微生物およびＤ−乳酸の製造方法
【課題】 より経済的にＤ−乳酸を生産する。
【解決手段】 本発明の課題はピルビン酸の高生産性酵母にＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、高発現させることで、Ｄ−乳酸を高濃度蓄積させることによって解決される。ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した微生物を培養することでＤ−乳酸を得る。微生物としては、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence)などの酵母が好ましく用いられる。
【解決手段】 本発明の課題はピルビン酸の高生産性酵母にＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、高発現させることで、Ｄ−乳酸を高濃度蓄積させることによって解決される。ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した微生物を培養することでＤ−乳酸を得る。微生物としては、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence)などの酵母が好ましく用いられる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−乳酸の製造法に関するものである。Ｄ−乳酸は農薬中間体などの合成原料として使用され、需要が高まりつつある。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｄ−乳酸脱水素酵素を産生する微生物としては、ラクトバチラス属、ロイコノストック属、スタフィロコッカス属等に属する微生物が知られている〔マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０年）〕。
【０００３】特開平５−２１９９８７号公報には、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属またはオブサムバクテリウム属の微生物を用い、ＤＬ−ラクトニトリルからＤ−乳酸またはＬ−乳酸を製造する方法が開示されている。特開平５−２６０９６４号公報には、シュードモナス属に属する微生物を培養して得られた酵素を用い、Ｌ−２−クロロプロピオン酸、Ｄ−２−クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマー混合物からＤ−乳酸を製造する方法が開示されている。特開平７−３２７６９３号公報には、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属の微生物の培養液、菌体等をＤＬ−ラクトアミドに作用させ、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを製造する方法が開示されている。これらはいずれもグルコースから直接Ｄ−乳酸を製造する方法ではない。
【０００４】特表平７−５０８１６５号公報には、乳酸菌（ラクトバチルス属）由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を導入したサッカロミセス酵母が開示されているが、用いられているのはＬ−乳酸脱水素酵素であり、またこの酵母による乳酸の生産は培地中のグルコースの２５〜３０％に相当するにすぎず、生成効率は低い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、微生物によるＤ−乳酸の高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するために、本発明者らは更に生産性の高いＤ−乳酸の製造方法について鋭意研究を行った結果、ピルビン酸の高生産能を有する微生物に乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込むことにより、Ｄ−乳酸の蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明はピルビン酸高生産性能を有し、かつＤ−乳酸脱水素酵素の高発現能を持った微生物を培養して、培養液中にＤ−乳酸を蓄積せしめ、前記培養液よりＤ−乳酸を回収することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。
【０００７】すなわち本発明はピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素遺伝子を導入した微生物とその微生物を培養しＤ−乳酸を生産することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】ピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作用により、直接乳酸に還元される。この場合、Ｌ−乳酸脱水素酵素を用いればＬ−乳酸が、Ｄ−乳酸脱水素酵素を用いればＤ−乳酸がピルビン酸より直接生成する。
【０００９】本発明に使用する宿主微生物は、ピルビン酸を高生産（１０ｇ／Ｌ以上）する微生物であるならば特に制限はない。本発明では、ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物であれば良い。ここで、ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物とは、特開２０００−７８９９６号公報の実施例５に記載の方法で培養した際にピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積するものである。
【００１０】微生物としては、酵母が好ましく用いられ、特に、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属の酵母が好ましい。さらに好ましくは、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）またはトルロプシス・メタノロベッセンス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｍｅｔｈａｎａｌｖｅｓｃｅｎｃｅ）である。
【００１１】さらに宿主としてはピルビン酸を２０ｇ／Ｌ蓄積する微生物が好ましい。このような微生物としてはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) TR-2026株（FERM BP1425）、ACII33株（FERM BP1424）、X-15株（FERM BP1423）、X-68株（FERM BP1426）、AOA-8株（FERM BP1427）、トルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence) TR-2044株（FERM BP1428）などがあげられる。
【００１２】さらに宿主としてはピルビン酸を４０ｇ／Ｌ以上蓄積する微生物が好ましい。このような微生物としてはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) P95-21株（FERM P-10652）、P120-5a株（FERM P-16745)、B26株（FERM P-16744）などがあげられる。
【００１３】また、ピルビン酸の高生産能力があれば、他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があってもよく、ピルビン酸の高生産能力がある微生物はすべて本発明に含まれる。
【００１４】宿主に組み込むべきＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、Ｄ−乳酸脱水素酵素としての活性が保持されるならば特に制限はないが、酵母以外の生物主由来であるものが好ましく、さらに、乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が好ましい。乳酸菌のＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としてはラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)などの遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。
