感染性疾患の病原体およびそれらの薬剤感受性を診断する方法
本明細書は概して、病原体、例えば感染性疾患の病原体を検出、診断、および／または同定する方法、ならびにそれらの薬剤感受性および適切な治療を決定する方法に関する。本発明は概して、個々の被験体および被験体の大きな集団内における病原体感染をモニタリングする方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる、２０１０年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／３０７，６６９号、および２０１０年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，２５２号の特典を請求するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可番号３Ｕ５４−Ａ１０５７１５９−０６Ｓ１および認可番号Ａ１０８００２の下で政府の支援によってなされたものである。政府は本発明において確固たる権利を有するものとする。
【０００３】
技術分野
本発明は特に、病原体、例えば、感染性疾患の病原体を検出、診断、および／または同定する、ならびに既知の治療または潜在的な治療（known or potential treatment）に対するそれらの感受性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
分子診断の発展は、感染疾患以外の大部分の医療用分野における対処（care）に革新をもたらしたが、感染疾患の分野では、広範かつ変革的な役割を果たせずにいる。緩徐な培養法への依存は現在の抗生物質耐性の危機においては特に欲求不満の種であるが、それは、刺激的病原体（inciting pathogen）およびその薬剤耐性プロファイルを迅速に診断するための分子ツールの発展が、細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫感染の管理法を変え、死亡率を低下させるための尽力において迅速で情報に基づいた薬剤治療を誘導し、医療費を制御し、病原体間で増大する耐性に関する公衆衛生の監視を改善する可能性があるからである。米国内の病院だけでも、１７０万人の人が院内細菌感染し、９９，０００人が毎年亡くなり、これらの感染の７０％は少なくとも１つの薬剤に対する細菌耐性が原因であり、推定年間コストは４５０億ドルである（Klevens et al、2002. Public Health Rep.2007;122(2):160-6;Klevens et al、Clin Infect Dis.2008;47(7):927-30;Scott、The Direct Medical Costs of Healthcare-Associated Infection in U.S. Hospitals and the Benefits of Prevention.In:Division of Healthcare Quality Promotion NCfP、Detection and Control of Infectious Diseases、editor.Atlanta:CDC、2009）。しかしながら、この問題は米国に限られず、微生物耐性は現在、世界中で大部分の一般的な細菌感染に影響を与えている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S.aureus）（ＭＲＳＡ）、多剤耐性結核菌（tuberculosis）（ＭＤＲ−ＴＢ）、および一層薬剤耐性のグラム陰性生物の世界的な広がりは、監視、予防および防除、研究および製品開発に焦点を当てたアクションプランの形成を促した（US action plan to combat antimicrobial resistance.、Infect Control Hosp Epidemiol.2001;22(3):183-4）。しかしながら、任意のこれらの範囲に関して進展は最小限である。
【０００５】
適切な抗生物質の迅速な投与は、腸球菌（E.faecium）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（A.baumanii）、緑膿菌（P.aeruginosa）、およびエンテロバクター（Enterobacter）種などの院内病原体に関する病院設定内、または結核菌（tuberculosis）（ＴＢ）などの病原体に関する供給源不足（resource-poor setting）の設定内のいずれかで、重度の細菌感染がある患者の死亡率を最小にすることが繰り返し示されている（Harbarth et al、Am J Med.2003;115(7):529-35;Harries et al、Lancet.2001;357(9267):1519-23;Lawn et al、Int J Tuberc Lung Dis.1997;1(5):485-6）。しかしながら、生物の培養および二次培養（sub-culture）を含む現在の診断法は、生物とその薬剤感受性パターンの両方を正確に同定するのに数日以上要する可能性があるので、医師は経験によるより広いスペクトルの抗生物質の多数回の使用に依存しており、耐性の選択圧を加え、関連医療費は増大する。病原体およびそれらの耐性プロファイルを迅速に（例えば、１時間未満で）検出するためのポイントオブケア診断が早急に必要とされ、医療の実践を劇的に変える可能性がある。ＤＮＡベースまたはＰＣＲベースの試験を設計するいくらかの尽力は、低い検出限界で病原体を迅速に同定することができるツールをもたらしている。しかしながら、これらのツールの世界的な使用は、研究室のインフラに関するコストおよび要求、および必要な酵素の影響を容易に受けない粗製サンプルの設定におけるＰＣＲベースの方法の固有の非感受性が原因で、現在制限されている。薬剤耐性を決定するための分子学的手法はより一層限られており、既知の耐性を与える変異と比較した感染細菌の遺伝子型の定義に基づいて、非常に限られた方法でいくつかの生物（例えば、ＭＲＳＡ、ＴＢ）に利用可能である。しかしながら、この方法は、高感度を有する、試験用の全ての耐性を与える単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の非常に広範囲の同定を必要とする（Carroll et al、Mol Diagn Ther.2008;12(1):15-24）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
要旨
本発明は、少なくとも部分的に、例えば粗製、非精製サンプル中のｍＲＮＡの検出に基づいて、疾患を診断する、病原体を同定する、および治療を最適化する、新しい方法の発見に基づく。本明細書に記載する方法は、薬剤感受性の決定に基づいて、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体の迅速で正確な同定をもたらし、最適な治療の選択を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫などの病原性生物（disease-causing organism）の薬剤感受性を決定する方法を特徴とする。方法は、病原体を含むサンプルを提供するステップと、サンプルと１つまたは複数の試験化合物を、例えば４時間未満接触させて、試験サンプルを提供するステップとを含む。試験サンプルは、試験サンプル中に病原体からｍＲＮＡを放出させる条件下で処理することができ、試験サンプルは複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに曝し、それぞれのサブセットは、耐性がある生物と比較して試験化合物に感受性がある生物中で差次的に発現される標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、曝露が、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で起こる。方法は、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップと、試験化合物の存在下での標的ｍＲＮＡのレベルと参照レベル、例えば試験化合物の不在下での標的ｍＲＮＡのレベルとを比較するステップであって、標的ｍＲＮＡの参照レベルと比較した標的ｍＲＮＡのレベルの違いが、病原体が試験化合物に対して感受性であるか、または耐性があるかを示すステップとを含む。
【０００８】
一実施形態では、病原体は既知の、例えば同定済みの病原体である。いくつかの実施形態では、方法は、未知の病原体、例えば未だに同定されていない病原体の薬剤感受性を決定する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、病原体を含むサンプルを、例えば同時にまたは同じサンプル内で２つ以上の試験化合物と接触させる、例えば既知の治療化合物または潜在的な治療化合物、例えば抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、および駆虫薬（antiparasitis）と接触させる。これらの化合物のうちの多くのもの、例えば、イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、ビオマイシン、エンビオマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、エチオナミド、プロチオナミド、シクロセリン、ｐ−アミノサリチル酸、リファブチン、クラリスロマイシン、リネゾリド、チオアセタゾン、チオリダジン、アルギニン、ビタミンＤ、Ｒ２０７９１０、オフロキサシン、ノボビオシン、テトラサイクリン、メレペネム、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、エノキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、マフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コ−トリモキサゾール）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタムブトール、フォスフォマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、メトロニタゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファンピン、チアムフェニコール、チニダゾール、セファロスポリン、テイコプラチン（teicoplatin）、オーグメンチン、セファレキシン、リファマイシン、リファキシミン、セファマンドール、ケトコナゾール、ラタモキセフ、またはセフメノキシムは当技術分野で知られている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、サンプルを４時間未満、例えば３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、１分未満、化合物と接触させる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、感染性疾患の病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を同定する、例えば、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体の存在を検出する方法を特徴とする。これらの方法は、
病原体に感染している疑いがある被験体からの試験サンプルを提供するステップと、
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を放出させる条件下で試験サンプルを処理するステップと、
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、曝露が、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で起こるステップと、
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップとを含む。参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大は、試験サンプル中の病原体のアイデンティティー（identity）を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、方法は、痰、血液、尿、大便、関節液（joint fluid）、脳脊髄液、および子宮頸部／膣スワブである、またはこれらを含む、サンプル中またはサンプル由来の感染性疾患の病原体を同定する。このようなサンプルは、複数の他の生物（例えば、１つまたは複数の非病原性細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫）または病原体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、臨床サンプル、例えば医療提供者による医学的治療を施されるまたはその可能性がある患者または人からのサンプルである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸プローブは表２から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プローブとの接触前に、粗製状態であり、例えば精製されておらず、および／または、ｍＲＮＡを増殖して例えばｃＤＮＡを生成することを含まない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、方法は、酵素的、化学的、および／または機械的に細胞を溶解するステップを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスの使用を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法を使用して、病原体の大発生、例えば、特定領域内の病原体数の急上昇の公衆衛生監視のため、病原体感染、例えば発生率、罹患率をモニタリングする。
【００１８】
本明細書に記載する方法は、ヒト、および実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、もしくはサル、または飼育動物および家畜（domesticated and farm animals）、例えばネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および鳥類、例えばニワトリなどの動物を含めた、被験体からのサンプル中に病原体が存在する場合に有効である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載するアッセイの結果に基づいて、被験体用の治療を決定および／または選択すること、および必要に応じて、被験体に治療を施すこと（administering the treatment）をさらに特徴とする。
【００２０】
別の一般的な態様では、本発明は、被験体用の治療を選択する方法を特徴とする。これらの方法は、
例えば本明細書に記載する方法を使用して、感染性疾患の病原体を必要に応じては同定するステップ（例えば、サンプル中の特異的病原体の存在および／またはアイデンティティーを検出するステップ）と、
本明細書に記載する方法を使用して病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
被験体を治療する際に使用するための病原体が感受性のある薬剤を選択するステップとを含む。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、被験体中の病原体による感染をモニタリングするための方法を提供する。これらの方法は、
第一の時点に、病原体を含む第一のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
必要に応じて、病原体が感受性のある治療を選択し、選択した治療を被験体に施すステップと、
第二の時点に、病原体を含む第二のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性と第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を比較し、それによって被験体中の感染をモニタリングするステップとを含む。
【００２２】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、被験体は免疫無防備状態（immune compromised）である。
【００２３】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、方法は、病原体が感受性のある治療を選択し、選択した治療を被験体に施すステップを含み、病原体の薬剤感受性の変化は、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあるか（the pathogen is or is becoming resistant to the treatment）を示し、例えば、方法は、施される治療に対する病原体の薬剤感受性を決定するステップを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、病原体の薬剤感受性の変化は、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあることを示し、方法は、被験体に異なる治療を施するステップをさらに含む。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、被験体集団内における、病原体による感染をモニタリングするための方法を特徴とする。これらの方法は、
第一の時点に、集団内の被験体からの第一の複数のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定し、必要に応じて、本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプル中の感染性疾患の病原体を同定するステップと、
必要に応じて、被験体に治療を施するステップと、
第二の時点に、集団内の被験体からの第二の複数のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定し、必要に応じて、本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプルにおける感染性疾患の病原体を同定するステップと、
第一の複数のサンプルおよび第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性、および必要に応じて、病原体のアイデンティティーを比較し、それによって被験体集団内の感染をモニタリングするステップとを含む。
【００２６】
さらに別の態様では、固形支持体と結合した複数のポリヌクレオチドを提供する。複数のポリヌクレオチドのそれぞれは、表２由来の１つまたは複数の遺伝子と選択的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、配列番号１〜２２７、およびそれらの任意の組合せを含む。
【００２７】
伝染病または伝染性疾患としても知られる「感染性疾患」は、被験体における病原性生物因子の感染、存在、および増殖に起因する臨床的に明らかな病状（すなわち、特徴的な医学的兆候および／または疾患の症状）を含む（Ryan and Ray(eds.)(2004).Sherris Medical Microbiology(4th ed.).McGraw Hill）。感染性疾患の診断は、例えば診断検査（例えば、血液検査）、カルテ審査、および臨床歴審査によって、医師により確認することができる。いくつかの場合、感染性疾患は、その過程の一部または全部で無症候性であり得る。感染性病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、多細胞寄生虫、およびプリオンを含むことができる。当業者は、病原体の伝播は、物理的接触、汚染食品、体液、物体、空気媒介吸入、およびベクター生物介在を例外なく含めた、異なる経路を介して起こり得ることを理解する。特に感染性が強い感染性疾患は時折伝染性と呼ばれ、病人およびその分泌物との接触によって伝播する可能性がある。
【００２８】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、産物（ＲＮＡまたはその翻訳産物、ポリペプチドのいずれか）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。遺伝子はコード領域を含有し、コード領域の前後に領域を含む（それぞれ「リーダー」および「トレイラー」と呼ばれる）。コード領域は、複数のコードセグメント（「エクソン」）および個々のコードセグメント間の介在配列（「イントロン」）で構成される。
【００２９】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、標的ｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、標的とのハイブリダイゼーション時に一本鎖であってよい。
【００３０】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明中で使用するための方法および材料を本明細書に記載し、当技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は単なる例示的なものであり、限定的であることを意図するものではない。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）（カラーコードプローブ対を用いた遺伝子発現の直接同時計測）技術を使用して、サンプル中のｍＲＮＡ分子を定量化するための例示的な方法を示すフローチャートである。１Ａ。対象のそれぞれのｍＲＮＡに対応する２つの分子プローブを粗製サンプル溶解物に加える。捕捉プローブは、ビオチンと結合した所与のｍＲＮＡ分子と相補的な５０ｂｐオリゴマーからなる。レポータープローブは、蛍光タグと結合した同じｍＲＮＡ分子の異なる部分と相補的な異なる５０ｂｐオリゴマーからなる。それぞれのタグは、所与のｍＲＮＡ分子を独自に同定する。捕捉プローブとレポータープローブは、溶解物内のそれらの対応するｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする。１Ｂ。それぞれのオリゴマー上のハンドルとハイブリダイズするビーズ精製により過剰なレポーターを除去し、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ複合体のみ残す。１Ｃ。ｍＲＮＡ複合体を表面上に固定して並べる（aligned）。ｍＲＮＡ複合体は、ストレプトアビジンコーティング表面上でビオチン結合捕捉プローブによって捕捉する。電場を利用して、表面上で全て同じ方向に複合体を並べる。１Ｄ。表面を画像化しコードを数える。ｍＲＮＡ複合体は顕微鏡画像処理し、並べたレポータータグは数えることができ、これによってｍＲＮＡ分子の定量測定値を与えることができる（ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍから得た画像）。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、薬剤耐性の遺伝子発現シグネチャーの診断を示す一連の図である。２Ａ。患者由来のサンプル、例えば痰。２Ｂ。薬剤感受性と耐性菌を区別するための発現プログラムの誘導。サンプルは分割し、菌が薬剤に耐性であるか感受性であるかに応じて、異なる薬剤に曝して発現プログラムを誘導する。２Ｃ。ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズするバーコードプローブ。細胞を溶解させ、プローブを粗製サンプルに加える。２Ｄ。ｍＲＮＡ複合体を捕捉して並べる。２Ｅ。複合体を画像化し計数する。２Ｆ。シグネチャーの分析。測定したｍＲＮＡレベルを標準化し、薬剤なしの対照および薬剤感受性および耐性の標準と比較して、全薬剤中の耐性プロファイルを定義する。
【図３】図３は、大腸菌（E.coli）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。６個の大腸菌（E.coli）遺伝子（ｆｔｓＱ、ｍｕｒＣ、ｏｐｇＧ、ｐｕｔＰ、ｓｅｃＡ、およびｕｕｐ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を大腸菌（E.coli）として陽性同定した。それぞれの値は、４〜６反復の平均および標準偏差を表す。
【図４】図４は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個の緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子（ｐｒｏＡ、ｓｌｔＢ１、ｎａｄＤ、ｄａｃＣ、およびｌｉｐＢ）用に設計したプローブを使用して、２個の臨床分離株を緑膿菌（P.aeruginosa）として陽性同定した。
【図５】図５は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個のクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子（ｌｒｐ、ｙｃｂＫ、ｃｌｐＳ、ｉｈｆＢ、ｍｒａＷ）用に設計したプローブを使用して、臨床分離株を陽性同定した。
【図６】図６は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｐｒｏＣ、ｒｐｏＢ、およびｆａｂＤ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を陽性同定した。
【図７】図７は、病原体特異的プローブを使用した病原体同定を示す、一連の３つの棒グラフである。
【図８】図８は、病原体同定感受性を示す一連の３つの棒グラフである。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、模擬臨床サンプル（simulated clinical sample）からの病原体同定を示す一連の３つの棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、模擬臨床サンプルからの病原体同定を示す一連の３つの棒グラフである。
