性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法
【課題】 新規かつ簡便な性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスを作製して表現型を解析し、同ノックアウトマウスでは、男性ホルモン障害の増悪因子であるテストステロンを分泌する組織である精巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。更に、同ノックアウトマウスでは、女性ホルモン障害の原因となるエストロゲンを分泌する組織である卵巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。これらの知見により、ＧＰＲｇ２ポリペプチド及び該ポリペプチドを発現している細胞を性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして提供した。更に、ＧＰＲｇ２ポリペプチドを使用する性ホルモン障害治療薬スクリーニング系を構築し、本発明を完成させた。
【解決手段】ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスを作製して表現型を解析し、同ノックアウトマウスでは、男性ホルモン障害の増悪因子であるテストステロンを分泌する組織である精巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。更に、同ノックアウトマウスでは、女性ホルモン障害の原因となるエストロゲンを分泌する組織である卵巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。これらの知見により、ＧＰＲｇ２ポリペプチド及び該ポリペプチドを発現している細胞を性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして提供した。更に、ＧＰＲｇ２ポリペプチドを使用する性ホルモン障害治療薬スクリーニング系を構築し、本発明を完成させた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２を使用した性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
性腺は男女を問わず、上位の刺激ホルモンにより機能が維持されている（非特許文献１）。視床下部から放出される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）が、下垂体門脈系を介して、下垂体前葉より卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と黄体化ホルモン（ＬＨ）の分泌を促進し、これらＦＳＨとＬＨにより、性ホルモンの合成・分泌、精子形成、卵胞発育、黄体維持が惹起される。
男性性腺である精巣の機能低下疾患としては、視床下部及び／又は下垂体系の障害によりＬＨ及び／又はＦＳＨ分泌が低下する低ゴナドトロピン性性腺機能低下症と、精巣原発性の異常からネガティブフィードバック機構を介してＬＨ及び／又はＦＳＨ分泌が増加する高ゴナドトロピン性性腺機能低下症がある（非特許文献２）。女性性腺である卵巣の機能低下症としては無排卵症があり、その原因によって視床下部障害、下垂体障害、卵巣性障害に分類される（非特許文献３）。
一般的に性ホルモンは、男性ホルモン（アンドロゲン）として、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロスタンジオン等に、女性ホルモンとして、エストロゲン、プロゲステロン等に分類される（非特許文献４）。アンドロゲンやエストロゲンが関与する性ホルモン異常に起因する疾患としては、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症等が挙げられる（特許文献１、非特許文献５）。
前立腺癌や前立腺肥大において、テストステロン等のアンドロゲンが、病態の発生・進行に重要な役割を担っていることは良く知られている（非特許文献６、非特許文献７）。血清中のアンドロゲン量を低下させることが前立腺癌や前立腺肥大等の種々の症例に有用であることは十分に確立されており、臨床的実施においては、睾丸摘出、ＬＨ−ＲＨアゴニスト又はアンドロゲンアンタゴニストが用いられている（特許文献１）。しかし睾丸摘出は心理的に受け入れ難いものであり、また、ＬＨ−ＲＨアゴニストによる治療の場合にはアゴニスト作用による一過性のフレアー現象が認められる。加えて、アンドロゲンアンタゴニストによる治療の場合には、アンドロゲンレセプターの変異により効果が衰弱することが近年知られている（特許文献１）。
一方、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌の治療としては、血清中のエストロゲン量を低下させることが有効であることは十分に確立されており（非特許文献５）、エストロゲンの分泌を阻害するＬＨ−ＲＨアゴニスト等によるホルモン療法が用いられる。しかし、エストロゲンレベルの低下に伴うホット・フラッシュ、発汗などの卵巣欠落症状と低エストロゲン状態が持続することによる骨塩量減少の副作用が認められる（非特許文献８）。また一方、更年期障害、オステオポローシスや卵巣機能低下に伴う高脂血症では、女性ホルモンであるエストロゲンの減少が大きく関与している。そのため、血中エストロゲン量を増加させることを目的として、エストロゲン製剤やプロゲステロン製剤が治療に用いられている（非特許文献９）。
Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）であるＧＰＲｇ２の遺伝子は、ヒトでは、２０番染色体に局在している。ヒトでの組織発現分布を解析すると、ＧＰＲｇ２は中枢神経系で比較的発現が高く、特に胎児脳では成人脳よりも高い発現が観察される。その他、骨格筋、骨髄、精巣でも量は低いが発現が観察される（非特許文献１０）。ＧＰＲｇ２のリガンドはプロキネティシン （Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ， ＰＫ）であることが、幾つかのグループにより報告されており（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）、リガンドであるＰＫと結合することにより、細胞内Ｃａ2+量の増大を引き起こす。ＧＰＲｇ２は、その組織発現分布様式から、概日リズムの調節を担っていること（非特許文献１３）、小腸の収縮や血管形成に関与すること（非特許文献１１）が示唆されている。
ＰＫは、ヒトでプロキネティシン１（ＰＫ１）とプロキネティシン２（ＰＫ２）の２種類のサブタイプが存在する生理活性ペプチドである（非特許文献１４）。ＰＫ１はエンドクリングランドバスキュラーエンドセリアルグロースファクター（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｇｌａｎｄ − ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ＥＧ−ＶＥＧＦ）、ＰＫ２は、Ｂｖ８という別称もあり（非特許文献１５、非特許文献１６）、マンバ（南アフリカ産のコブラ科の大型毒ヘビ）や、カエルにも該当分子が存在することが知られている（非特許文献１７、非特許文献１８）。
ＰＫの生理機能に関しては、神経細胞死抑制活性（非特許文献１９）、痛覚過敏惹起活性（非特許文献１８）、消化器収縮作用（非特許文献２１、非特許文献２２）、精子形成作用（非特許文献２３）、概日リズムの調節（非特許文献１３）、内分泌腺特異的内皮細胞増殖（非特許文献１５）や、精巣での血管新生活性（非特許文献１６）、及び摂食・摂水行動への機能（非特許文献２４）等が報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】イラスト内分泌内科、ｐ．８０−８１ 文光堂
【非特許文献２】内分泌・代謝病学、ｐ．２７７ 医学書院
【非特許文献３】内分泌・代謝病学、ｐ．２９３ 医学書院
【非特許文献４】血中ホルモン、測定法・意義・臨床 医学書院
【非特許文献５】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊
【非特許文献６】日本臨床、２００２年、６０巻、ｐ．２３−２７
【非特許文献７】臨床と研究、２０００年、７７巻、ｐ．４４８
【非特許文献８】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊、ｐ．１５０−１９８
【非特許文献９】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊、ｐ．２００−２１９
【非特許文献１０】「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ」ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ （オランダ） ２００２年、１５７９巻、ｐ．１７３−１７９
【非特許文献１１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国） ２００２年、２７７巻、ｐ．１９２７６−１９２８０
【非特許文献１２】「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ」ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ （オランダ） ２００２年、２９３巻、ｐ．３９６−４０２
【非特許文献１３】「ネイチャー」Ｎａｔｕｒｅ （英国） ２００２ ４１７：４０５−１０
【非特許文献１４】「モレキュラー・ファーマコロジー」ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （米国） ２００１年、第５９巻、ｐ．６９２−６９８
【非特許文献１５】「ネイチャー」Ｎａｔｕｒｅ （英国） ２００１年、４１２巻、ｐ．８７７−８８４
【非特許文献１６】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ ＯＦ ＴＨＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ （米国） ２００３年、１００巻、ｐ．２６８５−２６９０
【非特許文献１７】「トキシコン」Ｔｏｘｉｃｏｎ （英国） １９９０年、２８巻、ｐ．８４７−８５６
【非特許文献１８】「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （オランダ） １９９９年、３７４巻、ｐ．１８９−１９６
【非特許文献１９】ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ （英国） ２００１ １３：１６９４−７０２
【非特許文献２０】「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （英国） ２００２ １３７：１１４７−５４
【非特許文献２１】「モレキュラー・ファーマコロジー」ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （米国） ２００１ ５９：６９２−８
【非特許文献２２】「フェブス・レターズ」ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ （オランダ） １９９９ ４６１：１８３−８
【非特許文献２３】「フェブス・レターズ」ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ （オランダ） １９９９ ４６２：１７７−８１
【非特許文献２４】「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （英国） ２００４ １４２：１８１−１９１
【特許文献１】国際公開第００／１７１６３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規かつ簡便な性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意検討した結果、ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスの解析から、ＧＰＲｇ２（配列番号２記載のポリペプチド）のアゴニスト及び／又はアンタゴニストは性ホルモン障害治療薬となることを明らかにした。すなわち、本発明者らは、ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスを作製して表現型を解析し、同ノックアウトマウスでは、男性ホルモン障害（特には前立腺癌及び前立腺肥大症）の増悪因子であるテストステロンを分泌する組織である精巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮しており、血中テストステロン量が減少していることを見出した。更に、同ノックアウトマウスでは、女性ホルモン障害の原因となるエストロゲンを分泌する組織である卵巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。これらの知見により、ＧＰＲｇ２ポリペプチド及び該ポリペプチドを発現している細胞を性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして提供した。更に、ＧＰＲｇ２ポリペプチドを使用する性ホルモン障害治療薬スクリーニング系を構築し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］ ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド、あるいはｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド
を発現している細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法、
［２］ 性ホルモン障害が男性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法、
［３］ 性ホルモン障害が女性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法、
［４］ （１）請求項１に記載の細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）請求項１に記載のポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法、
［５］ 性ホルモンがテストステロンである請求項４に記載の検出する方法、
［６］ 性ホルモンがエストロゲンである請求項４に記載の検出する方法、
［７］ 請求項１に記載のポリペプチドである、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール、
［８］ 請求項１に記載の細胞である、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール、
［９］（１）請求項１に記載のポリペプチド、又は（２）請求項１に記載の細胞の性ホルモン障害治療薬スクリーニングのための使用
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
ＧＰＲｇ２は性ホルモン障害に関与する分子であり、本明細書のポリペプチド及び細胞は、性ホルモン障害治療薬の同定及びスクリーニングに用いることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
［１］性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール及びスクリーニングのための使用
本明細書において、「性ホルモン障害」とは男性ホルモン障害及び女性ホルモン障害をいう。「男性ホルモン障害」とは、男性ホルモンの異常により引き起こされる疾患(例えば、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症)を、「女性ホルモン障害」とは、女性ホルモンの異常により引き起こされる疾患（例えば、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌）をいう。本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物（具体的には、スクリーニングの為に用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）をいう。「性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール」とは、性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬をスクリーニングするために、本発明の性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬をスクリーニングする方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞又はポリペプチドである。（１）〜（３）に記載のポリペプチド又は細胞の、性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
本発明の性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールには、ポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールと細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとが含まれる。また、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとしては、テストステロン抑制剤スクリーニングツール、テストステロン亢進剤スクリーニングツール、エストロゲン抑制剤スクリーニングツール及びエストロゲン亢進剤スクリーニングツールが含まれる。
【０００９】
１）ポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。以下、本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることができるこれらの各種ポリペプチドを総称して、スクリーニング用ポリペプチドと称する。
【００１０】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味する。ＢＬＡＳＴ検索は、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて行うことができる。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
以上、スクリーニング用ポリペプチドについて説明したが、該ポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がより好ましい。スクリーニング用ポリペプチドは前記ポリペプチドである限り特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
【００１１】
例えば、機能的等価改変体であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の変異体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の変異体）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列を、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなども含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の対応するポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能的等価改変体（ヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の変異体も含む）は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
【００１２】
本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述するスクリーニングツール用細胞の一つであるスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、機能的改変体をコードするポリヌクレオチド、及び相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１３】
