形質転換植物及びロジン代替物の製造方法
【課題】 マツのような樹木から採取するよりも比較的容易且つ短期間でロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を取得できるよう、ジテルペン系樹脂酸を効率的に製造する方法、及びそれに用いる形質転換植物細胞、及び形質転換植物体を提供すること。
【解決手段】 ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれか又は両方を導入してなる形質転換植物細胞及び植物体を提供すること。
【解決手段】 ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれか又は両方を導入してなる形質転換植物細胞及び植物体を提供すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は形質転換植物を用いたロジン代替物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロジンは、馬尾松をはじめとするマツ科植物から得られる樹脂油のうち、精油などの揮発性物質を留去した後の残留樹脂であり、紙サイズ剤、印刷インキ、塗料、接着剤、滑り止め剤、はんだ用フラックス、医薬、香料などの用途に幅広く利用されている。また近年、環境保護の観点から再生可能な資源が注目されており、天然資源から繰り返し採取可能なロジンはグリーンサステイナブルな樹脂として重要度が増している。
【０００３】
採取法から分類したロジンの種類としては、ガムロジン、トールロジン、ウッドロジンがあるが、世界のロジン生産高の大半を占めるアジアにおいてはガムロジンが主である。ガムロジンの製造法は、マツの幹に傷を付け、にじみ出てくる樹液を回収、そこから精製するという方法であり、機械化が難しい作業であるため非常に手間のかかる方法である（非特許文献１）。また、マツを植栽してから樹液を回収できるようになるまでにはおよそ１５年を要することから、災害や病害虫などの被害により一旦マツが死滅してしまうと、再びロジンを採取できるようになるまでには非常に時間がかかってしまう。それ故、安定的な生産には高い計画性が要求される手法でもある。こうしたことから、従来の手法に代わる効率的なロジン製造法開発が望まれていた。
【０００４】
ところで、ロジン構成成分である樹脂酸のうち主成分はテルペノイド系化合物のうち、ジテルペン系樹脂酸といわれる化合物であり、アビエチン酸、レボピマール酸、ネオアビエチン酸、パルストリック酸、イソピマール酸、サンダラコピマール酸、ピマール酸、ジハイドロアビエチン酸、アガチック酸、イソコプレシック酸、コムニック酸などが挙げられ、なかでもアビエチン酸がロジン構成成分中でもっとも含有量が多い。これらジテルペン系樹脂酸はロジン代替物としてそのまま利用できることから、ジテルペン系樹脂酸、特にアビエチン酸を効率的に製造することができればそのままロジン代替物の効率的製造法に繋がるものと考えられる。
【０００５】
従来、遺伝子組換え技術を利用し、マツ科植物からの採集以外の方法でアビエチン酸あるいはアビエチン酸の前駆体であるアビエタジエンを生産しようとした試みとしては非特許文献２がある。しかし、該手法は遺伝子組換え宿主として酵母を用いており、大量生産に際しては大規模な設備投資が必要になるなど不利な点があった。また現在に至るまで、マツのような樹木よりも回収が容易且つ生長が速く短期間で収穫可能な植物の遺伝子組換えでジテルペン系樹脂酸あるいはジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの生産に成功した例は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００８） Ｖｏｌ．５４， Ｐ．６５６−６６９
【非特許文献２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００６） Ｖｏｌ．６７， Ｐ．２４１５−２４２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、マツのような樹木から採取するよりも比較的容易且つ短期間でロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を取得できるよう、ジテルペン系樹脂酸を効率的に製造する方法、及びそれに用いる形質転換植物細胞、及び形質転換植物体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、成長の比較的早い植物の形質転換細胞及び植物体を用いてジテルペン系樹脂酸を人為的に生産させることにより、ロジン代替物としてのジテルペン系樹脂酸を比較的容易な回収手段で且つ短期間で安定的に製造できることを見出し、本発明を完成することに至った。
【０００９】
本発明では、
ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれか又は両方を導入してなる形質転換植物細胞及び植物体を提供することにより、前記課題を解決する。
【００１０】
本発明の構成は以下の通りである。
１．植物形質転換用ベクターに、ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を連結したことを特徴とする組換えベクター。
２．前記組換えベクターを導入したアグロバクテリウム。
３．前記アグロバクテリウムにより、ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を導入した形質転換植物細胞、及びその形質転換植物細胞からなる形質転換植物体。
５．前記形質転換細胞又は形質転換植物体からジテルペン系樹脂酸を回収することによるロジン代替物の製造方法。
【００１１】
すなわち本発明を利用することで、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を導入し、なおかつ生体内で発現させることによりジテルペン系樹脂酸を生産することができる形質転換植物細胞、及びその形質転換植物細胞からなる形質転換植物体（以下、合わせて形質転換植物と記すことがある）を得ることができる。 本発明において、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドは、どちらか一方が宿主細胞内に導入されていれば良いが、両方同時に導入されているほうが好ましい。
【００１２】
生産されたジテルペン系樹脂酸を形質転換植物から回収することにより、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を効率的に生産することができる。マツと比較して生育の早い一年草などの植物を形質転換することにより、天災や病害虫の被害からの復興も容易であり、また形質転換植物の耕作面積を大きくするだけでロジン代替物の生産量を増やすことができることから、安定的且つ計画的なロジン代替物の製造が可能となる。この場合形質転換植物は、形質転換された第1世代は勿論、第１世代を継代して得られた第2世代以降の植物体を用いても良い。
更には、本発明を応用することにより、形質転換植物中で他の有用物質との同時生産も可能である。例えば、ゴム産生植物中でゴムとロジン代替物を同時に生産させたり、パームヤシ中でパーム油とロジン代替物を同時に生産させるなども可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ジテルペン系樹脂酸産生形質転換植物及びそれを用いた効率的なジテルペン系樹脂酸の製造方法が提供でき、これは比較的容易な回収作業で且つ短期間にロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を製造する方法に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（実施例１）で構築したベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ
【図２】（実施例２）で構築したベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０
【図３】（実施例３）で構築したベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０
【図４】（参考例１）アビエチン酸標品のＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図５】（実施例１３）ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図６】（実施例１４）Ｐ４５０形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図７】（実施例１５）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図８】（実施例１６）ｔ−ＬＡＳ形質転換ペリプロカ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図９】（実施例１７）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図１０】（実施例１８）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカサスペンジョンカルチャー抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
【００１６】
１．組換えベクター
１．１．ベクター
本発明の組換えベクターを作製する際に用いるベクターとしては、本発明の効果を損なわない限り、遺伝子導入用のベクターを用いることができる。宿主に植物を用いる場合には、通常植物形質転換に用いられるベクターを用いることができ、例えば、Ｔｉプラスミドやバイナリーベクター（ミニＴｉプラスミド）など各種ベクターを使用可能であるが、カナマイシン耐性等の抗生物質耐性の選択マーカーを有していることが好ましく、例えば、ｐＲＩ９１０やｐＢＩＮ１９などのバイナリーベクターがより好ましいものとして挙げられる。
【００１７】
１．２． 導入ポリヌクレオチド
１．２．１． ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸は、イソペンテニルジフォスフェートからゲラニルゲラニルジフォスフェートを経由して生合成される。ジテルペン系樹脂酸の合成を活性化するには、ジテルペン系樹脂酸生合成経路に寄与する生体触媒であるポリペプチドの合成を促進すればよく、ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入すればよい。ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンとしては、アビエタジエン、レボピマラジエン、ネオアビエタジエン、パルストラジエン、イソピマラジエン、サンダラコピマラジエン、ピマラジエン、ジハイドロアビエタジエン、アガタジエン、イソコプレジエン、コムナジエンが挙げられ、ジテルペンの合成活性を有するポリペプチドとしては、アビエタジエンシンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、ネオアビエタジエンシンターゼ、パルストラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、サンダラコピマラジエンシンターゼ、ピマラジエンシンターゼ、ジハイドロアビエタジエンシンターゼ、アガタジエンシンターゼ、イソコプレジエンシンターゼ、コムナジエンシンターゼなどが挙げられ、特にアビエタジエン合成活性を有するアビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
【００１８】
１．２．1.．１． アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アビエタジエンの合成を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば良く、トウヒやアカマツ、クロマツ、テーダマツなどのマツ科植物や、イチョウなど由来のレボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドやアビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられ、より好ましいものとして、ヨーロッパトウヒ（ピセア アビエス、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
この様なアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては例えば、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドがプラスチドで発現することを規定するシグナル（プラスチド移行シグナルとも称する）が前半部分にコードされているＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）である（Ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド、（Ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｃ）配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２０】