【図１０】図１０は、緑膿菌（P.aeruginosa）の２個の臨床分離株の同定を示す一連の２つの棒グラフである。
【図１１】図１１は、大腸菌（E.coli）におけるフルオロキノロン耐性の確認（identification）を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、大腸菌（E.coli）におけるアミノグリコシド耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）におけるメチシリン耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、エンテロコッカス（Enterococcus）におけるバンコマイシン耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、薬剤耐性結核菌（M.tuberculosis）における薬剤特異的遺伝子誘導を示す一連の４つの棒グラフである。
【図１６】図１６は、イソニアジド感受性と耐性ＴＢ菌株を比較する３個のスキャッタープロットの図である。それぞれのドットは、２４遺伝子プローブの１つを表す。軸はデジタル遺伝子発現技術（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標））によって測定した転写産物の数を表す。左−薬剤処理の不在下でのイソニアジド耐性菌株とイソニアジド感受性菌株における発現の比較。中央−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド感受性菌株（drug treated vs. drug untreated isoniazid sensitive strain）における発現の比較。右−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド耐性菌株における発現の比較。
【図１７】図１７は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）を使用して薬剤感受性と薬剤耐性の結核菌（M.tuberculosis）の転写応答を比較する一連の４つの棒グラフである。（Ａ）本明細書に記載するように菌株Ａ５０（ＩＮＨ−Ｒ）をＩＮＨ（０．４μｇ／ｍｌ）で処理した。（Ｂ）ＳＭ−ＲクローンＳ１０は２μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで処理した。
【図１８】図１８は、感受性と耐性のＴＢ菌株における差次的遺伝子発現誘導を示す棒グラフである。ＩＮＨで処理したＩＮＨ感受性（野生型）細胞／未処理細胞における各遺伝子の発現の割合は、ＩＮＨで処理したＩＮＨ耐性細胞／未処理細胞における各遺伝子の発現で割る。
【図１９】図１９は、結核菌（M.tuberculosis）におけるＩＮＨ誘導型遺伝子の誘導の経時変化を示す線グラフである。イソニアジド感受性Ｈ３７Ｒｖを０．４μｇ／ｍｌのＩＮＨ（５ＸＭＩＣ）に曝し、１時間、２時間、および５時間で１０ｍｌの培養物からＲＮＡを調製した。次いでｑＲＴ−ＰＣＲを使用してｋａｓＡ、ｋａｓＢ、およびｓｉｇＡに対する転写産物の量を定量化し、レベルはｓｉｇＡに標準化してｔ＝０と比較する。
【図２０】図２０は、発現シグネチャーを検出するための例示的なワークフローである。痰中のバチルス（bacilli）の実際の生理的状態は知られていないので、プロセス開発中に複製細菌と非複製細菌の両方をモデル化する。無菌培養において増殖したＨ３７Ｒｖ（リッチ７Ｈ９／ＯＡＤＣ／ＳＤＳ培地中または７Ｈ９／チロキサポール中で枯渇のいずれか）は、これらの実験において痰中のバチルス（bacilli）を表す。バチルス（bacilli）を富栄養培地（rich media）に曝しながら一定時間ｔ１パルス処理し、休眠状態からの蘇生を刺激して転写を活性化する。最適なｔ１は実験によって決定する。次いでバチルス（bacilli）を薬剤に曝しながら一定時間ｔ２パルス処理し、転写応答を誘発する。最適なｔ２は実験によって決定する。最後に、全てのサンプルを処理し、発現プロファイリングによって分析し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
【図２１】図２１は、遺伝子の発現の割合を比較して薬剤感受性と耐性のバチルス（bacilli）を区別する例示的な方法である。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、発現シグネチャーに含める候補である遺伝子に関するｍＲＮＡレベルを測定する。薬剤の存在下（誘導−薬剤）および薬剤の不在下（非誘導−無薬剤）で、「実験用（ｅｘｐ）」で示すサンプル（すなわち、臨床分離株）中の対象の遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する。標準ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡレベルも、薬剤の存在下（ハウスキーピング−薬剤）および薬剤の不在下（ハウスキーピング−無薬剤）で測定する。対象の遺伝子とハウスキーピング遺伝子のレベルの割合によって、薬剤の存在下（Ａ）および薬剤の不在下（Ｂ）での発現を標準化することができる。いくつかの薬剤感受性菌株に関してＡ＞Ｂ、および薬剤耐性菌株に関してＡ＝Ｂが予想される。最後に、薬剤感受性および薬剤耐性であることが知られている対照菌株（ＣおよびＤ）に関して同じ対応率を作製する。これらの対照値は、未知の菌株から得た実験比の比較用の標準として働く。
【図２２】図２２は、培養または患者標本に直接由来する細菌種の陽性同定を示す一連の棒グラフおよびスキャッタープロットである。細菌サンプルは、種特異的転写産物の検出用に設計したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを用いて分析した。Ｙ−軸：転写産物の加工していないカウント（raw count）；Ｘ−軸：遺伝子の名称。大腸菌（E.coli）（黒色）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）（白色）、緑膿菌（P.aeruginosa）（グレー）に特異的なプローブ。エラーバーは２回の生物学的反復の標準偏差を表す。（Ａ）グラム陰性細菌の培養物からの検出。（Ｂ）混合培養物（プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、シトロバクター・フレウンデー（Citrobacter freundii））内の検出。（Ｃ）培養物中のマイコバクテリウム（mycobacteria）の属および種特異的検出。結核菌（M.tuberculosis）（Ｍｔｂ）、マイコバクテリウム・アビウム亜種イントラセルラーレ（M.avium subsp.intracellulare）（ＭＡＩ）、ヨーネ菌（M.paratuberculosis）（Ｍｐａｒａ）、およびマイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）（Ｍｍａｒ）。属範囲（genus-wide）のプローブ（グレー）、結核菌（M.tuberculosis）特異的プローブ（黒色）。（Ｄ）臨床尿試料に直接由来する大腸菌（E.coli）の検出。（Ｅ）非大腸菌（E.coli）サンプルと比較した大腸菌（E.coli）サンプルのアイデンティティーの統計的決定。それぞれのプローブに関するカウントを平均し、対数（log）変換して合計した。（Ｆ）ブドウ球菌（Staphylococci）においてメチシリン耐性を与えるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ、および腸球菌（Enterococci）においてバンコマイシン耐性を与えるｖａｎＡ ｍＲＮＡの検出。それぞれのポイントは異なる臨床分離株を表す。
【図２３】図２３は、抗生物質への曝露によって感受性細菌と耐性細菌を区別するＲＮＡ発現シグネチャーを示す、一連の７つの棒グラフである。感受性または耐性の細菌株を対数期（log phase）まで増殖させ、抗生物質に軽く曝露し、溶解し、抗生物質への曝露に応じて変わる転写産物の定量化用に設計したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブセットを使用して分析した。加工していないカウントはサンプル用の全プローブの平均に標準化し、薬剤曝露と非曝露サンプルを比較することによって誘導倍率を決定した。Ｙ−軸：変化倍率；Ｘ−軸：遺伝子の名称。（Ａ）大腸菌（E.coli）：シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、アンピシリン（ＡＭＰ）、またはゲンタマイシン（ＧＭ）、（Ｂ）緑膿菌（P.aeruginosa）：シプロフロキサシン、および（Ｃ）結核菌（M.tuberculosis）：イソニアジド（ＩＮＨ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、またはシプロフロキサシン（ＣＩＰ）に曝露した、感受性菌株（黒色；上図）または耐性菌株（グレー；下図）に関するシグネチャー。それぞれの菌株は二連で試験し、エラーバーは、１個の代表的菌株の２回の生物学的反復の標準偏差を表す。試験した菌株の完全な一覧に関する表６を参照。
【図２４】図２４は、発現シグネチャーの誘導レベルの平均二乗長を使用した抗生物質耐性と感受性の細菌株の統計的分離を示す、３個のスキャッタープロットの図である。平均二乗長（ＭＳＤ）は、抗生物質に曝露した感受性菌株に関する平均シグナルからの試験した各菌株の偏差を示すＺスコアとして表す。感受性菌株：白い菱形；耐性菌株：黒い菱形。破線：Ｚ＝３．０９（ｐ＝０．００１）（Ａ）大腸菌（E.coli）臨床分離株。それぞれのポイントは、１菌株の２〜４回の生物学的反復を表す。（ＢおよびＣ）抗生物質への曝露に対する発現シグネチャー応答は耐性機構と無関係である。（Ｂ）染色体フルオロキノロン耐性を与えるｇｙｒＡの変異またはプラスミド媒介性キノロン耐性決定基（ａａｃ（６’）−Ｉｂ、ｑｎｒＢ、またはｏｑｘＡＢ）のいずれかを含有する大腸菌（E.coli）親菌株Ｊ５３および誘導体はシプロフロキサシンに曝露し、次いで前述のように分析した。エラーバーは４回の生物学的反復の標準偏差を表す。（Ｃ）結核菌（M.tuberculosis）。イソニアジド感受性および高または低レベルの耐性菌株をイソニアジドに曝露した。１μｇ／ｍＬで、低レベルのＩＮＨ耐性ｉｎｈＡは感受性シグネチャーを示すが、０．２μｇ／ｍＬでは、それは耐性シグネチャーを示す。
【図２５】図２５は、ウイルスおよび寄生虫の検出を示す一連の５つの棒グラフである。細胞を溶解し、プールしたプローブセットを加え、標準ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールに従いサンプルをハイブリダイズさせた。（Ａ）無菌培養から検出したカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）。（Ｂ）ＨＩＶ−１。ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｒｅｖ用に設計したプローブを用いたＰＢＭＣ溶解物からの検出。（Ｃ）インフルエンザＡ（Influenza A）。マトリックスタンパク質１および２用に設計したプローブを用いた、２９３Ｔ細胞溶解物におけるＰＲ８インフルエンザウイルスの検出。（Ｄ）ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２。ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ用に設計したプローブを用いた、ＨｅＬａ細胞溶解物におけるＨＳＶ−２菌株１８６Ｓｙｎ＋の検出。高いＭＯＩでさえ、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２特異的プローブのクロスハイブリダイゼーションはほとんどなかった。（Ｅ）熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）。示したレベルの寄生虫血症（parasitemia）で採取した赤血球からの熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）菌株３Ｄ７の検出。プローブは熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）に関して示した血液段階用に設計した。
【図２６】図２６は、臨床分離株の生物の同定を示す一連の３個のスキャッタープロットの図である。細菌培養物を溶解し、種特異的転写産物の検出用に設計したプローブを加え、ハイブリダイズさせ、標準ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールによって検出した。大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、または緑膿菌（P.aeruginosa）を同定するプローブを含有するプールしたプローブセットをＡおよびＢにおいて使用した。Ｃでは、結核菌（M.tuberculosis）用の種特異的プローブは微生物病原体に対する特に大きなプローブセットであった。左のＹ−軸はそれぞれの生物に関する１〜５の別個の転写産物からの対数変換のカウントの合計を示し、Ｘ−軸は試験した種を示す。破線は、所与サンプルのスコアが対照（「非生物」）サンプルの平均から逸脱した標準偏差数に基づく０．００１のｐ値を示す。「非生物」サンプルは、他の細菌生物、ただし定義する生物が不在であることが知られている細菌生物を含有した、試験したサンプルを示す。（Ｃ）に関しては、非生物サンプルは、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intracellulare）、ヨーネ菌（M.paratuberculosis）、マイコバクテリウム・アブセサス（M.abscessus）、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（M.gordonae）、およびマイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）を含めた、非結核菌マイコバクテリウム（tuberculous mycobacteria）であった。試験した菌株および臨床分離株の数は表４中に示し、（そのために５０ｎｔプローブを設計した）病原体同定に使用した遺伝子は表５中に列挙する。
【図２７】図２７は、ゲンタマイシン（左図）またはアンピシリン（左図）感受性と耐性の大腸菌（E.coli）菌株の平均二乗長（ＭＳＤ）の比較を示す図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心（centroid）と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。点線は、０．００１のｐ値に相当するＺ＝３．０９を示す。
【図２８】図２８は、シプロフロキサシン感受性と耐性の緑膿菌（P.aeruginosa）菌株の平均二乗長の比較を示すスキャッタープロットの図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。
【図２９】図２９は、ストレプトマイシン（ＳＭ）またはシプロフロキサシン（ＣＩＰ）感受性と耐性の結核菌（M.tuberculosis）菌株の平均二乗長の比較を示す２個のスキャッタープロットの図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。
【図３０】図３０は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｉｌｅＳ、ｐｐｎＫ、ｐｙｒＢ、ｒｏｃＤ、およびｕｖｒＣ）用に設計したプローブを使用して、３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株を陽性同定した。
【図３１】図３１は、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）分離株の陽性同定を示す棒グラフである。６個のステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）遺伝子（ｃｌｐＰ、ｄｎａＫ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＦ、ｓｄｈＡ、およびｓｅｃＤ）用に設計したプローブを使用して、３個の分離株をステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）として陽性同定した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本明細書に記載するのは、転写発現プロファイルシグネチャーに基づいて、病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫とその薬剤耐性パターンの両方を同定するための、迅速で、高感度の、表現型に基づく方法である。感受性および耐性の病原体は薬剤曝露に対して非常に異なる応答をし、初期の１つでは、最も迅速な応答はそのそれぞれの発現プロファイルの変化を反映した。分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現を使用して、薬剤曝露に対するこれらの初期転写応答を検出して、酵素学または分子生物学を必要としない迅速な形式で、薬剤感受性および耐性の病原体を区別することができる。本発明は様々な臨床サンプル中の広範囲の微生物病原体に適用可能であり、現在の診断ツールと共にまたは独立して使用することができる。主に結核菌（tuberculosis）（「ＴＢ」、結核菌（Mycobacterium tuberculosis））に関して使用する方法を記載するが、（例えば、表１中に列挙したような）他の病原体およびそれらの関連臨床症状に関する使用に、それらを適用することができることは当業者によって理解される。
【００３４】
薬剤耐性の診断および同定は、より迅速な「顕微鏡観察による薬剤感受性（microscopic-observation drug-susceptibility）」（ＭＯＤＳ）培養法、ファージ送達型レポーター、または比色定量指標さえも使用する培養試験に必要とされるＴＢの非常に遅い増殖のため、ＴＢに関して非常に課題がある。薬剤耐性を決定するための別のアプローチは、知られている耐性を与える変異と比較して感染病原体の遺伝子型を定義することに基づくが、しかしながら、このアプローチは、高感度を有する試験のためには全ての耐性を与える単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の非常に広範囲の同定を必要とする。
【００３５】
本明細書に記載する方法は、病原体の発現プロファイルシグネチャーに基づいて、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体を例えば同定するため、および病原体の薬剤感受性を決定するために使用することができる。薬剤感受性と耐性の病原体を区別するために使用することができる最も初期の最も迅速な応答の１つは、対象の薬剤への曝露時のそのそれぞれの転写プロファイルである。病原体は、それらがその特定薬剤に対して感受性であるかまたは耐性であるかに応じて、薬剤曝露に対して非常に異なる応答をする。例えばいくつかの場合、薬剤感受性または薬剤耐性の細菌は、上方および下方の制御遺伝子によって薬剤曝露に対して数分〜数時間内に応答し、耐性細菌にそのような応答がない一方で、薬剤および付随するより非特異的なストレスを克服しようとおそらく試みる。この迅速な応答は、病原体を殺傷またはその増殖を阻害するための化合物に必要とされる長時間とは対照的である。有効な形式での臨床サンプルからの病原体の死または増殖阻害の検出は、さらに大きな課題となる。例えば分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現を使用して、薬剤曝露に対するこれらの初期転写応答を検出し、酵素学または分子生物学を必要としない迅速な形式で薬剤感受性と耐性の病原体を区別することができ、したがって患者から回収した粗製臨床サンプルで直接実施することができる。この読み出し値が表現型であり、したがって例えばＴＢの薬剤耐性を考慮したＳＮＰの包括的定義を必要としない。本明細書に記載するのは、病原体、例えばＴＢバチルス（bacilli）に対する高い特異性を与え、感受性病原体と耐性病原体を区別するための遺伝子のセットである。感受性病原体と耐性病原体を区別する発現シグネチャーを構成する遺伝子の選択に基づいて、検出限界の感度を、多量に誘導され、したがって臨床サンプル内の病原体の数によってのみ制限されない転写産物を選択することによって最適化する。このセットの大きさを測定して、必要とされる遺伝子の数を最小にする。したがって本発明は、迅速（例えば、数時間）、高感度、および特異的である病原体およびその付随する耐性パターンを診断するための、高感度の表現型試験として使用することができる。この試験は病原体に感染した患者のケアを変える可能性があり、例えば世界のＴＢ発生領域のための、コスト効率が良い、ポイントオブケア診断である。
【００３６】
本発明の方法は、高度の感受性および特異性で、粗製細胞サンプルから直接の核酸シグネチャー、具体的にはＲＮＡレベルの検出を可能にする。この技術を使用してＴＢを同定することができ、臨床サンプル、例えば痰、尿、血液、または大便から直接の迅速で簡潔な処理を用いた、高感度での異なる発現シグネチャーの測定によって薬剤感受性パターンを決定することができ、この技術はリンパ節などの他の組織にも適用可能である。高感度は、ＤＮＡではなくｍＲＮＡを検出することによって得ることができる。単細胞は（検出のために増幅を典型的に必要とする）１ゲノムＤＮＡコピーと比較して細胞当たりより多くのｍＲＮＡのコピー（＞１０３）を有する可能性がある、（＜２０００コピーｍＲＮＡを検出する）この技術の高い固有の感度のためである。迅速で簡潔なサンプル処理は、ｍＲＮＡ分子の検出に必要とされる酵素学および分子生物学的方法の欠如のため可能であり、その代わりいくつかの実施形態では、これらの方法は、粗製溶解物中でのバーコードプローブとｍＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション、次に（例えば、図１中に例示するような）直接的可視化を利用する。これらの実施形態ではハイブリダイゼーションを使用するので、ｍＲＮＡは粗製細胞溶解物、固定組織サンプル、およびグアニジウムイソチオシアネート（guanidinium isothiocyanate）、ポリアクリルアミド、およびＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を含有するサンプルから、いかなる精製ステップもなく直接検出することができる。粗製ｍＲＮＡサンプルは生物体液または固形物から得ることができ、例えば、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、子宮頸部／膣スワブ、胆汁液、胸膜液、腹膜液、または心膜液、または例えば骨生検、肝生検、肺生検、脳生検、リンパ節生検、食道生検、結腸生検、胃生検、小腸生検、心筋生検、皮膚生検、および洞生検由来の組織生検サンプルを使用することもできる。
【００３７】
ＲＮＡ抽出
酵素的、化学的、または機械的にサンプルを処理して、サンプル中の細胞を溶解し、ｍＲＮＡを放出させることによって、サンプル、例えば病原体細胞または臨床サンプル中の細胞からＲＮＡを抽出することができる。プロセス中に他の破壊法を使用することができることは、当業者によって理解される。
【００３８】
細胞壁を除去するための酵素法の使用は、当技術分野で十分確立している。酵素は一般に市販されており、かつ大抵の場合、生物源から最初に単離されている。一般に使用される酵素としては、ライソザイム、リゾスタフィン、ジモラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースが挙げられる。
【００３９】
化学物質、例えば界面活性剤は、脂質−脂質、脂質−タンパク質およびタンパク質−タンパク質の相互作用を妨害することによって、細胞周辺の脂質バリアを破壊する。細胞溶解に理想的な界面活性剤は、細胞型および供給源に依存する。細菌と酵母は、それらの細胞壁の性質のため、最適な溶解に関して異なる要件を有する。一般に、非イオン性および両性イオン性の界面活性剤が穏やかである。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ系の非イオン性界面活性剤および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、両性イオン性界面活性剤が一般にこれらの目的に使用される。対照的に、イオン性界面活性剤は強力な可溶化剤であり、タンパク質を変性させる傾向があり、それによってタンパク質の活性および機能を妨害する。タンパク質と結合し変性させるＳＤＳ、イオン性界面活性剤が、細胞を破壊するために当技術分野で広く使用されている。
【００４０】
細胞の物理的破壊は超音波処理、フレンチプレス、エレクトロポレーションを必要とする可能性があり、または基本構造を含むマイクロ流体デバイスを使用して機械的に細胞を破壊することができる。これらの方法は当技術分野で知られている。
【００４１】
分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現
遺伝子発現プロファイルに基づいて病原体を同定するための、例示的手順のフローチャートを図１中に示す。対象の各病原体を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブは、ＢＬＡＳＴソフトウエアにより対象の病原体由来のコード配列と他の生物中の全遺伝子配列を比較することによって選択する。対象の病原体と完全に一致するが、任意の他の生物とは５０％を超えて一致しない、約５０ヌクレオチド、例えば８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、および２０ヌクレオチドのプローブのみを選択した。対象の各ｍＲＮＡに相当し互いに１００塩基対内である２つのプローブを選択する。
【００４２】
