微細藻類の培養方法
【課題】微細藻類を、微量金属の供給源として酸化スラグを用いてなる培地を用いて培養する微細藻類の培養方法を提供する。
【解決手段】酸性側で培養可能な微細藻類（例えば、シュードコリシスチス属の微細藻類）の培養方法であって、水に、少なくとも、酸化スラグ（製鋼工程の酸化期に発生するスラグ）と、窒素源となる化合物（尿素等）とが添加されて得られた培地を使用し、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする。
【解決手段】酸性側で培養可能な微細藻類（例えば、シュードコリシスチス属の微細藻類）の培養方法であって、水に、少なくとも、酸化スラグ（製鋼工程の酸化期に発生するスラグ）と、窒素源となる化合物（尿素等）とが添加されて得られた培地を使用し、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法に関する。更に詳しくは、本発明は、酸性側で培養可能な微細藻類、特に炭化水素生産能を有する微細藻類を、鉄、マンガン等の金属元素などの供給源として酸化スラグを用いてなる培地を使用して培養する微細藻類の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源の枯渇、及び地球温暖化等が問題となっており、これらを解決するため化石燃料からの脱却が強く望まれている。このような状況下、バイオ燃料への関心が非常に高まっており、特にトウモロコシ、サトウキビ等の食材由来ではなく、微細藻類由来等の非食バイオ燃料についての基礎研究及び応用開発が進められている。また、微細藻類の培養には、栄養塩、微量金属、ビタミン類等が必要であり、現状では、これらの必須成分は試薬を用いて供給されている。更に、必須成分のうち、鉄等の微量金属の供給源として、環境負荷物質である金属錯体が用いられることが多く（例えば、特許文献１参照。）、これらの環境負荷物質の低減が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１０９５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された微細藻類を用いた炭化水素の生産方法では、培地における微量金属の供給源として、環境負荷物質であるＦｅ−ＥＤＴＡ等の金属錯体が使用されており、その他の微量金属の供給源としても試薬が用いられている。このような試薬の使用は、必要な金属をそれぞれ用意し、秤量して、所要量を正確に配合することができ、且つ培養の阻害要因となる金属を無用に添加しない点で優れている。しかし、全ての微量金属を試薬で配合したのでは、高価な培地となってしまい、コスト面では不利である。
【０００５】
そこで、これまでの微量金属の供給源としての試薬に替えて、試薬を用いたときと同等の増殖作用が得られ、且つ安価な供給源について検討したところ、製鋼工程の酸化期に発生する酸化スラグが好適であることが見出された。酸化スラグには、鉄、マンガン、銅、コバルト、モリブデン等の金属元素等が含有されており、この酸化スラグの添加により、同時に多くの種類の微量元素を培地に供給することができる。また、酸化スラグは廃棄物として産生するものであり、この酸化スラグを有効な微量元素供給源として用いることで、資源の再利用になるとともに、培地のコストを引き下げることもできる。
本発明は、このような知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
本発明は、前記の従来の状況に鑑みてなされたものであり、酸性側で培養可能な微細藻類、特に炭化水素生産能を有する微細藻類を、鉄、マンガン等の金属元素などの供給源として酸化スラグを用いてなる培地を使用して培養する微細藻類の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
１．酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、
水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られた培地を使用し、
前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、
前記培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ前記微細藻類の増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする微細藻類の培養方法。
２．前記微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である前記１．に記載の培養方法。
３．前記窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である前記１．又は２．に記載の微細藻類の培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微細藻類の培養方法によれば、鉄、マンガン等の微量元素の供給源として酸化スラグを用いているため、微量元素のうちの多くを培地に同時に供給することができるとともに、各々の微量元素の供給源として試薬を用いたときと同等の増殖作用が得られる。また、酸化スラグは製鋼工程で発生する廃棄物であり、資源の再利用になるとともに、安価であるため、培地のコストを低減させることもできる。
また、微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である場合は、この微細藻類を容易に増殖させることができるとともに、特に窒素、リン、カリウムが欠乏した条件下では、炭化水素を効率よく産生させることもできる。
更に、窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である場合は、培養時、窒素源の消費に伴う水素イオン指数の上昇がみられず、又は少なくとも水素イオン指数の上昇が抑えられ、培地の水素イオン指数が全培養期間を通じて酸性側に維持されるため、微細藻類をより効率よく増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明において用いる培地によりシュードコリシスチスを培養するときに使用した試験器の模式的な斜視図である。
【図２】鉄及び他の微量元素の有無を評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図３】特定の酸化スラグを使用し、培地における鉄量を変化させ、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図４】特定の２種類の酸化スラグを使用し、それぞれ初期の水素イオン指数を変化させ、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図５】図４における培地の相違による培養初期と培養終了時の各々の水素イオン指数を比較して表すグラフである。
【図６】Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び特定の酸化スラグを使用し、それぞれ初期の水素イオン指数を少し高めに設定し、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図７】図６における培地の相違による培養初期と培養終了時の各々の水素イオン指数を比較して表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の微細藻類の培養方法は、酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られる培地を使用する。また、前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されている。更に、培地の初期の水素イオン指数（以下、「ｐＨ」と略記する。）が２．５以上であって、且つ微細藻類の増殖とともにｐＨが２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持される。
尚、［Ｆｅ］／［Ｎ］は、例えば、培地に添加したスラグ酸溶解液に含有される鉄量を、培地に添加した窒素源となる化合物に含有される窒素量で除して算出することができる。
【００１１】
