微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法
【課題】 食品中の微生物数を迅速かつ高精度で測定するために、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法を提供すること。
【解決手段】 食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料を、下記（１）〜（５）の工程により前処理する。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【解決手段】 食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料を、下記（１）〜（５）の工程により前処理する。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の微生物数を迅速に測定する際に、 精度の高い測定値を得るための食品試料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生法に基づく成分規格は、「食品、添加物等の規格基準」として食品別に定められ、それぞれに菌数 (生菌総数、大腸菌群、大腸菌、乳酸菌、芽胞菌、腸球菌、緑膿菌、食中毒菌など) の上限が定められている。また、成分規格以外の製造基準、調理基準、保存基準、加工基準などにも同様に微生物数の規格が定められている。これら微生物数の規格のうち、生菌総数は一般生菌数とも呼ばれ、国際的に広く支持されている。
生菌総数の測定法は、一般的には、平板法と呼ばれる、標準寒天培地を用いて３５℃、４８〜７２時間、有酸素 (好気性) の条件で培養して得られる微生物の総集落数をもって把握する方法が用いられている。
しかし、この方法は、微生物の増殖をモニターする試験であるため、検査に要する時間が長く、惣菜などの腐敗し易く、製造直後に出荷する食品については、汚染が発生した場合に迅速な対応が取れないと言う欠点があった。
【０００３】
そのような背景から、平板法に替わる、 一般生菌数の迅速測定法が多方面より提案されている。例えば、微生物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の発光量（相対発光量：Relative Light Unit, RLU）をルミノメータにて測定し、これから微生物数を算出するＡＴＰ法が知られている。しかしながら、ＡＴＰは微生物中のみならず、食材中にも大量に含有されているので、通常のＡＴＰ法では、食材中のＡＴＰを除去する前処理を行わない限り、バックグラウンド値が高すぎて実用的ではないという欠点があった。
【０００４】
そこで、ＡＴＰ法において食材中のＡＴＰをＡＴＰ分解酵素によって除去してから、細菌細胞膜を溶解して菌体内ＡＴＰを溶出させ、ホタルルシフェラーゼによってＡＴＰの発光反応を行うという方法も提案されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法でＡＴＰの消去操作を行ってもなお、ＡＴＰ測定値のバックグラウンド値が１０3 ＲＬＵ以上の高い値を示すことが多く、実用的には問題点が多かった。
【非特許文献１】ルシフェールＨＳセット（キッコーマン株式会社製）パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような従来の実状に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、食品中の微生物数を迅速かつ高精度で測定するために、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法について研究を重ねた結果、 食品試料を、多段階の特定の孔径を有するフィルタを通過せしめることにより、食材由来の可溶性成分、あるいは細菌よりも小さな夾雑物、および細菌よりも大きな夾雑物を除去することができ、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、「食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、下記（１）〜（５）の工程を有することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法」を提供するものである。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明を適用することで、迅速かつ高精度に食品中の一般生菌数を把握することが可能となる。この事により、食品の衛生状態の検査時間が飛躍的に短縮され、これまで生鮮食品をいち早く出荷したいとする当該業界の要望に応えることができ、高い衛生状態の食品を消費者に確実に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法を、その好ましい実施形態に基づいて説明する。
本発明において微生物数の測定対象の食品としては、その種類が制限されるものではないが、本発明で前処理される食品試料は、液状である必要がある。固形食品においては、該食品試料として、例えば、固形食品に滅菌蒸留水などを添加した後、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）やホモジナイザーなどでホモジナイズした懸濁液を調製する。該懸濁液中の固形物濃度は、１〜５０質量％程度とするとよく、より好ましくは５〜２０質量％である。
液状食品においては、そのまま上記食品試料として用いてもよく、必要に応じて適宜希釈して用いてもよい。
【００１０】
上記の液状の食品試料を上記の工程（１）、工程（２）および工程（３）の３段階の工程により濾過する。