また、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドであってプラスチド移行シグナルがコードされていないＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）である（Ｄ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド、（Ｅ）配列番号２のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｆ）配列番号２のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２１】
１．２．２． ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
宿主内で合成されたジテルペンは、そのまま宿主内の酸化還元酵素の作用によって自然にジテルペン酸へと変換させても良いが、ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドを宿主内で過多発現させることにより、ジテルペンを宿主内でジテルペン系樹脂酸へ効率よく変換させることによって、ロジン代替物を宿主内で安定的に生合成させることもできる。
ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドとしては、ジテルペンをジテルペン系樹脂酸へと酸化する活性があればよく、EC第１群に分類される各種酸化還元酵素を用いることができる。酸化還元酵素としては、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、カタラーゼなどが挙げられ、中でもオキシゲナーゼの一種であるＰ４５０が好ましい。また、ジテルペンの種類により、アビエタジエンオキシダーゼ、レボピマラジエンオキシダーゼ、ネオアビエタジエンオキシダーゼ、パルストラジエンオキシダーゼ、イソピマラジエンオキシダーゼ、サンダラコピマラジエンオキシダーゼ、ピマラジエンオキシダーゼ、ジハイドロアビエタジエンオキシダーゼ、アガタジエンオキシダーゼ、イソコプレジエンオキシダーゼ、コムナジエンオキシダーゼが好ましい。
【００２２】
１．２．２．１． アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
アビエタジエンからロジン代替物であるアビエチン酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アビエタジエンからロジン代替物であるアビエチン酸に変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば良く、例えばマツ科植物由来のP４５０遺伝子などが挙げられ、より好ましいものとしてテーダマツ（パイナス テーダ、Ｐｉｎａｓ ｔｅａｄａ）由来のP４５０遺伝子が挙げられる。
【００２３】
この様なアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては例えば、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ由来のチトクロームＰ４５０のｃＤＮＡである（Ｇ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド、（Ｈ）配列番号３のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｉ）配列番号３のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２４】
１．３． 組換えベクターの調製
本発明の組換えベクターは、ベクターに前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを片方又は両方を連結することによって調製できる。
これらのポリヌクレオチドは、そのままベクターに連結しても良いが、それぞれの活性を示す範囲内で、前記塩基の欠失、置換、もしくは付加を行っても良い。
【００２５】
さらに、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を促進する目的で、例えばエンハンサーなどの塩基配列を付加してもよい。このようなエンハンサーは、例えば翻訳エンハンサーであるタバコアルコール脱水素酵素遺伝子の５’非翻訳領域（ＮｔＡＤＨ）などが挙げられる。
【００２６】
さらに、前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端の少なくとも一方に、形質転換した際に宿主内で、例えば、プロモーターやターミネーター等の塩基配列を付加してもよい。このようなプロモーターやターミネーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターやＨＳＰターミネーターなどが挙げられる。
【００２７】
また、形質転換細胞の選抜の目安となる機能を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクターに連結しても良い。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、選抜マーカーとして用いることができる機能を有すればよく、各種薬剤耐性遺伝子、栄養要求株におけるその補足の遺伝子、ＵＶ耐性遺伝子、温度耐性遺伝子、高塩濃度耐性遺伝子、蛍光タンパク遺伝子などが挙げられる。
これら選抜マーカーは、宿主となる細胞の性質に合わせて選択すればよく、中でも蛍光タンパク遺伝子や薬剤耐性遺伝子を用いた場合、形質転換細胞を簡便に選択できるため、好ましい。蛍光タンパク遺伝子としてはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられ、例えばＥＧＦＰやｓＧＦＰなどを用いることができる。また、薬剤耐性遺伝子としてはカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２８】
２． 組換えベクターの導入方法
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、公知慣用の手法で形質転換を行えばよく、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、コンピテントセル法、などが挙げられ、宿主に植物を用いる場合には形質転換効率の観点からアグロバクテリウム法が好ましい。
【００２９】
２．１． アグロバクテリウム
前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをアグロバクテリウム法により植物細胞へ導入する場合、まず、前記組換えベクターをエレクトロポレーション法等によってアグロバクテリウムに導入する。本発明に用いるアグロバクテリウムの種類は特に制限されず、例えば、ＥＨＡ１０５やＬＢＡ４４０４などが使用できる。
前記組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを、例えば、カナマイシン等の抗生物質を含む培地で培養すれば、導入されたベクター内の抗生物質耐性遺伝子発現により生育してきたを形質転換した感染用アグロバクテリウムとして選択的に得ることができる。
【００３０】
３． ロジン代替物産生に用いる宿主
ロジン代替物産生に用いる宿主としては、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の生合成経路を持つ細胞又は細胞から形成される個体であれば良い。また、宿主としたい細胞がジテルペン系樹脂酸の生合成経路を持たない場合には、遺伝子組換えなどの手段によりジテルペン系化合物の生合成経路を後から獲得した細胞を作成し、宿主として用いても良い。宿主としては動物、植物、微生物などのどれを用いても良いが、予めジテルペン系樹脂酸の生合成経路を獲得している植物を宿主とするのが好ましい。
【００３１】
３．１． ロジン代替物産生に用いる植物
本発明でロジン代替物産生に用いる植物としては、栽培しやすく、成長速度が速く、産生したロジン代替物の回収が容易であり、導入されたジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現するものであれば、特に種類は限定しない。その中でも、特に栽培しやすく成長速度が速く、樹液の圧搾等によりロジン代替物の回収が容易である植物として、ペリプロカ属及びタバコ属の植物が好ましい。
【００３２】
３．１．１． ペリプロカ属
前記ペリプロカ属の植物としては、例えばペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ カロフィラ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ）、ペリプロカ フロリブンダ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）、ペリプロカ フォレスティ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｆｏｒｒｅｓｔｉｉ）などを挙げることができ、より好ましいものとしてペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）が挙げられる。
【００３３】
３．１．２． タバコ属
前記タバコ属の植物としては、例えばタバコ、ハナタバコ、マルバタバコ、キダチタバコ、ジャスミンタバコなどを挙げることができ、より好ましいものとしてタバコ（ニコチアナ タバカム、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）が挙げられる。
【００３４】
３．２． 形質転換植物細胞の作製
本発明の形質転換植物を得るには、前記組換えベクターを、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などの公知慣用の手法で植物細胞に導入し、必要に応じて導入が確認されたもののみを選抜、増殖させればよい。
なお、本発明における「植物細胞」とは、脱分化した状態の植物細胞、植物体を形成している状態の細胞、及び植物体そのものを含有するものとする。
【００３５】
３．３． 形質転換植物体の作製
前述のようにして得られた脱分化状態の形質転換植物細胞を例えば、再分化誘導剤を含む培地でインキュベートすれば、形質転換植物体を再生することができる。再分化誘導剤としては公知慣用のものを用いることができ、例えば、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類、およびゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン等のサイトカイニン類、ジベレリン酸等のジベレリン類等が挙げられ、これらの中からいずれか一種類、あるいは二種類以上を併用してもよい。
【００３６】
４． ロジン代替物の製造方法
発明の製造方法における、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の形質転換植物からの回収方法としては特に制限はないが、例えば植物体の場合、地上部分を切断し、裁断するなり磨り潰すなりして液状物質を搾り出すなどして回収してもよいし、水／有機溶媒を使った抽出などによって回収してもよい。これら回収した液から適宜精製工程、乾燥工程などを経て最終的にロジン代替物を得ることができる。また、脱分化状態の細胞の場合、ろ過や遠心分離などで細胞を集めた後、前記同様の方法にてロジン代替物を得ることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例の記載になんら限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳの構築
【００３９】
＜ベクター構築：ｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ＞
プラスチド移行シグナルを含まないＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）のｃＤＮＡ（配列番号２）を鋳型として、配列番号４及び５に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、ＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、翻訳エンハンサーであるタバコアルコール脱水素酵素遺伝子の５’非翻訳領域（ＮｔＡＤＨ）と、ＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片（ｔ−ＬＡＳ）と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）と、転写終結領域であるＨＳＰターミネーター（ＨＳＰ−Ｔ）を、カナマイシン耐性遺伝子を含むバイナリーベクターｐＲＩ９１０に挿入し、ｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ（図１）を構築した。
