選択期間は長く、典型的には約１週間〜１０日間継続させる。また、選択物質は、直接的にＤＮＡにダメージを与えるものであってもよい。
【０００６】
さらに、非ヒト遺伝子または遺伝子フラグメントが、遺伝子改変細胞に対して免疫反応を引き起こすという大きな危険がある。従って、このような遺伝子で改変されたヒト細胞は、免疫系によって除去される可能性があるが、細胞表面マーカーの場合、これらは一般的にヒト由来であるため、免疫原性は通常問題にはならない。対照的に、代謝性の選択マーカーは、場合によっては非哺乳動物由来であり、免疫原性の問題が指摘されている。
【０００７】
現在の選択マーカーに関するその他の問題は、正常な細胞機能に与えるそれらの推定上の影響である。これは、細胞の形質転換に影響する可能性のある細胞の変更を引き起こす危険を提唱している。
【０００８】
Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、全ての哺乳動物細胞に存在するハウスキーピング酵素である。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、ナトリウムイオンを細胞外に輸送し、カリウムイオンを細胞内に輸送することによって（割合３：２で）細胞質膜を介した電気化学的な勾配を成り立たせている内在性膜タンパク質であり、これは、エネルギー源としてＡＴＰ加水分解を利用している。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの活性における変化は、多数の重要な細胞機能に効果を有する。膜で活性な最小限機能的な酵素は、α−サブユニットとβ−サブユニットからなる二量体である。ヒトおよびラットにおいて、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα−サブユニット遺伝子ファミリーの４種のアイソフォーム（α1、α2、α3およびα4）がクローニングされており、α1が強心配糖体に対して最も耐性を有するアイソフォームである。
【０００９】
強心配糖体は、天然に存在する化合物であり、哺乳動物の心臓の収縮力とリズムに影響を有することがわかっている。例えば、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）由来のジゴキシンおよびジギトキシン、および、一般的なジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）；カイソウ（Ｕｒｇｉｎｅａ（Ｓｃｉｌｌａ） ｍａｒｉｔｉｍｅ）由来のプロシラリジンＡ、ストロファンツス・グラツス（Ｓｔｒｏｐｈａｎｔｕｓ ｇｒａｔｕｓ）由来のウアバイン（Ｇ−ストロファンチン）；メイフラワー（リリー・オブ・ザ・バレー（Ｌｉｌｙ−ｏｆ−ｔｈｅ−ｖａｌｌｅｙ），コンバラナ・マジャリス（Ｃｏｎｖａｌｌａｎａ ｍａｊａｌｉｓ））由来のコンバラトキシン；および、珊瑚のパリトア・トキシア（Ｐａｌｙｔｈｏａ ｔｏｘｉｃａ）由来のパリトキシンが挙げられる。いずれの強心配糖体も、１またはそれ以上のグルコース様分子に結合したステロイド部分を含むと考えられている。
【００１０】
ウアバインは、上記の薬物群のメンバーの一つであり、α−サブユニットに結合し、酵素のＡＴＰアーゼとイオン輸送活性を阻害することが示されている。この説明では、強心配糖体の一例としてウアバインが用いられる。
【００１１】
上述したように、現在の選択方法は、細胞選択に悪い影響を与える数々の短所がある。従って、インビトロでの用途、同様に、高い効率で免疫原性が最小のヒトの遺伝子治療において使用するための、迅速な選択マーカーが必要である。また、このようなマーカーは、薬物の毒物学、毒性メカニズムの研究、インビトロで新規の薬物のスクリーニング等のための方法に広範な用途を有するとも予測される。
【００１２】
一つの本発明の目的は、このようなマーカー、同様に、その製造方法および使用を利用可能にすることである。さらなる目的、本発明によって提供される解決策、同様に、それらの利点は、以下の説明および実施例を研究すれば当業者にとって明白であると予想される。
【００１３】
ウアバイン感受性は、様々な哺乳動物種間で大きな違いが天然に存在する。ラットおよびマウスのＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、強心配糖体への高い耐性を示すが、ヒト、ヒツジ、サルおよびブタのタンパク質は高い感受性を有する（Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９６８２〜２９６８７，１９９６年）。早くも１９８８年に、ＰｒｉｃｅおよびＬｉｎｇｒｅｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１，２７：８４００〜８４０８）は、ヒツジタンパク質のウアバイン感受性に関与する決定因子は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰαサブユニットのアミノ末端半分に位置することを示唆している。様々な非ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの耐性を増加させるための数々の試みがなされてきたが、成功率はまちまちであり、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの高度に耐性の表現型は達成されていない。
【００１４】
ＵＳ６,３０９,８７４（Ｂｅｌｕｓａ）は、アミノ酸位置７９９および／または８０１における点突然変異を含み、非ヒト哺乳動物細胞系にトランスフェクトされたラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα1遺伝子に基づく選択システムを提唱している。
【００１５】
Ｃｏｐｐｉ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：２４９４〜２５０５，１９９９年）は、α1およびα2ラットアイソフォームのウアバイン親和性部分に隣接するＭ１−Ｍ２ループにおける電荷を有する残基の組合せの作用を研究した。彼等は、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのウアバイン感受性は、Ｍ１−Ｍ２ループに隣接する残基の同一性だけでなく、それらが導入される環境にも依存することを報告している。彼等はまた、これらの残基が、ウアバインが優先的に結合するＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのＥ２コンフォメーションを、不安定化するか、または、変更することによって、ウアバイン感受性に影響を与える可能性があることを示唆している。
【００１６】
Ｄｅ Ｆｕｓｃｏ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３３：１９２〜１９６ ２００３年−２００３年１月２１日に出版）は、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα2サブユニットをコードする遺伝子における突然変異、および、それらと家族性片麻痺性偏頭痛２型との関連を研究した。突然変異α2およびβ2サブユニットのイオン輸送機能を調査するために、彼等は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ活性を用いた。第一の細胞外ループに２つのアミノ酸突然変異（Ｑ１１６ＲおよびＮ１２７Ｄ）を導入することによって、α2およびβ2サブユニットをウアバイン耐性にした。しかしながら、アミノ酸レベルでの、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼにおけるα1アイソフォームとα2アイソフォームとの相同性は低く（すなわちわずか約８７％）、それゆえに、α1遺伝子で同じ突然変異を起こすことによって、同じ望ましい作用が生じると推測することはできない。
【００１７】
Ａｉｎｔｓ等（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：９６９〜９７７，２００２年）は、ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを用いた、ヒト細胞におけるウアバイン耐性の増加を達成したが、この場合、標的化した変異誘発によって７９９位のロイシンが、システインで置換されている。
【００１８】
Ｅｍａｎｕｅｌ等（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９：３７４４〜３７４９，１９８９年）は、差異的なウアバイン感受性に寄与するＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのαサブユニット内の決定因子を研究した。彼等は、ウアバイン耐性αサブユニットのｃＤＮＡと、ウアバイン感受性αサブユニットのｃＤＮＡとのキメラｃＤＮＡ分子を構築した。ヒトのα１サブユニットの５’末端を、ラットのα１のｃＤＮＡの５’末端で置換することによって、Ｅｍａｎｕｅｌ等は、アミノ末端に、ラットのα１サブユニットの１７２個のアミノ酸残基を含む組換えタンパク質を得た。このコンストラクトをアフリカミドリザルＣＶ−１細胞にトランスフェクトしたところ、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼは、１０-4Ｍウアバインに対して耐性であることが示された。しかしながら、このコンストラクトは、ヒト細胞にトランスフェクトされておらず、ヒト細胞における前記コンストラクトの機能性および免疫原性は、この研究から推定することはできない。このようなラット遺伝子から誘導された大規模な置換を含むコンストラクトは、ヒト細胞に高い免疫原性を付与する可能性が高く、従って、ヒトの遺伝子治療で用いるための選択マーカーとして適切ではない。
【００１９】
すなわち、これら従来技術は、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに関する生物学では、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットにおけるウアバイン耐性の増加を付与するアミノ酸が同一であるという証拠を得ることができず、それゆえに、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１遺伝子を、ヒトの遺伝子治療のための効率的な選択マーカーに発展させることができるという証拠または提案を提供することに成功していないを説明している。すなわち、ヒトの遺伝子治療および調査で用いるための、非免疫原性の、迅速で信頼できる選択マーカーが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、高い強心配糖体耐性を有する組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質、特に、このような高い強心配糖体耐性を付与する組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットポリペプチドに関する。前記組換えタンパク質は、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに少なくとも９８％相同である。本組換えα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列の相違点は、配列番号１のヒトＮａ＋、Ｋ＋ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの番号６５〜１３３またはそれらの機能に同等な相同体に対応するアミノ酸の間およびその中に位置する。
【００２１】
