微生物検出培地
【課題】ポリフェノール類を含有する試料であっても、微生物を精度良く検出できる手段を提供する。
【解決手段】ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地。
【解決手段】ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテキン等のポリフェノール類を含有する試料中の微生物を正確に検出することができる培地及び微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、食品や飲料の衛生管理のために種々の微生物検査が行われており、当該微生物検査には、微生物検出培地が広く用いられている。
近年、カテキン等のポリフェノール類が体脂肪の増加抑制効果や血中コレステロール低下効果等の生理活性を有することが明らかになり、緑茶飲料やカテキン含有食品等が注目され、広く使用されている。
【非特許文献１】Kansenshogaku Zasshi. 1994 Dec;68(12):1518-22.
【非特許文献２】Nippon Saikingaku Zasshi. 1991 Sep;46(5):839-45. Japanese
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
カテキン等のポリフェノール類には微生物の発育阻止活性を有する（非特許文献１、２）ことから、ポリフェノール類を含有する試料からの微生物の検出感度が低下するという問題があった。
従って、本発明の目的は、ポリフェノール類を含有する試料であっても、微生物を精度良く検出できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、培地成分について種々検討したところ、全く意外にも、ポリフェノールオキシダーゼを培地に加えることにより、ポリフェノール類を含有する試料から微生物を精度良く検出できることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地を提供するものである。
また本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを含有する培地に、ポリフェノール類含有試料を接種して培養することを特徴とするポリフェノール類含有試料からの微生物の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の微生物検出培地を用いれば、ポリフェノール類を多量含有する飲料や食品を試料とした場合であっても、当該試料中の微生物を精度良く検出できる。従って、ポリフェノール類の存在により、微生物陰性とされていた飲料や食品の微生物汚染を未然に正確に把握でき、本発明方法は食品衛生管理上極めて重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の微生物検出培地はポリフェノールオキシダーゼを含有する。ポリフェノールオキシダーゼとしては、ポリフェノールを酸化する酵素であれば特に制限されないが培地成分の殺菌処理に耐える点から、耐熱性ポリフェノールオキシダーゼが好ましい。より具体的には、耐熱性ラッカーゼ、例えばラッカーゼダイワＹ１２０（大和化成（株））、特開２００６−１５８２５２号公報記載のサーマス属由来のラッカーゼ等が挙げられる。
【０００８】
ポリフェノールオキシダーゼの培地中の含有量は、微生物検出の精度の点から、使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上、さらには８０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上、特に１００，０００ＰＯＵ／Ｌ以上が好ましい。含有量の上限は特に制限されないが１，０００，０００ＰＯＵ／Ｌが好ましい。ここで、ＰＯＵはポリフェノールオキシダーゼの力価であり、４−アミノアンチピリンとフェノールにpH４．５、３０℃で作用するとき、ポリフェノールオキシダーゼが触媒する酸化縮合反応により生成するキノンイミン色素の５０５nmにおける吸光度を反応初期１分間に０．１増加させるのに必要な酵素量を１ＰＯＵとする。本発明において、使用時の濃度とは、被検試料添加後の濃度である。例えば、培地が乾燥培地の場合、乾燥培地に被検試料液を添加した後の濃度である。
【０００９】
本発明の培地には、ポリフェノールオキシダーゼ以外に、微生物栄養成分、無機塩類、糖類、pH調整剤、抗生物質等の他、特定の微生物特有の検出試薬を配合することができる。微生物栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。
【００１０】
ここで無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。また、他の無機塩類は、胆汁末、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。糖類としては、単糖類及びオリゴ糖類が使用でき、例えばラクトース、シュークロース(白糖)、キシロース、セロビオース、マルトース等が挙げられる。
【００１１】
微生物特有の検出試薬としては、一般生菌数であれば２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライドなどのテトラゾリウム塩、大腸菌群であれば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）などのβ−ガラクトシダーゼの基質となりうる色原体化合物等のように特定の微生物が特有に保有する酵素の基質となりうる色原体化合物等、色素、pH指示薬等が挙げられる。