前記「酸性側で培養可能な微細藻類」は特に限定されず、シュードコリシスチス属に属する微細藻類、コッコミキサ属に属する微細藻類、コリシスティス属に属する微細藻類、シアニディウム属に属する微細藻類、及びシアニディオシゾン属、及びガルディエリア属に属する微細藻類などが挙げられる。
【００１２】
シュードコリシスチス属に属する微細藻類は、特に窒素等が欠乏した条件下で、炭化水素を効率よく産生させることができる微細藻類である。このような微細藻類としては、例えば、シュードコリシスチス エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株などが挙げられる。
【００１３】
前記「培地」としては、水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られる培地が使用される。
前記「水」は、特に限定されず、種々の水を用いることができる。この水は、イオン交換水及び純水等の高度に精製された水であってもよく、微細藻類の増殖が阻害されない限り、水道水、工業用水、農業用水及び地下水等の水であってもよい。また、これらの各種の水が混合された水であってもよい。
【００１４】
前記「酸化スラグ」は、製鋼工程の酸化期に発生するスラグであり、還元スラグと比べてシリカ分を多く含有する。この酸化スラグには、鉄、マンガン等の各種の金属元素が含有されるが、酸化スラグを１００質量％とした場合に、鉄は０．１〜５０．０質量％、特に５．０〜４０．０質量％、マンガンは０．１〜２０．０質量％、特に１．０〜１５．０質量％含有される。また、酸化スラグには、通常、カルシウム、シリコン、アルミニウム等の金属元素が含有され、酸化スラグを１００質量％とした場合に、カルシウムは５．０〜３５．０質量％、特に５．０〜３０．０質量％、シリコンは２０．０質量％以下、特に１５．０質量％以下（通常、３．０質量％以上）、アルミニウムは１０．０質量％以下、特に８．０質量％以下（通常、１．０質量％以上）含有される。
【００１５】
前述のように、培地には微量元素の供給源として酸化スラグが添加されるが、この酸化スラグに加えて他のスラグを添加することもできる。このような他のスラグとしては、高炉スラグ、転炉スラグ、合金鉄スラグ、電気炉スラグ等の他、これらのスラグの誘導品が挙げられる。また、これらの各種のスラグ及び誘導品には、酸化スラグと同程度の量の鉄、マンガン等の金属元素等が含有されていることが好ましい。
【００１６】
酸化スラグには、微量金属として培地に添加されることが多い、鉄、マンガン、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、銅、モリブデン、コバルト等の各種の金属元素の他、ホウ素等が含有されており、これらの微量元素が、酸化スラグを添加することで培地に同時に供給されることになる。更に、酸化スラグには、試薬として添加されることが少ない、シリコン、アルミニウム、クロム、ニッケル等の金属元素も含有されており、培地には、これらの金属元素も微量金属として併せて供給され、含有されることになる。
【００１７】
更に、酸化スラグに含有されているものの、含有量が十分ではない微量元素であるカルシウム、コバルト、銅、亜鉛、モリブデン、マグネシウム等は、増量が必要であれば試薬を用いて追加して含有させることができる。このようにして、所定の微量元素が所要量含有される培地とすることができる。
【００１８】
酸化スラグとしては、より具体的には、例えば、表１に記載された元素を、表１に記載された量、含有するスラグが挙げられる。表１に記載された２種類の酸化スラグは、いずれも愛知製鋼社の製鋼工程で発生した酸化スラグであり、後述の実施例においても、これらの酸化スラグを用いた。これらの酸化スラグは、通常、酸によりｐＨが調整された水に添加され、濾過されて得られるスラグ酸溶解液として用いられる。このようにすれば、スラグ酸溶解液における鉄元素等の微量元素の濃度と、培地へのスラグ酸溶解液の添加量とによって、培地における鉄元素等の微量元素の含有量を容易に調整することができ、微細藻類を効率よく増殖させ得る培地とすることができる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
スラグ酸溶解液の調製方法は特に限定されないが、培地に供給され、含有される鉄等の元素は微量であるため、通常、所定量の微量の元素が含有される溶解液を直接調製するのではなく、元素が高濃度に含有される原液を調製する。そして、この原液を少量、又は原液を水により希釈した希釈液を、培地に添加する。このようにすれば、所定量の微量元素が含有される培地を容易に調製することができる。また、原液の調製時、酸化スラグの溶解を促進するため、必要に応じて１５〜６５℃程度に加温することもできるが、培養時の培地の温度を勘案し、即ち、その温度における溶解度を考慮して適宜の温度に加温することが好ましい。
【００２１】
また、酸化スラグにおける鉄元素等の微量元素は酸化物又は複数の金属元素を有する複合金属酸化物の形態で含有されていることが多く、スラグ酸溶解液を調製したときに、水に溶解し、溶解液に含有される微量元素の量はｐＨにより大きく影響を受ける。例えば、ｐＨ１．５〜７．０の範囲における各々の微量元素の溶解量が記載された表２のように、通常、ｐＨ７．０未満の酸性側での溶解量が多い。ここで、必須の微量元素のうち、鉄量（鉄はイオンの状態で含有されており、この鉄量は鉄イオンの総量を意味する。）は、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上である必要があり、例えば、尿素を１９５ｐｐｍ溶解させた培地の場合、培地に対する鉄の溶解量として０．０１５ｐｐｍ以上である必要があり、この溶解量は、０．０３ｐｐｍ以上、特に０．０６ｐｐｍ以上（通常、２．０ｐｐｍ以下）であることが好ましい。従って、増殖の間、培地のｐＨは酸性側に維持されることが好ましい。尚、鉄以外の元素も培地には、通常、イオンの状態で含有されている。
【００２２】
【表２】
【００２３】
更に、培地の初期のｐＨは２．５以上である必要があり、このｐＨは２．５〜１０．０、特に２．５〜７．０であることが好ましい。このように、微細藻類の増殖の観点では、ｐＨは酸性側であることが好ましいのにも拘わらず、初期のｐＨを２．５以上とし、上限を設けていないのは、培地を加熱滅菌したときなどに、窒素源が分解して一時的にｐＨを上昇させることがあるためである。このようなｐＨを上昇させる要因がないときは、培地のｐＨは増殖の初期から終了まで酸性側、例えば、ｐＨ７．０未満（但し、２．５以上）に維持されることが好ましい。
【００２４】
また、本発明では、微細藻類の増殖活動、特に窒素、リン、カリウム分が十分に供給されない状態における増殖活動と、増殖に伴ってｐＨが上昇することのない、又は少なくともｐＨの上昇が押さえられる特定の窒素源を用いること、とにより、増殖の間、微細藻類の増殖とともに培地のｐＨが２．５以上７．０未満、特に２．５〜６．８の範囲に収束されて維持される。このように、培地のｐＨが酸性側に維持されることにより、微細藻類の増殖が効率よくなされるとともに、黴等の雑菌の繁殖が抑えられ、雑菌により微細藻類の増殖が阻害されることもない。
【００２５】
尚、酸化スラグは、水溶液とせず、培地に直接添加することもできる。この場合も、前述のように培地のｐＨが酸性側に維持されるため、所要量の鉄元素等の微量元素が培地に溶解し、培地として十分に機能する。
【００２６】
前記「窒素源となる化合物」としては、前述のように、微細藻類の増殖に伴う窒素源の消費により培地のｐＨが上昇しない、又はｐＨの上昇が十分に抑えられる化合物が用いられる。これにより、培地のｐＨが２．５以上７．０未満、特に２．５〜６．８の範囲に収束され維持されて、微細藻類の増殖が促進される。この窒素源となる化合物としては、ｐＨの上昇が十分に抑えられる限り、特に限定されないが、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等が挙げられ、尿素が特に好ましい。このような化合物を用いることにより、微細藻類が窒素源を消費し、化合物が分解したとしても培地のｐＨがアルカリ側になることがなく、良好な増殖作用が維持される。
【００２７】