添付された配列表（パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ）３．１ソフトウェアを用いて作製された）では、ヒト野生型Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに関するアミノ酸配列（配列番号１）、本発明の一実施形態に係る組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列（配列番号２）、および、前記タンパク質に対応する組換え核酸をコードする配列（配列番号３）を開示している。実施例で用いたプライマーは、配列番号４〜２１として開示されている。最小２個のアミノ酸置換を示すアミノ酸配列が、配列番号２３として開示されており、それに対応するコード配列は、配列番号２４として開示されており、いずれも本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００２２】
本発明のさらなる形態、およびそれらの利点は、以下の説明、実施例、図面および添付の請求項から明らかになると予想され、これらは参照により本発明に加入させる。
【００２３】
本発明を、以下の説明、実施例、および添付の図面でより詳細に説明する：
図１は、ウアバインで誘導された細胞死への耐性に関して試験したコンストラクトの概略図を示す。これらのコンストラクトを含むプラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａおよびＣＯＳ−７細胞を、１０μＭウアバイン中で、それぞれ２４時間および４日間インキュベートし、続いて、解析した。上から６個のコンストラクトは、ウアバインで誘導された細胞死への耐性を付与したが、その下の８個のコンストラクトは付与しなかった。
図２は、一時的なトランスフェクションの後、ウアバインを用いてＨｅＬａ細胞を選択した結果を図示する。トランスフェクションの２４時間後にウアバインを細胞に加えた。４８時間後、トランスフェクション細胞をトリプシン処理し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。次の日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬を用いて解析した。細胞は、トランスフェクトされていない（コントロール）か、または、フレーム内にＥＧＦＰをコードするＣ１プラスミド、ラットＯｕａＲ（ｐＥＧＦＰＲ）、または、アミノ酸置換Ｑ１１８Ｒ、Ｎ１２９Ｄを有するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）でトランスフェクトされた。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明の明細書および請求項の文中で、用語「機能的に相同な」または「機能的に同等な」は、開示された配列との構造的な相同性は低いが、健康な生物または病気の生物のいずれかにおいて、インビボおよび／またはインビトロで相同な機能を示す配列特性を意味する場合があり、例えば同一または高度に類似した細胞の機能を有する同一または高度に類似したタンパク質をコードする配列特性を意味する。最も関連のある細胞の機能は、この場合強心配糖体への耐性の増大、および、免疫原性が低いこと、または免疫原性がないことである。
【００２５】
本発明は、細胞培養実験および分子生物学、例えばヒト細胞の選択で用いるための、新規の効率的な選択マーカーに関する。本発明は、全ての細胞で天然に発現される遺伝子、すなわちＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子に基づく。正常なタンパク質活性の変更を最小化することによって、ヒトの遺伝子治療で用いるための効率的な選択マーカーを確立し、それにより、ウアバインで改変されていないヒト細胞を迅速に除去し、遺伝子改変細胞を効率的に回収することができる。天然に存在する遺伝子の変更を最小化することにより、本選択マーカーは、免疫原性をなくするか、または、免疫原性を極めて低くすることができる。
【００２６】
本発明は特に、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡのアミノ末端における最初の約１３０個、好ましくは最初の１３３個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を、それに対応するラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの部分で置換した実験の結果に基づく。ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのラット相同体は、ウアバイン毒性への顕著に高い耐性を付与する。驚くべきことに、本発明者は、このキメラｃＤＮＡによってコードされたキメラα１−サブユニットは、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１に比べて、強心配糖体ウアバインに顕著に高い耐性を示すことを示した。キメラα１−サブユニットは、１０の位置においてヒトα１−サブユニットとは異なるアミノ酸をコードする。従って、タンパク質レベルでのキメラα１−サブユニットと野生型ヒトα１−サブユニットとの差は、１０個のアミノ酸置換である。
【００２７】
遺伝子改変細胞の選択に関する本発明の形態を考察すれば、本選択プロセスは、細胞質膜を通過するイオン輸送の阻害による、ウアバインでのヒト細胞の特異的な迅速な除去に基づくことが強調される。それゆえに、本選択プロセスは遺伝毒性ではなく、すなわちこれは、発明者の最良の知識において、実質的にヒト遺伝子に関して高いウアバイン耐性が初めて得られたことを示す。結果的に得られた前例のない耐性レベルにより、この突然変異遺伝子を、選択マーカーとして、未改変のヒト細胞の極めて迅速な除去に利用することを可能にする。このマーカーは、遺伝子治療用途において、ヒトの病気および能力障害のワイドアレイ、同様に、培養における細胞の遺伝学的改変に関する用途を有する可能性がある。
【００２８】
その上、この選択マーカーは、いわゆる自殺遺伝子、すなわち細胞死を誘導する遺伝子と共に有利に用いることができる。
【００２９】
本発明は、全ての細胞型において発現された遺伝子に基づいており、現在の選択／ソーティングマーカーにとって有利な選択システムを提供する。本発明の核酸コンストラクトによってコードされたアミノ酸配列が、ヒト野生型Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットと少なくとも９８％、好ましくは９９％超の相同性を有するため、免疫原性が起こる可能性は極めて低い。
【００３０】
さらなる利点は、ウアバインは、周知の比較的安価な医薬であり、病院で強心薬として広範に用いられていることである。ウアバインは、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼの阻害剤としての作用以外の毒性作用は知られておらず、簡単な洗浄によって細胞培養物から迅速に除去することができ、偽陽性の選択を生じない。細胞培養環境におけるそれらの迅速な作用経過により、一時的にトランスフェクトされた細胞または安定して導入された細胞の迅速な選択が可能であり、簡単に言えば、選択が迅速であり、すなわちほとんどの細胞型で２４〜４８時間であり、偽陽性の結果を生じない。これらの特性により、このヒト突然変異コンストラクトを、臨床前および臨床分子医学で用いるのに好ましい選択マーカーとすることができる。
【００３１】
ウアバインは、Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに細胞外で結合し、第一と第二の膜貫通領域との間のジャンクション（Ｈ１−Ｈ２ジャンクション）は、α１−サブユニットのウアバイン耐性レベルに強く影響を与えると考えられている。細胞外に露出したＨ１−Ｈ２ジャンクションは、アミノ酸番号１１８〜１２９（番号付けは、配列番号１またはそれらの機能的に同等な相同体に従って確立されている）を含み、最初の約１３０個のアミノ酸における５個の一致した種間の残基の差のうち４個はＨ１−Ｈ２ジャンクション内にあり、すなわち、配列番号１に記載のヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット配列におけるアミノ酸番号Ｑ１１８、Ａ１１９、Ｑ１２６およびＮ１２９、または、上記サブユニット配列の機能的に同等な相同体における対応するアミノ酸に対応する。また、Ｈ１−Ｈ２ジャンクションの端にある膜に結合した残基も、ウアバイン親和性に重要であると考えられている。
【００３２】
本発明の一つの形態は、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットであり、前記組換えタンパク質は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体であり、本組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのウアバイン耐性は、対応するヒトタンパク質より高い。
【００３３】
本発明者は、置換の位置が極めて重要であることを示した。その結果として、本発明の好ましい形態は、組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットであり、ここにおいて、前記タンパク質と、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとの差は、最初の約１３０個のアミノ酸内に位置しており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３４】
本発明者によって行われた研究により、以下のことが実証された：前記タンパク質のα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列における差は、好ましくは、アミノ酸番号６５〜１３３の間およびその中に位置しており、最も好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０（Ｈ１−Ｈ２ジャンクションの端にある第一の膜に結合した残基も含む）の間およびその中に位置するアミノ酸の少なくとも１つに限定されており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。本発明の一実施形態において、前記タンパク質と、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大１０個のアミノ酸、より好ましくはアミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大４個のアミノ酸、最も好ましくはアミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なっており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３５】
一実施形態において、本組換えα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９の同一性、最も好ましくは突然変異Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄにおいて異なっており、ここにおいて、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００３６】
本発明に係る組換えタンパク質は、高いウアバイン耐性を示し、好ましくは、前記タンパク質は、ウアバイン濃度が少なくとも１０-7Ｍで、ウアバイン耐性である。より好ましくは、前記タンパク質は、ウアバイン濃度が少なくとも１０-5Ｍで、最も好ましくは、少なくとも１０-3Ｍで、ウアバイン耐性である。
【００３７】
