微生物スクリーニング方法、及び該微生物を用いた環境浄化方法と有用物質生産方法
【課題】目的の微生物を、容易に、かつ効率的に獲得するための新規な微生物スクリーニング方法を提供すること。
【解決手段】本発明に係る微生物スクリーニング方法は、所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階Ｐ１、生存生物のみを収得する第２段階Ｐ２、生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階Ｐ３、前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源する培地に接種して培養する第４段階Ｐ４、微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階Ｐ５を、少なくとも行うことで目的の微生物を獲得する微生物スクリーニング方法。
【解決手段】本発明に係る微生物スクリーニング方法は、所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階Ｐ１、生存生物のみを収得する第２段階Ｐ２、生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階Ｐ３、前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源する培地に接種して培養する第４段階Ｐ４、微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階Ｐ５を、少なくとも行うことで目的の微生物を獲得する微生物スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物スクリーニング方法に関する。より詳しくは、生物に人口餌を摂取させることにより、生物の腸内微生物叢が変化することを利用した微生物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な分野で、微生物を利用した試みが注目されている。例えば、バイオメディエーションのように微生物を利用した環境汚染物質の浄化や、農薬、医薬品、又は工業薬品等に利用される物質を、微生物を利用して生産する方法などが挙げられる。
【０００３】
例えば、特許文献１では、土壌や地下水等に存在する環境汚染物質を微生物で分解除去する方法が開示されている。また、特許文献２では、各種工業薬品、農薬及び医薬品の製造中間体である光学活性２−アルキル−Ｄ−システインエステルを、微生物を利用して製造する方法が開示されている。
【０００４】
このような背景の下、特定の機能を有する微生物をより簡単にスクリーニングする方法が求められている。一般に、微生物のスクリーニング方法は、自然界の微生物を含む土壌や水中、または生物の臓器等から得られるサンプルを、そのまま寒天培地等を用いて単離培養を行う方法や、人工的な培地を用いて試験管やフラスコなどの装置内で集積培養を行った後に、寒天培地を用いて微生物の単離を行う方法などが挙げられる。
【０００５】
例えば、特許文献３では、写真感光材料生産工場の排水中の細菌を銀含有培地上で培養することで、銀担持菌をスクリーニングする方法が開示されている。また、特許文献４では、シロアリの腸を摘出してすりつぶし、フェノール性化合物を有する培地に加えて培養することで、フェノール性化合物分解能を有する微生物をスクリーニングする方法が開示されている。
【特許文献１】特開平０９−１５０１３９号公報。
【特許文献２】特開２００６−６号公報。
【特許文献３】特開２００４−１８０５８２号公報。
【特許文献４】特開平０６−２２７６９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的な微生物のスクリーニング方法である自然界の微生物を含む土壌や水中、または生物の臓器等から得られるサンプルを、そのまま寒天培地等を用いて単離培養を行う方法では、自然界に目的の微生物が少数である場合には、非常に非効率である。
【０００７】
また、上記のように得られたサンプルを人工的な培地を用いて集積培養をおこなった後に、寒天培地等で単離培養を行う方法では、人工的な環境に適応できる微生物しか獲得できないといった問題がある。
【０００８】
そこで、本発明では、あらゆる微生物を、容易に、かつ効率的に獲得できる微生物スクリーニング方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、生物の腸内微生物叢が生物の食す餌成分の分解に大きく寄与していることから、餌成分を変化させると、腸内微生物叢が、変化後の餌成分を分解できる微生物叢に変化することを突き止めた。そして、生物に所定の成分を含む人工餌を与えることで、一定期間生き残った生物の腸内では、この所定成分を分解利用する微生物が濃縮されることを見出し、これまで生物の腸内からスクリーニングすることが難しかった微生物を、容易に、かつ効率的にスクリーニングすることができる、新規な微生物スクリーニング方法を開発した。
【００１０】
本発明に係る微生物スクリーニング方法は、所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階と、第１段階を経た後に生存している生物のみを収得する第２段階と、前記生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階と、前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源とする培地に接種して培養する第４段階と、前記培地から収得した単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、該培養液中の所定成分の濃度を定量することによって、当該単一コロニーを形成する微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階と、からなる方法である。