【００１２】
本発明培地の形態は特に限定されず、通常の寒天培地の他、シート状簡易培地（特開昭５７−５０２２００号、特開平６−１８１７４１号及び例えばメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開平９−１９２８２号、特開２０００−３２５０７２））とすることもできる。
【００１３】
本発明培地の測定対象としては、緑茶飲料、カテキン含有食品等のポリフェノール類を含有する食品、飲料等のポリフェノール類含有試料が挙げられる。また、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液やこれを増菌用培地で培養した培養液も試料とすることができる。ここでポリフェノール類とは、カテキン、フラボノール、イソフラボン、タンニン、ケルセチン、アントシアニン等を含む総称である。
【００１４】
本発明培地を用いて微生物を検出するには、ポリフェノール含有試料を培地に接種して培養し、コロニーの着色、蛍光等の特性を観察することにより行われる。培養は通常２５〜３５℃で２４〜７２時間行うのが好ましい。ここで、コロニーの検出は、前記微生物特有の検出、試薬により色などが相違する。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
（１）培地の作製
標準寒天培地（ＳＰＣ）（ペプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ブドウ糖１ｇ、寒天１５ｇ：日水製薬社製）１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間、高圧蒸気滅菌する。これを２本作製した。滅菌後培地を５０℃に保温し、一方のＳＰＣにはろ過滅菌したラッカーゼ（ラッカーゼダイワＹ１２０）を１０８，０００ＰＯＵ／Ｌになるように加え酵素加標準寒天培地（ＥＳＰＣ）とした。
但し、１ＰＯＵは４−アミノアンチピリンとフェノールにpH４．５、３０℃で作用するとき、ラッカーゼが触媒する酸化縮合反応により生成するキノンイミン色素の５０５nmにおける吸光度を反応初期１分間に０．１増加させるのに必要な酵素量とする。
【００１７】
（２）希釈液の作製
カテキン含有緑茶飲料を無菌的に９mLずつ、滅菌試験管に分注した。対照として、９mLの滅菌生理食塩水を準備した。
【００１８】
（３）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水及びカテキン含有緑茶飲料で１０-1〜１０-8まで希釈した。希釈したそれぞれの菌液を滅菌空シャーレに１mLずつ接種し、予め滅菌保温したＳＰＣ及びＥＳＰＣそれぞれにて混釈培養を行った。３５℃、４８時間培養後、発育したコロニー数を計測した。
【００１９】
結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
ＳＰＣにおいては緑茶飲料で希釈した場合、カテキンの抗菌作用により菌数が滅菌生理食塩水で希釈した菌数より少なくなっている。一方、本発明培地（ＥＳＰＣ）においてはカテキンの抗菌作用を中和する事から緑茶飲料と滅菌生理食塩水でほぼ同等の菌数となっている。
【００２２】
実施例２
（１）培地の作製
標準寒天培地（ＳＰＣ）（ペプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ブドウ糖１ｇ、寒天１５ｇ：日水製薬社製）１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間、高圧蒸気滅菌する。滅菌後培地を５０℃に保温し、これにろ過滅菌したラッカーゼを１０８，０００ＰＯＵ／Ｌ（１ｇ／Ｌ）、１０，８００ＰＯＵ／Ｌ（０．１ｇ／Ｌ）、１，０８０ＰＯＵ／Ｌ（０．０１ｇ／Ｌ）、０ ＰＯＵ／Ｌ（０ｇ／Ｌ）になるようにそれぞれ加え使用した。
（２）希釈液の作製
カテキン含有緑茶飲料を無菌的に９mLずつ、滅菌試験管に分注した。対照として、９mLの滅菌生理食塩水を準備した。
（３）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水及びカテキン含有緑茶飲料で１０-1〜１０-8まで希釈した。希釈したそれぞれの菌液を滅菌空シャーレに１mLずつ接種し、予め滅菌保温したそれぞれの培地にて混釈培養を行った。３５℃、４８時間培養後、発育したコロニー数を計測した。
結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】
標準寒天培地に加え混釈培養するとき、酵素濃度は１０，８００ＰＯＵ／Ｌ以上で良く、１０８，０００ＰＯＵ／Ｌ（１ｇ／Ｌ）以上添加することがより好ましいことがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カテキン等のポリフェノール類を含有する試料中の微生物を正確に検出することができる培地及び微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、食品や飲料の衛生管理のために種々の微生物検査が行われており、当該微生物検査には、微生物検出培地が広く用いられている。
近年、カテキン等のポリフェノール類が体脂肪の増加抑制効果や血中コレステロール低下効果等の生理活性を有することが明らかになり、緑茶飲料やカテキン含有食品等が注目され、広く使用されている。
【非特許文献１】Kansenshogaku Zasshi. 1994 Dec;68(12):1518-22.