本発明は、上記で定義した組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にするものであって、さらに本発明は、前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体、好ましくは、配列番号２３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を含むことを特徴とする組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にする。
【００３８】
本発明のその他の形態は、上記で定義したように、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットと少なくとも９８％の相同性を有する組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする核酸コンストラクトであり、特に、コードされたアミノ酸配列は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとは、配列番号１またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体の番号６５〜１３３に対応するアミノ酸の間およびその中に位置するアミノ酸残基において異なる核酸コンストラクトである。本コンストラクトは、細胞中で発現されると、強心配糖体およびその他のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ阻害剤、特に、これらに限定されないが、ウアバイン、ジゴキシンおよびジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンのいずれか１種への高い耐性を付与する。
【００３９】
本発明の一実施形態によれば、本核酸コンストラクトは、配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等な相同体を含む。
【００４０】
本発明はまた、上記で定義したような組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの新規の製造方法も利用可能にする。この方法において、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、アミノ酸レベルで対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに少なくとも９８％相同な組換えタンパク質を生産するように改変され、前記改変は、配列番号１またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体のアミノ酸番号６５〜１３３の間およびその中に位置するアミノ酸置換である。
【００４１】
本発明の方法の一実施形態によれば、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、コード配列中に少なくとも１つの部位特異的突然変異が導入されるように改変され、それによって、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に含まれるアミノ酸に関する少なくとも１個のアミノ酸が置換され、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１の配列またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００４２】
本発明に係る方法のその他の実施形態によれば、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡの５’末端は、タンパク質のアミノ酸配列に特定の変化が導入されるように改変され、前記変化は、コード配列中の最大１０個の部位特異的突然変異からなり、それによって、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が置換され、より好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が最大４個置換され、最も好ましくは、アミノ酸番号１１７〜１３０の間およびその中に位置するアミノ酸が最大２個置換され、前記ヒトタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である。
【００４３】
本発明の方法の一実施形態において、本組換えα１−サブユニットは、それに対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１８および１２９（配列の番号付けは、配列番号１またはそれらの機能的に同等な相同体の対応するアミノ酸に従っている）、最も好ましくは置換Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄにおいて異なるように改変される。対応する配列は、配列番号２３（タンパク質）および配列番号２４（コード配列）として添付されている。
【００４４】
本発明の方法のその他の実施形態によれば、本組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットは、細胞で発現された際に、少なくとも１０-7Ｍのウアバインに対して耐性を付与する。好ましくは、本核酸コンストラクトは、少なくとも１０-5、より好ましくは、少なくとも１０-3Ｍのウアバインに対して耐性を付与する。
【００４５】
本発明はまた、本発明の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットが、その他の強心配糖体、および、その他のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼ阻害剤、例えば、これらに限定されないが、ジゴキシンおよびジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンへの耐性を付与する方法に関する。
【００４６】
さらに本発明は、組換え強心配糖体耐性マーカー（例えば上記で定義したウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット）が、インビトロでの遺伝子改変細胞の選択方法で用いられている遺伝子治療法における工程を利用可能にする。
【００４７】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択方法は当業者周知である。通常、このような方法は、以下の工程を含んでもよい：第一に、細胞培養培地中で、安定な培養細胞系、または、ドナーまたは患者由来の初発のヒト細胞を増殖させること、である。第二に、天然もしくは合成の核酸または改変された核酸、またはそれらの類似体の形態での、遺伝子のトランスファー、すなわち遺伝情報のトランスファーを、電気的、化学または生物学的手段、例えばエレクトロポレーション、トランスフェクションまたはウイルス遺伝子トランスファー（導入）によって行うこと、である。しかしながら、これは、細胞分画でしか遺伝子トランスファーが起こらない。
【００４８】
従って、第三の工程として、分離（例えば化学的な選択）によって、結果生じた遺伝子改変細胞群を未改変細胞から単離する必要がある：また、トランスファーされた遺伝学的材料は、治療上活性な遺伝子を含むことに加えて、毒性物質への耐性を付与する選択可能な遺伝子、または、毒性濃度における医薬も含む。選択は、改変された、および、未改変の細胞の混合物を、毒性物質または物質の混合物に接触させることによって行われる。このような物質によって、未改変細胞において細胞死が誘導されるが、遺伝子改変細胞群では誘導されない。従って、選択後に、純粋な遺伝子改変細胞群が得られる。
【００４９】
本発明によれば、毒性物質として、ウアバインのような強心配糖体が用いられ、トランスファーされる遺伝学的材料としては、本発明で開示されたウアバイン耐性を付与する組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットをコードする核酸配列が挙げられる。
【００５０】
さらに、本発明は、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程を利用可能にし、ここにおいて、インビトロまたはインビボでの研究のための方法に、組換え強心配糖体耐性マーカー（例えば、上記で定義したウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット）が用いられる。
【００５１】
インビトロでの毒性研究方法は当業者周知である。一般的に、このような方法は、例えば、細胞膜のイオンチャンネルに作用することによって、細胞質膜を通過する電気化学的な勾配とイオンの恒常性に影響を与える物質を用いた、細胞死の誘導に関する研究を含んでもよい。このような研究において、試験細胞を細胞培養で成長させ、細胞の様々な試験物質に対する反応を記録した。本発明によれば、試験細胞は、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットコンストラクトを発現するように改変され、細胞の生存率と、細胞の化学シグナル伝達反応パターンにおける変化が記録される。
【００５２】
さらに、本発明は、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究で用いるための、上記で定義したウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを利用可能にする。
【００５３】
当業者であれば、様々な薬理学的な研究のための方法は既知であり、文献や、本発明の説明および実施例で開示された情報に基づきこのような方法を改変することができる。一般的に、このような研究は、化学的な刺激または遺伝子トランスファーによる細胞の代謝における変化の誘導を含む。このような方法の一例において、以下の工程が含まれる；第一に、試験細胞を細胞培養で成長させること、および、試験物質または遺伝子操作に対する細胞の反応を記録すること。本発明によれば、上記細胞は、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットコンストラクトを発現するように改変され、細胞の機能のパターンおける変化が記録される。薬理学的な研究はまた、インビボで行なわれうる。
【００５４】
本発明はまた、上記で定義した核酸コンストラクト、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を包含し、ここにおいて、前記コンストラクトは、遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する。このようなトランスファーベクターは、好ましくはプラスミド、ウイルスベクター、またはそれらのあらゆるハイブリッドコンストラクトである。
【００５５】
さらに、本発明の特定の実施形態は、上記で定義したこのような核酸コンストラクト、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を含む、遺伝子改変された、天然の、部分的または完全に合成の細胞である。好ましくは前記細胞は、真核細胞、または、ヒトキメラ細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００５６】
さらに、本発明の特定の実施形態は、キャリアー（例えばエキソゾームおよびリポソーム）、またはそれらの機能的な同等物によってトランスファーされた、ウアバイン耐性組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットを発現する細胞である。
【００５７】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００５８】
１．材料および方法
１．１ コンストラクトおよびプラスミド