【００１１】
この微生物スクリーニング方法では、培養前に、人工的ではなく、より自然に近い状態の生きた生物の腸内で、目的の微生物を濃縮することができるため、それらの微生物を容易に、かつ効率的に獲得することができる。
【００１２】
目的の微生物を培養する際、目的の微生物によっては、前記所定成分以外の炭素源により影響を受け易い場合がある。その場合は、前記第４段階で用いる培地に、前記所定成分以外の炭素源が含まれないようにすることもできる。
【００１３】
また、前記微生物スクリーニング方法で使用される生物は、微生物叢を腸内に共生させている生物であれば、昆虫、土壌生物、水系生物等のあらゆる生物を用いることができる。
【００１４】
前記第１段階で用いる人工餌に含まれる所定成分を環境汚染物質にすれば、環境汚染物質を分解利用する微生物をスクリーニングすることができる。そして、この微生物を用いて、環境汚染物質の浄化を行うことができる。
【００１５】
また、前記人工餌の所定成分を微生物分解により有用物質を提供し得る物質にすれば、有効物質を生産し得る微生物をスクリーニングすることができる。そして、この微生物を用いて有用物質の生産を行うことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る微生物スクリーニング方法は、生物の腸内微生物叢の変化を利用することで、大量獲得が難しかった微生物や人工的な環境下では獲得が難しかった微生物を、容易に、かつ効率的に獲得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を実施するための最良の形態について、添付した図面を参照しながら説明する。なお、本実施形態は、本発明の一実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００１８】
図１は、本発明に係る微生物スクリーニング方法のフロー図である。以下、方法の段階毎に説明する。
【００１９】
＜所定成分の選択段階Ａ＞
まず、本微生物スクリーニング方法では、微生物に分解等させたい所定の成分を選択する。所定成分は特に限定しないが、例えば、フェノール、ダイオキシン類等の環境汚染物質を選択すれば、本微生物スクリーニング方法によって、環境汚染物質を分解利用できる微生物を獲得することができる。そして、この微生物を用いて、環境汚染物質の浄化を行うことができる。
【００２０】
また、所定成分を、微生物により分解させることで農薬、医薬品、又は工業薬品等に利用される有用物質へと変化する物質を選択すれば、本スクリーニング方法によって、有用物質を生産しうる微生物を獲得することができる。そして、この微生物を用いて、前記有用物質の生産を行うことができる。
【００２１】
＜人工餌の作製段階Ｂ＞
次に、前記所定成分の選択段階Ａで選択した所定成分を含む人工餌を作製する。人工餌の作製方法は、特に限定しないが、例えば、所定成分を含む溶液を滅菌し、この溶液を寒天溶液等と混合した後ゲル化し、このゲル中に固定することで作製する方法が挙げられる。
【００２２】
＜第１段階：生物の人工餌摂食Ｐ１＞
第１段階では、前記人工餌の作製段階Ｂで作製した人工餌を生物に摂食させる。上記生物は特に限定されず、微生物叢を腸内に共生させている生物であれば、昆虫、土壌生物、水系生物等あらゆる生物を用いることができる。
【００２３】
＜第２段階：生存生物の収得Ｐ２＞
第２段階では、前記第１段階Ｐ１を経た生物であって、一定期間後に生き残っている生物を収得する。この一定期間は、特に限定されず、前記所定成分に基づいて決定すればよい。このときの生存生物の腸内微生物叢には、前記所定成分を分解利用する微生物が濃縮されている。
【００２４】
＜第３段階：腸懸濁液の作製Ｐ３＞
第３段階では、前記第２段階Ｐ２で収得した生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する。腸懸濁液の調整方法は特に限定しないが、例えば、生存生物の腸を無菌的に摘出し、摘出した腸を粉砕することで、懸濁液を調整する方法が挙げられる。
【００２５】
＜第４段階：微生物の培養Ｐ４＞
第４段階では、前記第３段階Ｐ３で調整した腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源とする培地に接種し培養させる。前記培地は特に限定しないが、例えば、液体培地、半流動培地、固形培地等いずれの培地を用いてもよい。また、目的の微生物のみを培養するために、選択増菌培地等を用いることも可能である。
【００２６】
更に、前記所定成分以外の炭素源により影響を受け易い微生物を培養させる場合には、前記所定成分以外の炭素源が含まれない培地を用いることも可能である。一例を挙げると、飲食物等の不純物濾過で使用されているメンブランフィルターを、微生物の培養法に応用することができる。この方法では、メンブランフィルターを通過できる成分のみで目的の微生物を培養することができるのでより好適である。
【００２７】
＜第５段階：分解能力の評価Ｐ５＞
第５段階では、前記第４段階Ｐ４で培養し、得られた単一コロニーの前記所定成分の分解能力を評価する。評価方法は、得られた単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、培養後の前記所定成分の濃度を測定することにより行う。該濃度の低下が見られれば分解能力ありと、該濃度の低下が見られないときは分解能力なしと評価する。
【００２８】
以上の微生物スクリーニング方法で得られた微生物は、前記所定成分に応じて、環境汚染物質の浄化に用いたり、有用物質の生産に用いたりすることができる。
【実施例１】
【００２９】
実施例１では、イエシロアリの人口餌摂取による生存率の変化と、腸内原生動物叢の変化について調べた。
【００３０】
