微生物細胞壁の透過性を増大させるための組成物および膜上で前記微生物を検出するための方法
【課題】微生物細胞壁を透過性にするための組成物を提供すること。
【解決手段】この組成物がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む。本発明はまた、標的化方式で膜上の微生物を計数および検出するために前記組成物を使用する方法にも関する。本発明はまた、前記方法を実行するために適したキットおよびプローブにも関する。
【解決手段】この組成物がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む。本発明はまた、標的化方式で膜上の微生物を計数および検出するために前記組成物を使用する方法にも関する。本発明はまた、前記方法を実行するために適したキットおよびプローブにも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞壁の透過性を増大させるための新規な組成物およびこれらの使用に関し、特に、液体または気体の媒質中での微生物の計数および／または標的識別のための方法におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は食品または医薬品用の製造ライン中に含まれる液体および気体の媒質の微生物学的品質の管理に適合する。
【背景技術】
【０００３】
この分野では、検出対象となる微生物はしばしば極めて少数で存在し、これらが人間の健康に危険を与えるか否かを判定するために微生物の性質を見分けることが望ましい。実行される管理は製品のどのような汚染も短時間のうちに警告し、適切であれば製造を中止して汚染除去工程を取り入れることを可能にしなければならない。
【０００４】
微生物の培養時間を最短にする一方で同時に、或る種の微生物を検索することを可能にするための多くの方法が開発されてきた。
【０００５】
これは特に、国際公開第０１／５９１５７号パンフレットに述べられた、膜を通して液体を濾過した後に実行される微生物検出のための方法の主題である。この方法によると、液体サンプル中に含まれる微生物は液体を膜に通すことによって前記膜の表面に留められる。これらの微生物が、肉眼では見えない微小コロニーを形成するために必要な時間量で寒天培地と接触させて膜の表面で培養される。次いで、微小コロニーを形成した細胞はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および核酸内容物を放出するように溶解処理される。ＡＴＰはＡＴＰ生物発光によって、生細胞を識別および定量化するためのマーカーとして使用される。この検出法は、ＡＴＰがすべての生きた微生物に存在するマーカーであるという点で普遍的と称される。結果の読み取りは、前記ＡＴＰに特異的である酵素によるＡＴＰのフォトンへの変換を含む化学発光反応によって得られる。光信号は適切な映像インターフェース（例えばＬＣＤカメラ）を使用して検出される。得られた画像は、ペトリ皿上の寒天培地で実施される従来の計数と同様の方式で、微生物が増殖した膜上の部位をその場で可視化することを可能にする。
【０００６】
ミリポア社で販売されている「Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ ｒａｐｉｄ（登録商標）」システムが上述の原理で動作する。これはプラスチックの支持体に保持されている１つの同じ膜上で濾過および検出工程を実行するように設計された。この支持体は、濾過、微生物の培養、検出試薬による膜の含浸、および映像チャンバへの画像の取り込みに使用される様々な装置に取り付けられるように設計される。
【０００７】
この小型化されたシステムは従来式のペトリ皿での検査に比べて明らかな時間的利益を可能にする。さらに、これは得られた画像をデジタルサポートに保存することを可能にし、これは汚染をモニタすることを可能にする（トレーサビリティ）。
【０００８】
しかしながら、実用上、膜の表面に存在する微生物の計数が細胞の溶解後に実施されるという事実に起因してこのシステムは或る種の制限を有する。したがって、検出された微生物を正確に同定する目的で同じ膜を再使用することは困難である。
【０００９】
しかしながら、或る種の微生物の存在を実証するために、たとえ自然のヌクレオチドであっても他のＰＮＡ（ペプチド核酸）タイプであっても標識されたプローブを使用して特異的なハイブリッド形成を実施することが可能である。
【００１０】
ＰＮＡプローブは自然のペプチドであるという利点を有し、これは或る一定の用途で、オリゴヌクレオチドプローブに都合良く取って代わることを可能にする。
【００１１】
概して、インシツープローブハイブリッド形成は細胞の核酸への完全なアクセス可能性を必要とし、そうでなければこの操作は偽陰性を生じさせる。
【００１２】
国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットは、血液サンプルを汚染している微生物の存在を検出することを可能にする膜上での検出のシステムを述べている。
【００１３】
このシステムの特異性は、標識試薬の、細胞壁を貫通しての微生物内への透過を通じて微生物が検出されるという事実にある。使用される標識試薬は小分子、特に、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を挿入する化合物（例えばシアニン誘導体、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、または臭化エチジウム）であり、これは微生物内部への透過という点で見るとオリゴヌクレオチドプローブよりも少ない難度を有する。
【００１４】
試験対象となる液体サンプルは標識剤および細胞透過性付与試薬を含む透過性付与溶液中に希釈される。細胞がこの透過性付与溶液中でインキュベートされるが、この目的は存在する微生物内部への標識生成物の透過を容易にするために細胞壁の多孔度を高めることである。引き続いてこの透過性付与溶液は含んでいると見込まれる微生物を伴なって膜を通して濾過され、次いで、存在する微生物が膜上で保持され、標識剤を化合物と反応させることによって、および／または蛍光信号の放出を可能にする光源によって検出される。このシステムは検出の前に微生物を溶解しない、または少なくとも可能な限り溶解を制限するという利点を有する。
【００１５】
これは結果としてさらに良好な分解能を提供する検出につながる。
【００１６】
しかしながら、これらのマーカーは特異的ではないのでこのシステムは検出された微生物の性質を判定することを可能にしない。
【００１７】
さらに、そのようなシステムでは、微生物の取り扱いが溶液中で行われ、これはさらに複雑な特定の事前対応措置および機器を必要とする。濾過に先立つ溶液中での生細胞のインキュベーションが、膜上に固定される前に細胞が生育および分裂し続ける可能性があるという欠点を有することに留意すべきであり、これは検査の最終結果にある程度の不確実性を投げ掛ける。
【００１８】
特に、透過性付与剤に概して一層敏感であるグラム陽性細菌と一層耐性のあるグラム陰性細菌を同時に検出することが追求されるとき、国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットに述べられた方法に従って透過性付与試薬を透過性付与溶液中に適切に秤量することも困難である。
【００１９】
透過性付与溶液の組成物の作製に使用できる透過性付与剤は、通常、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、ノネンシン、ヘキサメタリン酸ナトリウムまたは塩化ベンザルコニウムである。
【００２０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用することも可能であり、これは細菌の細胞壁を、通常では細胞質細菌の中に透過しない抗生物質のような溶質に対して透過性にすると知られている弱塩基性でポリカチオン性の脂肪族ポリマーである（Ｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），１４３：３１９３〜３１９９）。
【００２１】
国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットに述べられたような透過性付与溶液中のポリエチレンイミンの濃度は概して１００μｇ／ｍｌ未満の濃度に限られる。大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌に最も適した濃度は約２０〜３０μｇ／ｍｌである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第０１／５９１５７号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０９０２号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），１４３：３１９３〜３１９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は上述された既にある膜検出システムの制限に対する解答を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
意外なことに、少なくとも１つのアルコール、特定すると第１級アルコール、さらに特定するとエタノールと組み合わせたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用すると微生物細胞壁を透過性にするためのさらに効果的な組成物を生成することに本発明者らは気付いた。そのような組成物は特に、場合によって標識されるヌクレオチドプローブのような巨大分子が微生物の中に透過する事態を生じさせる。
【００２６】
ＰＥＩおよび第１級アルコール、特にエタノールを含む組成物中でインキュベートされた微生物が先行技術による組成物中におけるよりも高いＰＥＩの濃度に耐えることが特に明らかになった。第１級アルコールとの組合せは特に、どのような著しい細胞溶解効果も生じさせることなく１００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌの間の濃度までＰＥＩを使用することを可能にする。
【００２７】
本発明では、「微生物」という用語はいずれかの（真核または原核）生細胞、単細胞生物、配偶子、または単層もしくは多層の細胞壁によって形成されたエンベロープ内に含まれた遺伝的形質を有するウィルスを意味する。
【００２８】
上記で規定されたような組成物は巨大分子が微生物の中に透過しながら一方で同時にこれらの細胞壁の破壊を制限することを可能にする。
【００２９】
巨大分子は多数の単純な分子の組合せから結果として生じる分子、例えばポリペプチド類、タンパク質類、糖タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、多糖類、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、抗体類、またはこれらの誘導体として規定される。
【００３０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はいくつかの形で入手可能な可溶性生成物である。モノマーから重合させられ、約７５０ｋＤａの分子量を有する形は本発明による好ましい形である（ＣＡＳ Ｎｏ．９００２−９８−６）。ＰＥＩは多くの分野で、特に様々な精製法において溶液中のタンパク質および核酸の凝集のための作用物質として使用される。細胞壁に存在するリン脂質を可逆的に破壊し、したがってこれら細胞壁を通常では細胞内への透過を許容されない作用物質に対して透過性にする特性を有するという事実に起因して透過性付与剤としても使用される。
【００３１】
したがって本発明の第１の主題は微生物細胞壁を透過性にするためのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコール、特定すると第１級アルコール、最も特定するとエタノールの組合せを含む組成物である。
【００３２】
この組成物はどのような界面活性剤も含まないことが好ましい。
【００３３】
透過性付与組成物の中のＰＥＩの濃度は１００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌの間、概して１００μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間、好ましくは１５０μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間、さらに好ましくは２００μｇ／ｍｌと８００μｇ／ｍｌの間であることが可能である。
【００３４】
本発明によれば、第１級アルコールは５％と９５％の間、好ましくは５％と５０％の間、さらに好ましくは１０％と５０％の間の濃度で透過性付与組成物の中に概して存在する。
【００３５】
本発明の他の主題は本発明による組成物の使用に関し、さらに特定すると、微生物の中への標識された巨大分子の透過で構成される工程を含む、膜上で微生物を検出するための方法に関する。
【００３６】
未だによく知られていない理由のために、ＰＥＩと第１級アルコール、特定するとエタノールの混合物はヌクレオチドプローブのような巨大分子の微生物の中への透過を容易にする。
【００３７】