【００４０】
（実施例２）組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０の構築
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ＞
形質転換体の視覚的選抜を行う為に、３５Ｓ−Ｐ、蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ９１０に挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰを構築した。
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０＞
Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ由来のチトクロームＰ４５０のｃＤＮＡ（配列番号３）を鋳型として、配列番号６及び７に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、Ｐ４５０挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、Ｐ４５０遺伝子（Ｐ４５０）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０（図２）を構築した。
【００４１】
（実施例３）組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０の構築
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０＞
プラスチド移行シグナルを含むＰａＴＰＳ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）のｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、配列番号８及び５に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、ＰａＴＰＳ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、ＰａＴＰＳ−ＬＡＳ遺伝子（ＬＡＳ）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳを構築した。
また、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、Ｐ４５０、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０（図３）を構築した。
【００４２】
（実施例４）感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）の作製
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５を、エレクトロポレーション法を用いて実施例１で構築した組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳで形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムを、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ液体培地で暗黒、２５℃、１４０ｒｐｍの条件下、１２時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（５５００ｒｐｍ、１５分）により集菌、濃縮して回収し、感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を得た。
【００４３】
（実施例５）感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）の作製
実施例４で使用した実施例１の組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳを、実施例２で構築した組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０に換えた以外は実施例４と同様にして、感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）を得た。
【００４４】
（実施例６）感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）の作製
実施例４で使用した実施例１の組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳを、実施例３で構築した組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０に換えた以外は実施例４と同様にして、感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を得た。
【００４５】
（実施例７）ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコの作製
形質転換タバコの作製はＲｏｇｅｒｓらの方法（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ： ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔ ｕｓｉｎｇ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｌ，１１８， ６２７−６４０．１９８６）により行った。無菌タバコ（ニコチアナ タバカム、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ． Ｐｅｔｉｔ ｈａｂａｎａ ＳＲ１）の葉部を、葉脈を含まないように１×１ｃｍ程度の大きさに切り取り、滅菌水が入ったシャーレに葉の裏面が上になるように置き、実施例４で作製した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）をシャーレに注いで３分から５分間浸した。葉片を取り出し、余分な菌液を滅菌ペーパータオルで拭き取り、カルス形成培地に置床して２５℃で培養した。２‐３日後、アグロバクテリウムが培地上で見ることができるようになったら、葉片を５０ｍｌチューブに移し、滅菌水で５回洗浄した後、カルス形成培地（２ｍｇ／L ニコチン酸アミド、０．２ｍｇ／L ６−ベンジルアミノプリン、３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したしたＭＳ培地）に置床し、１‐２週間２５℃で培養した。葉片が最初に比べて丸まり、表面に凹凸が生じたら、シュート形成培地（０．０２ｍｇ／L ニコチン酸アミド、１ｍｇ／L ６−ベンジルアミノプリン、３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したＭＳ培地）に移した。さらに４‐６週間後、茎葉部の発達したシュートを切り取ってルート形成培地（３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したＭＳ培地）に移し、発根が見られるまで２５℃で培養した。植物体がある程度の大きさに成長したものを鉢植えにすることで、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを得た。
【００４６】
（実施例８）Ｐ４５０導入形質転換タバコの作製
実施例７で使用した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を、実施例５で作製した感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）に換えた以外は実施例と同様にして、Ｐ４５０導入形質転換タバコを得た。
【００４７】
（実施例９）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコの作製
実施例７で使用した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を、実施例６で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）に換えた以外は実施例と同様にして、ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコを得た。
【００４８】
（実施例１０）ｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例４で作製した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ)を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ニコチン酸アミド、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）に置床し、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で培養した。培養４週間後に同じ組成の再分化培地ＰｓＣＳＣＫに継代して引き続き再分化するまで培養を続けた。
【００４９】
再分化個体をシュート伸長培地ＰｓＳＬＣＫ（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したホルモンフリーのＭＳ培地）に移して、カナマイシン耐性を検定した。非形質転換体は伸長せず一週間ほどで枯死するのに対し、ポリヌクレオチドが導入されたと考えられる形質転換体は耐性を示し、カナマイシン非存在下での野生株と同等の生育を示した。形質転換体が大きくなったところで新たな培地に移植し、成熟した完全なｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカ植物体が得られた。再分化から植物体を得るまでに要した期間は僅か２ヶ月程度であった。
【００５０】
（実施例１１）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例5で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ）を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ニコチン酸アミド、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）に置床し、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で培養した。培養４週間後、同じ組成の再分化培地ＰｓＣＳＣＫに、ＥＧＦＰ蛍光の見える部分だけを切り出して継代して、引き続き再分化するまで培養を続けた。
【００５１】
再分化個体をシュート伸長培地ＰｓＳＬＣＫ（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したホルモンフリーのＭＳ培地）に移して、カナマイシン耐性を検定した。非形質転換体は伸長せず一週間ほどで枯死するのに対し、ポリヌクレオチドが導入されたと考えられる形質転換体は耐性を示し、カナマイシン非存在下での野生株と同等の生育を示した。形質転換体が大きくなったところで新たな培地に移植し、成熟した完全なＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカ植物体が得られた。再分化から植物体を得るまでに要した期間は僅か２ヶ月程度であった。
【００５２】
（実施例１２）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例６で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ)を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ＮＡＡ、３μＭ ＢＡＰ、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）上で、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で２週間培養したペリプロカ セピウムのカルスを、ゲルライトを除いた液体培地（２０ｇ／Ｌ スクロース、１μＭ ＮＡＡ、１μＭ ２，４−Ｄ、２．４ｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）３０ｍLに対して３個以上加え、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日、暗期８時間、振盪回数１１０ｒｐｍの条件下で振盪培養を行ない、ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを得た。