＜イエシロアリの飼育条件＞
まず、イエシロアリを２５匹ずつ３群に分けた。それぞれの餌条件は、木材（赤松）を与えた群（以下「木材群I」と称する。）、１．５％アガロースゲルであるアガロース人口餌を与えた群（以下「アガロース群II」と称する。）、１．５％アガロースゲルに１００ｍｇ／Ｌのフェノールを添加したフェノール人口餌を与えた群（以下「フェノール群III」と称する。）と設定した。温度条件は、３０℃で行った。図２中のＩからIIIにそれぞれの群の飼育の様子を示す。なお、アガロース群IIは、フェノール群IIIのコントロールとした。
【００３１】
＜イエシロアリの生存率の変化＞
それぞれの群の経時的な生存数を表１に、また、アガロース群IIとフェノール群IIIの経時的な生存率の変化を図３に示す。
【表１】
【００３２】
図３に示すように、２０日後の生存率は、アガロース群IIでは８０％の生存率を維持していたのに対し、フェノール群では２０％以下に低下している。この結果から、フェノールの毒性により、イエシロアリの生存が阻害されることが分かった。
【００３３】
＜イエシロアリの腸内原生動物叢の変化＞
それぞれの群の経時的な腸内原生動物数を図４に示す。図４に示すように、木材群Iでは、ほぼ一定に原生動物が存在しているのに対し、アガロース群II、及びフェノール群IIIでは、腸内原生動物数は初期から激減し、１０日以内に消失した。
【００３４】
実施例１では、フェノールの毒性によりイエシロアリの生存が阻害され、アガロース、及びフェノールによりイエシロアリの腸内原生動物の生存が阻害されることが分かった。
【実施例２】
【００３５】
実施例２では、フェノール分解菌の検出、及び定量を試みた。
【００３６】
＜イエシロアリの飼育＞
実施例１と同様の条件で、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育した。
【００３７】
＜コロニーの検出＞
まず、上記で飼育し、生き残ったイエシロアリの腸を摘出し、腸懸濁液の調整を行った。具体的には、イエシロアリの腸５匹分を無菌的に摘出し、表２に示す組成を含むＭＰ５００培地中で、ペレットミキサーを用いて粉砕し、懸濁液を調整した。この懸濁液１００μＬを９００μＬのＭＰ５００培地にいれ希釈した。この操作を数回繰り返し適当な細胞濃度の腸懸濁液を調整した。次に、調製した懸濁液を、表２に示す組成を含む培地に寒天１５ｇ／Ｌを加えたＭＰ５００寒天培地に接種した。温度条件３０℃で１週間培養した。
【表２】
【００３８】
＜コロニー数のカウント＞
前記培養後、各群の寒天培地に生じたコロニー数をカウントした。カウントしたコロニー数を図５に示す。腸１匹分当たり、木材群Iでは約３万５千、アガロース群IIでは約６万、フェノール群では約１８万〜２０万のコロニーが生じた。
【００３９】
＜コロニーのフェノール分解能の確認＞
まず、シングルコロニーを一つずつピックアップして、ＭＰ５００液体培地の入ったＬ字管に接種し、温度条件３０℃で振とう培養を行った。次に、培養後の培養液中のフェノール濃度をFhenol Test Wako（和光純薬工業株式会社）を使い定量し、フェノール濃度の低下が見られたコロニーをフェノール分解菌として評価した。
【００４０】
総計８５コロニーを調査したところ、８３コロニーがフェノール分解能を示さなかった。これにより、ＭＰ５００寒天培地から得られたコロニーのうち、９０％以上がフェノール分解菌でないことが分かった。
【００４１】
実施例２では、フェノール含有の人工餌によりイエシロアリの腸内微生物は濃縮されるが、その微生物のほとんどは、フェノール分解菌ではないことが分かった。
【００４２】
上記のように、ほとんどがフェノール分解菌でない原因としては、寒天若しくは寒天由来の低分子の糖を利用し、５００ｍｇ／Ｌフェノールに耐性を有する微生物がコロニーを形成することが考えられる。
【実施例３】
【００４３】
実施例３では、実施例２でほとんど得られなかったフェノール分解菌のみの特異的な検出、及び定量を試みた。
【００４４】
フェノール以外の炭素源を排除するために、培養法としてメンブランフィルター法を採用した。メンブランフィルター法の概略を図６に示す。メンブランフィルター法とは、非常に難分解なＰＶＤＦフィルター（φ0.45μｍ）１上に微生物２を接種し、その下に液体培地３をしみこませた濾紙を置いて培養する方法である。この方法は、ＰＶＤＦフィルター１を通じて供給される液体培地３の成分を利用できる微生物２しか培養されないといった特徴がある。培地成分の移動の様子を矢印Ｔで示す。本実施例では、メンブランフィルター法のキットとしてMilliflex（Millipore Corporation）を用いた。
【００４５】
＜イエシロアリの飼育＞
実施例２と同様に、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育した。
【００４６】
＜コロニーの検出＞
上記で飼育し、生き残ったイエシロアリの腸を摘出し、実施例２と同様の方法で腸懸濁液の調整を行い、図７に示すように、腸懸濁液をＰＶＤＦフィルター１上に接種し、ＰＶＤＦフィルター１の下から、吸引濾過により液体を除去した（図７中（ａ）参照）。そして、ＭＰ５００液体培地３を含む培地カセットをＰＤＶＦフィルター１の下部へ装着した（図７中（ｂ）参照）。この状態のまま、温度条件３０℃で１週間培養した（図７中（ｃ）参照）。
【００４７】
＜コロニー数のカウント＞
前記培養後、各群のＰＤＶＦフィルター１上に生じたコロニー（微生物２）数をカウントした。カウントしたコロニー（微生物２）数を図８に示す。腸１匹分当たり、木材群I、アガロース群IIでは全くコロニー（微生物２）が生じていないのに対し、フェノール群では２８７０のコロニー（微生物２）が生じた。
【００４８】
＜コロニーのフェノール分解能の確認＞
実施例２と同様の方法で、フェノール濃度の定量により、コロニーのフェノール分解能を確認した。５０コロニーを調査したところ、５０コロニー全てがフェノール分解菌であることが分かった。
