心臓血管疾患の危険を評価するためのＰＡＲ１多型の解析および使用
本発明は、３０９０位および／または３３２９位にＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異を含むポリヌクレオチド配列に関する。驚くべきことに、ヒトにおける前記変異体の存在は、特定の心臓血管疾患と関連する。本発明はまた、前記遺伝学的変異の検出方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＲ１遺伝子の３０９０および／または３３２９位に遺伝学的変異を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＣＰＲ）のクラスに属するトロンビン受容体であり、ＰＡＲ１に関する遺伝子は、染色体５ｑ１３に位置し、２つのエキソンを含み、約２７ｋｂの領域をカバーしている。ＰＡＲ１は、特に、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ニューロンおよびヒト血小板で発現される。血小板において、ＰＡＲ１は、血小板の凝集の開始に関与する重要なシグナル伝達受容体である。ＰＡＲは、ＰＡＲのＮ末端の一部をタンパク質分解で除去し、それにより新しいＮ末端配列が露出することによって活性化され、次に、受容体を活性化する。ＰＡＲ１およびＰＡＲ４は、血小板の活性化において中心的な役割を果たす；血小板におけるこれら受容体の活性化により、形態学的な変化が起こり、ＡＤＰが放出され、前記血小板が凝集する。
【０００３】
韓国人の患者群では、冠動脈心疾患と、ＰＡＲ１のプロモーター領域における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）との関係は確認されていない。他の研究において、ＰＡＲ１プロモーターの変異体は、静脈の血栓塞栓症の発症に関する防御的な作用を有することを示した。
【０００４】
ヒトＰＡＲ１遺伝子の配列は既知である。この遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、番号ＮＭ−００１９９２で利用可能である。同様に、そのタンパク質配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、番号ＮＰ−００１９８３で利用可能である。ＮＣＢＩとは、国立バイオテクノロジー情報センターのことである（所在地：国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州，２０８９４，米国；ウェブアドレス：www.ncbi.nhm.nih.gov）。ＰＡＲ１遺伝子のクローニングは、特に、「Ｓｃｈｍｉｄｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９３０７〜９３１２，１９９６」で説明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＡＲ１遺伝子の様々な新規の多型があり、それにより、個体の冠動脈心疾患に関する比較的強い素因を決定することができる。これによって、影響を受けた個体は、適切な時期に、例えば喫煙、アルコール摂取、コレステロール豊富な食物、高血圧などのようなその他の有害な影響をさらにコントロールして埋め合わせることにより生活様式を適宜に適合させて、この危険因子を中和することができる。
【０００６】
このような健康に関連する予防的メカニズムは、ＰＡＲ１多型の情報（以下でより詳細に説明される）と対応する方法におけるそれらの使用なしには不可能と予想される。
【０００７】
１個単位の位置に置換を含む特定のヌクレオチド配列の変異体は、用語「ＳＮＰ」（＝単一ヌクレオチド多型）として当業者既知である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換（従来技術として公共的に利用可能である）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３０９０位におけるＴからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２の配列からなる。
【０００９】
さらに本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３３２９位にＡからＣへの置換（従来技術として公共的に利用可能である）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３３２９位におけるＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列からなる。
【００１０】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位にＴからＣへの置換、同時に、前記ＰＡＲ１配列の３３２９位にＡからＶへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３０９０位にＴからＣへの置換、同時に３３２９位にＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、配列番号５に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関する。
【００１２】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号６に記載の配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号７に記載の配列を含む。
【００１４】
本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位でのＴからＣへの置換、同時に、前記ＰＡＲ１配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号８に記載の配列からなる。
【００１５】
さらに本発明は、ＰＡＲ１のｃＤＮＡ遺伝子の３５９２塩基対のポリヌクレオチド配列の製造を含み、前記配列は、上記で定義された３０９０位および３３２９位での多型を、それぞれ、または組合せて含んでもよいし、含まなくてもよく、その製造は、以下の方法の工程を含む：
ａ］配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号９および配列番号１０に記載の配列を有するプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によってＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列を増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られた３．５６ｋｂのフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］からのフラグメントを配列解析すること。
【００１６】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列の製造に関し、本製造は、以下の方法の工程を含む：
ａ］配列番号１に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトゲノムＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって、ＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列のフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られたフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］からのフラグメントを配列解析すること。
【００１７】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ＰＣＲ反応により、配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］からのポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
【００１８】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］逆転写酵素によって、前記ＲＮＡをｃＤＮＡに転写すること、
ｄ］必要に応じて、前記ＰＣＲ反応によって、配列番号１０および配列番号１１に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｅ］ｃ］に記載のｃＤＮＡ、および／または、ｄ］に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
【００１９】
本発明はまた、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載の染色体ＤＮＡをサザンブロットすること、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのサザンブロットと、ｄ］からのプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ｅ］からのハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること。
【００２０】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む；
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載のＲＮＡをノーザンブロットすること、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのノーザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること。
【００２１】
ＰＡＲ１遺伝子における３０９０位および／または３３２９位での遺伝学的変異または多型の検出は、（ａ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症の危険を評価するための遺伝子マーカー、（ｂ）相当する遺伝子変異キャリアーの心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または安定狭心症を予防的処置するためのマーカー、（ｃ）投与しようとする心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬活性物質の用量を調整するためのマーカー、（ｄ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬活性物質を同定するためのハイスループット−スクリーニング法を決定するためのマーカー、（ｅ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬物質の忍容性、安全性および有効性を試験する臨床研究のために、関連のある個体または患者を同定するマーカー、および、（ｆ）ＰＡＲ１遺伝子における遺伝学的変異をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで解析するための分析システムを開発するための基礎として用いてもよい。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列に関し、好ましくは、前記配列は、配列番号１１を含む。さらに本発明は、配列番号１２に記載の配列からなる２０〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列に関する。好ましくは、前記配列は、配列番号１２を含む。
【００２３】
本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって対応するＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するための、配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列と、配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列を含む２０〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列とを組合せた使用に関する。好ましくは、この使用は、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換を有する、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のフラグメントの増幅に関する。
【００２４】
その上、本発明は、成分のキットを含み、本キットは、以下を含む：
ａ］配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列からなる、単離された、長さが２１〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列、
ｂ］配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列からなる、単離された、長さが２０〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための少なくとも１種の酵素、
ｄ］必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応を行うための物質および／または溶液、 ｅ］必要に応じて、全長および／またはそれらの一部に、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の３３２９位における置換を有する、または有さない、ＰＡＲ１遺伝子を包含するポリヌクレオチド配列、
ｆ］および、必要に応じて、配列解析反応を行うための試薬。
【００２５】
ここで成分のキットとは、前記成分が、機能単位中で互いに空間的に近い位置に組み入れられた組合せを意味する。
【００２６】
さらに本発明は、上述の成分のキットの製造に関し、以下を含む：
ａ］配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列からなる、単離された、長さが２１〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｂ］配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列からなる、単離された、長さが２０〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための酵素を提供すること、
ｄ］必要に応じて、配列解析を行うための試薬を提供すること、
ｅ］必要に応じて、前期ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液を提供すること、
ｆ］必要に応じて、ＰＡＲ１遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を提供すること、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、いずれの場合においても、全長またはそれらの一部に、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含んでもよいし、または含まなくてもよい、
ｇ］適切な容器中で、ａ］からの成分を、いずれの場合においても別々にｆ］に導入すること、
ｈ］必要に応じて、ｇ］に記載の容器を、１またはそれ以上のパック単位に合わせること。
【００２７】
上述の成分のキットは、ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するのに用いてもよい。
【００２８】
本発明の技術的な形態を、以下の実施形態でより詳細に説明する。
【００２９】
単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって増幅することにより製造してもよい。この目的に適切したプライマーは、配列番号９および配列番号１０に記載される。
【００３０】
ＰＣＲは、２種の既知の配列が両端にあるポリヌクレオチド断片を選択的に複製することに用いられるインビトロの技術である。増幅には、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートの定義された配列の末端に相補的な短い一本鎖ＤＮＡ分子（プライマー）が必要である。ＤＮＡポリメラーゼは、正確な反応条件下で、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、一本鎖の変性したポリヌクレオチドテンプレートに沿ってプライマーを伸長させ、このようにして、前記テンプレートに配列が相補的な新しいＤＮＡ鎖が合成される。このプロセスの際、繰り返してポリヌクレオチド鎖が変性し、プライマーが付着し、伸長されるように、温度を規則的な間隔で変化させる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）が用いられる。典型的なＰＣＲ反応混合物は、ポリヌクレオチドテンプレート以外に、２種の適切なプライマーヌクレオチド（例えば０．２〜２μＭの濃度で）、さらに、ｄＮＴＰ（例えば各ｄＮＰＴあたり２００μＭの濃度で）、さらに、ＭｇＣｌ2（１〜２ｍＭの濃度で）、および、例えばＴａｑポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ）のような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（１〜１０ユニット）を含む。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼや、上記ＰＣＲを行うための成分、さらにプロトコールは、例えばロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのような多数の会社から市販されている。
【００３１】
単離しようとするポリヌクレオチド配列を増幅するためのポリヌクレオチドテンプレートは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で存在してもよい。次に、ポリヌクレオチドテンプレートがＲＮＡの場合、実際のＰＣＲ反応の前に、そのＲＮＡは逆転写酵素によってＤＮＡに転写される。ＰＣＲ反応を行うためのポリヌクレオチドテンプレートの量は、例えば０．０１〜２０ｎｇの範囲であり得る。