また、培地には、窒素源及び微量元素の他、窒素源を除く他の各種の栄養塩、ビタミン等が含有される。他の栄養塩としては、例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウム等のカリウム源及びリン源が挙げられる。また、ビタミンとしては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等の各種のビタミンが挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
［１］培地における鉄及び他の微量元素の有無の影響
参考例１〜３
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）、並びにＣａＣｌ２、Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び微量元素を除いた組成の鉄添加・微量元素無添加予備培地（ｂ）、鉄・微量元素無添加予備培地（ｃ）を作製した。
【００２９】
【表３】
【００３０】
その後、各々の予備培地を扁平なガラスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例１）を調製し、予備培地（ｂ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄添加・微量元素無添加培地（参考例２）を調製した。尚、予備培地（ｃ）は、そのまま鉄・微量元素無添加培地（参考例３）として用いた。また、参考例１、２の培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．００１４となるように調製し、初期のｐＨは参考例１、２及び３ともに４．０となるように塩酸を用いて調整した。
以下、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比を［Ｆｅ］／［Ｎ］と表記する。
【００３１】
次いで、上述の３種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ１内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１５日間培養を継続した。
【００３２】
このようにして、１５日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表４及び図２に記載する。吸光度は、培養初期（表４では培養日数「０」と表記する。）、並びに３日、６日、１０日及び１５日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表４及び図２に記載する。
【００３３】
【表４】
【００３４】
表４及び図２によれば、鉄・微量元素添加培地（参考例１）では良好な増殖が認められた。一方、鉄添加・微量元素無添加培地（参考例２）及び鉄・微量元素無添加培地（参考例３）では、増殖が不良であり、鉄・微量元素添加培地の吸光度に対する比によって表した指標は、それぞれ０．２９、０．３０であり、判定はいずれも×であった。このように、シュードコリシスチスの増殖には鉄及び他の微量元素がいずれも必須であることが裏付けられている。
尚、この培養はガラスフラスコを用いた例であるが、上述の結果は大規模培養（レースウェイを用いた培養等）についても同様に適用することができる。
【００３５】
［２］培地における鉄量の影響
参考例４及び実施例１〜３
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）を作製した。また、表５に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００３６】
【表５】
【００３７】
その後、各々の予備培地を扁平なガラスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（［Ｆｅ］／［Ｎ］；０．００１４）（参考例４）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を添加して酸化スラグを用いた鉄・微量元素添加培地を調製した。この際、［Ｆｅ］／［Ｎ］が、参考例４の培地と同値（０．００１４）（実施例１）、１／２（０．０００７）（実施例２）及び１／４（約０．０００３）（実施例３）に相当する値となるようにスラグ酸溶解液の添加量を調整した。尚、［Ｆｅ］／［Ｎ］が１／２、１／４になるとともに、鉄量が１／２量、１／４量となり、他の微量元素の含有量も１／２量、１／４量になる。
【００３８】
上述のスラグ酸溶解液は、以下のようにして調製した。
１リットルのイオン交換水のｐＨを塩酸により１．５に調整し、このイオン交換水に１０ｇの酸化スラグ［表３に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（１）」］を添加し、その後、攪拌機を用いて１８時間攪拌した。また、攪拌中にｐＨが変動するため、自動ｐＨ調整機により塩酸を滴下することで、ｐＨが１．５に保持されるようにした。攪拌終了後、液を濾紙（Ｎｏ．５Ｂ）を用いて濾過し、スラグ酸溶解液を得た。
【００３９】
その後、上述の４種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ１内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００４０】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表６及び図３に記載する。吸光度は、培養初期（表６では培養日数「０」と表記する。）、並びに２日、４日、７日、９日、１１日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表６及び図３に記載する。
【００４１】
【表６】
【００４２】
表６及び図３によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例４）と、鉄源として酸化スラグを用いた鉄・微量元素添加培地（実施例１〜３）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。また、鉄量がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときと当量（実施例１）である場合ばかりでなく、１／２量（実施例２）及び１／４量（実施例３）とより微量であるときも、増殖作用は同等であり、酸化スラグから供給される鉄等が極めて微量であっても、藻体が十分に増殖し得ることが分かる。
【００４３】
［３］培地の初期ｐＨの影響（その１）
参考例５〜６、実施例４〜７及び比較例１〜２
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）並びにＣａＣｌ２、Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び微量元素を除いた組成の鉄・微量元素無添加予備培地（ｃ）を作製した。また、表４に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００４４】
その後、各々の予備培地を扁平なガスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例５）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を添加して鉄・微量元素添加培地を調製した。尚、予備培地（ｃ）は、そのまま鉄・微量元素無添加培地（参考例６）として用いた。
【００４５】
上述の培地の調製の際、酸化スラグ［表１に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（１）」］が溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが２．０（比較例１）、４．０（実施例４）、６．０（実施例５）となるように調整した。また、酸化スラグ［表１に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（２）」］が溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが２．０（比較例２）、４．０（実施例６）、６．０（実施例７）となるように調整した。
【００４６】