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（Ａ）ＰＣＲを用いた方法、（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（Ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
【００１４】
（Ａ）ＰＣＲを用いた方法
本明細書のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織からｍＲＮＡを抽出する。次いでこのｍＲＮＡを鋳型として該受容体ｍＲＮＡ又は一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、該本明細書のポリペプチドｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。さらに、得られたヒトの本明細書のポリペプチドｃＤＮＡ又はその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、該受容体の蛋白質を製造することができる。
まず、本明細書のポリペプチドの産生能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脳から該蛋白質をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該蛋白質の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。また、ｃＤＮＡは合成せずとも、実施例１、実施例２で用いているように、市販されているｃＤＮＡを用いても良い。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９１；以下、ＰＣＲという）に供し、目的とする本明細書のポリペプチドのＤＮＡを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００１５】
（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
【００１６】
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法、（３）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００１７】
他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞表面に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
【００１８】
（Ｃ）化学合成法
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
【００１９】
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、下記の方法によって得ることができる。単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることができる。
前記形質転換細胞を培養することにより、前記細胞の細胞表面に生産されるスクリーニングツール用ポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。該方法としては、具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。なお、膜分画は常法に従って得ることができる。例えば本発明のプロキネティシン受容体を表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより得られる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（ＣＨＡＰＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ジキトニン等）でプロキネティシン受容体を可溶化することにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドはマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ、ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列と本明細書のポリペプチドの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とＨｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｍ．Ｋ． ａｎｄ Ｈａｇａ， Ｔ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０， １２３２−１２３８）
【００２０】
２）細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール
本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）としては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している細胞；
（２）機能的等価改変体を発現している細胞；及び
（３）相同ポリペプチドを発現している細胞を挙げることができる。上記ポリペプチドを発現している細胞としては、ｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞、及びｉｉ）天然に前記ポリペプチドを発現している細胞の両方が含まれる。本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとしては、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞が好ましい。
スクリーニングツール用細胞は、例えば、先に述べた方法により単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
【００２１】
前記発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。また、本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用細胞は、前記発現ベクターで形質転換され、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いる際に前記ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。スクリーニングツール用細胞は、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００２２】
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． （１９８１） Ｃｅｌｌ， ２３， １７５−１８２）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ．（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４２１６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ＶｉｒｕｓのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ （Ｓｕｂｒａｍａｎｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １， ８５４−８６４）、ヒトのｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒプロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ （Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５３２２）、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を例示できるが、これに限定されない。
【００２３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 ｐＭＥ１８Ｓ、 （Ｍａｒｕｙａｍａ， Ｋ． ａｎｄ Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ． （１９９０） Ｍｅｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０， ２７−３２）、ｐＥＦ−ＢＯＳ （Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５３２２）、 ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ， ３２９， ８４０−８４２） 等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｇ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ， Ａ． Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２， ４５６−４５７）、 ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．（１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ．， １， ８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９）： “ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ． （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １， ３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによりスクリーニング用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内又は細胞表面に本発明のスクリーニング用ポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
【００２４】
［２］性ホルモン障害治療薬スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法には、
スクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程、およびスクリーニングツール用ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法
が含まれる。更には、
性ホルモン障害が男性ホルモン障害である上記記載のスクリーニングする方法、性ホルモン障害が女性ホルモン障害である上記記載のスクリーニングする方法が包含される。
男性ホルモン障害としては、男性ホルモン（特にはテストステロン）が増悪因子となる疾患(特には、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏)及び男性ホルモン（特にはテストステロン）の減少が原因となる疾患（特には低ゴナドトロピン性性腺機能低下症）が挙げられる。女性ホルモン障害としては、女性ホルモン（特にはエストロゲン）の減少が原因となる疾患（特には、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症）、及び女性ホルモン（特にはエストロゲン）が増悪因子となる疾患（特には、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌）が挙げられる。
従って、本発明には、性ホルモン障害が前立腺肥大及び／又は前立腺癌である上記記載のスクリーニングする方法も包含される。
【００２５】
スクリーニングツール用ポリペプチド又はスクリーニングツール用細胞を用いると、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を修飾可能な物質（化合物、ペプチド及び抗体）を検出及びスクリーニングすることができる。本明細書の「スクリーニング」とは、多数の試験化合物の中から目的の活性を有する化合物を篩い分けること、及び、ある試験化合物について、その化合物が目的の性質を有する化合物であるか否かを検出すること（即ち篩い分けること）の両方を含む。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニング用ポリペプチドの活性の変化は、スクリーニングに用いる受容体蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測定することにより分析することができる。指標とする活性とは、たとえばリガンドとの結合活性であり、あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答である。具体的には、以下ａ）〜ｃ）に述べるような検出方法を示すことができる。スクリーニング用ポリペプチドとしては、該ポリペプチドを発現させた細胞、該細胞の膜分画、又は該ポリペプチドからなる蛋白質の精製標品などを用いることもできる。また本発明によるスクリーニング方法のための試験化合物としては、市販の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５１， ８１３５−８１３７）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２２， ３０１−３１０）などを応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング方法により選択された化合物又はペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドを用いうるが、それらに限らない。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニング用ポリペプチドの活性変化を分析する工程は、スクリーニング用ポリペプチドの生理学的な特性に応じた活性の指標を測定（例えば、リガンドとの結合活性を測定、あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答を測定（例えばＧＴＰγＳ結合の測定又は細胞内Ｃａ2+濃度の変動の測定））し、分析することにより実施できる。
ａ）リガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドに結合する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はリガンド結合アッセイ法によりスクリーニングする事ができる。該スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を調製する。緩衝液、イオン、ｐＨのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で同スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を、標識リガンド、例えば125Ｉ標識プロキネティシン（好ましくは125Ｉ標識プロキネティシン２）を試験化合物と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性をγカウンター等で測定する。以上の工程（以下、リガンド結合アッセイ工程）により得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質は、男性ホルモン（特にはテストステロン）の減少が原因となる疾患（特には低ゴナドトロピン性性腺機能低下症）、及び、女性ホルモン（特にはエストロゲン）の減少が原因となる疾患（特には、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症）の治療や予防に有用である。また、本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質は、男性ホルモン（特にはテストステロン）が増悪因子となる疾患(特には、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏)、及び女性ホルモン（特にはエストロゲン）が増悪因子となる疾患（特には、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌）の治療や予防に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、ＷＯ０１／１９９８６に記載のリガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法により実施できる。ただし、リガンドはＬＴＣ4をプロキネティシンに、受容体はＬＴＣ4受容体をスクリーニング用ポリペプチドに置き換える。より具体的には実施例６に記載の方法により実施できる。
【００２８】
ｂ）ＧＴＰγＳ結合法を利用したスクリーニング方法
スクリーニング用ポリペプチドの活性を修飾する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はＧＴＰγＳ結合法によりスクリーニングすることが可能である（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ． ａｎｄ Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ． （１９９３） Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １０９， １１２０−１１２７）。スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５０ｍＭ ＧＤＰ溶液中で、35Ｓで標識されたＧＴＰγＳ ４００ｐＭと混合する。試験化合物存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。以上の工程を、以下、ＧＴＰγＳ結合法アッセイ工程という。試験化合物存在下における、特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験化合物存在下における、リガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００２９】
ｃ）細胞内Ｃａ2+濃度の変動を利用したスクリーニング方法
スクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）は、スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の細胞内Ｃａ2+濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。細胞内Ｃａ2+濃度の変動を測定する工程を、細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程という。細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程は、ｆｕｒａ２やｆｌｕｏ３等を用いて測定することにより実施できる。
あるいは、Ｃａ2+濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出することにより、間接的にＣａ2+濃度を測定することにより実施可能である。具体的には以下の方法で、Ｃａ2+濃度を測定することができる。まず、セラムレスポンシブエレメントをつないだレポーター遺伝子をスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞に導入し、試験化合物及びリガンド（好ましくは最終濃度５−５００ｎＭのプロキネティシン（特に好ましくはプロキネティシン２））を該細胞の培養液中に加える。レポーター遺伝子には、検出可能なシグナルを生成することができる任意の遺伝子を用いることができ、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。３７℃で４時間インキュベート後、培地を除去し、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定する。そして試験薬添加時のルシフェラーゼ活性誘導を指標に、スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験薬添加時のリガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるルシフェラーゼ活性誘導の阻害を指標に、スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法においては、該蛋白質を発現させた細胞と発現させていない宿主細胞（コントロール細胞）に試験薬（化合物、ペプチド、及び抗体）及びリガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）を一定時間作用させ、Ｃａ2+濃度を直接あるいは間接的に測定する。コントロール細胞と比較して、該蛋白質を発現させた細胞特異的なＣａ2+濃度の上昇又は低下を指標にアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験化合物存在下における、リガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるＣａ2+濃度の上昇又は低下の阻害作用を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法は、実施例５記載の条件で行うことが好ましい。