２つの分子プローブを、ｍＲＮＡ分子を含有する粗製サンプル溶解物に加える。捕捉プローブは所与のｍＲＮＡ分子と相補的な５０ヌクレオチドを含み、ビオチンと結合させることが可能である。レポータープローブは同じｍＲＮＡ分子の異なる部分と相補的な異なる５０ヌクレオチドを含み、レポーター分子、例えば蛍光タグまたは量子ドットと結合させることが可能である。それぞれのレポーター分子は所与のｍＲＮＡ分子を独自に同定する。捕捉プローブとレポータープローブは、溶解物内のそれらの対応するｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする。それぞれのオリゴマー上のハンドルとハイブリダイズするビーズ精製により過剰なレポーターを除去し、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ複合体のみ残す。ｍＲＮＡ複合体は、表面上、例えばストレプトアビジンコーティング表面上で捕捉し固定することができる。表面を顕微鏡画像処理する前に、電場を利用して、表面上で全て同じ方向に複合体を並べることができる。
【００４３】
レポーター分子を計数して、ｍＲＮＡ分子の定量測定値を与えることができる。市販のｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）をその手順中で使用することができる。しかしながら、他のシステムをそのプロセス中で使用することができることは当業者によって理解される。例えば、バーコードではなく、量子ドットでプローブを標識することができる。例えば、Sapsford et al、「Biosensing with luminescent semiconductor quantum dots.」Sensors 6(8): 925-953 (2006);Stavis et al、「Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel.」Lab on a Chip 5(3):337-343 (2005);およびLiang et al、「An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe.」Nucleic Acids Research 33(2):e17(2005)を参照。
【００４４】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体（例えば「ラボオンチップ」）デバイスを、サンプル中のｍＲＮＡを検出および定量化するために本発明の方法において使用することができる。このようなデバイスは、マイクロ流体フローサイトメトリー、連続的な大きさに基づく分離（continuous size-based separation）、およびクロマトグラフィーによる分離用に首尾よく使用されている。特に、このようなデバイスは、本明細書に記載するように粗製サンプル中の特定標的ｍＲＮＡを検出するために使用することができる。様々なアプローチを使用して、特定ｍＲＮＡのレベルの変化を検出することができる。したがって、このようなマイクロ流体チップ技術は、本明細書に記載する方法中で使用するための診断および予後用デバイスにおいて使用することができる。例えば、Stavis et al、Lab on a Chip5(3):337-343(2005);Hong et al、Nat.Biotechnol. 22(4):435-439(2004);Wang et al、Biosensors and Bioelectronics 22(5):582-588(2006);Carlo et al、Lab on a Chip3(4):287-291 (2003);Lion et al、Electrophoresis24 21 3533-3562 (2003); Fortier et al、Anal.Chem.,77(6):1631-1640(2005)、米国特許公開Ｎｏ．２００９／００８２５５２；および米国特許第７，６１１，８３４号を例えば参照。本明細書中には、結合成分、例えば本明細書に記載する病原体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、マイクロ流体デバイスも含まれる。
【００４５】
これらのマイクロ流体デバイスは、標識量子ドットおよび他のレポーター分子のレーザー励起を組み込むことができる。これらのデバイスは、可視光線を含めた様々な検出機構、および電荷結合デバイスベースカメラを含めた様々なデジタルイメージングセンサー法による、生じる発光の検出も組み込むことができる。これらのデバイスは、生成した加工されていないシグナルおよびデータを診断情報に変換する（translate）画像処理および分析能力も組み込むことができる。
【００４６】
発現シグネチャーを使用する、病原体アイデンティティーおよび病原体薬剤耐性の迅速な、表現型による診断
この技術を利用して、病原体のアイデンティティーまたは薬剤耐性の迅速な決定を達成することができる。
【００４７】
特有遺伝子の検出に基づいて、サンプル中の病原体を同定することができる。したがって例えば、肺炎または気管支炎などの呼吸器疾患関連の症状を有する被験体から、痰サンプルを得ることができ、どの疾患が存在しどの病原体がその疾患の原因であるかを決定するアッセイを実施する（例えば、表１参照）。尿サンプルを得て膀胱炎、腎盂腎炎、または前立腺炎を診断することができる（例えば、表１参照）。当業者は、患者によって示される症状の性質およびその差次的診断に応じて、特定の型のサンプルを得て、アッセイすることができることを理解している。それぞれの生物を同定するための具体的な遺伝子は本明細書に記載する方法により同定することができ、特定病原体を同定するための例示的な遺伝子は表２中に含まれる。
【００４８】
大きく加速する耐性の試験に関する原則は、対象の特定薬剤への曝露時に病原体の薬剤感受性と耐性の菌株の間で生じる転写応答の差異の検出に基づく。これらの転写プロファイルは測定可能な薬剤曝露に対する初期表現型応答であり、それらは薬剤曝露による桿菌死のかなり前に検出することができる。この転写ベースのアプローチには、それが代用ＳＮＰではなく薬剤曝露に対する病原体の直接的な応答を測定する点で、遺伝子型ベースのアプローチに勝る異なる利点もある。
【００４９】
いくつかの実施形態では、図２中に記載したように試験を実施することができる。サンプル、例えばＴＢを有する患者由来の痰サンプルを、いくつかのより小さなサブサンプルに分割する。異なるサブサンプルを、所定の時間（例えば、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、１分未満）、薬剤なしまたは異なる、既知もしくは潜在的薬剤（例えば、ＴＢサンプルの場合、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、モキシフロキサシン、ストレプトマイシン）のいずれかに曝露し、その間に薬剤感受性菌株において発現プロファイルが誘導され、それを薬剤耐性菌株と区別する。次いでサブサンプル中のＴＢバチルス（bacilli）を溶解し、バーコード分子プローブをハイブリダイゼーション用に加え、固定および画像化後にサブサンプルを分析する。次いで転写データセットを分析して、ＴＢの薬剤感受性および薬剤耐性の菌株に関する発現応答に基づいて一群の薬剤に対する耐性を決定する。したがって、ＴＢおよび個々の抗生物質に対するその応答を独自に同定するための発現シグネチャーを決定することができ、生じたデジタル遺伝子発現に利用するためのプローブセット、およびサンプル処理および回収法を最適化することができる。
【００５０】
発現シグネチャーの定義および転写シグナルの最適化の際に、考慮しなければならない２つの問題は、１．細胞が複製状態または非複製状態のいずれかであり得るので、現在定義されていない痰中のバチルス（bacilli）の代謝状態、および２．回収した痰中のＴＢバチルス（bacilli）が抗生物質に事前に曝されている（すなわち、患者が抗生物質を用いて経験的に既に治療されている）可能性である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、病原体を同定する方法および薬剤感受性を決定する方法は、同じマイクロアレイもしくはマイクロ流体デバイスにおいて、同時に、例えば同じサンプルで、または例えば、病原体のアイデンティティーを決定した後に、続けて実施し、薬剤感受性に適したアッセイを選択し実施する。
【００５２】
本明細書に記載する方法において有用な遺伝子およびプローブの例示的なセットは、ここに提示する表２中に提供される。
【００５３】
治療の方法
本明細書に記載する方法は、障害、例えば表１中に列挙する障害を治療するための方法を含むが、これに限定されない。一般に、これらの方法は、本明細書に記載する方法を使用して被験体からのサンプル中の病原体を同定すること、または、被験体中の病原体が感受性である１つの薬剤（または複数の薬剤）を同定すること、およびこのような治療を必要とする、またはこのような治療を必要とすると決定された被験体に、病原体を中和する治療用化合物を、治療有効量投与することを含む。この文脈で使用する「治療する（treat）」は、表１中に列挙する障害の１つと関係がある障害の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。例えばこれらの方法は、咳、胸の痛み、熱、疲労、予期せぬ体重減少、食欲不振、悪寒および寝汗をもたらすことが多いＴＢの治療を含み、したがって、治療はこれらの症状の低減をもたらすことができる。他の疾患の臨床症状は当技術分野でよく知られている。
【００５４】
「有効量」は、有益または望ましい結果を得るのに十分な量である。例えば治療量は、望ましい治療効果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発生を予防するのに必要な量である、予防有効量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１回または複数回の投与（administeration）、適用（application）または投薬（dosage）で施すことができる。組成物の治療有効量は、選択する組成物に依存する。組成物は、２日に１回を含めて、１日当たり１回または複数回から１週間当たり１回または複数回で投与することができる。組成物は、１ヶ月当たり１回または複数回から１年当たり１回または複数回で投与することもできる。当業者は、疾患または障害の重度、事前の治療、被験体の一般的な健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を非制限的に含めたいくつかの要因が、被験体を効率よく治療するのに必要な用量およびタイミングに影響を与える可能性があることを理解している。さらに、本明細書に記載する治療有効量の組成物を用いた被験体の治療は、１回の治療または一連の治療を含むことができる。
【００５５】
診断の方法
病原体を同定するおよび／またはその薬剤感受性を決定するための方法は本明細書に含まれる。方法は、被験体からサンプルを得ること、およびサンプル中の病原体の存在および／または薬剤感受性を評価すること、および１つまたは複数の参照、例えば非感染被験体または野生型病原体におけるレベルと存在および／または薬剤感受性を比較することを含む。ｍＲＮＡの存在および／またはレベルは本明細書に記載する方法を使用して評価することができ、これらは当技術分野で知られており、例えば定量イムノアッセイ法を使用する。いくつかの実施形態では、当技術分野で知られているハイスループット法、例えば遺伝子チップ（例えばCh.12、Genomics、in Griffiths et al、Eds.Modern Genetic Analysis、1999、W.H.Freeman and Company; Ekins and Chu、Trends in Biotechnology、1999、17:217-218; MacBeath and Schreiber、Science2000、289(5485):1760-1763; Simpson、Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003を参照）を使用してｍＲＮＡの存在および／またはレベルを検出することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、サンプルは、生物体液または固形物、例えば、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、子宮頸部／膣スワブ、胆汁液、胸膜液、腹膜液、または心膜液、または例えば骨生検、肝生検、肺生検、脳生検、リンパ節生検、食道生検、結腸生検、胃生検、小腸生検、心筋生検、皮膚生検、および洞生検（sinus biopsy）由来の組織生検サンプルを含む。いくつかの実施形態では、人が病原体、例えば表１中に列挙する病原体を有すること、または薬剤耐性病原体を有することを決定した後、次いで治療、例えば当技術分野で知られているまたは本明細書に記載する治療を施すことができる。
【００５７】
キット
本明細書に記載する遺伝子の領域とハイブリダイズするプローブを含むキットも本発明の範囲内であり、キットを使用して本明細書に記載する病原体を検出することができる。キットは、使用説明書、および他の試薬、例えば標識、またはプローブと標識を結合させるのに有用な作用物質を含めた、１つまたは複数の他のエレメントを含むことができる。使用説明書は、本明細書に記載する方法において治療に対する応答を予想するためのプローブの診断用途に関する説明書を含むことができる。他の説明書は、プローブと標識を結合させるための説明書、プローブを用いて分析を実施するための説明書、および／または被験体から分析するサンプルを得るための説明書を含むことができる。前に論じたように、キットは標識、例えばフルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、および３２Ｐおよび３Ｈなどの放射性同位体を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載する遺伝子の領域とハイブリダイズする標識プローブ、例えば本明細書に記載する標識プローブを含む。
【００５８】
キットは、病原体と関係がある同じ遺伝子または別の遺伝子またはその一部分とハイブリダイズする、１つまたは複数のさらなるプローブも含むことができる。さらなるプローブを含むキットは、標識、例えばプローブ用の１つまたは複数の同じまたは異なる標識をさらに含むことができる。他の実施形態では、キットと共に供給されるさらなる１つまたは複数のプローブは、標識された１つまたは複数のプローブであってよい。キットが１つまたは複数のさらなるプローブをさらに含むとき、キットはその１つまたは複数のさらなるプローブの使用説明書をさらに提供することができる。
【００５９】
自己試験で使用するためのキットも提供することができる。例えば、このような試験キットは、医療供給者の協力なしで、例えば痰、口腔細胞、または血液のサンプルを得るために被験体が使用することができる、デバイスおよび説明書を含むことができる。例えば、口腔細胞は、口腔スワブまたはブラシを使用して、または口内洗浄液を使用して得ることができる。
【００６０】
本明細書で提供するキットは、例えば研究室に、分析用サンプルを返却するために使用することができる、郵便物、例えば料金別納封筒または郵便小包も含むことができる。キットは１つまたは複数のサンプル用容器を含むことができ、またはサンプルは標準的な血液回収バイアル中に存在してよい。キットは、１つまたは複数の承諾書、試験依頼書、および本明細書に記載する方法中でのキットの使用法に関する説明書も含むことができる。このようなキットを使用するための方法も本明細書に含まれる。１つまたは複数の文書、例えば試験依頼書、およびサンプルを保持する容器は、サンプルを提供した被験体を同定するために、例えばバーコードでコードすることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、キットはサンプルを処理するための１つまたは複数の試薬を含むことができる。例えばキットは、サンプルからｍＲＮＡを単離するための試薬を含むことができる。キットは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡアンプリコンを検出可能に標識するための１つまたは複数の試薬も必要に応じては含有することができ、これらの試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素、１つまたは複数の検出可能に標識したｄＮＴＰ、または検出可能に標識したγホスフェートＡＴＰ（例えば３３Ｐ−ＡＴＰ）を含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、マイクロアレイ分析または発現プロファイルの結果を分析するためのソフトウエアパッケージを含むことができる。
【００６３】
本発明は以下の実施例中にさらに記載するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：病原体の同定
大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）。大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、およびエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）における特有コード配列を同定し（表２）、これらを使用してこれらの生物を陽性同定した（図３〜６）。臨床分離株は、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いで５マイクロリットルのそれぞれの培養液を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファー（ＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）に加え、５秒間攪拌した。次いで４マイクロリットルのそれぞれの溶解調製物を、溶解物に関する製造者の標準プロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で使用した。同定に関する基準は、平均バックグラウンド（他の２個の生物に関する全生物同定用プローブに関する平均カウント）の少なくとも２倍を超える、（緑膿菌（P.aeruginosa）またはクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）用の）全５個または（大腸菌（E.coli）用の）６個の生物同定用プローブに関するカウントであった。複製間で比較するため、カウントはｐｒｏＣのカウントに標準化した。表２中に記載する生物同定用プローブを使用して、４個の大腸菌（E.coli）臨床分離株を、６個の大腸菌（E.coli）遺伝子（ｆｔｓＱ、ｍｕｒＣ、ｏｐｇＧ、ｐｕｔＰ、ｓｅｃＡ、およびｕｕｐ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（図３）。２個の臨床分離株を、図４中に示すように５個の緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子（ｐｒｏＡ、ｓｌｔＢ１、ｎａｄＤ、ｄａｃＣ、およびｌｉｐＢ）用に設計したプローブを使用して、緑膿菌（P.aeruginosa）として正確に同定した。図５中に示すように、５個のクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子（ｌｒｐ、ｙｃｂＫ、ｃｌｐＳ、ｉｈｆＢ、およびｍｒａＷ）用に設計したプローブは、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）臨床分離株を陽性同定した。３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｐｒｏＣ、ｒｐｏＢ、およびｆａｂＤ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を陽性同定した（図６）。同定に関する分離基準（cut-off）は、ｒｐｏＢおよびｆａｂＤに関するカウントが、平均バックグラウンド（大腸菌（E.coli）、緑膿菌（P.aeruginosa）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）に関する全生物同定用プローブに関する平均カウント）の少なくとも２倍を超えるであることであった。
【００６５】
平均して、それぞれの生物に関する４〜５配列を大きなプールに含めて、望ましいレベルの特異性を得た。この技術を使用して、これら３生物のそれぞれを、粗製溶解物を直接プローブ処理することによって、検出し、同定し、無菌培養および８個のさらなるグラム陰性病原体を含む複合混合物において区別した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
【００６６】
ＴＢ。Ｒｖ１６４１．１およびＲｖ３５８３ｃ．１に対するプローブは結核菌（M.tuberculosis）において多量の転写産物を検出し（参照８）、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）、およびマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）においてオルソロガスな転写産物を検出し、したがってこれら３種のいずれかの検出に使用することができる。さらに、３個のＴＢ遺伝子（Ｒｖ１９８０ｃ．１、Ｒｖ１３９８ｃ．１、およびＲｖ２０３１ｃ．１）に対するプローブを使用して結核菌（M.tuberculosis）を差次的に同定することができる、すなわちそれらは、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）は検出しない。ＭＡＰ＿２１２１ｃ．１、ＭＡＶ＿３２５２．１、ＭＡＶ＿３２３９．１、およびＭＡＶ＿１６００．１に対するプローブを使用してマイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）を検出することはできるが、結核菌（M.tuberculosis）は検出しない。したがって、Ｒｖ１９８０ｃおよびＲｖ３８５３プローブを用いて最大感受性が得られ、一方Ｒｖ１９８０ｃ．１、Ｒｖ１３９８ｃ．１、およびＲｖ２０３１ｃ．１、およびＭＡＰ＿２１２１ｃ．１、ＭＡＶ＿３２５２．１、ＭＡＶ＿３２３９．１、およびＭＡＶ＿１６００．１に対するプローブは、結核菌（M.tuberculosis）感染とマイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）感染の間の区別を可能にする。
【００６７】
マイコバクテリウム（mycobacterium）属全体で保存されている遺伝子および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のみに特異的である遺伝子に対してプローブを設計した。ｐａｎ−マイコバクテリウムプローブは多種を認識したが、一方で結核菌（M.tuberculosis）プローブは非常に特異的であった（図２２Ｃ）。
【００６８】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）
表２に記載する生物同定用プローブを使用して、３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株を、５個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｉｌｅＳ、ｐｐｎＫ、ｐｙｒＢ、ｒｏｃＤ、およびｕｖｒＣ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（図３０）。同様に、３個のステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）分離株を、６個のステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）遺伝子（ｃｌｐＰ、ｄｎａＫ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＦ、ｓｄｈＡ、およびｓｅｃＤ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（表２および図３１）。
【００６９】
実施例２：方法の感度
図７〜１０中に示すように、本発明の方法は対象のそれぞれの病原体に特異的であり、臨床サンプル、例えば血液および尿中の１００個未満の細胞を検出する感度がある。
【００７０】
３病原体のそれぞれから単離したＲＮＡ（１ｎｇ）を２４遺伝子プローブセットでプローブ処理した（図７）。大腸菌（E.coli）遺伝子、左側、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子、中央、および緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子、右側。大腸菌（E.coli）ＲＮＡ、上部。クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）中央、および緑膿菌（P.aeruginosa）、底部。ｙ軸は、デジタル遺伝子発現技術を使用することによって検出した、それぞれの遺伝子に関するカウントの数を示す。それぞれの生物由来のＲＮＡは、それぞれの病原体の容易な同定を可能にする異なる発現シグネチャーを示す。
【００７１】
この２４遺伝子プローブセットを使用して、１０，０００細胞、１０００細胞、および１００細胞由来の粗製大腸菌（E.coli）溶解物をプローブ処理した（図８）。異なる大腸菌（E.coli）の発現シグネチャーは、１００細胞まで区別可能であった。
【００７２】
臨床サンプルはスパイクした尿および血液サンプル（spiked urine and blood sample）でシミュレートした。スパイクした尿サンプルでは、尿サンプルは尿１ｍＬ当たり１０５の大腸菌（E.coli）細菌でスパイクした。サンプルは４℃で一晩冷蔵し、次いで粗製細菌サンプルを溶解し、大腸菌（E.coli）を同定するためにグラム陰性細菌に使用した２４遺伝子プローブセットでプローブ処理した（図９Ａ、上図、および９Ｂ）。血液は１０００ｃｆｕ／ｍｌでスパイクし、これも２４遺伝子プローブセットで検出した（図９Ａ、下図）。
【００７３】
（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ臨床微生物学研究室から得た）緑膿菌（P.aeruginosa）の２個の臨床分離株を、グラム陰性細菌に使用した２４遺伝子プローブセットでプローブ処理して、その遺伝子セットが同じ細菌属の別の臨床菌株を同定することができることを実証した（図１０）。
【００７４】