更に、参考例５、６では、塩酸を用いてそれぞれの初期のｐＨが４．０となるように調整した。尚、それぞれの培地の初期のｐＨは上述の値を目標としているが、初期とはいっても実際に測定したのは少し時間が経過した後であり、ばらつきはある。
【００４７】
その後、上述の８種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００４８】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表７及び図４に記載する。吸光度は、培養初期（表７では培養日数「０」と表記する。）、並びに２日、６日、８日、１０日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表７及び図４に記載する。
【００４９】
【表７】
【００５０】
表７及び図４によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例５）と、鉄等の微量元素の供給源として２種類の酸化スラグを使用し、且つ初期のｐＨを４．０又は６．０に調整した鉄・微量元素添加培地（実施例４〜７）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。一方、スラグ酸溶解液を添加し、鉄等の微量元素を所定量含有させた場合であっても、初期のｐＨが２．０と低い比較例１、２では、増殖が不良であり、鉄・微量元素添加培地の吸光度に対する比によって表した指標は、それぞれ０．１２、０．１３であり、判定はいずれも×であった。このように、初期のｐＨが２．５未満であるときは、所定量の鉄等の微量元素が含有されていても、増殖作用に劣ることが分かる。また、前述の参考例３と同様に参考例６でも、指標は０．３４であり、判定は×であった。
【００５１】
［４］培地初期と終了時のｐＨの比較
表７の参考例５〜６、実施例４〜７及び比較例１〜２の各々の培養において、１４日経過後の培養終了時のｐＨを測定し、前述の初期のｐＨからの変化を確認した。結果を表８及び図５に記載する。
【００５２】
【表８】
【００５３】
表８及び図５によれば、良好な増殖作用が得られた参考例５、及び実施例４〜７では、培養終了時の培地のｐＨは３．１２〜３．４３の範囲となっている。このように、シュードコリシスチスの増殖作用に伴って培養終了時のｐＨは酸性領域に収束することが分かる。一方、初期のｐＨが２．０と低過ぎる場合は、増殖作用が不良であり、培養終了時の培地のｐＨに大きな変化はみられなかった。また、同じく増殖作用が不良である参考例６でも、培地のｐＨに大きな変化はみられなかった。
【００５４】
［５］培地の初期ｐＨの影響（その２）
参考例７〜１０、実施例８〜１１
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）を作製した。また、表４に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００５５】
その後、各々の予備培地を扁平なガスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例７〜１０）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液［前述のスラグ（１）を用いた。］を添加して鉄・微量元素添加培地（実施例８〜１１）を調製した。
【００５６】
上述の培地の調製の際、Ｆｅ−ＥＤＴＡを［Ｆｅ］／［Ｎ］が０．００１４となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが４．０（参考例７）、６．０（参考例８）、８．０（参考例９）、１０．０（参考例１０）となるように調整した。また、酸化スラグが溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが４．０（実施例８）、６．０（実施例９）、８．０（実施例１０）、１０．０（実施例１１）となるように調整した。
【００５７】
その後、上述の８種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００５８】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表９及び図６に記載する。吸光度は、培養初期（表９では培養日数「０」と表記する。）、並びに１日、２日、５日、６日、７日、８日、９日、１２日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表９及び図６に記載する。
【００５９】
【表９】
【００６０】
表９及び図６によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを使用し、且つ初期のｐＨを４．０、６．０、８．０又は１０．０に調整した鉄・微量元素添加培地（参考例７〜１０）と、鉄等の微量元素の供給源として酸化スラグを使用し、且つ初期のｐＨを４．０、６．０、８．０又は１０．０に調整した鉄・微量元素添加培地（実施例８〜１１）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。尚、Ｆｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例７）の吸光度に対する比によって表した指標は、参考例８〜１０では１．０８〜１．３８であり、実施例８〜１１では０．８４〜１．２８であり、判定はいずれも○であった。
【００６１】
尚、表５〜７及び９で、培養日数の欄の数値は吸光度である。また、表５等で、「鉄・微量元素添加」等、鉄と微量金属等の微量元素とが別物であるかのように記載してあるが、これは、鉄供給源として、従来、主として環境負荷物質である錯体が用いられているのに対して、本発明では、酸化スラグを用いており、この相違を強調するため、鉄と微量元素とを併記しているものであり、鉄も微量金属元素の１種である。
【００６２】
［６］培地初期と終了時のｐＨの比較
表９の参考例７〜１０及び実施例８〜１１の各々の培養において、１４日経過後の培養終了時のｐＨを測定し、前述の初期のｐＨからの変化を確認した。結果を表１０及び図７に記載する。
【００６３】
【表１０】
【００６４】
表１０及び図７によれば、鉄源がＦｅ−ＥＤＴＡである参考例７〜１０では、培養終了時の培地のｐＨは３．３７〜６．２５であり、鉄源がスラグである実施例８〜１１では、
培養終了時の培地のｐＨは３．５８〜６．６４である。このように、初期のｐＨに拘わらず、シュードコリシスチスの増殖作用に伴って培養終了時のｐＨは酸性領域に収束することが分かる。尚、初期のｐＨが高いほど、培養終了時の培地のｐＨは酸性側ではあるが、高くなる傾向にある。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、微細藻類、特にシュードコリシスチス属に属する微細藻類等を増殖させる培養方法の技術分野において利用することができる。特に鉄等の微量元素の供給源として製鋼工程において発生する酸化スラグを用いているため、本来、廃棄物である資源の再利用という技術分野においても有用である。
【符号の説明】
【００６６】
１００；培養試験装置、１；ガラスフラスコ、２；培養液、３；栓、４；二酸化炭素付加空気の供給口、５；二酸化炭素付加空気の排出口、６；滅菌フィルタ、７；気泡。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法に関する。更に詳しくは、本発明は、酸性側で培養可能な微細藻類、特に炭化水素生産能を有する微細藻類を、鉄、マンガン等の金属元素などの供給源として酸化スラグを用いてなる培地を使用して培養する微細藻類の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源の枯渇、及び地球温暖化等が問題となっており、これらを解決するため化石燃料からの脱却が強く望まれている。このような状況下、バイオ燃料への関心が非常に高まっており、特にトウモロコシ、サトウキビ等の食材由来ではなく、微細藻類由来等の非食バイオ燃料についての基礎研究及び応用開発が進められている。また、微細藻類の培養には、栄養塩、微量金属、ビタミン類等が必要であり、現状では、これらの必須成分は試薬を用いて供給されている。更に、必須成分のうち、鉄等の微量金属の供給源として、環境負荷物質である金属錯体が用いられることが多く（例えば、特許文献１参照。）、これらの環境負荷物質の低減が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１０９５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載された微細藻類を用いた炭化水素の生産方法では、培地における微量金属の供給源として、環境負荷物質であるＦｅ−ＥＤＴＡ等の金属錯体が使用されており、その他の微量金属の供給源としても試薬が用いられている。このような試薬の使用は、必要な金属をそれぞれ用意し、秤量して、所要量を正確に配合することができ、且つ培養の阻害要因となる金属を無用に添加しない点で優れている。しかし、全ての微量金属を試薬で配合したのでは、高価な培地となってしまい、コスト面では不利である。