【非特許文献２】Nippon Saikingaku Zasshi. 1991 Sep;46(5):839-45. Japanese
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
カテキン等のポリフェノール類には微生物の発育阻止活性を有する（非特許文献１、２）ことから、ポリフェノール類を含有する試料からの微生物の検出感度が低下するという問題があった。
従って、本発明の目的は、ポリフェノール類を含有する試料であっても、微生物を精度良く検出できる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで本発明者は、培地成分について種々検討したところ、全く意外にも、ポリフェノールオキシダーゼを培地に加えることにより、ポリフェノール類を含有する試料から微生物を精度良く検出できることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地を提供するものである。
また本発明は、ポリフェノールオキシダーゼを含有する培地に、ポリフェノール類含有試料を接種して培養することを特徴とするポリフェノール類含有試料からの微生物の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の微生物検出培地を用いれば、ポリフェノール類を多量含有する飲料や食品を試料とした場合であっても、当該試料中の微生物を精度良く検出できる。従って、ポリフェノール類の存在により、微生物陰性とされていた飲料や食品の微生物汚染を未然に正確に把握でき、本発明方法は食品衛生管理上極めて重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の微生物検出培地はポリフェノールオキシダーゼを含有する。ポリフェノールオキシダーゼとしては、ポリフェノールを酸化する酵素であれば特に制限されないが培地成分の殺菌処理に耐える点から、耐熱性ポリフェノールオキシダーゼが好ましい。より具体的には、耐熱性ラッカーゼ、例えばラッカーゼダイワＹ１２０（大和化成（株））、特開２００６−１５８２５２号公報記載のサーマス属由来のラッカーゼ等が挙げられる。
【０００８】
ポリフェノールオキシダーゼの培地中の含有量は、微生物検出の精度の点から、使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上、さらには８０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上、特に１００，０００ＰＯＵ／Ｌ以上が好ましい。含有量の上限は特に制限されないが１，０００，０００ＰＯＵ／Ｌが好ましい。ここで、ＰＯＵはポリフェノールオキシダーゼの力価であり、４−アミノアンチピリンとフェノールにpH４．５、３０℃で作用するとき、ポリフェノールオキシダーゼが触媒する酸化縮合反応により生成するキノンイミン色素の５０５nmにおける吸光度を反応初期１分間に０．１増加させるのに必要な酵素量を１ＰＯＵとする。本発明において、使用時の濃度とは、被検試料添加後の濃度である。例えば、培地が乾燥培地の場合、乾燥培地に被検試料液を添加した後の濃度である。
【０００９】
本発明の培地には、ポリフェノールオキシダーゼ以外に、微生物栄養成分、無機塩類、糖類、pH調整剤、抗生物質等の他、特定の微生物特有の検出試薬を配合することができる。微生物栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。
【００１０】
ここで無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。また、他の無機塩類は、胆汁末、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。糖類としては、単糖類及びオリゴ糖類が使用でき、例えばラクトース、シュークロース(白糖)、キシロース、セロビオース、マルトース等が挙げられる。
【００１１】
微生物特有の検出試薬としては、一般生菌数であれば２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライドなどのテトラゾリウム塩、大腸菌群であれば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）などのβ−ガラクトシダーゼの基質となりうる色原体化合物等のように特定の微生物が特有に保有する酵素の基質となりうる色原体化合物等、色素、pH指示薬等が挙げられる。
【００１２】
本発明培地の形態は特に限定されず、通常の寒天培地の他、シート状簡易培地（特開昭５７−５０２２００号、特開平６−１８１７４１号及び例えばメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開平９−１９２８２号、特開２０００−３２５０７２））とすることもできる。
【００１３】
本発明培地の測定対象としては、緑茶飲料、カテキン含有食品等のポリフェノール類を含有する食品、飲料等のポリフェノール類含有試料が挙げられる。また、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液やこれを増菌用培地で培養した培養液も試料とすることができる。ここでポリフェノール類とは、カテキン、フラボノール、イソフラボン、タンニン、ケルセチン、アントシアニン等を含む総称である。
【００１４】
本発明培地を用いて微生物を検出するには、ポリフェノール含有試料を培地に接種して培養し、コロニーの着色、蛍光等の特性を観察することにより行われる。培養は通常２５〜３５℃で２４〜７２時間行うのが好ましい。ここで、コロニーの検出は、前記微生物特有の検出、試薬により色などが相違する。