例えば実施例５に記載のアッセイ条件で、ＥＣ５０が１００μＭ以下の物質を、好ましくはＥＣ５０が１０μＭ以下の物質を、更に好ましくはＥＣ５０が１μＭ以下の物質をアゴニスト活性を有する物質として選択することができる。また、たとえば実施例５に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、即ち、実施例５の条件でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
【００３２】
［３］本発明の検出方法
本発明には、
（１）スクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）スクリーニングツール用ポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物がスクリーニングツール用ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法
が含まれる。また、本発明には、性ホルモンがテストステロンである上記検出方法及び性ホルモンがエストロゲンである上記検出方法が含まれる。
前記（１）及び（２）の工程は、例えば、前述の［２］性ホルモン障害治療薬スクリーニング方法のリガンド結合アッセイ工程、ＧＴＰγＳ結合法アッセイ工程又は細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程に記載の通りに実施することができる。試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程は、定法に従って行うことができる。例えば、試験化合物によるテストステロン量の変動を分析する工程は、常法に従い、試験化合物又は陰性コントロール（例えば生理食塩水など）を試験動物（例えばマウス、ラットなど）に投与し、試験動物の血中テストステロン濃度を測定し分析することにより実施できる。血中テストステロン濃度は、トータルテストステロンキット（ヤトロン社）やＤＥＬＦＩＡテストステロン測定キット（パーキンエルマー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。好ましくは、実施例１０に記載の方法により実施できる。試験化合物によるエストロゲン量の変動を分析する工程は、常法に従い、試験化合物又は陰性コントロール（例えば生理食塩水など）を試験動物（例えばマウス、ラットなど）に投与し、試験動物の血中エストロゲン濃度を測定し分析することにより実施できる。血中エストロゲン濃度は、ＤＥＬＦＩＡエストラジオール測定キット（パーキンエルマー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドのアンタゴニストとしては、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を阻害するものが好ましく、更には、テストステロン及び／又はエストロゲン量を低下させる物質が好ましい。スクリーニングツール用ポリペプチドのアゴニストとしては、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を亢進するものが好ましく、更には、エストロゲン量を増加させる物質が好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りのない限り、公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ら， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ， １９８９、相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５等の遺伝子操作実験マニュアルに従って実施した。
（実施例１） 動物細胞でのプロキネティシン発現系の構築
【００３４】
ヒトプロキネティシン１、２をコードする遺伝子の増幅には、プロキネティシン１はヒト小腸、プロキネティシン２はヒト精巣由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに用いた。プロキネティシン１が、フォワードプライマーとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。プロキネティシン２がフォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号４、配列番号６で表される塩基配列にはＦＬＡＧ配列が含まれる。従って、プロキネティシンは、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧ エピトープをインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシンの精製が簡便化できる。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、プロキネティシン１、２共に約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をｐＣＲ２．１ ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、既知プロキネティシン１、２配列 （ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． ＡＦ３３３０２４、ＡＦ３３３０２５）と合致したクローンをそれぞれ選択した。これらクローンをＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、動物細胞発現用ｐＣＥＰ４ ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）に挿入した。
構築されたプロキネティシン発現プラスミドは、６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社製）にＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１×１０5細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのプロキネティシン１又はプロキネティシン２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、ハイグロマイシンＢ含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をプロキネティシン発現細胞として用いた。プロキネティシン発現細胞は、１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ；アサヒテクノグラス社）にコンフルエントになるまで培養後、培地を廃棄し、０．５％牛胎児血清入りＤＭＥＭ培地にて４日間培養して、プロキネティシン含有培地を回収した。
（実施例２） ＧＰＲｇ２の遺伝子クローニングとＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞の取得
【００３５】
ヒトＧＰＲｇ２をコードする遺伝子の増幅には、ヒト脾臓由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに、フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＸｂａＩで消化した後、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９７ １３５４：１５９−７０）に挿入した。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号１に示す。
同配列は１１５５塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号：１）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（３８４アミノ酸）を配列番号２に示す。
構築されたＧＰＲｇ２発現プラスミドは、６ウェルプレートにＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞を１ウェルあたり１×１０5細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのＧＰＲｇ２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、メトトレキセート含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をＧＰＲｇ２発現細胞として用いた。
（実施例３） ＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞のプロキネティシンによる細胞内Ｃａ2+濃度の変化
【００３６】
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）にＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞もしくは、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒを組み込んだＣＨＯ細胞（空ベクター処理細胞）を１×１０4細胞でプレーティングして２４時間培養後、培地を廃棄し、４μＭ Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（モレキュラープローブ社）、０．００４％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄおよび１％ ＦＢＳと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨｕｎｋ≡ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ；ギブコ社）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳで４回洗浄して、１ウェルあたり１００μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳを添加した。
細胞内Ｃａ2+濃度の変化は細胞内Ｃａ2+濃度測定装置（ＦＬＩＰＲ；モレキュラーデバイス社）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始１０秒後に、プロキネティシンを含むＨＥＫ２９３細胞培養上清を添加し、添加後、５０秒間は１秒毎に、さらに４分間は６秒毎に蛍光強度を測定した。得られた結果の蛍光値をＹ軸に、時間をＸ軸にプロットすると、ＧＰＲｇ２はプロキネティシンに反応して細胞内Ｃａ2+濃度の変化が観察されたが、プロキネティシンを発現させないＨＥＫ２９３細胞培養上清では観察されなかった。さらに、同反応は、空ベクターを処理したＣＨＯ細胞では見られなかった。
以上により、本明細書のポリペプチドで形質転換した細胞の細胞内Ｃａ2+濃度の変化を測定する事で本明細書のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、すなわち性ホルモン障害治療薬のスクリーニングが可能となった。
（実施例４） 動物細胞発現プロキネティシン１及び２の発現並びに精製
【００３７】
動物細胞で発現させたプロキネティシンの精製サンプルを用いて、放射性同位元素標識を行い、バインディングアッセイ等に用いることを考え、まず、以下の実験により精製プロキネティシンを得た。その際、プロキネティシン１は、精製時に用いたＦＬＡＧ配列を除去するために、インフレームでＦａｃｔｏｒＸａ配列を入れて、ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍと同じものを作製した。また、プロキネティシン２は、分子内に放射性同位元素標識に用いるＴｙｒ残基を有していないため、Ｃ末端のＦＬＡＧ配列を残して、同配列中のＴｙｒ残基に対して放射性同位元素標識することを考えた。具体的には以下の手順で精製プロキネティシンを取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン１を取得するために、フォワードプライマーとして配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＳｐｅＩ認識配列が付加してある。なお、配列番号９で表される塩基配列には、インフルエンザＡウイルス・ヘマグルチニンのシグナルシーケンス配列、ＦＬＡＧ配列、そしてＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列が含まれる。従って、プロキネティシン１は、細胞外分泌後は、Ｎ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧ エピトープとＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列をインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシン１の精製が簡便化できる。ＰＣＲはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９４°Ｃ（３０秒）／５５°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＳｐｅＩで消化した後、ｐＣＥＰ４ ｐｌａｓｍｉｄに挿入した。得られたクローンの塩基配列は、ＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解析した。構築されたプロキネティシン１発現プラスミドは、（実施例１）で用いた方法と同様に、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン１安定発現細胞株を取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン２の取得のためには、実施例１で作製した、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現されるプロキネティシン２をコードするｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ ｐｌａｓｍｉｄに挿入して用いた。従って、プロキネティシン２は、細胞外分泌後は、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現される。構築されたプロキネティシン２発現プラスミドは、実施例２で用いた方法と同様に、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン２安定発現細胞株を取得した。
実施例１と同じ方法で回収したプロキネティシン１もしくは、プロキネティシン２を含有する培地を、それぞれＭ２−アガロースカラム（シグマ社）にかけ、０．５％ ＮａＣｌ含有ＰＢＳでカラムを洗浄後、プロキネティシン１は、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ（アマシャム社）含有ＰＢＳで一晩反応して、プロキネティシン２は、ＦＬＡＧ−ｐｅｐｔｉｄｅ含有ＰＢＳにて、それぞれＭ２−アガロースカラムより溶出した。目的プロキネティシンを含む溶出産物は、最終的にＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＦＰＬＣカラム（アマシャム社）でゲルろ過を行い精製を行った。精製産物をＳＤＳ電気泳動後、銀染色（第一化学社）を行ったところ、プロキネティシン２の方がプロキネティシン１よりわずかに高分子側に、共に約１０ ｋＤａの単一バンドとして確認された。プロキネティシン１と２の推定分子量は、それぞれ９６６６．８８Ｄａ、１００３９．３１Ｄａである事から、予測分子量に合致しており、プロキネティシン１及び２が精製されていることが確認できた。
（実施例５）ＧＰＲｇ２発現ＨＥＫ２９３細胞のプロキネティシンによるルシフェラーゼレポーターアッセイ系の構築
【００３８】
コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を１ウェル当たり７×１０4細胞となるように播種し、２４時間培養した後、実施例１で構築したＧＰＲｇ２動物細胞発現プラスミド、又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ストラタジーン社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて、２者同時に遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、１０ｎＭの精製プロキネティシン１もしくは精製プロキネティシン２を添加して、５時間３７℃で反応させ、ルシフェラーゼアッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＧＰＲｇ２を遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞では、空ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞に比べて、細胞内ルシフェラーゼ活性が特異的に上昇していた。
プロキネティシンの代わりに、又はプロキネティシンと同時に被験薬を添加してこの反応系を用いる事で、プロキネティシン１又は２と同様の活性を有するアゴニスト活性を有する物質、並びにＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質、即ち性ホルモン障害治療薬のスクリーニングが可能になった。
（実施例６） 125Ｉ標識プロキネティシン２を用いたＧＰＲｇ２受容体結合アッセイ系の構築
【００３９】
１５０ｍｍ培養シャーレにＣＨＯ細胞及びＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞をコンフルエントになるまでそれぞれ培養後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2にそれぞれ懸濁してホモジナイザー（ポリトロン；キネマティカ社）にてホモジェナイズした。超遠心後、各沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に懸濁し、これをＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分とした。125Ｉ標識したプロキネティシン２（［125Ｉ］−ＰＫ２）は、実施例５で精製した５μｇのプロキネティシン２をＩｏｄａｉｎｅ−１２５（パーキンエルマー社）を用いて、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ法（ピアス社）に従って作製した。
前記ＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分各３０μｇに［125Ｉ］−ＰＫ２を最終濃度５００ ｐＭになるようにそれぞれ加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＢＳＡからなる溶液５０μｌ中で室温１時間インキュベーションし、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測定した。さらに、前述の試験に最終濃度０．５μＭの非標識プロキネティシン１もしくは２（すなわち実施例５で精製したプロキネティシン）を加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。その結果、［125Ｉ］−ＰＫ２はＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞の膜画分に特異的に結合することが分かった。一方、空ベクターを遺伝子導入したＣＨＯ細胞の膜画分では、特異的結合は観察されなかった。