【００５３】
（参考例１） アビエチン酸標品の分析
アビエチン酸の標品として、アビエチン酸（東京化成工業株式会社製）をピリジンに溶解させて、ジーエルサイエンス社製シリル化剤ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いてＴＭＳ（トリメチルシリル）化処理を行ったうえで、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣカラムとしては、アジレント・テクノロジー株式会社製ＤＢ−５ＭＳ(０．２５ｍｍφ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）のキャピラリーカラムを用い、８０℃，４分Ｈｏｌｄ−８℃／分−３２０℃の昇温条件でアビエチン酸の分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図４に示した。以降の実施例で示した植物中のアビエチン酸の定性分析に関しては、ここで得られたGC−MSチャートを指標にＴＩＣ（Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ）法もしくはＳＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法にてアビエチン酸の定性を行った。
【００５４】
（実施例１３） ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例７で得られたｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコから、アビエチン酸を抽出・回収し、分析を行った。ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコの一部約０．５ｇに蒸留水１５ｍＬを加え、すり鉢を用いて十分に磨り潰し、ジエチルエーテル５０ｍＬを加えて二相分配法により抽出を行った。ジエチルエーテル相を回収し、ジーエルサイエンス社製グラファイトカーボンパウダーを通過させて緑色素を除去した後、エバポレーターでエーテルを留去し、ピリジンに溶解させて抽出回収液を得た。この抽出回収液をジーエルサイエンス社製シリル化剤ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いてＴＭＳ（トリメチルシリル）化処理を行ったうえで、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣカラムとしては、アジレント・テクノロジー株式会社製ＤＢ−５ＭＳ(０．２５ｍｍφ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）のキャピラリーカラムを用い、８０℃，４分Ｈｏｌｄ−８℃／分−３２０℃の昇温条件でアビエチン酸の分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図５に示した。
【００５５】
（実施例１４） Ｐ４５０形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに実施例８で得られたＰ４５０導入形質転換タバコを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図６に示した。
【００５６】
（実施例１５） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例９で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図７に示した。
【００５７】
（実施例１６） ｔ−ＬＡＳ形質転換ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例１０で得られたｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図８に示した。
【００５８】
（実施例１７） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１６において、形質転換タバコを用いる替わりに実施例１１で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図９に示した。
【００５９】
（実施例１８） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１６において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例１２で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図１０に示した。
【００６０】
（比較例１） 野生型タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型タバコを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６１】
（比較例２） 野生型ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型ペリプロカを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６２】
（比較例３） 野生型ペリプロカのサスペンジョンカルチャーからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６３】
結果は図に示すとおり、比較例では見られなかったアビエチン酸のＧＣ−ＭＳのピークが実施例では見られることから、形質転換することによりアビエチン酸が新たに生産されたことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の製造において有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は形質転換植物を用いたロジン代替物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロジンは、馬尾松をはじめとするマツ科植物から得られる樹脂油のうち、精油などの揮発性物質を留去した後の残留樹脂であり、紙サイズ剤、印刷インキ、塗料、接着剤、滑り止め剤、はんだ用フラックス、医薬、香料などの用途に幅広く利用されている。また近年、環境保護の観点から再生可能な資源が注目されており、天然資源から繰り返し採取可能なロジンはグリーンサステイナブルな樹脂として重要度が増している。
【０００３】
採取法から分類したロジンの種類としては、ガムロジン、トールロジン、ウッドロジンがあるが、世界のロジン生産高の大半を占めるアジアにおいてはガムロジンが主である。ガムロジンの製造法は、マツの幹に傷を付け、にじみ出てくる樹液を回収、そこから精製するという方法であり、機械化が難しい作業であるため非常に手間のかかる方法である（非特許文献１）。また、マツを植栽してから樹液を回収できるようになるまでにはおよそ１５年を要することから、災害や病害虫などの被害により一旦マツが死滅してしまうと、再びロジンを採取できるようになるまでには非常に時間がかかってしまう。それ故、安定的な生産には高い計画性が要求される手法でもある。こうしたことから、従来の手法に代わる効率的なロジン製造法開発が望まれていた。
【０００４】
ところで、ロジン構成成分である樹脂酸のうち主成分はテルペノイド系化合物のうち、ジテルペン系樹脂酸といわれる化合物であり、アビエチン酸、レボピマール酸、ネオアビエチン酸、パルストリック酸、イソピマール酸、サンダラコピマール酸、ピマール酸、ジハイドロアビエチン酸、アガチック酸、イソコプレシック酸、コムニック酸などが挙げられ、なかでもアビエチン酸がロジン構成成分中でもっとも含有量が多い。これらジテルペン系樹脂酸はロジン代替物としてそのまま利用できることから、ジテルペン系樹脂酸、特にアビエチン酸を効率的に製造することができればそのままロジン代替物の効率的製造法に繋がるものと考えられる。
【０００５】
従来、遺伝子組換え技術を利用し、マツ科植物からの採集以外の方法でアビエチン酸あるいはアビエチン酸の前駆体であるアビエタジエンを生産しようとした試みとしては非特許文献２がある。しかし、該手法は遺伝子組換え宿主として酵母を用いており、大量生産に際しては大規模な設備投資が必要になるなど不利な点があった。また現在に至るまで、マツのような樹木よりも回収が容易且つ生長が速く短期間で収穫可能な植物の遺伝子組換えでジテルペン系樹脂酸あるいはジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの生産に成功した例は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ （２００８） Ｖｏｌ．５４， Ｐ．６５６−６６９
【非特許文献２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００６） Ｖｏｌ．６７， Ｐ．２４１５−２４２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、マツのような樹木から採取するよりも比較的容易且つ短期間でロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を取得できるよう、ジテルペン系樹脂酸を効率的に製造する方法、及びそれに用いる形質転換植物細胞、及び形質転換植物体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、成長の比較的早い植物の形質転換細胞及び植物体を用いてジテルペン系樹脂酸を人為的に生産させることにより、ロジン代替物としてのジテルペン系樹脂酸を比較的容易な回収手段で且つ短期間で安定的に製造できることを見出し、本発明を完成することに至った。
【０００９】
本発明では、
ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれか又は両方を導入してなる形質転換植物細胞及び植物体を提供することにより、前記課題を解決する。
【００１０】
本発明の構成は以下の通りである。
１．植物形質転換用ベクターに、ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を連結したことを特徴とする組換えベクター。
２．前記組換えベクターを導入したアグロバクテリウム。
３．前記アグロバクテリウムにより、ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を導入した形質転換植物細胞、及びその形質転換植物細胞からなる形質転換植物体。
５．前記形質転換細胞又は形質転換植物体からジテルペン系樹脂酸を回収することによるロジン代替物の製造方法。
【００１１】
すなわち本発明を利用することで、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドの片方又は両方を導入し、なおかつ生体内で発現させることによりジテルペン系樹脂酸を生産することができる形質転換植物細胞、及びその形質転換植物細胞からなる形質転換植物体（以下、合わせて形質転換植物と記すことがある）を得ることができる。 本発明において、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、ジテルペンをロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸に変換する活性を有するポリペプチドは、どちらか一方が宿主細胞内に導入されていれば良いが、両方同時に導入されているほうが好ましい。
【００１２】
生産されたジテルペン系樹脂酸を形質転換植物から回収することにより、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を効率的に生産することができる。マツと比較して生育の早い一年草などの植物を形質転換することにより、天災や病害虫の被害からの復興も容易であり、また形質転換植物の耕作面積を大きくするだけでロジン代替物の生産量を増やすことができることから、安定的且つ計画的なロジン代替物の製造が可能となる。この場合形質転換植物は、形質転換された第1世代は勿論、第１世代を継代して得られた第2世代以降の植物体を用いても良い。