尿サンプル中の大腸菌（Escherichia coli）の直接同定。大腸菌（E.coli）菌株Ｋ１２を、培養後期の対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いで細菌は、１００，０００ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度まで健常ドナー由来の尿試料に加えた（ＯＤ６００により推定）。次いで尿サンプルを０時間、４時間、２４時間、もしくは４８時間室温で放置し、または２４時間４℃に置いた。１ｍｌのスパイクした尿を１分間１３，０００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットは１００マイクロリットルのＬＢ培地に再懸濁した。細菌はＢａｃｔｅｒｉａ ＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理し、次いでイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファー（ＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。
【００７５】
患者尿試料のアリコートを直接アッセイして尿路感染症における大腸菌（E.coli）転写産物を検出した（図２２Ｄ）。生物の有無を評価する１つの測定基準に多数の転写産物からのシグナルを集めるために、それぞれのプローブからの加工していないカウントを対数変換し合計した。１７の大腸菌（E.coli）臨床分離株のセットに適用すると、それぞれの分離株は１３の非大腸菌（E.coli）サンプルのセットと容易に区別することができた（非大腸菌（E.coli）対照と比較してＺスコア＞６．５、図２２Ｅ）。
【００７６】
実施例３：病原体の薬剤感受性
大腸菌（Escherichia coli）におけるフルオロキノロンおよびアミノグリコシド耐性の確認（identification）。フルオロキノロンおよびアミノグリコシドへの曝露時の大腸菌（E.coli）に関する公開済みの発現アレイデータ（Sangurdekar DP、Srienc F、Khodursky AB.A classification based framework for quantitative description of large-scale microarray data.Genome Biol 2006;7(4):R32）を使用して、フルオロキノロンおよびアミノグリコシドへの曝露時に有意に下方または上方制御されると予想される遺伝子のセットを選択した。ｐａｎ感受性実験室菌株（Ｋ１２）、フルオロキノロン耐性臨床分離株１および２、およびゲンタマイシン耐性臨床分離株（Ｅ２７２９１８１およびＥＢ８９４９４０）を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。それぞれの培養物の２ｍｌアリコートを得て、抗生物質を８μｇ／ｍｌのシプロフロキサシンまたは１２８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの最終濃度までこれらのアリコートに加えた。培養物は３７℃で１０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。カウントはｐｒｏＣのカウントに標準化し、ここでもｐｒｏＣは実験間で最も比較可能であるようであった。それぞれの遺伝子に関する誘導倍率は、抗生物質曝露の有無の下でのカウントを比較することによって決定した。２個の耐性臨床分離株とそれを区別する薬剤感受性Ｋ１２菌株における誘導または抑制を示す、９プローブ（ｃａｒＡ、ｄｅｏＣ、ｆｌｇＦ、ｈｔｒＬ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｙｂｈＫ、ｕｕｐ、およびｆａｂＤ）からの明らかなシグナルが存在した（図１１）。第１０のプローブ、ｗｂｂＫは誘導も抑制もされず、遺伝子と発現変化に関する有用な比較をもたらした。同様に、８遺伝子に対するプローブは、これらの遺伝子は、薬剤感受性Ｋ１２菌株において、抑制状態（ｆｌｇＦ、ｃｙｓＤ、ｇｌｎＡ、またはｏｐｇＧ）誘導状態（ｆｔｓＱ、ｂ１６４９、ｒｅｃＡ、ｄｉｎＤ）のいずれかであり、２個の耐性臨床分離株とそれを区別することを示す（図１２）。
【００７７】
スタフィロコッカス（Staphylococcus）におけるメチシリン耐性の確認。６個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）臨床分離株を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いでそれぞれの培養物の２ｍｌアリコートを得て、クロキサシリンを２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。培養物は３７℃で３０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。２個の別個のプローブを使用して（表２）、ｍｅｃＡの発現をメチシリン耐性であることが知られている４個の分離株において確認した。対照的に、メチシリン感受性であることが知られている２個の分離株において検出可能なｍｅｃＡ発現はなく、クロキサシリンの不在下では最小のｍｅｃＡ発現であった（図１３）。
【００７８】
エンテロコッカス（Enterococcus）におけるバンコマイシン耐性の確認。４個のエンテロコッカス（Enterococcus）臨床分離株を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。２ｍｌアリコートを得て、バンコマイシンを１２８μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。培養物は３７℃で３０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。２個の別個のプローブを使用して（表２）、ｖａｎＡの発現をバンコマイシン耐性であることが知られている２個の分離株において確認した。対照的に、バンコマイシン感受性であることが知られている２個の分離株において検出可能なｖａｎＡ発現はなく、バンコマイシンの不在下では最小のｖａｎＡ発現であった（図１４）。４個の分離株のいずれにおいても検出可能なｖａｎＢ発現はなかった。
【００７９】
生物同定のための転写産物の検出以外に、可動性遺伝因子（mobile genetic element）にコードされる遺伝子の検出は、特定分離株に関する多くのゲノム詳細をもたらすことができる。例えば、スタフィロコッカス（Staphylococci）においてメチシリン耐性を与えるｍｅｃＡｍＲＮＡ、およびエンテロコッカス（Enterococci）においてバンコマイシン耐性を与えるｖａｎＡｍＲＮＡに関して、細菌分離株をプローブ処理した。いずれの場合も、ＭＲＳＡおよびバンコマイシン耐性エンテロコッカス（Enterococcus）（ＶＲＥ）の迅速な同定を可能にする関連転写産物を検出した（図２２Ｆ）。したがって、ＲＮＡの直接検出は、知られている耐性因子の検出を可能にし得る。さらに、このアプローチは、食物媒介病原体における水平的遺伝子間交流によって得られる病原性因子、すなわち、腸管出血性（Enterohemorrhagic）または志賀毒素産生性（Shigatoxigenic）大腸菌（E.coli）における志賀毒素などの、他の遺伝因子による分離株の区別を可能にする。
【００８０】
ＴＢにおける薬剤耐性の確認。２４遺伝子プローブセットを公開済みの遺伝子発現データから確認して、イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、およびフルオロキノロンを含めた異なる抗生物質への曝露時の薬剤感受性ＴＢの発現変化を確認することができる発現シグネチャーを確認した（図１５〜１８）。薬剤曝露後の誘導または抑制の程度は表３中に示す。
【００８１】
Ａ６０００．３における対数期の結核菌（M.tuberculosis）細胞を、４個の異なる薬剤（イソニアジド、０．４μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン、２μｇ／ｍｌ；オフロキサシン、５μｇ／ｍｌ；リファンピシン０．５μｇ／ｍｌ）の１つの存在下でインクウェル容器（１０ｍｌ体積、平行培養）中で増殖させた。薬剤処理開始後の示した時間で（図１５）、遠心分離（３０００×ｇ、５分間）により培養物を採取し、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁し、ビーズで刺激した（１００ｎｍガラスビーズ、最高速度、２回の１分間パルス）。クロロホルム（０．２ｍｌ）をサンプルに加え、６０００×ｇで５分間の遠心分離後、水相を分析用に回収した。
【００８２】
サンプルは１：１０に希釈し、製造者のプロトコールに従い表２中に記載するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブセットを使用して分析した。それぞれの転写産物の相対量を３個のハウスキーピング遺伝子（ｓｉｇＡ、ｒｐｏＢ、およびｍｐｔ６４）の平均カウントに標準化することによって最初に計算し、次いでデータは、未処理対照由来のサンプルに対する倍率変化としてプロットする。ボックスは、薬剤特異的誘導の以前の痕跡に基づいて選択したプローブを示す（Boshoff et al、J Biol Chem.2004、279(38):40174-84.)。
【００８３】
薬剤耐性ＴＢ菌株は、イソニアジドへの曝露時に発現シグネチャーの誘導を明らかに示す薬剤感受性菌株とは対照的に、イソニアジドへの曝露時に発現シグネチャー誘導を示さない（図１６）。イソニアジド感受性と耐性のＴＢ菌株を比較する３個のスキャッタープロットを図１６中に示し、それぞれのドットは２４遺伝子プローブの１つを表す。軸はデジタル遺伝子発現技術（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標））によって測定した転写産物の数を表す。左−薬剤処理の不在下でのイソニアジド耐性菌株とイソニアジド感受性菌株における発現の比較。中央−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド感受性菌株（drug treated vs. drug untreated isoniazid sensitive strain）における発現の比較。右−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド耐性菌株における発現の比較。
【００８４】
異なる遺伝子のセットを、図１７中に示すように薬剤に応じて、薬剤感受性結核菌（M.tuberculosis）において誘導する。薬剤感受性と薬剤耐性の結核菌（M.tuberculosis）の転写応答。（Ａ）本明細書に記載するようにＩＮＨ（０．４μｇ／ｍｌ）で処理した菌株Ａ５０（ＩＮＨ−Ｒ）。（Ｂ）ＳＭ−ＲクローンＳ１０は２μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで処理した。差次的遺伝子誘導をＴＢ２４遺伝子プローブセットのデジタル遺伝子発現により測定して確かなシグネチャーを明らかにすることができ、薬剤感受性を確認することができる（図１８）。
【００８５】
３個のハウスキーピング遺伝子、ｍｐｔ６４、ｒｐｏＢ、およびｓｉｇＡを標準化に使用した。それぞれの実験サンプル用に、実験遺伝子に関する加工していないカウントはこれら３個のハウスキーピング遺伝子の加工していないカウントの平均に標準化し、対照遺伝子に対する多量の試験遺伝子の指標を与えた。誘導または抑制は、非薬剤曝露サンプルと比較した、薬剤曝露サンプルにおけるこれらの標準化カウントの変化として定義する。この方法を使用して、以下の遺伝子は、イソニアジド、リファンピン、フルオロキノロン、およびストレプトマイシンへの曝露後に薬剤感受性ＴＢにおいて誘導または抑制されることが分かった。
【００８６】
イソニアジド：薬剤依存性誘導用：ｋａｓＡ、ｆａｄＤ３２、ａｃｃＤ６、ｅｆｐＡ、およびＲｖ３６７５．１。
リファンピン：薬剤依存性誘導用：ｂｉｏＤ、ｈｉｓＩ、ｅｒａ、およびＲｖ２２９６。
フルオロキノロン：薬剤依存性誘導用：ｒｐｓＲ、ａｌｋＡ、ｒｅｃＡ、ｌｔｐ１、およびｌｈｒ、薬剤依存性抑制用：ｋａｓＡおよびａｃｃＤ６。
ストレプトマイシン：薬剤依存性誘導用：ＣＨＰ、ｂｃｐＢ、ｇｃｖＢ、およびｇｒｏＥＬ。
【００８７】
実施例４：デジタル遺伝子発現および分子バーコードを使用した、薬剤感受性および耐性のＴＢを同定するための表現型発現シグネチャーベースの試験
この実施例は、痰中のＴＢの診断および耐性プロファイルの迅速な決定のための、表現型発現シグネチャーベースの試験を記載する。この方法は、バーコード化対分子プローブ（barcoded, paired molecular probe）のプローブセットの作製によって、その発現プロファイルがＴＢを独自に検出して薬剤耐性と感受性の菌株を区別する遺伝子の検出に基づく。遺伝子の選択は、無菌培養（複製と非複製状態の両方）におけるＴＢ、細胞培養マクロファージにおけるＴＢ、および痰においてスパイクしたＴＢを含めた様々な増殖条件下でマイクロアレイを使用して得た発現プロファイルデータの、バイオインフォマティクスによる解析によって決定した。
【００８８】
Ａ．ＴＢを同定するためのシグネチャーの定義
複製と非複製のＴＢの両方由来のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする分子プローブセットを確認している。これらのプローブは、全増殖条件下に多量に存在し、全ＴＢ菌株中で保存されるｍＲＮＡに特異的である。１６ＳｒＲＮＡ（Ａｍｐｌｉｃｏｒ、Ｒｏｃｈｅ）またはＩＳ６１１０領域（Ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ）を認識するＴＢを確認するための特有ＤＮＡ配列は以前に定義されているが、これらの定義された領域は、デジタル遺伝子発現におけるシグネチャーに必要とされる最適特性を有していない。１６ＳｒＲＮＡは、その長さのため低レベルの遺伝的変異性に耐え得る５０塩基オリゴマー遺伝子プローブを使用して、異なる種間で区別可能であったマイコバクテリア種間で十分分岐していない。ゲノムのＩＳ６１１０領域は、全増殖条件下においてそれがＴＢを同定するための確かなシグナルとして使用することができるほど十分高いレベルでは発現されない。したがって、他のマイコバクテリア種由来のＴＢの同定を可能にする発現シグネチャーを記載する。
【００８９】
ｉ．保存型ＴＢ遺伝子に関するバイオインフォマティクスによる遺伝子解析。 他のマイコバクテリア種に優るＴＢの検出に特有の発現シグネチャーを定義している。一般に、シグネチャーに含めるのに最適な遺伝子は、１．感度を増大するために高い発現レベル（高いｍＲＮＡコピー数）を有すること、２．全ＴＢ菌株中で高度に保存されていること、および高度に保存された配列を有すること、ならびに３．全ての他のマイコバクテリア種よりＴＢゲノムに非常に特異的であることの基準を満たす。このような遺伝子は、全ての他の配列決定済みマイコバクテリア種（すなわち、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（M.avium-intracellulaire）、マイコバクテリウム・カンサシ（M.kansaii）、マイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）、マイコバクテリウム・アブセサス（M.abscessus））中に存在しない利用可能なＴＢゲノムにおける保存型遺伝子のバイオインフォマティクスによる解析を使用して同定した。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで配列決定された臨床分離株由来の４０を超えるＴＢゲノムが分析のために利用可能である。
【００９０】
ｉｉ．候補遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現プロファイル分析。 痰中のＴＢバチルス（bacilli）を検出するための分子プローブの選択に関する第二の基準は、それらが非常に多量で安定状態のｍＲＮＡとハイブリダイズして最高感度をもたらすことである。このようなｍＲＮＡは、必須ハウスキーピング遺伝子に対応すると予想される。Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｔｂｄｂ．ｏｒｇ）で作成されたデータベース中の既存の公に入手可能な発現データのバイオインフォマティクスによる解析と、複製許容可能（対数増殖）および炭素枯渇、静止期、および低酸素により誘導される非複製条件下での候補遺伝子の高レベルの発現を確認するための発現プロファイリングを使用したＴＢ菌株Ｈ３７Ｒｖに関する実験発現プロファイルの組合せを使用して、遺伝子が選択されている。Ｈ３７Ｒｖに関する発現プロファイリング実験を、確立しているＴＢの炭素枯渇モデル（７Ｈ９／チロキサポール中で５週間枯渇）、静止期増殖、および嫌気的増殖に関するＷａｙｎｅモデル（密封チューブ中でゆっくり攪拌する培養）を使用して実施する。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること、および配列決定を使用してｃＤＮＡ分子をカウントすることによって、Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を使用して発現プロファイルを決定する。発現レベルを確認するためのこの定量法は、マイクロアレイデータよりデジタル遺伝子発現を使用して得られるレベルを反映する可能性が高く、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍで確立された方法である。レーン当たり７５ｂｐリードおよび１０００万リードとして配列決定レーン当たり１２サンプルを多重化することができる。
【００９１】
ｉｉｉ．ＴＢを同定するための発現シグネチャーのプローブ選択。 デジタル遺伝子発現技術は２個の５０ヌクレオチドプローブと対象のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションに基づくので、遺伝子中の２個の５０塩基対領域は、非特異的ハイブリダイゼーションを最小にするためゲノム内に特異的であり、配列決定したＴＢゲノムから証明される最小多型を含有する（Ａｉ）および（Ａｉｉ）から同定する。プローブはバイオインフォマティクスにより選択して、５℃の融解温度範囲内、最小ｍＲＮＡ二次構造に適合させる。プローブは（多数の菌株、すなわちＨ３７Ｒｖ、ＣＤＣ１５５１、Ｆ１１、Ｅｒｄｍａｎを含めた）複製および非複製ＴＢ、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（M.avium-intracellulaire）、マイコバクテリウム・カンサシ（M.kansaii）、およびマイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）から単離したｍＲＮＡに対して試験して、利用可能な技術を使用してプローブセット全体の特異性を確認した。プローブはこれら他のマイコバクテリア種用に選択することができ、これらによって痰由来のこれらの病原体の同定も可能にする。イントラセルラーレ・バチルス（intracellular bacilli）を同定する能力をマクロファージ感染モデルで試験して、宿主ｍＲＮＡの存在下でＴＢｍＲＮＡを検出する能力を実証する。最後に、アッセイの感度を、試験サンプル中のＴＢバチルス（bacilli）（したがって細胞溶解物中に存在するｍＲＮＡ）の数をタイトレーションする（titrating down）ことによって決定する。デジタル遺伝子発現を使用する全ての実験は、同じ遺伝子セットに対して定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認する。セットの改良および精錬は反復式に行う。
【００９２】
Ｂ．感受性ＴＢと耐性ＴＢを区別するためのシグネチャーの定義
薬剤感受性と耐性の菌株を区別するプロファイルを得ることができる、それぞれ個々のＴＢ用薬剤への曝露時に特異的に誘導されるｍＲＮＡとハイブリダイズする分子プローブのセットが同定されている。イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン、およびモキシフロキサシンへの曝露に関するシグネチャーが決定されている。
【００９３】
シグネチャーに含めるのに理想的な遺伝子に関する前述の特性（すなわち、ＴＢ菌株中で保存されていること、ＴＢゲノムに特異的であること）に加えて、いくつか他の特性が薬剤耐性のシグネチャーに関する遺伝子選択において優先される。薬剤耐性は薬剤感受性と薬剤耐性の菌株における転写産物誘導間の差によって決定されるので、理想的な遺伝子候補は所与の薬剤への曝露時に薬剤感受性菌株において高度に誘導される。これらの遺伝子は、初期に早急に誘導されるのが理想的である。この時間期間は、かなりの程度で診断試験全体の迅速性を決定するからである。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用したデータに基づいて、わずか１〜２時間以内に薬剤曝露に対する転写応答を観察する（図１９）。ｍＲＮＡ分子の半減期を考慮すると、遺伝子抑制ではなく遺伝子誘導の利用がより迅速で検出可能な応答をもたらす。
【００９４】
イソニアジドおよびストレプトマイシンに関する記載した全ての実験に関して、野生型、完全薬剤感受性Ｈ３７Ｒｖと比較するために使用する単剤耐性菌株のセット（a set of singly resistant strain）を作製したＢＳＬ３設定で、ＴＢ菌株Ｈ３７Ｒｖを使用した。リファンピンが研究室における感染という予期せぬ事象における治療オプションであることを確実にするために、増殖にリシンおよびパントテン酸の添加を必要とするＴＢの栄養要求株（ｌｙｓＡ、ｐａｎＣ）においてリファンピン耐性変異体を作製する。
【００９５】
最後に、任意または全ての抗生物質に対する一般的なストレス応答ではなく、それぞれの抗生物質に特有であるシグネチャーを同定している。この特異性の理論的根拠は、臨床設定で、多くの患者は異なる抗生物質で経験的に既に治療されており、したがっていくつかの一般的なストレス応答が、痰サンプル中のバチルス（bacilli）において既に活性化されている可能性があることである。しかしながら、試験および分析で薬剤特異的応答は保たれる。
【００９６】
ｉ．抗生物質に対する曝露に応答した発現プロファイリング。 薬剤感受性と耐性の菌株Ｈ３７Ｒｖにおける転写応答を区別する候補遺伝子を同定するための発現プロファイリングを実施する。痰中のバチルス（bacilli）の複製状態または転写活性は知られていないので、（５週間の炭素枯渇モデルによって誘導した）非複製状態のバチルス（bacilli）において追加的実験を実施する。薬剤曝露に次いで応答し得るいくらかの基底転写（basal transcription）を刺激するために、非複製状態のバチルス（bacilli）が富栄養培地（７Ｈ９／ＯＡＤＣ）中での短時間（ｔ１）の「増殖刺激」を必要とするかどうか決定する（図２０）。薬剤感受性と耐性の菌株を区別するための確かなシグネチャーおよび最適薬剤濃度を得るための薬剤曝露に必要とされる最適時間期間（ｔ２）も決定して、確かな、再現可能な応答を得る。これらの実験は、個々の抗生物質のそれぞれについて実施する。
【００９７】
完全非複製状態は、痰中のバチルス（bacilli）が非複製状態、休眠状態である場合の、「最悪のシナリオ」（すなわち、必要とされ得る最長の時間）である。実際、患者の痰中のバチルス（bacilli）からの発現プロファイリングを調べた刊行物に基づくと、発現プロファイリングが痰中のバチルス（bacilli）から直接得られたとして、この時間は必要とされる場合は必ず非常に短い。（特に、この刊行物のデータを分析中にさらに取り込んで、痰中の細菌において考えられる遺伝子候補への最初の見通しをもたらす。）プロファイリング実験のマトリックス（a matrix of profiling experimants）を実施し、それぞれのｔ１に関して０、１、および２時間からリッチ７Ｈ９／ＯＡＤＣ培地への曝露時間（ｔ１）、およびそれぞれの抗生物質への曝露時間（ｔ２）を変える。ｔ１とｔ２のそれぞれのセットに関して、抗生物質濃度をそれぞれの抗生物質に関して、感受性と耐性のＨ３７Ｒｖ菌株の両方に関して１×、３×、および５×最小阻害濃度（ＭＩＣ）から変えて、最適パラメーターを決定する。発現プロファイリングを使用して、確かな、再現可能なプロファイルを生成するのに最適な条件を同定する。
【００９８】
最適条件（ｔ１およびｔ２）に基づいて、発現プロファイリングをこれらの条件下で薬剤感受性および耐性のＨ３７Ｒｖ菌株において実施する。バイオインフォマティクスによる解析を実施して、誘導のレベルが薬剤耐性菌株と比較して薬剤感受性菌株において高い各薬剤に関して遺伝子を同定する（抑制のレベルが薬剤耐性菌株と比較して薬剤感受性菌株において高いリファンピン以外）。発現のレベルを薬剤感受性と薬剤耐性の菌株の間で比較し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
【００９９】
ｉｉ．薬剤耐性を確認するための解析アルゴリズムの開発。 最適アルゴリズムを決定して、（標準ＭＩＣ測定によって定義される）感受性と耐性の菌株を区別する遺伝子セットに関する発現率を分析する。この方法の長所の１つは大部分の例（すなわち、ＴＢ抗生物質に事前に曝露されていない例）に関するものであり、所与の抗生物質に曝露した菌株と曝露していない同じ菌株の間で遺伝子発現レベルの比較を行うことができる。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１．抗生物質への曝露なし、２．イソニアジドへの曝露、３．リファンピンへの曝露、４．エタンブトールへの曝露、５．ストレプトマイシンへの曝露、および６．モキシフロキサシンへの曝露を含む条件下でＨ３７Ｒｖ由来のｍＲＮＡレベルを測定する。抗生物質への曝露後の所与の遺伝子からの発現のレベルは、定常状態のハウスキーピング遺伝子のセット（すなわち、ハウスキーピング遺伝子の転写を刺激する主なシグマ因子をコードするｓｉｇＡ、およびＲＮＡポリメラーゼの合成サブユニットをコードするｒｐｏＢ）からの発現のレベルに標準化し、抗生物質への曝露の不在下での同じ遺伝子の発現の同じ標準化レベルと比較する。標準感受性菌株と耐性対照菌株の比較も行う（図２１）。理想としては、特定薬剤への曝露は、薬剤感受性菌株において高レベル、Ａ＞＞Ｂ、一方で薬剤曝露に対して感受性がない薬剤耐性菌株に関して、Ａ＝Ｂの遺伝子発現を誘導する。（リファンピンの機構、すなわちＡ＝Ｃ＜＜Ｂ＝Ｄを考慮して、最も短い半減期を有するｍＲＮＡの遺伝子抑制を検出する、リファンピンに関しては例外である。）転写レベルの広いダイナミックレンジのため、Ｃ／Ｄの比が最大であり、したがって感受性と耐性の菌株の明白で確かな区別を可能にする遺伝子を選択する。さらに、他の抗生物質を用いて誘導される応答の重複がないように、それぞれ個々の抗生物質に関して、最適な、独自の遺伝子セットを選択している。