【００３２】
ポリヌクレオチドテンプレートは、生物材料からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを得るための当業者既知の技術を用いて得られる。本発明における生物材料としては、特に、ヒトなどの脊椎動物の組織または器官の細胞（例えば脳、血液、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、血管）、もしくは、真核細胞培養物由来の細胞（例えばＨｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞）、もしくは、単離しようとするＤＮＡ配列がクローンされた形態で存在する細菌または酵母などの細胞が挙げられる。
【００３３】
ヒトなどの脊椎動物の組織集合体または器官の細胞は、血液の採取、組織の穿刺または外科的技術によって得てもよい。例えば、細胞を破壊し、必要に応じて個々の細胞器官（特に細胞核）を濃縮し、沈殿や遠心分離によりＤＮＡまたはＲＮＡを回収することによって、それらからポリヌクレオチドテンプレートを得てもよい。
【００３４】
単離された、ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列を製造するその他の方法は、ＰＡＲ１遺伝子をクローニングし、続いてその遺伝子を細菌または酵母中で発現させ、発現されたポリヌクレオチドを精製することを含む。例えば、上述のＰＣＲ反応は、クローン可能なポリヌクレオチドフラグメントを製造するのに適している。フラグメントをクローニングするには、相補配列の反応酵素の５’の認識配列からなるプライマーを用いることが有利である。２種のプライマーには、それぞれ同一または異なる制限酵素の認識配列を用いることができる。
【００３５】
一般的な制限酵素の例は、以下の通りである：ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）、ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧ１）。
【００３６】
クローニングのために、ベクターは、プライマーに付加された認識配列に対応する制限酵素で処理される。フラグメントを単離し、同じ制限酵素で処理して、リガーゼによってベクターに連結する。ベクターは、例えばプラスミド、バクテリオファージまたはコスミドのようなＤＮＡ分子を意味し、それを用いることによって、遺伝子またはその他のＤＮＡ配列をクローニングし、複製のためにそれらを細菌または真核細胞に導入することができる。ベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３，１のようなＤＮＡ分子が挙げられ、ベクターは、ロシュ・ダイアグノスティックス、ニューイングランドバイオラボ、プロメガ、ストラタジーンなどのようなバイオテクノロジー系材料専門の会社から市販されている。
【００３７】
ポリヌクレオチドを提供するため、またはクローニング手順を行うためのＰＣＲ反応を行うのに必要な説明は、標準的なマニュアルで、配合表およびプロトコールの様式で当業者により見ることができ、このようなマニュアルとしては、例えば、ａ］“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集者），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（編集者），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編集者），Ｄａｖｉｄ Ｄ，Ｍｏｏｒｅ（編集者），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編集者），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（編集者），ルーズリーフ版，継続的に更新中，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク、または、ｂ］Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第五版，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集者），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（編集者），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編集者），Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（編集者），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編集者），Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ（編集者），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（編集者），２００２年１０月，ジョン・ワイリー＆サンズ社，ニューヨーク”、または、ｃ］“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｃｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）”が挙げられる。
【００３８】
適切なプライマー配列は、例えばそれらを化学合成することによって提供されるが、これは、例えばＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの会社に注文して行ってもよい。
【００３９】
様々な器官由来のヒトｃＤＮＡは、例えばプロメガ、ストラタジーンなどの会社から市販されている。
【００４０】
ポリヌクレオチドの配列解析は、例えば、ライフテクノロジーズ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）などのような会社製の実験用ロボットを用いて、当業者既知の習慣的な方法で行われる。
【００４１】
ＰＡＲ１変異体の単離されたポリヌクレオチド配列およびそれら由来のフラグメントはまた、様々なストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションに用いてもよい。ストリンジェンシーは、２つの一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションまたは結合特異性に影響する反応条件を説明するものである。ストリンジェンシー、すなわち反応特異性は、温度を高くすること、および、イオン強度を低くすることによって高くすることができる。例えば、２×ＳＳＣ溶液中で室温でハイブリダイゼーションが行われる場合、低ストリンジェンシー条件が提供される。例えば０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃でハイブリダイゼーションが行われる場合、高ストリンジェンシー条件が提供される。
【００４２】
本願に係るストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、以下を意味する：
１］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．５ｍｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ中で、一晩、標識されたプローブと研究しようとするサンプルとをハイブリダイズさせること、
２］室温で、２×ＳＳＣ中で、１０分間洗浄すること、
３］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること、
４］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること、
５］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること。
【００４３】
この目的では、全長で２０個の長さを有するヌクレオチドのＤＮＡフラグメントがオリゴヌクレオチドとみなされる。融解温度は、式Ｔｍ＝２（Ａ＋Ｔの数）＋４（Ｇ＋Ｃの数）℃より得られる。
【００４４】
２×ＳＳＣ、または、０．１×ＳＳＣ溶液は、２０×ＳＳＣ溶液を適宜に希釈することによって製造される。２０×ＳＳＣ溶液は、３ＭのＮａＣｌ／０．３クエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ溶液を含み、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、研究しようとするポリヌクレオチドを、電気泳動分画し、続いて変性させた後、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンにトランスファーすることによって行われる（サザンブロット−ＤＮＡ；ノーザンブロット−ＲＮＡ）。ハイブリダイゼーションは、放射標識されたプローブ、または、その他の方法（例えば蛍光色素を用いて）で標識されたプローブを用いて行われる、。プローブは、通常、一本鎖および／または変性ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列を含み、再び一本鎖にした、および／または変性させた研究しようとするＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列の相補ヌクレオチド配列に結合する。
【００４６】
ＰＡＲ１遺伝子の単一ヌクレオチド多型は、本発明のプライマーを用いて、または、ＳＳＣＰの分析によって検出することができる、。ＳＳＣＰとは、一本鎖高次構造多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の略であり、これは、個々の塩基対の置換を同定するための電気泳動技術である。研究しようとするポリヌクレオチドは、一本鎖に変性させた後に、標識されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分画される。研究しようとするＤＮＡフラグメントが個々の塩基対の置換を示す場合、それらは異なるコンフォメーションを有するため、ＰＡＧＥにおいて異なる率で移動する。
【００４７】
ＰＣＲを行うための物質の例は、緩衝液、例えばＨｅｐｅｓまたはトリス、さらに、ｄＡＰＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＭｇ2+、必要に応じて、さらに二価または一価の鉄である。これら物質は、溶液に溶解させた状態で含まれる。
【実施例】
【００４８】
ＰＡＲ１遺伝子のゲノム領域の増幅
以下のプライマーを用いて、ＰＡＲ１配列における、３０９０位におけるＴからＣへヌクレオチド置換、および、３３２９位におけるＡからＣへの置換を検出した：
プライマー１：５’−ＡＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１１）
プライマー２：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣ−３（配列番号１２）。
プライマー１（配列番号１１）は、ＮＭ−００１９９２参照配列の２７６７〜２７８９位に対応する。プライマー２は、ＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１由来である。
【００４９】
増幅のためのＰＣＲプロトコール：
用いられた試薬は、アプライド・バイオシステムズより得た（フォスターシティー，米国）：
ゲノムＤＮＡ、２０ｎｇ；ＴａｑＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、１ユニット；１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2：２００ｎＭの
各増幅プライマー対；Ｈ2Ｏ、５μｌまで。
【００５０】
遺伝子型解析のためのＰＣＲ増幅プログラム
９５℃で１０分間を、１サイクル；
９５℃で３０秒、７０℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、６５℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒を、４０サイクル；
７２℃で１０分、４℃で３０秒を、１サイクル。
【００５１】
ＳＮＰの同定
ミニシーケンス配列解析およびＳＮＰの検出のためのプロトコール
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー，米国）より得た。精製したＰＣＲ産物、２μｌ；ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ）、１．５μｌ；２００ｎＭの配列解析用プライマー；Ｈ2Ｏ、１０μｌまで。
【００５２】
配列解析のための増幅プログラム：
９６℃で２分を、１サイクル；
９６℃で１０秒、５５℃で１０秒、６５℃で４分間を、３０サイクル；
７２℃で７分、４℃で３０秒を、１サイクル。
【００５３】
配列解析産物の解析：
まず、配列解析ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，米国）を用いて配列を解析し、生データを得て、次に、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄおよびＣｏｎｓｅｄを用いて加工した。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄとＣｏｎｓｅｄは、ワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（http://www.genome.Washington.edu）で、Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎによって作成されたソフトウェアである。
【００５４】
ＰＡＲ１のＳＮＰの、冠動脈疾患への割り当て
臨床研究で、患者の同齢集団で、ＰＡＲ１遺伝子の３’非コード領域からの２種のＰＡＲ１多型を、血栓および心臓血管系の合併症との関係に関して研究した。
【００５５】
下記の略語は、以下のように用いられる（示された全ての位置は、参照配列ＮＭ−００１９９２におけるヌクレオチド位置を意味する）。
ＰＡＲ１Ｔ３０９０Ｔは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３０９０位にチミジン（Ｔ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ｔ３０９０Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の一方の対立遺伝子が３０９０位にシチジン（Ｃ）を有し、ＰＡＲ１遺伝子の他方の対立遺伝子が３０９０位にチミジン（Ｔ）を有する個体群を示す。これらの個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ヘテロ接合型である。
ＰＡＲ１Ｃ３０９０Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３０９０位にシチジン（Ｃ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ａ３３２９Ａは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３３２９位にアデノシン（Ａ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ａ３３２９Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の一方の対立遺伝子が３３２９位にシチジン（Ｃ）を有し、ＰＡＲ１遺伝子の他方の対立遺伝子が３３２９位にアデノシン（Ａ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ヘテロ接合型である。
ＰＡＲ１Ｃ３３２９Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３３２９位にシチジン（Ｃ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
【００５６】
解析された患者群において（図１）、ＰＡＲ１変異体Ｃ３０９０Ｃのホモ接合型キャリアーと、心房細動および心筋症との統計学的に有意な関連が観察された。ロジスティック回帰を行ったところ、ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃのホモ接合型キャリアーにおいて、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０／Ｔ３０９０Ｔのキャリアーと比較して心房細動の危険が１．９７倍増加、心筋症の危険が１．８４倍増加したことがわかった（図３）。
【００５７】
ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーに関して、前記変異体は、心房細動の危険が、ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ａ／Ａ３３２９Ａのキャリアーと比較して２．３５倍増加したことに関連があることが示された。ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーにおいて、前記変異体は、急性冠症候群および不安定狭心症の出現の観点で、さらに防御的のようである。ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーにおいて、急性冠症候群および／または不安定狭心症の出現の危険が、ＰＡＲ１変異Ａ３３２９Ｃ／Ａ３３２９Ａのキャリアーと比較して２．７８倍減少した（図４）。
【００５８】
それゆえに、本発明の方法によって、および、特定のＳＮＰ型の単離されたＰＡＲ１配列またはそれらのフラグメントを用いて、ヒト個体が、提示された結果に関して、危険群に割り当てられるかどうかを決定することが可能である。
【００５９】
プラスミドＤＮＡの製造
細菌の一晩の培養物１ｍｌを、エッペンドルフチューブに移し、ヘレウス・バイオフューズ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ）で、遠心分離した（５０００ｒｐｍで５分間）。細菌細胞ペレットを冷却した溶液Ｉ（１００μｌ）に再懸濁し、次に、氷上に５分間置いた。