本発明に従って好ましいヌクレオチドプローブは微生物のリボソームＲＮＡ、特定すると緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の１６Ｓ ＲＮＡまたは２３Ｓ ＲＮＡの特定のハイブリッド形成を可能にする。そのようなプローブは特に、配列番号１、配列番号２または配列番号３に相当する配列を有する。
【００３８】
これらのプローブが微生物に存在する或る種の核酸とハイブリッド形成可能であるとき、前記方法は液体または気体の媒質中に存在する微生物の（複数の）種類を検出することを可能にする。この方法は結果として、検出される微生物集団のさらに正確な写真が得られることにつながる。
【００３９】
巨大分子が抗原類または抗体類で構成されることおよびこれらが免疫タイプの検出に参画することを想定することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】気体状のサンプルが本発明の方法に従って試験されることが可能となる方式を示す図である。
【図２】実施例１で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示する図である。
【図３】実施例１に述べられる試験の結果を表わす図である。
【図４】図３に与えられた画像の三次元表現を示す図である。
【図５】実施例２で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示する図である。
【図６】実施例２に述べられる試験の結果を表わす図である。
【図７】図６に与えられた画像の三次元表現を示す図である。
【図８】実施例３で実施されるＡＴＰ生物発光によって微生物を検出するための方法の様々な工程を例示する図である。
【図９】実施例３ｂ）で実施される試験の結果を表わす図である。
【図１０】他の透過性付与溶液（９０％エタノール、および２５％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）について図９と同じ事物を表わす図である。
【図１１】図８に例示されたＡＴＰ生物発光手順の前状況で試験された各透過性付与溶液に関して測定された光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の主題はさらに特定すると、液体または気体の媒質中に最初に存在する微生物を膜上で計数および／または識別するための方法の中での上述のような透過性付与組成物の使用である。
【００４２】
本発明の或る特定の形態によると、本方法は以下の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）液体または気体の媒質が、この媒質中に存在する微生物を膜の上または中に留めるように膜を通して濾過される。
（ｂ）この膜および微生物が、ポリエチレンイミンと少なくとも１つのアルコールを含む上述されたような透過性付与組成物と接触させられる。
（ｃ）架橋剤によって細胞が膜に固定される。
（ｄ）微生物が、場合によって標識される１つまたは複数の、微生物細胞壁を横切ることが可能な巨大分子と接触させられる。
（ｅ）微生物の内部に透過した巨大分子が検出される。
【００４３】
本発明の方法によって標的にされる微生物はさらに特定すると、環境中で頻繁に遭遇する病原性の微生物であるシュードモナス属、エシェリキア属、レジオネラ属、サルモネラ属、リステリア属、バチルス属、ストレプトコッカス属、ビブリオ属、エルシニア属、ブドウ球菌属、マイコバクテリウム属、シゲラ属、クロストリジウム属、カンピロバクター属またはアエロモナス属のグラム陽性またはグラム陰性の病原性細菌、ジアルディア属、エントアメーバ属、クリプトスポリジウム属またはサイクロスポーラ属の原生動物、マイコプラズマ属またはウレアプラズマ属のマイコプラズマ、アスペルギルス属、カンジダ属またはペニシリウム属の真菌、およびＡ型肝炎およびＢ型肝炎ウィルスから選択される。
【００４４】
本方法は原理的に、シアノバクテリアのような単細胞の藻類、アメーバのような寄生生物の単細胞形、または線虫、吸虫、または回虫の卵、または花粉や精子といった他の植物や動物の配偶子の検出にも応用可能である。
【００４５】
本方法の目的は液体の媒質（例えば水）または気体の媒質（例えば空気）中に存在する微生物を計数しながらその一方で同時に、これらの識別（科、属、種など）を可能な限り判定することである。「液体または気体の媒質」という表現は、概して０．１ミクロンと１．５ミクロンの間、好ましくは０．１５ミクロンと０．８ミクロンの間、さらに好ましくは０．２ミクロンと０．６ミクロンの間の平均直径を備えた複数の孔を有する膜を通して圧力差を加えることによって濾過され得るどのような流体も意味するように意図される。このような流体は無菌製剤の製造に含まれる純粋の溶液類だけでなく複合溶液類（飲料水、血清、尿、羊水など）で、または場合によっては大気といった気体混合物で構成されることも可能である。
【００４６】
さらに、本方法は動物または患者に起源を発するサンプルの分析のために診断の分野での用途を有する。
【００４７】
本願明細書の中の「膜」という用語は２つの面を有する合成支持体を意味し、これらの面の複数の孔は知られている平均直径を有する。
【００４８】
本発明の背景で使用される膜は概して高い表面／体積比および好ましくは９０ミクロンと２００ミクロンの間で一定の厚さを示す。
【００４９】
このような膜は単層または多層の膜であることが可能である。概して、これはポリテトラフルオロエチレン、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース、およびニトロセルロースから選択される１つまたは複数の材料で構成される。
【００５０】
材料は、使用される溶剤、特に本方法の様々な工程で使用される可能性が高いアルコール類およびアルデヒド類と両立するように選択されることが望ましい。
【００５１】
上で微生物が検出される膜は主にＰＶＤＦ（ポリ（フッ化ビニリデン））またはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。これはミリポア社によって商標名Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ、および照会名ＨＶＷＰ（登録商標）またはＨＶＭＦＸ（登録商標）で販売されているようなタイプのＰＶＤＦ濾過膜であることがさらに好ましい。
【００５２】
本発明による方法の工程ａ）は分析対象となる液体または気体の媒質を、前記媒質中に含まれる微生物を上記で規定されたような膜の表面に留めるようにこの膜を通して濾過する工程で構成される。
【００５３】
いったんこれらの微生物が濾過されて膜上に保持されると、場合により加えられる、適切な培地と接触させて微生物を培養する工程で構成される工程が本方法の工程ａ）とｂ）の間に含まれることもあり得る。この培地は、濾過の後に膜が上に置かれる寒天培地であることが好ましい。場合によって加えられるこの工程は最初に濾過された各々の微生物のコロニーを得ることを可能にし、それにより、これらをさらに容易に検出することを可能にする。
【００５４】
本発明によると、これらの微生物は引き続いて工程ｂ）で本発明による透過性付与組成物中でインキュベートされる。
【００５５】
このインキュベーション工程は膜の表面で被膜を形成する少量の溶液で実施される。都合の良いことに、この透過性付与組成物は上に膜が置かれることになる固体の支持体、例えば含浸パッドの中に含まれることが可能であり、この支持体が膜の表面の液体のどのような考え得る移動も、したがって微生物の混ざり合いも制限する。これは５から２０分の間、２０℃と３５℃の間の温度で実施される。
【００５６】
本発明による方法は工程ｃ）を含むのでなおさら効果的であり、この工程によって細胞は架橋剤として働く作用物質により膜上に固定される。
【００５７】
この工程は膜によって構成される支持体の上に細胞を固定することを可能にする。本発明による好ましい架橋剤はグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択され、パラホルムアルデヒドは少なくとも６個のホルムアルデヒド単位から成る分子として定義される。都合の良いことに、この固定用組成物は上に膜が置かれることになる固体の支持体、例えば含浸パッドの中に含まれることが可能であり、この支持体が膜の表面の液体のどのような考え得る移動も、したがって微生物の混ざり合いも制限する。本発明によれば、この固定工程は５から２０分の間、２０℃と３５℃の間の温度で実施されることが好ましい。
【００５８】
この固定工程はまた、ＵＶ放射による膜上の微生物の照射によって実施されることも可能である。このとき、膜はＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。
【００５９】
微生物を、この微生物細胞壁を通り抜けて前記微生物の中に入る１つまたは複数の場合によっては標識される巨大分子との接触に至らせる工程を含む工程ｄ）はインキュベーションおよび固定の工程ｂ）およびｃ）それぞれの終わりに実施されることが好ましく、なぜならば微生物細胞壁が巨大分子に対して最も透過性であることが観察されたのがこの正確な場合であるからである。
【００６０】
本発明の好ましい形態によると、巨大分子は標識されてプローブとして使用される。
【００６１】
「プローブ」という用語はここでは微生物の特定の生物学的要素を認識して結合することが可能であり、したがってこれが可視化されることを可能にする巨大分子類を意味するように意図される。
【００６２】
本発明のさらに別の好ましい形態によると、プローブは微生物の中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッド形成し、前記核酸に関してある一定度の特異性を示すことが可能な巨大分子であることが可能である。このとき、核酸プローブに対してこの背景で基準が作成される。本発明は、核酸とハイブリッド形成を生じさせることが可能で当業者に知られているどのようなタイプの核酸プローブも想定しており、これらは例えば単純なオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡタイプのオリゴヌクレオチド、またはＰＮＡタイプのプローブ類（プリンおよびピリミジン塩基で置換されたポリペプチド鎖で構成されたプローブ類）（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７〜１５００）または欧州特許第１０１３６６１号明細書に述べられたようなＬＮＡタイプ（１つまたは複数の２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルモノマーを含むオリゴヌクレオチド）である。
【００６３】
本発明の好ましい態様によると、緑膿菌のような微生物の標的化された検出の目的で使用されるプローブ類は以下に示される配列、すなわち
５’−ＴＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＡＣＴＴＡＣＧＴＧＡＣＡＣＣ−３’［配列番号１］
５’−ＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡ−３’［配列番号２］
５’−ＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＡＣＴ−３’［配列番号３］
のうちの１つまたは複数を含む。
【００６４】
配列番号１、２および３の配列は緑膿菌の１６Ｓ ＲＮＡまたは２３Ｓ ＲＮＡにそれぞれ特異的で選択的にハイブリッド形成する特異性を有する。実際に本発明者らは、微生物のリボソームＲＮＡとハイブリッド形成することが可能なプローブ類が本発明を実施するために特に有用であることに気付いた。
【００６５】
したがって本発明の１つの態様は配列番号１または配列番号２に相当する配列、すなわち上記に示された配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の同一性を示す配列を有するプローブで構成される。そのようなプローブは特に、本発明による計数および／または識別の方法を遂行するために示される。本発明の別の態様によると、微生物の中に透過するように作られ、上述されたプローブ類と同じ性質である可能性の高い巨大分子は微生物中に含まれる核酸類の特異的な増幅で構成される追加的工程を遂行するためのプライマーとして使用される。そのような巨大分子が本発明による方法の中で使用されれば、追加的である、しかしそれでも場合によって行われる工程が本方法の中に工程ｄ）とｅ）の間で導入される。
【００６６】
そのような増幅工程は、検出の目的で利用可能な核酸の量を増加させることにより、微生物の最適な検出のために有用であることを示すことが可能である。この増幅工程が高度に特異的であれば、この工程はさらに選択性を備えて微生物を同定すること、したがって擬陽性の数を減少させることを可能にする。この増幅はＮＡＳＢＡタイプ（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５０：９１〜９２）またはＬＡＭＰ−ＰＣＲタイプ（Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），２８（１２）：ｅ６３）の増幅であることが好ましい。
【００６７】