上記工程（１）で用いられるフィルタは、孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであり、上記工程（２）で用いられるフィルタは、孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであり、上記工程（３）で用いられるフィルタは、孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタである。
これらの多孔性フィルムの材質は特に制限されないが、厚みは、好ましくは６μｍ〜１１μｍである。
斯かる多孔性フィルムからなるフィルタとしては、市販のトラックエッチドメンブレンフィルタ（以下、ＴＥフィルタと称する）を用いることができ、例えば、日本ミリポア社製のアイソポア（登録商標）ＴＥフィルタを好適に用いることができる。
濾過方法としては、加圧法、吸引法、遠心濾過法などが用いられるが、特に制限はない。
【００１１】
上記の工程（２）および工程（３）により得られる残渣には、微生物由来の成分のみが含まれているので、各種迅速測定法の測定試料として供することによって、平板培養法で測定したときとほぼ同じ、精度の高い測定値を得ることができる。
上記工程（４）における上記残渣の回収は、フィルタ上の残渣に微生物溶解液を注入し、微生物中のＡＴＰを溶出させ、ＡＴＰ抽出液として残渣を回収することが好ましい。
【００１２】
本発明の方法により前処理された食品試料を適用できる迅速測定法に特に制限はなく、ＡＴＰ法や微生物を蛍光標識する原理による方法を好適に適用することができ、例えばＡＴＰ法の場合、常法どおり、ルシフェラーゼとルシフェリンなどの発光試薬を添加し、ルミノメータでＡＴＰ発光量を測定すればよい。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実施形態が可能であり、本発明は本明細書および図面に開示の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。
【００１４】
実施例１〜６（複数のＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法による生菌数判別評価）
ほうれん草白和え１０ｇに９０ｍｌの０．１％ペプトン水を加え、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）により処理し、１０％懸濁液を調製した。該懸濁液を、４℃で表１に示す期間保管し、 微生物を増殖せしめたものを試料液として用いた。各試料液を滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、 この希釈液１０ｍｌを孔径３μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) TSTPフィルタ）に通し、 その濾過液全量を孔径１．２μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) RTTPフィルタ）に通した。さらにその濾過液全量を孔径０．２μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) GTTPフィルタ）に通した。これらのＴＥフィルタによる濾過方法は加圧法による。
上記試料液を通した孔径１．２μｍのＴＥフィルタおよび孔径０．２μｍのＴＥフィルタの上部にルシフェール250 プラスキット（キッコーマン株式会杜製) のＡＴＰ消去酵素液１ｍｌを無加圧で注入し、３０分間室温で処理した後、上部より注射筒で空気を送り込みＡＴＰ消去酵素液を除去した。次に、同様の操作で上記キット付属のＡＴＰ抽出液１ｍｌを上記ＴＥフィルタの上部に注入し、２０秒間攪拌処理後、同様に注射筒で空気を送り込みＡＴＰ抽出液を試験管に回収した。回収したＡＴＰ抽出液は、上記キット付属の発光試薬を用いルミテスターC-100 （キッコーマン株式会社製）にてＡＴＰ発光量を測定した。また、ＴＥフィルタに通す前の試料液の生菌数を平板培養法にて測定した。
これらの測定結果を表１に示す。また、それぞれの生菌数と発光量の相関を評価した結果を図１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この結果、複数のＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法を用いたＡＴＰ法の測定結果は、平板培養法で測定した生菌数との相関が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１〜６における生菌数とＡＴＰ発光量の相関を評価した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の微生物数を迅速に測定する際に、 精度の高い測定値を得るための食品試料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生法に基づく成分規格は、「食品、添加物等の規格基準」として食品別に定められ、それぞれに菌数 (生菌総数、大腸菌群、大腸菌、乳酸菌、芽胞菌、腸球菌、緑膿菌、食中毒菌など) の上限が定められている。また、成分規格以外の製造基準、調理基準、保存基準、加工基準などにも同様に微生物数の規格が定められている。これら微生物数の規格のうち、生菌総数は一般生菌数とも呼ばれ、国際的に広く支持されている。
生菌総数の測定法は、一般的には、平板法と呼ばれる、標準寒天培地を用いて３５℃、４８〜７２時間、有酸素 (好気性) の条件で培養して得られる微生物の総集落数をもって把握する方法が用いられている。
しかし、この方法は、微生物の増殖をモニターする試験であるため、検査に要する時間が長く、惣菜などの腐敗し易く、製造直後に出荷する食品については、汚染が発生した場合に迅速な対応が取れないと言う欠点があった。