溶液Ｉ：２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのグルコース（滅菌ろ過した）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ。
溶液ＩＩを２００μｌ添加した後、混合物全体をよく混合したところ、ＤＮＡのアルカリ変性が起こった。
溶液ＩＩ：２００ｍＭのＮａＯＨ，１％ＳＤＳ。
その後氷上で５分間インキュベートした後に、その混合物に溶液ＩＩＩを１５０μｌ添加した。続いて再度混合し、さらに１５分間氷上でインキュベートした。
溶液ＩＩＩ：３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）。
１２０００ｒｐｍで１５分間ヘレウス・バイオフューズで遠心分離して、細胞の破片、ゲノムＤＮＡおよび変性タンパク質を除去した。得られたプラスミドＤＮＡを含む上清を、第二のエッペンドルフチューブにデカントし、９６％濃度のＥｔＯＨ１ｍｌ（または、イソプロパノール３００μｌ）と混合した。沈殿混合物を徹底的に混合し、再度遠心分離した（１５分間、１２０００ｒｐｍ、ヘレウス・バイオフューズで）。それにより、プラスミドＤＮＡの沈殿が生じた。プラスミドＤＮＡの沈殿を、氷冷した７０％濃度のＥｔＯＨで洗浄し、次に、空気乾燥した。最後に、乾燥した沈殿を滅菌蒸留水５０μｌに溶解させた。
【００６０】
ＤＮＡのアルコール沈殿
沈殿混合物：ＤＮＡ溶液、１０分の１容量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、２〜３容量の９６％ＥｔＯＨ（イソプロパノール１容量）。
この混合物をよく混合し、−２０℃で保存したが、沈殿の生成量は増加しなかった。１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してプラスミドＤＮＡを沈殿させた。
沈殿させた後、残留した用いられた酢酸ナトリウムを除去するために、プラスミドＤＮＡを７０％濃度のＥｔＯＨ１ｍｌで再度洗浄する必要があった。
【００６１】
ＤＮＡのフェノール抽出
ＤＮＡ溶液を、同量のフェノール（Ｒｏｔｉｐｈｅｎｏｌ(R)と混合し、ＴＥ緩衝液ｐＨ７．６（ロス（Ｒｏｔｈ），カールスルーエ，ドイツ）で平衡化し、５分間振盪し、５０００ｒｐｍ遠心分離した。目下変性しているタンパク質のほとんどが、界面に集積された。ＤＮＡを含む上部の水相を吸引によって慎重に除去し、次に、残留したフェノールを除去するためにクロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２４：１）と混合し。続いて、さらに遠心分離し、その後、水性の上清を除去し、アルコール沈殿によって溶液からＤＮＡを単離した。
【００６２】
増幅したＤＮＡ分子の精製
ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてＤＮＡアンプリコンを精製した。これにより、初発の分子、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよび塩を除去した。この目的のために、ＰＣＲ反応混合物を、５倍量のＰＢ緩衝液と混合し、よく混合し、キアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）カラムにアプライした。次に、増幅したＤＮＡを選択的にカラム材に結合させ、ＰＥ緩衝液（７５０μｌ）で２回洗浄することによってｄＮＰＴを除去した。次に、増幅したＤＮＡを望ましい量の水で溶出させた（最良の量は、ＰＣＲ反応混合物の初発の材料の量と同じである）。
【００６３】
制限酵素でのＤＮＡ切断
混合：ＤＮＡを３μｌ、１０×切断用緩衝液を２μｌ、制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなど）を２．５〜５Ｕ、蒸留水を添加して量を２０μｌにした。
切断反応は、制限酵素に応じて２５〜５５℃で１〜２時間行われた。解析のために、フラグメントを、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルで、長さの標準と平行させて電気泳動で分画した。反応が二重の切断である場合、まず一方の酵素を混合物に添加した。１時間後、アリコートを適切なゲルにアプライし、切断が起こった場合、第二の酵素を添加した。同じ切断用緩衝液中で第二の酵素による切断が起こらない場合、まずアルコール沈殿が必要である。
【００６４】
ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
アガロース（ロス）を望ましい濃度で１×アガロース緩衝液に溶解させ、アガロースが完全に溶解するまで高周波レンジで沸騰させた。次に、この溶液を、密封したプレキシガラス製の平床式ゲルチャンバーに注いだ。このＤＮＡサンプルを、１０分の１量のローディングブルー（５０％ｖ／ｖグリセロール；５０ｍＭのＥＤＴＡ；０．００５％ｗ／ｖのＢＰＢ［メルク（Ｍｅｒｃｋ），ダルムシュタット，ドイツ］、および、０．００５％キシレンシアノール）と混合し、コームを用いて作成したゲルのポケットにピペッティングした。
電気泳動は、ランニング緩衝液として１×アガロース緩衝液中で、ゲルのサイズや電極間の距離に応じて８０〜１４０Ｖの定電圧で、水平に行われた。
１×アガロース緩衝液：４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ。
【００６５】
ＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動
７．５％ポリアクリルアミドゲル溶液；４０％濃度のアクリルアミド−ビスアクリルアミドストック溶液、０．９４ｍｌ；１０×ＴＢＥ緩衝液（４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；２００ｍＭの酢酸ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ）、０．５ｍｌ；１％ＡＭＰＳ、０．２５ｍｌ；ＴＥＭＥＤ、１０μｌ；蒸留水、３．３３ｍｌ。
この混合物を、垂直の重合装置にマウントされた十分清潔な垂直のガラスプレートの間に注いだ（約１０〜２０分間）。１×ＴＢＥ緩衝液中で、１４０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。
【００６６】
ＤＮＡ配列解析
ＤＮＡ（１〜２μｇ）を、蒸留水８１μｌに溶解させ、変性のために、ＮａＯＨ（２Ｎ）９μｌを添加した。室温で１０分間インキュベートした後、この混合物を沈殿させ、得られたＤＮＡ沈殿を氷冷した８０％濃度のエタノールで徹底的に洗浄した（これは、その後の配列解析反応にとって重要である）。５×配列解析用の緩衝液（２００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１００ｍＭのＭｇＣｌ2／２５０ｍＭのＮａＣｌ）２μｌ、オリゴヌクレオチド（１ｐＭ／μｌ）１μｌ、および、最後に蒸留水を、沈殿に添加し、総量を１０μｌにした。その後、３７℃の水槽中で３０分間インキュベートした際に、初発のオリゴヌクレオチドがＤＮＡにハイブリダイズした。
配列解析反応のためのハイブリダイゼーション混合物に添加した試薬：ＤＴＴ（０．１Ｍ）、１．０μｌ；標識混合物（１：５に希釈）、２．０μｌ；［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ、０．５μｌ；ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM（１３Ｕ／μｌ，ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））（酵素希釈緩衝液で１：８に希釈）、２μｌ。
【００６７】
それに続いて室温で５分間インキュベートした際に、反対の鎖が合成され、合成されたＤＮＡは、放射性同位体で標識されたｄＡＴＰを取り込むことによって標識された。これに続き、いずれの場合も、４種の異なる停止用混合物２．５μｌに標識混合物３．５μｌを添加した。さらに３７℃で５分間インキュベートしたところ、ランダムに分散した反対の鎖の合成の停止反応が起こった。停止緩衝液（４μｌ）を添加することによって反応を停止させ、その後、混合物を８０〜９０℃で変性させ、６％濃度の変性配列解析ゲルにアプライした。サンプルをローディングした後に、主要な泳動を、３０〜５０Ｗで、それぞれ１３００〜１６００Ｖで、２〜５時間行った。次に、ゲルを１０％濃度の酢酸槽で固定し（１５分間）、流水下で残留した尿素を除去し、乾燥した（ヒートガンを用いて４５分間、または、７０℃のインキュベーターで２時間）。続いてオートラジオグラフィを４℃で１６〜２４時間行った（フジ・メディカル（Ｆｕｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ）のＸ線フィルムＲＸ（Ｘ−ｒａｙ−Ｆｉｌｍ ＲＸ），３０×４０；コダック・サイエンティフィック（Ｋｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のイメージングフィルムＸ−ｏｍａｔＡＲ）。
【００６８】
標識混合物ストック溶液：それぞれ７．５μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ。
停止用混合物：それぞれ８０μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および、それぞれ８μＭの各ｄｄＮＴＰ。
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ希釈緩衝液：１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ。
停止緩衝液：９５％ホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールＦＦ。
【００６９】
自動ＤＮＡ配列解析
混合物：プラスミドＤＮＡ（ＰＣＲフラグメントの場合、例えば、１００ｎｇ／５００個（ヌクレオチド））、１μｇ；初発の分子（ＰＣＲプライマー、可能であれば、Ｔｍは５５℃）、３〜５ｐｍｏｌ；ダイ・ターミネーター・レディミックス（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ−ｍｉｘ，ＦｄｄＮＴＰｓ−Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＦＳ混合物）４μｌ；蒸留水を加えて量を２０μｌにする。
ＰＣＲ反応液［２５×（９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分］をアルコールで沈殿させ、ローディング緩衝液４μｌに溶解させ、次に、サンプルを９５℃で３分間変性させ、遠心分離で除去し、垂直のポリアクリルアミドゲル（長さ３４ｃｍ、２４個の平行なレーンを備える）にアプライした。
４８８ｎｍのアルゴンレーザー光線で励起させた後に、色素から５２５ｎｍ〜６０５ｎｍの範囲の異なる波長の光を放出させ、格子「分光写真器」によってそのスペクトル色に分離した。続いて、このスペクトル色を、ＣＣＤカメラの高解像度の画素フィールドを用いて同時に検出した。コンピューター（マッキントッシュ・クアドラ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ）／６５０Ｍａｃｌｌｃｘアップルシェア（Ａｐｐｌｅ Ｓｈａｒｅ））、および、対応するデータ解析ソフトウェア（ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），ヴァイターシュタット，ドイツ）を用いてデータを記録した。
配列解析ゲル；尿素（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、３０ｇ；蒸留水、２１．５ｍｌ；１０×ＴＢＥ、６ｍｌ。
この混合物を、広口フラスコ中で、以下を添加しながら、５０℃の加熱ブロック上で溶解させた：４０％ビスアクリルアミド（ろ過済み）、９ｍｌ；１０％ＡＰＳ、１８０μｌ；ＴＥＭＥＤ、２４μｌ。
【００７０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）
以下のＤＮＡポリメラーゼを用いた：
Ｔａｑ（サーマス・アクアティカス）ＤＮＡポリメラーゼ（組換え，ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））、および、１０×ＰＣＲ緩衝液［２００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭのＫＣｌ］、Ｔｆｌ（サーマス・フラーブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ））ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｓｔｅｒ ＡｍｐTM，Ｂｉｏｚｙｍ，オルデンドルフ，ドイツ）、および、２０×ＰＣＲ緩衝液［２０ｍＭの（ＮＨ2）ＳＯ4、１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）。
【００７１】
【表１】
【００７２】
この場合、以下が適用された：１Ｕで、７４℃で３０分以内に、１０ｎＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の、酸不溶性のＤＮＡ産物への変換が触媒された。ＰＣＲ反応は通常、「ホットスタート」で開始される：まず、ＤＮＡを変性させるために、９４℃で、ポリメラーゼ無しで混合物をインキュベートした。温度が８０℃に達した後、非特異的な増幅を防ぐために、ＤＮＡポリメラーゼをさらに低い温度で混合物に添加した。その後、実際のＰＣＲ反応を２５〜３５サイクル行った。
【００７３】
各サイクルでは、 以下の反応条件が適用された；
【表２】
【００７４】
最終的に、さらに鎖の伸長を７２℃で１０分間行い、最後に冷却した。
【００７５】
トータルＲＮＡの単離
全ての遠心分離工程は、１３０００ｒｐｍ、１６℃で行われ、溶解緩衝液（１００ＲＬＴ緩衝液：１メルカプトエタノール）６００μｌで細胞を溶解させた。細胞の溶解産物を、ＱｉａＳｃｈｒｅｄｄｅｒカラムにアプライし、２分間の遠心分離で除去した。
溶出液を、７０％エタノール６００μｌと混合し、よく混合し、ＤＮＡをＲＮＡイージー（ＲＮＡｅａｓｙ）ミニスピンカラムにアプライし、１５秒間遠心分離した（ＲＮＡをシリカマトリックスに結合させた）。カラムを３回洗浄した（１回はＲＷ１緩衝液７００ｍｌで、２回はＲＰＥ緩衝液５００μｌで）。次に、カラムを、オートクレーブした１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、ＲＮＡを蒸留水１５μｌで溶出させた。この方法で得られたトータルＲＮＡの平均濃度は、１μｇ／μｌであった。
【００７６】
アガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ分画化
変性アガロースゲル：アガロース、１ｇ；蒸留水、３７ｍｌ；１０×ＭＯＰＳ（０．２ｍＭのＭＯＰＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡＰ、１００ｍＭのＮａＡｃ）、１０ｍｌ；この混合物を沸騰させ、６０℃に冷却した。３７％濃度のホルムアルデヒド１６ｍｌを添加した。
ゲルが固化した後、ゲルを、ＲＮＡゲルランニング緩衝液と共に電気泳動装置に挿入した。ＲＮＡを特別なサンプル緩衝液と一緒にアプライした。
ＲＮＡゲルランニング緩衝液：１０×ＭＯＰＳ、４０ｍｌ；３７％濃度のホルムアルデヒド、６５ｍｌ；蒸留水、２９５ｍｌ。
ＲＮＡサンプル緩衝液：ＲＮＡ、１〜５μｇ；ＲＮＡ−新しい緩衝液（３７％濃度のホルムアルデヒドを７．５μｌ、１０×ＭＯＰＳを４．５μｌ、ホルムアミドを２５．９μｌ、蒸留水を７．５μｌ）、５μｌ；ホルムアミド色素マーカー［５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０，２５％（ｖ／ｖ）ブロモフェノールブルー、０，２５％（ｖ／ｖ）キシレンシアノール］、２μｌ。
ゲルを、８０Ｖで約３時間泳動した。この作業には、真核性ＲＮＡの単離物しか用いていないため、ゲル上で見ることができる優勢のバンドは、２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡのバンドのはずである。
【００７７】
ＭＭＬＶ−ＲＴ（マウスのモロニー白血病ウイルス逆転写酵素）を用いた逆転写酵素
逆転写酵素混合物；ＲＮＡ、５μｇ；初発の分子、１００μＭ。
ＲＮＡテンプレートにおける転写酵素を阻害する要因となり得る二次構造の形成を防ぐために、ＲＮＡ調整物と初発の分子を、７５℃で１０分間インキュベートした。しかしながら、通常は、この工程を行わなくても転写反応は起こる。
逆転写酵素反応混合物：Ｒｎａｓｉｎ(R)（プロメガ）、２８Ｕ；２５ｍＭのｄＮＴＰ；１０×逆転写酵素緩衝液［１０Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2］、５μｌ；逆転写酵素（ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔTM，ストラタジーン）、５０Ｕ；蒸留水で５０μｌにした。
混合物を４２℃で１５分間、および、３７℃で４５分間インキュベートすることによって逆転写を行った。比較的長いＲＮＡテンプレートの場合、さらに、５５℃で３０秒中断しながら、４２℃で２時間長くインキュベートすることが推奨される。続いて、９５℃で５分間混合物をインキュベートすることにより、前記逆転写酵素が活性化された。続いて、逆転写混合物５〜２０μｌをＰＣＲ反応に用いた。
【００７８】
組織からのゲノムＤＮＡの製造
組織１００ｍｇを液体窒素中で破砕し、粉末を得た。この組織粉末を、反応緩衝液（直前に、プロテイナーゼＫ［２０ｍｇ／ｍｌ］３０μｌを緩衝液に添加した）６ｍｌを含むファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに入れ、５６℃で一晩、慎重に振盪しながらインキュベートした（１２〜１８時間）。インキュベート後に、ＲＮアーゼＡ（１０μｇ／μｌ）１００μｌを添加し、この混合物を、３７℃で１時間さらに振盪しながらインキュベートした。