更には、本発明を応用することにより、形質転換植物中で他の有用物質との同時生産も可能である。例えば、ゴム産生植物中でゴムとロジン代替物を同時に生産させたり、パームヤシ中でパーム油とロジン代替物を同時に生産させるなども可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ジテルペン系樹脂酸産生形質転換植物及びそれを用いた効率的なジテルペン系樹脂酸の製造方法が提供でき、これは比較的容易な回収作業で且つ短期間にロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸を製造する方法に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（実施例１）で構築したベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ
【図２】（実施例２）で構築したベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０
【図３】（実施例３）で構築したベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０
【図４】（参考例１）アビエチン酸標品のＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図５】（実施例１３）ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図６】（実施例１４）Ｐ４５０形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図７】（実施例１５）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換タバコ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図８】（実施例１６）ｔ−ＬＡＳ形質転換ペリプロカ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図９】（実施例１７）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカ抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【図１０】（実施例１８）ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカサスペンジョンカルチャー抽出物のアビエチン酸ＧＣ−ＭＳチャート（上図：ガスクロマトグラフ、下図：マススペクトル）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「Ｍ」は「ｍｏｌ／Ｌ」を、単位「ｍＭ」は「ｍｍｏｌ／Ｌ」を、単位「μＭ」は「μｍｏｌ／Ｌ」をそれぞれ示す。
【００１６】
１．組換えベクター
１．１．ベクター
本発明の組換えベクターを作製する際に用いるベクターとしては、本発明の効果を損なわない限り、遺伝子導入用のベクターを用いることができる。宿主に植物を用いる場合には、通常植物形質転換に用いられるベクターを用いることができ、例えば、Ｔｉプラスミドやバイナリーベクター（ミニＴｉプラスミド）など各種ベクターを使用可能であるが、カナマイシン耐性等の抗生物質耐性の選択マーカーを有していることが好ましく、例えば、ｐＲＩ９１０やｐＢＩＮ１９などのバイナリーベクターがより好ましいものとして挙げられる。
【００１７】
１．２． 導入ポリヌクレオチド
１．２．１． ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸は、イソペンテニルジフォスフェートからゲラニルゲラニルジフォスフェートを経由して生合成される。ジテルペン系樹脂酸の合成を活性化するには、ジテルペン系樹脂酸生合成経路に寄与する生体触媒であるポリペプチドの合成を促進すればよく、ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入すればよい。ジテルペン系樹脂酸の前駆体であるジテルペンとしては、アビエタジエン、レボピマラジエン、ネオアビエタジエン、パルストラジエン、イソピマラジエン、サンダラコピマラジエン、ピマラジエン、ジハイドロアビエタジエン、アガタジエン、イソコプレジエン、コムナジエンが挙げられ、ジテルペンの合成活性を有するポリペプチドとしては、アビエタジエンシンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、ネオアビエタジエンシンターゼ、パルストラジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、サンダラコピマラジエンシンターゼ、ピマラジエンシンターゼ、ジハイドロアビエタジエンシンターゼ、アガタジエンシンターゼ、イソコプレジエンシンターゼ、コムナジエンシンターゼなどが挙げられ、特にアビエタジエン合成活性を有するアビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
【００１８】
１．２．1.．１． アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アビエタジエンの合成を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば良く、トウヒやアカマツ、クロマツ、テーダマツなどのマツ科植物や、イチョウなど由来のレボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドやアビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられ、より好ましいものとして、ヨーロッパトウヒ（ピセア アビエス、Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
この様なアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては例えば、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドがプラスチドで発現することを規定するシグナル（プラスチド移行シグナルとも称する）が前半部分にコードされているＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）である（Ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド、（Ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｃ）配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２０】
また、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドであってプラスチド移行シグナルがコードされていないＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）である（Ｄ）配列番号２で表されるポリヌクレオチド、（Ｅ）配列番号２のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｆ）配列番号２のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２１】
１．２．２． ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
宿主内で合成されたジテルペンは、そのまま宿主内の酸化還元酵素の作用によって自然にジテルペン酸へと変換させても良いが、ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドを宿主内で過多発現させることにより、ジテルペンを宿主内でジテルペン系樹脂酸へ効率よく変換させることによって、ロジン代替物を宿主内で安定的に生合成させることもできる。
ジテルペンからジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドとしては、ジテルペンをジテルペン系樹脂酸へと酸化する活性があればよく、EC第１群に分類される各種酸化還元酵素を用いることができる。酸化還元酵素としては、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、カタラーゼなどが挙げられ、中でもオキシゲナーゼの一種であるＰ４５０が好ましい。また、ジテルペンの種類により、アビエタジエンオキシダーゼ、レボピマラジエンオキシダーゼ、ネオアビエタジエンオキシダーゼ、パルストラジエンオキシダーゼ、イソピマラジエンオキシダーゼ、サンダラコピマラジエンオキシダーゼ、ピマラジエンオキシダーゼ、ジハイドロアビエタジエンオキシダーゼ、アガタジエンオキシダーゼ、イソコプレジエンオキシダーゼ、コムナジエンオキシダーゼが好ましい。
【００２２】
１．２．２．１． アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
アビエタジエンからロジン代替物であるアビエチン酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アビエタジエンからロジン代替物であるアビエチン酸に変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであれば良く、例えばマツ科植物由来のP４５０遺伝子などが挙げられ、より好ましいものとしてテーダマツ（パイナス テーダ、Ｐｉｎａｓ ｔｅａｄａ）由来のP４５０遺伝子が挙げられる。
【００２３】
この様なアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては例えば、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ由来のチトクロームＰ４５０のｃＤＮＡである（Ｇ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド、（Ｈ）配列番号３のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、もしくは挿入されており、且つ、アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は（Ｉ）配列番号３のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ただし、ここで「数個」とは、置換、欠失、もしくは挿入されるヌクレオチドの配列や位置によっても異なるが、具体的には２から１００個、好ましくは２から５０個、より好ましくは２から９個であり、例えばイントロンの挿入なども想定される。また、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件としては、相同性が高いポリヌクレオチド同士、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、具体的には、４０℃、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０）、０．１％ ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。
【００２４】
１．３． 組換えベクターの調製
本発明の組換えベクターは、ベクターに前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを片方又は両方を連結することによって調製できる。
これらのポリヌクレオチドは、そのままベクターに連結しても良いが、それぞれの活性を示す範囲内で、前記塩基の欠失、置換、もしくは付加を行っても良い。
【００２５】
さらに、前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を促進する目的で、例えばエンハンサーなどの塩基配列を付加してもよい。このようなエンハンサーは、例えば翻訳エンハンサーであるタバコアルコール脱水素酵素遺伝子の５’非翻訳領域（ＮｔＡＤＨ）などが挙げられる。
【００２６】
さらに、前記ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端の少なくとも一方に、形質転換した際に宿主内で、例えば、プロモーターやターミネーター等の塩基配列を付加してもよい。このようなプロモーターやターミネーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターやＨＳＰターミネーターなどが挙げられる。
【００２７】
また、形質転換細胞の選抜の目安となる機能を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクターに連結しても良い。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、選抜マーカーとして用いることができる機能を有すればよく、各種薬剤耐性遺伝子、栄養要求株におけるその補足の遺伝子、ＵＶ耐性遺伝子、温度耐性遺伝子、高塩濃度耐性遺伝子、蛍光タンパク遺伝子などが挙げられる。