【００４９】
実施例３の結果から、フェノール人口餌接種後に、生き残ったイエシロアリの腸内には、フェノール分解菌が濃縮されていることが示唆された。
【実施例４】
【００５０】
実施例４では、人口餌によるイエシロアリの腸内微生物叢の変化と、従来のスクリーニング法での腸内微生物叢の変化との比較をした。
【００５１】
＜微生物叢サンプルの作製＞
まず、実施例２、及び実施例３と同様に、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育し、生き残ったイエシロアリの腸内微生物叢をサンプルとした。また、従来のスクリーニング法における微生物叢サンプルとして、木材摂食イエシロアリの腸内微生物叢を、そのままフェノール人工培地に接種して集積培養を行った微生物叢を用いた（以下「集積培養群IV」と称する。）。前記集積培養は、ＭＰ５００液体培地を用いてＬ字管を用いて行った。
【００５２】
＜腸内微生物叢の解析＞
腸内微生物叢の全体的な変化を捉えるために、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析を行った。電気泳動条件は、変性剤濃度勾配２０〜７０％、電圧３５Ｖ、泳動時間２５時間で行った。バンドパターンを図９に示す。
【００５３】
バンドパターンの類似度をSorensenの式により求めた。類似度を基に作成した系統樹を図１０に示す。図１０のように、フェノール群IIIとアガロース群IIの類似度は６０％程度であるところ、フェノール群IIIと木材群Iの類似度は４０％以下しか示さず、大きく異なっていることが分かる。更に、フェノール群IIIと集積培養群IVの類似度は１０％程度の類似度しか示さず、非常に大きく異なっていることが分かる。
【００５４】
実施例４の結果から、イエシロアリの腸内微生物叢は、フェノール人工餌摂食によって、大きく変化することが分かった。また、フェノール人工餌摂食によって変化した微生物叢は、従来のスクリーニング法で得られる微生物叢とは大きく異なることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に係る微生物スクリーニング方法では、培養前に、生物の腸内で目的の微生物を濃縮した後に培養させるため、容易に、かつ効率的に目的の微生物を獲得することができる。また、より自然に近い生きた生物の腸内微生物叢を利用するため、人工的な環境下で獲得される微生物と全く異なる微生物を獲得することができる。さらに、得られた微生物を用いて、環境汚染物質の浄化や有用物質の生産をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係る微生物スクリーニング方法のフロー図である。
【図２】イエシロアリの飼育の様子を示す図である。
【図３】実施例１におけるイエシロアリの経時的な生存率の変化を示す図である。
【図４】実施例１におけるイエシロアリの経時的な腸内原生動物数の変化を示す図である。
【図５】実施例２における各群の寒天培地に生じたコロニー数を示す図である。
【図６】実施例３で使用するメンブランフィルター法の概略を示す図である。
【図７】実施例３におけるメンブランフィルターを使った培養方法の概略を示す図である。
【図８】実施例３における各群のＰＤＶＦフィルター上に生じたコロニー数を示す図である。
【図９】実施例４における各群のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を行った際のバンドパターンを示す図である。
【図１０】Sorensenの式により求めた図９で示すバンドパターンの類似度を基に作成した系統樹を示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
Ａ 所定成分の選択段階
Ｂ 人工餌の作製段階
Ｐ１ 第１段階：生物の人工餌摂食
Ｐ２ 第２段階：生存生物の収得
Ｐ３ 第３段階：腸懸濁液の作製
Ｐ４ 第４段階：微生物の培養
Ｐ５ 第５段階：分解能力の評価
Ｉ 木材群
II アガロース群
III フェノール群
IV 集積培養群
１ ＰＶＤＦフィルター
２ 微生物
３ 液体培地
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物スクリーニング方法に関する。より詳しくは、生物に人口餌を摂取させることにより、生物の腸内微生物叢が変化することを利用した微生物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な分野で、微生物を利用した試みが注目されている。例えば、バイオメディエーションのように微生物を利用した環境汚染物質の浄化や、農薬、医薬品、又は工業薬品等に利用される物質を、微生物を利用して生産する方法などが挙げられる。
【０００３】
例えば、特許文献１では、土壌や地下水等に存在する環境汚染物質を微生物で分解除去する方法が開示されている。また、特許文献２では、各種工業薬品、農薬及び医薬品の製造中間体である光学活性２−アルキル−Ｄ−システインエステルを、微生物を利用して製造する方法が開示されている。
【０００４】
このような背景の下、特定の機能を有する微生物をより簡単にスクリーニングする方法が求められている。一般に、微生物のスクリーニング方法は、自然界の微生物を含む土壌や水中、または生物の臓器等から得られるサンプルを、そのまま寒天培地等を用いて単離培養を行う方法や、人工的な培地を用いて試験管やフラスコなどの装置内で集積培養を行った後に、寒天培地を用いて微生物の単離を行う方法などが挙げられる。
【０００５】
例えば、特許文献３では、写真感光材料生産工場の排水中の細菌を銀含有培地上で培養することで、銀担持菌をスクリーニングする方法が開示されている。また、特許文献４では、シロアリの腸を摘出してすりつぶし、フェノール性化合物を有する培地に加えて培養することで、フェノール性化合物分解能を有する微生物をスクリーニングする方法が開示されている。