【０００５】
そこで、これまでの微量金属の供給源としての試薬に替えて、試薬を用いたときと同等の増殖作用が得られ、且つ安価な供給源について検討したところ、製鋼工程の酸化期に発生する酸化スラグが好適であることが見出された。酸化スラグには、鉄、マンガン、銅、コバルト、モリブデン等の金属元素等が含有されており、この酸化スラグの添加により、同時に多くの種類の微量元素を培地に供給することができる。また、酸化スラグは廃棄物として産生するものであり、この酸化スラグを有効な微量元素供給源として用いることで、資源の再利用になるとともに、培地のコストを引き下げることもできる。
本発明は、このような知見に基づいてなされたものである。
【０００６】
本発明は、前記の従来の状況に鑑みてなされたものであり、酸性側で培養可能な微細藻類、特に炭化水素生産能を有する微細藻類を、鉄、マンガン等の金属元素などの供給源として酸化スラグを用いてなる培地を使用して培養する微細藻類の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
１．酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、
水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られた培地を使用し、
前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、
前記培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ前記微細藻類の増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする微細藻類の培養方法。
２．前記微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である前記１．に記載の培養方法。
３．前記窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である前記１．又は２．に記載の微細藻類の培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微細藻類の培養方法によれば、鉄、マンガン等の微量元素の供給源として酸化スラグを用いているため、微量元素のうちの多くを培地に同時に供給することができるとともに、各々の微量元素の供給源として試薬を用いたときと同等の増殖作用が得られる。また、酸化スラグは製鋼工程で発生する廃棄物であり、資源の再利用になるとともに、安価であるため、培地のコストを低減させることもできる。
また、微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である場合は、この微細藻類を容易に増殖させることができるとともに、特に窒素、リン、カリウムが欠乏した条件下では、炭化水素を効率よく産生させることもできる。
更に、窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である場合は、培養時、窒素源の消費に伴う水素イオン指数の上昇がみられず、又は少なくとも水素イオン指数の上昇が抑えられ、培地の水素イオン指数が全培養期間を通じて酸性側に維持されるため、微細藻類をより効率よく増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明において用いる培地によりシュードコリシスチスを培養するときに使用した試験器の模式的な斜視図である。
【図２】鉄及び他の微量元素の有無を評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図３】特定の酸化スラグを使用し、培地における鉄量を変化させ、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図４】特定の２種類の酸化スラグを使用し、それぞれ初期の水素イオン指数を変化させ、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図５】図４における培地の相違による培養初期と培養終了時の各々の水素イオン指数を比較して表すグラフである。
【図６】Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び特定の酸化スラグを使用し、それぞれ初期の水素イオン指数を少し高めに設定し、評価したときの、増殖の指標となる波長７２０ｎｍの可視光線の吸光度と、培養の経過日数との相関を表すグラフである。
【図７】図６における培地の相違による培養初期と培養終了時の各々の水素イオン指数を比較して表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明の微細藻類の培養方法は、酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られる培地を使用する。また、前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されている。更に、培地の初期の水素イオン指数（以下、「ｐＨ」と略記する。）が２．５以上であって、且つ微細藻類の増殖とともにｐＨが２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持される。
尚、［Ｆｅ］／［Ｎ］は、例えば、培地に添加したスラグ酸溶解液に含有される鉄量を、培地に添加した窒素源となる化合物に含有される窒素量で除して算出することができる。
【００１１】
前記「酸性側で培養可能な微細藻類」は特に限定されず、シュードコリシスチス属に属する微細藻類、コッコミキサ属に属する微細藻類、コリシスティス属に属する微細藻類、シアニディウム属に属する微細藻類、及びシアニディオシゾン属、及びガルディエリア属に属する微細藻類などが挙げられる。
【００１２】
シュードコリシスチス属に属する微細藻類は、特に窒素等が欠乏した条件下で、炭化水素を効率よく産生させることができる微細藻類である。このような微細藻類としては、例えば、シュードコリシスチス エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株などが挙げられる。
【００１３】
前記「培地」としては、水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られる培地が使用される。
前記「水」は、特に限定されず、種々の水を用いることができる。この水は、イオン交換水及び純水等の高度に精製された水であってもよく、微細藻類の増殖が阻害されない限り、水道水、工業用水、農業用水及び地下水等の水であってもよい。また、これらの各種の水が混合された水であってもよい。
【００１４】
前記「酸化スラグ」は、製鋼工程の酸化期に発生するスラグであり、還元スラグと比べてシリカ分を多く含有する。この酸化スラグには、鉄、マンガン等の各種の金属元素が含有されるが、酸化スラグを１００質量％とした場合に、鉄は０．１〜５０．０質量％、特に５．０〜４０．０質量％、マンガンは０．１〜２０．０質量％、特に１．０〜１５．０質量％含有される。また、酸化スラグには、通常、カルシウム、シリコン、アルミニウム等の金属元素が含有され、酸化スラグを１００質量％とした場合に、カルシウムは５．０〜３５．０質量％、特に５．０〜３０．０質量％、シリコンは２０．０質量％以下、特に１５．０質量％以下（通常、３．０質量％以上）、アルミニウムは１０．０質量％以下、特に８．０質量％以下（通常、１．０質量％以上）含有される。
【００１５】