上述されたプローブ類またはプライマー類は唯一またはいくつかの種類の微生物を検出するように設計されることが可能である。この点において、これらは微生物中に存在する複数の生物学的要素に関して異なる特異性の度合いを示す可能性が高い。例えば、これらのプライマー類またはプローブ類が、多数の種の微生物中にその配列が保持されている核酸とハイブリッド形成するように選択された核酸であれば、識別が極めて特異的であることはなく、他方でこれらの配列が少数の種に特異的な配列のみを見分けるように選択されれば、特異性はさらに大きくなる。
【００６８】
本発明のなおも別の特定の形態によれば、好都合には、前記微生物の核酸と核酸プローブまたはプライマーの特異的ハイブリッド形成で構成される工程は工程ｄ）よりも後、引き続く検出工程ｅ）よりも前に実行できる。
【００６９】
核酸プローブまたはプライマーのハイブリッド形成で構成されるこの工程は、当業者に知られている標準的なハイブリッド形成条件下で実行される。この工程は非特異的なハイブリッド形成を生じさせた核酸プローブまたはプライマーを除去するための洗浄工程を含むことも可能である。
【００７０】
検出の目的で、本発明による核酸プローブまたはプライマーは蛍光物質で標識されるか、または場合によっては化学発光反応を達成するために酵素に連結されることが好ましい。
【００７１】
微生物検出工程ｅ）は、プローブまたはプライマーの標識に対応して、化学発光反応に起源を発する光信号または蛍光によって得られる発光を適切なインターフェースで検出することによって実施される。
【００７２】
本発明のさらに好ましい態様によると、オリゴヌクレオチド類のような核酸プローブがペルオキシダーゼに連結される。ペルオキシダーゼがルミノール（ペルオキシダーゼの基質）と接触させられると、ペルオキシダーゼが後者を分解し、分解産物がフォトンを発してこれらがＭｉｌｌｉｆｌｅｘシステムの映像インターフェース（ＬＣＤカメラ）で検出される。
【００７３】
なおも別の態様によると、本発明はインヴィトロでの診断検査を実施するために上述されたような透過性付与組成物の使用で構成される。
【００７４】
インシツーでの検出を実施するために、ヒトまたは動物から得られた細胞または培地に維持された細胞の中に核酸プローブまたはいずれかの他の分子複合体を透過させるように本発明による透過性付与組成物の特定の特性を使用することを想定することが実際に可能である。
【００７５】
本発明による透過性付与組成物は医学分野での多くの用途、例えば、抗生物質または抗ウィルス剤などの活性成分に対して細胞または微生物を敏感にするために前記細胞または前記微生物細胞壁の透過性を高めるための薬物補助物質の用途を見出すことも可能である。
【００７６】
さらに特定すると、本発明による組成物は、特に遺伝病または或る種の癌の治療において或る種の遺伝子の発現を阻害することが意図される場合に、アンチセンス核酸、特にアンチセンスＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を細胞の中に透過させるために有用である。
【００７７】
本発明はまた、液体または気体の媒質中の微生物を検出および計数するためのキットであり、少なくとも
液体または気体の媒質を濾過するための膜、および
本発明に述べられるような透過性付与組成物、
を含むキットを範囲に入れるように意図される。
【００７８】
このキットに含まれる膜は主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。
【００７９】
都合の良いことに、このようなキットはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、およびパラホルムアルデヒドから選択される架橋剤を含む組成物も含む。この第２の組成物は微生物を膜上に固定することを可能にし、これは、本発明による方法を実施することによってさらに良好な分解能の検出を得ることを可能にする。
【００８０】
本発明によるキットは求める微生物の特異的な検出のためのプローブ、特に配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を有する上記で規定されたようなプローブを含むことも可能である。
【００８１】
以下の実施例の目的は本発明を具体的に示すことである。
【実施例１】
【００８２】
オリゴヌクレオチドプローブによる緑膿菌の特異的検出
実施される方法の複数の工程が図２に具体的に示される。
【００８３】
この方法の実施は最初に、照会名ＨＶＷＰ（登録商標）またはＨＶＭＦＸ（登録商標）でＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）の名称で販売されている装置を使用して１００ｍｌの溶液を濾過することにある。この装置は円形のプラスチック構造体上に保持されたＰＶＤＦタイプの濾過膜を有する。
【００８４】
濾過に続いて、この膜が寒天培地のカセットの上に置かれ、次いで、膜の表面に細菌の微小コロニーが成長することが可能となるように５時間３０分間、３５℃でインキュベートされる。
【００８５】
寒天培地のカセットから膜が分離され、次いで、透過性付与溶液（２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ）で含浸処理されたセルロースのパッドに接触されて大気温度に１０分間置かれる。
【００８６】
次いで、この膜は固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００８７】
引き続いて、上にこの膜が位置しているこのプラスチック構造体が、下側部分が密封されているハイブリッド形成カセットの上に嵌め込まれる。この膜が、２ｍｌの第１の予備ハイブリッド形成溶液（１０％ＰＥＧ、３００ｍＭのＮａＣｌ、３０％ホルムアミド、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．２％ＰＶＰ、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と接触させて３０分間、４５℃でハイブリッド形成カセットの中でインキュベートされる。第１の溶液が除去されると直ぐに、膜はダイズペルオキシダーゼに結合したオリゴヌクレオチドプローブ１００ｎＭを含む同じ量のハイブリッド形成溶液と接触させて６０分間、４５℃に置かれる。
【００８８】
緑膿菌の１６Ｓ ＲＮＡに特異的な使用されたオリゴヌクレオチドプローブは以下の配列（配列番号２）を有する。
５’−ＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡ−３’［配列番号２］
【００８９】
引き続き、膜がハイブリッド形成カセットから分離され、次いで、洗浄液１００ｍｌ（１０ｍＭのＣＡＰＳＯ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）と接触させて洗浄槽の中に置かれる。１０分間、４５℃で３回の洗浄が実施される。
【００９０】
この膜が乾燥処理され、次いで、生物発光試薬（ミリポア社カタログ＃ＷＢＫＬＳ０１００）が再構成の後に膜の表面に吹き付けられる。この装置がＭｉｌｌｉｆｌｅｘ Ｒａｐｉｄシステムの中に置かれ、光信号が記録される。
【００９１】
膜の表面での緑膿菌の検出の結果が図３に示されている。同じ分析に付随した三次元図が図４に示されており、ここでは各々の緑膿菌の膜局在性が明らかに見分けられる。
【実施例２】
【００９２】
ＰＮＡタイプのプローブによる緑膿菌の特異的検出
ａ）２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ透過性付与溶液の使用
実施される方法の複数の工程は図５に具体的に示される。
【００９３】
実施例１の手順に従って実施された濾過の後、膜は寒天培地のカセットの上に置かれ、６時間、３５℃でインキュベートされる。
【００９４】
寒天培地のカセットから膜が分離され、次いで、透過性付与溶液（２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００９５】
引き続いて、この装置は固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００９６】
実施例１のように、この膜はダイズペルオキシダーゼに結合したＰＮＡプローブ１００ｎＭを含む２ｍｌのハイブリッド形成溶液（１０％ＰＥＧ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３０％ホルムアミド、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．２％ＰＶＰ、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と接触させてハイブリッド形成カセットの上に置かれる。このアセンブリが６０分間、５０℃に置かれる。
【００９７】
使用されるＰＮＡプローブは実施例１のオリゴヌクレオチドプローブのように緑膿菌の同じ１６Ｓ ＲＮＡ配列とハイブリッド形成することが可能であり、配列配列番号３である。
【００９８】
支持体上の膜がハイブリッド形成カセットから分離され、次いで、洗浄液１００ｍｌ（１０ｍＭのＣＡＰＳＯ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）と接触されて洗浄槽の中に置かれる。１０分間、５０℃で３回の洗浄が実施される。
【００９９】
この膜が乾燥処理され、次いで、生物発光試薬（ミリポア社カタログ＃ＷＢＫＬＳ０１００）が再構成の後に膜の表面に吹き付けられる。最後に、この膜がＭｉｌｌｉｆｌｅｘ Ｒａｐｉｄシステムの画像解析装置の中に置かれ、ここで光信号が記録される。得られた画像が図６に示されている。同じ分析の三次元図が図７に示されている。
【０１００】
この方法は、濾過膜の表面における緑膿菌の存在を特異的に検出することを可能にする。
【０１０１】
ｂ）ＰＥＩ単独２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ単独５００μｇ／ｍｌ、または１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成される混合物（ＥｔｏＨ１０％−ＰＥＩ５００）を含む透過性付与溶液の使用
上記で述べられたものと同じ手順がＰＥＩのみを含む透過性付与溶液で、次いで１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成された混合物（ＥｔｏＨ１０％−ＰＥＩ５００）を含む透過性付与溶液で実施された。
【０１０２】
濾過に続いて、膜は寒天培地のカセットの上に置かれ、次いで１５時間、３５℃でインキュベートされた。
【０１０３】
引き続いて、膜はＰＥＩ単独２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ単独５００μｇ／ｍｌ、または１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成された混合物を含む透過性付与溶液で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれ、未処理の膜が比較対照として使用された。
【０１０４】
引き続いてこの膜が固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれ、次いで、上記に示されたように処理された。
【０１０５】
様々な濃度のＰＥＩに関して、およびＰＥＩとアルコールの併用にも関して得られた結果が図９に示されている。
【０１０６】
ＰＥＩとＥｔＯＨの併用が透過性付与剤の不在下（比較対照）、またはＰＥＩのみの存在下で得られることが可能な信号と比較して強力で正確な信号を得ることを可能にすることがわかる。
【実施例３】
【０１０７】
ＡＴＰ生物発光による微生物の非特異的検出
本発明による透過性付与組成物は生きた微生物によって産生されるＡＴＰを、先行技術（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｇ．Ｍ．Ｅｄｅｒｅｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｍａｔｓｅｎ．１９７６．「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｓｓａｙ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｃｔｅｒｉｕｒｉａ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：４２〜４６）から知られている化学発光反応に従って検出するための方法に使用できる。
【０１０８】
本発明による組成物の使用は微生物細胞壁の、これらのＡＴＰ内容物の放出という観点でさらに良好な透過性を得ることを可能にする。
【０１０９】
ａ）化学発光によるＡＴＰの検出の前の９０％エタノールまたは２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌによる細胞の処理
水中に存在する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をＡＴＰ生物発光（様々な工程は図８に例示されている）によって検出するための方法が試験された。この試験では、化学発光反応の前に細胞が９０％エタノール、または２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌで透過処理される。
【０１１０】
手順は先行する実施例のように、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）装置を使用して１００ｍｌの溶液を濾過することにある。