【０１００】
ｉｉｉ．ＴＢバチルス（bacilli）のシグネチャーに対する事前の抗生物質に対する曝露の影響の解析。 患者を抗生物質で事前に治療した場合においても耐性パターンを確認するための、これらのシグネチャーの有効性を測定するために、薬剤感受性および耐性のＴＢバチルス（bacilli）（複製、非複製、マクロファージ内）を、この試験の適用前にＴＢ特有の設定で患者に施すことができる一般的な抗生物質である、アモキシシリン、セファロスポリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびエリスロマイシンに事前に曝す。現在のＴＢ薬剤の異なる組合せへのＴＢバチルス（bacilli）の事前の曝露をさらに実施して、このような事前の曝露が、このような応答を検出する問題の転写応答能力にも干渉するかどうか決定する。独自のシグネチャーが保たれ、したがって耐性を決定する問題の能力は妨害されないはずである。対象の遺伝子のセットの遺伝子発現レベルは定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定する。
【０１０１】
ｉｖ．耐性プロファイルを確認するための発現シグネチャーのプローブ選択。
Ｓｕｂ−ａｉｍ Ｂｉにおいて得たデータに基づいて、抗生物質への曝露に対する転写応答に関するシグネチャーをもたらす候補遺伝子のセットを選択する。ＴＢゲノム中で高度に保存された領域内の、それぞれの遺伝子に関する２個の５０塩基対領域を選択する。プローブはバイオインフォマティクスにより選択して、５℃の融解温度範囲内、最小ｍＲＮＡ二次構造に適合させる。これらのプローブを使用して、最初に複製または非複製状態である無菌培養中のバチルス（bacilli）、本発明者らが現在研究室に有する細胞培養マクロファージ感染モデル中のイントラセルラーレ・バチルス（intracellular bacilli）、および異なる抗生物質の組合せに事前に曝した細菌を含む、前に記載した条件下で利用可能な技術を使用して、薬剤感受性と耐性の菌株を比較する。全ての結果は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって得たデータと比較する。セットの改良および精錬は反復式に行う。
【０１０２】
Ｃ．分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現用のサンプル処理の最適化。
発現シグネチャーを確認するためのプローブセットの定義に加えて、第二の大きな課題は、サンプルの処理を最適化して、サンプル内に存在するバチルス（bacilli）からのデジタル遺伝子発現を測定することである。ＴＢ症例の大部分は肺が発端であり、処理するサンプルの大部分は患者の痰であるので、感染ＴＢバチルス（bacilli）からｍＲＮＡ測定値を得るための痰サンプルの処理を最適化する。（抗生物質で治療されていない）健常な、非感染患者から回収した痰を、複製または非複製（炭素枯渇）状態のいずれかであるＴＢバチルス（bacilli）でスパイクした、スパイク痰モデルを使用する。対処すべき問題としては、様々な粘性の痰の処理、痰サンプル内のＴＢバチルス（bacilli）の効率よい溶解が挙げられる。デジタル遺伝子発現の主な利点の１つは、粗製細胞溶解物、固定組織サンプル、全血および尿中の細胞、ダニ（tick）の粗製溶解物由来の細胞、および４００ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン（ＧＩＴＣ）、ポリアクリルアミド、およびトリゾールを含有するサンプルを含めた非常に粗製状態のサンプルにおいて、ｍＲＮＡがそのそれぞれのプローブとハイブリダイズする能力である。したがって一次適用は、痰内の細菌の溶解後に精製ステップが必要とされないことを示唆する。全血、尿、または固定組織サンプルからの精製は必要とされていないからである。唯一の要件は、プローブとｍＲＮＡの間の接触を可能にする十分な混合である。
【０１０３】
これらの実験用に、非感染状態の痰をＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）の試料バンクから得る。試料バンクは、ＢＷＨ病理部のＬｙｎ Ｂｒｙ、ＭＤ、ＰｈＤにより管理されるＩＲＢ制御機関である。廃棄用の痰は、研究室内で全ての処理が終了した後に得る（一般に回収の１２〜２４時間以内）。事前の４８時間以内にいかなる抗生物質も与えていない被験体のみから、痰を回収する。全てのサンプルが確認されるわけではないので、保護された健康情報は得られない。試料研究室の現在の負担に基づいて、必要な量の痰（２５〜５０ｍＬ）を数週間以内に得る。
【０１０４】
ｉ．痰の処理。 痰サンプルは細菌量、コンシステンシー、および粘性が様々である。いくつかのアプローチを試験して、細菌が培地条件で殺菌レベルの抗生物質と接触する迅速性、およびハイブリダイゼーション用のオリゴマープローブへの曝露を最大にする。無処理、注射針を介した痰の移動、リゾチームおよび／またはＤＮａｓｅ、嚢胞性線維症患者由来の痰を処理するために標準的に使用されるＳｐｕｔａｌｙｓｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；０．１％ＤＴＴ）を用いた処理、またはある最小変性剤（すなわちＧＩＴＣ）へのサンプルの単純な希釈を含めた、痰を処理するいくつかの方法を使用する。痰はＨ３７Ｒｖでスパイクし、その粘性を変えるための様々な方法によって処理し、それらを実施して任意のこれらの方法がこの技術に干渉するかどうか決定する。
【０１０５】
ｉｉ．ＴＢバチルス（bacilli）でスパイクした痰中の細菌溶解。 細菌細胞を効率よく溶解するため、転写および酵素ベースのｍＲＮＡ分解を抑制するため、およびｍＲＮＡをプローブにアクセス可能にするための、いくつかのアプローチをアッセイ中で使用する。痰中の細菌の転写応答を調べた以前の試験は、サンプルにＧＴＣまたは類似の試薬を最初に加えて転写応答を抑制した。次いで遠心分離を使用して、ＧＴＣ処理後に痰サンプル由来の細菌を濃縮することができる。マイコバクテリア（mycobacteria）の溶解は一般に、物理的手段、すなわち０．１ｍｌのガラスまたはジルコニウムビーズを用いた均質化によって実施する。このような物理的手段を利用して処理した痰内の細菌を破壊し、ＴＢバチルス（bacilli）検出用に１Ａから設計したプローブセットを使用して、非感染ヒト痰にスパイクしたバチルス（bacilli）を分析する。
【０１０６】
他の方法を、ファージ溶解を含めた、現場ベースの考慮事項により影響を受ける可能性がある溶解に使用する。ファージ、またはより最適には、精製ファージリシン（１つまたは複数）の添加によって、細菌溶解のための、低コストの、単純で、かつ非電気的な選択肢をもたらすことができる。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ研究室（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、ペプチドグリカンを酵素的に加水分解し浸透圧溶解をもたらす精製バクテリオファージリシンを使用した、いくつかのグラム陽性種の迅速で完全な溶解を近年実証している。Ｈａｔｆｕｌｌ研究室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）は、数種の溶解性マイコバクテリオファージ由来のＬｙｓＡ酵素の活性を特徴付けるため、およびその性能を最適化するために現在作業している。精製リシンの不在下で、調査を実施して、高ＭＯＩ感染のＴＢおよびＤ２９などの溶解性バクテリオファージが痰中のＴＢを効率よく溶解することができるかどうかを決定する。どのようにしてこの手法が細菌の転写プロファイルに影響を与えるかは、現在明らかではない。それはおそらく、ファージの結合、進入、および二次溶解性を妨害し得る変性剤の不在下で起こる必要があるからである。マイコバクテリオファージＴＭ４は、ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を有する構造タンパク質Ｔｍｐをさらに発現し、このためそれを高ＭＯＩでの細胞溶解の迅速な手段として使用することができる。溶解後、内因性ＲＮＡｓｅ活性を不活性化するＧＩＴＣ、ＲＮＡｌａｔｅｒ、または他の試薬でｍＲＮＡを安定状態にする。
【０１０７】
実施例５：
細菌および真菌培養： 大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、緑膿菌（P.aeruginosa）、プロビデンシア・スチュアリティ（Providencia stuartii）、プロテウス・ミラビリス（P.mirabilis）、霊菌（S.marcescens）、エンテロバクター・アエロゲネス（E.aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（E.cloacae）、モルガネラ・モルガニー（M.morganii）、クレブシエラ・オキシトカ（K.oxytoca）、カンジダ・フロインディ（C.freundii）、またはカンジダ・アルビカンス（C.albicans）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。混合実験用に、ＯＤ６００によって決定した等数の細菌をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）分析用に溶解前に組み合わせた。マイコバクテリウム（Mycobacterium）分離株は、以下に記載するように採取または抗生物質への曝露まで、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９培地中で対数増殖中期まで増殖させた。
【０１０８】
耐性実験室細菌菌株の誘導： 大腸菌（E.coli）実験室菌株Ｊ５３および定義済みｇｙｒＡフルオロキノロン耐性染色体変異体（ｇｙｒＡ１−Ｇ８１Ｄ；ｇｙｒＡ２−Ｓ８３Ｌ）を、Ｈｏｏｐｅｒ ｌａｂ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡから得た。プラズマ媒介性キノロン耐性決定基（ｏｑｘＡＢ、ｑｎｒＢ、ａａｃ６−Ｉｂ）は、これらのプラスミドを含有することが以前に決定された臨床分離株から精製した。大腸菌（E.coli）親菌株Ｊ５３をこれらのプラスミドで形質転換し、それらの存在はＰＣＲによって確認した。
【０１０９】
ウイルスおよびプラスモジウム（plasmodium）感染： ＨｅＬａ細胞（１×１０６）、２９３Ｔ細胞（２×１０５）、およびヒト末梢血単球（５×１０５）を、示したＭＯＩで、それぞれＨＳＶ−１菌株ＫＯＳおよびＨＳＶ−１菌株１８６Ｓｙｎ＋、インフルエンザＡ ＰＲ８、またはＨＩＶ−１ＮＬ−ＡＤＡに感染させた。主要赤血球細胞（５×１０９）は、それらが示したレベルの寄生虫血症に達するまで、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）菌株３Ｄ７に感染させた。示した時間で、細胞はＰＢＳで１回洗浄し採取した。
【０１１０】
抗生物質への曝露： 大腸菌（E.coli）または緑膿菌（P.aeruginosa）の培養物をＬＢ中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。次いで培養物を２つのサンプルに分け、その１つは抗生物質で処理した（大腸菌（E.coli）、１０分間：シプロフロキサシン４〜８μｇ／ｍｌまたは３００ｎｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン６４または１２８μｇ／ｍｌ、またはアンピシリン５００μｇ／ｍｌ；緑膿菌（P.aeruginosa）、３０分間：シプロフロキサシン１６μｇ／ｍｌ）。処理部分と未処理部分の両方を２００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃に維持し、黄色ブドウ球菌（S.aureus）またはエンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）の培養物をＬＢ中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。次いで培養物は、３０分間それぞれクロキサシリン（２５μｇ／ｍＬ）またはバンコマイシン（１２８μｇ／ｍＬ）に曝した。
【０１１１】
結核菌（M.tuberculosis）の培養物を対数増殖中期まで増殖させ、次いで０．２のＯＤ６００に標準化した。２ｍｌのそれぞれの培養物を、無抗生物質または以下の（最終濃度の）：イソニアジド０．２〜１．０μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン５μｇ／ｍｌ、リファンピシン０．５μｇ／ｍｌ、またはシプロフロキサシン５μｇ／ｍｌの１つのいずれかで処理した。プレートは密封し、攪拌せずに３または６時間インキュベートした。次いで溶解物を作製し、表６中に列挙するプローブを使用して、前に記載したように分析した。
【０１１２】
サンプル処理： グラム陰性分離株に関して、５〜１０μｌの培養物を１００μｌのＲＬＴバッファーに直接加えて攪拌した。臨床試料に関して、大腸菌（E.coli）菌尿路感染症を有することが臨床研究室によって決定された患者由来の２０μｌの尿は、１００μｌのＲＬＴバッファーに直接加えた。マイコバクテリア（mycobacteria）に関して、１．５ｍｌの培養物を遠心分離し、次いでビーズ刺激による機械的破壊有りまたは無しでＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、初期水相を分析用に回収した。ウイルスおよび寄生虫のＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌおよびクロロホルムを使用して同様に調製した。全ての溶解物に関して、標準的なＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールに従い３〜５μｌをハイブリダイゼーションにおいて直接使用した。加工していないカウントをサンプル用の全プローブの平均に標準化し、それぞれの遺伝子に関する誘導倍率は抗生物質処理サンプルと未処理サンプルを比較することにより決定した。
【０１１３】
生物同定用プローブの選択： 生物の差次的検出用のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを選択するため、関連生物の全ての公に入手可能な配列決定ゲノムを比較した。その種の全ての配列決定ゲノムに関するＣＤＳ長の少なくとも７０％にわたり少なくとも５０％の同一性を有するコード配列（ＣＤＳ）を選択することによって、各種内で保存された遺伝子を同定した。ＣＤＳは重複５０量体に破壊し、試験中に種内で完全に保存され任意の多種中のＣＤＳと５０％を超えない同一性を有する５０量体のみを保持した。遺伝子発現オムニバスにおいて入手可能な公開済みの発現データを概観し、大部分の条件下で十分な発現がある遺伝子を選択した。特有の結核菌（M.tuberculosis）プローブを同定するために、公開済みのマイクロアレイデータを使用して、２クラス：結核菌（M.tuberculosis）複合体に特有な遺伝子（ＢＬＡＳＴＮを使用した非冗長データベースにおいて任意の他の遺伝子と７０％を超える同一性、全ての入手可能な結核菌（M.tuberculosis）およびマイコバクテリウム・ボビス（M.bovis）ゲノム中で保存されている）、および結核菌（M.tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）、およびヨーネ菌（M.paratuberculosis）を含めた臨床上関連があるマイコバクテリア（mycobacteria）のセット中で８５％を超える同一性を有する遺伝子の１つの範疇に入る高度に発現された遺伝子を同定した。カンジダ・アルビカンス（C.albicans）用プローブを、そのプローブセット中に含まれた１０のさらなる病原体生物の完全ゲノムと比較して特有な、カンジダ・アルビカンス（C.albicans）ゲノムの５０量体セグメントに対して設計した。ウイルス用プローブは、同じファミリー内のウイルス間（すなわち、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の間）で低度に保存されたウイルス（すなわち、全てのＨＳＶ−２またはＨＩＶ−１分離株）内で高度に保存された遺伝子に対して設計した。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）用プローブは、寄生虫の生活環の血液段階（blood stage）のそれぞれで多量に発現された遺伝子に対して設計した。全てのプローブをスクリーニングしてヒトＲＮＡとのクロスハイブリダイゼーションを回避した。
【０１１４】
プローブセット： グラム陰性生物の同定用に、大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、および緑膿菌（P.aeruginosa）用プローブを含有するプールしたプローブセットを使用した。マイコバクテリウム（mycobacterial）生物の同定用に、特に結核菌（M.tuberculosis）種特異的プローブおよびより広範囲のマイコバクテリウム（mycobacterial）属用プローブが、微生物病原体に対するより広範囲のプローブセットであった。
【０１１５】
応答の有無を測定するために、様々な抗菌剤への曝露時に差次的に制御される遺伝子用にプローブを設計した（Sangurdekar et al、Genome Biology 7、R32(2006); Anderson et al、Infect.Immun.76、1423-1433、(2008); Brazas and Hancock、Antimicrob.Agents Chemother.49、3222-3227、(2005)）。シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、またはアンピシリンに野生型大腸菌（E.coli）Ｋ−１２を１０〜３０分間曝した後、それぞれの抗生物質に関する薬剤感受性発現シグネチャーを同時に定義する転写レベルの予想された変化を観察した（図２３Ａおよび２３Ｂ、表７）。これらのシグネチャーは対応する耐性菌株では誘導されなかった（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０１１６】
表現型試験の確立した方法は数週間〜数ヶ月を要するので、迅速な表現型による薬剤感受性試験は、結核において特に顕著な影響を与える可能性がある（Minion et al、Lancet Infect Dis 10、688-698、(2010)）。抗結核薬イソニアジド、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンに応答した発現シグネチャーによって、３〜６時間の抗生物質への曝露後に感受性と耐性の分離株を区別することができた（図２３Ｃ）。転写プロファイルにおけるいくつかの遺伝子は機構特異的である（すなわち、シプロフロキサシンに関してｒｅｃＡ、ａｌｋＡ、およびｌｈｒ、ストレプトマイシンに関してｇｒｏＥＬ、およびイソニアジドに関してｋａｓＡおよびａｃｃＤ６）。他の遺伝子、特にミコール酸合成または中間代謝と関係がある遺伝子は、多数の抗生物質に応答して下方制御され、増殖から損傷修復へのシフトを示す。
【０１１７】
これらの複合応答を、感受性と耐性の菌株を区別するための、１つの定量的測定基準にまとめるために、各実験サンプルから、対照抗生物質感受性サンプルの中心からの発現応答の平均二乗距離（ＭＳＤ）の測定基準を利用した。抗生物質感受性菌株は密集し、したがって小さいＭＳＤを有する。逆に抗生物質耐性菌株は、より大きな値、平均的感受性菌株と同様の形式で抗生物質に応答しなかった多数の遺伝子の結果を有する。ＭＳＤは、標準偏差、大腸菌（E.coli）（図２４Ａ、２４Ｂ、２７、および２８）または結核菌（M.tuberculosis）（図２４Ｃおよび２９）の感受性分離株の平均範囲内のサンプルの数を示す、点の（dimensionless）Ｚスコアとして報告される。
【０１１８】
発現プロファイルは遺伝子型ではなく表現型を反映するので、様々な機構によって媒介される耐性は、１つの統合された発現シグネチャーを使用して測定することができる。シプロフロキサシン感受性大腸菌（E.coli）菌株Ｊ５３の転写応答は、異なる耐性機構を有する一連の同質遺伝子変異体、フルオロキノロン標的遺伝子トポイソメラーゼｇｙｒＡに一種の変異（Ｇ８１ＤまたはＳ８３Ｌ）を有する２つ、およびａａｃ（６’）−Ｉｂ（アセチル化、不活性酵素）、ｑｎｒＢ（ｇｙｒＡの活性部位を遮断する）、およびｏｑｘＡＢ（排出ポンプ）を含むエピソームキノロン耐性遺伝子を有する３つと比較した。親菌株と比較して、全てのＪ５３誘導体は、耐性を示す大きなＺスコアを有していた（図２４Ｂ）。
【０１１９】
イソニアジドに対する応答を、一連の感受性臨床および実験室分離株、およびｋａｔＧ（Ｓ３１５Ｔ）、プロドラッグ活性化に必要なカタラーゼに変異を有するＨ３７Ｒｖ由来実験室菌株、およびｉｎｈＡ（Ｃ−１５Ｔ）、イソニアジドの標的のプロモーターに変異を有する臨床分離株を含む、２個のイソニアジド耐性菌株において比較した。それらの異なる耐性機構のため、これら２個の菌株はイソニアジドに対して異なるレベルの耐性を有し、ｋａｔＧ変異体は高レベルの耐性（６．４μｇ／ｍＬを超えるまで最小阻害濃度（ＭＩＣ）の１００倍を超える増大）を有し、一方ｉｎｈＡプロモーター変異は０．４μｇ／ｍＬまでわずか８倍のＭＩＣの増大をもたらす。低いイソニアジド濃度（０．２μｇ／ｍＬ）への曝露はいずれの耐性菌株においても転写応答を誘導することができなかったが、高いイソニアジド濃度（１μｇ／ｍＬ）では、ｋａｔＧ変異体と対照的に、ｉｎｈＡ変異体は感受性がある形式で応答する（図２４Ｃ）。したがって、この方法は機構独立性であるだけでなく、高レベルと低レベルの耐性を区別するための比較測定値も与えることができる。
【０１２０】
最後に、細菌、ウイルス、真菌から寄生虫の範囲の病原体においてＲＮＡはほぼユニバーサルなので、広範囲の感染因子にわたり適用可能である１つの診断プラットフォームにＲＮＡ検出を組み込むことができる。大きな混合型病原体用プローブのプールを使用して、本発明者らは、真菌病原体カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（図２５Ａ）；用量依存式に細胞培養中にヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス（influenza virus）および単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus-2）（ＨＳＶ−２）（図２５Ｂ〜Ｄ）；および感染赤血球における熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）生活環の異なる段階（図２５Ｅ）を同定するためのシグナルを直接かつ特異的に検出することができた。
【０１２１】
薬剤感受性に関する距離の測定基準である平均二乗距離のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）によるデータの分析および計算： 全ての薬剤処理サンプルに関して、それぞれのプローブに関する加工していないＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）カウントを、それぞれのサンプル用の全ての関連（すなわち、種に適した）プローブの平均に最初に標準化した。転写レベルの変化倍率は、抗生物質処理サンプル中のそれぞれのプローブに関する標準化カウントと、それぞれの試験条件に関する未処理ベースラインサンプル中の対応するカウントを比較することによって決定した。
【０１２２】
定性発現シグネチャーを感受性または耐性のバイナリ形式の結果に変換するために、同じ薬剤に曝した感受性菌株のそれからのサンプルの転写プロファイルの平均二乗距離（ＭＳＤ）を計算するためのアルゴリズムを開発した。薬剤感受性実験におけるＭＳＤ測定基準は以下のように計算した：
１．サンプル量の変動を、加工していない値（raw value）をサンプル中の全ての関連プローブについてのカウントの平均数に標準することによって補正する。
２．本発明者らがＰｊと示す一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。この分析は薬剤感受性分離株と薬剤耐性分離株の間で差次的に変化したプローブに限られる。
３．薬剤感受性菌株の複製はＮｓａｍｐとして定義する。それぞれの複製に関して、薬剤処理前後のそれぞれのプローブＰｊに関する標準化カウントは
【数１】
または
【数２】
で示し、ｉはサンプルインデックスを表す。
４．「対数誘導比」を次に算定する：
【数３】
このように比を対数変換することによって、いずれか１つのプローブが計算したＭＳＤを占めるのを妨げる。
５．薬剤感受性サンプルの平均誘導比、
【数４】
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数５】
６．ＭＳＤを、（インデックスｉの）薬剤感受性菌株の複製それぞれに関して次いで計算する、これは全ての薬剤感受性サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数６】
７．耐性菌株に関する誘導比、
【数７−１】
は感受性菌株のそれと同様に計算する：
【数７−２】
８．薬剤耐性菌株に関するＭＳＤを、薬剤感受性集団の中心と比較して計算する：
【数８】
【０１２３】
大部分の感受性菌株は平均的感受性菌株と同様に挙動するので、
【数９】
の典型的な値は、耐性菌株に関する典型的な値
【数１０】
と比較して小さい。
【０１２４】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１１】
の値は平均からの偶発偏差数（random deviation）の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって、薬剤感受性集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１２】