以上のように、本発明のＧＰＲｇ２受容体は、プロキネティシン２に結合親和性を持つ受容体であることが確認された。本ＧＰＲｇ２受容体を発現する細胞を用いて被験薬存在下で結合実験を行うことで、ＧＰＲｇ２受容体に対して親和性を有する物質のスクリーニングが可能となった。こうした物質は、プロキネティシン１又は２の活性を増強する活性を有する物質、もしくはＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質、即ち性ホルモン障害治療薬である。
《実施例７：ＧＰＲｇ２遺伝子ノックアウトマウスの作製》
【００４０】
（１）ターゲッティングベクターの作製
マウスＧＰＲｇ２遺伝子の蛋白質コード領域のうち、開始コドンを含むエキソンと隣接するイントロンのゲノム配列（３’ショートアーム（ｓｈｏｒｔ ａｒｍ））、ＰＧＫ−１プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスＧＰＲｇ２遺伝子の５’側のゲノム配列（５’ロングアーム（ｌｏｎｇ ａｒｍ））、及びＰＧＫ−１プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。
約６．６ｋｂｐの５’ｌｏｎｇ ａｒｍ断片（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列・ｒｅｆ｜ＮＴ＿０３９２０７．３｜Ｍｍ２＿３９２４７＿３３の７３０７９２１９〜７３０７２６６８に該当）と、約２．０ｋｂｐの３’ｓｈｏｒｔ ａｒｍ断片（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列・ｒｅｆ｜ＮＴ＿０３９２０７．３｜Ｍｍ２＿３９２４７＿３３の７３０７０８５１〜７３０６８８５５に該当）は、以下のようなＰＣＲ反応で取得した。２種のプライマーセットとして、配列番号１１（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧ、５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号１２（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＴＧＴＣＣ、５’側にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセット、及び配列番号１３（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴＣ、５’側にＸｈｏＩとＸｂａＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号１４（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧ、５’側にＸｈｏＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセットを使用した。ＰＣＲ反応では、変性（９４℃にて３０秒間）、アニール（５５℃にて３０秒間）、及び伸長（７２℃にて６分間）からなるサイクルを３５サイクル実施した。得られたＤＮＡ産物は、それぞれ、プラスミドｐＰＮＴ（Ｃｅｌｌ、１９９１年、６５巻、ｐ．１１５３−１１６３）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイト、及びＸｈｏＩサイトへ挿入して、ターゲッティングベクターを完成させた。この際、マウスＧＰＲｇ２遺伝子の５’上流側がｐＰＮＴベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入されるようデザインし、ベクター上ではネオマイシン遺伝子の転写方向と逆向きになるよう、ＧＰＲｇ２遺伝子由来のアーム断片を設置した（図１）。
【００４１】
（２）相同組み換えＥＳ細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、エレクトロポレーションによりＥＳ（ＴＴ２）細胞（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３年、２１４巻、ｐ．７０−７６）に導入し、Ｇ４１８による選別を行った。形成されたコロニーのピックアップを行い、それぞれのクローンについてゲノムＤＮＡを抽出し、相同組み換えが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ターゲッティングベクターの３’ｓｈｏｒｔ ａｒｍ下流のゲノム配列、配列番号１５（CGAAAATACTGCACAGGAAGCCACGAGGACTCTGAAAACCAGAGAAAACCCTCAGACAAACAAACAAAGAGGCAGGTATCGTCATGCTAGAGTGCACACACATATGCTGATGCAGCAAAAGAGGAGTGGGGGAGTGTGTACCAAAGTGGTGAGAGCAGAGGGGAATGGGAGAGCATGTGCTGAAATGTAAAGGCAGAGGCCTATAGGGGAGAATATACTCAAGGATAAGAGAAAGGAGGCTGGAGGAGGTATGGCAGCATCTGCCACGACTGCCACAGGTTTGTGGCTATGCTGTCCCCAGGCTATGAAACGTAGAAATACAAGCTGTAGAAGATGTAATTTTTGAACTCAAAAGCTTTTTTTTTTCATGTAAAAACTAGGAATTATCAAACATTGGGAATAATAAACATATGGTGACTTGTAAATGCTAGTTTTTCAACマウス）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、制限酵素ＸｂａＩで切断したＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型クローンの３．９ ｋｂｐに対して相同組換えが起きているクローンでは２．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出することができた。
【００４２】
（３）ＧＰＲｇ２遺伝子ホモノックアウトマウスの取得
続いて、アグリゲーション法（Ｎａｇｙ Ａ．， １９９３， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ１４７−１７９）にて相同組換された（ＧＰＲｇ２遺伝子が破壊された）ＥＳ細胞クローンとＩＣＲ系８細胞期胚を凝集させ、翌日桑実胚〜胚盤胞に発生したキメラ胚を偽妊娠誘起したＩＣＲ系雌マウス（偽妊娠誘起から３日目）の子宮へ移植した（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５）。移植後、１７．５日に帝王切開を行い、キメラマウスを得た。キメラマウスは４週まで、里親に保育させた（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５）。キメラ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス２匹を自然交配させ、ＧＰＲｇ２の開始コドンを含むエキソンを欠失した変異アレルを持つＧＰＲｇ２遺伝子のＦ１ヘテロノックアウトマウスを得た。
このＦ１へテロノックアウト雄マウスと、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与により過排卵処置を施したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスとの体外受精（ＩＶＦ）により得られた受精卵を、精管結搾雄マウスとの交配により偽妊娠誘起処置を施したＩＣＲ系雌マウス（レシピエント）に移植することにより、Ｆ２へテロノックアウトマウスを大量に作出した。そこで得られたＦ２ヘテロノックアウトマウスを用いてＩＶＦを行い、受精卵を作製後、それらの胚をレシピエントに移植することにより得た産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、前述の配列番号１５を用いたサザンブロット解析により、変異アレルの２．７ｋｂｐのバンドのみが出現するＦ３ホモノックアウトマウスを同定した。この際、野生型では、３．９ｋｂｐのバンドのみが出現し、ヘテロノックアウトマウスでは、３．９ｋｂｐと２．７ｋｂｐのバンドが両方出現した。
《実施例８：ホモノックアウトマウスでのＧＰＲｇ２遺伝子発現消失の確認》
【００４３】
得られたＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス、ヘテロノックアウトマウス、野生型マウスの脳を、各２匹ずつ計６匹採取し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出後、逆転写酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡ化し、ＰＲＩＳＭ ７７００ シーケンスディテクションシステム（アプライドバイオシステムズ）によりＧＰＲｇ２遺伝子の転写発現量を測定した。具体的には、リアルタイムＰＣＲ試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、目的遺伝子であるＧＰＲｇ２が配列番号１６及び配列番号１７（５’−ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧ−３’）、内部標準遺伝子としてＧ３ＰＤＨが配列番号１８及び配列番号１９（５’−ＡＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴ−３’と５’−ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴ−３’）の各特異的プライマーで増幅されるｃＤＮＡ量を定量測定した。ＰＣＲ反応では、変性（９５℃にて１５秒間）、アニール及び伸長（５９℃にて１分間）からなるサイクルを４５サイクル実施した。ＧＰＲｇ２の測定結果は、Ｇ３ＰＤＨの測定結果で補正してグラフ作成した。その結果、ヘテロノックアウトマウスと野生型マウスの脳ではＧＰＲｇ２のｍＲＮＡが検出されたが、ホモノックアウトマウスでは検出されない事を確認した。
《実施例９：ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスの表現型解析》
【００４４】
Ｆ２ヘテロノックアウトマウス同士の交配により得られたＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス（雄５匹、雌６匹）と野生型マウス（雄６匹、雌６匹）の各個体について２０週齢の時点で、生殖器を観察した。その結果、ホモノックアウトマウスでは、精巣と卵巣が野生型マウスに比べ、有意に萎縮していることが判明した。具体的には雄では、左右の精巣重量が野生型では平均１１３．１±７．６ｍｇと１１４．９±１１．８ｍｇ、ホモノックアウトマウスでは平均２．７±０．４ｍｇと２．８±０．５ｍｇであり、精巣が顕著に萎縮していることがわかった。その他、前立腺、ペニス、精嚢、包皮腺、精巣上体等の雄の泌尿生殖組織も萎縮していた。また雌では、左右の卵巣重量が野生型では平均３．０±０．６ｍｇと３．４±０．７ｍｇであったのに比べ、ホモノックアウトマウスでは左右共に測定限界値（０．１ｍｇ）以下の重量であり、卵巣が顕著に萎縮していることがわかった。
《実施例１０：ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスの血中テストステロン濃度測定》
【００４５】
２０週齢のＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス（雄５匹、雌６匹）と野生型マウス（雄６匹、雌６匹）の各個体より血漿サンプルを調製し、テストステロン測定キットであるＤＰＣ・トータルテストステロンキット（三菱化学ヤトロン）を用いて血中のテストステロン濃度を測定した。その結果、野生型マウスでは、５４．１±１９．８ｎｇ／ｄＬであったのに対して、ホモノックアウトマウスでは１６．１±１３．０ｎｇ／ｄＬであった。
精巣小葉に存在する精細管は、周囲を規定膜で囲まれており、その外側結合組織中にライディッヒ細胞と呼ばれるテストステロンを産生する間質細胞が存在する（カラー人体解剖学 構造と機能：ミクロからマクロへ ＦＨマティーニ、ＭＪティモンズ、ＭＰマッキンリ 西村書店）。精巣切除去勢動物モデルでは、ライディッヒ細胞消失により血中テストステロン濃度が減少する事が知られており（癌と化学療法 １９９３年、２０巻、ｐ２３００−２３０５）、今回の雄ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスでは、生殖器の顕著な萎縮が観察され、去勢動物モデルと同様に、血中テストステロン量が減少していることが確かめられた。また同様に、卵巣はエストロゲンの主合成組織であることから（イラスト内分泌内科、ｐ．８０−８１ 文光堂）、雌のＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスでは、血中エストロゲン量が減少していることも明らかである。テストステロンやエストロゲンは、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症等の性ホルモン異常に起因する疾患の病態発生・進行に重要な役割を担っていることは良く知られていることから、我々は、ＧＰＲｇ２を介した細胞内情報伝達機構の阻害又は活性化により、これらの性ホルモン異常に起因する疾患の治療が可能になることを初めて見出した。即ち、ＧＰＲｇ２アンタゴニスト及び／又はアゴニストが性ホルモン異常に起因する疾患の治療薬等になることを見出した。（より具体的には、ＧＰＲｇ２アンタゴニストのスクリーニングにより前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌の治療薬、並びにＧＰＲｇ２アゴニストのスクリーニングにより低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症の治療薬がスクリーニングできることを可能とした。）
《実施例１１：ＧＰＲｇ２活性を阻害する物質のスクリーニング》
【００４６】
実施例３と同様の方法で、ＧＰＲｇ２活性変化を指標とするスクリーニング系を用いて試験物質のスクリーニングを行った。
ＧＰＲｇ２を発現するＣＨＯ細胞（実施例２）を実施例３と同様にプレーティングし、そこに、プロキネティシンを含むＣＨＯ含有培地（実施例１）と、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭ又は０．００３μＭとなるように添加又は等量のジメチルスルホキシドのみを添加し、その後細胞内Ｃａ2+濃度を測定した。試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実施例３に従った。ＧＰＲｇ２を発現させた細胞においてＧＰＲｇ２活性を阻害する物質（ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質）をアンタゴニストとして選択したところ、ＩＣ５０値が４．８６μＭを示す化合物2-[{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}(2-メトキシエチル)アミノ]-N-(3,4-ジメトキシベンジル)-N-[2-(1H-インドール-3-イル)エチル]アセトアミド（2-[{[(4-Chlorophenyl)amino]carbonyl}(2-methoxyethyl)amino]-N-(3,4-dimethoxybenzyl)-N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]acetamide）を取得することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３〜１４及び１５〜１９の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ターゲティングベクターの構造を模式的に示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロキネティシン受容体ＧＰＲｇ２を使用した性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
性腺は男女を問わず、上位の刺激ホルモンにより機能が維持されている（非特許文献１）。視床下部から放出される性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）が、下垂体門脈系を介して、下垂体前葉より卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）と黄体化ホルモン（ＬＨ）の分泌を促進し、これらＦＳＨとＬＨにより、性ホルモンの合成・分泌、精子形成、卵胞発育、黄体維持が惹起される。
男性性腺である精巣の機能低下疾患としては、視床下部及び／又は下垂体系の障害によりＬＨ及び／又はＦＳＨ分泌が低下する低ゴナドトロピン性性腺機能低下症と、精巣原発性の異常からネガティブフィードバック機構を介してＬＨ及び／又はＦＳＨ分泌が増加する高ゴナドトロピン性性腺機能低下症がある（非特許文献２）。女性性腺である卵巣の機能低下症としては無排卵症があり、その原因によって視床下部障害、下垂体障害、卵巣性障害に分類される（非特許文献３）。
一般的に性ホルモンは、男性ホルモン（アンドロゲン）として、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロスタンジオン等に、女性ホルモンとして、エストロゲン、プロゲステロン等に分類される（非特許文献４）。アンドロゲンやエストロゲンが関与する性ホルモン異常に起因する疾患としては、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症等が挙げられる（特許文献１、非特許文献５）。
前立腺癌や前立腺肥大において、テストステロン等のアンドロゲンが、病態の発生・進行に重要な役割を担っていることは良く知られている（非特許文献６、非特許文献７）。血清中のアンドロゲン量を低下させることが前立腺癌や前立腺肥大等の種々の症例に有用であることは十分に確立されており、臨床的実施においては、睾丸摘出、ＬＨ−ＲＨアゴニスト又はアンドロゲンアンタゴニストが用いられている（特許文献１）。しかし睾丸摘出は心理的に受け入れ難いものであり、また、ＬＨ−ＲＨアゴニストによる治療の場合にはアゴニスト作用による一過性のフレアー現象が認められる。加えて、アンドロゲンアンタゴニストによる治療の場合には、アンドロゲンレセプターの変異により効果が衰弱することが近年知られている（特許文献１）。
一方、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌の治療としては、血清中のエストロゲン量を低下させることが有効であることは十分に確立されており（非特許文献５）、エストロゲンの分泌を阻害するＬＨ−ＲＨアゴニスト等によるホルモン療法が用いられる。しかし、エストロゲンレベルの低下に伴うホット・フラッシュ、発汗などの卵巣欠落症状と低エストロゲン状態が持続することによる骨塩量減少の副作用が認められる（非特許文献８）。また一方、更年期障害、オステオポローシスや卵巣機能低下に伴う高脂血症では、女性ホルモンであるエストロゲンの減少が大きく関与している。そのため、血中エストロゲン量を増加させることを目的として、エストロゲン製剤やプロゲステロン製剤が治療に用いられている（非特許文献９）。
Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）であるＧＰＲｇ２の遺伝子は、ヒトでは、２０番染色体に局在している。ヒトでの組織発現分布を解析すると、ＧＰＲｇ２は中枢神経系で比較的発現が高く、特に胎児脳では成人脳よりも高い発現が観察される。その他、骨格筋、骨髄、精巣でも量は低いが発現が観察される（非特許文献１０）。ＧＰＲｇ２のリガンドはプロキネティシン （Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ， ＰＫ）であることが、幾つかのグループにより報告されており（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）、リガンドであるＰＫと結合することにより、細胞内Ｃａ2+量の増大を引き起こす。ＧＰＲｇ２は、その組織発現分布様式から、概日リズムの調節を担っていること（非特許文献１３）、小腸の収縮や血管形成に関与すること（非特許文献１１）が示唆されている。
ＰＫは、ヒトでプロキネティシン１（ＰＫ１）とプロキネティシン２（ＰＫ２）の２種類のサブタイプが存在する生理活性ペプチドである（非特許文献１４）。ＰＫ１はエンドクリングランドバスキュラーエンドセリアルグロースファクター（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｇｌａｎｄ − ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ＥＧ−ＶＥＧＦ）、ＰＫ２は、Ｂｖ８という別称もあり（非特許文献１５、非特許文献１６）、マンバ（南アフリカ産のコブラ科の大型毒ヘビ）や、カエルにも該当分子が存在することが知られている（非特許文献１７、非特許文献１８）。