これに続いて、フェノール４ｍｌを加え、チューブを手動で逆さまにひっくり返して、再び約５分間上に向けた。即座にＣｌ（クロロホルム／イソアミルアルコール）４ｍｌを添加し、チューブを逆さまにひっくり返し、再びさらに５分間上に向け、次に、１５分間遠心分離した（３０００ｒｐｍ）。その上清を慎重に除去し、１０ｍｌファルコンチューブに移した。上清がまだ透明ではない場合、フェノール抽出を繰り返すか、または、Ｃｌ４ｍｌを添加し、チューブを手動で逆さまにひっくり返し、５分間上に向け、続いて１５分間遠心分離しなければならない（３０００ｒｐｍ）。その上清を慎重に除去し、Ｃｌ抽出を繰り返した。得られた最終的な上清を、１０分の１量の酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ，ｐＨ６）、および、２．５倍量のエタノール（９９．８％）と混合した。ＤＮＡがもつれた状態で沈殿するまでチューブを慎重に回転させた。このＤＮＡがもつれたものを、ガラス製のフックを用いてエタノール（７０％）約２５ｍｌに移し、３分間静置した。洗浄を２回繰り返した。次に、ＤＮＡを空気乾燥させ、室温で再蒸留水０．５ｍｌに溶解させた。
【００７９】
サザンブロット
アガロースゲルによるＤＮＡの分画化
より大きいＤＮＡ分子（＞６ｋＢｐ）で鎖の破壊を起こすために、ゲルを短波長のＵＶ上に約５分間放置した。
ＤＮＡ変性のために、変性溶液中で連続的にゲルを３０分間傾けた。
中和のために、中和溶液中で連続的にゲルを３０分間傾けた。
ブロットの構成（下から上へ）：ゲル、ナイロンメンブレン、乾燥したろ紙、ブロッティングペーパー、プレート、重り（約１ｋｇ）。
２０×ＳＳＣを用いて一晩ブロッティングした。
２×ＳＳＣ中で１０分間メンブレンを洗浄し、ろ紙上でメンブレンを乾燥させ、８０℃で１時間ベーキングするか、またはＵＶ架橋により核酸を固定した（例えば「Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ」で、自動的に位置決定して）。次に、ハイブリダイゼーションまでメンブレンを保存した。
ハイブリダイゼーション溶液中で、メンブレンを約１〜２時間プレハイブリダイゼーションし、メンブレン上の非特異的結合部位を覆った。
ハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、
変性溶液：０．５ＭのＮａＯＨ（２０ｇ）、１ＭのＮａＣｌ、
中和溶液：１．５ＭのＮａＣｌ／０．５Ｍのトリス（ｐＨ７．４）。
２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム；ＮａＣｌ、１７５．３ｇ；クエン酸ナトリウム×２Ｈ2Ｏ、８８．２ｇであり、再蒸留水で１ｌにし、ｐＨをＨＣｌで７に調整した。
５０×デンハルト溶液：フィコール４００、５ｇ；ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、５ｇ；ＢＳＡＴ、５ｇ；再蒸留水で５００ｍｌにした。
【００８０】
ノーザンブロット
ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いたＲＮＡの分画化
ブロットの構成（下から上へ）：ゲル、ナイロンメンブレン、乾燥したろ紙、ブロッティングペーパー、プレート、重り（約１ｋｇ）。
２０×ＳＳＣ中で一晩ブロッティングした。８０℃でベーキング（１時間）してろ紙上にＲＮＡを固定した。ＲＮＡの脱グリオキシル酸化（ｄｅｇｌｙｏｘｙｌａｔｉｏｎ）のために、ろ紙を沸騰した２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）に導入し、室温まで冷却した。
【００８１】
図面の説明
図１：研究群の特徴付けである。
図２：解析した１３６２人の個体における、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０Ｃ、および、Ａ３３２９Ｃの分布である。
図３：ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃと、心房細動と心筋症との関連である。
図４：ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃと、心房細動、急性冠症候群および不安定狭心症との関連である。
図５：５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースで番号ＮＭ−００１９９２として利用可能である。製造された配列は、配列番号１と同一である。
図６：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号２と同一である。
図７：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号３と同一である。
図８：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号４と同一である。
図９：５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号５と同一である。
図１０：ＮＭ−０１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号６と同一である。
【００８２】
図１１：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号７と同一である、
図１２：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号８と同一である。
図１３：ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの５’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号９と同一である。
図１４：ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの３’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１０と同一である。
図１５：ＮＭ−００１９９２に記載の２７６７〜２７８９位に関するヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１１と同一である。
図１６：ヒトＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１２と同一である。
図１７：ヒトＰＡＲ１受容体のタンパク質配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩタンパク質データベースで番号ＮＰ−００１９８３として利用可能である。示された配列は、配列番号１３と同一である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】研究群の特徴付けである。
【図２】解析した１３６２人の個体における、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０Ｃ、および、Ａ３３２９Ｃの分布である。
【図３】ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃと、心房細動と心筋症との関連である。
【図４】ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃと、心房細動、急性冠症候群および不安定狭心症との関連である。
【図５−１】５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１０】ＮＭ−０１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１２】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１３】ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの５’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１４】ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの３’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１５】ＮＭ−００１９９２に記載の２７６７〜２７８９位に関するヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１６】ヒトＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１７】ヒトＰＡＲ１受容体のタンパク質配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩタンパク質データベースで番号ＮＰ−００１９８３として利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＲ１遺伝子の３０９０および／または３３２９位に遺伝学的変異を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＣＰＲ）のクラスに属するトロンビン受容体であり、ＰＡＲ１に関する遺伝子は、染色体５ｑ１３に位置し、２つのエキソンを含み、約２７ｋｂの領域をカバーしている。ＰＡＲ１は、特に、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、ニューロンおよびヒト血小板で発現される。血小板において、ＰＡＲ１は、血小板の凝集の開始に関与する重要なシグナル伝達受容体である。ＰＡＲは、ＰＡＲのＮ末端の一部をタンパク質分解で除去し、それにより新しいＮ末端配列が露出することによって活性化され、次に、受容体を活性化する。ＰＡＲ１およびＰＡＲ４は、血小板の活性化において中心的な役割を果たす；血小板におけるこれら受容体の活性化により、形態学的な変化が起こり、ＡＤＰが放出され、前記血小板が凝集する。
【０００３】
韓国人の患者群では、冠動脈心疾患と、ＰＡＲ１のプロモーター領域における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）との関係は確認されていない。他の研究において、ＰＡＲ１プロモーターの変異体は、静脈の血栓塞栓症の発症に関する防御的な作用を有することを示した。
【０００４】
ヒトＰＡＲ１遺伝子の配列は既知である。この遺伝子のポリヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースにおいて、番号ＮＭ−００１９９２で利用可能である。同様に、そのタンパク質配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースにおいて、番号ＮＰ−００１９８３で利用可能である。ＮＣＢＩとは、国立バイオテクノロジー情報センターのことである（所在地：国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ３８Ａ，ベセスダ，メリーランド州，２０８９４，米国；ウェブアドレス：www.ncbi.nhm.nih.gov）。ＰＡＲ１遺伝子のクローニングは、特に、「Ｓｃｈｍｉｄｔ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，９３０７〜９３１２，１９９６」で説明されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＡＲ１遺伝子の様々な新規の多型があり、それにより、個体の冠動脈心疾患に関する比較的強い素因を決定することができる。これによって、影響を受けた個体は、適切な時期に、例えば喫煙、アルコール摂取、コレステロール豊富な食物、高血圧などのようなその他の有害な影響をさらにコントロールして埋め合わせることにより生活様式を適宜に適合させて、この危険因子を中和することができる。
【０００６】
このような健康に関連する予防的メカニズムは、ＰＡＲ１多型の情報（以下でより詳細に説明される）と対応する方法におけるそれらの使用なしには不可能と予想される。
【０００７】
１個単位の位置に置換を含む特定のヌクレオチド配列の変異体は、用語「ＳＮＰ」（＝単一ヌクレオチド多型）として当業者既知である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換（従来技術として公共的に利用可能である）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３０９０位におけるＴからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２の配列からなる。
【０００９】
さらに本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３３２９位にＡからＣへの置換（従来技術として公共的に利用可能である）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３３２９位におけるＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３の配列からなる。
【００１０】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位にＴからＣへの置換、同時に、前記ＰＡＲ１配列の３３２９位にＡからＶへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列に関する。好ましい実施形態において、３０９０位にＴからＣへの置換、同時に３３２９位にＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を包含し、特に好ましい実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を含む。
【００１１】
本発明はまた、配列番号５に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関する。
【００１２】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号６に記載の配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号７に記載の配列を含む。
【００１４】
本発明は、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位でのＴからＣへの置換、同時に、前記ＰＡＲ１配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部に関し、前記一部は、配列番号８に記載の配列からなる。
【００１５】
さらに本発明は、ＰＡＲ１のｃＤＮＡ遺伝子の３５９２塩基対のポリヌクレオチド配列の製造を含み、前記配列は、上記で定義された３０９０位および３３２９位での多型を、それぞれ、または組合せて含んでもよいし、含まなくてもよく、その製造は、以下の方法の工程を含む：
ａ］配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号９および配列番号１０に記載の配列を有するプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によってＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列を増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られた３．５６ｋｂのフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］からのフラグメントを配列解析すること。
【００１６】
本発明はまた、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に記載のポリヌクレオチド配列の製造に関し、本製造は、以下の方法の工程を含む：
ａ］配列番号１に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトゲノムＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって、ＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列のフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られたフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］からのフラグメントを配列解析すること。
【００１７】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ＰＣＲ反応により、配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］からのポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
【００１８】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］逆転写酵素によって、前記ＲＮＡをｃＤＮＡに転写すること、
ｄ］必要に応じて、前記ＰＣＲ反応によって、配列番号１０および配列番号１１に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｅ］ｃ］に記載のｃＤＮＡ、および／または、ｄ］に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること。
【００１９】
本発明はまた、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載の染色体ＤＮＡをサザンブロットすること、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのサザンブロットと、ｄ］からのプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ｅ］からのハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること。
【００２０】
さらに本発明は、ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法に関し、本方法は、以下の方法の工程を含む；
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載のＲＮＡをノーザンブロットすること、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのノーザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること。
【００２１】