【特許文献１】特開平０９−１５０１３９号公報。
【特許文献２】特開２００６−６号公報。
【特許文献３】特開２００４−１８０５８２号公報。
【特許文献４】特開平０６−２２７６９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的な微生物のスクリーニング方法である自然界の微生物を含む土壌や水中、または生物の臓器等から得られるサンプルを、そのまま寒天培地等を用いて単離培養を行う方法では、自然界に目的の微生物が少数である場合には、非常に非効率である。
【０００７】
また、上記のように得られたサンプルを人工的な培地を用いて集積培養をおこなった後に、寒天培地等で単離培養を行う方法では、人工的な環境に適応できる微生物しか獲得できないといった問題がある。
【０００８】
そこで、本発明では、あらゆる微生物を、容易に、かつ効率的に獲得できる微生物スクリーニング方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、生物の腸内微生物叢が生物の食す餌成分の分解に大きく寄与していることから、餌成分を変化させると、腸内微生物叢が、変化後の餌成分を分解できる微生物叢に変化することを突き止めた。そして、生物に所定の成分を含む人工餌を与えることで、一定期間生き残った生物の腸内では、この所定成分を分解利用する微生物が濃縮されることを見出し、これまで生物の腸内からスクリーニングすることが難しかった微生物を、容易に、かつ効率的にスクリーニングすることができる、新規な微生物スクリーニング方法を開発した。
【００１０】
本発明に係る微生物スクリーニング方法は、所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階と、第１段階を経た後に生存している生物のみを収得する第２段階と、前記生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階と、前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源とする培地に接種して培養する第４段階と、前記培地から収得した単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、該培養液中の所定成分の濃度を定量することによって、当該単一コロニーを形成する微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階と、からなる方法である。
【００１１】
この微生物スクリーニング方法では、培養前に、人工的ではなく、より自然に近い状態の生きた生物の腸内で、目的の微生物を濃縮することができるため、それらの微生物を容易に、かつ効率的に獲得することができる。
【００１２】
目的の微生物を培養する際、目的の微生物によっては、前記所定成分以外の炭素源により影響を受け易い場合がある。その場合は、前記第４段階で用いる培地に、前記所定成分以外の炭素源が含まれないようにすることもできる。
【００１３】
また、前記微生物スクリーニング方法で使用される生物は、微生物叢を腸内に共生させている生物であれば、昆虫、土壌生物、水系生物等のあらゆる生物を用いることができる。
【００１４】
前記第１段階で用いる人工餌に含まれる所定成分を環境汚染物質にすれば、環境汚染物質を分解利用する微生物をスクリーニングすることができる。そして、この微生物を用いて、環境汚染物質の浄化を行うことができる。
【００１５】
また、前記人工餌の所定成分を微生物分解により有用物質を提供し得る物質にすれば、有効物質を生産し得る微生物をスクリーニングすることができる。そして、この微生物を用いて有用物質の生産を行うことができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る微生物スクリーニング方法は、生物の腸内微生物叢の変化を利用することで、大量獲得が難しかった微生物や人工的な環境下では獲得が難しかった微生物を、容易に、かつ効率的に獲得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明を実施するための最良の形態について、添付した図面を参照しながら説明する。なお、本実施形態は、本発明の一実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００１８】
図１は、本発明に係る微生物スクリーニング方法のフロー図である。以下、方法の段階毎に説明する。
【００１９】
＜所定成分の選択段階Ａ＞
まず、本微生物スクリーニング方法では、微生物に分解等させたい所定の成分を選択する。所定成分は特に限定しないが、例えば、フェノール、ダイオキシン類等の環境汚染物質を選択すれば、本微生物スクリーニング方法によって、環境汚染物質を分解利用できる微生物を獲得することができる。そして、この微生物を用いて、環境汚染物質の浄化を行うことができる。
【００２０】
また、所定成分を、微生物により分解させることで農薬、医薬品、又は工業薬品等に利用される有用物質へと変化する物質を選択すれば、本スクリーニング方法によって、有用物質を生産しうる微生物を獲得することができる。そして、この微生物を用いて、前記有用物質の生産を行うことができる。
【００２１】
＜人工餌の作製段階Ｂ＞
次に、前記所定成分の選択段階Ａで選択した所定成分を含む人工餌を作製する。人工餌の作製方法は、特に限定しないが、例えば、所定成分を含む溶液を滅菌し、この溶液を寒天溶液等と混合した後ゲル化し、このゲル中に固定することで作製する方法が挙げられる。
【００２２】
＜第１段階：生物の人工餌摂食Ｐ１＞
第１段階では、前記人工餌の作製段階Ｂで作製した人工餌を生物に摂食させる。上記生物は特に限定されず、微生物叢を腸内に共生させている生物であれば、昆虫、土壌生物、水系生物等あらゆる生物を用いることができる。