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１３】
【０１２５】
この測定基準を、異なる抗生物質に対して試験した多数の研究室および臨床分離株の分析に適用し、そのデータは図２４、２７、２８および２９中に示す。
【０１２６】
生物同定のための距離測定基準の計算： 多数のプローブからの情報をバイナリ形式の結果に変換するために、それぞれのプローブに関する加工していないカウントを対数変換した。このように比を対数変換することによって、いずれか１つのプローブが分析を占めるのを妨げる。次いでこれらの対数変換カウントを技術反復間で平均する。
【０１２７】
Ｐｊと示される一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを記載したように選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。
【数１４−１】
【０１２８】
生物同定は擬似または異なる生物と比較して転写産物を検出する能力に依存するので、対象の生物なしで調製したサンプル中のバックグラウンドレベルのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）カウントをしたがって使用して対照中心を定義した。これらの対照サンプルの中心
【数１４−２】
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数１５】
【０１２９】
ＭＳＤを、（インデックスｉの）実験サンプルの平均技術反復に関して次いで計算する、これは全ての対照サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数１６】
【０１３０】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１７】
の値は平均からの偶発偏差数の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって本発明者らは、対照集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１８】
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１９】
【０１３１】
この測定基準を、図２６および表４中に示す関連細菌種に関して試験した多数の研究室分離株および臨床分離株の分析に適用した。その生物に関してＭＳＤが２を超えた場合に、特定生物として菌株を同定した。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
本明細書に記載するＲＮＡ発現シグネチャーの直接測定は、培養中および患者試料に直接由来する一定範囲の病原体の迅速な同定をもたらすことができる。特に、抗生物質への曝露に対する表現型による応答によって感受性菌株と耐性菌株を区別することができ、したがって共通応答に様々な耐性機構を組み込む非常に早期の迅速な感受性の決定をもたらすことができる。この原理は、病原体ＲＮＡが広範囲の臨床設定および感染性疾患に適用可能である一診断プラットフォームの基盤を形成するパラダイムシフトとなり、病原体の同定および迅速な表現型による抗微生物感受性試験を同時にもたらす。
【０１３７】
参考文献
【表５】
【０１３８】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するわけでなく、それを例示することを目的とすることは理解されよう。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる、２０１０年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／３０７，６６９号、および２０１０年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，２５２号の特典を請求するものである。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた認可番号３Ｕ５４−Ａ１０５７１５９−０６Ｓ１および認可番号Ａ１０８００２の下で政府の支援によってなされたものである。政府は本発明において確固たる権利を有するものとする。
【０００３】
技術分野
本発明は特に、病原体、例えば、感染性疾患の病原体を検出、診断、および／または同定する、ならびに既知の治療または潜在的な治療（known or potential treatment）に対するそれらの感受性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
分子診断の発展は、感染疾患以外の大部分の医療用分野における対処（care）に革新をもたらしたが、感染疾患の分野では、広範かつ変革的な役割を果たせずにいる。緩徐な培養法への依存は現在の抗生物質耐性の危機においては特に欲求不満の種であるが、それは、刺激的病原体（inciting pathogen）およびその薬剤耐性プロファイルを迅速に診断するための分子ツールの発展が、細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫感染の管理法を変え、死亡率を低下させるための尽力において迅速で情報に基づいた薬剤治療を誘導し、医療費を制御し、病原体間で増大する耐性に関する公衆衛生の監視を改善する可能性があるからである。米国内の病院だけでも、１７０万人の人が院内細菌感染し、９９，０００人が毎年亡くなり、これらの感染の７０％は少なくとも１つの薬剤に対する細菌耐性が原因であり、推定年間コストは４５０億ドルである（Klevens et al、2002. Public Health Rep.2007;122(2):160-6;Klevens et al、Clin Infect Dis.2008;47(7):927-30;Scott、The Direct Medical Costs of Healthcare-Associated Infection in U.S. Hospitals and the Benefits of Prevention.In:Division of Healthcare Quality Promotion NCfP、Detection and Control of Infectious Diseases、editor.Atlanta:CDC、2009）。しかしながら、この問題は米国に限られず、微生物耐性は現在、世界中で大部分の一般的な細菌感染に影響を与えている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S.aureus）（ＭＲＳＡ）、多剤耐性結核菌（tuberculosis）（ＭＤＲ−ＴＢ）、および一層薬剤耐性のグラム陰性生物の世界的な広がりは、監視、予防および防除、研究および製品開発に焦点を当てたアクションプランの形成を促した（US action plan to combat antimicrobial resistance.、Infect Control Hosp Epidemiol.2001;22(3):183-4）。しかしながら、任意のこれらの範囲に関して進展は最小限である。
【０００５】
適切な抗生物質の迅速な投与は、腸球菌（E.faecium）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ（A.baumanii）、緑膿菌（P.aeruginosa）、およびエンテロバクター（Enterobacter）種などの院内病原体に関する病院設定内、または結核菌（tuberculosis）（ＴＢ）などの病原体に関する供給源不足（resource-poor setting）の設定内のいずれかで、重度の細菌感染がある患者の死亡率を最小にすることが繰り返し示されている（Harbarth et al、Am J Med.2003;115(7):529-35;Harries et al、Lancet.2001;357(9267):1519-23;Lawn et al、Int J Tuberc Lung Dis.1997;1(5):485-6）。しかしながら、生物の培養および二次培養（sub-culture）を含む現在の診断法は、生物とその薬剤感受性パターンの両方を正確に同定するのに数日以上要する可能性があるので、医師は経験によるより広いスペクトルの抗生物質の多数回の使用に依存しており、耐性の選択圧を加え、関連医療費は増大する。病原体およびそれらの耐性プロファイルを迅速に（例えば、１時間未満で）検出するためのポイントオブケア診断が早急に必要とされ、医療の実践を劇的に変える可能性がある。ＤＮＡベースまたはＰＣＲベースの試験を設計するいくらかの尽力は、低い検出限界で病原体を迅速に同定することができるツールをもたらしている。しかしながら、これらのツールの世界的な使用は、研究室のインフラに関するコストおよび要求、および必要な酵素の影響を容易に受けない粗製サンプルの設定におけるＰＣＲベースの方法の固有の非感受性が原因で、現在制限されている。薬剤耐性を決定するための分子学的手法はより一層限られており、既知の耐性を与える変異と比較した感染細菌の遺伝子型の定義に基づいて、非常に限られた方法でいくつかの生物（例えば、ＭＲＳＡ、ＴＢ）に利用可能である。しかしながら、この方法は、高感度を有する、試験用の全ての耐性を与える単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の非常に広範囲の同定を必要とする（Carroll et al、Mol Diagn Ther.2008;12(1):15-24）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
要旨
本発明は、少なくとも部分的に、例えば粗製、非精製サンプル中のｍＲＮＡの検出に基づいて、疾患を診断する、病原体を同定する、および治療を最適化する、新しい方法の発見に基づく。本明細書に記載する方法は、薬剤感受性の決定に基づいて、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体の迅速で正確な同定をもたらし、最適な治療の選択を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫などの病原性生物（disease-causing organism）の薬剤感受性を決定する方法を特徴とする。方法は、病原体を含むサンプルを提供するステップと、サンプルと１つまたは複数の試験化合物を、例えば４時間未満接触させて、試験サンプルを提供するステップとを含む。試験サンプルは、試験サンプル中に病原体からｍＲＮＡを放出させる条件下で処理することができ、試験サンプルは複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに曝し、それぞれのサブセットは、耐性がある生物と比較して試験化合物に感受性がある生物中で差次的に発現される標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、曝露が、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で起こる。方法は、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップと、試験化合物の存在下での標的ｍＲＮＡのレベルと参照レベル、例えば試験化合物の不在下での標的ｍＲＮＡのレベルとを比較するステップであって、標的ｍＲＮＡの参照レベルと比較した標的ｍＲＮＡのレベルの違いが、病原体が試験化合物に対して感受性であるか、または耐性があるかを示すステップとを含む。
【０００８】
一実施形態では、病原体は既知の、例えば同定済みの病原体である。いくつかの実施形態では、方法は、未知の病原体、例えば未だに同定されていない病原体の薬剤感受性を決定する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、病原体を含むサンプルを、例えば同時にまたは同じサンプル内で２つ以上の試験化合物と接触させる、例えば既知の治療化合物または潜在的な治療化合物、例えば抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、および駆虫薬（antiparasitis）と接触させる。これらの化合物のうちの多くのもの、例えば、イソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド、エタンブトール、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、ビオマイシン、エンビオマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、エチオナミド、プロチオナミド、シクロセリン、ｐ−アミノサリチル酸、リファブチン、クラリスロマイシン、リネゾリド、チオアセタゾン、チオリダジン、アルギニン、ビタミンＤ、Ｒ２０７９１０、オフロキサシン、ノボビオシン、テトラサイクリン、メレペネム、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ロラカルベフ、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、セフトビプロール、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、テリスロマイシン、スペクチノマイシン、アズトレオナム、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、エノキサシン、ガチフロキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、マフェニド、プロントジル、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファニリミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コ−トリモキサゾール）、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、アルスフェナミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、エタムブトール、フォスフォマイシン、フシジン酸、フラゾリドン、メトロニタゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルフォプリスチン、リファンピン、チアムフェニコール、チニダゾール、セファロスポリン、テイコプラチン（teicoplatin）、オーグメンチン、セファレキシン、リファマイシン、リファキシミン、セファマンドール、ケトコナゾール、ラタモキセフ、またはセフメノキシムは当技術分野で知られている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、サンプルを４時間未満、例えば３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、１分未満、化合物と接触させる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、感染性疾患の病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を同定する、例えば、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体の存在を検出する方法を特徴とする。これらの方法は、
病原体に感染している疑いがある被験体からの試験サンプルを提供するステップと、
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を放出させる条件下で試験サンプルを処理するステップと、
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、曝露が、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で起こるステップと、
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップとを含む。参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大は、試験サンプル中の病原体のアイデンティティー（identity）を示す。
【００１２】
いくつかの実施形態では、方法は、痰、血液、尿、大便、関節液（joint fluid）、脳脊髄液、および子宮頸部／膣スワブである、またはこれらを含む、サンプル中またはサンプル由来の感染性疾患の病原体を同定する。このようなサンプルは、複数の他の生物（例えば、１つまたは複数の非病原性細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫）または病原体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、臨床サンプル、例えば医療提供者による医学的治療を施されるまたはその可能性がある患者または人からのサンプルである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の核酸プローブは表２から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プローブとの接触前に、粗製状態であり、例えば精製されておらず、および／または、ｍＲＮＡを増殖して例えばｃＤＮＡを生成することを含まない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、方法は、酵素的、化学的、および／または機械的に細胞を溶解するステップを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスの使用を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、方法を使用して、病原体の大発生、例えば、特定領域内の病原体数の急上昇の公衆衛生監視のため、病原体感染、例えば発生率、罹患率をモニタリングする。
【００１８】
本明細書に記載する方法は、ヒト、および実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、もしくはサル、または飼育動物および家畜（domesticated and farm animals）、例えばネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および鳥類、例えばニワトリなどの動物を含めた、被験体からのサンプル中に病原体が存在する場合に有効である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載するアッセイの結果に基づいて、被験体用の治療を決定および／または選択すること、および必要に応じて、被験体に治療を施すこと（administering the treatment）をさらに特徴とする。
【００２０】
別の一般的な態様では、本発明は、被験体用の治療を選択する方法を特徴とする。これらの方法は、
例えば本明細書に記載する方法を使用して、感染性疾患の病原体を必要に応じては同定するステップ（例えば、サンプル中の特異的病原体の存在および／またはアイデンティティーを検出するステップ）と、
本明細書に記載する方法を使用して病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
被験体を治療する際に使用するための病原体が感受性のある薬剤を選択するステップとを含む。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、被験体中の病原体による感染をモニタリングするための方法を提供する。これらの方法は、
第一の時点に、病原体を含む第一のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
必要に応じて、病原体が感受性のある治療を選択し、選択した治療を被験体に施すステップと、
第二の時点に、病原体を含む第二のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性と第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を比較し、それによって被験体中の感染をモニタリングするステップとを含む。
【００２２】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、被験体は免疫無防備状態（immune compromised）である。
【００２３】
本明細書に記載する方法のいくつかの実施形態では、方法は、病原体が感受性のある治療を選択し、選択した治療を被験体に施すステップを含み、病原体の薬剤感受性の変化は、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあるか（the pathogen is or is becoming resistant to the treatment）を示し、例えば、方法は、施される治療に対する病原体の薬剤感受性を決定するステップを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、病原体の薬剤感受性の変化は、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあることを示し、方法は、被験体に異なる治療を施するステップをさらに含む。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、被験体集団内における、病原体による感染をモニタリングするための方法を特徴とする。これらの方法は、
第一の時点に、集団内の被験体からの第一の複数のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定し、必要に応じて、本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプル中の感染性疾患の病原体を同定するステップと、
必要に応じて、被験体に治療を施するステップと、
第二の時点に、集団内の被験体からの第二の複数のサンプルを得るステップと、
本明細書に記載する方法を使用して第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定し、必要に応じて、本明細書に記載する方法を使用して第一の複数のサンプルにおける感染性疾患の病原体を同定するステップと、
第一の複数のサンプルおよび第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性、および必要に応じて、病原体のアイデンティティーを比較し、それによって被験体集団内の感染をモニタリングするステップとを含む。
【００２６】
さらに別の態様では、固形支持体と結合した複数のポリヌクレオチドを提供する。複数のポリヌクレオチドのそれぞれは、表２由来の１つまたは複数の遺伝子と選択的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のポリヌクレオチドは、配列番号１〜２２７、およびそれらの任意の組合せを含む。
【００２７】
伝染病または伝染性疾患としても知られる「感染性疾患」は、被験体における病原性生物因子の感染、存在、および増殖に起因する臨床的に明らかな病状（すなわち、特徴的な医学的兆候および／または疾患の症状）を含む（Ryan and Ray(eds.)(2004).Sherris Medical Microbiology(4th ed.).McGraw Hill）。感染性疾患の診断は、例えば診断検査（例えば、血液検査）、カルテ審査、および臨床歴審査によって、医師により確認することができる。いくつかの場合、感染性疾患は、その過程の一部または全部で無症候性であり得る。感染性病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、多細胞寄生虫、およびプリオンを含むことができる。当業者は、病原体の伝播は、物理的接触、汚染食品、体液、物体、空気媒介吸入、およびベクター生物介在を例外なく含めた、異なる経路を介して起こり得ることを理解する。特に感染性が強い感染性疾患は時折伝染性と呼ばれ、病人およびその分泌物との接触によって伝播する可能性がある。
【００２８】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、産物（ＲＮＡまたはその翻訳産物、ポリペプチドのいずれか）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。遺伝子はコード領域を含有し、コード領域の前後に領域を含む（それぞれ「リーダー」および「トレイラー」と呼ばれる）。コード領域は、複数のコードセグメント（「エクソン」）および個々のコードセグメント間の介在配列（「イントロン」）で構成される。
【００２９】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、標的ｍＲＮＡと特異的に結合するオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、標的とのハイブリダイゼーション時に一本鎖であってよい。
【００３０】