野生型ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１をコードするプラスミド（ｐＣＭＶＯｕａｂ’）を、ファーミンジェン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ，カリフォルニア州）から購入した。ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡを、プラスミド（ｐｈＮＫＡａ１）として、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｎｇｒｅｌに提供してもらった（Ｄｅｐｔ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｕｎｉｖ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，シンシナティ，オハイオ州）。部位特異的変異誘発によって、ｐＣＭＶＯｕａｂｒ中のＬ−７９９をシステインに突然変異させ、ＯｕａＲと命名した（Ａｉｎｔｓ等，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３：９６９〜９７７，２００２年）。ｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲ（ｐＥＧＦＰＲ）は、ｐＣＭＶ−ＯｕａＲからのＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３のＡｐａＩ部位とＸｂａＩ部位との間に挿入することによって作製された（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），パロアルト，カリフォルニア州）。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡα１プラスミド（ｐＥＧＦＰＨ）を、ｐｈＮＫＡα１からのＮｃｏＩ（充填）−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック，パロアルト，カリフォルニア州）中のＳｍａＩとＸｂａＩとの間に挿入することによって作製した。いずれの場合も、挿入されたタンパク質とＥＧＦＰとの間で、フレーム内融合していた。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡα１−ＰＸ（Ｈ３Ｒ）キメラ融合遺伝子を、ヌクレオチド配列ＰｆｕＭＩ−ＸｂａＩを、ｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲの相同フラグメントで置換することによって作製した。ｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡａ１−ＰＶ（Ｈ３Ｒ４Ｈ）およびｐＥＧＦＰ−ｈＮＫＡａ１−ＶＸ（Ｈ４Ｒ）キメラ融合遺伝子を、ヌクレオチド配列ＰｆｕＭＩ−ＰｐｕＭＩ、および、ＰｐｕＭＩ−ＸｂａＩを、それぞれｐＥＧＦＰ−ＯｕａＲの相同フラグメントで置換することによって作製した。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の５’末端においてキメラを作製するため、ＯｕａＲのセグメントを以下のプライマーで増幅した：
ＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＣＧＧＧＧＴＣＧＴＧＣ（フォワード）（配列番号４）、
ＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＴＴ（フォワード）（配列番号５）、
ＡＡＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡＧＧ（リバース）（配列番号６）、
ＡＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣ（リバース）（配列番号７）、および、
ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡ（リバース）（配列番号８）。
【００５９】
ｐＥＧＦＰＨのセグメントを以下のプライマーで増幅した：
ＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＧＣＴ（フォワード）（配列番号９）、
ＣＣＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＴ（フォワード）（配列番号１０）、
ＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣ（フォワード）（配列番号−１１）、
ＡＡＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡ（リバース）（配列番号１２）、および、
ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＧＴＡＧＧＴ（リバース）（配列番号１３）。
【００６０】
以下のプライマー：
ＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣ（フォワード）（配列番号１４）
が両方のコンストラクトに用いられた。交差点は、遺伝子の５’末端から３９０ｂｐおよび９００ｂｐの位置であった。ＰＣＲでクローニングされたキメラコンストラクトは、以下の通りである：Ｈ１Ｒ、Ｒ１Ｈ、Ｒ１Ｈ４Ｒ、Ｒ１Ｈ３Ｒ、Ｒ１Ｈ３Ｒ４Ｈ、Ｈ１Ｒ２Ｈ３Ｒ、Ｈ１Ｒ２Ｈ３Ｒ４Ｈ、Ｈ１Ｒ２Ｈ４Ｒ、Ｒ１Ｈ２Ｒ。
【００６１】
Ｈ＝ヒト、Ｒ ＝ラット、１＝第一の交差点まで、２＝第二の交差点まで、３＝ＰｆｕＭＩ制限部位の後、４＝ＰｐｕＭＩ制限部位の後。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、ワンショット（Ｏｎｅ−Ｓｈｏｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン）の形質転換によって、製造元が提供したプロトコールに従って増幅した。これら細菌から、キアプレップ・ミニプレップ（Ｑｕｉａｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐ）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いて、製造元により供給されたプロトコールに従ってプラスミドを精製した。ＰＣＲコンストラクトをプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位から切り出し、ゲルで精製した。このフラグメントを、ＥＧＦＰ−Ｃ１またはＥＧＦＰ−Ｃ３プラスミド（クロンテック，パロアルト，カリフォルニア州）中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＥＧＦＰとフレーム内で融合させた。ラット遺伝子配列の５’末端を有する全てのコンストラクトをＥＧＦＰ−Ｃ３プラスミドに挿入し、ヒト配列の５’末端を有するコンストラクトをＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドに挿入した。これらのプラスミドをワンショットＥ．ｃｏｌｉ（インビトロジェン）で増幅し、キアプレップ・ミニプレップ（キアゲン）を用いて精製した。コンストラクトを制限酵素マッピングと部分的な配列解析によって確認した。
【００６２】
１．２ トランスフェクションおよびウアバイン毒性分析
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州）を、１０％の熱で不活性化したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）で培養した。トランスフェクションのために、フージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）６ 試薬（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム（Ｒｏｃｈｅ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ），ドイツ）を、製造元の説明に従って用いた。簡単に言えば、細胞培養培地（１００μｌ）中で、プラスミドＤＮＡ（１０5個の細胞あたり２μｇ）と試薬（５μｌ）とを混合し、１５分間インキュベートした後、細胞に加えた。２４時間後に、ウアバインを最終濃度が１０μＭになるように各ウェルに加えた。２４時間インキュベートした後に、細胞の生存率 を記録した。
【００６３】
上述のように、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州）を培養し、トランスフェクトした。１０μＭウアバイン中で４８時間インキュベートした後に、細胞を、ＰＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で２回洗浄し、０．０２５％ブタトリプシンを含む塩類溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で１５分間インキュベートした。ＦＢＳ添加によりトリプシンを不活性化した。１０μＭウアバイン中で細胞を再びインキュベートした。４８時間インキュベートした後、細胞の生存率を記録した。
【００６４】
２．結果
２．１ 細胞内での局在
トランスフェクションプロセスと突然変異タンパク質の細胞内での局在をモニターするために、ＥＧＦＰ−キメラヒト／ラットＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１融合遺伝子を構築した。ＣＯＳ−７およびＨｅＬａ細胞の、ｐＥＧＦＰ−キメラ融合遺伝子でのトランスフェクションにより、融合タンパク質の細胞膜への局在が起こった。トランスフェクション実験におけるポジティブコントロールとして、ｐＥＧＦＰＲを用いた。ｐＥＧＦＰＨ発現は、ＣＯＳ−７細胞にウアバイン耐性を付与しなかった。その上、ｐＥＧＦＰＨのトランスフェクションによってＨｅＬａで天然に発現されたヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１遺伝子の過剰発現は、ウアバイン感受性に影響を与えなかった。コントロール、ｐＥＧＦＰＲ、ｐＥＧＦＰＨ、同様に、キメラＥＧＦＰ融合タンパク質は、細胞膜に局在しており、ＧＦＰ蛍光で検出することができた。Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１発現の翻訳後調節は、その同起源のβサブユニットのレベルによって制御される。トランスフェクトされた細胞において、プラスミドによってコードされたタンパク質は、βサブユニットに関して内因性αサブユニットと競合し、アセンブルされていないα−サブユニットは迅速に分解する（ＳｈａｎｂａｋｙおよびＰｒｅｓｓｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９９５年，７３：２６１〜２６８）。
【００６５】
２．２ ウアバイン感受性
トランスフェクトされたキメラｃＤＮＡのウアバイン毒性に対する感受性をインビトロで測定した。１０μＭウアバインは、野生型ＨｅＬａおよびＣＯＳ−７の細胞死を誘導するが、ラットＯｕａＲコンストラクトは、ウアバイン耐性を付与し、この α１−サブユニットを発現するＨｅＬａおよびＣＯＳ−７を生存させる。ウアバインで２４時間インキュベートした後に、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の生存率を記録した。４８時間インキュベートした後に、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の生存率を記録し、その後、トリプシン処理し、１０μＭウアバインとさらに４８時間接触させた。ラット配列のキメラｃＤＮＡの５’末端を有するキメラｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞は、１０μＭウアバインに対して耐性であったが、ヒト配列の５’末端を有するコンストラクトでトランスフェクトされた細胞は、ｃＤＮＡの残りの部分の構成に関わらず、ウアバインで誘導された細胞死によって死滅した（図１）。ポジティブコントロール（ｐＥＧＦＰＲ）は、トランスフェクトされた細胞へ耐性を付与したが、ネガティブコントロール（ｐＥＧＦＰＨ）および未導入の細胞は、ウアバインと摂取させることによって除去された。それゆえに、１０μＭウアバイン耐性の表現型に重要なアミノ酸は、キメラα１−サブユニットのアミノ末端内に、より正確には最初の１２９のアミノ酸内に位置する。ウアバイン結合部位は、細胞外表面上の膜に近接していると推測される。従って、本発明者は、Ｈ１−Ｈ２ジャンクション内、および、その端にあるアミノ酸は、ラット−ヒトキメラα１−サブユニットタンパク質の、１０μＭウアバイン耐性の表現型に関して特定の重要性があると考えている。