これら選抜マーカーは、宿主となる細胞の性質に合わせて選択すればよく、中でも蛍光タンパク遺伝子や薬剤耐性遺伝子を用いた場合、形質転換細胞を簡便に選択できるため、好ましい。蛍光タンパク遺伝子としてはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられ、例えばＥＧＦＰやｓＧＦＰなどを用いることができる。また、薬剤耐性遺伝子としてはカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２８】
２． 組換えベクターの導入方法
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、公知慣用の手法で形質転換を行えばよく、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、コンピテントセル法、などが挙げられ、宿主に植物を用いる場合には形質転換効率の観点からアグロバクテリウム法が好ましい。
【００２９】
２．１． アグロバクテリウム
前記ジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをアグロバクテリウム法により植物細胞へ導入する場合、まず、前記組換えベクターをエレクトロポレーション法等によってアグロバクテリウムに導入する。本発明に用いるアグロバクテリウムの種類は特に制限されず、例えば、ＥＨＡ１０５やＬＢＡ４４０４などが使用できる。
前記組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを、例えば、カナマイシン等の抗生物質を含む培地で培養すれば、導入されたベクター内の抗生物質耐性遺伝子発現により生育してきたを形質転換した感染用アグロバクテリウムとして選択的に得ることができる。
【００３０】
３． ロジン代替物産生に用いる宿主
ロジン代替物産生に用いる宿主としては、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の生合成経路を持つ細胞又は細胞から形成される個体であれば良い。また、宿主としたい細胞がジテルペン系樹脂酸の生合成経路を持たない場合には、遺伝子組換えなどの手段によりジテルペン系化合物の生合成経路を後から獲得した細胞を作成し、宿主として用いても良い。宿主としては動物、植物、微生物などのどれを用いても良いが、予めジテルペン系樹脂酸の生合成経路を獲得している植物を宿主とするのが好ましい。
【００３１】
３．１． ロジン代替物産生に用いる植物
本発明でロジン代替物産生に用いる植物としては、栽培しやすく、成長速度が速く、産生したロジン代替物の回収が容易であり、導入されたジテルペン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びジテルペンからロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現するものであれば、特に種類は限定しない。その中でも、特に栽培しやすく成長速度が速く、樹液の圧搾等によりロジン代替物の回収が容易である植物として、ペリプロカ属及びタバコ属の植物が好ましい。
【００３２】
３．１．１． ペリプロカ属
前記ペリプロカ属の植物としては、例えばペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）、ペリプロカ カロフィラ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ）、ペリプロカ フロリブンダ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）、ペリプロカ フォレスティ（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｆｏｒｒｅｓｔｉｉ）などを挙げることができ、より好ましいものとしてペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）が挙げられる。
【００３３】
３．１．２． タバコ属
前記タバコ属の植物としては、例えばタバコ、ハナタバコ、マルバタバコ、キダチタバコ、ジャスミンタバコなどを挙げることができ、より好ましいものとしてタバコ（ニコチアナ タバカム、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）が挙げられる。
【００３４】
３．２． 形質転換植物細胞の作製
本発明の形質転換植物を得るには、前記組換えベクターを、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などの公知慣用の手法で植物細胞に導入し、必要に応じて導入が確認されたもののみを選抜、増殖させればよい。
なお、本発明における「植物細胞」とは、脱分化した状態の植物細胞、植物体を形成している状態の細胞、及び植物体そのものを含有するものとする。
【００３５】
３．３． 形質転換植物体の作製
前述のようにして得られた脱分化状態の形質転換植物細胞を例えば、再分化誘導剤を含む培地でインキュベートすれば、形質転換植物体を再生することができる。再分化誘導剤としては公知慣用のものを用いることができ、例えば、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類、およびゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン等のサイトカイニン類、ジベレリン酸等のジベレリン類等が挙げられ、これらの中からいずれか一種類、あるいは二種類以上を併用してもよい。
【００３６】
４． ロジン代替物の製造方法
発明の製造方法における、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の形質転換植物からの回収方法としては特に制限はないが、例えば植物体の場合、地上部分を切断し、裁断するなり磨り潰すなりして液状物質を搾り出すなどして回収してもよいし、水／有機溶媒を使った抽出などによって回収してもよい。これら回収した液から適宜精製工程、乾燥工程などを経て最終的にロジン代替物を得ることができる。また、脱分化状態の細胞の場合、ろ過や遠心分離などで細胞を集めた後、前記同様の方法にてロジン代替物を得ることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例の記載になんら限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳの構築
【００３９】
＜ベクター構築：ｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ＞
プラスチド移行シグナルを含まないＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）のｃＤＮＡ（配列番号２）を鋳型として、配列番号４及び５に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、ＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、翻訳エンハンサーであるタバコアルコール脱水素酵素遺伝子の５’非翻訳領域（ＮｔＡＤＨ）と、ＰａＴＰＳ−ｔ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片（ｔ−ＬＡＳ）と、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）と、転写終結領域であるＨＳＰターミネーター（ＨＳＰ−Ｔ）を、カナマイシン耐性遺伝子を含むバイナリーベクターｐＲＩ９１０に挿入し、ｐＲＩ ｔ−ＬＡＳ（図１）を構築した。
【００４０】
（実施例２）組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０の構築
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ＞
形質転換体の視覚的選抜を行う為に、３５Ｓ−Ｐ、蛍光タンパク質遺伝子（ＥＧＦＰ）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ９１０に挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰを構築した。
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０＞
Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ由来のチトクロームＰ４５０のｃＤＮＡ（配列番号３）を鋳型として、配列番号６及び７に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、Ｐ４５０挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、Ｐ４５０遺伝子（Ｐ４５０）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０（図２）を構築した。
【００４１】
（実施例３）組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０の構築
＜ベクター構築：ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０＞
プラスチド移行シグナルを含むＰａＴＰＳ−ＬＡＳ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ由来レボピマラジエン／アビエタジエンシンターゼ）のｃＤＮＡ（配列番号１）を鋳型として、配列番号８及び５に示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法により５’側にＸｈｏＩ、３’側にＫｐｎＩ制限酵素サイトを導入し、ＰａＴＰＳ−ＬＡＳ挿入用ＤＮＡ断片を作製した。そして、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、ＰａＴＰＳ−ＬＡＳ遺伝子（ＬＡＳ）、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳを構築した。
また、３５Ｓ−Ｐ、ＮｔＡＤＨ、Ｐ４５０、ＨＳＰ−Ｔからなる発現カセットをバイナリーベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳに挿入し、ｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０（図３）を構築した。
【００４２】
（実施例４）感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）の作製
アグロバクテリウムＥＨＡ１０５を、エレクトロポレーション法を用いて実施例１で構築した組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳで形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムを、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ液体培地で暗黒、２５℃、１４０ｒｐｍの条件下、１２時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（５５００ｒｐｍ、１５分）により集菌、濃縮して回収し、感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を得た。
【００４３】
（実施例５）感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）の作製
実施例４で使用した実施例１の組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳを、実施例２で構築した組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／Ｐ４５０に換えた以外は実施例４と同様にして、感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）を得た。
【００４４】
（実施例６）感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）の作製
実施例４で使用した実施例１の組換えベクターｐＲＩ ｔ−ＬＡＳを、実施例３で構築した組換えベクターｐＲＩ ＥＧＦＰ／ＬＡＳ／Ｐ４５０に換えた以外は実施例４と同様にして、感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を得た。
【００４５】
（実施例７）ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコの作製