【実施例】
【００１５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
（１）培地の作製
標準寒天培地（ＳＰＣ）（ペプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ブドウ糖１ｇ、寒天１５ｇ：日水製薬社製）１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間、高圧蒸気滅菌する。これを２本作製した。滅菌後培地を５０℃に保温し、一方のＳＰＣにはろ過滅菌したラッカーゼ（ラッカーゼダイワＹ１２０）を１０８，０００ＰＯＵ／Ｌになるように加え酵素加標準寒天培地（ＥＳＰＣ）とした。
但し、１ＰＯＵは４−アミノアンチピリンとフェノールにpH４．５、３０℃で作用するとき、ラッカーゼが触媒する酸化縮合反応により生成するキノンイミン色素の５０５nmにおける吸光度を反応初期１分間に０．１増加させるのに必要な酵素量とする。
【００１７】
（２）希釈液の作製
カテキン含有緑茶飲料を無菌的に９mLずつ、滅菌試験管に分注した。対照として、９mLの滅菌生理食塩水を準備した。
【００１８】
（３）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水及びカテキン含有緑茶飲料で１０-1〜１０-8まで希釈した。希釈したそれぞれの菌液を滅菌空シャーレに１mLずつ接種し、予め滅菌保温したＳＰＣ及びＥＳＰＣそれぞれにて混釈培養を行った。３５℃、４８時間培養後、発育したコロニー数を計測した。
【００１９】
結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
ＳＰＣにおいては緑茶飲料で希釈した場合、カテキンの抗菌作用により菌数が滅菌生理食塩水で希釈した菌数より少なくなっている。一方、本発明培地（ＥＳＰＣ）においてはカテキンの抗菌作用を中和する事から緑茶飲料と滅菌生理食塩水でほぼ同等の菌数となっている。
【００２２】
実施例２
（１）培地の作製
標準寒天培地（ＳＰＣ）（ペプトン５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、ブドウ糖１ｇ、寒天１５ｇ：日水製薬社製）１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間、高圧蒸気滅菌する。滅菌後培地を５０℃に保温し、これにろ過滅菌したラッカーゼを１０８，０００ＰＯＵ／Ｌ（１ｇ／Ｌ）、１０，８００ＰＯＵ／Ｌ（０．１ｇ／Ｌ）、１，０８０ＰＯＵ／Ｌ（０．０１ｇ／Ｌ）、０ ＰＯＵ／Ｌ（０ｇ／Ｌ）になるようにそれぞれ加え使用した。
（２）希釈液の作製
カテキン含有緑茶飲料を無菌的に９mLずつ、滅菌試験管に分注した。対照として、９mLの滅菌生理食塩水を準備した。
（３）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを用い、これを滅菌生理食塩水及びカテキン含有緑茶飲料で１０-1〜１０-8まで希釈した。希釈したそれぞれの菌液を滅菌空シャーレに１mLずつ接種し、予め滅菌保温したそれぞれの培地にて混釈培養を行った。３５℃、４８時間培養後、発育したコロニー数を計測した。
結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】
標準寒天培地に加え混釈培養するとき、酵素濃度は１０，８００ＰＯＵ／Ｌ以上で良く、１０８，０００ＰＯＵ／Ｌ（１ｇ／Ｌ）以上添加することがより好ましいことがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地。
【請求項２】
ポリフェノールオキシダーゼ含有量が使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上である請求項１記載の培地。
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼを含有する培地に、ポリフェノール類含有試料を接種して培養することを特徴とするポリフェノール類含有試料からの微生物の検出方法。
【請求項４】
培地中のポリフェノールオキシダーゼ含有量が使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上である請求項３記載の検出方法。
【請求項１】
ポリフェノールオキシダーゼを含有することを特徴とする、ポリフェノール類含有試料用微生物検出培地。
【請求項２】
ポリフェノールオキシダーゼ含有量が使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上である請求項１記載の培地。
【請求項３】
ポリフェノールオキシダーゼを含有する培地に、ポリフェノール類含有試料を接種して培養することを特徴とするポリフェノール類含有試料からの微生物の検出方法。
【請求項４】
培地中のポリフェノールオキシダーゼ含有量が使用時の濃度として５０，０００ＰＯＵ／Ｌ以上である請求項３記載の検出方法。
【公開番号】特開２００８−１３１８９６（Ｐ２００８−１３１８９６Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３２０５９７（Ｐ２００６−３２０５９７）
【出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【出願人】（０００２２６８６２）日水製薬株式会社 (35)
【Ｆターム（参考）】
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