【００６６】
優先権を主張した年に追加された実験部分
３．材料および方法
３．１ 部位特異的変異誘発
ｐＥＧＦＰＨを、テンプレートとして用いて、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｎ１２９Ｄを作製した。以下のプライマーを用いて、オーバーラップするセグメントを作製し、それらを連結させ、ＰＣＲによって増幅した；
ＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴ（Ｑ１１８Ｒフォワード）（配列番号１５）、
ＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡ（Ｑ１１８Ｒリバース）（配列番号１６）、
ＴＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓフォワード）（配列番号１７）、
ＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓリバース）（配列番号１８）、
ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧ（Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄフォワード）（配列番号１９）、
ＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ（Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄリバース）（配列番号２０）、
ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧ（Ｎ１２９Ｄフォワード）（配列番号２１）、
ＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴ（Ｎ１２９Ｄリバース）（配列番号２２）。
【００６７】
上記の１または２個のアミノ酸置換をコードするｃＤＮＡを、テンプレートとして用いて、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ）、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ）、Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）およびＨ（Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｎ１２９Ｄ）を作製し、再度、上記のプライマーを用いた。これらのコンストラクトを、キメラｃＤＮＡに関して説明したように、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングした。これらクローンのＡｃｃＩで切り出されたフラグメント（突然変異領域を含む）を、ＡｃｃＩで切断したｐＥＧＦＰＨに挿入し、置換した。最終的なｃＤＮＡは以下の通り；ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｎ１２９Ｄ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ ｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ ｐＥＧＦＰＨ−Ｎ１２９Ｄ。これらのコンストラクトは、キメラｃＤＮＡに関して説明したように、形質転換によって増幅して製造された。制限酵素マッピングと部分的な配列解析により、突然変異したｃＤＮＡを確認した。
【００６８】
３．２ 細胞系
ヒト上皮ガンＨｅＬａ（ＡＴＣＣ，マナサス，バージニア州，米国）、フェニックス（Ｐｈｏｅｎｉｘ）ＧＰ（リンパ芽球Ｃ１Ｒ−ｓＢ７）は、Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（スタンフォード，カリフォルニア州，米国）のＧ．Ｎｏｌａｎ博士の許可のもとにＡＴＣＣから得て、ＧａＬＶエンベロープを有するマウスレトロウイルス生産細胞系ＰＧ１３を、ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）グルタマックス−１と、１０％の熱で不活性化されたウシ胎仔血清（ギブコ）中で培養した。増殖するために、細胞をＰＢＳ（ギブコ）で２回洗浄し、０．０２５％ブタトリプシンを含む塩類溶液（シグマ）中で約５分間インキュベートした。ＦＢＳの添加によってトリプシンを不活性化した。
【００６９】
３．３ ＤＮＡトランスフェクションおよびウアバイン毒性分析
トランスフェクションのために、フージーン６試薬（ロシュ・ベーリンガー・マンハイム，ドイツ）を、製造元の説明書に従って用いた。簡単に言えば、体積１００μｌの細胞培養培地 ＤＭＥＭグルタマックス中で、プラスミドＤＮＡ（１０5個の細胞あたり２μｇ）と試薬（５μｌ）とを混合し、１５分間インキュベートした後に、細胞に加えた。ウアバイン（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を、１０ｍＭのストック溶液として、ＤＭＥＭに溶解させた。選択実験には、１０〜５００μＭが用いられた。トランスフェクションの２４時間後に、ウアバインを細胞に加えた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（ロシュ）を製造元の説明書に従って用いて、細胞の生存を分光光度法によって定量した。
【００７０】
３．４ レトロウイルスベクターコンストラクト
マルチクローニング部位を含むｐＭＰ７１−ＥＧＦＰからの７００ｂｐのＮｈｅＩ；ＸｈｏＩ３’−ＬＴＲフラグメントを、ＳＦ９１MCSにおけるＸｂａＩ部位に挿入することによって、ｐＭＰ９１MCSを作製した。レトロウイルスベクターｐＭＰ９１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）を、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断したベクターｐＭＰ９１MCS、ｐＧＣ１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）のＨｉｎｄＩＩＩ；ＢｇｌＩＩフラグメント、および、ｐＧＣ３−Ｒ１stＨからのＢｇｌＩＩ；ＳａｌＩフラグメント（ＰＣＲで停止コドンの下流に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む）の３点ＤＮＡライゲーションとして作製した。
【００７１】
３．５ ウイルス上清の製造
一時的なフェニックスＧＰのトランスフェクションによって、組換えレトロウイルスベクターを製造した。６−ウェルプレート中１０００００個の濃度で細胞をプレーティングした。次の日、フージーン６試薬を上記のプロトコールに従って用いて、細胞を、ベクタープラスミド（３．７５μｇ）およびｐＭＤＧ（０．７５μｇ）（Ｄ．Ｔｒｏｎｏ，Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ提供，水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードする）でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、上清を回収し、ろ過し、アリコートにして−７０℃で凍結した。ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウイルスベクターを用いて、ＰＧ１３ＧＡＬＶ−偽型生産細胞プールを製造した。ＰＧ１３細胞を、６−ウェルプレート中に約２３０００個でプレーティングし、ＶＳＶ−Ｇ（１ｍｌ）を用いて導入した。ポリブレンを、濃度４〜８μｇ／ｍｌで用いた。６日間連続して、６回の導入を行った。生産細胞プールを拡張し、これを用いて上清を製造した。上清を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、凍結した。
【００７２】
３．６ ＨｅＬａの導入と選択
ＨｅＬａを、６−ウェルプレートに密度１０5／ウェルで播いた。ＰＧ１３生産細胞プール（約５０００ＴＵ／ｍｌ）から回収された、凍結ｐＭＰ９１−Ｈ（Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ）の上清（２００μｌ）を３７℃に温め、上記細胞に加えた。また、８μｇ／ｍｌのポリブレンを加えた。導入の２４時間後に、ウアバインを、濃度１０μＭで、この培養液に加えた。ウアバイン選択の４８時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次に、導入され、選択された細胞を、ウアバイン非含有培地で増殖させた。
【００７３】
４．結果
４．１ ヒトタンパク質の操作されたウアバイン耐性
本発明者は、キメララット−ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の、ｃＤＮＡのウアバイン耐性の増加に関与する重要なアミノ酸を決定することを計画した。ウアバイン結合部位は、細胞外表面上の膜に近接していると推測される。それゆえに、本発明者は、Ｈ１−Ｈ２ジャンクション内の、および、それに隣接するアミノ酸が、１０μＭウアバイン耐性の表現型に関する特定の重要性を有する可能性があると仮定した。Ｈ１−Ｈ２ジャンクション（位置番号１１８〜１２９，ヒトアミノ酸配列）内の４つの位置が、ヒトのα１−サブユニット配列とラットのα１−サブユニット配列で異なるため、本発明者は、これらの位置（Ｑ１１８、Ａ１１９、Ｑ１２６、およびＮ１２９）が、キメララット−ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１のｃＤＮＡのウアバイン耐性に重要であると推測した。ヒトｃＤＮＡにおいて、これらの位置のアミノ酸を、ヒトからラットに、Ｑ１１８Ｒ、Ａ１１９Ｓ、Ｑ１２６Ｐ、Ｎ１２９Ｄのように置換することによって、これらのうちどれが、組換えヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットの、１０μＭウアバインに対する耐性を増加させるのに必要であり、かつ十分であるかを評価することができる。アミノ酸置換を、ＰＣＲ技術を用いた部位特異的変異誘発によって作製した。突然変異遺伝子は、以下の通り：Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、および、Ｈ−Ｎ１２９Ｄ。キメラｃＤＮＡで説明した方法を用いる、突然変異ヒトｃＤＮＡを、ＧＣ１プラスミド中でＥＧＦＰとフレーム内で融合させた。
【００７４】
４．２ ヒト細胞系のトランスフェクションおよび選択