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明中で使用するための方法および材料を本明細書に記載し、当技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は単なる例示的なものであり、限定的であることを意図するものではない。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が優先される。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）（カラーコードプローブ対を用いた遺伝子発現の直接同時計測）技術を使用して、サンプル中のｍＲＮＡ分子を定量化するための例示的な方法を示すフローチャートである。１Ａ。対象のそれぞれのｍＲＮＡに対応する２つの分子プローブを粗製サンプル溶解物に加える。捕捉プローブは、ビオチンと結合した所与のｍＲＮＡ分子と相補的な５０ｂｐオリゴマーからなる。レポータープローブは、蛍光タグと結合した同じｍＲＮＡ分子の異なる部分と相補的な異なる５０ｂｐオリゴマーからなる。それぞれのタグは、所与のｍＲＮＡ分子を独自に同定する。捕捉プローブとレポータープローブは、溶解物内のそれらの対応するｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする。１Ｂ。それぞれのオリゴマー上のハンドルとハイブリダイズするビーズ精製により過剰なレポーターを除去し、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ複合体のみ残す。１Ｃ。ｍＲＮＡ複合体を表面上に固定して並べる（aligned）。ｍＲＮＡ複合体は、ストレプトアビジンコーティング表面上でビオチン結合捕捉プローブによって捕捉する。電場を利用して、表面上で全て同じ方向に複合体を並べる。１Ｄ。表面を画像化しコードを数える。ｍＲＮＡ複合体は顕微鏡画像処理し、並べたレポータータグは数えることができ、これによってｍＲＮＡ分子の定量測定値を与えることができる（ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ．ｃｏｍから得た画像）。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、薬剤耐性の遺伝子発現シグネチャーの診断を示す一連の図である。２Ａ。患者由来のサンプル、例えば痰。２Ｂ。薬剤感受性と耐性菌を区別するための発現プログラムの誘導。サンプルは分割し、菌が薬剤に耐性であるか感受性であるかに応じて、異なる薬剤に曝して発現プログラムを誘導する。２Ｃ。ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズするバーコードプローブ。細胞を溶解させ、プローブを粗製サンプルに加える。２Ｄ。ｍＲＮＡ複合体を捕捉して並べる。２Ｅ。複合体を画像化し計数する。２Ｆ。シグネチャーの分析。測定したｍＲＮＡレベルを標準化し、薬剤なしの対照および薬剤感受性および耐性の標準と比較して、全薬剤中の耐性プロファイルを定義する。
【図３】図３は、大腸菌（E.coli）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。６個の大腸菌（E.coli）遺伝子（ｆｔｓＱ、ｍｕｒＣ、ｏｐｇＧ、ｐｕｔＰ、ｓｅｃＡ、およびｕｕｐ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を大腸菌（E.coli）として陽性同定した。それぞれの値は、４〜６反復の平均および標準偏差を表す。
【図４】図４は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個の緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子（ｐｒｏＡ、ｓｌｔＢ１、ｎａｄＤ、ｄａｃＣ、およびｌｉｐＢ）用に設計したプローブを使用して、２個の臨床分離株を緑膿菌（P.aeruginosa）として陽性同定した。
【図５】図５は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個のクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子（ｌｒｐ、ｙｃｂＫ、ｃｌｐＳ、ｉｈｆＢ、ｍｒａＷ）用に設計したプローブを使用して、臨床分離株を陽性同定した。
【図６】図６は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）臨床分離株の陽性同定を示す棒グラフである。３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｐｒｏＣ、ｒｐｏＢ、およびｆａｂＤ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を陽性同定した。
【図７】図７は、病原体特異的プローブを使用した病原体同定を示す、一連の３つの棒グラフである。
【図８】図８は、病原体同定感受性を示す一連の３つの棒グラフである。
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂは、模擬臨床サンプル（simulated clinical sample）からの病原体同定を示す一連の３つの棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、模擬臨床サンプルからの病原体同定を示す一連の３つの棒グラフである。
【図１０】図１０は、緑膿菌（P.aeruginosa）の２個の臨床分離株の同定を示す一連の２つの棒グラフである。
【図１１】図１１は、大腸菌（E.coli）におけるフルオロキノロン耐性の確認（identification）を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、大腸菌（E.coli）におけるアミノグリコシド耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）におけるメチシリン耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、エンテロコッカス（Enterococcus）におけるバンコマイシン耐性の確認を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、薬剤耐性結核菌（M.tuberculosis）における薬剤特異的遺伝子誘導を示す一連の４つの棒グラフである。
【図１６】図１６は、イソニアジド感受性と耐性ＴＢ菌株を比較する３個のスキャッタープロットの図である。それぞれのドットは、２４遺伝子プローブの１つを表す。軸はデジタル遺伝子発現技術（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標））によって測定した転写産物の数を表す。左−薬剤処理の不在下でのイソニアジド耐性菌株とイソニアジド感受性菌株における発現の比較。中央−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド感受性菌株（drug treated vs. drug untreated isoniazid sensitive strain）における発現の比較。右−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド耐性菌株における発現の比較。
【図１７】図１７は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）を使用して薬剤感受性と薬剤耐性の結核菌（M.tuberculosis）の転写応答を比較する一連の４つの棒グラフである。（Ａ）本明細書に記載するように菌株Ａ５０（ＩＮＨ−Ｒ）をＩＮＨ（０．４μｇ／ｍｌ）で処理した。（Ｂ）ＳＭ−ＲクローンＳ１０は２μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで処理した。
【図１８】図１８は、感受性と耐性のＴＢ菌株における差次的遺伝子発現誘導を示す棒グラフである。ＩＮＨで処理したＩＮＨ感受性（野生型）細胞／未処理細胞における各遺伝子の発現の割合は、ＩＮＨで処理したＩＮＨ耐性細胞／未処理細胞における各遺伝子の発現で割る。
【図１９】図１９は、結核菌（M.tuberculosis）におけるＩＮＨ誘導型遺伝子の誘導の経時変化を示す線グラフである。イソニアジド感受性Ｈ３７Ｒｖを０．４μｇ／ｍｌのＩＮＨ（５ＸＭＩＣ）に曝し、１時間、２時間、および５時間で１０ｍｌの培養物からＲＮＡを調製した。次いでｑＲＴ−ＰＣＲを使用してｋａｓＡ、ｋａｓＢ、およびｓｉｇＡに対する転写産物の量を定量化し、レベルはｓｉｇＡに標準化してｔ＝０と比較する。
【図２０】図２０は、発現シグネチャーを検出するための例示的なワークフローである。痰中のバチルス（bacilli）の実際の生理的状態は知られていないので、プロセス開発中に複製細菌と非複製細菌の両方をモデル化する。無菌培養において増殖したＨ３７Ｒｖ（リッチ７Ｈ９／ＯＡＤＣ／ＳＤＳ培地中または７Ｈ９／チロキサポール中で枯渇のいずれか）は、これらの実験において痰中のバチルス（bacilli）を表す。バチルス（bacilli）を富栄養培地（rich media）に曝しながら一定時間ｔ１パルス処理し、休眠状態からの蘇生を刺激して転写を活性化する。最適なｔ１は実験によって決定する。次いでバチルス（bacilli）を薬剤に曝しながら一定時間ｔ２パルス処理し、転写応答を誘発する。最適なｔ２は実験によって決定する。最後に、全てのサンプルを処理し、発現プロファイリングによって分析し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
【図２１】図２１は、遺伝子の発現の割合を比較して薬剤感受性と耐性のバチルス（bacilli）を区別する例示的な方法である。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、発現シグネチャーに含める候補である遺伝子に関するｍＲＮＡレベルを測定する。薬剤の存在下（誘導−薬剤）および薬剤の不在下（非誘導−無薬剤）で、「実験用（ｅｘｐ）」で示すサンプル（すなわち、臨床分離株）中の対象の遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する。標準ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡレベルも、薬剤の存在下（ハウスキーピング−薬剤）および薬剤の不在下（ハウスキーピング−無薬剤）で測定する。対象の遺伝子とハウスキーピング遺伝子のレベルの割合によって、薬剤の存在下（Ａ）および薬剤の不在下（Ｂ）での発現を標準化することができる。いくつかの薬剤感受性菌株に関してＡ＞Ｂ、および薬剤耐性菌株に関してＡ＝Ｂが予想される。最後に、薬剤感受性および薬剤耐性であることが知られている対照菌株（ＣおよびＤ）に関して同じ対応率を作製する。これらの対照値は、未知の菌株から得た実験比の比較用の標準として働く。
【図２２】図２２は、培養または患者標本に直接由来する細菌種の陽性同定を示す一連の棒グラフおよびスキャッタープロットである。細菌サンプルは、種特異的転写産物の検出用に設計したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを用いて分析した。Ｙ−軸：転写産物の加工していないカウント（raw count）；Ｘ−軸：遺伝子の名称。大腸菌（E.coli）（黒色）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）（白色）、緑膿菌（P.aeruginosa）（グレー）に特異的なプローブ。エラーバーは２回の生物学的反復の標準偏差を表す。（Ａ）グラム陰性細菌の培養物からの検出。（Ｂ）混合培養物（プロビデンシア・スチュアルティ（Providencia stuartii）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、シトロバクター・フレウンデー（Citrobacter freundii））内の検出。（Ｃ）培養物中のマイコバクテリウム（mycobacteria）の属および種特異的検出。結核菌（M.tuberculosis）（Ｍｔｂ）、マイコバクテリウム・アビウム亜種イントラセルラーレ（M.avium subsp.intracellulare）（ＭＡＩ）、ヨーネ菌（M.paratuberculosis）（Ｍｐａｒａ）、およびマイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）（Ｍｍａｒ）。属範囲（genus-wide）のプローブ（グレー）、結核菌（M.tuberculosis）特異的プローブ（黒色）。（Ｄ）臨床尿試料に直接由来する大腸菌（E.coli）の検出。（Ｅ）非大腸菌（E.coli）サンプルと比較した大腸菌（E.coli）サンプルのアイデンティティーの統計的決定。それぞれのプローブに関するカウントを平均し、対数（log）変換して合計した。（Ｆ）ブドウ球菌（Staphylococci）においてメチシリン耐性を与えるｍｅｃＡ ｍＲＮＡ、および腸球菌（Enterococci）においてバンコマイシン耐性を与えるｖａｎＡ ｍＲＮＡの検出。それぞれのポイントは異なる臨床分離株を表す。
【図２３】図２３は、抗生物質への曝露によって感受性細菌と耐性細菌を区別するＲＮＡ発現シグネチャーを示す、一連の７つの棒グラフである。感受性または耐性の細菌株を対数期（log phase）まで増殖させ、抗生物質に軽く曝露し、溶解し、抗生物質への曝露に応じて変わる転写産物の定量化用に設計したＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブセットを使用して分析した。加工していないカウントはサンプル用の全プローブの平均に標準化し、薬剤曝露と非曝露サンプルを比較することによって誘導倍率を決定した。Ｙ−軸：変化倍率；Ｘ−軸：遺伝子の名称。（Ａ）大腸菌（E.coli）：シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、アンピシリン（ＡＭＰ）、またはゲンタマイシン（ＧＭ）、（Ｂ）緑膿菌（P.aeruginosa）：シプロフロキサシン、および（Ｃ）結核菌（M.tuberculosis）：イソニアジド（ＩＮＨ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、またはシプロフロキサシン（ＣＩＰ）に曝露した、感受性菌株（黒色；上図）または耐性菌株（グレー；下図）に関するシグネチャー。それぞれの菌株は二連で試験し、エラーバーは、１個の代表的菌株の２回の生物学的反復の標準偏差を表す。試験した菌株の完全な一覧に関する表６を参照。
【図２４】図２４は、発現シグネチャーの誘導レベルの平均二乗長を使用した抗生物質耐性と感受性の細菌株の統計的分離を示す、３個のスキャッタープロットの図である。平均二乗長（ＭＳＤ）は、抗生物質に曝露した感受性菌株に関する平均シグナルからの試験した各菌株の偏差を示すＺスコアとして表す。感受性菌株：白い菱形；耐性菌株：黒い菱形。破線：Ｚ＝３．０９（ｐ＝０．００１）（Ａ）大腸菌（E.coli）臨床分離株。それぞれのポイントは、１菌株の２〜４回の生物学的反復を表す。（ＢおよびＣ）抗生物質への曝露に対する発現シグネチャー応答は耐性機構と無関係である。（Ｂ）染色体フルオロキノロン耐性を与えるｇｙｒＡの変異またはプラスミド媒介性キノロン耐性決定基（ａａｃ（６’）−Ｉｂ、ｑｎｒＢ、またはｏｑｘＡＢ）のいずれかを含有する大腸菌（E.coli）親菌株Ｊ５３および誘導体はシプロフロキサシンに曝露し、次いで前述のように分析した。エラーバーは４回の生物学的反復の標準偏差を表す。（Ｃ）結核菌（M.tuberculosis）。イソニアジド感受性および高または低レベルの耐性菌株をイソニアジドに曝露した。１μｇ／ｍＬで、低レベルのＩＮＨ耐性ｉｎｈＡは感受性シグネチャーを示すが、０．２μｇ／ｍＬでは、それは耐性シグネチャーを示す。
【図２５】図２５は、ウイルスおよび寄生虫の検出を示す一連の５つの棒グラフである。細胞を溶解し、プールしたプローブセットを加え、標準ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールに従いサンプルをハイブリダイズさせた。（Ａ）無菌培養から検出したカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）。（Ｂ）ＨＩＶ−１。ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｒｅｖ用に設計したプローブを用いたＰＢＭＣ溶解物からの検出。（Ｃ）インフルエンザＡ（Influenza A）。マトリックスタンパク質１および２用に設計したプローブを用いた、２９３Ｔ細胞溶解物におけるＰＲ８インフルエンザウイルスの検出。（Ｄ）ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２。ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｇ用に設計したプローブを用いた、ＨｅＬａ細胞溶解物におけるＨＳＶ−２菌株１８６Ｓｙｎ＋の検出。高いＭＯＩでさえ、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２特異的プローブのクロスハイブリダイゼーションはほとんどなかった。（Ｅ）熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）。示したレベルの寄生虫血症（parasitemia）で採取した赤血球からの熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）菌株３Ｄ７の検出。プローブは熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）に関して示した血液段階用に設計した。
【図２６】図２６は、臨床分離株の生物の同定を示す一連の３個のスキャッタープロットの図である。細菌培養物を溶解し、種特異的転写産物の検出用に設計したプローブを加え、ハイブリダイズさせ、標準ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールによって検出した。大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、または緑膿菌（P.aeruginosa）を同定するプローブを含有するプールしたプローブセットをＡおよびＢにおいて使用した。Ｃでは、結核菌（M.tuberculosis）用の種特異的プローブは微生物病原体に対する特に大きなプローブセットであった。左のＹ−軸はそれぞれの生物に関する１〜５の別個の転写産物からの対数変換のカウントの合計を示し、Ｘ−軸は試験した種を示す。破線は、所与サンプルのスコアが対照（「非生物」）サンプルの平均から逸脱した標準偏差数に基づく０．００１のｐ値を示す。「非生物」サンプルは、他の細菌生物、ただし定義する生物が不在であることが知られている細菌生物を含有した、試験したサンプルを示す。（Ｃ）に関しては、非生物サンプルは、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M.intracellulare）、ヨーネ菌（M.paratuberculosis）、マイコバクテリウム・アブセサス（M.abscessus）、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・ゴルドナエ（M.gordonae）、およびマイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）を含めた、非結核菌マイコバクテリウム（tuberculous mycobacteria）であった。試験した菌株および臨床分離株の数は表４中に示し、（そのために５０ｎｔプローブを設計した）病原体同定に使用した遺伝子は表５中に列挙する。
【図２７】図２７は、ゲンタマイシン（左図）またはアンピシリン（左図）感受性と耐性の大腸菌（E.coli）菌株の平均二乗長（ＭＳＤ）の比較を示す図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心（centroid）と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。点線は、０．００１のｐ値に相当するＺ＝３．０９を示す。
【図２８】図２８は、シプロフロキサシン感受性と耐性の緑膿菌（P.aeruginosa）菌株の平均二乗長の比較を示すスキャッタープロットの図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。
【図２９】図２９は、ストレプトマイシン（ＳＭ）またはシプロフロキサシン（ＣＩＰ）感受性と耐性の結核菌（M.tuberculosis）菌株の平均二乗長の比較を示す２個のスキャッタープロットの図である。Ｙ軸は、既知の感受性菌株の応答の中心と比較した、それぞれのサンプルのＭＳＤのＺスコアを示す。
【図３０】図３０は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株の陽性同定を示す棒グラフである。５個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｉｌｅＳ、ｐｐｎＫ、ｐｙｒＢ、ｒｏｃＤ、およびｕｖｒＣ）用に設計したプローブを使用して、３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株を陽性同定した。
【図３１】図３１は、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）分離株の陽性同定を示す棒グラフである。６個のステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）遺伝子（ｃｌｐＰ、ｄｎａＫ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＦ、ｓｄｈＡ、およびｓｅｃＤ）用に設計したプローブを使用して、３個の分離株をステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）として陽性同定した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本明細書に記載するのは、転写発現プロファイルシグネチャーに基づいて、病原体、例えば細菌、真菌、ウイルス、および寄生虫とその薬剤耐性パターンの両方を同定するための、迅速で、高感度の、表現型に基づく方法である。感受性および耐性の病原体は薬剤曝露に対して非常に異なる応答をし、初期の１つでは、最も迅速な応答はそのそれぞれの発現プロファイルの変化を反映した。分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現を使用して、薬剤曝露に対するこれらの初期転写応答を検出して、酵素学または分子生物学を必要としない迅速な形式で、薬剤感受性および耐性の病原体を区別することができる。本発明は様々な臨床サンプル中の広範囲の微生物病原体に適用可能であり、現在の診断ツールと共にまたは独立して使用することができる。主に結核菌（tuberculosis）（「ＴＢ」、結核菌（Mycobacterium tuberculosis））に関して使用する方法を記載するが、（例えば、表１中に列挙したような）他の病原体およびそれらの関連臨床症状に関する使用に、それらを適用することができることは当業者によって理解される。
【００３４】
薬剤耐性の診断および同定は、より迅速な「顕微鏡観察による薬剤感受性（microscopic-observation drug-susceptibility）」（ＭＯＤＳ）培養法、ファージ送達型レポーター、または比色定量指標さえも使用する培養試験に必要とされるＴＢの非常に遅い増殖のため、ＴＢに関して非常に課題がある。薬剤耐性を決定するための別のアプローチは、知られている耐性を与える変異と比較して感染病原体の遺伝子型を定義することに基づくが、しかしながら、このアプローチは、高感度を有する試験のためには全ての耐性を与える単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の非常に広範囲の同定を必要とする。
【００３５】
本明細書に記載する方法は、病原体の発現プロファイルシグネチャーに基づいて、サンプル、例えば臨床サンプル中の病原体を例えば同定するため、および病原体の薬剤感受性を決定するために使用することができる。薬剤感受性と耐性の病原体を区別するために使用することができる最も初期の最も迅速な応答の１つは、対象の薬剤への曝露時のそのそれぞれの転写プロファイルである。病原体は、それらがその特定薬剤に対して感受性であるかまたは耐性であるかに応じて、薬剤曝露に対して非常に異なる応答をする。例えばいくつかの場合、薬剤感受性または薬剤耐性の細菌は、上方および下方の制御遺伝子によって薬剤曝露に対して数分〜数時間内に応答し、耐性細菌にそのような応答がない一方で、薬剤および付随するより非特異的なストレスを克服しようとおそらく試みる。この迅速な応答は、病原体を殺傷またはその増殖を阻害するための化合物に必要とされる長時間とは対照的である。有効な形式での臨床サンプルからの病原体の死または増殖阻害の検出は、さらに大きな課題となる。例えば分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現を使用して、薬剤曝露に対するこれらの初期転写応答を検出し、酵素学または分子生物学を必要としない迅速な形式で薬剤感受性と耐性の病原体を区別することができ、したがって患者から回収した粗製臨床サンプルで直接実施することができる。この読み出し値が表現型であり、したがって例えばＴＢの薬剤耐性を考慮したＳＮＰの包括的定義を必要としない。本明細書に記載するのは、病原体、例えばＴＢバチルス（bacilli）に対する高い特異性を与え、感受性病原体と耐性病原体を区別するための遺伝子のセットである。感受性病原体と耐性病原体を区別する発現シグネチャーを構成する遺伝子の選択に基づいて、検出限界の感度を、多量に誘導され、したがって臨床サンプル内の病原体の数によってのみ制限されない転写産物を選択することによって最適化する。このセットの大きさを測定して、必要とされる遺伝子の数を最小にする。したがって本発明は、迅速（例えば、数時間）、高感度、および特異的である病原体およびその付随する耐性パターンを診断するための、高感度の表現型試験として使用することができる。この試験は病原体に感染した患者のケアを変える可能性があり、例えば世界のＴＢ発生領域のための、コスト効率が良い、ポイントオブケア診断である。
【００３６】