【００２３】
＜第２段階：生存生物の収得Ｐ２＞
第２段階では、前記第１段階Ｐ１を経た生物であって、一定期間後に生き残っている生物を収得する。この一定期間は、特に限定されず、前記所定成分に基づいて決定すればよい。このときの生存生物の腸内微生物叢には、前記所定成分を分解利用する微生物が濃縮されている。
【００２４】
＜第３段階：腸懸濁液の作製Ｐ３＞
第３段階では、前記第２段階Ｐ２で収得した生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する。腸懸濁液の調整方法は特に限定しないが、例えば、生存生物の腸を無菌的に摘出し、摘出した腸を粉砕することで、懸濁液を調整する方法が挙げられる。
【００２５】
＜第４段階：微生物の培養Ｐ４＞
第４段階では、前記第３段階Ｐ３で調整した腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源とする培地に接種し培養させる。前記培地は特に限定しないが、例えば、液体培地、半流動培地、固形培地等いずれの培地を用いてもよい。また、目的の微生物のみを培養するために、選択増菌培地等を用いることも可能である。
【００２６】
更に、前記所定成分以外の炭素源により影響を受け易い微生物を培養させる場合には、前記所定成分以外の炭素源が含まれない培地を用いることも可能である。一例を挙げると、飲食物等の不純物濾過で使用されているメンブランフィルターを、微生物の培養法に応用することができる。この方法では、メンブランフィルターを通過できる成分のみで目的の微生物を培養することができるのでより好適である。
【００２７】
＜第５段階：分解能力の評価Ｐ５＞
第５段階では、前記第４段階Ｐ４で培養し、得られた単一コロニーの前記所定成分の分解能力を評価する。評価方法は、得られた単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、培養後の前記所定成分の濃度を測定することにより行う。該濃度の低下が見られれば分解能力ありと、該濃度の低下が見られないときは分解能力なしと評価する。
【００２８】
以上の微生物スクリーニング方法で得られた微生物は、前記所定成分に応じて、環境汚染物質の浄化に用いたり、有用物質の生産に用いたりすることができる。
【実施例１】
【００２９】
実施例１では、イエシロアリの人口餌摂取による生存率の変化と、腸内原生動物叢の変化について調べた。
【００３０】
＜イエシロアリの飼育条件＞
まず、イエシロアリを２５匹ずつ３群に分けた。それぞれの餌条件は、木材（赤松）を与えた群（以下「木材群I」と称する。）、１．５％アガロースゲルであるアガロース人口餌を与えた群（以下「アガロース群II」と称する。）、１．５％アガロースゲルに１００ｍｇ／Ｌのフェノールを添加したフェノール人口餌を与えた群（以下「フェノール群III」と称する。）と設定した。温度条件は、３０℃で行った。図２中のＩからIIIにそれぞれの群の飼育の様子を示す。なお、アガロース群IIは、フェノール群IIIのコントロールとした。
【００３１】
＜イエシロアリの生存率の変化＞
それぞれの群の経時的な生存数を表１に、また、アガロース群IIとフェノール群IIIの経時的な生存率の変化を図３に示す。
【表１】
【００３２】
図３に示すように、２０日後の生存率は、アガロース群IIでは８０％の生存率を維持していたのに対し、フェノール群では２０％以下に低下している。この結果から、フェノールの毒性により、イエシロアリの生存が阻害されることが分かった。
【００３３】
＜イエシロアリの腸内原生動物叢の変化＞
それぞれの群の経時的な腸内原生動物数を図４に示す。図４に示すように、木材群Iでは、ほぼ一定に原生動物が存在しているのに対し、アガロース群II、及びフェノール群IIIでは、腸内原生動物数は初期から激減し、１０日以内に消失した。
【００３４】
実施例１では、フェノールの毒性によりイエシロアリの生存が阻害され、アガロース、及びフェノールによりイエシロアリの腸内原生動物の生存が阻害されることが分かった。
【実施例２】
【００３５】
実施例２では、フェノール分解菌の検出、及び定量を試みた。
【００３６】
＜イエシロアリの飼育＞
実施例１と同様の条件で、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育した。
【００３７】
＜コロニーの検出＞
まず、上記で飼育し、生き残ったイエシロアリの腸を摘出し、腸懸濁液の調整を行った。具体的には、イエシロアリの腸５匹分を無菌的に摘出し、表２に示す組成を含むＭＰ５００培地中で、ペレットミキサーを用いて粉砕し、懸濁液を調整した。この懸濁液１００μＬを９００μＬのＭＰ５００培地にいれ希釈した。この操作を数回繰り返し適当な細胞濃度の腸懸濁液を調整した。次に、調製した懸濁液を、表２に示す組成を含む培地に寒天１５ｇ／Ｌを加えたＭＰ５００寒天培地に接種した。温度条件３０℃で１週間培養した。
【表２】
【００３８】
＜コロニー数のカウント＞
前記培養後、各群の寒天培地に生じたコロニー数をカウントした。カウントしたコロニー数を図５に示す。腸１匹分当たり、木材群Iでは約３万５千、アガロース群IIでは約６万、フェノール群では約１８万〜２０万のコロニーが生じた。
【００３９】
＜コロニーのフェノール分解能の確認＞
まず、シングルコロニーを一つずつピックアップして、ＭＰ５００液体培地の入ったＬ字管に接種し、温度条件３０℃で振とう培養を行った。次に、培養後の培養液中のフェノール濃度をFhenol Test Wako（和光純薬工業株式会社）を使い定量し、フェノール濃度の低下が見られたコロニーをフェノール分解菌として評価した。
【００４０】
総計８５コロニーを調査したところ、８３コロニーがフェノール分解能を示さなかった。これにより、ＭＰ５００寒天培地から得られたコロニーのうち、９０％以上がフェノール分解菌でないことが分かった。