ＰＫの生理機能に関しては、神経細胞死抑制活性（非特許文献１９）、痛覚過敏惹起活性（非特許文献１８）、消化器収縮作用（非特許文献２１、非特許文献２２）、精子形成作用（非特許文献２３）、概日リズムの調節（非特許文献１３）、内分泌腺特異的内皮細胞増殖（非特許文献１５）や、精巣での血管新生活性（非特許文献１６）、及び摂食・摂水行動への機能（非特許文献２４）等が報告されている。
【０００３】
【非特許文献１】イラスト内分泌内科、ｐ．８０−８１ 文光堂
【非特許文献２】内分泌・代謝病学、ｐ．２７７ 医学書院
【非特許文献３】内分泌・代謝病学、ｐ．２９３ 医学書院
【非特許文献４】血中ホルモン、測定法・意義・臨床 医学書院
【非特許文献５】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊
【非特許文献６】日本臨床、２００２年、６０巻、ｐ．２３−２７
【非特許文献７】臨床と研究、２０００年、７７巻、ｐ．４４８
【非特許文献８】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊、ｐ．１５０−１９８
【非特許文献９】産科と婦人科、２００１年、６８巻増刊、ｐ．２００−２１９
【非特許文献１０】「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ」ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ （オランダ） ２００２年、１５７９巻、ｐ．１７３−１７９
【非特許文献１１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国） ２００２年、２７７巻、ｐ．１９２７６−１９２８０
【非特許文献１２】「バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ」ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ ＥＴ ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ ＡＣＴＡ （オランダ） ２００２年、２９３巻、ｐ．３９６−４０２
【非特許文献１３】「ネイチャー」Ｎａｔｕｒｅ （英国） ２００２ ４１７：４０５−１０
【非特許文献１４】「モレキュラー・ファーマコロジー」ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （米国） ２００１年、第５９巻、ｐ．６９２−６９８
【非特許文献１５】「ネイチャー」Ｎａｔｕｒｅ （英国） ２００１年、４１２巻、ｐ．８７７−８８４
【非特許文献１６】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ ＯＦ ＴＨＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ （米国） ２００３年、１００巻、ｐ．２６８５−２６９０
【非特許文献１７】「トキシコン」Ｔｏｘｉｃｏｎ （英国） １９９０年、２８巻、ｐ．８４７−８５６
【非特許文献１８】「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （オランダ） １９９９年、３７４巻、ｐ．１８９−１９６
【非特許文献１９】ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ （英国） ２００１ １３：１６９４−７０２
【非特許文献２０】「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （英国） ２００２ １３７：１１４７−５４
【非特許文献２１】「モレキュラー・ファーマコロジー」ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （米国） ２００１ ５９：６９２−８
【非特許文献２２】「フェブス・レターズ」ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ （オランダ） １９９９ ４６１：１８３−８
【非特許文献２３】「フェブス・レターズ」ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ （オランダ） １９９９ ４６２：１７７−８１
【非特許文献２４】「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー」ＢＲＩＴＩＳＨ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ （英国） ２００４ １４２：１８１−１９１
【特許文献１】国際公開第００／１７１６３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規かつ簡便な性ホルモン障害治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意検討した結果、ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスの解析から、ＧＰＲｇ２（配列番号２記載のポリペプチド）のアゴニスト及び／又はアンタゴニストは性ホルモン障害治療薬となることを明らかにした。すなわち、本発明者らは、ＧＰＲｇ２遺伝子のノックアウトマウスを作製して表現型を解析し、同ノックアウトマウスでは、男性ホルモン障害（特には前立腺癌及び前立腺肥大症）の増悪因子であるテストステロンを分泌する組織である精巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮しており、血中テストステロン量が減少していることを見出した。更に、同ノックアウトマウスでは、女性ホルモン障害の原因となるエストロゲンを分泌する組織である卵巣が、野生型マウスに比べ顕著に萎縮していることを見出した。これらの知見により、ＧＰＲｇ２ポリペプチド及び該ポリペプチドを発現している細胞を性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして提供した。更に、ＧＰＲｇ２ポリペプチドを使用する性ホルモン障害治療薬スクリーニング系を構築し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］ ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド、あるいはｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド
を発現している細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法、
［２］ 性ホルモン障害が男性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法、
［３］ 性ホルモン障害が女性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法、
［４］ （１）請求項１に記載の細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）請求項１に記載のポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法、
［５］ 性ホルモンがテストステロンである請求項４に記載の検出する方法、
［６］ 性ホルモンがエストロゲンである請求項４に記載の検出する方法、
［７］ 請求項１に記載のポリペプチドである、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール、
［８］ 請求項１に記載の細胞である、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール、
［９］（１）請求項１に記載のポリペプチド、又は（２）請求項１に記載の細胞の性ホルモン障害治療薬スクリーニングのための使用
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
ＧＰＲｇ２は性ホルモン障害に関与する分子であり、本明細書のポリペプチド及び細胞は、性ホルモン障害治療薬の同定及びスクリーニングに用いることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
［１］性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール及びスクリーニングのための使用
本明細書において、「性ホルモン障害」とは男性ホルモン障害及び女性ホルモン障害をいう。「男性ホルモン障害」とは、男性ホルモンの異常により引き起こされる疾患(例えば、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症)を、「女性ホルモン障害」とは、女性ホルモンの異常により引き起こされる疾患（例えば、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌）をいう。本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物（具体的には、スクリーニングの為に用いるポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）をいう。「性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール」とは、性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬をスクリーニングするために、本発明の性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬をスクリーニングする方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞又はポリペプチドである。（１）〜（３）に記載のポリペプチド又は細胞の、性ホルモン障害（男性ホルモン障害及び／又は女性ホルモン障害）治療薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
本発明の性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールには、ポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールと細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとが含まれる。また、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとしては、テストステロン抑制剤スクリーニングツール、テストステロン亢進剤スクリーニングツール、エストロゲン抑制剤スクリーニングツール及びエストロゲン亢進剤スクリーニングツールが含まれる。
【０００９】
１）ポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン（好ましくはプロキネティシン２）存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。以下、本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることができるこれらの各種ポリペプチドを総称して、スクリーニング用ポリペプチドと称する。
【００１０】
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなることができる。なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｎｇｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）検索により得られた値を意味する。ＢＬＡＳＴ検索は、ＢＬＡＳＴパッケージ［ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）より入手］のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用いて行うことができる。なお、パラメーターでは、ペアワイズアラインメントパラメーターとして、「プログラム名」として「ｂｌａｓｔｐ」を、「Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値」を「０」で、「Ｍａｔｒｉｘ」として「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用する。
以上、スクリーニング用ポリペプチドについて説明したが、該ポリペプチドとしては、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」、あるいは、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかも、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド」が好ましく、「配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」がより好ましい。スクリーニング用ポリペプチドは前記ポリペプチドである限り特に限定されるものではなく、その起源もヒトに限定されない。
【００１１】
例えば、機能的等価改変体であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、又はイヌ）由来の変異体が含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の変異体）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列を、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなども含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の対応するポリペプチドにみられる差異を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能的等価改変体（ヒトにおける変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来の変異体も含む）は、当業者であれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列表の配列番号１で表される塩基配列）の情報を基にして取得することができる。なお、遺伝子組換え技術については、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することが可能である。
【００１２】
本発明のポリペプチド型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。より具体的には、後述するスクリーニングツール用細胞の一つであるスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞を、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養し、受容体タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、その培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、機能的改変体をコードするポリヌクレオチド、及び相同ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１３】
スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（Ａ）ＰＣＲを用いた方法、（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（Ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
【００１４】
（Ａ）ＰＣＲを用いた方法
本明細書のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織からｍＲＮＡを抽出する。次いでこのｍＲＮＡを鋳型として該受容体ｍＲＮＡ又は一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、該本明細書のポリペプチドｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。さらに、得られたヒトの本明細書のポリペプチドｃＤＮＡ又はその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、該受容体の蛋白質を製造することができる。
まず、本明細書のポリペプチドの産生能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脳から該蛋白質をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該蛋白質の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定することができる。
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。また、ｃＤＮＡは合成せずとも、実施例１、実施例２で用いているように、市販されているｃＤＮＡを用いても良い。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９１；以下、ＰＣＲという）に供し、目的とする本明細書のポリペプチドのＤＮＡを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００１５】
（Ｂ）常法の遺伝子工学的手法
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げることができる。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテント細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
【００１６】
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法、（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法、（３）他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（32Ｐ又は33Ｐで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
ＰＣＲにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、本発明のポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡ断片を、例えば、32Ｐ又は33Ｐで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
【００１７】
他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、形質転換株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞表面に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いることもできる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、元の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
【００１８】
（Ｃ）化学合成法
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ １０００Ｍ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
また、本明細書のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６６６，１９８４）等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
【００１９】
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、下記の方法によって得ることができる。単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることができる。