ＨｅＬａ細胞を、ＥＧＦＰ突然変異ヒトｃＤＮＡを有するプラスミドでトランスフェクトし、続いて、トランスフェクションの２４時間後に、１０μＭウアバイン中で２４時間インキュベートした。突然変異遺伝子Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ，Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ；Ｑ１２６Ｐ、および、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄは、ウアバイン耐性を付与したが、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ａ１１９Ｓ、Ｈ−Ｑ１２６Ｐ；Ｎ１２９Ｄ、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ、および、Ｈ−Ｎ１２９Ｄは、耐性が付与されなかった。結論として、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１の１０μＭウアバイン耐性を付与するためには、２つの位置；Ｑ１１８ＲおよびＮ１２９Ｄでの置換が必要であり、かつ十分である。最小限に突然変異させたヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１により、どの程度ウアバイン耐性が付与されたかを決定するために、用量応答分析を行った。ＨｅＬａ細胞を、プラスミドｐＥＧＦＰＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ、または、ｐＥＧＦＰＲで一時的にトランスフェクトした。２４時間で、細胞は、ウアバインで選択するのに十分な量の融合遺伝子を発現した。このトランスフェクトされた細胞を、様々な濃度のウアバイン（１０〜５００μＭ）で２４時間選択し、続いて、ウアバイン非含有培地にトランスファーし、ＷＳＴ−１増殖性物質を用いて定量した。結果を図２に示す。ウアバインの２４時間後に、コントロールおよびトランスフェクトされていない細胞は除去したが、ラットＯｕａＲ、または、ヒトＱ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄ置換Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼα１ｃＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされた細胞は、１０および１０μＭウアバイン濃度で生存した。５００μＭウアバインは、突然変異ヒトコンストラクトでトランスフェクトされた細胞にとって毒性であり、また、ラットＯｕａＲでトランスフェクトされた細胞にとっても概して多少の毒性を有することを示した。死細胞片と、ウアバイン選択中に解離した細胞を洗浄し、ウアバイン非含有培地にトランスファーした。解離した細胞と死細胞片からは、生存細胞は観察されなかった（データ示さず）。
【００７５】
４．３ レトロウイルスベクターの製造および遺伝子トランスファー
我々は、ＰＧ１３のＭＰ９１Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９Ｄレトロウイルス生産細胞プールを用いて、Ｈ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９ＤのｃＤＮＡを標的ＨｅＬａ細胞に導入することができた。重複感染度（ＭＯＩ）は＜０．０５であった。それゆえに、導入された細胞が、細胞あたり１超のレトロウイルスコピーを統合する可能性は極めて低い。純粋な導入された細胞群を得るために、導入の２４時間後に、１０μＭウアバインを４８時間加えた。選択された細胞群をさらに拡張し、ウアバイン非含有成長培地で増殖させた。プラスミドＤＮＡでの一時的なトランスフェクションにより、細胞あたり数千に至る遺伝子コピーがトランスファーされ、導入遺伝子の高発現が起こる。この実験において、たった１つの遺伝子コピーでも、１０μＭウアバイン耐性を付与するのに十分な量でＨ−Ｑ１１８Ｒ；Ｎ１２９ＤのｃＤＮＡを発現させることがわかった。
【００７６】
本発明者が当座認識している最良の形態を構成する好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、当業者であれば様々な変化および改変が明白であり、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に添付された請求項の記載に従ってなされ得るものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ウアバインで誘導された細胞死への耐性に関して試験したコンストラクトの概略図を示す。
【図２】一時的なトランスフェクションの後、ウアバインを用いてＨｅＬａ細胞を選択した結果を図示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質であって：
−組換えタンパク質のα１−サブユニットは、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットに少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、該ヒトタンパク質のα１−サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体であること；
−タンパク質のα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列における差は、アミノ酸番号６５〜１３３の間に位置する；および、
−組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、ウアバイン、ジゴキシン、ジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンから選択される強心配糖体に対して耐性であること、
を特徴とする、上記タンパク質。
【請求項２】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置する少なくとも１つのアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項３】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大１０個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項４】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大４個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項５】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項６】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９において異なる、請求項５に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項７】
タンパク質は、少なくとも１０-7Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項８】
タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１または２に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項９】
タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１または２に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする、核酸コンストラクトまたはそれらの機能的な相同体。
【請求項１１】
配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である、請求項１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２】
配列番号２４に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法であって、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同な組換えα１−サブユニットタンパク質またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を生産するように改変され、該改変は、配列番号１のアミノ酸番号６５〜１３３の間に位置するアミノ酸置換であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸について少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されるように改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、特定のアミノ酸置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大１０個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大４個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子の５’末端は、該タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大２個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１８および１２９の置換である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２１】
インビトロでの研究で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質が用いられることを特徴とする、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程。
【請求項２２】
哺乳動物のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究において用いるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２３】
遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、ドナー、患者または第三の要素の源またはそれらのあらゆる組合せの遺伝子改変された初発の正常なヒトまたはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的または完全に天然の細胞もしくは合成細胞。
【請求項２５】
細胞は真核細胞である、請求項２４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２６】
細胞はヒト細胞である、請求項２４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２７】
メカニズム（例えばエキソゾームおよびリポソーム、またはそれらの機能的な同等物）によってトランスファーされた、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を発現する、ドナー、患者または第三の要素の源またはそれらのあらゆる組合せの初発の正常なヒトまたはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的または完全に天然の細胞もしくは合成細胞。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質であって：
― α−サブユニットはα１−アイソフォームであり、
― 該組換えタンパク質のα１−サブユニットは、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットに少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、該ヒトタンパク質のα１−サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはその機能的に同等ないずれかの相同体であること；