【００１５】Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。
【００１６】取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００１７】用いられる発現ベクターのタイプについては宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限はない。例えば酵母においては、酵母内在性の２μプラスミドの複製起点を持つＹＥｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点を持つＹＲｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びセントロメア配列を持つＹＣｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つＹＬｐ型ベクター、酵母中での複製起点を持たないＹＩｐ型ベクターなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持するためにはＹＩｐ型ベクターを用いることが好ましい。
【００１８】Ｄ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのプロモーターについては、宿主細胞においてＤ−乳酸脱水素酵素が発現され、Ｄ−乳酸が生成する限り特に制限はない。例えば酵母においてはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可能である。
【００１９】本発明における培養方法について説明する。ピルビン酸の高生産用培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地であるが、Ｄ−乳酸が生成する限り特に制限はない。
【００２０】宿主がＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を持つ場合、ピルビン酸からＬ−乳酸が生産されるため、Ｄ−乳酸のみを製造するためにＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を破壊することも可能である。
【００２１】炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１％〜４．０％、有機微量成分としてはビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００２２】これらの他にリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加される。さらにチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなどの要求ビタミン、又はこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００２３】培養は通常、好気的条件下で行うが、Ｄ−乳酸の生成に応じて適宜条件を変更することが可能である。培養中はＤ−乳酸の生成蓄積に応じて、培地のｐＨ低下が起こるので、炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリなどのアルカリでｐＨ３〜ｐＨ８に調節することが有効である。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化を図る。培養温度は１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３５℃が用いられる。
【００２４】これらの条件の下に２４〜１２０時間振とうまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。
【００２５】培養液中に生成したＤ−乳酸は、そのまま単離精製することなく利用することもできるし、菌体を遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用することもできる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００２７】実施例１（１）Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング宿主細胞の生産するピルビン酸からＤ−乳酸を産生させるために、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングを行った。
【００２８】公知となっているＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元に、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)用のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は配列表１、配列表２に示した。
【００２９】これらのプライマーを用い、Lactobacillus plantarum ATCC8041株のゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、1027塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片は大腸菌のベクターであるpUC18のHincII切断部位にサブクローニングし、塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にLactobacillus plantarumのＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子をコードしていることを確認した。
【００３０】（２）発現ベクターの作製（１）で増幅したDNA断片を酵母中で発現するPGKプロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるpAUR101（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に導入し、Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD1を作製した（図■）。
【００３１】（３）宿主への発現ベクターの導入（２）で作製した発現ベクターpDLD1をTorulopsis glabrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
【００３２】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabrataDLA株と命名した。
【００３３】実施例２（形質転換株によるＤ−乳酸の発現）
Torulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株、およびこの形質転換株Torulopsis glabrata DLA株を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＹＣＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前培養した。
【００３４】次に、以下に示した組成の培地５０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で７０時間培養した。
【００３５】
【表１】
【００３６】培養終了後、菌体を除去した培養上清中のＤ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。その結果を以下に示した。
【００３７】
【表２】
【００３８】コントロールであるTorulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata DLA株ではＤ−乳酸の著量蓄積が見られた。
【００３９】実施例３（１）発現ベクターの作製実施例１の（１）で増幅したDNA断片を市販の酵母用ベクターであるpAUR123（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に導入し、Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123を作製した（図２）。