前記形質転換細胞を培養することにより、前記細胞の細胞表面に生産されるスクリーニングツール用ポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。該方法としては、具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。なお、膜分画は常法に従って得ることができる。例えば本発明のプロキネティシン受容体を表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより得られる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（ＣＨＡＰＳ、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ジキトニン等）でプロキネティシン受容体を可溶化することにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドはマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、スクリーニングツール用ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｈｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｔａｇ、ｍｙｃ ｅｐｉｔｏｐｅなどがある。また、マーカー配列と本明細書のポリペプチドの間にエンテロキナーゼ、ファクターＸａ、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とＨｅｘａ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｍ．Ｋ． ａｎｄ Ｈａｇａ， Ｔ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０， １２３２−１２３８）
【００２０】
２）細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール
本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）としては、例えば、
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している細胞；
（２）機能的等価改変体を発現している細胞；及び
（３）相同ポリペプチドを発現している細胞を挙げることができる。上記ポリペプチドを発現している細胞としては、ｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞、及びｉｉ）天然に前記ポリペプチドを発現している細胞の両方が含まれる。本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとしては、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞が好ましい。
スクリーニングツール用細胞は、例えば、先に述べた方法により単離されたスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくはＣＨＯ細胞又は２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
【００２１】
前記発現ベクターは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。また、本発明の細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用細胞は、前記発現ベクターで形質転換され、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、細胞型性ホルモン障害治療薬スクリーニングツールとして用いる際に前記ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。スクリーニングツール用細胞は、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００２２】
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． （１９８１） Ｃｅｌｌ， ２３， １７５−１８２）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ．（１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７， ４２１６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ＶｉｒｕｓのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ （Ｓｕｂｒａｍａｎｉ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １， ８５４−８６４）、ヒトのｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒプロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ （Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５３２２）、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を例示できるが、これに限定されない。
【００２３】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 ｐＭＥ１８Ｓ、 （Ｍａｒｕｙａｍａ， Ｋ． ａｎｄ Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ． （１９９０） Ｍｅｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０， ２７−３２）、ｐＥＦ−ＢＯＳ （Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ． ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８， ５３２２）、 ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ， ３２９， ８４０−８４２） 等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ， Ｇ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １１， １２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ． Ｌ． ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ， Ａ． Ｊ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２， ４５６−４５７）、 ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いた方法、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．（１９８２） ＥＭＢＯ Ｊ．， １， ８４１−８４５）等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９８９）： “ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ）やｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ． （１９８２） Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １， ３２７−３４１）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによりスクリーニング用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内又は細胞表面に本発明のスクリーニング用ポリペプチドが生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればＲＰＭＩ−１６４０培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
【００２４】
［２］性ホルモン障害治療薬スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法には、
スクリーニングツール用細胞と試験化合物とを接触させる工程、およびスクリーニングツール用ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法
が含まれる。更には、
性ホルモン障害が男性ホルモン障害である上記記載のスクリーニングする方法、性ホルモン障害が女性ホルモン障害である上記記載のスクリーニングする方法が包含される。
男性ホルモン障害としては、男性ホルモン（特にはテストステロン）が増悪因子となる疾患(特には、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏)及び男性ホルモン（特にはテストステロン）の減少が原因となる疾患（特には低ゴナドトロピン性性腺機能低下症）が挙げられる。女性ホルモン障害としては、女性ホルモン（特にはエストロゲン）の減少が原因となる疾患（特には、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症）、及び女性ホルモン（特にはエストロゲン）が増悪因子となる疾患（特には、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌）が挙げられる。
従って、本発明には、性ホルモン障害が前立腺肥大及び／又は前立腺癌である上記記載のスクリーニングする方法も包含される。
【００２５】
スクリーニングツール用ポリペプチド又はスクリーニングツール用細胞を用いると、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を修飾可能な物質（化合物、ペプチド及び抗体）を検出及びスクリーニングすることができる。本明細書の「スクリーニング」とは、多数の試験化合物の中から目的の活性を有する化合物を篩い分けること、及び、ある試験化合物について、その化合物が目的の性質を有する化合物であるか否かを検出すること（即ち篩い分けること）の両方を含む。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニング用ポリペプチドの活性の変化は、スクリーニングに用いる受容体蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測定することにより分析することができる。指標とする活性とは、たとえばリガンドとの結合活性であり、あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答である。具体的には、以下ａ）〜ｃ）に述べるような検出方法を示すことができる。スクリーニング用ポリペプチドとしては、該ポリペプチドを発現させた細胞、該細胞の膜分画、又は該ポリペプチドからなる蛋白質の精製標品などを用いることもできる。また本発明によるスクリーニング方法のための試験化合物としては、市販の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５１， ８１３５−８１３７）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．， ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２２２， ３０１−３１０）などを応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング方法により選択された化合物又はペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はペプチドを用いうるが、それらに限らない。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニング用ポリペプチドの活性変化を分析する工程は、スクリーニング用ポリペプチドの生理学的な特性に応じた活性の指標を測定（例えば、リガンドとの結合活性を測定、あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答を測定（例えばＧＴＰγＳ結合の測定又は細胞内Ｃａ2+濃度の変動の測定））し、分析することにより実施できる。
ａ）リガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリペプチドに結合する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はリガンド結合アッセイ法によりスクリーニングする事ができる。該スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を調製する。緩衝液、イオン、ｐＨのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で同スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜、あるいは該スクリーニング用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を、標識リガンド、例えば125Ｉ標識プロキネティシン（好ましくは125Ｉ標識プロキネティシン２）を試験化合物と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性をγカウンター等で測定する。以上の工程（以下、リガンド結合アッセイ工程）により得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質は、男性ホルモン（特にはテストステロン）の減少が原因となる疾患（特には低ゴナドトロピン性性腺機能低下症）、及び、女性ホルモン（特にはエストロゲン）の減少が原因となる疾患（特には、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症）の治療や予防に有用である。また、本発明のスクリーニング方法によって選択される、該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質は、男性ホルモン（特にはテストステロン）が増悪因子となる疾患(特には、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏)、及び女性ホルモン（特にはエストロゲン）が増悪因子となる疾患（特には、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌）の治療や予防に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、ＷＯ０１／１９９８６に記載のリガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法により実施できる。ただし、リガンドはＬＴＣ4をプロキネティシンに、受容体はＬＴＣ4受容体をスクリーニング用ポリペプチドに置き換える。より具体的には実施例６に記載の方法により実施できる。
【００２８】
ｂ）ＧＴＰγＳ結合法を利用したスクリーニング方法
スクリーニング用ポリペプチドの活性を修飾する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）はＧＴＰγＳ結合法によりスクリーニングすることが可能である（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ． ａｎｄ Ｂｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ． （１９９３） Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １０９， １１２０−１１２７）。スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．４）， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５０ｍＭ ＧＤＰ溶液中で、35Ｓで標識されたＧＴＰγＳ ４００ｐＭと混合する。試験化合物存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。以上の工程を、以下、ＧＴＰγＳ結合法アッセイ工程という。試験化合物存在下における、特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験化合物存在下における、リガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるＧＴＰγＳ結合上昇の抑制を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００２９】
ｃ）細胞内Ｃａ2+濃度の変動を利用したスクリーニング方法
スクリーニング用ポリペプチドの活性を抑制する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）は、スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の細胞内Ｃａ2+濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。細胞内Ｃａ2+濃度の変動を測定する工程を、細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程という。細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程は、ｆｕｒａ２やｆｌｕｏ３等を用いて測定することにより実施できる。
あるいは、Ｃａ2+濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出することにより、間接的にＣａ2+濃度を測定することにより実施可能である。具体的には以下の方法で、Ｃａ2+濃度を測定することができる。まず、セラムレスポンシブエレメントをつないだレポーター遺伝子をスクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞に導入し、試験化合物及びリガンド（好ましくは最終濃度５−５００ｎＭのプロキネティシン（特に好ましくはプロキネティシン２））を該細胞の培養液中に加える。レポーター遺伝子には、検出可能なシグナルを生成することができる任意の遺伝子を用いることができ、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。３７℃で４時間インキュベート後、培地を除去し、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定する。そして試験薬添加時のルシフェラーゼ活性誘導を指標に、スクリーニング用ポリペプチドのアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験薬添加時のリガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるルシフェラーゼ活性誘導の阻害を指標に、スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法においては、該蛋白質を発現させた細胞と発現させていない宿主細胞（コントロール細胞）に試験薬（化合物、ペプチド、及び抗体）及びリガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）を一定時間作用させ、Ｃａ2+濃度を直接あるいは間接的に測定する。コントロール細胞と比較して、該蛋白質を発現させた細胞特異的なＣａ2+濃度の上昇又は低下を指標にアゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。また、試験化合物存在下における、リガンド（好ましくはプロキネティシン、更に好ましくはプロキネティシン２）によるＣａ2+濃度の上昇又は低下の阻害作用を指標に該スクリーニング用ポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合物、ペプチド、及び抗体）をスクリーニングすることができる。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法は、実施例５記載の条件で行うことが好ましい。