【００４１】
実施例２では、フェノール含有の人工餌によりイエシロアリの腸内微生物は濃縮されるが、その微生物のほとんどは、フェノール分解菌ではないことが分かった。
【００４２】
上記のように、ほとんどがフェノール分解菌でない原因としては、寒天若しくは寒天由来の低分子の糖を利用し、５００ｍｇ／Ｌフェノールに耐性を有する微生物がコロニーを形成することが考えられる。
【実施例３】
【００４３】
実施例３では、実施例２でほとんど得られなかったフェノール分解菌のみの特異的な検出、及び定量を試みた。
【００４４】
フェノール以外の炭素源を排除するために、培養法としてメンブランフィルター法を採用した。メンブランフィルター法の概略を図６に示す。メンブランフィルター法とは、非常に難分解なＰＶＤＦフィルター（φ0.45μｍ）１上に微生物２を接種し、その下に液体培地３をしみこませた濾紙を置いて培養する方法である。この方法は、ＰＶＤＦフィルター１を通じて供給される液体培地３の成分を利用できる微生物２しか培養されないといった特徴がある。培地成分の移動の様子を矢印Ｔで示す。本実施例では、メンブランフィルター法のキットとしてMilliflex（Millipore Corporation）を用いた。
【００４５】
＜イエシロアリの飼育＞
実施例２と同様に、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育した。
【００４６】
＜コロニーの検出＞
上記で飼育し、生き残ったイエシロアリの腸を摘出し、実施例２と同様の方法で腸懸濁液の調整を行い、図７に示すように、腸懸濁液をＰＶＤＦフィルター１上に接種し、ＰＶＤＦフィルター１の下から、吸引濾過により液体を除去した（図７中（ａ）参照）。そして、ＭＰ５００液体培地３を含む培地カセットをＰＤＶＦフィルター１の下部へ装着した（図７中（ｂ）参照）。この状態のまま、温度条件３０℃で１週間培養した（図７中（ｃ）参照）。
【００４７】
＜コロニー数のカウント＞
前記培養後、各群のＰＤＶＦフィルター１上に生じたコロニー（微生物２）数をカウントした。カウントしたコロニー（微生物２）数を図８に示す。腸１匹分当たり、木材群I、アガロース群IIでは全くコロニー（微生物２）が生じていないのに対し、フェノール群では２８７０のコロニー（微生物２）が生じた。
【００４８】
＜コロニーのフェノール分解能の確認＞
実施例２と同様の方法で、フェノール濃度の定量により、コロニーのフェノール分解能を確認した。５０コロニーを調査したところ、５０コロニー全てがフェノール分解菌であることが分かった。
【００４９】
実施例３の結果から、フェノール人口餌接種後に、生き残ったイエシロアリの腸内には、フェノール分解菌が濃縮されていることが示唆された。
【実施例４】
【００５０】
実施例４では、人口餌によるイエシロアリの腸内微生物叢の変化と、従来のスクリーニング法での腸内微生物叢の変化との比較をした。
【００５１】
＜微生物叢サンプルの作製＞
まず、実施例２、及び実施例３と同様に、イエシロアリを、木材群I、アガロース群II、フェノール群IIIに分けて１０日間飼育し、生き残ったイエシロアリの腸内微生物叢をサンプルとした。また、従来のスクリーニング法における微生物叢サンプルとして、木材摂食イエシロアリの腸内微生物叢を、そのままフェノール人工培地に接種して集積培養を行った微生物叢を用いた（以下「集積培養群IV」と称する。）。前記集積培養は、ＭＰ５００液体培地を用いてＬ字管を用いて行った。
【００５２】
＜腸内微生物叢の解析＞
腸内微生物叢の全体的な変化を捉えるために、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による解析を行った。電気泳動条件は、変性剤濃度勾配２０〜７０％、電圧３５Ｖ、泳動時間２５時間で行った。バンドパターンを図９に示す。
【００５３】
バンドパターンの類似度をSorensenの式により求めた。類似度を基に作成した系統樹を図１０に示す。図１０のように、フェノール群IIIとアガロース群IIの類似度は６０％程度であるところ、フェノール群IIIと木材群Iの類似度は４０％以下しか示さず、大きく異なっていることが分かる。更に、フェノール群IIIと集積培養群IVの類似度は１０％程度の類似度しか示さず、非常に大きく異なっていることが分かる。
【００５４】
実施例４の結果から、イエシロアリの腸内微生物叢は、フェノール人工餌摂食によって、大きく変化することが分かった。また、フェノール人工餌摂食によって変化した微生物叢は、従来のスクリーニング法で得られる微生物叢とは大きく異なることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明に係る微生物スクリーニング方法では、培養前に、生物の腸内で目的の微生物を濃縮した後に培養させるため、容易に、かつ効率的に目的の微生物を獲得することができる。また、より自然に近い生きた生物の腸内微生物叢を利用するため、人工的な環境下で獲得される微生物と全く異なる微生物を獲得することができる。さらに、得られた微生物を用いて、環境汚染物質の浄化や有用物質の生産をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係る微生物スクリーニング方法のフロー図である。
【図２】イエシロアリの飼育の様子を示す図である。
【図３】実施例１におけるイエシロアリの経時的な生存率の変化を示す図である。
【図４】実施例１におけるイエシロアリの経時的な腸内原生動物数の変化を示す図である。
【図５】実施例２における各群の寒天培地に生じたコロニー数を示す図である。
【図６】実施例３で使用するメンブランフィルター法の概略を示す図である。
【図７】実施例３におけるメンブランフィルターを使った培養方法の概略を示す図である。
【図８】実施例３における各群のＰＤＶＦフィルター上に生じたコロニー数を示す図である。