ＰＡＲ１遺伝子における３０９０位および／または３３２９位での遺伝学的変異または多型の検出は、（ａ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症の危険を評価するための遺伝子マーカー、（ｂ）相当する遺伝子変異キャリアーの心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または安定狭心症を予防的処置するためのマーカー、（ｃ）投与しようとする心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬活性物質の用量を調整するためのマーカー、（ｄ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬活性物質を同定するためのハイスループット−スクリーニング法を決定するためのマーカー、（ｅ）心房細動、急性冠症候群、心筋症および／または不安定狭心症のための医薬物質の忍容性、安全性および有効性を試験する臨床研究のために、関連のある個体または患者を同定するマーカー、および、（ｆ）ＰＡＲ１遺伝子における遺伝学的変異をＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで解析するための分析システムを開発するための基礎として用いてもよい。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列に関し、好ましくは、前記配列は、配列番号１１を含む。さらに本発明は、配列番号１２に記載の配列からなる２０〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列に関する。好ましくは、前記配列は、配列番号１２を含む。
【００２３】
本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって対応するＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するための、配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列と、配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列を含む２０〜５０個のヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチド配列とを組合せた使用に関する。好ましくは、この使用は、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換を有する、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を有するＰＡＲ１遺伝子のフラグメントの増幅に関する。
【００２４】
その上、本発明は、成分のキットを含み、本キットは、以下を含む：
ａ］配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列からなる、単離された、長さが２１〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列、
ｂ］配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列からなる、単離された、長さが２０〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための少なくとも１種の酵素、
ｄ］必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応を行うための物質および／または溶液、 ｅ］必要に応じて、全長および／またはそれらの一部に、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の３３２９位における置換を有する、または有さない、ＰＡＲ１遺伝子を包含するポリヌクレオチド配列、
ｆ］および、必要に応じて、配列解析反応を行うための試薬。
【００２５】
ここで成分のキットとは、前記成分が、機能単位中で互いに空間的に近い位置に組み入れられた組合せを意味する。
【００２６】
さらに本発明は、上述の成分のキットの製造に関し、以下を含む：
ａ］配列番号１１に記載の配列を包含する、または、配列番号１１に記載の配列からなる、単離された、長さが２１〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｂ］配列番号１２に記載の配列を包含する、または、配列番号１２に記載の配列からなる、単離された、長さが２０〜５０個のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための酵素を提供すること、
ｄ］必要に応じて、配列解析を行うための試薬を提供すること、
ｅ］必要に応じて、前期ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液を提供すること、
ｆ］必要に応じて、ＰＡＲ１遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を提供すること、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、いずれの場合においても、全長またはそれらの一部に、ＮＭ−００１９９２に記載のＰＡＲ１配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含んでもよいし、または含まなくてもよい、
ｇ］適切な容器中で、ａ］からの成分を、いずれの場合においても別々にｆ］に導入すること、
ｈ］必要に応じて、ｇ］に記載の容器を、１またはそれ以上のパック単位に合わせること。
【００２７】
上述の成分のキットは、ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するのに用いてもよい。
【００２８】
本発明の技術的な形態を、以下の実施形態でより詳細に説明する。
【００２９】
単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって増幅することにより製造してもよい。この目的に適切したプライマーは、配列番号９および配列番号１０に記載される。
【００３０】
ＰＣＲは、２種の既知の配列が両端にあるポリヌクレオチド断片を選択的に複製することに用いられるインビトロの技術である。増幅には、ＤＮＡまたはＲＮＡテンプレートの定義された配列の末端に相補的な短い一本鎖ＤＮＡ分子（プライマー）が必要である。ＤＮＡポリメラーゼは、正確な反応条件下で、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、一本鎖の変性したポリヌクレオチドテンプレートに沿ってプライマーを伸長させ、このようにして、前記テンプレートに配列が相補的な新しいＤＮＡ鎖が合成される。このプロセスの際、繰り返してポリヌクレオチド鎖が変性し、プライマーが付着し、伸長されるように、温度を規則的な間隔で変化させる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）が用いられる。典型的なＰＣＲ反応混合物は、ポリヌクレオチドテンプレート以外に、２種の適切なプライマーヌクレオチド（例えば０．２〜２μＭの濃度で）、さらに、ｄＮＴＰ（例えば各ｄＮＰＴあたり２００μＭの濃度で）、さらに、ＭｇＣｌ2（１〜２ｍＭの濃度で）、および、例えばＴａｑポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ）のような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（１〜１０ユニット）を含む。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼや、上記ＰＣＲを行うための成分、さらにプロトコールは、例えばロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのような多数の会社から市販されている。
【００３１】
単離しようとするポリヌクレオチド配列を増幅するためのポリヌクレオチドテンプレートは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態で存在してもよい。次に、ポリヌクレオチドテンプレートがＲＮＡの場合、実際のＰＣＲ反応の前に、そのＲＮＡは逆転写酵素によってＤＮＡに転写される。ＰＣＲ反応を行うためのポリヌクレオチドテンプレートの量は、例えば０．０１〜２０ｎｇの範囲であり得る。
【００３２】
ポリヌクレオチドテンプレートは、生物材料からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを得るための当業者既知の技術を用いて得られる。本発明における生物材料としては、特に、ヒトなどの脊椎動物の組織または器官の細胞（例えば脳、血液、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、血管）、もしくは、真核細胞培養物由来の細胞（例えばＨｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞）、もしくは、単離しようとするＤＮＡ配列がクローンされた形態で存在する細菌または酵母などの細胞が挙げられる。
【００３３】
ヒトなどの脊椎動物の組織集合体または器官の細胞は、血液の採取、組織の穿刺または外科的技術によって得てもよい。例えば、細胞を破壊し、必要に応じて個々の細胞器官（特に細胞核）を濃縮し、沈殿や遠心分離によりＤＮＡまたはＲＮＡを回収することによって、それらからポリヌクレオチドテンプレートを得てもよい。
【００３４】
単離された、ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列を製造するその他の方法は、ＰＡＲ１遺伝子をクローニングし、続いてその遺伝子を細菌または酵母中で発現させ、発現されたポリヌクレオチドを精製することを含む。例えば、上述のＰＣＲ反応は、クローン可能なポリヌクレオチドフラグメントを製造するのに適している。フラグメントをクローニングするには、相補配列の反応酵素の５’の認識配列からなるプライマーを用いることが有利である。２種のプライマーには、それぞれ同一または異なる制限酵素の認識配列を用いることができる。
【００３５】
一般的な制限酵素の例は、以下の通りである：ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）、ＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）、ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧ１）。
【００３６】
クローニングのために、ベクターは、プライマーに付加された認識配列に対応する制限酵素で処理される。フラグメントを単離し、同じ制限酵素で処理して、リガーゼによってベクターに連結する。ベクターは、例えばプラスミド、バクテリオファージまたはコスミドのようなＤＮＡ分子を意味し、それを用いることによって、遺伝子またはその他のＤＮＡ配列をクローニングし、複製のためにそれらを細菌または真核細胞に導入することができる。ベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｃＤＮＡ３，１のようなＤＮＡ分子が挙げられ、ベクターは、ロシュ・ダイアグノスティックス、ニューイングランドバイオラボ、プロメガ、ストラタジーンなどのようなバイオテクノロジー系材料専門の会社から市販されている。
【００３７】
ポリヌクレオチドを提供するため、またはクローニング手順を行うためのＰＣＲ反応を行うのに必要な説明は、標準的なマニュアルで、配合表およびプロトコールの様式で当業者により見ることができ、このようなマニュアルとしては、例えば、ａ］“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集者），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（編集者），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編集者），Ｄａｖｉｄ Ｄ，Ｍｏｏｒｅ（編集者），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編集者），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（編集者），ルーズリーフ版，継続的に更新中，ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク、または、ｂ］Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第五版，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集者），Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ（編集者），Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（編集者），Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ（編集者），Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ（編集者），Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ（編集者），Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ（編集者），２００２年１０月，ジョン・ワイリー＆サンズ社，ニューヨーク”、または、ｃ］“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｃｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）”が挙げられる。
【００３８】
適切なプライマー配列は、例えばそれらを化学合成することによって提供されるが、これは、例えばＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの会社に注文して行ってもよい。
【００３９】
様々な器官由来のヒトｃＤＮＡは、例えばプロメガ、ストラタジーンなどの会社から市販されている。
【００４０】
ポリヌクレオチドの配列解析は、例えば、ライフテクノロジーズ、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）などのような会社製の実験用ロボットを用いて、当業者既知の習慣的な方法で行われる。
【００４１】
ＰＡＲ１変異体の単離されたポリヌクレオチド配列およびそれら由来のフラグメントはまた、様々なストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションに用いてもよい。ストリンジェンシーは、２つの一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションまたは結合特異性に影響する反応条件を説明するものである。ストリンジェンシー、すなわち反応特異性は、温度を高くすること、および、イオン強度を低くすることによって高くすることができる。例えば、２×ＳＳＣ溶液中で室温でハイブリダイゼーションが行われる場合、低ストリンジェンシー条件が提供される。例えば０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液中で６８℃でハイブリダイゼーションが行われる場合、高ストリンジェンシー条件が提供される。
【００４２】
本願に係るストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、以下を意味する：
１］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、０．５ｍｇ／ｍｌの変性したサケ精子ＤＮＡ中で、一晩、標識されたプローブと研究しようとするサンプルとをハイブリダイズさせること、
２］室温で、２×ＳＳＣ中で、１０分間洗浄すること、
３］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること、
４］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること、
５］６５℃で（または、オリゴヌクレオチドの場合、融解温度から５℃低い温度で）、０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、３０分間洗浄すること。
【００４３】
この目的では、全長で２０個の長さを有するヌクレオチドのＤＮＡフラグメントがオリゴヌクレオチドとみなされる。融解温度は、式Ｔｍ＝２（Ａ＋Ｔの数）＋４（Ｇ＋Ｃの数）℃より得られる。
【００４４】
２×ＳＳＣ、または、０．１×ＳＳＣ溶液は、２０×ＳＳＣ溶液を適宜に希釈することによって製造される。２０×ＳＳＣ溶液は、３ＭのＮａＣｌ／０．３クエン酸ナトリウム・２Ｈ2Ｏ溶液を含み、ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムである。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、研究しようとするポリヌクレオチドを、電気泳動分画し、続いて変性させた後、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレンにトランスファーすることによって行われる（サザンブロット−ＤＮＡ；ノーザンブロット−ＲＮＡ）。ハイブリダイゼーションは、放射標識されたプローブ、または、その他の方法（例えば蛍光色素を用いて）で標識されたプローブを用いて行われる、。プローブは、通常、一本鎖および／または変性ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列を含み、再び一本鎖にした、および／または変性させた研究しようとするＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列の相補ヌクレオチド配列に結合する。
【００４６】
ＰＡＲ１遺伝子の単一ヌクレオチド多型は、本発明のプライマーを用いて、または、ＳＳＣＰの分析によって検出することができる、。ＳＳＣＰとは、一本鎖高次構造多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の略であり、これは、個々の塩基対の置換を同定するための電気泳動技術である。研究しようとするポリヌクレオチドは、一本鎖に変性させた後に、標識されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分画される。研究しようとするＤＮＡフラグメントが個々の塩基対の置換を示す場合、それらは異なるコンフォメーションを有するため、ＰＡＧＥにおいて異なる率で移動する。