形質転換タバコの作製はＲｏｇｅｒｓらの方法（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ： ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔ ｕｓｉｎｇ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｌ，１１８， ６２７−６４０．１９８６）により行った。無菌タバコ（ニコチアナ タバカム、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．ｃｖ． Ｐｅｔｉｔ ｈａｂａｎａ ＳＲ１）の葉部を、葉脈を含まないように１×１ｃｍ程度の大きさに切り取り、滅菌水が入ったシャーレに葉の裏面が上になるように置き、実施例４で作製した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）をシャーレに注いで３分から５分間浸した。葉片を取り出し、余分な菌液を滅菌ペーパータオルで拭き取り、カルス形成培地に置床して２５℃で培養した。２‐３日後、アグロバクテリウムが培地上で見ることができるようになったら、葉片を５０ｍｌチューブに移し、滅菌水で５回洗浄した後、カルス形成培地（２ｍｇ／L ニコチン酸アミド、０．２ｍｇ／L ６−ベンジルアミノプリン、３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したしたＭＳ培地）に置床し、１‐２週間２５℃で培養した。葉片が最初に比べて丸まり、表面に凹凸が生じたら、シュート形成培地（０．０２ｍｇ／L ニコチン酸アミド、１ｍｇ／L ６−ベンジルアミノプリン、３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したＭＳ培地）に移した。さらに４‐６週間後、茎葉部の発達したシュートを切り取ってルート形成培地（３ｇ／L ゲランガム、１００ｍｇ／L カナマイシン、２５０ｍｇ／L カルベニシリン、ｐH５．８となるように添加したＭＳ培地）に移し、発根が見られるまで２５℃で培養した。植物体がある程度の大きさに成長したものを鉢植えにすることで、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを得た。
【００４６】
（実施例８）Ｐ４５０導入形質転換タバコの作製
実施例７で使用した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を、実施例５で作製した感染用アグロバクテリウム（Ｐ４５０）に換えた以外は実施例と同様にして、Ｐ４５０導入形質転換タバコを得た。
【００４７】
（実施例９）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコの作製
実施例７で使用した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を、実施例６で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）に換えた以外は実施例と同様にして、ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコを得た。
【００４８】
（実施例１０）ｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例４で作製した感染用アグロバクテリウム（ｔ−ＬＡＳ）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ)を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ニコチン酸アミド、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）に置床し、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で培養した。培養４週間後に同じ組成の再分化培地ＰｓＣＳＣＫに継代して引き続き再分化するまで培養を続けた。
【００４９】
再分化個体をシュート伸長培地ＰｓＳＬＣＫ（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したホルモンフリーのＭＳ培地）に移して、カナマイシン耐性を検定した。非形質転換体は伸長せず一週間ほどで枯死するのに対し、ポリヌクレオチドが導入されたと考えられる形質転換体は耐性を示し、カナマイシン非存在下での野生株と同等の生育を示した。形質転換体が大きくなったところで新たな培地に移植し、成熟した完全なｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカ植物体が得られた。再分化から植物体を得るまでに要した期間は僅か２ヶ月程度であった。
【００５０】
（実施例１１）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例5で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ）を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ニコチン酸アミド、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）に置床し、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で培養した。培養４週間後、同じ組成の再分化培地ＰｓＣＳＣＫに、ＥＧＦＰ蛍光の見える部分だけを切り出して継代して、引き続き再分化するまで培養を続けた。
【００５１】
再分化個体をシュート伸長培地ＰｓＳＬＣＫ（５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したホルモンフリーのＭＳ培地）に移して、カナマイシン耐性を検定した。非形質転換体は伸長せず一週間ほどで枯死するのに対し、ポリヌクレオチドが導入されたと考えられる形質転換体は耐性を示し、カナマイシン非存在下での野生株と同等の生育を示した。形質転換体が大きくなったところで新たな培地に移植し、成熟した完全なＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカ植物体が得られた。再分化から植物体を得るまでに要した期間は僅か２ヶ月程度であった。
【００５２】
（実施例１２）ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーの作製
ペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）のシュートの節間を１ｃｍごとに切断したものを外植体とて準備した。外植体を、実施例６で作製した感染用アグロバクテリウム（ＬＡＳ／Ｐ４５０）を含む液体感染培地ＰｓＣｏ−７（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ α−ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、３μＭ ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、２０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴン、ｐＨ５．８となるように添加したムラシゲスクーグ（ＭＳ）培地）に入れ、手で振盪しながら２分間浸漬した。浸漬後、外植体を滅菌した濾紙上で水分を除去し、液体感染培地と同じ培地組成にゲルライト（和光純薬工業、２．４ｇ／Ｌ)を添加した固体共培養培地ＰｓＣｏ−７に置床し、２５℃暗黒下で３日間共存培養した。３日後、カルベニシリン(５００ｍｇ／Ｌ)を添加した滅菌水で該外植体を３回水洗し、アグロバクテリウムを除去した。濾紙上で余分な水分を除去した後、選抜再分化培地ＰｓＣＳＣＫ（２０ｇ／Ｌ スクロース、０．１μＭ ＮＡＡ、３μＭ ＢＡＰ、２．４ｇ／Ｌ ゲルライト、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）上で、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日の照明下で２週間培養したペリプロカ セピウムのカルスを、ゲルライトを除いた液体培地（２０ｇ／Ｌ スクロース、１μＭ ＮＡＡ、１μＭ ２，４−Ｄ、２．４ｇ／Ｌ カナマイシン、２５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリン、ｐＨ５．８となるように添加したＭＳ培地）３０ｍLに対して３個以上加え、２５℃、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）５０μｍｏｌｍ−２ｓ−１、明期１６時間／日、暗期８時間、振盪回数１１０ｒｐｍの条件下で振盪培養を行ない、ＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを得た。
【００５３】
（参考例１） アビエチン酸標品の分析
アビエチン酸の標品として、アビエチン酸（東京化成工業株式会社製）をピリジンに溶解させて、ジーエルサイエンス社製シリル化剤ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いてＴＭＳ（トリメチルシリル）化処理を行ったうえで、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣカラムとしては、アジレント・テクノロジー株式会社製ＤＢ−５ＭＳ(０．２５ｍｍφ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）のキャピラリーカラムを用い、８０℃，４分Ｈｏｌｄ−８℃／分−３２０℃の昇温条件でアビエチン酸の分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図４に示した。以降の実施例で示した植物中のアビエチン酸の定性分析に関しては、ここで得られたGC−MSチャートを指標にＴＩＣ（Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ）法もしくはＳＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）法にてアビエチン酸の定性を行った。
【００５４】
（実施例１３） ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例７で得られたｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコから、アビエチン酸を抽出・回収し、分析を行った。ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコの一部約０．５ｇに蒸留水１５ｍＬを加え、すり鉢を用いて十分に磨り潰し、ジエチルエーテル５０ｍＬを加えて二相分配法により抽出を行った。ジエチルエーテル相を回収し、ジーエルサイエンス社製グラファイトカーボンパウダーを通過させて緑色素を除去した後、エバポレーターでエーテルを留去し、ピリジンに溶解させて抽出回収液を得た。この抽出回収液をジーエルサイエンス社製シリル化剤ＢＳＴＦＡ（Ｎ，Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を用いてＴＭＳ（トリメチルシリル）化処理を行ったうえで、ＧＣ−ＭＳ（ＧＣカラムとしては、アジレント・テクノロジー株式会社製ＤＢ−５ＭＳ(０．２５ｍｍφ×３０ｍ、膜厚０．２５μｍ）のキャピラリーカラムを用い、８０℃，４分Ｈｏｌｄ−８℃／分−３２０℃の昇温条件でアビエチン酸の分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図５に示した。
【００５５】
（実施例１４） Ｐ４５０形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに実施例８で得られたＰ４５０導入形質転換タバコを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図６に示した。
【００５６】
（実施例１５） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例９で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換タバコを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図７に示した。
【００５７】
（実施例１６） ｔ−ＬＡＳ形質転換ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例１０で得られたｔ−ＬＡＳ導入形質転換ペリプロカを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図８に示した。
【００５８】
（実施例１７） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１６において、形質転換タバコを用いる替わりに実施例１１で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図９に示した。
【００５９】