― 該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置するアミノ酸の少なくとも１つに関して異なること；および、
― 組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、ウアバイン、ジゴキシン、ジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンから選択される強心配糖体に対して耐性であること、
を特徴とするα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含む、上記タンパク質。
【請求項２】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置する最大１０個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項３】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大４個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項４】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項５】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９において異なる、請求項
１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸番号１１８がグルタミンからアルギニンに置換されおよびアミノ酸番号１２９がアスパラギンからアスパルテートに置換された、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項７】
該タンパク質は、少なくとも１０-7Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項８】
該タンパク質は、少なくとも１０-5Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項９】
該タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１０】
該タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする、核酸コンストラクトまたはその機能的な相同体。
【請求項１２】
配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
配列番号２４に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１４】
組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法であって、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同な組換えα１−サブユニットタンパク質を生産するように改変され、該改変は、配列番号１のアミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置するアミノ酸置換であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸について少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されるように改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、特定のアミノ酸置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大１０個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大４個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子の５′末端は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大２個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１８および１２９の置換である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該置換は、アミノ酸番号１１８のグルタミンのアルギニンへの置換およびアミノ酸番号１２９のアスパラギンのアスパルテートへの置換である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２２】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用い、および、該選択が２４〜４８時間行われることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２３】
インビトロでの研究で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程。
【請求項２４】
哺乳動物のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究において用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２５】
遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２６】
ウイルス性遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子改変された、ドナー、患者もしくは第三者由来のまたはそれらのあらゆる組合せの、初代正常ヒトもしくはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的もしくは完全に天然もしくは合成細胞。
【請求項２８】
細胞は真核細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２９】
細胞はヒト細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３０】
エキソゾームおよびリポソームのようなメカニズム、またはそれらの機能的な同等物によってトランスファーされた、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を発現する、ドナー、患者もしくは第三者由来のまたはそれらのあらゆる組合せの、初代正常ヒトもしくはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的もしくは完全に天然もしくは合成細胞。
【請求項１】
組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質であって：
−組換えタンパク質のα１−サブユニットは、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットに少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、該ヒトタンパク質のα１−サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体であること；
−タンパク質のα１−サブユニットと、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットとのアミノ酸配列における差は、アミノ酸番号６５〜１３３の間に位置する；および、
−組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、ウアバイン、ジゴキシン、ジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンから選択される強心配糖体に対して耐性であること、
を特徴とする、上記タンパク質。
【請求項２】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置する少なくとも１つのアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項３】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大１０個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項４】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大４個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項５】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項６】
タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９において異なる、請求項５に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項７】
タンパク質は、少なくとも１０-7Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項８】
タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１または２に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項９】
タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１または２に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする、核酸コンストラクトまたはそれらの機能的な相同体。
【請求項１１】
配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体である、請求項１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１２】
配列番号２４に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１０に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法であって、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同な組換えα１−サブユニットタンパク質またはそれらの機能的に同等なあらゆる相同体を生産するように改変され、該改変は、配列番号１のアミノ酸番号６５〜１３３の間に位置するアミノ酸置換であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸について少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されるように改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、特定のアミノ酸置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大１０個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大４個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子の５’末端は、該タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大２個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１８および１２９の置換である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２１】