【００４７】
ＰＣＲを行うための物質の例は、緩衝液、例えばＨｅｐｅｓまたはトリス、さらに、ｄＡＰＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＭｇ2+、必要に応じて、さらに二価または一価の鉄である。これら物質は、溶液に溶解させた状態で含まれる。
【実施例】
【００４８】
ＰＡＲ１遺伝子のゲノム領域の増幅
以下のプライマーを用いて、ＰＡＲ１配列における、３０９０位におけるＴからＣへヌクレオチド置換、および、３３２９位におけるＡからＣへの置換を検出した：
プライマー１：５’−ＡＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＡＡＧＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号１１）
プライマー２：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＴＡＧＣＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣ−３（配列番号１２）。
プライマー１（配列番号１１）は、ＮＭ−００１９９２参照配列の２７６７〜２７８９位に対応する。プライマー２は、ＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１由来である。
【００４９】
増幅のためのＰＣＲプロトコール：
用いられた試薬は、アプライド・バイオシステムズより得た（フォスターシティー，米国）：
ゲノムＤＮＡ、２０ｎｇ；ＴａｑＧｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、１ユニット；１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液；５００μＭのｄＮＴＰ；２．５ｍＭのＭｇＣｌ2：２００ｎＭの
各増幅プライマー対；Ｈ2Ｏ、５μｌまで。
【００５０】
遺伝子型解析のためのＰＣＲ増幅プログラム
９５℃で１０分間を、１サイクル；
９５℃で３０秒、７０℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、６５℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、６０℃で３０秒を、２サイクル；
９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒を、４０サイクル；
７２℃で１０分、４℃で３０秒を、１サイクル。
【００５１】
ＳＮＰの同定
ミニシーケンス配列解析およびＳＮＰの検出のためのプロトコール
全ての試薬は、アプライド・バイオシステムズ（フォスターシティー，米国）より得た。精製したＰＣＲ産物、２μｌ；ＢｉｇＤｙｅターミネーターキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｋｉｔ）、１．５μｌ；２００ｎＭの配列解析用プライマー；Ｈ2Ｏ、１０μｌまで。
【００５２】
配列解析のための増幅プログラム：
９６℃で２分を、１サイクル；
９６℃で１０秒、５５℃で１０秒、６５℃で４分間を、３０サイクル；
７２℃で７分、４℃で３０秒を、１サイクル。
【００５３】
配列解析産物の解析：
まず、配列解析ソフトウェア（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），フォスターシティー，米国）を用いて配列を解析し、生データを得て、次に、Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄおよびＣｏｎｓｅｄを用いて加工した。Ｐｈｒｅｄ、Ｐｈｒａｐ、ＰｏｌｙｐｈｒｅｄとＣｏｎｓｅｄは、ワシントン大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（http://www.genome.Washington.edu）で、Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎによって作成されたソフトウェアである。
【００５４】
ＰＡＲ１のＳＮＰの、冠動脈疾患への割り当て
臨床研究で、患者の同齢集団で、ＰＡＲ１遺伝子の３’非コード領域からの２種のＰＡＲ１多型を、血栓および心臓血管系の合併症との関係に関して研究した。
【００５５】
下記の略語は、以下のように用いられる（示された全ての位置は、参照配列ＮＭ−００１９９２におけるヌクレオチド位置を意味する）。
ＰＡＲ１Ｔ３０９０Ｔは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３０９０位にチミジン（Ｔ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ｔ３０９０Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の一方の対立遺伝子が３０９０位にシチジン（Ｃ）を有し、ＰＡＲ１遺伝子の他方の対立遺伝子が３０９０位にチミジン（Ｔ）を有する個体群を示す。これらの個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ヘテロ接合型である。
ＰＡＲ１Ｃ３０９０Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３０９０位にシチジン（Ｃ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ａ３３２９Ａは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３３２９位にアデノシン（Ａ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
ＰＡＲ１Ａ３３２９Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の一方の対立遺伝子が３３２９位にシチジン（Ｃ）を有し、ＰＡＲ１遺伝子の他方の対立遺伝子が３３２９位にアデノシン（Ａ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ヘテロ接合型である。
ＰＡＲ１Ｃ３３２９Ｃは、ＰＡＲ１遺伝子の対立遺伝子が両方とも３３２９位にシチジン（Ｃ）を有する個体群を示す。これら個体は、このＰＡＲ１変異体に関して、ホモ接合型である。
【００５６】
解析された患者群において（図１）、ＰＡＲ１変異体Ｃ３０９０Ｃのホモ接合型キャリアーと、心房細動および心筋症との統計学的に有意な関連が観察された。ロジスティック回帰を行ったところ、ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃのホモ接合型キャリアーにおいて、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０／Ｔ３０９０Ｔのキャリアーと比較して心房細動の危険が１．９７倍増加、心筋症の危険が１．８４倍増加したことがわかった（図３）。
【００５７】
ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーに関して、前記変異体は、心房細動の危険が、ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ａ／Ａ３３２９Ａのキャリアーと比較して２．３５倍増加したことに関連があることが示された。ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーにおいて、前記変異体は、急性冠症候群および不安定狭心症の出現の観点で、さらに防御的のようである。ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃのキャリアーにおいて、急性冠症候群および／または不安定狭心症の出現の危険が、ＰＡＲ１変異Ａ３３２９Ｃ／Ａ３３２９Ａのキャリアーと比較して２．７８倍減少した（図４）。
【００５８】
それゆえに、本発明の方法によって、および、特定のＳＮＰ型の単離されたＰＡＲ１配列またはそれらのフラグメントを用いて、ヒト個体が、提示された結果に関して、危険群に割り当てられるかどうかを決定することが可能である。
【００５９】
プラスミドＤＮＡの製造
細菌の一晩の培養物１ｍｌを、エッペンドルフチューブに移し、ヘレウス・バイオフューズ（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ）で、遠心分離した（５０００ｒｐｍで５分間）。細菌細胞ペレットを冷却した溶液Ｉ（１００μｌ）に再懸濁し、次に、氷上に５分間置いた。
溶液Ｉ：２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのグルコース（滅菌ろ過した）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ。
溶液ＩＩを２００μｌ添加した後、混合物全体をよく混合したところ、ＤＮＡのアルカリ変性が起こった。
溶液ＩＩ：２００ｍＭのＮａＯＨ，１％ＳＤＳ。
その後氷上で５分間インキュベートした後に、その混合物に溶液ＩＩＩを１５０μｌ添加した。続いて再度混合し、さらに１５分間氷上でインキュベートした。
溶液ＩＩＩ：３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）。
１２０００ｒｐｍで１５分間ヘレウス・バイオフューズで遠心分離して、細胞の破片、ゲノムＤＮＡおよび変性タンパク質を除去した。得られたプラスミドＤＮＡを含む上清を、第二のエッペンドルフチューブにデカントし、９６％濃度のＥｔＯＨ１ｍｌ（または、イソプロパノール３００μｌ）と混合した。沈殿混合物を徹底的に混合し、再度遠心分離した（１５分間、１２０００ｒｐｍ、ヘレウス・バイオフューズで）。それにより、プラスミドＤＮＡの沈殿が生じた。プラスミドＤＮＡの沈殿を、氷冷した７０％濃度のＥｔＯＨで洗浄し、次に、空気乾燥した。最後に、乾燥した沈殿を滅菌蒸留水５０μｌに溶解させた。
【００６０】
ＤＮＡのアルコール沈殿
沈殿混合物：ＤＮＡ溶液、１０分の１容量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）、２〜３容量の９６％ＥｔＯＨ（イソプロパノール１容量）。
この混合物をよく混合し、−２０℃で保存したが、沈殿の生成量は増加しなかった。１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離してプラスミドＤＮＡを沈殿させた。
沈殿させた後、残留した用いられた酢酸ナトリウムを除去するために、プラスミドＤＮＡを７０％濃度のＥｔＯＨ１ｍｌで再度洗浄する必要があった。
【００６１】
ＤＮＡのフェノール抽出
ＤＮＡ溶液を、同量のフェノール（Ｒｏｔｉｐｈｅｎｏｌ(R)と混合し、ＴＥ緩衝液ｐＨ７．６（ロス（Ｒｏｔｈ），カールスルーエ，ドイツ）で平衡化し、５分間振盪し、５０００ｒｐｍ遠心分離した。目下変性しているタンパク質のほとんどが、界面に集積された。ＤＮＡを含む上部の水相を吸引によって慎重に除去し、次に、残留したフェノールを除去するためにクロロホルム／イソアミルアルコール混合物（２４：１）と混合し。続いて、さらに遠心分離し、その後、水性の上清を除去し、アルコール沈殿によって溶液からＤＮＡを単離した。
【００６２】
増幅したＤＮＡ分子の精製
ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてＤＮＡアンプリコンを精製した。これにより、初発の分子、ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼおよび塩を除去した。この目的のために、ＰＣＲ反応混合物を、５倍量のＰＢ緩衝液と混合し、よく混合し、キアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）カラムにアプライした。次に、増幅したＤＮＡを選択的にカラム材に結合させ、ＰＥ緩衝液（７５０μｌ）で２回洗浄することによってｄＮＰＴを除去した。次に、増幅したＤＮＡを望ましい量の水で溶出させた（最良の量は、ＰＣＲ反応混合物の初発の材料の量と同じである）。
【００６３】
制限酵素でのＤＮＡ切断
混合：ＤＮＡを３μｌ、１０×切断用緩衝液を２μｌ、制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなど）を２．５〜５Ｕ、蒸留水を添加して量を２０μｌにした。
切断反応は、制限酵素に応じて２５〜５５℃で１〜２時間行われた。解析のために、フラグメントを、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルで、長さの標準と平行させて電気泳動で分画した。反応が二重の切断である場合、まず一方の酵素を混合物に添加した。１時間後、アリコートを適切なゲルにアプライし、切断が起こった場合、第二の酵素を添加した。同じ切断用緩衝液中で第二の酵素による切断が起こらない場合、まずアルコール沈殿が必要である。
【００６４】
ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
アガロース（ロス）を望ましい濃度で１×アガロース緩衝液に溶解させ、アガロースが完全に溶解するまで高周波レンジで沸騰させた。次に、この溶液を、密封したプレキシガラス製の平床式ゲルチャンバーに注いだ。このＤＮＡサンプルを、１０分の１量のローディングブルー（５０％ｖ／ｖグリセロール；５０ｍＭのＥＤＴＡ；０．００５％ｗ／ｖのＢＰＢ［メルク（Ｍｅｒｃｋ），ダルムシュタット，ドイツ］、および、０．００５％キシレンシアノール）と混合し、コームを用いて作成したゲルのポケットにピペッティングした。
電気泳動は、ランニング緩衝液として１×アガロース緩衝液中で、ゲルのサイズや電極間の距離に応じて８０〜１４０Ｖの定電圧で、水平に行われた。
１×アガロース緩衝液：４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ。
【００６５】
ＤＮＡのポリアクリルアミドゲル電気泳動
７．５％ポリアクリルアミドゲル溶液；４０％濃度のアクリルアミド−ビスアクリルアミドストック溶液、０．９４ｍｌ；１０×ＴＢＥ緩衝液（４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；２００ｍＭの酢酸ナトリウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ）、０．５ｍｌ；１％ＡＭＰＳ、０．２５ｍｌ；ＴＥＭＥＤ、１０μｌ；蒸留水、３．３３ｍｌ。
この混合物を、垂直の重合装置にマウントされた十分清潔な垂直のガラスプレートの間に注いだ（約１０〜２０分間）。１×ＴＢＥ緩衝液中で、１４０Ｖの定電圧でゲルを泳動した。
【００６６】
ＤＮＡ配列解析
ＤＮＡ（１〜２μｇ）を、蒸留水８１μｌに溶解させ、変性のために、ＮａＯＨ（２Ｎ）９μｌを添加した。室温で１０分間インキュベートした後、この混合物を沈殿させ、得られたＤＮＡ沈殿を氷冷した８０％濃度のエタノールで徹底的に洗浄した（これは、その後の配列解析反応にとって重要である）。５×配列解析用の緩衝液（２００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１００ｍＭのＭｇＣｌ2／２５０ｍＭのＮａＣｌ）２μｌ、オリゴヌクレオチド（１ｐＭ／μｌ）１μｌ、および、最後に蒸留水を、沈殿に添加し、総量を１０μｌにした。その後、３７℃の水槽中で３０分間インキュベートした際に、初発のオリゴヌクレオチドがＤＮＡにハイブリダイズした。
配列解析反応のためのハイブリダイゼーション混合物に添加した試薬：ＤＴＴ（０．１Ｍ）、１．０μｌ；標識混合物（１：５に希釈）、２．０μｌ；［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ、０．５μｌ；ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM（１３Ｕ／μｌ，ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））（酵素希釈緩衝液で１：８に希釈）、２μｌ。
【００６７】
それに続いて室温で５分間インキュベートした際に、反対の鎖が合成され、合成されたＤＮＡは、放射性同位体で標識されたｄＡＴＰを取り込むことによって標識された。これに続き、いずれの場合も、４種の異なる停止用混合物２．５μｌに標識混合物３．５μｌを添加した。さらに３７℃で５分間インキュベートしたところ、ランダムに分散した反対の鎖の合成の停止反応が起こった。停止緩衝液（４μｌ）を添加することによって反応を停止させ、その後、混合物を８０〜９０℃で変性させ、６％濃度の変性配列解析ゲルにアプライした。サンプルをローディングした後に、主要な泳動を、３０〜５０Ｗで、それぞれ１３００〜１６００Ｖで、２〜５時間行った。次に、ゲルを１０％濃度の酢酸槽で固定し（１５分間）、流水下で残留した尿素を除去し、乾燥した（ヒートガンを用いて４５分間、または、７０℃のインキュベーターで２時間）。続いてオートラジオグラフィを４℃で１６〜２４時間行った（フジ・メディカル（Ｆｕｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ）のＸ線フィルムＲＸ（Ｘ−ｒａｙ−Ｆｉｌｍ ＲＸ），３０×４０；コダック・サイエンティフィック（Ｋｏｄａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のイメージングフィルムＸ−ｏｍａｔＡＲ）。
【００６８】
標識混合物ストック溶液：それぞれ７．５μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ。
停止用混合物：それぞれ８０μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、および、それぞれ８μＭの各ｄｄＮＴＰ。
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ希釈緩衝液：１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ。
停止緩衝液：９５％ホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールＦＦ。
【００６９】
自動ＤＮＡ配列解析