【００４０】（２）宿主への発現ベクターの導入（１）で作製した発現ベクターpDLD123をTorulopsis glabrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
【００４１】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabrataDLA123株と命名した。
【００４２】実施例４（形質転換株によるＤ−乳酸の発現）
Torulopsis glabrata DLA123株を実施例２に従って培養した。
【００４３】培養終了後、菌体を除去した培養上清中のＤ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。その結果を以下に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】コントロールであるTorulopsis glabrata B26株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata DLA123株でもＤ−乳酸の著量蓄積が見られた。
【００４６】
【発明の効果】本発明の酵母を用い、発酵法によりＤ−乳酸を培養液中に生産すると、既存の方法に比較してより経済的なＤ−乳酸の生産が可能となる。
【００４７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> TORAY<120> The method to produce D-lactate<130> 51E16151<160> 2<210> 1<211> 31<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus plantarum<400> gtaatgaagcttattgcatatgctgtacgtg<210> 2<211> 36<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus plantarum<400> ttaaggatcctcgaaattagtcaaacttaacttgcg
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD1のフィジカルマップを示す図である。
【図２】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123のフィジカルマップを示す図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−乳酸の製造法に関するものである。Ｄ−乳酸は農薬中間体などの合成原料として使用され、需要が高まりつつある。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｄ−乳酸脱水素酵素を産生する微生物としては、ラクトバチラス属、ロイコノストック属、スタフィロコッカス属等に属する微生物が知られている〔マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbiological Reviews）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９８０年）〕。
【０００３】特開平５−２１９９８７号公報には、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属またはオブサムバクテリウム属の微生物を用い、ＤＬ−ラクトニトリルからＤ−乳酸またはＬ−乳酸を製造する方法が開示されている。特開平５−２６０９６４号公報には、シュードモナス属に属する微生物を培養して得られた酵素を用い、Ｌ−２−クロロプロピオン酸、Ｄ−２−クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマー混合物からＤ−乳酸を製造する方法が開示されている。特開平７−３２７６９３号公報には、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及びロドコッカス属の微生物の培養液、菌体等をＤＬ−ラクトアミドに作用させ、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを製造する方法が開示されている。これらはいずれもグルコースから直接Ｄ−乳酸を製造する方法ではない。
【０００４】特表平７−５０８１６５号公報には、乳酸菌（ラクトバチルス属）由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を導入したサッカロミセス酵母が開示されているが、用いられているのはＬ−乳酸脱水素酵素であり、またこの酵母による乳酸の生産は培地中のグルコースの２５〜３０％に相当するにすぎず、生成効率は低い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、微生物によるＤ−乳酸の高効率な工業的製造方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するために、本発明者らは更に生産性の高いＤ−乳酸の製造方法について鋭意研究を行った結果、ピルビン酸の高生産能を有する微生物に乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込むことにより、Ｄ−乳酸の蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明はピルビン酸高生産性能を有し、かつＤ−乳酸脱水素酵素の高発現能を持った微生物を培養して、培養液中にＤ−乳酸を蓄積せしめ、前記培養液よりＤ−乳酸を回収することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。
【０００７】すなわち本発明はピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素遺伝子を導入した微生物とその微生物を培養しＤ−乳酸を生産することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】ピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作用により、直接乳酸に還元される。この場合、Ｌ−乳酸脱水素酵素を用いればＬ−乳酸が、Ｄ−乳酸脱水素酵素を用いればＤ−乳酸がピルビン酸より直接生成する。
【０００９】本発明に使用する宿主微生物は、ピルビン酸を高生産（１０ｇ／Ｌ以上）する微生物であるならば特に制限はない。本発明では、ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物であれば良い。ここで、ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物とは、特開２０００−７８９９６号公報の実施例５に記載の方法で培養した際にピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積するものである。
【００１０】微生物としては、酵母が好ましく用いられ、特に、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属の酵母が好ましい。さらに好ましくは、トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）またはトルロプシス・メタノロベッセンス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｍｅｔｈａｎａｌｖｅｓｃｅｎｃｅ）である。
【００１１】さらに宿主としてはピルビン酸を２０ｇ／Ｌ蓄積する微生物が好ましい。このような微生物としてはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) TR-2026株（FERM BP1425）、ACII33株（FERM BP1424）、X-15株（FERM BP1423）、X-68株（FERM BP1426）、AOA-8株（FERM BP1427）、トルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence) TR-2044株（FERM BP1428）などがあげられる。