インビトロでの研究で、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質が用いられることを特徴とする、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程。
【請求項２２】
哺乳動物のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究において用いるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２３】
遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、ドナー、患者または第三の要素の源またはそれらのあらゆる組合せの遺伝子改変された初発の正常なヒトまたはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的または完全に天然の細胞もしくは合成細胞。
【請求項２５】
細胞は真核細胞である、請求項２４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２６】
細胞はヒト細胞である、請求項２４に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２７】
メカニズム（例えばエキソゾームおよびリポソーム、またはそれらの機能的な同等物）によってトランスファーされた、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を発現する、ドナー、患者または第三の要素の源またはそれらのあらゆる組合せの初発の正常なヒトまたはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的または完全に天然の細胞もしくは合成細胞。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質であって：
― α−サブユニットはα１−アイソフォームであり、
― 該組換えタンパク質のα１−サブユニットは、アミノ酸レベルで、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットに少なくとも９８％相同であり、ここにおいて、該ヒトタンパク質のα１−サブユニットのアミノ酸配列は、配列番号１に記載の配列、またはその機能的に同等ないずれかの相同体であること；
― 該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置するアミノ酸の少なくとも１つに関して異なること；および、
― 組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質は、ウアバイン、ジゴキシン、ジギトキシン、プロシラリジンＡ、パリトキシンおよびコンバラトキシンから選択される強心配糖体に対して耐性であること、
を特徴とするα−サブユニットおよびβ−サブユニットを含む、上記タンパク質。
【請求項２】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置する最大１０個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項３】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大４個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項４】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットと、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に位置する最大２個のアミノ酸に関して異なる、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項５】
該タンパク質のα１−サブユニットは、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットとは、アミノ酸番号１１８および１２９において異なる、請求項
１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸番号１１８がグルタミンからアルギニンに置換されおよびアミノ酸番号１２９がアスパラギンからアスパルテートに置換された、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項７】
該タンパク質は、少なくとも１０-7Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項８】
該タンパク質は、少なくとも１０-5Ｍウアバインに対して耐性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項９】
該タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１０】
該タンパク質のα１−サブユニットは、配列番号２３に記載の配列を含む、請求項１に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質のα１−サブユニットをコードする、核酸コンストラクトまたはその機能的な相同体。
【請求項１２】
配列番号３に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１３】
配列番号２４に記載の配列、またはそれらの機能的に同等ないずれかの相同体である、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項１４】
組換えウアバイン耐性Ｎａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼタンパク質の製造方法であって、ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、対応するヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットに、アミノ酸レベルで少なくとも９８％相同な組換えα１−サブユニットタンパク質を生産するように改変され、該改変は、配列番号１のアミノ酸番号１１７〜１３３の間に位置するアミノ酸置換であることを特徴とする、上記方法。
【請求項１５】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸について少なくとも１つのアミノ酸置換が導入されるように改変される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニット遺伝子は、特定のアミノ酸置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大１０個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大４個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子の５′末端は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１７〜１３０の間に含まれるアミノ酸の最大２個の置換からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該変化は、アミノ酸番号１１８および１２９の置換である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヒトＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼのα１−サブユニットのｃＤＮＡまたは遺伝子は、タンパク質のアミノ酸に特定の置換が導入されるように改変され、該置換は、アミノ酸番号１１８のグルタミンのアルギニンへの置換およびアミノ酸番号１２９のアスパラギンのアスパルテートへの置換である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２２】
インビトロでの遺伝子改変細胞の選択に、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用い、および、該選択が２４〜４８時間行われることを特徴とする、遺伝子治療法における工程。
【請求項２３】
インビトロでの研究で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を用いることを特徴とする、毒性メカニズムの研究に用いられる方法における工程。
【請求項２４】
哺乳動物のＮａ+，Ｋ+ＡＴＰアーゼに直接的または間接的に影響を与える物質の薬理学的研究において用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項２５】
遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２６】
ウイルス性遺伝子トランスファーベクターの機能的な部分を形成する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトまたはそれらの同等なあらゆる相同体。
【請求項２７】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを含む、遺伝子改変された、ドナー、患者もしくは第三者由来のまたはそれらのあらゆる組合せの、初代正常ヒトもしくはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的もしくは完全に天然もしくは合成細胞。
【請求項２８】
細胞は真核細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項２９】
細胞はヒト細胞である、請求項２７に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項３０】
エキソゾームおよびリポソームのようなメカニズム、またはそれらの機能的な同等物によってトランスファーされた、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を発現する、ドナー、患者もしくは第三者由来のまたはそれらのあらゆる組合せの、初代正常ヒトもしくはヒト腫瘍細胞、ヒトのキメラ細胞、または、非ヒト細胞、部分的もしくは完全に天然もしくは合成細胞。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５１７７９９（Ｐ２００６−５１７７９９Ａ）
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２８０３（Ｐ２００６−５０２８０３）
【出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２７８
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０５３０５９２７）アヴァリス・アクチエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１３日（２００４．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２７８
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５０５３０５９２７）アヴァリス・アクチエボラーグ (5)
【Ｆターム（参考）】
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