混合物：プラスミドＤＮＡ（ＰＣＲフラグメントの場合、例えば、１００ｎｇ／５００個（ヌクレオチド））、１μｇ；初発の分子（ＰＣＲプライマー、可能であれば、Ｔｍは５５℃）、３〜５ｐｍｏｌ；ダイ・ターミネーター・レディミックス（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ−ｍｉｘ，ＦｄｄＮＴＰｓ−Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＦＳ混合物）４μｌ；蒸留水を加えて量を２０μｌにする。
ＰＣＲ反応液［２５×（９４℃で１５秒、５０℃で１５秒、６０℃で４分］をアルコールで沈殿させ、ローディング緩衝液４μｌに溶解させ、次に、サンプルを９５℃で３分間変性させ、遠心分離で除去し、垂直のポリアクリルアミドゲル（長さ３４ｃｍ、２４個の平行なレーンを備える）にアプライした。
４８８ｎｍのアルゴンレーザー光線で励起させた後に、色素から５２５ｎｍ〜６０５ｎｍの範囲の異なる波長の光を放出させ、格子「分光写真器」によってそのスペクトル色に分離した。続いて、このスペクトル色を、ＣＣＤカメラの高解像度の画素フィールドを用いて同時に検出した。コンピューター（マッキントッシュ・クアドラ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｑｕａｄｒａ）／６５０Ｍａｃｌｌｃｘアップルシェア（Ａｐｐｌｅ Ｓｈａｒｅ））、および、対応するデータ解析ソフトウェア（ＰＥバイオシステムズ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），ヴァイターシュタット，ドイツ）を用いてデータを記録した。
配列解析ゲル；尿素（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、３０ｇ；蒸留水、２１．５ｍｌ；１０×ＴＢＥ、６ｍｌ。
この混合物を、広口フラスコ中で、以下を添加しながら、５０℃の加熱ブロック上で溶解させた：４０％ビスアクリルアミド（ろ過済み）、９ｍｌ；１０％ＡＰＳ、１８０μｌ；ＴＥＭＥＤ、２４μｌ。
【００７０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）
以下のＤＮＡポリメラーゼを用いた：
Ｔａｑ（サーマス・アクアティカス）ＤＮＡポリメラーゼ（組換え，ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））、および、１０×ＰＣＲ緩衝液［２００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭのＫＣｌ］、Ｔｆｌ（サーマス・フラーブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ））ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｓｔｅｒ ＡｍｐTM，Ｂｉｏｚｙｍ，オルデンドルフ，ドイツ）、および、２０×ＰＣＲ緩衝液［２０ｍＭの（ＮＨ2）ＳＯ4、１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）。
【００７１】
【表１】
【００７２】
この場合、以下が適用された：１Ｕで、７４℃で３０分以内に、１０ｎＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸の、酸不溶性のＤＮＡ産物への変換が触媒された。ＰＣＲ反応は通常、「ホットスタート」で開始される：まず、ＤＮＡを変性させるために、９４℃で、ポリメラーゼ無しで混合物をインキュベートした。温度が８０℃に達した後、非特異的な増幅を防ぐために、ＤＮＡポリメラーゼをさらに低い温度で混合物に添加した。その後、実際のＰＣＲ反応を２５〜３５サイクル行った。
【００７３】
各サイクルでは、 以下の反応条件が適用された；
【表２】
【００７４】
最終的に、さらに鎖の伸長を７２℃で１０分間行い、最後に冷却した。
【００７５】
トータルＲＮＡの単離
全ての遠心分離工程は、１３０００ｒｐｍ、１６℃で行われ、溶解緩衝液（１００ＲＬＴ緩衝液：１メルカプトエタノール）６００μｌで細胞を溶解させた。細胞の溶解産物を、ＱｉａＳｃｈｒｅｄｄｅｒカラムにアプライし、２分間の遠心分離で除去した。
溶出液を、７０％エタノール６００μｌと混合し、よく混合し、ＤＮＡをＲＮＡイージー（ＲＮＡｅａｓｙ）ミニスピンカラムにアプライし、１５秒間遠心分離した（ＲＮＡをシリカマトリックスに結合させた）。カラムを３回洗浄した（１回はＲＷ１緩衝液７００ｍｌで、２回はＲＰＥ緩衝液５００μｌで）。次に、カラムを、オートクレーブした１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、ＲＮＡを蒸留水１５μｌで溶出させた。この方法で得られたトータルＲＮＡの平均濃度は、１μｇ／μｌであった。
【００７６】
アガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ分画化
変性アガロースゲル：アガロース、１ｇ；蒸留水、３７ｍｌ；１０×ＭＯＰＳ（０．２ｍＭのＭＯＰＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡＰ、１００ｍＭのＮａＡｃ）、１０ｍｌ；この混合物を沸騰させ、６０℃に冷却した。３７％濃度のホルムアルデヒド１６ｍｌを添加した。
ゲルが固化した後、ゲルを、ＲＮＡゲルランニング緩衝液と共に電気泳動装置に挿入した。ＲＮＡを特別なサンプル緩衝液と一緒にアプライした。
ＲＮＡゲルランニング緩衝液：１０×ＭＯＰＳ、４０ｍｌ；３７％濃度のホルムアルデヒド、６５ｍｌ；蒸留水、２９５ｍｌ。
ＲＮＡサンプル緩衝液：ＲＮＡ、１〜５μｇ；ＲＮＡ−新しい緩衝液（３７％濃度のホルムアルデヒドを７．５μｌ、１０×ＭＯＰＳを４．５μｌ、ホルムアミドを２５．９μｌ、蒸留水を７．５μｌ）、５μｌ；ホルムアミド色素マーカー［５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０，２５％（ｖ／ｖ）ブロモフェノールブルー、０，２５％（ｖ／ｖ）キシレンシアノール］、２μｌ。
ゲルを、８０Ｖで約３時間泳動した。この作業には、真核性ＲＮＡの単離物しか用いていないため、ゲル上で見ることができる優勢のバンドは、２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡのバンドのはずである。
【００７７】
ＭＭＬＶ−ＲＴ（マウスのモロニー白血病ウイルス逆転写酵素）を用いた逆転写酵素
逆転写酵素混合物；ＲＮＡ、５μｇ；初発の分子、１００μＭ。
ＲＮＡテンプレートにおける転写酵素を阻害する要因となり得る二次構造の形成を防ぐために、ＲＮＡ調整物と初発の分子を、７５℃で１０分間インキュベートした。しかしながら、通常は、この工程を行わなくても転写反応は起こる。
逆転写酵素反応混合物：Ｒｎａｓｉｎ(R)（プロメガ）、２８Ｕ；２５ｍＭのｄＮＴＰ；１０×逆転写酵素緩衝液［１０Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2］、５μｌ；逆転写酵素（ＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔTM，ストラタジーン）、５０Ｕ；蒸留水で５０μｌにした。
混合物を４２℃で１５分間、および、３７℃で４５分間インキュベートすることによって逆転写を行った。比較的長いＲＮＡテンプレートの場合、さらに、５５℃で３０秒中断しながら、４２℃で２時間長くインキュベートすることが推奨される。続いて、９５℃で５分間混合物をインキュベートすることにより、前記逆転写酵素が活性化された。続いて、逆転写混合物５〜２０μｌをＰＣＲ反応に用いた。
【００７８】
組織からのゲノムＤＮＡの製造
組織１００ｍｇを液体窒素中で破砕し、粉末を得た。この組織粉末を、反応緩衝液（直前に、プロテイナーゼＫ［２０ｍｇ／ｍｌ］３０μｌを緩衝液に添加した）６ｍｌを含むファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに入れ、５６℃で一晩、慎重に振盪しながらインキュベートした（１２〜１８時間）。インキュベート後に、ＲＮアーゼＡ（１０μｇ／μｌ）１００μｌを添加し、この混合物を、３７℃で１時間さらに振盪しながらインキュベートした。
これに続いて、フェノール４ｍｌを加え、チューブを手動で逆さまにひっくり返して、再び約５分間上に向けた。即座にＣｌ（クロロホルム／イソアミルアルコール）４ｍｌを添加し、チューブを逆さまにひっくり返し、再びさらに５分間上に向け、次に、１５分間遠心分離した（３０００ｒｐｍ）。その上清を慎重に除去し、１０ｍｌファルコンチューブに移した。上清がまだ透明ではない場合、フェノール抽出を繰り返すか、または、Ｃｌ４ｍｌを添加し、チューブを手動で逆さまにひっくり返し、５分間上に向け、続いて１５分間遠心分離しなければならない（３０００ｒｐｍ）。その上清を慎重に除去し、Ｃｌ抽出を繰り返した。得られた最終的な上清を、１０分の１量の酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ，ｐＨ６）、および、２．５倍量のエタノール（９９．８％）と混合した。ＤＮＡがもつれた状態で沈殿するまでチューブを慎重に回転させた。このＤＮＡがもつれたものを、ガラス製のフックを用いてエタノール（７０％）約２５ｍｌに移し、３分間静置した。洗浄を２回繰り返した。次に、ＤＮＡを空気乾燥させ、室温で再蒸留水０．５ｍｌに溶解させた。
【００７９】
サザンブロット
アガロースゲルによるＤＮＡの分画化
より大きいＤＮＡ分子（＞６ｋＢｐ）で鎖の破壊を起こすために、ゲルを短波長のＵＶ上に約５分間放置した。
ＤＮＡ変性のために、変性溶液中で連続的にゲルを３０分間傾けた。
中和のために、中和溶液中で連続的にゲルを３０分間傾けた。
ブロットの構成（下から上へ）：ゲル、ナイロンメンブレン、乾燥したろ紙、ブロッティングペーパー、プレート、重り（約１ｋｇ）。
２０×ＳＳＣを用いて一晩ブロッティングした。
２×ＳＳＣ中で１０分間メンブレンを洗浄し、ろ紙上でメンブレンを乾燥させ、８０℃で１時間ベーキングするか、またはＵＶ架橋により核酸を固定した（例えば「Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ」で、自動的に位置決定して）。次に、ハイブリダイゼーションまでメンブレンを保存した。
ハイブリダイゼーション溶液中で、メンブレンを約１〜２時間プレハイブリダイゼーションし、メンブレン上の非特異的結合部位を覆った。
ハイブリダイゼーション溶液：５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、
変性溶液：０．５ＭのＮａＯＨ（２０ｇ）、１ＭのＮａＣｌ、
中和溶液：１．５ＭのＮａＣｌ／０．５Ｍのトリス（ｐＨ７．４）。
２０×ＳＳＣは、３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸ナトリウム；ＮａＣｌ、１７５．３ｇ；クエン酸ナトリウム×２Ｈ2Ｏ、８８．２ｇであり、再蒸留水で１ｌにし、ｐＨをＨＣｌで７に調整した。
５０×デンハルト溶液：フィコール４００、５ｇ；ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、５ｇ；ＢＳＡＴ、５ｇ；再蒸留水で５００ｍｌにした。
【００８０】
ノーザンブロット
ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いたＲＮＡの分画化
ブロットの構成（下から上へ）：ゲル、ナイロンメンブレン、乾燥したろ紙、ブロッティングペーパー、プレート、重り（約１ｋｇ）。
２０×ＳＳＣ中で一晩ブロッティングした。８０℃でベーキング（１時間）してろ紙上にＲＮＡを固定した。ＲＮＡの脱グリオキシル酸化（ｄｅｇｌｙｏｘｙｌａｔｉｏｎ）のために、ろ紙を沸騰した２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）に導入し、室温まで冷却した。
【００８１】
図面の説明
図１：研究群の特徴付けである。
図２：解析した１３６２人の個体における、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０Ｃ、および、Ａ３３２９Ｃの分布である。
図３：ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃと、心房細動と心筋症との関連である。
図４：ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃと、心房細動、急性冠症候群および不安定狭心症との関連である。
図５：５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースで番号ＮＭ−００１９９２として利用可能である。製造された配列は、配列番号１と同一である。
図６：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号２と同一である。
図７：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号３と同一である。
図８：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号４と同一である。
図９：５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号５と同一である。
図１０：ＮＭ−０１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号６と同一である。
【００８２】
図１１：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号７と同一である、
図１２：ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号８と同一である。
図１３：ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの５’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号９と同一である。
図１４：ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの３’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１０と同一である。
図１５：ＮＭ−００１９９２に記載の２７６７〜２７８９位に関するヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１１と同一である。
図１６：ヒトＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。示された配列は、配列番号１２と同一である。
図１７：ヒトＰＡＲ１受容体のタンパク質配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩタンパク質データベースで番号ＮＰ−００１９８３として利用可能である。示された配列は、配列番号１３と同一である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】研究群の特徴付けである。
【図２】解析した１３６２人の個体における、ＰＡＲ１変異Ｔ３０９０Ｃ、および、Ａ３３２９Ｃの分布である。
【図３】ＰＡＲ１変異Ｃ３０９０Ｃと、心房細動と心筋症との関連である。
【図４】ＰＡＲ１変異Ｃ３３２９Ｃと、心房細動、急性冠症候群および不安定狭心症との関連である。
【図５−１】５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図５−２】図５−１の続きである。
【図６−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８−１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図９】５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１０】ＮＭ−０１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１１】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１２】ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位にＴからＣへの置換を含む多型を有し、同時に、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位にＡからＣへの置換を含む第二の多型を有する、５’／３’方向のヒトＰＡＲ１遺伝子のフラグメントのポリヌクレオチド配列である。
【図１３】ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの５’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１４】ヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの３’末端の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１５】ＮＭ−００１９９２に記載の２７６７〜２７８９位に関するヒトＰＡＲ１遺伝子ｃＤＮＡの、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１６】ヒトＰＡＲ１遺伝子のエキソン番号１の、５’／３’方向のポリヌクレオチド配列である。
【図１７】ヒトＰＡＲ１受容体のタンパク質配列である。この配列は、公共的に製造された配列に相当し、ＮＣＢＩタンパク質データベースで番号ＮＰ−００１９８３として利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を包含する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
３０９０位におけるＴからＣへの置換、および、３３２９位におけるＡからＣへの置換（いずれもＮＭ−００１９９２に基づく）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を包む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を含む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号５に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１１】
配列番号６に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１２】