（実施例１８） ＬＡＳ／Ｐ４５０形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１６において、ｔ−ＬＡＳ形質転換タバコを用いる替わりに実施例１２で得られたＬＡＳ／Ｐ４５０導入形質転換ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行った。得られたＧＣ−ＭＳチャートを図１０に示した。
【００６０】
（比較例１） 野生型タバコからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型タバコを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６１】
（比較例２） 野生型ペリプロカからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型ペリプロカを用いるほかは実施例１６と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６２】
（比較例３） 野生型ペリプロカのサスペンジョンカルチャーからのアビエチン酸の回収・分析
実施例１３において、ｔ−ＬＡＳ導入形質転換タバコを用いる替わりに野生型ペリプロカのサスペンジョンカルチャーを用いるほかは実施例１３と同様にして、アビエチン酸の回収及び分析を行ったところ、GC−ＭＳスペクトルにおいてアビエチン酸のピークは検出されなかった。
【００６３】
結果は図に示すとおり、比較例では見られなかったアビエチン酸のＧＣ−ＭＳのピークが実施例では見られることから、形質転換することによりアビエチン酸が新たに生産されたことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ロジン代替物であるジテルペン系樹脂酸の製造において有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換植物細胞。
【請求項２】
前記アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（Ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失若しくは挿入されており、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｃ）配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項３】
前記アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（D）配列番号２で表されるポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号２のポリヌクレオチドにおいて、２又は数個のヌクレオチドが置換、欠失若しくは挿入されており、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｆ）配列番号２のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４】
前記アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドコードをするポリヌクレオチドが、
（Ｇ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド、
（Ｈ）配列番号３のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、若しくは挿入されており、且つアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有する酸化酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｉ）配列番号３のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
である請求項１から３の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項５】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ピセア アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）から得られたものである請求項１から４の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項６】
アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、パイナス テーダ（Ｐｉｎｕｓ ｔｅａｄａ）から得られたものである請求項１から５の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項７】
前記形質転換植物細胞が、形質転換草本植物細胞又は形質転換木本植物細胞である請求項１から６の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項８】
前記草本植物がタバコ属の植物である請求項７に記載の形質転換草本植物細胞。
【請求項９】
前記タバコ属の植物がニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である請求項８に記載の形質転換草本植物細胞。
【請求項１０】
前記木本植物がペリプロカ属の植物である請求項９に記載の形質転換木本植物細胞。
【請求項１１】
前記ペリプロカ属の植物がペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）である請求項１０に記載の形質転換木本植物細胞。
【請求項１２】
前記ロジン代替物がアビエチン酸である請求項１から１１の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れかに記載の形質転換植物細胞を分化してなる形質転換植物体。
【請求項１４】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、組換えベクターに導入されたものである、請求項１から１２の何れかに記載の形質転換植物細胞を作出する方法及び請求項１３に記載の形質転換植物体を作出する方法。
【請求項１５】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、エンハンサーと結合している、請求項１４に記載の形質転換植物細胞を作出する方法及び形質転換植物体を作出する方法。
【請求項１６】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過多発現させることにより得られる請求項１から１５の何れかに記載の形質転換植物細胞又は形質転換植物体を用いてロジン代替物を産生した後、該ロジン代替物を採取するロジン代替物の製造方法。
【請求項１７】
ロジン代替物がアビエチン酸である、請求項１６記載のロジン代替物の製造方法。
【請求項１】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換植物細胞。
【請求項２】
前記アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（Ａ）配列番号１で表されるポリヌクレオチド、
（Ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失若しくは挿入されており、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｃ）配列番号１のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項３】
前記アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
（D）配列番号２で表されるポリヌクレオチド、
（Ｅ）配列番号２のポリヌクレオチドにおいて、２又は数個のヌクレオチドが置換、欠失若しくは挿入されており、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｆ）配列番号２のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである請求項１に記載の形質転換植物細胞。
【請求項４】
前記アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドコードをするポリヌクレオチドが、
（Ｇ）配列番号３で表されるポリヌクレオチド、
（Ｈ）配列番号３のポリヌクレオチドにおいて、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、若しくは挿入されており、且つアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有する酸化酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチド、又は
（Ｉ）配列番号３のポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
である請求項１から３の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項５】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ピセア アビエス（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）から得られたものである請求項１から４の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項６】
アビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、パイナス テーダ（Ｐｉｎｕｓ ｔｅａｄａ）から得られたものである請求項１から５の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項７】
前記形質転換植物細胞が、形質転換草本植物細胞又は形質転換木本植物細胞である請求項１から６の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項８】
前記草本植物がタバコ属の植物である請求項７に記載の形質転換草本植物細胞。
【請求項９】
前記タバコ属の植物がニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）である請求項８に記載の形質転換草本植物細胞。
【請求項１０】
前記木本植物がペリプロカ属の植物である請求項９に記載の形質転換木本植物細胞。
【請求項１１】
前記ペリプロカ属の植物がペリプロカ セピウム（Ｐｅｒｉｐｌｏｃａ ｓｅｐｉｕｍ）である請求項１０に記載の形質転換木本植物細胞。
【請求項１２】
前記ロジン代替物がアビエチン酸である請求項１から１１の何れかに記載の形質転換植物細胞。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れかに記載の形質転換植物細胞を分化してなる形質転換植物体。
【請求項１４】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、組換えベクターに導入されたものである、請求項１から１２の何れかに記載の形質転換植物細胞を作出する方法及び請求項１３に記載の形質転換植物体を作出する方法。
【請求項１５】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、エンハンサーと結合している、請求項１４に記載の形質転換植物細胞を作出する方法及び形質転換植物体を作出する方法。
【請求項１６】
アビエタジエン合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はアビエタジエンからロジン代替物への変換活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを過多発現させることにより得られる請求項１から１５の何れかに記載の形質転換植物細胞又は形質転換植物体を用いてロジン代替物を産生した後、該ロジン代替物を採取するロジン代替物の製造方法。
【請求項１７】
ロジン代替物がアビエチン酸である、請求項１６記載のロジン代替物の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−２３４６３１（Ｐ２０１１−２３４６３１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０６３４８（Ｐ２０１０−１０６３４８）
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（０００００２８８６）ＤＩＣ株式会社 (2,597)
【Ｆターム（参考）】
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