前述のように、培地には微量元素の供給源として酸化スラグが添加されるが、この酸化スラグに加えて他のスラグを添加することもできる。このような他のスラグとしては、高炉スラグ、転炉スラグ、合金鉄スラグ、電気炉スラグ等の他、これらのスラグの誘導品が挙げられる。また、これらの各種のスラグ及び誘導品には、酸化スラグと同程度の量の鉄、マンガン等の金属元素等が含有されていることが好ましい。
【００１６】
酸化スラグには、微量金属として培地に添加されることが多い、鉄、マンガン、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、銅、モリブデン、コバルト等の各種の金属元素の他、ホウ素等が含有されており、これらの微量元素が、酸化スラグを添加することで培地に同時に供給されることになる。更に、酸化スラグには、試薬として添加されることが少ない、シリコン、アルミニウム、クロム、ニッケル等の金属元素も含有されており、培地には、これらの金属元素も微量金属として併せて供給され、含有されることになる。
【００１７】
更に、酸化スラグに含有されているものの、含有量が十分ではない微量元素であるカルシウム、コバルト、銅、亜鉛、モリブデン、マグネシウム等は、増量が必要であれば試薬を用いて追加して含有させることができる。このようにして、所定の微量元素が所要量含有される培地とすることができる。
【００１８】
酸化スラグとしては、より具体的には、例えば、表１に記載された元素を、表１に記載された量、含有するスラグが挙げられる。表１に記載された２種類の酸化スラグは、いずれも愛知製鋼社の製鋼工程で発生した酸化スラグであり、後述の実施例においても、これらの酸化スラグを用いた。これらの酸化スラグは、通常、酸によりｐＨが調整された水に添加され、濾過されて得られるスラグ酸溶解液として用いられる。このようにすれば、スラグ酸溶解液における鉄元素等の微量元素の濃度と、培地へのスラグ酸溶解液の添加量とによって、培地における鉄元素等の微量元素の含有量を容易に調整することができ、微細藻類を効率よく増殖させ得る培地とすることができる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
スラグ酸溶解液の調製方法は特に限定されないが、培地に供給され、含有される鉄等の元素は微量であるため、通常、所定量の微量の元素が含有される溶解液を直接調製するのではなく、元素が高濃度に含有される原液を調製する。そして、この原液を少量、又は原液を水により希釈した希釈液を、培地に添加する。このようにすれば、所定量の微量元素が含有される培地を容易に調製することができる。また、原液の調製時、酸化スラグの溶解を促進するため、必要に応じて１５〜６５℃程度に加温することもできるが、培養時の培地の温度を勘案し、即ち、その温度における溶解度を考慮して適宜の温度に加温することが好ましい。
【００２１】
また、酸化スラグにおける鉄元素等の微量元素は酸化物又は複数の金属元素を有する複合金属酸化物の形態で含有されていることが多く、スラグ酸溶解液を調製したときに、水に溶解し、溶解液に含有される微量元素の量はｐＨにより大きく影響を受ける。例えば、ｐＨ１．５〜７．０の範囲における各々の微量元素の溶解量が記載された表２のように、通常、ｐＨ７．０未満の酸性側での溶解量が多い。ここで、必須の微量元素のうち、鉄量（鉄はイオンの状態で含有されており、この鉄量は鉄イオンの総量を意味する。）は、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上である必要があり、例えば、尿素を１９５ｐｐｍ溶解させた培地の場合、培地に対する鉄の溶解量として０．０１５ｐｐｍ以上である必要があり、この溶解量は、０．０３ｐｐｍ以上、特に０．０６ｐｐｍ以上（通常、２．０ｐｐｍ以下）であることが好ましい。従って、増殖の間、培地のｐＨは酸性側に維持されることが好ましい。尚、鉄以外の元素も培地には、通常、イオンの状態で含有されている。
【００２２】
【表２】
【００２３】
更に、培地の初期のｐＨは２．５以上である必要があり、このｐＨは２．５〜１０．０、特に２．５〜７．０であることが好ましい。このように、微細藻類の増殖の観点では、ｐＨは酸性側であることが好ましいのにも拘わらず、初期のｐＨを２．５以上とし、上限を設けていないのは、培地を加熱滅菌したときなどに、窒素源が分解して一時的にｐＨを上昇させることがあるためである。このようなｐＨを上昇させる要因がないときは、培地のｐＨは増殖の初期から終了まで酸性側、例えば、ｐＨ７．０未満（但し、２．５以上）に維持されることが好ましい。
【００２４】
また、本発明では、微細藻類の増殖活動、特に窒素、リン、カリウム分が十分に供給されない状態における増殖活動と、増殖に伴ってｐＨが上昇することのない、又は少なくともｐＨの上昇が押さえられる特定の窒素源を用いること、とにより、増殖の間、微細藻類の増殖とともに培地のｐＨが２．５以上７．０未満、特に２．５〜６．８の範囲に収束されて維持される。このように、培地のｐＨが酸性側に維持されることにより、微細藻類の増殖が効率よくなされるとともに、黴等の雑菌の繁殖が抑えられ、雑菌により微細藻類の増殖が阻害されることもない。
【００２５】
尚、酸化スラグは、水溶液とせず、培地に直接添加することもできる。この場合も、前述のように培地のｐＨが酸性側に維持されるため、所要量の鉄元素等の微量元素が培地に溶解し、培地として十分に機能する。
【００２６】
前記「窒素源となる化合物」としては、前述のように、微細藻類の増殖に伴う窒素源の消費により培地のｐＨが上昇しない、又はｐＨの上昇が十分に抑えられる化合物が用いられる。これにより、培地のｐＨが２．５以上７．０未満、特に２．５〜６．８の範囲に収束され維持されて、微細藻類の増殖が促進される。この窒素源となる化合物としては、ｐＨの上昇が十分に抑えられる限り、特に限定されないが、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等が挙げられ、尿素が特に好ましい。このような化合物を用いることにより、微細藻類が窒素源を消費し、化合物が分解したとしても培地のｐＨがアルカリ側になることがなく、良好な増殖作用が維持される。
【００２７】
また、培地には、窒素源及び微量元素の他、窒素源を除く他の各種の栄養塩、ビタミン等が含有される。他の栄養塩としては、例えば、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウム等のカリウム源及びリン源が挙げられる。また、ビタミンとしては、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等の各種のビタミンが挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
［１］培地における鉄及び他の微量元素の有無の影響
参考例１〜３
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）、並びにＣａＣｌ２、Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び微量元素を除いた組成の鉄添加・微量元素無添加予備培地（ｂ）、鉄・微量元素無添加予備培地（ｃ）を作製した。
【００２９】
【表３】
【００３０】
その後、各々の予備培地を扁平なガラスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例１）を調製し、予備培地（ｂ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄添加・微量元素無添加培地（参考例２）を調製した。尚、予備培地（ｃ）は、そのまま鉄・微量元素無添加培地（参考例３）として用いた。また、参考例１、２の培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．００１４となるように調製し、初期のｐＨは参考例１、２及び３ともに４．０となるように塩酸を用いて調整した。
以下、培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比を［Ｆｅ］／［Ｎ］と表記する。
【００３１】
次いで、上述の３種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ１内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１５日間培養を継続した。