【０１１１】
次いで、膜は膜の表面に吹き付けられる９０％エタノール、または２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌの溶液４０μｌで処理され、次いで、再び乾燥処理される。
【０１１２】
引き続いて、膜は膜の表面に吹き付けられる生物発光溶液４０μｌで処理され、次いで、画像解析装置の中に置かれてここで光信号が記録される。
【０１１３】
ｂ）化学発光によるＡＴＰの検出の前のＰＥＩのみ（１００〜５００μｇ／ｍｌ）またはエタノール−ＰＥＩ混合物による処理
上述されたのと同じ手順が実施され、ここではエタノールによる処理はＰＥＩのみ（１００−２５０−５００μｇ／ｍｌ）、またはエタノール−ＰＥＩの混合物（本発明による組成物）、すなわちＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ １００μｇ／ｍｌ、ＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ ２５０μｇ／ｍｌ、ＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌ ＥｔＯＨで置き換えられた。
【０１１４】
ａ）およびｂ）による様々な処理に関連する結果は図１０の表および図１１の図に示されている。ＥｔＯＨとＰＥＩの組合せが、たとえＰＥＩ単独が高い濃度で使用されるとしても、ＥｔＯＨ単独またはＰＥＩ単独の使用によるよりも明らかに強い信号を得ることを可能にすることがこれらの比較結果から浮かび上がってくる。
【実施例４】
【０１１５】
ＤＮＡインターカレート剤（ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ）の透過による微生物の非特異的検出
１つの実験は、１０％エタノール−ＰＥＩ １００μｇ／ｍｌ混合物を含む本発明による組成物の溶液中で大腸菌をインキュベートすることにある。
【０１１６】
２５μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩのみの溶液中で、または透過性付与の不在下（ＰＢＳ）で細胞をインキュベートすることによって同じ実験が実施された。
【０１１７】
この実験は上述の作用物質およびＤＮＡ挿入剤（ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ Ｉ、１／４０００）の存在下で細菌を１５分間インキュベートし、次いで、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光の存在を測定することにある。
【０１１８】
結果は下記に示される表１に報告されている。
【０１１９】
ＥｔＯＨとＰＥＩの組合せはＰＥＩが単独で使用されるときよりも明らかに強い信号を得ることを可能にする。これは、アルコールをＰＥＩと組み合わせることによってさらに良好な微生物細胞壁の透過性が得られることが可能であることを示している。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
図１は、気体または気体混合物が１％ペプトン水のような液体の中に泡立てられることによって気体状のサンプルが本発明の方法に従って試験されることが可能となる方式を示している。液体と接触すると、気体中に含まれる微生物は液体中に捕捉される。次いで、この液体が本願明細書に示されるように濾過される。
【０１２２】
図２は、実施例１で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示している。標識されたオリゴヌクレオチドプローブによって実施されるこの検出は緑膿菌に特異的である。
【０１２３】
図３は実施例１に述べられる試験の結果を表わしている。これは、プローブによって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像としての膜の表現である。
【０１２４】
図４は図３に与えられた画像の三次元表現である。
【０１２５】
図５は、実施例２で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示している。標識されたＰＮＡタイプのプローブによって実施されるこの検出は緑膿菌に特異的である。
【０１２６】
図６は実施例２に述べられる試験の結果を表わしている。これは、プローブによって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像としての膜の表現である。
【０１２７】
図７は図６に与えられた画像の三次元表現である。
【０１２８】
図８は、実施例３で実施されるＡＴＰ生物発光による微生物検出のための方法の様々な工程を例示している。
【０１２９】
図９は実施例３ｂ）で実施される試験の結果を表わしており、様々な透過性付与溶液（ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ、および１０％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）を比較している。これらはＡＴＰ生物発光によって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像である。
【０１３０】
図１０は他の透過性付与溶液（９０％エタノール、および２５％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）について図９と同じ事物を表わしている。
【０１３１】
図１１は、図８に例示されたＡＴＰ生物発光手順の状況で試験された各透過性付与溶液に関して測定された光強度を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞壁の透過性を増大させるための新規な組成物およびこれらの使用に関し、特に、液体または気体の媒質中での微生物の計数および／または標的識別のための方法におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
本発明は食品または医薬品用の製造ライン中に含まれる液体および気体の媒質の微生物学的品質の管理に適合する。
【背景技術】
【０００３】
この分野では、検出対象となる微生物はしばしば極めて少数で存在し、これらが人間の健康に危険を与えるか否かを判定するために微生物の性質を見分けることが望ましい。実行される管理は製品のどのような汚染も短時間のうちに警告し、適切であれば製造を中止して汚染除去工程を取り入れることを可能にしなければならない。
【０００４】
微生物の培養時間を最短にする一方で同時に、或る種の微生物を検索することを可能にするための多くの方法が開発されてきた。
【０００５】
これは特に、国際公開第０１／５９１５７号パンフレットに述べられた、膜を通して液体を濾過した後に実行される微生物検出のための方法の主題である。この方法によると、液体サンプル中に含まれる微生物は液体を膜に通すことによって前記膜の表面に留められる。これらの微生物が、肉眼では見えない微小コロニーを形成するために必要な時間量で寒天培地と接触させて膜の表面で培養される。次いで、微小コロニーを形成した細胞はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および核酸内容物を放出するように溶解処理される。ＡＴＰはＡＴＰ生物発光によって、生細胞を識別および定量化するためのマーカーとして使用される。この検出法は、ＡＴＰがすべての生きた微生物に存在するマーカーであるという点で普遍的と称される。結果の読み取りは、前記ＡＴＰに特異的である酵素によるＡＴＰのフォトンへの変換を含む化学発光反応によって得られる。光信号は適切な映像インターフェース（例えばＬＣＤカメラ）を使用して検出される。得られた画像は、ペトリ皿上の寒天培地で実施される従来の計数と同様の方式で、微生物が増殖した膜上の部位をその場で可視化することを可能にする。
【０００６】
ミリポア社で販売されている「Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ ｒａｐｉｄ（登録商標）」システムが上述の原理で動作する。これはプラスチックの支持体に保持されている１つの同じ膜上で濾過および検出工程を実行するように設計された。この支持体は、濾過、微生物の培養、検出試薬による膜の含浸、および映像チャンバへの画像の取り込みに使用される様々な装置に取り付けられるように設計される。
【０００７】
この小型化されたシステムは従来式のペトリ皿での検査に比べて明らかな時間的利益を可能にする。さらに、これは得られた画像をデジタルサポートに保存することを可能にし、これは汚染をモニタすることを可能にする（トレーサビリティ）。
【０００８】
しかしながら、実用上、膜の表面に存在する微生物の計数が細胞の溶解後に実施されるという事実に起因してこのシステムは或る種の制限を有する。したがって、検出された微生物を正確に同定する目的で同じ膜を再使用することは困難である。
【０００９】
しかしながら、或る種の微生物の存在を実証するために、たとえ自然のヌクレオチドであっても他のＰＮＡ（ペプチド核酸）タイプであっても標識されたプローブを使用して特異的なハイブリッド形成を実施することが可能である。
【００１０】
ＰＮＡプローブは自然のペプチドであるという利点を有し、これは或る一定の用途で、オリゴヌクレオチドプローブに都合良く取って代わることを可能にする。
【００１１】
概して、インシツープローブハイブリッド形成は細胞の核酸への完全なアクセス可能性を必要とし、そうでなければこの操作は偽陰性を生じさせる。
【００１２】
国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットは、血液サンプルを汚染している微生物の存在を検出することを可能にする膜上での検出のシステムを述べている。
【００１３】
このシステムの特異性は、標識試薬の、細胞壁を貫通しての微生物内への透過を通じて微生物が検出されるという事実にある。使用される標識試薬は小分子、特に、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を挿入する化合物（例えばシアニン誘導体、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、または臭化エチジウム）であり、これは微生物内部への透過という点で見るとオリゴヌクレオチドプローブよりも少ない難度を有する。
【００１４】
試験対象となる液体サンプルは標識剤および細胞透過性付与試薬を含む透過性付与溶液中に希釈される。細胞がこの透過性付与溶液中でインキュベートされるが、この目的は存在する微生物内部への標識生成物の透過を容易にするために細胞壁の多孔度を高めることである。引き続いてこの透過性付与溶液は含んでいると見込まれる微生物を伴なって膜を通して濾過され、次いで、存在する微生物が膜上で保持され、標識剤を化合物と反応させることによって、および／または蛍光信号の放出を可能にする光源によって検出される。このシステムは検出の前に微生物を溶解しない、または少なくとも可能な限り溶解を制限するという利点を有する。
【００１５】
これは結果としてさらに良好な分解能を提供する検出につながる。
【００１６】
しかしながら、これらのマーカーは特異的ではないのでこのシステムは検出された微生物の性質を判定することを可能にしない。
【００１７】
さらに、そのようなシステムでは、微生物の取り扱いが溶液中で行われ、これはさらに複雑な特定の事前対応措置および機器を必要とする。濾過に先立つ溶液中での生細胞のインキュベーションが、膜上に固定される前に細胞が生育および分裂し続ける可能性があるという欠点を有することに留意すべきであり、これは検査の最終結果にある程度の不確実性を投げ掛ける。
【００１８】
特に、透過性付与剤に概して一層敏感であるグラム陽性細菌と一層耐性のあるグラム陰性細菌を同時に検出することが追求されるとき、国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットに述べられた方法に従って透過性付与試薬を透過性付与溶液中に適切に秤量することも困難である。
【００１９】
透過性付与溶液の組成物の作製に使用できる透過性付与剤は、通常、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジギトニン、ノネンシン、ヘキサメタリン酸ナトリウムまたは塩化ベンザルコニウムである。
【００２０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用することも可能であり、これは細菌の細胞壁を、通常では細胞質細菌の中に透過しない抗生物質のような溶質に対して透過性にすると知られている弱塩基性でポリカチオン性の脂肪族ポリマーである（Ｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），１４３：３１９３〜３１９９）。
【００２１】
国際公開第２００４／０５０９０２号パンフレットに述べられたような透過性付与溶液中のポリエチレンイミンの濃度は概して１００μｇ／ｍｌ未満の濃度に限られる。大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のようなグラム陰性細菌に最も適した濃度は約２０〜３０μｇ／ｍｌである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第０１／５９１５７号