【００１２】さらに宿主としてはピルビン酸を４０ｇ／Ｌ以上蓄積する微生物が好ましい。このような微生物としてはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) P95-21株（FERM P-10652）、P120-5a株（FERM P-16745)、B26株（FERM P-16744）などがあげられる。
【００１３】また、ピルビン酸の高生産能力があれば、他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があってもよく、ピルビン酸の高生産能力がある微生物はすべて本発明に含まれる。
【００１４】宿主に組み込むべきＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、宿主によって発現され、Ｄ−乳酸脱水素酵素としての活性が保持されるならば特に制限はないが、酵母以外の生物主由来であるものが好ましく、さらに、乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が好ましい。乳酸菌のＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子としてはラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)などの遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。
【００１５】Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子の取得方法としては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。
【００１６】取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００１７】用いられる発現ベクターのタイプについては宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限はない。例えば酵母においては、酵母内在性の２μプラスミドの複製起点を持つＹＥｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点を持つＹＲｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びセントロメア配列を持つＹＣｐ型ベクター、酵母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つＹＬｐ型ベクター、酵母中での複製起点を持たないＹＩｐ型ベクターなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持するためにはＹＩｐ型ベクターを用いることが好ましい。
【００１８】Ｄ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのプロモーターについては、宿主細胞においてＤ−乳酸脱水素酵素が発現され、Ｄ−乳酸が生成する限り特に制限はない。例えば酵母においてはホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可能である。
【００１９】本発明における培養方法について説明する。ピルビン酸の高生産用培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地であるが、Ｄ−乳酸が生成する限り特に制限はない。
【００２０】宿主がＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を持つ場合、ピルビン酸からＬ−乳酸が生産されるため、Ｄ−乳酸のみを製造するためにＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を破壊することも可能である。
【００２１】炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１％〜４．０％、有機微量成分としてはビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００２２】これらの他にリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加される。さらにチアミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなどの要求ビタミン、又はこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００２３】培養は通常、好気的条件下で行うが、Ｄ−乳酸の生成に応じて適宜条件を変更することが可能である。培養中はＤ−乳酸の生成蓄積に応じて、培地のｐＨ低下が起こるので、炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性カリなどのアルカリでｐＨ３〜ｐＨ８に調節することが有効である。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化を図る。培養温度は１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３５℃が用いられる。
【００２４】これらの条件の下に２４〜１２０時間振とうまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。
【００２５】培養液中に生成したＤ−乳酸は、そのまま単離精製することなく利用することもできるし、菌体を遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用することもできる。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００２７】実施例１（１）Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング宿主細胞の生産するピルビン酸からＤ−乳酸を産生させるために、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングを行った。
【００２８】公知となっているＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元に、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)用のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列は配列表１、配列表２に示した。
【００２９】これらのプライマーを用い、Lactobacillus plantarum ATCC8041株のゲノムDNAを鋳型としてＰＣＲを行い、1027塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片は大腸菌のベクターであるpUC18のHincII切断部位にサブクローニングし、塩基配列を確認した結果、この増幅断片が実際にLactobacillus plantarumのＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子をコードしていることを確認した。
【００３０】（２）発現ベクターの作製（１）で増幅したDNA断片を酵母中で発現するPGKプロモーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるpAUR101（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に導入し、Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD1を作製した（図
【００３１】（３）宿主への発現ベクターの導入（２）で作製した発現ベクターpDLD1をTorulopsis glabrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
【００３２】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabrataDLA株と命名した。
【００３３】実施例２（形質転換株によるＤ−乳酸の発現）
Torulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株、およびこの形質転換株Torulopsis glabrata DLA株を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＹＣＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前培養した。
【００３４】次に、以下に示した組成の培地５０ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で７０時間培養した。
【００３５】
【表１】
【００３６】培養終了後、菌体を除去した培養上清中のＤ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。その結果を以下に示した。
【００３７】
【表２】
【００３８】コントロールであるTorulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata DLA株ではＤ−乳酸の著量蓄積が見られた。
【００３９】実施例３（１）発現ベクターの作製実施例１の（１）で増幅したDNA断片を市販の酵母用ベクターであるpAUR123（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に導入し、Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123を作製した（図２）。
【００４０】（２）宿主への発現ベクターの導入（１）で作製した発現ベクターpDLD123をTorulopsis glabrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
【００４１】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabrataDLA123株と命名した。
【００４２】実施例４（形質転換株によるＤ−乳酸の発現）
Torulopsis glabrata DLA123株を実施例２に従って培養した。
【００４３】培養終了後、菌体を除去した培養上清中のＤ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量した。その結果を以下に示した。
【００４４】
【表３】
【００４５】コントロールであるTorulopsis glabrata B26株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata DLA123株でもＤ−乳酸の著量蓄積が見られた。
【００４６】
【発明の効果】本発明の酵母を用い、発酵法によりＤ−乳酸を培養液中に生産すると、既存の方法に比較してより経済的なＤ−乳酸の生産が可能となる。
【００４７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> TORAY<120> The method to produce D-lactate<130> 51E16151<160> 2<210> 1<211> 31<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus plantarum<400> gtaatgaagcttattgcatatgctgtacgtg<210> 2<211> 36<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus plantarum<400> ttaaggatcctcgaaattagtcaaacttaacttgcg
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD1のフィジカルマップを示す図である。
【図２】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123のフィジカルマップを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した微生物。
【請求項２】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物が酵母であるところの請求項１に記載の微生物。
【請求項３】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物がトルロプシス(Torulopsis)属であるところの請求項２に記載の微生物。
【請求項４】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物がトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence)であるところの請求項３に記載の微生物。
【請求項５】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が酵母以外の生物主由来であるところの請求項１〜４のいずれかに記載の微生物。
【請求項６】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が乳酸菌由来であるところの請求項５に記載の微生物。
【請求項７】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子がラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)のいずれかに由来するところの請求項６に記載の微生物。
【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の微生物を培養し、Ｄ−乳酸を生産させることを特徴とするＤ−乳酸の製造方法。
【請求項１】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した微生物。
【請求項２】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物が酵母であるところの請求項１に記載の微生物。
【請求項３】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物がトルロプシス(Torulopsis)属であるところの請求項２に記載の微生物。
【請求項４】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物がトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Torulopsis methanalvescence)であるところの請求項３に記載の微生物。
【請求項５】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が酵母以外の生物主由来であるところの請求項１〜４のいずれかに記載の微生物。
【請求項６】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が乳酸菌由来であるところの請求項５に記載の微生物。
【請求項７】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子がラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)のいずれかに由来するところの請求項６に記載の微生物。
【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の微生物を培養し、Ｄ−乳酸を生産させることを特徴とするＤ−乳酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００２−１３６２９３（Ｐ２００２−１３６２９３Ａ）
【公開日】平成１４年５月１４日（２００２．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００１−２５２３９５（Ｐ２００１−２５２３９５）
【出願日】平成１３年８月２３日（２００１．８．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１４年５月１４日（２００２．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１３年８月２３日（２００１．８．２３）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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