【００３２】
このようにして、１５日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表４及び図２に記載する。吸光度は、培養初期（表４では培養日数「０」と表記する。）、並びに３日、６日、１０日及び１５日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表４及び図２に記載する。
【００３３】
【表４】
【００３４】
表４及び図２によれば、鉄・微量元素添加培地（参考例１）では良好な増殖が認められた。一方、鉄添加・微量元素無添加培地（参考例２）及び鉄・微量元素無添加培地（参考例３）では、増殖が不良であり、鉄・微量元素添加培地の吸光度に対する比によって表した指標は、それぞれ０．２９、０．３０であり、判定はいずれも×であった。このように、シュードコリシスチスの増殖には鉄及び他の微量元素がいずれも必須であることが裏付けられている。
尚、この培養はガラスフラスコを用いた例であるが、上述の結果は大規模培養（レースウェイを用いた培養等）についても同様に適用することができる。
【００３５】
［２］培地における鉄量の影響
参考例４及び実施例１〜３
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）を作製した。また、表５に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００３６】
【表５】
【００３７】
その後、各々の予備培地を扁平なガラスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（［Ｆｅ］／［Ｎ］；０．００１４）（参考例４）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を添加して酸化スラグを用いた鉄・微量元素添加培地を調製した。この際、［Ｆｅ］／［Ｎ］が、参考例４の培地と同値（０．００１４）（実施例１）、１／２（０．０００７）（実施例２）及び１／４（約０．０００３）（実施例３）に相当する値となるようにスラグ酸溶解液の添加量を調整した。尚、［Ｆｅ］／［Ｎ］が１／２、１／４になるとともに、鉄量が１／２量、１／４量となり、他の微量元素の含有量も１／２量、１／４量になる。
【００３８】
上述のスラグ酸溶解液は、以下のようにして調製した。
１リットルのイオン交換水のｐＨを塩酸により１．５に調整し、このイオン交換水に１０ｇの酸化スラグ［表３に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（１）」］を添加し、その後、攪拌機を用いて１８時間攪拌した。また、攪拌中にｐＨが変動するため、自動ｐＨ調整機により塩酸を滴下することで、ｐＨが１．５に保持されるようにした。攪拌終了後、液を濾紙（Ｎｏ．５Ｂ）を用いて濾過し、スラグ酸溶解液を得た。
【００３９】
その後、上述の４種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ１内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００４０】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表６及び図３に記載する。吸光度は、培養初期（表６では培養日数「０」と表記する。）、並びに２日、４日、７日、９日、１１日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表６及び図３に記載する。
【００４１】
【表６】
【００４２】
表６及び図３によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例４）と、鉄源として酸化スラグを用いた鉄・微量元素添加培地（実施例１〜３）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。また、鉄量がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときと当量（実施例１）である場合ばかりでなく、１／２量（実施例２）及び１／４量（実施例３）とより微量であるときも、増殖作用は同等であり、酸化スラグから供給される鉄等が極めて微量であっても、藻体が十分に増殖し得ることが分かる。
【００４３】
［３］培地の初期ｐＨの影響（その１）
参考例５〜６、実施例４〜７及び比較例１〜２
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）並びにＣａＣｌ２、Ｆｅ−ＥＤＴＡ及び微量元素を除いた組成の鉄・微量元素無添加予備培地（ｃ）を作製した。また、表４に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００４４】
その後、各々の予備培地を扁平なガスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例５）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を添加して鉄・微量元素添加培地を調製した。尚、予備培地（ｃ）は、そのまま鉄・微量元素無添加培地（参考例６）として用いた。
【００４５】
上述の培地の調製の際、酸化スラグ［表１に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（１）」］が溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが２．０（比較例１）、４．０（実施例４）、６．０（実施例５）となるように調整した。また、酸化スラグ［表１に記載された愛知製鋼社の製鋼工程で発生したスラグ「スラグ（２）」］が溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが２．０（比較例２）、４．０（実施例６）、６．０（実施例７）となるように調整した。
【００４６】
更に、参考例５、６では、塩酸を用いてそれぞれの初期のｐＨが４．０となるように調整した。尚、それぞれの培地の初期のｐＨは上述の値を目標としているが、初期とはいっても実際に測定したのは少し時間が経過した後であり、ばらつきはある。
【００４７】
その後、上述の８種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００４８】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表７及び図４に記載する。吸光度は、培養初期（表７では培養日数「０」と表記する。）、並びに２日、６日、８日、１０日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表７及び図４に記載する。
【００４９】
【表７】
【００５０】
表７及び図４によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例５）と、鉄等の微量元素の供給源として２種類の酸化スラグを使用し、且つ初期のｐＨを４．０又は６．０に調整した鉄・微量元素添加培地（実施例４〜７）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。一方、スラグ酸溶解液を添加し、鉄等の微量元素を所定量含有させた場合であっても、初期のｐＨが２．０と低い比較例１、２では、増殖が不良であり、鉄・微量元素添加培地の吸光度に対する比によって表した指標は、それぞれ０．１２、０．１３であり、判定はいずれも×であった。このように、初期のｐＨが２．５未満であるときは、所定量の鉄等の微量元素が含有されていても、増殖作用に劣ることが分かる。また、前述の参考例３と同様に参考例６でも、指標は０．３４であり、判定は×であった。
【００５１】
［４］培地初期と終了時のｐＨの比較
表７の参考例５〜６、実施例４〜７及び比較例１〜２の各々の培養において、１４日経過後の培養終了時のｐＨを測定し、前述の初期のｐＨからの変化を確認した。結果を表８及び図５に記載する。
【００５２】
【表８】
【００５３】