例えば実施例５に記載のアッセイ条件で、ＥＣ５０が１００μＭ以下の物質を、好ましくはＥＣ５０が１０μＭ以下の物質を、更に好ましくはＥＣ５０が１μＭ以下の物質をアゴニスト活性を有する物質として選択することができる。また、たとえば実施例５に記載のアッセイ条件に試験化合物を追加することにより、即ち、実施例５の条件でＩＣ５０が１０μＭ以下の物質を、好ましくはＩＣ５０が１μＭ以下の物質を、更に好ましくはＩＣ５０が０．１μＭ以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
【００３２】
［３］本発明の検出方法
本発明には、
（１）スクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）スクリーニングツール用ポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物がスクリーニングツール用ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法
が含まれる。また、本発明には、性ホルモンがテストステロンである上記検出方法及び性ホルモンがエストロゲンである上記検出方法が含まれる。
前記（１）及び（２）の工程は、例えば、前述の［２］性ホルモン障害治療薬スクリーニング方法のリガンド結合アッセイ工程、ＧＴＰγＳ結合法アッセイ工程又は細胞内Ｃａ2+濃度の変動測定工程に記載の通りに実施することができる。試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程は、定法に従って行うことができる。例えば、試験化合物によるテストステロン量の変動を分析する工程は、常法に従い、試験化合物又は陰性コントロール（例えば生理食塩水など）を試験動物（例えばマウス、ラットなど）に投与し、試験動物の血中テストステロン濃度を測定し分析することにより実施できる。血中テストステロン濃度は、トータルテストステロンキット（ヤトロン社）やＤＥＬＦＩＡテストステロン測定キット（パーキンエルマー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。好ましくは、実施例１０に記載の方法により実施できる。試験化合物によるエストロゲン量の変動を分析する工程は、常法に従い、試験化合物又は陰性コントロール（例えば生理食塩水など）を試験動物（例えばマウス、ラットなど）に投与し、試験動物の血中エストロゲン濃度を測定し分析することにより実施できる。血中エストロゲン濃度は、ＤＥＬＦＩＡエストラジオール測定キット（パーキンエルマー社）などの市販のキットを用いて測定することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドのアンタゴニストとしては、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を阻害するものが好ましく、更には、テストステロン及び／又はエストロゲン量を低下させる物質が好ましい。スクリーニングツール用ポリペプチドのアゴニストとしては、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を亢進するものが好ましく、更には、エストロゲン量を増加させる物質が好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りのない限り、公知の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ら， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ， １９８９、相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５等の遺伝子操作実験マニュアルに従って実施した。
（実施例１） 動物細胞でのプロキネティシン発現系の構築
【００３４】
ヒトプロキネティシン１、２をコードする遺伝子の増幅には、プロキネティシン１はヒト小腸、プロキネティシン２はヒト精巣由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに用いた。プロキネティシン１が、フォワードプライマーとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。プロキネティシン２がフォワードプライマーとして、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号４、配列番号６で表される塩基配列にはＦＬＡＧ配列が含まれる。従って、プロキネティシンは、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧ エピトープをインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシンの精製が簡便化できる。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列、ＮｏｔＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、プロキネティシン１、２共に約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をｐＣＲ２．１ ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）で解析し、既知プロキネティシン１、２配列 （ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． ＡＦ３３３０２４、ＡＦ３３３０２５）と合致したクローンをそれぞれ選択した。これらクローンをＸｂａＩ−ＮｏｔＩで消化し、動物細胞発現用ｐＣＥＰ４ ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン社）に挿入した。
構築されたプロキネティシン発現プラスミドは、６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社製）にＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１×１０5細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのプロキネティシン１又はプロキネティシン２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、ハイグロマイシンＢ含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をプロキネティシン発現細胞として用いた。プロキネティシン発現細胞は、１０ｃｍシャーレ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ；アサヒテクノグラス社）にコンフルエントになるまで培養後、培地を廃棄し、０．５％牛胎児血清入りＤＭＥＭ培地にて４日間培養して、プロキネティシン含有培地を回収した。
（実施例２） ＧＰＲｇ２の遺伝子クローニングとＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞の取得
【００３５】
ヒトＧＰＲｇ２をコードする遺伝子の増幅には、ヒト脾臓由来のｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型ｃＤＮＡに、フォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。なお、前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＸｂａＩ認識配列が付加してある。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９６°Ｃ（５秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／７０°Ｃ（１．５分）のサイクルを５回、９６°Ｃ（５秒）／６８°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＸｂａＩで消化した後、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９７ １３５４：１５９−７０）に挿入した。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号１に示す。
同配列は１１５５塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号：１）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（３８４アミノ酸）を配列番号２に示す。
構築されたＧＰＲｇ２発現プラスミドは、６ウェルプレートにＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞を１ウェルあたり１×１０5細胞で播種して２４時間培養後、１ウェルあたり１μｇのＧＰＲｇ２発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入７２時間後より、メトトレキセート含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、得られた薬剤耐性細胞をＧＰＲｇ２発現細胞として用いた。
（実施例３） ＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞のプロキネティシンによる細胞内Ｃａ2+濃度の変化
【００３６】
９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌ Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ ；ＢＥＣＴＯＮ ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社）にＧＰＲｇ２発現ＣＨＯ細胞もしくは、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒを組み込んだＣＨＯ細胞（空ベクター処理細胞）を１×１０4細胞でプレーティングして２４時間培養後、培地を廃棄し、４μＭ Ｆｌｕｏ−３，ＡＭ（モレキュラープローブ社）、０．００４％ ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄおよび１％ ＦＢＳと２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨｕｎｋ≡ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ；ギブコ社）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳで４回洗浄して、１ウェルあたり１００μｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ ＢＳＳを添加した。
細胞内Ｃａ2+濃度の変化は細胞内Ｃａ2+濃度測定装置（ＦＬＩＰＲ；モレキュラーデバイス社）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始１０秒後に、プロキネティシンを含むＨＥＫ２９３細胞培養上清を添加し、添加後、５０秒間は１秒毎に、さらに４分間は６秒毎に蛍光強度を測定した。得られた結果の蛍光値をＹ軸に、時間をＸ軸にプロットすると、ＧＰＲｇ２はプロキネティシンに反応して細胞内Ｃａ2+濃度の変化が観察されたが、プロキネティシンを発現させないＨＥＫ２９３細胞培養上清では観察されなかった。さらに、同反応は、空ベクターを処理したＣＨＯ細胞では見られなかった。
以上により、本明細書のポリペプチドで形質転換した細胞の細胞内Ｃａ2+濃度の変化を測定する事で本明細書のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、すなわち性ホルモン障害治療薬のスクリーニングが可能となった。
（実施例４） 動物細胞発現プロキネティシン１及び２の発現並びに精製
【００３７】
動物細胞で発現させたプロキネティシンの精製サンプルを用いて、放射性同位元素標識を行い、バインディングアッセイ等に用いることを考え、まず、以下の実験により精製プロキネティシンを得た。その際、プロキネティシン１は、精製時に用いたＦＬＡＧ配列を除去するために、インフレームでＦａｃｔｏｒＸａ配列を入れて、ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒｍと同じものを作製した。また、プロキネティシン２は、分子内に放射性同位元素標識に用いるＴｙｒ残基を有していないため、Ｃ末端のＦＬＡＧ配列を残して、同配列中のＴｙｒ残基に対して放射性同位元素標識することを考えた。具体的には以下の手順で精製プロキネティシンを取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン１を取得するために、フォワードプライマーとして配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして、配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。前記の各プライマーの５’末端には、それぞれ、ＳｐｅＩ認識配列が付加してある。なお、配列番号９で表される塩基配列には、インフルエンザＡウイルス・ヘマグルチニンのシグナルシーケンス配列、ＦＬＡＧ配列、そしてＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列が含まれる。従って、プロキネティシン１は、細胞外分泌後は、Ｎ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧ エピトープとＦａｃｔｏｒ Ｘａ認識配列をインフレームで融合して発現される。これにより、プロキネティシン１の精製が簡便化できる。ＰＣＲはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９４°Ｃ（２分）の後、９４°Ｃ（３０秒）／５５°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（１．５分）のサイクルを２０回繰り返した。その結果、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をＳｐｅＩで消化した後、ｐＣＥＰ４ ｐｌａｓｍｉｄに挿入した。得られたクローンの塩基配列は、ＡＢＩ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて解析した。構築されたプロキネティシン１発現プラスミドは、（実施例１）で用いた方法と同様に、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン１安定発現細胞株を取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン２の取得のためには、実施例１で作製した、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現されるプロキネティシン２をコードするｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ−ｄｈｆｒ ｐｌａｓｍｉｄに挿入して用いた。従って、プロキネティシン２は、細胞外分泌後は、Ｃ末端側にマーカー配列ＦＬＡＧエピトープをインフレームで融合して発現される。構築されたプロキネティシン２発現プラスミドは、実施例２で用いた方法と同様に、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ-細胞に遺伝子導入し、プロキネティシン２安定発現細胞株を取得した。
実施例１と同じ方法で回収したプロキネティシン１もしくは、プロキネティシン２を含有する培地を、それぞれＭ２−アガロースカラム（シグマ社）にかけ、０．５％ ＮａＣｌ含有ＰＢＳでカラムを洗浄後、プロキネティシン１は、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ（アマシャム社）含有ＰＢＳで一晩反応して、プロキネティシン２は、ＦＬＡＧ−ｐｅｐｔｉｄｅ含有ＰＢＳにて、それぞれＭ２−アガロースカラムより溶出した。目的プロキネティシンを含む溶出産物は、最終的にＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＦＰＬＣカラム（アマシャム社）でゲルろ過を行い精製を行った。精製産物をＳＤＳ電気泳動後、銀染色（第一化学社）を行ったところ、プロキネティシン２の方がプロキネティシン１よりわずかに高分子側に、共に約１０ ｋＤａの単一バンドとして確認された。プロキネティシン１と２の推定分子量は、それぞれ９６６６．８８Ｄａ、１００３９．３１Ｄａである事から、予測分子量に合致しており、プロキネティシン１及び２が精製されていることが確認できた。
（実施例５）ＧＰＲｇ２発現ＨＥＫ２９３細胞のプロキネティシンによるルシフェラーゼレポーターアッセイ系の構築
【００３８】
コラーゲンタイプＩをコーティングした２４ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＴｙｐｅＩ−Ｃｏａｔｅｄ ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；アサヒテクノグラス社）に、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）を１ウェル当たり７×１０4細胞となるように播種し、２４時間培養した後、実施例１で構築したＧＰＲｇ２動物細胞発現プラスミド、又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロールとしての空ベクター）（１ウェル当たり１００ｎｇ）と、プラスミドｐＳＲＥ−ｌｕｃ（ストラタジーン社）（１ウェル当たり２０ｎｇ）とを、遺伝子導入試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；ベーリンガーマンハイム社）を用いて、２者同時に遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間経過した後、培地を廃棄し、１０ｎＭの精製プロキネティシン１もしくは精製プロキネティシン２を添加して、５時間３７℃で反応させ、ルシフェラーゼアッセイシステム（和光純薬社）の方法に従い、細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、ＧＰＲｇ２を遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞では、空ベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３細胞に比べて、細胞内ルシフェラーゼ活性が特異的に上昇していた。
プロキネティシンの代わりに、又はプロキネティシンと同時に被験薬を添加してこの反応系を用いる事で、プロキネティシン１又は２と同様の活性を有するアゴニスト活性を有する物質、並びにＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質、即ち性ホルモン障害治療薬のスクリーニングが可能になった。
（実施例６） 125Ｉ標識プロキネティシン２を用いたＧＰＲｇ２受容体結合アッセイ系の構築
【００３９】
１５０ｍｍ培養シャーレにＣＨＯ細胞及びＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞をコンフルエントになるまでそれぞれ培養後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2にそれぞれ懸濁してホモジナイザー（ポリトロン；キネマティカ社）にてホモジェナイズした。超遠心後、各沈殿物を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に懸濁し、これをＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分とした。125Ｉ標識したプロキネティシン２（［125Ｉ］−ＰＫ２）は、実施例５で精製した５μｇのプロキネティシン２をＩｏｄａｉｎｅ−１２５（パーキンエルマー社）を用いて、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ法（ピアス社）に従って作製した。
前記ＣＨＯ膜画分、ＧＰＲｇ２膜画分各３０μｇに［125Ｉ］−ＰＫ２を最終濃度５００ ｐＭになるようにそれぞれ加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．１％ＢＳＡからなる溶液５０μｌ中で室温１時間インキュベーションし、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで膜画分への総結合量を測定した。さらに、前述の試験に最終濃度０．５μＭの非標識プロキネティシン１もしくは２（すなわち実施例５で精製したプロキネティシン）を加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。その結果、［125Ｉ］−ＰＫ２はＧＰＲｇ２を安定発現するＣＨＯ細胞の膜画分に特異的に結合することが分かった。一方、空ベクターを遺伝子導入したＣＨＯ細胞の膜画分では、特異的結合は観察されなかった。