【図９】実施例４における各群のＰＣＲ−ＤＧＧＥ法を行った際のバンドパターンを示す図である。
【図１０】Sorensenの式により求めた図９で示すバンドパターンの類似度を基に作成した系統樹を示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
Ａ 所定成分の選択段階
Ｂ 人工餌の作製段階
Ｐ１ 第１段階：生物の人工餌摂食
Ｐ２ 第２段階：生存生物の収得
Ｐ３ 第３段階：腸懸濁液の作製
Ｐ４ 第４段階：微生物の培養
Ｐ５ 第５段階：分解能力の評価
Ｉ 木材群
II アガロース群
III フェノール群
IV 集積培養群
１ ＰＶＤＦフィルター
２ 微生物
３ 液体培地
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階と、
前記第１段階を経て生存生物のみを収得する第２段階と、
前記生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階と、
前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源する培地に接種して培養する第４段階と、
前記培地から収得した単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、該培養液中の前記所定成分の濃度を定量することによって、当該単一コロニーを形成する微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階と、
からなる微生物スクリーニング方法。
【請求項２】
前記第４段階で用いる培地には前記所定成分以外の炭素源が含まれないことを特徴する請求項１記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項３】
前記生物は、（１）昆虫、（２）土壌生物、（３）水系生物のいずれか一つから選択されることを特徴とする請求項１記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項４】
前記人工餌に含まれる前記所定成分は、環境汚染物質であることを特徴とする請求項１に記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項５】
前記人工餌に含まれる前記所定成分は、微生物分解により有用物質を提供し得る物質であることを特徴とする請求項１に記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項６】
請求項４記載の微生物スクリーニング方法によって得られた微生物を用いて前記環境汚染物質の浄化を行うことを特徴とする環境浄化方法。
【請求項７】
請求項５記載の微生物スクリーニング方法によって得られた微生物を用いて前記有用物質を生産することを特徴とする有用物質生産方法。
【請求項１】
所定成分を含む人工餌を生物に摂食させる第１段階と、
前記第１段階を経て生存生物のみを収得する第２段階と、
前記生存生物の腸を摘出し、腸懸濁液を調整する第３段階と、
前記腸懸濁液を、前記所定成分を栄養源する培地に接種して培養する第４段階と、
前記培地から収得した単一コロニーを、前記所定成分を含有する培養液に接種し、該培養液中の前記所定成分の濃度を定量することによって、当該単一コロニーを形成する微生物の前記所定成分の分解能力を評価する第５段階と、
からなる微生物スクリーニング方法。
【請求項２】
前記第４段階で用いる培地には前記所定成分以外の炭素源が含まれないことを特徴する請求項１記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項３】
前記生物は、（１）昆虫、（２）土壌生物、（３）水系生物のいずれか一つから選択されることを特徴とする請求項１記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項４】
前記人工餌に含まれる前記所定成分は、環境汚染物質であることを特徴とする請求項１に記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項５】
前記人工餌に含まれる前記所定成分は、微生物分解により有用物質を提供し得る物質であることを特徴とする請求項１に記載の微生物スクリーニング方法。
【請求項６】
請求項４記載の微生物スクリーニング方法によって得られた微生物を用いて前記環境汚染物質の浄化を行うことを特徴とする環境浄化方法。
【請求項７】
請求項５記載の微生物スクリーニング方法によって得られた微生物を用いて前記有用物質を生産することを特徴とする有用物質生産方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００７−２５２２４４（Ｐ２００７−２５２２４４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−７８７８９（Ｐ２００６−７８７８９）
【出願日】平成１８年３月２２日（２００６．３．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１１月１７日 社団法人日本生物工学会主催の「平成１７年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２２日（２００６．３．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年１１月１７日 社団法人日本生物工学会主催の「平成１７年度日本生物工学会大会」において文書をもって発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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