【特許文献２】国際公開第２００４／０５０９０２号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｈｅｌａｎｄｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ ｏｆ ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７），１４３：３１９３〜３１９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は上述された既にある膜検出システムの制限に対する解答を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
意外なことに、少なくとも１つのアルコール、特定すると第１級アルコール、さらに特定するとエタノールと組み合わせたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用すると微生物細胞壁を透過性にするためのさらに効果的な組成物を生成することに本発明者らは気付いた。そのような組成物は特に、場合によって標識されるヌクレオチドプローブのような巨大分子が微生物の中に透過する事態を生じさせる。
【００２６】
ＰＥＩおよび第１級アルコール、特にエタノールを含む組成物中でインキュベートされた微生物が先行技術による組成物中におけるよりも高いＰＥＩの濃度に耐えることが特に明らかになった。第１級アルコールとの組合せは特に、どのような著しい細胞溶解効果も生じさせることなく１００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌの間の濃度までＰＥＩを使用することを可能にする。
【００２７】
本発明では、「微生物」という用語はいずれかの（真核または原核）生細胞、単細胞生物、配偶子、または単層もしくは多層の細胞壁によって形成されたエンベロープ内に含まれた遺伝的形質を有するウィルスを意味する。
【００２８】
上記で規定されたような組成物は巨大分子が微生物の中に透過しながら一方で同時にこれらの細胞壁の破壊を制限することを可能にする。
【００２９】
巨大分子は多数の単純な分子の組合せから結果として生じる分子、例えばポリペプチド類、タンパク質類、糖タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、多糖類、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、抗体類、またはこれらの誘導体として規定される。
【００３０】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）はいくつかの形で入手可能な可溶性生成物である。モノマーから重合させられ、約７５０ｋＤａの分子量を有する形は本発明による好ましい形である（ＣＡＳ Ｎｏ．９００２−９８−６）。ＰＥＩは多くの分野で、特に様々な精製法において溶液中のタンパク質および核酸の凝集のための作用物質として使用される。細胞壁に存在するリン脂質を可逆的に破壊し、したがってこれら細胞壁を通常では細胞内への透過を許容されない作用物質に対して透過性にする特性を有するという事実に起因して透過性付与剤としても使用される。
【００３１】
したがって本発明の第１の主題は微生物細胞壁を透過性にするためのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコール、特定すると第１級アルコール、最も特定するとエタノールの組合せを含む組成物である。
【００３２】
この組成物はどのような界面活性剤も含まないことが好ましい。
【００３３】
透過性付与組成物の中のＰＥＩの濃度は１００μｇ／ｍｌと１０００μｇ／ｍｌの間、概して１００μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間、好ましくは１５０μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間、さらに好ましくは２００μｇ／ｍｌと８００μｇ／ｍｌの間であることが可能である。
【００３４】
本発明によれば、第１級アルコールは５％と９５％の間、好ましくは５％と５０％の間、さらに好ましくは１０％と５０％の間の濃度で透過性付与組成物の中に概して存在する。
【００３５】
本発明の他の主題は本発明による組成物の使用に関し、さらに特定すると、微生物の中への標識された巨大分子の透過で構成される工程を含む、膜上で微生物を検出するための方法に関する。
【００３６】
未だによく知られていない理由のために、ＰＥＩと第１級アルコール、特定するとエタノールの混合物はヌクレオチドプローブのような巨大分子の微生物の中への透過を容易にする。
【００３７】
本発明に従って好ましいヌクレオチドプローブは微生物のリボソームＲＮＡ、特定すると緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の１６Ｓ ＲＮＡまたは２３Ｓ ＲＮＡの特定のハイブリッド形成を可能にする。そのようなプローブは特に、配列番号１、配列番号２または配列番号３に相当する配列を有する。
【００３８】
これらのプローブが微生物に存在する或る種の核酸とハイブリッド形成可能であるとき、前記方法は液体または気体の媒質中に存在する微生物の（複数の）種類を検出することを可能にする。この方法は結果として、検出される微生物集団のさらに正確な写真が得られることにつながる。
【００３９】
巨大分子が抗原類または抗体類で構成されることおよびこれらが免疫タイプの検出に参画することを想定することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】気体状のサンプルが本発明の方法に従って試験されることが可能となる方式を示す図である。
【図２】実施例１で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示する図である。
【図３】実施例１に述べられる試験の結果を表わす図である。
【図４】図３に与えられた画像の三次元表現を示す図である。
【図５】実施例２で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示する図である。
【図６】実施例２に述べられる試験の結果を表わす図である。
【図７】図６に与えられた画像の三次元表現を示す図である。
【図８】実施例３で実施されるＡＴＰ生物発光によって微生物を検出するための方法の様々な工程を例示する図である。
【図９】実施例３ｂ）で実施される試験の結果を表わす図である。
【図１０】他の透過性付与溶液（９０％エタノール、および２５％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）について図９と同じ事物を表わす図である。
【図１１】図８に例示されたＡＴＰ生物発光手順の前状況で試験された各透過性付与溶液に関して測定された光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の主題はさらに特定すると、液体または気体の媒質中に最初に存在する微生物を膜上で計数および／または識別するための方法の中での上述のような透過性付与組成物の使用である。
【００４２】
本発明の或る特定の形態によると、本方法は以下の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）液体または気体の媒質が、この媒質中に存在する微生物を膜の上または中に留めるように膜を通して濾過される。
（ｂ）この膜および微生物が、ポリエチレンイミンと少なくとも１つのアルコールを含む上述されたような透過性付与組成物と接触させられる。
（ｃ）架橋剤によって細胞が膜に固定される。
（ｄ）微生物が、場合によって標識される１つまたは複数の、微生物細胞壁を横切ることが可能な巨大分子と接触させられる。
（ｅ）微生物の内部に透過した巨大分子が検出される。
【００４３】
本発明の方法によって標的にされる微生物はさらに特定すると、環境中で頻繁に遭遇する病原性の微生物であるシュードモナス属、エシェリキア属、レジオネラ属、サルモネラ属、リステリア属、バチルス属、ストレプトコッカス属、ビブリオ属、エルシニア属、ブドウ球菌属、マイコバクテリウム属、シゲラ属、クロストリジウム属、カンピロバクター属またはアエロモナス属のグラム陽性またはグラム陰性の病原性細菌、ジアルディア属、エントアメーバ属、クリプトスポリジウム属またはサイクロスポーラ属の原生動物、マイコプラズマ属またはウレアプラズマ属のマイコプラズマ、アスペルギルス属、カンジダ属またはペニシリウム属の真菌、およびＡ型肝炎およびＢ型肝炎ウィルスから選択される。
【００４４】
本方法は原理的に、シアノバクテリアのような単細胞の藻類、アメーバのような寄生生物の単細胞形、または線虫、吸虫、または回虫の卵、または花粉や精子といった他の植物や動物の配偶子の検出にも応用可能である。
【００４５】
本方法の目的は液体の媒質（例えば水）または気体の媒質（例えば空気）中に存在する微生物を計数しながらその一方で同時に、これらの識別（科、属、種など）を可能な限り判定することである。「液体または気体の媒質」という表現は、概して０．１ミクロンと１．５ミクロンの間、好ましくは０．１５ミクロンと０．８ミクロンの間、さらに好ましくは０．２ミクロンと０．６ミクロンの間の平均直径を備えた複数の孔を有する膜を通して圧力差を加えることによって濾過され得るどのような流体も意味するように意図される。このような流体は無菌製剤の製造に含まれる純粋の溶液類だけでなく複合溶液類（飲料水、血清、尿、羊水など）で、または場合によっては大気といった気体混合物で構成されることも可能である。
【００４６】
さらに、本方法は動物または患者に起源を発するサンプルの分析のために診断の分野での用途を有する。
【００４７】
本願明細書の中の「膜」という用語は２つの面を有する合成支持体を意味し、これらの面の複数の孔は知られている平均直径を有する。
【００４８】
本発明の背景で使用される膜は概して高い表面／体積比および好ましくは９０ミクロンと２００ミクロンの間で一定の厚さを示す。
【００４９】
このような膜は単層または多層の膜であることが可能である。概して、これはポリテトラフルオロエチレン、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース、およびニトロセルロースから選択される１つまたは複数の材料で構成される。
【００５０】
材料は、使用される溶剤、特に本方法の様々な工程で使用される可能性が高いアルコール類およびアルデヒド類と両立するように選択されることが望ましい。
【００５１】
上で微生物が検出される膜は主にＰＶＤＦ（ポリ（フッ化ビニリデン））またはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。これはミリポア社によって商標名Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ、および照会名ＨＶＷＰ（登録商標）またはＨＶＭＦＸ（登録商標）で販売されているようなタイプのＰＶＤＦ濾過膜であることがさらに好ましい。
【００５２】
本発明による方法の工程ａ）は分析対象となる液体または気体の媒質を、前記媒質中に含まれる微生物を上記で規定されたような膜の表面に留めるようにこの膜を通して濾過する工程で構成される。
【００５３】
いったんこれらの微生物が濾過されて膜上に保持されると、場合により加えられる、適切な培地と接触させて微生物を培養する工程で構成される工程が本方法の工程ａ）とｂ）の間に含まれることもあり得る。この培地は、濾過の後に膜が上に置かれる寒天培地であることが好ましい。場合によって加えられるこの工程は最初に濾過された各々の微生物のコロニーを得ることを可能にし、それにより、これらをさらに容易に検出することを可能にする。
【００５４】
本発明によると、これらの微生物は引き続いて工程ｂ）で本発明による透過性付与組成物中でインキュベートされる。
【００５５】
このインキュベーション工程は膜の表面で被膜を形成する少量の溶液で実施される。都合の良いことに、この透過性付与組成物は上に膜が置かれることになる固体の支持体、例えば含浸パッドの中に含まれることが可能であり、この支持体が膜の表面の液体のどのような考え得る移動も、したがって微生物の混ざり合いも制限する。これは５から２０分の間、２０℃と３５℃の間の温度で実施される。
【００５６】
本発明による方法は工程ｃ）を含むのでなおさら効果的であり、この工程によって細胞は架橋剤として働く作用物質により膜上に固定される。
【００５７】
この工程は膜によって構成される支持体の上に細胞を固定することを可能にする。本発明による好ましい架橋剤はグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択され、パラホルムアルデヒドは少なくとも６個のホルムアルデヒド単位から成る分子として定義される。都合の良いことに、この固定用組成物は上に膜が置かれることになる固体の支持体、例えば含浸パッドの中に含まれることが可能であり、この支持体が膜の表面の液体のどのような考え得る移動も、したがって微生物の混ざり合いも制限する。本発明によれば、この固定工程は５から２０分の間、２０℃と３５℃の間の温度で実施されることが好ましい。
【００５８】