以上のように、本発明のＧＰＲｇ２受容体は、プロキネティシン２に結合親和性を持つ受容体であることが確認された。本ＧＰＲｇ２受容体を発現する細胞を用いて被験薬存在下で結合実験を行うことで、ＧＰＲｇ２受容体に対して親和性を有する物質のスクリーニングが可能となった。こうした物質は、プロキネティシン１又は２の活性を増強する活性を有する物質、もしくはＧＰＲｇ２に対するプロキネティシン１又は２の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質、即ち性ホルモン障害治療薬である。
《実施例７：ＧＰＲｇ２遺伝子ノックアウトマウスの作製》
【００４０】
（１）ターゲッティングベクターの作製
マウスＧＰＲｇ２遺伝子の蛋白質コード領域のうち、開始コドンを含むエキソンと隣接するイントロンのゲノム配列（３’ショートアーム（ｓｈｏｒｔ ａｒｍ））、ＰＧＫ−１プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスＧＰＲｇ２遺伝子の５’側のゲノム配列（５’ロングアーム（ｌｏｎｇ ａｒｍ））、及びＰＧＫ−１プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。
約６．６ｋｂｐの５’ｌｏｎｇ ａｒｍ断片（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列・ｒｅｆ｜ＮＴ＿０３９２０７．３｜Ｍｍ２＿３９２４７＿３３の７３０７９２１９〜７３０７２６６８に該当）と、約２．０ｋｂｐの３’ｓｈｏｒｔ ａｒｍ断片（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列・ｒｅｆ｜ＮＴ＿０３９２０７．３｜Ｍｍ２＿３９２４７＿３３の７３０７０８５１〜７３０６８８５５に該当）は、以下のようなＰＣＲ反応で取得した。２種のプライマーセットとして、配列番号１１（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＴＡＴＧ、５’側にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号１２（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＴＧＴＣＣ、５’側にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセット、及び配列番号１３（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＣＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＴＴＣ、５’側にＸｈｏＩとＸｂａＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡと配列番号１４（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＣＣＧＡＧ、５’側にＸｈｏＩ制限酵素部位を含む）で表される塩基配列からなるオリゴＤＮＡとのセットを使用した。ＰＣＲ反応では、変性（９４℃にて３０秒間）、アニール（５５℃にて３０秒間）、及び伸長（７２℃にて６分間）からなるサイクルを３５サイクル実施した。得られたＤＮＡ産物は、それぞれ、プラスミドｐＰＮＴ（Ｃｅｌｌ、１９９１年、６５巻、ｐ．１１５３−１１６３）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイト、及びＸｈｏＩサイトへ挿入して、ターゲッティングベクターを完成させた。この際、マウスＧＰＲｇ２遺伝子の５’上流側がｐＰＮＴベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入されるようデザインし、ベクター上ではネオマイシン遺伝子の転写方向と逆向きになるよう、ＧＰＲｇ２遺伝子由来のアーム断片を設置した（図１）。
【００４１】
（２）相同組み換えＥＳ細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、エレクトロポレーションによりＥＳ（ＴＴ２）細胞（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９３年、２１４巻、ｐ．７０−７６）に導入し、Ｇ４１８による選別を行った。形成されたコロニーのピックアップを行い、それぞれのクローンについてゲノムＤＮＡを抽出し、相同組み換えが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ターゲッティングベクターの３’ｓｈｏｒｔ ａｒｍ下流のゲノム配列、配列番号１５（CGAAAATACTGCACAGGAAGCCACGAGGACTCTGAAAACCAGAGAAAACCCTCAGACAAACAAACAAAGAGGCAGGTATCGTCATGCTAGAGTGCACACACATATGCTGATGCAGCAAAAGAGGAGTGGGGGAGTGTGTACCAAAGTGGTGAGAGCAGAGGGGAATGGGAGAGCATGTGCTGAAATGTAAAGGCAGAGGCCTATAGGGGAGAATATACTCAAGGATAAGAGAAAGGAGGCTGGAGGAGGTATGGCAGCATCTGCCACGACTGCCACAGGTTTGTGGCTATGCTGTCCCCAGGCTATGAAACGTAGAAATACAAGCTGTAGAAGATGTAATTTTTGAACTCAAAAGCTTTTTTTTTTCATGTAAAAACTAGGAATTATCAAACATTGGGAATAATAAACATATGGTGACTTGTAAATGCTAGTTTTTCAACマウス）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、制限酵素ＸｂａＩで切断したＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型クローンの３．９ ｋｂｐに対して相同組換えが起きているクローンでは２．７ ｋｂｐのＤＮＡ断片を検出することができた。
【００４２】
（３）ＧＰＲｇ２遺伝子ホモノックアウトマウスの取得
続いて、アグリゲーション法（Ｎａｇｙ Ａ．， １９９３， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ１４７−１７９）にて相同組換された（ＧＰＲｇ２遺伝子が破壊された）ＥＳ細胞クローンとＩＣＲ系８細胞期胚を凝集させ、翌日桑実胚〜胚盤胞に発生したキメラ胚を偽妊娠誘起したＩＣＲ系雌マウス（偽妊娠誘起から３日目）の子宮へ移植した（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５）。移植後、１７．５日に帝王切開を行い、キメラマウスを得た。キメラマウスは４週まで、里親に保育させた（相沢慎一，「ジーンターゲティング・ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」，羊土社，１９９５）。キメラ雄マウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス２匹を自然交配させ、ＧＰＲｇ２の開始コドンを含むエキソンを欠失した変異アレルを持つＧＰＲｇ２遺伝子のＦ１ヘテロノックアウトマウスを得た。
このＦ１へテロノックアウト雄マウスと、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）の投与により過排卵処置を施したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスとの体外受精（ＩＶＦ）により得られた受精卵を、精管結搾雄マウスとの交配により偽妊娠誘起処置を施したＩＣＲ系雌マウス（レシピエント）に移植することにより、Ｆ２へテロノックアウトマウスを大量に作出した。そこで得られたＦ２ヘテロノックアウトマウスを用いてＩＶＦを行い、受精卵を作製後、それらの胚をレシピエントに移植することにより得た産仔の尻尾よりゲノムＤＮＡを抽出し、前述の配列番号１５を用いたサザンブロット解析により、変異アレルの２．７ｋｂｐのバンドのみが出現するＦ３ホモノックアウトマウスを同定した。この際、野生型では、３．９ｋｂｐのバンドのみが出現し、ヘテロノックアウトマウスでは、３．９ｋｂｐと２．７ｋｂｐのバンドが両方出現した。
《実施例８：ホモノックアウトマウスでのＧＰＲｇ２遺伝子発現消失の確認》
【００４３】
得られたＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス、ヘテロノックアウトマウス、野生型マウスの脳を、各２匹ずつ計６匹採取し、ＲＮＡ抽出試薬ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出後、逆転写酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（インビトロジェン）を用いてｃＤＮＡ化し、ＰＲＩＳＭ ７７００ シーケンスディテクションシステム（アプライドバイオシステムズ）によりＧＰＲｇ２遺伝子の転写発現量を測定した。具体的には、リアルタイムＰＣＲ試薬ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、目的遺伝子であるＧＰＲｇ２が配列番号１６及び配列番号１７（５’−ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＣ−３’と５’−ＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧ−３’）、内部標準遺伝子としてＧ３ＰＤＨが配列番号１８及び配列番号１９（５’−ＡＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴ−３’と５’−ＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴ−３’）の各特異的プライマーで増幅されるｃＤＮＡ量を定量測定した。ＰＣＲ反応では、変性（９５℃にて１５秒間）、アニール及び伸長（５９℃にて１分間）からなるサイクルを４５サイクル実施した。ＧＰＲｇ２の測定結果は、Ｇ３ＰＤＨの測定結果で補正してグラフ作成した。その結果、ヘテロノックアウトマウスと野生型マウスの脳ではＧＰＲｇ２のｍＲＮＡが検出されたが、ホモノックアウトマウスでは検出されない事を確認した。
《実施例９：ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスの表現型解析》
【００４４】
Ｆ２ヘテロノックアウトマウス同士の交配により得られたＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス（雄５匹、雌６匹）と野生型マウス（雄６匹、雌６匹）の各個体について２０週齢の時点で、生殖器を観察した。その結果、ホモノックアウトマウスでは、精巣と卵巣が野生型マウスに比べ、有意に萎縮していることが判明した。具体的には雄では、左右の精巣重量が野生型では平均１１３．１±７．６ｍｇと１１４．９±１１．８ｍｇ、ホモノックアウトマウスでは平均２．７±０．４ｍｇと２．８±０．５ｍｇであり、精巣が顕著に萎縮していることがわかった。その他、前立腺、ペニス、精嚢、包皮腺、精巣上体等の雄の泌尿生殖組織も萎縮していた。また雌では、左右の卵巣重量が野生型では平均３．０±０．６ｍｇと３．４±０．７ｍｇであったのに比べ、ホモノックアウトマウスでは左右共に測定限界値（０．１ｍｇ）以下の重量であり、卵巣が顕著に萎縮していることがわかった。
《実施例１０：ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスの血中テストステロン濃度測定》
【００４５】
２０週齢のＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウス（雄５匹、雌６匹）と野生型マウス（雄６匹、雌６匹）の各個体より血漿サンプルを調製し、テストステロン測定キットであるＤＰＣ・トータルテストステロンキット（三菱化学ヤトロン）を用いて血中のテストステロン濃度を測定した。その結果、野生型マウスでは、５４．１±１９．８ｎｇ／ｄＬであったのに対して、ホモノックアウトマウスでは１６．１±１３．０ｎｇ／ｄＬであった。
精巣小葉に存在する精細管は、周囲を規定膜で囲まれており、その外側結合組織中にライディッヒ細胞と呼ばれるテストステロンを産生する間質細胞が存在する（カラー人体解剖学 構造と機能：ミクロからマクロへ ＦＨマティーニ、ＭＪティモンズ、ＭＰマッキンリ 西村書店）。精巣切除去勢動物モデルでは、ライディッヒ細胞消失により血中テストステロン濃度が減少する事が知られており（癌と化学療法 １９９３年、２０巻、ｐ２３００−２３０５）、今回の雄ＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスでは、生殖器の顕著な萎縮が観察され、去勢動物モデルと同様に、血中テストステロン量が減少していることが確かめられた。また同様に、卵巣はエストロゲンの主合成組織であることから（イラスト内分泌内科、ｐ．８０−８１ 文光堂）、雌のＧＰＲｇ２ホモノックアウトマウスでは、血中エストロゲン量が減少していることも明らかである。テストステロンやエストロゲンは、前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、乳癌、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症等の性ホルモン異常に起因する疾患の病態発生・進行に重要な役割を担っていることは良く知られていることから、我々は、ＧＰＲｇ２を介した細胞内情報伝達機構の阻害又は活性化により、これらの性ホルモン異常に起因する疾患の治療が可能になることを初めて見出した。即ち、ＧＰＲｇ２アンタゴニスト及び／又はアゴニストが性ホルモン異常に起因する疾患の治療薬等になることを見出した。（より具体的には、ＧＰＲｇ２アンタゴニストのスクリーニングにより前立腺肥大、前立腺癌、男性化症、多毛症、禿頭症、脂漏、子宮筋腫、子宮内膜症、乳腺症、及び／又は乳癌の治療薬、並びにＧＰＲｇ２アゴニストのスクリーニングにより低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、更年期障害、オステオポローシス、高脂血症の治療薬がスクリーニングできることを可能とした。）
《実施例１１：ＧＰＲｇ２活性を阻害する物質のスクリーニング》
【００４６】
実施例３と同様の方法で、ＧＰＲｇ２活性変化を指標とするスクリーニング系を用いて試験物質のスクリーニングを行った。
ＧＰＲｇ２を発現するＣＨＯ細胞（実施例２）を実施例３と同様にプレーティングし、そこに、プロキネティシンを含むＣＨＯ含有培地（実施例１）と、試験化合物のジメチルスルホキシド溶液を最終濃度が１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ、０．０３μＭ、０．０１μＭ又は０．００３μＭとなるように添加又は等量のジメチルスルホキシドのみを添加し、その後細胞内Ｃａ2+濃度を測定した。試験化合物による５０％活性抑制濃度（ＩＣ５０）を決定した。化合物処理に対するコントロールとして、等量のジメチルスルホキシドのみを加えた場合のレポーター活性を１００％とした。他の条件及びレポーター活性の測定は実施例３に従った。ＧＰＲｇ２を発現させた細胞においてＧＰＲｇ２活性を阻害する物質（ＩＣ５０が１０μＭ以下の物質）をアンタゴニストとして選択したところ、ＩＣ５０値が４．８６μＭを示す化合物2-[{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}(2-メトキシエチル)アミノ]-N-(3,4-ジメトキシベンジル)-N-[2-(1H-インドール-3-イル)エチル]アセトアミド（2-[{[(4-Chlorophenyl)amino]carbonyl}(2-methoxyethyl)amino]-N-(3,4-dimethoxybenzyl)-N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]acetamide）を取得することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３〜１４及び１５〜１９の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ターゲティングベクターの構造を模式的に示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド、あるいはｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド
を発現している細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
性ホルモン障害が男性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法。
【請求項３】
性ホルモン障害が女性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法。
【請求項４】
（１）請求項１に記載の細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）請求項１に記載のポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法。
【請求項５】
性ホルモンがテストステロンである請求項４に記載の検出する方法。
【請求項６】
性ホルモンがエストロゲンである請求項４に記載の検出する方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドである、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞である、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール。
【請求項９】
（１）請求項１に記載のポリペプチド、又は（２）請求項１に記載の細胞の性ホルモン障害治療薬スクリーニングのための使用。
【請求項１】
ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド、あるいはｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確認できるポリペプチド
を発現している細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、および前記ポリペプチドの活性変化を分析する工程を含むことを特徴とする、性ホルモン障害治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
性ホルモン障害が男性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法。
【請求項３】
性ホルモン障害が女性ホルモン障害である請求項１に記載のスクリーニングする方法。
【請求項４】
（１）請求項１に記載の細胞又はその細胞膜と、試験化合物とを接触させる工程、及び
（２）請求項１に記載のポリペプチドの活性変化を分析する工程、並びに
（３）試験化合物による性ホルモン量の変動を分析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法。
【請求項５】
性ホルモンがテストステロンである請求項４に記載の検出する方法。
【請求項６】
性ホルモンがエストロゲンである請求項４に記載の検出する方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドである、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞である、性ホルモン障害治療薬スクリーニングツール。
【請求項９】
（１）請求項１に記載のポリペプチド、又は（２）請求項１に記載の細胞の性ホルモン障害治療薬スクリーニングのための使用。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１６６８２３（Ｐ２００６−１６６８２３Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３６５１８１（Ｐ２００４−３６５１８１）
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１７日（２００４．１２．１７）
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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