表８及び図５によれば、良好な増殖作用が得られた参考例５、及び実施例４〜７では、培養終了時の培地のｐＨは３．１２〜３．４３の範囲となっている。このように、シュードコリシスチスの増殖作用に伴って培養終了時のｐＨは酸性領域に収束することが分かる。一方、初期のｐＨが２．０と低過ぎる場合は、増殖作用が不良であり、培養終了時の培地のｐＨに大きな変化はみられなかった。また、同じく増殖作用が不良である参考例６でも、培地のｐＨに大きな変化はみられなかった。
【００５４】
［５］培地の初期ｐＨの影響（その２）
参考例７〜１０、実施例８〜１１
蒸留水を用いて、表３に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ａ）を作製した。また、表４に記載の組成のうちＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液を除いた組成の鉄・微量元素添加予備培地（ｄ）を作製した。
【００５５】
その後、各々の予備培地を扁平なガスフラスコ１（稼働容量５００ミリリットル、図１の試験器１００参照）に投入し、加圧滅菌した。次いで、予備培地（ａ）にＣａＣｌ２及びＦｅ−ＥＤＴＡを添加して鉄・微量元素添加培地（参考例７〜１０）を調製した。更に、予備培地（ｄ）にＣａＣｌ２及びスラグ酸溶解液［前述のスラグ（１）を用いた。］を添加して鉄・微量元素添加培地（実施例８〜１１）を調製した。
【００５６】
上述の培地の調製の際、Ｆｅ−ＥＤＴＡを［Ｆｅ］／［Ｎ］が０．００１４となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが４．０（参考例７）、６．０（参考例８）、８．０（参考例９）、１０．０（参考例１０）となるように調整した。また、酸化スラグが溶解したスラグ酸溶解液を、［Ｆｅ］／［Ｎ］がＦｅ−ＥＤＴＡを用いたときの１／２（０．０００７）となるように添加し、塩酸を用いて初期のｐＨが４．０（実施例８）、６．０（実施例９）、８．０（実施例１０）、１０．０（実施例１１）となるように調整した。
【００５７】
その後、上述の８種類の培地の各々にシュードコリシスチスを植菌し、通気性を有する栓３をし、１体積％の二酸化炭素を付加した空気を通気量０．３ｖｖｍの速度で供給口４から供給し、排出口５から排出させて流通させるとともに、ガラスフラスコ１内の培養液２を攪拌した。同時に、ガラスフラスコ１の周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、ガラスフラスコ内の雰囲気温度を２８℃付近に調整して、１４日間培養を継続した。
【００５８】
このようにして、１４日間培養したときの菌の増殖を、波長７２０ｎｍの可視光の吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、評価した。評価結果を表９及び図６に記載する。吸光度は、培養初期（表９では培養日数「０」と表記する。）、並びに１日、２日、５日、６日、７日、８日、９日、１２日及び１４日経過した時点で測定し、各時点での吸光度により増殖作用を評価した。結果を表９及び図６に記載する。
【００５９】
【表９】
【００６０】
表９及び図６によれば、鉄源としてＦｅ−ＥＤＴＡを使用し、且つ初期のｐＨを４．０、６．０、８．０又は１０．０に調整した鉄・微量元素添加培地（参考例７〜１０）と、鉄等の微量元素の供給源として酸化スラグを使用し、且つ初期のｐＨを４．０、６．０、８．０又は１０．０に調整した鉄・微量元素添加培地（実施例８〜１１）とで、増殖作用に大差はなく、試薬に替えて酸化スラグを用いたときも、同等の作用効果が得られることが分かる。尚、Ｆｅ−ＥＤＴＡを用いた鉄・微量元素添加培地（参考例７）の吸光度に対する比によって表した指標は、参考例８〜１０では１．０８〜１．３８であり、実施例８〜１１では０．８４〜１．２８であり、判定はいずれも○であった。
【００６１】
尚、表５〜７及び９で、培養日数の欄の数値は吸光度である。また、表５等で、「鉄・微量元素添加」等、鉄と微量金属等の微量元素とが別物であるかのように記載してあるが、これは、鉄供給源として、従来、主として環境負荷物質である錯体が用いられているのに対して、本発明では、酸化スラグを用いており、この相違を強調するため、鉄と微量元素とを併記しているものであり、鉄も微量金属元素の１種である。
【００６２】
［６］培地初期と終了時のｐＨの比較
表９の参考例７〜１０及び実施例８〜１１の各々の培養において、１４日経過後の培養終了時のｐＨを測定し、前述の初期のｐＨからの変化を確認した。結果を表１０及び図７に記載する。
【００６３】
【表１０】
【００６４】
表１０及び図７によれば、鉄源がＦｅ−ＥＤＴＡである参考例７〜１０では、培養終了時の培地のｐＨは３．３７〜６．２５であり、鉄源がスラグである実施例８〜１１では、
培養終了時の培地のｐＨは３．５８〜６．６４である。このように、初期のｐＨに拘わらず、シュードコリシスチスの増殖作用に伴って培養終了時のｐＨは酸性領域に収束することが分かる。尚、初期のｐＨが高いほど、培養終了時の培地のｐＨは酸性側ではあるが、高くなる傾向にある。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、微細藻類、特にシュードコリシスチス属に属する微細藻類等を増殖させる培養方法の技術分野において利用することができる。特に鉄等の微量元素の供給源として製鋼工程において発生する酸化スラグを用いているため、本来、廃棄物である資源の再利用という技術分野においても有用である。
【符号の説明】
【００６６】
１００；培養試験装置、１；ガラスフラスコ、２；培養液、３；栓、４；二酸化炭素付加空気の供給口、５；二酸化炭素付加空気の排出口、６；滅菌フィルタ、７；気泡。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、
水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られた培地を使用し、
前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、
前記培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ前記微細藻類の増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である請求項１又は２に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項１】
酸性側で培養可能な微細藻類の培養方法であって、
水に、少なくとも、酸化スラグと、窒素源となる化合物とが添加されて得られた培地を使用し、
前記培地に溶解している初期の鉄量［Ｆｅ］と、前記培地に溶解している初期の窒素量［Ｎ］との比（［Ｆｅ］／［Ｎ］）が０．０００２以上となるように調整されており、
前記培地の初期の水素イオン指数が２．５以上であって、且つ前記微細藻類の増殖とともに水素イオン指数が２．５以上７．０未満の範囲に収束されて維持されることを特徴とする微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、シュードコリシスチス属に属する微細藻類である請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記窒素源となる化合物が尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウムのうちの少なくとも１種である請求項１又は２に記載の微細藻類の培養方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−１３３４３（Ｐ２０１３−１３３４３Ａ）
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４６７３４（Ｐ２０１１−１４６７３４）
【出願日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（０００１１６６５５）愛知製鋼株式会社 (141)
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（０００１１６６５５）愛知製鋼株式会社 (141)
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【Ｆターム（参考）】
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