この固定工程はまた、ＵＶ放射による膜上の微生物の照射によって実施されることも可能である。このとき、膜はＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。
【００５９】
微生物を、この微生物細胞壁を通り抜けて前記微生物の中に入る１つまたは複数の場合によっては標識される巨大分子との接触に至らせる工程を含む工程ｄ）はインキュベーションおよび固定の工程ｂ）およびｃ）それぞれの終わりに実施されることが好ましく、なぜならば微生物細胞壁が巨大分子に対して最も透過性であることが観察されたのがこの正確な場合であるからである。
【００６０】
本発明の好ましい形態によると、巨大分子は標識されてプローブとして使用される。
【００６１】
「プローブ」という用語はここでは微生物の特定の生物学的要素を認識して結合することが可能であり、したがってこれが可視化されることを可能にする巨大分子類を意味するように意図される。
【００６２】
本発明のさらに別の好ましい形態によると、プローブは微生物の中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリッド形成し、前記核酸に関してある一定度の特異性を示すことが可能な巨大分子であることが可能である。このとき、核酸プローブに対してこの背景で基準が作成される。本発明は、核酸とハイブリッド形成を生じさせることが可能で当業者に知られているどのようなタイプの核酸プローブも想定しており、これらは例えば単純なオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡタイプのオリゴヌクレオチド、またはＰＮＡタイプのプローブ類（プリンおよびピリミジン塩基で置換されたポリペプチド鎖で構成されたプローブ類）（Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｐ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７〜１５００）または欧州特許第１０１３６６１号明細書に述べられたようなＬＮＡタイプ（１つまたは複数の２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルモノマーを含むオリゴヌクレオチド）である。
【００６３】
本発明の好ましい態様によると、緑膿菌のような微生物の標的化された検出の目的で使用されるプローブ類は以下に示される配列、すなわち
５’−ＴＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＡＣＴＴＡＣＧＴＧＡＣＡＣＣ−３’［配列番号１］
５’−ＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡ−３’［配列番号２］
５’−ＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＡＣＴ−３’［配列番号３］
のうちの１つまたは複数を含む。
【００６４】
配列番号１、２および３の配列は緑膿菌の１６Ｓ ＲＮＡまたは２３Ｓ ＲＮＡにそれぞれ特異的で選択的にハイブリッド形成する特異性を有する。実際に本発明者らは、微生物のリボソームＲＮＡとハイブリッド形成することが可能なプローブ類が本発明を実施するために特に有用であることに気付いた。
【００６５】
したがって本発明の１つの態様は配列番号１または配列番号２に相当する配列、すなわち上記に示された配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の同一性を示す配列を有するプローブで構成される。そのようなプローブは特に、本発明による計数および／または識別の方法を遂行するために示される。本発明の別の態様によると、微生物の中に透過するように作られ、上述されたプローブ類と同じ性質である可能性の高い巨大分子は微生物中に含まれる核酸類の特異的な増幅で構成される追加的工程を遂行するためのプライマーとして使用される。そのような巨大分子が本発明による方法の中で使用されれば、追加的である、しかしそれでも場合によって行われる工程が本方法の中に工程ｄ）とｅ）の間で導入される。
【００６６】
そのような増幅工程は、検出の目的で利用可能な核酸の量を増加させることにより、微生物の最適な検出のために有用であることを示すことが可能である。この増幅工程が高度に特異的であれば、この工程はさらに選択性を備えて微生物を同定すること、したがって擬陽性の数を減少させることを可能にする。この増幅はＮＡＳＢＡタイプ（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５０：９１〜９２）またはＬＡＭＰ−ＰＣＲタイプ（Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），２８（１２）：ｅ６３）の増幅であることが好ましい。
【００６７】
上述されたプローブ類またはプライマー類は唯一またはいくつかの種類の微生物を検出するように設計されることが可能である。この点において、これらは微生物中に存在する複数の生物学的要素に関して異なる特異性の度合いを示す可能性が高い。例えば、これらのプライマー類またはプローブ類が、多数の種の微生物中にその配列が保持されている核酸とハイブリッド形成するように選択された核酸であれば、識別が極めて特異的であることはなく、他方でこれらの配列が少数の種に特異的な配列のみを見分けるように選択されれば、特異性はさらに大きくなる。
【００６８】
本発明のなおも別の特定の形態によれば、好都合には、前記微生物の核酸と核酸プローブまたはプライマーの特異的ハイブリッド形成で構成される工程は工程ｄ）よりも後、引き続く検出工程ｅ）よりも前に実行できる。
【００６９】
核酸プローブまたはプライマーのハイブリッド形成で構成されるこの工程は、当業者に知られている標準的なハイブリッド形成条件下で実行される。この工程は非特異的なハイブリッド形成を生じさせた核酸プローブまたはプライマーを除去するための洗浄工程を含むことも可能である。
【００７０】
検出の目的で、本発明による核酸プローブまたはプライマーは蛍光物質で標識されるか、または場合によっては化学発光反応を達成するために酵素に連結されることが好ましい。
【００７１】
微生物検出工程ｅ）は、プローブまたはプライマーの標識に対応して、化学発光反応に起源を発する光信号または蛍光によって得られる発光を適切なインターフェースで検出することによって実施される。
【００７２】
本発明のさらに好ましい態様によると、オリゴヌクレオチド類のような核酸プローブがペルオキシダーゼに連結される。ペルオキシダーゼがルミノール（ペルオキシダーゼの基質）と接触させられると、ペルオキシダーゼが後者を分解し、分解産物がフォトンを発してこれらがＭｉｌｌｉｆｌｅｘシステムの映像インターフェース（ＬＣＤカメラ）で検出される。
【００７３】
なおも別の態様によると、本発明はインヴィトロでの診断検査を実施するために上述されたような透過性付与組成物の使用で構成される。
【００７４】
インシツーでの検出を実施するために、ヒトまたは動物から得られた細胞または培地に維持された細胞の中に核酸プローブまたはいずれかの他の分子複合体を透過させるように本発明による透過性付与組成物の特定の特性を使用することを想定することが実際に可能である。
【００７５】
本発明による透過性付与組成物は医学分野での多くの用途、例えば、抗生物質または抗ウィルス剤などの活性成分に対して細胞または微生物を敏感にするために前記細胞または前記微生物細胞壁の透過性を高めるための薬物補助物質の用途を見出すことも可能である。
【００７６】
さらに特定すると、本発明による組成物は、特に遺伝病または或る種の癌の治療において或る種の遺伝子の発現を阻害することが意図される場合に、アンチセンス核酸、特にアンチセンスＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を細胞の中に透過させるために有用である。
【００７７】
本発明はまた、液体または気体の媒質中の微生物を検出および計数するためのキットであり、少なくとも
液体または気体の媒質を濾過するための膜、および
本発明に述べられるような透過性付与組成物、
を含むキットを範囲に入れるように意図される。
【００７８】
このキットに含まれる膜は主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることが好ましい。
【００７９】
都合の良いことに、このようなキットはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、およびパラホルムアルデヒドから選択される架橋剤を含む組成物も含む。この第２の組成物は微生物を膜上に固定することを可能にし、これは、本発明による方法を実施することによってさらに良好な分解能の検出を得ることを可能にする。
【００８０】
本発明によるキットは求める微生物の特異的な検出のためのプローブ、特に配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を有する上記で規定されたようなプローブを含むことも可能である。
【００８１】
以下の実施例の目的は本発明を具体的に示すことである。
【実施例１】
【００８２】
オリゴヌクレオチドプローブによる緑膿菌の特異的検出
実施される方法の複数の工程が図２に具体的に示される。
【００８３】
この方法の実施は最初に、照会名ＨＶＷＰ（登録商標）またはＨＶＭＦＸ（登録商標）でＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）の名称で販売されている装置を使用して１００ｍｌの溶液を濾過することにある。この装置は円形のプラスチック構造体上に保持されたＰＶＤＦタイプの濾過膜を有する。
【００８４】
濾過に続いて、この膜が寒天培地のカセットの上に置かれ、次いで、膜の表面に細菌の微小コロニーが成長することが可能となるように５時間３０分間、３５℃でインキュベートされる。
【００８５】
寒天培地のカセットから膜が分離され、次いで、透過性付与溶液（２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ）で含浸処理されたセルロースのパッドに接触されて大気温度に１０分間置かれる。
【００８６】
次いで、この膜は固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００８７】
引き続いて、上にこの膜が位置しているこのプラスチック構造体が、下側部分が密封されているハイブリッド形成カセットの上に嵌め込まれる。この膜が、２ｍｌの第１の予備ハイブリッド形成溶液（１０％ＰＥＧ、３００ｍＭのＮａＣｌ、３０％ホルムアミド、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．２％ＰＶＰ、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と接触させて３０分間、４５℃でハイブリッド形成カセットの中でインキュベートされる。第１の溶液が除去されると直ぐに、膜はダイズペルオキシダーゼに結合したオリゴヌクレオチドプローブ１００ｎＭを含む同じ量のハイブリッド形成溶液と接触させて６０分間、４５℃に置かれる。
【００８８】
緑膿菌の１６Ｓ ＲＮＡに特異的な使用されたオリゴヌクレオチドプローブは以下の配列（配列番号２）を有する。
５’−ＣＧＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡ−３’［配列番号２］
【００８９】
引き続き、膜がハイブリッド形成カセットから分離され、次いで、洗浄液１００ｍｌ（１０ｍＭのＣＡＰＳＯ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）と接触させて洗浄槽の中に置かれる。１０分間、４５℃で３回の洗浄が実施される。
【００９０】
この膜が乾燥処理され、次いで、生物発光試薬（ミリポア社カタログ＃ＷＢＫＬＳ０１００）が再構成の後に膜の表面に吹き付けられる。この装置がＭｉｌｌｉｆｌｅｘ Ｒａｐｉｄシステムの中に置かれ、光信号が記録される。
【００９１】
膜の表面での緑膿菌の検出の結果が図３に示されている。同じ分析に付随した三次元図が図４に示されており、ここでは各々の緑膿菌の膜局在性が明らかに見分けられる。
【実施例２】
【００９２】
ＰＮＡタイプのプローブによる緑膿菌の特異的検出
ａ）２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ透過性付与溶液の使用
実施される方法の複数の工程は図５に具体的に示される。
【００９３】
実施例１の手順に従って実施された濾過の後、膜は寒天培地のカセットの上に置かれ、６時間、３５℃でインキュベートされる。
【００９４】
寒天培地のカセットから膜が分離され、次いで、透過性付与溶液（２０％エタノール、ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００９５】
引き続いて、この装置は固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれる。
【００９６】
実施例１のように、この膜はダイズペルオキシダーゼに結合したＰＮＡプローブ１００ｎＭを含む２ｍｌのハイブリッド形成溶液（１０％ＰＥＧ、１０ｍＭのＮａＣｌ、３０％ホルムアミド、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．２％ＰＶＰ、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））と接触させてハイブリッド形成カセットの上に置かれる。このアセンブリが６０分間、５０℃に置かれる。