配列番号７に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１３】
配列番号８に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１４】
以下の方法の工程：
ａ］配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列からなるヒトｃＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号９および配列番号１０に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によってＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列を増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られた３.５６ｋｂのフラグメントを単離および／または精製すること
、
ｅ］ｄ］に記載のフラグメントを配列解析すること
によって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を製造する方法。
【請求項１５】
以下の方法の工程：
ａ］配列番号１に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトゲノムＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって、ＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列のフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られたフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］に記載のフラグメントを配列解析すること
によって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を製造する方法。
【請求項１６】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ＰＣＲ反応により、配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］からのポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること、
を含む、上記方法。
【請求項１７】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］ＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写すること、
ｄ］必要に応じて、ＰＣＲ反応により、配列番号１０および配列番号１１に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｅ］ｃ］に記載のｃＤＮＡ、および／または、ｄ］に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること、
を含む、上記方法。
【請求項１８】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載の染色体ＤＮＡでサザンブロットを行うこと、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのサザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ｅ］からのハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項１９】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのノーザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２０】
配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
配列番号１１を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号１２に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
配列番号１２を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ＰＣＲ反応により、ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するための、請求項２０または２１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列と、請求項２２または２３に記載の単離されたポリヌクレオチド配列とを組み合わせた使用。
【請求項２５】
ＰＡＲ１遺伝子は、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ａ］請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド配列、
ｂ］請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド配列、
ｃ］ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の酵素、
ｄ］および、必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液、
ｅ］および、必要に応じて、さらに請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列、
ｆ］および、必要に応じて、配列解析を行うための試薬、
を含む、成分のキット。
【請求項２７】
請求項２６に記載の成分のキットを製造する方法であって、
ａ］請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド配列を製造すること、
ｂ］請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｃ］ＰＣＲ反応を行うための酵素を提供すること、
ｄ］必要に応じて、配列解析を行うための試薬を提供すること、
ｅ］必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液を提供すること、
ｆ］必要に応じて、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｇ］適切な容器に、ａ］〜ｅ］に記載の成分を、それぞれ別々に導入すること、
ｈ］必要に応じて、ｇ］に記載の容器を、１またはそれ以上のパック単位に合わせること、
を含む、上記方法。
【請求項２８】
ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するため、および、必要に応じて、ＰＡＲ１遺伝子において、遺伝学的変異が、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位に存在するかどうかをさらに解析するための、請求項２６または２７に記載の成分のキットの使用。
【請求項１】
ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を包含する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に記載の配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号３に記載の配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
３０９０位におけるＴからＣへの置換、および、３３２９位におけるＡからＣへの置換（いずれもＮＭ−００１９９２に基づく）を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を包む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
ＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列は、配列番号４に記載の配列を含む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
配列番号５に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１１】
配列番号６に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１２】
配列番号７に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１３】
配列番号８に記載の配列を含む、単離されたＰＡＲ１遺伝子のポリヌクレオチド配列の一部。
【請求項１４】
以下の方法の工程：
ａ］配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列からなるヒトｃＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号９および配列番号１０に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によってＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列を増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られた３.５６ｋｂのフラグメントを単離および／または精製すること
、
ｅ］ｄ］に記載のフラグメントを配列解析すること
によって、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を製造する方法。
【請求項１５】
以下の方法の工程：
ａ］配列番号１に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号２に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号３に記載のＰＡＲ１配列、および／または、配列番号４に記載のＰＡＲ１配列を含むヒトゲノムＤＮＡを提供すること、
ｂ］配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマー対を提供すること、
ｃ］ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）によって、ＰＡＲ１のポリヌクレオチド配列のフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］から得られたフラグメントを単離および／または精製すること、
ｅ］ｄ］に記載のフラグメントを配列解析すること
によって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を製造する方法。
【請求項１６】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ＰＣＲ反応により、配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｄ］ｃ］からのポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること、
を含む、上記方法。
【請求項１７】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］ＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写すること、
ｄ］必要に応じて、ＰＣＲ反応により、配列番号１０および配列番号１１に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドフラグメントを増幅すること、
ｅ］ｃ］に記載のｃＤＮＡ、および／または、ｄ］に記載のポリヌクレオチドフラグメントを配列解析すること、
を含む、上記方法。
【請求項１８】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料から染色体ＤＮＡを得ること、
ｃ］ｂ］に記載の染色体ＤＮＡでサザンブロットを行うこと、
ｄ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのサザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ｅ］からのハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項１９】
ＰＡＲ１遺伝子において、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換があるかないかを検出する方法であって、以下の工程：
ａ］ヒト細胞を含む生物材料を提供すること、
ｂ］ａ］に記載の材料からＲＮＡを得ること、
ｃ］配列番号５、および／または、配列番号６、および／または、配列番号７、および／または、配列番号８に記載のプローブを提供すること、
ｅ］ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ｃ］からのノーザンブロットと、ｄ］に記載のプローブとをハイブリダイズすること、
ｆ］ハイブリダイゼーションの結果を比較することによって、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位における、ＰＡＲ１遺伝子の遺伝学的変異があるかないかを決定すること、
を含む、上記方法。
【請求項２０】
配列番号１１に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２１】
配列番号１１を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２２】
配列番号１２に記載の配列を含む２１〜５０個のヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２３】
配列番号１２を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２４】
ＰＣＲ反応により、ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するための、請求項２０または２１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列と、請求項２２または２３に記載の単離されたポリヌクレオチド配列とを組み合わせた使用。
【請求項２５】
ＰＡＲ１遺伝子は、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３０９０位におけるＴからＣへの置換、および／または、ＮＭ−００１９９２に記載の配列の３３２９位におけるＡからＣへの置換を有する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ａ］請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド配列、
ｂ］請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド配列、
ｃ］ＰＣＲ反応を行うための少なくとも１種の酵素、
ｄ］および、必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液、
ｅ］および、必要に応じて、さらに請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列、
ｆ］および、必要に応じて、配列解析を行うための試薬、
を含む、成分のキット。
【請求項２７】
請求項２６に記載の成分のキットを製造する方法であって、
ａ］請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド配列を製造すること、
ｂ］請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｃ］ＰＣＲ反応を行うための酵素を提供すること、
ｄ］必要に応じて、配列解析を行うための試薬を提供すること、
ｅ］必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖伸長反応（ＰＣＲ）を行うための物質および／または溶液を提供すること、
ｆ］必要に応じて、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を提供すること、
ｇ］適切な容器に、ａ］〜ｅ］に記載の成分を、それぞれ別々に導入すること、
ｈ］必要に応じて、ｇ］に記載の容器を、１またはそれ以上のパック単位に合わせること、
を含む、上記方法。
【請求項２８】
ＰＡＲ１遺伝子のフラグメントを増幅するため、および、必要に応じて、ＰＡＲ１遺伝子において、遺伝学的変異が、ＮＭ−００１９９２の３０９０位および／または３３２９位に存在するかどうかをさらに解析するための、請求項２６または２７に記載の成分のキットの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５３４２９３（Ｐ２００７−５３４２９３Ａ）
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５１５９（Ｐ２００６−５０５１５９）
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４０３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４７０
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１６日（２００４．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４０３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９４４７０
【国際公開日】平成１６年１１月４日（２００４．１１．４）
【出願人】（３９７０５６６９５）サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング (456)
【Ｆターム（参考）】
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