【０００３】
そのような背景から、平板法に替わる、 一般生菌数の迅速測定法が多方面より提案されている。例えば、微生物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の発光量（相対発光量：Relative Light Unit, RLU）をルミノメータにて測定し、これから微生物数を算出するＡＴＰ法が知られている。しかしながら、ＡＴＰは微生物中のみならず、食材中にも大量に含有されているので、通常のＡＴＰ法では、食材中のＡＴＰを除去する前処理を行わない限り、バックグラウンド値が高すぎて実用的ではないという欠点があった。
【０００４】
そこで、ＡＴＰ法において食材中のＡＴＰをＡＴＰ分解酵素によって除去してから、細菌細胞膜を溶解して菌体内ＡＴＰを溶出させ、ホタルルシフェラーゼによってＡＴＰの発光反応を行うという方法も提案されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法でＡＴＰの消去操作を行ってもなお、ＡＴＰ測定値のバックグラウンド値が１０3 ＲＬＵ以上の高い値を示すことが多く、実用的には問題点が多かった。
【非特許文献１】ルシフェールＨＳセット（キッコーマン株式会社製）パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような従来の実状に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、食品中の微生物数を迅速かつ高精度で測定するために、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法について研究を重ねた結果、 食品試料を、多段階の特定の孔径を有するフィルタを通過せしめることにより、食材由来の可溶性成分、あるいは細菌よりも小さな夾雑物、および細菌よりも大きな夾雑物を除去することができ、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、「食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、下記（１）〜（５）の工程を有することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法」を提供するものである。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明を適用することで、迅速かつ高精度に食品中の一般生菌数を把握することが可能となる。この事により、食品の衛生状態の検査時間が飛躍的に短縮され、これまで生鮮食品をいち早く出荷したいとする当該業界の要望に応えることができ、高い衛生状態の食品を消費者に確実に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法を、その好ましい実施形態に基づいて説明する。
本発明において微生物数の測定対象の食品としては、その種類が制限されるものではないが、本発明で前処理される食品試料は、液状である必要がある。固形食品においては、該食品試料として、例えば、固形食品に滅菌蒸留水などを添加した後、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）やホモジナイザーなどでホモジナイズした懸濁液を調製する。該懸濁液中の固形物濃度は、１〜５０質量％程度とするとよく、より好ましくは５〜２０質量％である。
液状食品においては、そのまま上記食品試料として用いてもよく、必要に応じて適宜希釈して用いてもよい。
【００１０】
上記の液状の食品試料を上記の工程（１）、工程（２）および工程（３）の３段階の工程により濾過する。
上記工程（１）で用いられるフィルタは、孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであり、上記工程（２）で用いられるフィルタは、孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであり、上記工程（３）で用いられるフィルタは、孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタである。
これらの多孔性フィルムの材質は特に制限されないが、厚みは、好ましくは６μｍ〜１１μｍである。
斯かる多孔性フィルムからなるフィルタとしては、市販のトラックエッチドメンブレンフィルタ（以下、ＴＥフィルタと称する）を用いることができ、例えば、日本ミリポア社製のアイソポア（登録商標）ＴＥフィルタを好適に用いることができる。
濾過方法としては、加圧法、吸引法、遠心濾過法などが用いられるが、特に制限はない。
【００１１】
上記の工程（２）および工程（３）により得られる残渣には、微生物由来の成分のみが含まれているので、各種迅速測定法の測定試料として供することによって、平板培養法で測定したときとほぼ同じ、精度の高い測定値を得ることができる。
上記工程（４）における上記残渣の回収は、フィルタ上の残渣に微生物溶解液を注入し、微生物中のＡＴＰを溶出させ、ＡＴＰ抽出液として残渣を回収することが好ましい。
【００１２】
本発明の方法により前処理された食品試料を適用できる迅速測定法に特に制限はなく、ＡＴＰ法や微生物を蛍光標識する原理による方法を好適に適用することができ、例えばＡＴＰ法の場合、常法どおり、ルシフェラーゼとルシフェリンなどの発光試薬を添加し、ルミノメータでＡＴＰ発光量を測定すればよい。
【実施例】
【００１３】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実施形態が可能であり、本発明は本明細書および図面に開示の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。