【００９７】
使用されるＰＮＡプローブは実施例１のオリゴヌクレオチドプローブのように緑膿菌の同じ１６Ｓ ＲＮＡ配列とハイブリッド形成することが可能であり、配列配列番号３である。
【００９８】
支持体上の膜がハイブリッド形成カセットから分離され、次いで、洗浄液１００ｍｌ（１０ｍＭのＣＡＰＳＯ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）と接触されて洗浄槽の中に置かれる。１０分間、５０℃で３回の洗浄が実施される。
【００９９】
この膜が乾燥処理され、次いで、生物発光試薬（ミリポア社カタログ＃ＷＢＫＬＳ０１００）が再構成の後に膜の表面に吹き付けられる。最後に、この膜がＭｉｌｌｉｆｌｅｘ Ｒａｐｉｄシステムの画像解析装置の中に置かれ、ここで光信号が記録される。得られた画像が図６に示されている。同じ分析の三次元図が図７に示されている。
【０１００】
この方法は、濾過膜の表面における緑膿菌の存在を特異的に検出することを可能にする。
【０１０１】
ｂ）ＰＥＩ単独２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ単独５００μｇ／ｍｌ、または１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成される混合物（ＥｔｏＨ１０％−ＰＥＩ５００）を含む透過性付与溶液の使用
上記で述べられたものと同じ手順がＰＥＩのみを含む透過性付与溶液で、次いで１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成された混合物（ＥｔｏＨ１０％−ＰＥＩ５００）を含む透過性付与溶液で実施された。
【０１０２】
濾過に続いて、膜は寒天培地のカセットの上に置かれ、次いで１５時間、３５℃でインキュベートされた。
【０１０３】
引き続いて、膜はＰＥＩ単独２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ単独５００μｇ／ｍｌ、または１０％エタノールと５００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩで構成された混合物を含む透過性付与溶液で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれ、未処理の膜が比較対照として使用された。
【０１０４】
引き続いてこの膜が固定用溶液（８０％メタノール、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭのＮａＮ３、０．０１％Ｈ２Ｏ２−尿素）で含浸処理されたセルロースのパッドの上に大気温度で１０分間置かれ、次いで、上記に示されたように処理された。
【０１０５】
様々な濃度のＰＥＩに関して、およびＰＥＩとアルコールの併用にも関して得られた結果が図９に示されている。
【０１０６】
ＰＥＩとＥｔＯＨの併用が透過性付与剤の不在下（比較対照）、またはＰＥＩのみの存在下で得られることが可能な信号と比較して強力で正確な信号を得ることを可能にすることがわかる。
【実施例３】
【０１０７】
ＡＴＰ生物発光による微生物の非特異的検出
本発明による透過性付与組成物は生きた微生物によって産生されるＡＴＰを、先行技術（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｎ．，Ｇ．Ｍ．Ｅｄｅｒｅｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｍａｔｓｅｎ．１９７６．「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｓｓａｙ ａｓ ａ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｃｔｅｒｉｕｒｉａ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：４２〜４６）から知られている化学発光反応に従って検出するための方法に使用できる。
【０１０８】
本発明による組成物の使用は微生物細胞壁の、これらのＡＴＰ内容物の放出という観点でさらに良好な透過性を得ることを可能にする。
【０１０９】
ａ）化学発光によるＡＴＰの検出の前の９０％エタノールまたは２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌによる細胞の処理
水中に存在する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をＡＴＰ生物発光（様々な工程は図８に例示されている）によって検出するための方法が試験された。この試験では、化学発光反応の前に細胞が９０％エタノール、または２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌで透過処理される。
【０１１０】
手順は先行する実施例のように、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）装置を使用して１００ｍｌの溶液を濾過することにある。
【０１１１】
次いで、膜は膜の表面に吹き付けられる９０％エタノール、または２５％エタノール−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌの溶液４０μｌで処理され、次いで、再び乾燥処理される。
【０１１２】
引き続いて、膜は膜の表面に吹き付けられる生物発光溶液４０μｌで処理され、次いで、画像解析装置の中に置かれてここで光信号が記録される。
【０１１３】
ｂ）化学発光によるＡＴＰの検出の前のＰＥＩのみ（１００〜５００μｇ／ｍｌ）またはエタノール−ＰＥＩ混合物による処理
上述されたのと同じ手順が実施され、ここではエタノールによる処理はＰＥＩのみ（１００−２５０−５００μｇ／ｍｌ）、またはエタノール−ＰＥＩの混合物（本発明による組成物）、すなわちＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ １００μｇ／ｍｌ、ＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ ２５０μｇ／ｍｌ、ＥｔＯＨ１０％−ＰＥＩ ５００μｇ／ｍｌ ＥｔＯＨで置き換えられた。
【０１１４】
ａ）およびｂ）による様々な処理に関連する結果は図１０の表および図１１の図に示されている。ＥｔＯＨとＰＥＩの組合せが、たとえＰＥＩ単独が高い濃度で使用されるとしても、ＥｔＯＨ単独またはＰＥＩ単独の使用によるよりも明らかに強い信号を得ることを可能にすることがこれらの比較結果から浮かび上がってくる。
【実施例４】
【０１１５】
ＤＮＡインターカレート剤（ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ）の透過による微生物の非特異的検出
１つの実験は、１０％エタノール−ＰＥＩ １００μｇ／ｍｌ混合物を含む本発明による組成物の溶液中で大腸菌をインキュベートすることにある。
【０１１６】
２５μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度のＰＥＩのみの溶液中で、または透過性付与の不在下（ＰＢＳ）で細胞をインキュベートすることによって同じ実験が実施された。
【０１１７】
この実験は上述の作用物質およびＤＮＡ挿入剤（ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ Ｉ、１／４０００）の存在下で細菌を１５分間インキュベートし、次いで、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光の存在を測定することにある。
【０１１８】
結果は下記に示される表１に報告されている。
【０１１９】
ＥｔＯＨとＰＥＩの組合せはＰＥＩが単独で使用されるときよりも明らかに強い信号を得ることを可能にする。これは、アルコールをＰＥＩと組み合わせることによってさらに良好な微生物細胞壁の透過性が得られることが可能であることを示している。
【０１２０】
【表１】
【０１２１】
図１は、気体または気体混合物が１％ペプトン水のような液体の中に泡立てられることによって気体状のサンプルが本発明の方法に従って試験されることが可能となる方式を示している。液体と接触すると、気体中に含まれる微生物は液体中に捕捉される。次いで、この液体が本願明細書に示されるように濾過される。
【０１２２】
図２は、実施例１で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示している。標識されたオリゴヌクレオチドプローブによって実施されるこの検出は緑膿菌に特異的である。
【０１２３】
図３は実施例１に述べられる試験の結果を表わしている。これは、プローブによって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像としての膜の表現である。
【０１２４】
図４は図３に与えられた画像の三次元表現である。
【０１２５】
図５は、実施例２で実施される本発明による微生物の検出および計数のための方法の様々な工程を例示している。標識されたＰＮＡタイプのプローブによって実施されるこの検出は緑膿菌に特異的である。
【０１２６】
図６は実施例２に述べられる試験の結果を表わしている。これは、プローブによって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像としての膜の表現である。
【０１２７】
図７は図６に与えられた画像の三次元表現である。
【０１２８】
図８は、実施例３で実施されるＡＴＰ生物発光による微生物検出のための方法の様々な工程を例示している。
【０１２９】
図９は実施例３ｂ）で実施される試験の結果を表わしており、様々な透過性付与溶液（ＰＥＩ２００μｇ／ｍｌ、ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ、および１０％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）を比較している。これらはＡＴＰ生物発光によって放出される光信号の記録およびデジタル処理の後に得られた合成画像である。
【０１３０】
図１０は他の透過性付与溶液（９０％エタノール、および２５％エタノール＋ＰＥＩ５００μｇ／ｍｌ）について図９と同じ事物を表わしている。
【０１３１】
図１１は、図８に例示されたＡＴＰ生物発光手順の状況で試験された各透過性付与溶液に関して測定された光強度を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞壁を透過性にするための、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む組成物。
【請求項２】
組成物中のポリエチレンイミンの濃度が１００μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、微生物細胞壁を透過性にするための、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む組成物。
【請求項３】
組成物中のポリエチレンイミンの濃度が２００μｇ／ｍｌと８００μｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アルコールが第１級アルコールであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
以下の工程、すなわち
（ａ）液体または気体の媒質が、この媒質中に存在する微生物を膜の上または中に留めるように膜を通して濾過される工程、
（ｂ）この膜および微生物が、ポリエチレンイミンと少なくとも１つのアルコールを含む透過性付与組成物と接触させられる工程、
（ｃ）架橋剤によって細胞が膜に固定される工程、
（ｄ）微生物が、場合によって標識される１つまたは複数の、微生物細胞壁を横切ることが可能な巨大分子と接触させられる工程、および
（ｅ）微生物の内部に透過した巨大分子が検出される工程
を含むことを特徴とする、液体または気体の媒質中に最初に存在する微生物を膜の上で計数および／または同定するための方法。
【請求項７】