【００１４】
実施例１〜６（複数のＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法による生菌数判別評価）
ほうれん草白和え１０ｇに９０ｍｌの０．１％ペプトン水を加え、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）により処理し、１０％懸濁液を調製した。該懸濁液を、４℃で表１に示す期間保管し、 微生物を増殖せしめたものを試料液として用いた。各試料液を滅菌蒸留水で１０倍に希釈し、 この希釈液１０ｍｌを孔径３μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) TSTPフィルタ）に通し、 その濾過液全量を孔径１．２μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) RTTPフィルタ）に通した。さらにその濾過液全量を孔径０．２μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) GTTPフィルタ）に通した。これらのＴＥフィルタによる濾過方法は加圧法による。
上記試料液を通した孔径１．２μｍのＴＥフィルタおよび孔径０．２μｍのＴＥフィルタの上部にルシフェール250 プラスキット（キッコーマン株式会杜製) のＡＴＰ消去酵素液１ｍｌを無加圧で注入し、３０分間室温で処理した後、上部より注射筒で空気を送り込みＡＴＰ消去酵素液を除去した。次に、同様の操作で上記キット付属のＡＴＰ抽出液１ｍｌを上記ＴＥフィルタの上部に注入し、２０秒間攪拌処理後、同様に注射筒で空気を送り込みＡＴＰ抽出液を試験管に回収した。回収したＡＴＰ抽出液は、上記キット付属の発光試薬を用いルミテスターC-100 （キッコーマン株式会社製）にてＡＴＰ発光量を測定した。また、ＴＥフィルタに通す前の試料液の生菌数を平板培養法にて測定した。
これらの測定結果を表１に示す。また、それぞれの生菌数と発光量の相関を評価した結果を図１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この結果、複数のＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法を用いたＡＴＰ法の測定結果は、平板培養法で測定した生菌数との相関が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１〜６における生菌数とＡＴＰ発光量の相関を評価した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、下記（１）〜（５）の工程を有することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【請求項２】
微生物数の迅速測定方法が、ＡＴＰ法である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
上記工程（４）において、フィルタ上の残渣に微生物溶解液を注入し、微生物中のＡＴＰを溶出させ、ＡＴＰ抽出液として残渣を回収する、請求項１または２に記載の前処理方法。
【請求項１】
食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、下記（１）〜（５）の工程を有することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法。
（１）液状の食品試料を孔径３．０μｍ〜５．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（２）上記工程（１）で得られる濾過液を孔径０．８μｍ〜２．０μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（３）上記工程（２）で得られる濾過液を孔径０．２μｍ〜０．６μｍの多孔性フィルムからなるフィルタに通す工程
（４）上記工程（２）および（３）で得られる残渣を回収する工程
（５）上記工程（４）で回収した残渣を食品試料として迅速測定に供する工程
【請求項２】
微生物数の迅速測定方法が、ＡＴＰ法である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
上記工程（４）において、フィルタ上の残渣に微生物溶解液を注入し、微生物中のＡＴＰを溶出させ、ＡＴＰ抽出液として残渣を回収する、請求項１または２に記載の前処理方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１４２５６（Ｐ２００７−１４２５６Ａ）
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９８４１６（Ｐ２００５−１９８４１６）
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（０００２２６９９８）株式会社日清製粉グループ本社 (125)
【出願人】（５０５２５７５７８）日本微生物クリニック株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月２５日（２００７．１．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（０００２２６９９８）株式会社日清製粉グループ本社 (125)
【出願人】（５０５２５７５７８）日本微生物クリニック株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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