工程ａ）と工程ｂ）の間に、微生物を培養することで構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）で架橋剤として働く作用物質がグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択されることを特徴とする、請求項６および７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）において、使用される巨大分子がＰＮＡタイプのプローブであることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）において、使用される巨大分子がオリゴヌクレオチドタイプのプローブであることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）において使用されるプローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする、請求項９および１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程ｄ）において、プローブまたはプライマーが光信号の放出を可能にする酵素と結合することによって標識されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｅ）における微生物の検出が、化学発光反応および適切なインターフェースにより放出された光の認識によって実行されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｄ）において、プローブまたはプライマーが蛍光分子で標識されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｅ）における微生物の検出が、プローブまたはプライマーの標識に対応する蛍光放出信号を適切なインターフェースで検出することによって実行されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｄ）と工程ｅ）の間に、前記微生物の核酸とプローブまたはプライマーの特異的なハイブリッド形成で構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｄ）とｅ）の間に、微生物中に存在する核酸の特異的な増幅で構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
上で微生物が検出される膜が、主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）から成ることを特徴とする、請求項６から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｂ）で使用される組成物が、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物であることを特徴とする、請求項６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
微生物細胞壁の透過性を高めるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２１】
微生物を計数および／または同定する方法における、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２２】
核酸を細胞の中に透過させるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２３】
薬物補助物質として、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２４】
活性成分を細胞の中に透過させるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２５】
前記組成物が請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物に従うものであることを特徴とする、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を含むハイブリッド形成プローブ。
【請求項２７】
液体を濾過するための膜、および
ポリエチレンイミンとアルコールの組合せを含む組成物
を含むことを特徴とする、微生物を検出および計数するためのキット。
【請求項２８】
前記組成物が請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物に従うものであることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択される架橋剤を含む組成物も含むことを特徴とする、請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
微生物の特異的検出のための少なくとも１つのプローブも含むことを特徴とする、請求項２７から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
求める微生物の特異的検出のためのプローブが請求項２６に記載の通りであることを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記膜が主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることを特徴とする、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１】
微生物細胞壁を透過性にするための、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む組成物。
【請求項２】
組成物中のポリエチレンイミンの濃度が１００μｇ／ｍｌと９００μｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、微生物細胞壁を透過性にするための、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と少なくとも１つのアルコールの組合せを含む組成物。
【請求項３】
組成物中のポリエチレンイミンの濃度が２００μｇ／ｍｌと８００μｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アルコールが第１級アルコールであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
以下の工程、すなわち
（ａ）液体または気体の媒質が、この媒質中に存在する微生物を膜の上または中に留めるように膜を通して濾過される工程、
（ｂ）この膜および微生物が、ポリエチレンイミンと少なくとも１つのアルコールを含む透過性付与組成物と接触させられる工程、
（ｃ）架橋剤によって細胞が膜に固定される工程、
（ｄ）微生物が、場合によって標識される１つまたは複数の、微生物細胞壁を横切ることが可能な巨大分子と接触させられる工程、および
（ｅ）微生物の内部に透過した巨大分子が検出される工程
を含むことを特徴とする、液体または気体の媒質中に最初に存在する微生物を膜の上で計数および／または同定するための方法。
【請求項７】
工程ａ）と工程ｂ）の間に、微生物を培養することで構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）で架橋剤として働く作用物質がグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択されることを特徴とする、請求項６および７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程ｄ）において、使用される巨大分子がＰＮＡタイプのプローブであることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｄ）において、使用される巨大分子がオリゴヌクレオチドタイプのプローブであることを特徴とする、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）において使用されるプローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を含むことを特徴とする、請求項９および１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程ｄ）において、プローブまたはプライマーが光信号の放出を可能にする酵素と結合することによって標識されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｅ）における微生物の検出が、化学発光反応および適切なインターフェースにより放出された光の認識によって実行されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｄ）において、プローブまたはプライマーが蛍光分子で標識されることを特徴とする、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｅ）における微生物の検出が、プローブまたはプライマーの標識に対応する蛍光放出信号を適切なインターフェースで検出することによって実行されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｄ）と工程ｅ）の間に、前記微生物の核酸とプローブまたはプライマーの特異的なハイブリッド形成で構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｄ）とｅ）の間に、微生物中に存在する核酸の特異的な増幅で構成される追加の工程を含むことを特徴とする、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
上で微生物が検出される膜が、主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）から成ることを特徴とする、請求項６から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｂ）で使用される組成物が、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物であることを特徴とする、請求項６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
微生物細胞壁の透過性を高めるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２１】
微生物を計数および／または同定する方法における、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２２】
核酸を細胞の中に透過させるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２３】
薬物補助物質として、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２４】
活性成分を細胞の中に透過させるための、アルコールとポリエチレンイミンの組合せを含む組成物の使用。
【請求項２５】
前記組成物が請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物に従うものであることを特徴とする、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
配列番号１、配列番号２または配列番号３と少なくとも８０％の同一性を示す配列を含むハイブリッド形成プローブ。
【請求項２７】
液体を濾過するための膜、および
ポリエチレンイミンとアルコールの組合せを含む組成物
を含むことを特徴とする、微生物を検出および計数するためのキット。
【請求項２８】
前記組成物が請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物に従うものであることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドから選択される架橋剤を含む組成物も含むことを特徴とする、請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
微生物の特異的検出のための少なくとも１つのプローブも含むことを特徴とする、請求項２７から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
求める微生物の特異的検出のためのプローブが請求項２６に記載の通りであることを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記膜が主にＰＶＤＦまたはＮｙｌｏｎ（登録商標）で構成されることを特徴とする、請求項２７から３１のいずれか一項に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２１３７２４（Ｐ２０１０−２１３７２４Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１３０８２６（Ｐ２０１０−１３０８２６）
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【分割の表示】特願２００６−３４１２５０（Ｐ２００６−３４１２５０）の分割
【原出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【出願人】（３９００１９５８５）ミリポア・コーポレイション (212)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３０８２６（Ｐ２０１０−１３０８２６）
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【分割の表示】特願２００６−３４１２５０（Ｐ２００６−３４１２５０）の分割
【原出願日】平成１８年１２月１９日（２００６．１２．１９）
【出願人】（３９００１９５８５）ミリポア・コーポレイション (212)
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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