本発明の方法は、高度の感受性および特異性で、粗製細胞サンプルから直接の核酸シグネチャー、具体的にはＲＮＡレベルの検出を可能にする。この技術を使用してＴＢを同定することができ、臨床サンプル、例えば痰、尿、血液、または大便から直接の迅速で簡潔な処理を用いた、高感度での異なる発現シグネチャーの測定によって薬剤感受性パターンを決定することができ、この技術はリンパ節などの他の組織にも適用可能である。高感度は、ＤＮＡではなくｍＲＮＡを検出することによって得ることができる。単細胞は（検出のために増幅を典型的に必要とする）１ゲノムＤＮＡコピーと比較して細胞当たりより多くのｍＲＮＡのコピー（＞１０３）を有する可能性がある、（＜２０００コピーｍＲＮＡを検出する）この技術の高い固有の感度のためである。迅速で簡潔なサンプル処理は、ｍＲＮＡ分子の検出に必要とされる酵素学および分子生物学的方法の欠如のため可能であり、その代わりいくつかの実施形態では、これらの方法は、粗製溶解物中でのバーコードプローブとｍＲＮＡ分子のハイブリダイゼーション、次に（例えば、図１中に例示するような）直接的可視化を利用する。これらの実施形態ではハイブリダイゼーションを使用するので、ｍＲＮＡは粗製細胞溶解物、固定組織サンプル、およびグアニジウムイソチオシアネート（guanidinium isothiocyanate）、ポリアクリルアミド、およびＴｒｉｚｏｌ（登録商標）を含有するサンプルから、いかなる精製ステップもなく直接検出することができる。粗製ｍＲＮＡサンプルは生物体液または固形物から得ることができ、例えば、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、子宮頸部／膣スワブ、胆汁液、胸膜液、腹膜液、または心膜液、または例えば骨生検、肝生検、肺生検、脳生検、リンパ節生検、食道生検、結腸生検、胃生検、小腸生検、心筋生検、皮膚生検、および洞生検由来の組織生検サンプルを使用することもできる。
【００３７】
ＲＮＡ抽出
酵素的、化学的、または機械的にサンプルを処理して、サンプル中の細胞を溶解し、ｍＲＮＡを放出させることによって、サンプル、例えば病原体細胞または臨床サンプル中の細胞からＲＮＡを抽出することができる。プロセス中に他の破壊法を使用することができることは、当業者によって理解される。
【００３８】
細胞壁を除去するための酵素法の使用は、当技術分野で十分確立している。酵素は一般に市販されており、かつ大抵の場合、生物源から最初に単離されている。一般に使用される酵素としては、ライソザイム、リゾスタフィン、ジモラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼ、およびマンノースが挙げられる。
【００３９】
化学物質、例えば界面活性剤は、脂質−脂質、脂質−タンパク質およびタンパク質−タンパク質の相互作用を妨害することによって、細胞周辺の脂質バリアを破壊する。細胞溶解に理想的な界面活性剤は、細胞型および供給源に依存する。細菌と酵母は、それらの細胞壁の性質のため、最適な溶解に関して異なる要件を有する。一般に、非イオン性および両性イオン性の界面活性剤が穏やかである。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ系の非イオン性界面活性剤および３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、両性イオン性界面活性剤が一般にこれらの目的に使用される。対照的に、イオン性界面活性剤は強力な可溶化剤であり、タンパク質を変性させる傾向があり、それによってタンパク質の活性および機能を妨害する。タンパク質と結合し変性させるＳＤＳ、イオン性界面活性剤が、細胞を破壊するために当技術分野で広く使用されている。
【００４０】
細胞の物理的破壊は超音波処理、フレンチプレス、エレクトロポレーションを必要とする可能性があり、または基本構造を含むマイクロ流体デバイスを使用して機械的に細胞を破壊することができる。これらの方法は当技術分野で知られている。
【００４１】
分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現
遺伝子発現プロファイルに基づいて病原体を同定するための、例示的手順のフローチャートを図１中に示す。対象の各病原体を同定するためのオリゴヌクレオチドプローブは、ＢＬＡＳＴソフトウエアにより対象の病原体由来のコード配列と他の生物中の全遺伝子配列を比較することによって選択する。対象の病原体と完全に一致するが、任意の他の生物とは５０％を超えて一致しない、約５０ヌクレオチド、例えば８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、および２０ヌクレオチドのプローブのみを選択した。対象の各ｍＲＮＡに相当し互いに１００塩基対内である２つのプローブを選択する。
【００４２】
２つの分子プローブを、ｍＲＮＡ分子を含有する粗製サンプル溶解物に加える。捕捉プローブは所与のｍＲＮＡ分子と相補的な５０ヌクレオチドを含み、ビオチンと結合させることが可能である。レポータープローブは同じｍＲＮＡ分子の異なる部分と相補的な異なる５０ヌクレオチドを含み、レポーター分子、例えば蛍光タグまたは量子ドットと結合させることが可能である。それぞれのレポーター分子は所与のｍＲＮＡ分子を独自に同定する。捕捉プローブとレポータープローブは、溶解物内のそれらの対応するｍＲＮＡ分子とハイブリダイズする。それぞれのオリゴマー上のハンドルとハイブリダイズするビーズ精製により過剰なレポーターを除去し、ハイブリダイズしたｍＲＮＡ複合体のみ残す。ｍＲＮＡ複合体は、表面上、例えばストレプトアビジンコーティング表面上で捕捉し固定することができる。表面を顕微鏡画像処理する前に、電場を利用して、表面上で全て同じ方向に複合体を並べることができる。
【００４３】
レポーター分子を計数して、ｍＲＮＡ分子の定量測定値を与えることができる。市販のｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）をその手順中で使用することができる。しかしながら、他のシステムをそのプロセス中で使用することができることは当業者によって理解される。例えば、バーコードではなく、量子ドットでプローブを標識することができる。例えば、Sapsford et al、「Biosensing with luminescent semiconductor quantum dots.」Sensors 6(8): 925-953 (2006);Stavis et al、「Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel.」Lab on a Chip 5(3):337-343 (2005);およびLiang et al、「An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe.」Nucleic Acids Research 33(2):e17(2005)を参照。
【００４４】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体（例えば「ラボオンチップ」）デバイスを、サンプル中のｍＲＮＡを検出および定量化するために本発明の方法において使用することができる。このようなデバイスは、マイクロ流体フローサイトメトリー、連続的な大きさに基づく分離（continuous size-based separation）、およびクロマトグラフィーによる分離用に首尾よく使用されている。特に、このようなデバイスは、本明細書に記載するように粗製サンプル中の特定標的ｍＲＮＡを検出するために使用することができる。様々なアプローチを使用して、特定ｍＲＮＡのレベルの変化を検出することができる。したがって、このようなマイクロ流体チップ技術は、本明細書に記載する方法中で使用するための診断および予後用デバイスにおいて使用することができる。例えば、Stavis et al、Lab on a Chip5(3):337-343(2005);Hong et al、Nat.Biotechnol. 22(4):435-439(2004);Wang et al、Biosensors and Bioelectronics 22(5):582-588(2006);Carlo et al、Lab on a Chip3(4):287-291 (2003);Lion et al、Electrophoresis24 21 3533-3562 (2003); Fortier et al、Anal.Chem.,77(6):1631-1640(2005)、米国特許公開Ｎｏ．２００９／００８２５５２；および米国特許第７，６１１，８３４号を例えば参照。本明細書中には、結合成分、例えば本明細書に記載する病原体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、マイクロ流体デバイスも含まれる。
【００４５】
これらのマイクロ流体デバイスは、標識量子ドットおよび他のレポーター分子のレーザー励起を組み込むことができる。これらのデバイスは、可視光線を含めた様々な検出機構、および電荷結合デバイスベースカメラを含めた様々なデジタルイメージングセンサー法による、生じる発光の検出も組み込むことができる。これらのデバイスは、生成した加工されていないシグナルおよびデータを診断情報に変換する（translate）画像処理および分析能力も組み込むことができる。
【００４６】
発現シグネチャーを使用する、病原体アイデンティティーおよび病原体薬剤耐性の迅速な、表現型による診断
この技術を利用して、病原体のアイデンティティーまたは薬剤耐性の迅速な決定を達成することができる。
【００４７】
特有遺伝子の検出に基づいて、サンプル中の病原体を同定することができる。したがって例えば、肺炎または気管支炎などの呼吸器疾患関連の症状を有する被験体から、痰サンプルを得ることができ、どの疾患が存在しどの病原体がその疾患の原因であるかを決定するアッセイを実施する（例えば、表１参照）。尿サンプルを得て膀胱炎、腎盂腎炎、または前立腺炎を診断することができる（例えば、表１参照）。当業者は、患者によって示される症状の性質およびその差次的診断に応じて、特定の型のサンプルを得て、アッセイすることができることを理解している。それぞれの生物を同定するための具体的な遺伝子は本明細書に記載する方法により同定することができ、特定病原体を同定するための例示的な遺伝子は表２中に含まれる。
【００４８】
大きく加速する耐性の試験に関する原則は、対象の特定薬剤への曝露時に病原体の薬剤感受性と耐性の菌株の間で生じる転写応答の差異の検出に基づく。これらの転写プロファイルは測定可能な薬剤曝露に対する初期表現型応答であり、それらは薬剤曝露による桿菌死のかなり前に検出することができる。この転写ベースのアプローチには、それが代用ＳＮＰではなく薬剤曝露に対する病原体の直接的な応答を測定する点で、遺伝子型ベースのアプローチに勝る異なる利点もある。
【００４９】
いくつかの実施形態では、図２中に記載したように試験を実施することができる。サンプル、例えばＴＢを有する患者由来の痰サンプルを、いくつかのより小さなサブサンプルに分割する。異なるサブサンプルを、所定の時間（例えば、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、１分未満）、薬剤なしまたは異なる、既知もしくは潜在的薬剤（例えば、ＴＢサンプルの場合、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、モキシフロキサシン、ストレプトマイシン）のいずれかに曝露し、その間に薬剤感受性菌株において発現プロファイルが誘導され、それを薬剤耐性菌株と区別する。次いでサブサンプル中のＴＢバチルス（bacilli）を溶解し、バーコード分子プローブをハイブリダイゼーション用に加え、固定および画像化後にサブサンプルを分析する。次いで転写データセットを分析して、ＴＢの薬剤感受性および薬剤耐性の菌株に関する発現応答に基づいて一群の薬剤に対する耐性を決定する。したがって、ＴＢおよび個々の抗生物質に対するその応答を独自に同定するための発現シグネチャーを決定することができ、生じたデジタル遺伝子発現に利用するためのプローブセット、およびサンプル処理および回収法を最適化することができる。
【００５０】
発現シグネチャーの定義および転写シグナルの最適化の際に、考慮しなければならない２つの問題は、１．細胞が複製状態または非複製状態のいずれかであり得るので、現在定義されていない痰中のバチルス（bacilli）の代謝状態、および２．回収した痰中のＴＢバチルス（bacilli）が抗生物質に事前に曝されている（すなわち、患者が抗生物質を用いて経験的に既に治療されている）可能性である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、病原体を同定する方法および薬剤感受性を決定する方法は、同じマイクロアレイもしくはマイクロ流体デバイスにおいて、同時に、例えば同じサンプルで、または例えば、病原体のアイデンティティーを決定した後に、続けて実施し、薬剤感受性に適したアッセイを選択し実施する。
【００５２】
本明細書に記載する方法において有用な遺伝子およびプローブの例示的なセットは、ここに提示する表２中に提供される。
【００５３】
治療の方法
本明細書に記載する方法は、障害、例えば表１中に列挙する障害を治療するための方法を含むが、これに限定されない。一般に、これらの方法は、本明細書に記載する方法を使用して被験体からのサンプル中の病原体を同定すること、または、被験体中の病原体が感受性である１つの薬剤（または複数の薬剤）を同定すること、およびこのような治療を必要とする、またはこのような治療を必要とすると決定された被験体に、病原体を中和する治療用化合物を、治療有効量投与することを含む。この文脈で使用する「治療する（treat）」は、表１中に列挙する障害の１つと関係がある障害の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。例えばこれらの方法は、咳、胸の痛み、熱、疲労、予期せぬ体重減少、食欲不振、悪寒および寝汗をもたらすことが多いＴＢの治療を含み、したがって、治療はこれらの症状の低減をもたらすことができる。他の疾患の臨床症状は当技術分野でよく知られている。
【００５４】
「有効量」は、有益または望ましい結果を得るのに十分な量である。例えば治療量は、望ましい治療効果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発生を予防するのに必要な量である、予防有効量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１回または複数回の投与（administeration）、適用（application）または投薬（dosage）で施すことができる。組成物の治療有効量は、選択する組成物に依存する。組成物は、２日に１回を含めて、１日当たり１回または複数回から１週間当たり１回または複数回で投与することができる。組成物は、１ヶ月当たり１回または複数回から１年当たり１回または複数回で投与することもできる。当業者は、疾患または障害の重度、事前の治療、被験体の一般的な健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を非制限的に含めたいくつかの要因が、被験体を効率よく治療するのに必要な用量およびタイミングに影響を与える可能性があることを理解している。さらに、本明細書に記載する治療有効量の組成物を用いた被験体の治療は、１回の治療または一連の治療を含むことができる。
【００５５】
診断の方法
病原体を同定するおよび／またはその薬剤感受性を決定するための方法は本明細書に含まれる。方法は、被験体からサンプルを得ること、およびサンプル中の病原体の存在および／または薬剤感受性を評価すること、および１つまたは複数の参照、例えば非感染被験体または野生型病原体におけるレベルと存在および／または薬剤感受性を比較することを含む。ｍＲＮＡの存在および／またはレベルは本明細書に記載する方法を使用して評価することができ、これらは当技術分野で知られており、例えば定量イムノアッセイ法を使用する。いくつかの実施形態では、当技術分野で知られているハイスループット法、例えば遺伝子チップ（例えばCh.12、Genomics、in Griffiths et al、Eds.Modern Genetic Analysis、1999、W.H.Freeman and Company; Ekins and Chu、Trends in Biotechnology、1999、17:217-218; MacBeath and Schreiber、Science2000、289(5485):1760-1763; Simpson、Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2002; Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003を参照）を使用してｍＲＮＡの存在および／またはレベルを検出することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、サンプルは、生物体液または固形物、例えば、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、子宮頸部／膣スワブ、胆汁液、胸膜液、腹膜液、または心膜液、または例えば骨生検、肝生検、肺生検、脳生検、リンパ節生検、食道生検、結腸生検、胃生検、小腸生検、心筋生検、皮膚生検、および洞生検（sinus biopsy）由来の組織生検サンプルを含む。いくつかの実施形態では、人が病原体、例えば表１中に列挙する病原体を有すること、または薬剤耐性病原体を有することを決定した後、次いで治療、例えば当技術分野で知られているまたは本明細書に記載する治療を施すことができる。
【００５７】
キット
本明細書に記載する遺伝子の領域とハイブリダイズするプローブを含むキットも本発明の範囲内であり、キットを使用して本明細書に記載する病原体を検出することができる。キットは、使用説明書、および他の試薬、例えば標識、またはプローブと標識を結合させるのに有用な作用物質を含めた、１つまたは複数の他のエレメントを含むことができる。使用説明書は、本明細書に記載する方法において治療に対する応答を予想するためのプローブの診断用途に関する説明書を含むことができる。他の説明書は、プローブと標識を結合させるための説明書、プローブを用いて分析を実施するための説明書、および／または被験体から分析するサンプルを得るための説明書を含むことができる。前に論じたように、キットは標識、例えばフルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、および３２Ｐおよび３Ｈなどの放射性同位体を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載する遺伝子の領域とハイブリダイズする標識プローブ、例えば本明細書に記載する標識プローブを含む。
【００５８】
キットは、病原体と関係がある同じ遺伝子または別の遺伝子またはその一部分とハイブリダイズする、１つまたは複数のさらなるプローブも含むことができる。さらなるプローブを含むキットは、標識、例えばプローブ用の１つまたは複数の同じまたは異なる標識をさらに含むことができる。他の実施形態では、キットと共に供給されるさらなる１つまたは複数のプローブは、標識された１つまたは複数のプローブであってよい。キットが１つまたは複数のさらなるプローブをさらに含むとき、キットはその１つまたは複数のさらなるプローブの使用説明書をさらに提供することができる。
【００５９】
自己試験で使用するためのキットも提供することができる。例えば、このような試験キットは、医療供給者の協力なしで、例えば痰、口腔細胞、または血液のサンプルを得るために被験体が使用することができる、デバイスおよび説明書を含むことができる。例えば、口腔細胞は、口腔スワブまたはブラシを使用して、または口内洗浄液を使用して得ることができる。
【００６０】
本明細書で提供するキットは、例えば研究室に、分析用サンプルを返却するために使用することができる、郵便物、例えば料金別納封筒または郵便小包も含むことができる。キットは１つまたは複数のサンプル用容器を含むことができ、またはサンプルは標準的な血液回収バイアル中に存在してよい。キットは、１つまたは複数の承諾書、試験依頼書、および本明細書に記載する方法中でのキットの使用法に関する説明書も含むことができる。このようなキットを使用するための方法も本明細書に含まれる。１つまたは複数の文書、例えば試験依頼書、およびサンプルを保持する容器は、サンプルを提供した被験体を同定するために、例えばバーコードでコードすることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、キットはサンプルを処理するための１つまたは複数の試薬を含むことができる。例えばキットは、サンプルからｍＲＮＡを単離するための試薬を含むことができる。キットは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡアンプリコンを検出可能に標識するための１つまたは複数の試薬も必要に応じては含有することができ、これらの試薬は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素、１つまたは複数の検出可能に標識したｄＮＴＰ、または検出可能に標識したγホスフェートＡＴＰ（例えば３３Ｐ−ＡＴＰ）を含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、マイクロアレイ分析または発現プロファイルの結果を分析するためのソフトウエアパッケージを含むことができる。
【００６３】
本発明は以下の実施例中にさらに記載するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：病原体の同定
大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）。大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、およびエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）における特有コード配列を同定し（表２）、これらを使用してこれらの生物を陽性同定した（図３〜６）。臨床分離株は、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いで５マイクロリットルのそれぞれの培養液を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファー（ＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）に加え、５秒間攪拌した。次いで４マイクロリットルのそれぞれの溶解調製物を、溶解物に関する製造者の標準プロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で使用した。同定に関する基準は、平均バックグラウンド（他の２個の生物に関する全生物同定用プローブに関する平均カウント）の少なくとも２倍を超える、（緑膿菌（P.aeruginosa）またはクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）用の）全５個または（大腸菌（E.coli）用の）６個の生物同定用プローブに関するカウントであった。複製間で比較するため、カウントはｐｒｏＣのカウントに標準化した。表２中に記載する生物同定用プローブを使用して、４個の大腸菌（E.coli）臨床分離株を、６個の大腸菌（E.coli）遺伝子（ｆｔｓＱ、ｍｕｒＣ、ｏｐｇＧ、ｐｕｔＰ、ｓｅｃＡ、およびｕｕｐ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（図３）。２個の臨床分離株を、図４中に示すように５個の緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子（ｐｒｏＡ、ｓｌｔＢ１、ｎａｄＤ、ｄａｃＣ、およびｌｉｐＢ）用に設計したプローブを使用して、緑膿菌（P.aeruginosa）として正確に同定した。図５中に示すように、５個のクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子（ｌｒｐ、ｙｃｂＫ、ｃｌｐＳ、ｉｈｆＢ、およびｍｒａＷ）用に設計したプローブは、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）臨床分離株を陽性同定した。３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｐｒｏＣ、ｒｐｏＢ、およびｆａｂＤ）用に設計したプローブを使用して、４個の臨床分離株を陽性同定した（図６）。同定に関する分離基準（cut-off）は、ｒｐｏＢおよびｆａｂＤに関するカウントが、平均バックグラウンド（大腸菌（E.coli）、緑膿菌（P.aeruginosa）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）に関する全生物同定用プローブに関する平均カウント）の少なくとも２倍を超えるであることであった。
【００６５】
平均して、それぞれの生物に関する４〜５配列を大きなプールに含めて、望ましいレベルの特異性を得た。この技術を使用して、これら３生物のそれぞれを、粗製溶解物を直接プローブ処理することによって、検出し、同定し、無菌培養および８個のさらなるグラム陰性病原体を含む複合混合物において区別した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。
【００６６】
ＴＢ。Ｒｖ１６４１．１およびＲｖ３５８３ｃ．１に対するプローブは結核菌（M.tuberculosis）において多量の転写産物を検出し（参照８）、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）、およびマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）においてオルソロガスな転写産物を検出し、したがってこれら３種のいずれかの検出に使用することができる。さらに、３個のＴＢ遺伝子（Ｒｖ１９８０ｃ．１、Ｒｖ１３９８ｃ．１、およびＲｖ２０３１ｃ．１）に対するプローブを使用して結核菌（M.tuberculosis）を差次的に同定することができる、すなわちそれらは、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）は検出しない。ＭＡＰ＿２１２１ｃ．１、ＭＡＶ＿３２５２．１、ＭＡＶ＿３２３９．１、およびＭＡＶ＿１６００．１に対するプローブを使用してマイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）を検出することはできるが、結核菌（M.tuberculosis）は検出しない。したがって、Ｒｖ１９８０ｃおよびＲｖ３８５３プローブを用いて最大感受性が得られ、一方Ｒｖ１９８０ｃ．１、Ｒｖ１３９８ｃ．１、およびＲｖ２０３１ｃ．１、およびＭＡＰ＿２１２１ｃ．１、ＭＡＶ＿３２５２．１、ＭＡＶ＿３２３９．１、およびＭＡＶ＿１６００．１に対するプローブは、結核菌（M.tuberculosis）感染とマイコバクテリウム・アビウム（M.avium）またはマイコバクテリウム・アビウム亜種ヨーネ菌（M.avium subsp.paratuberculosis）感染の間の区別を可能にする。
【００６７】
マイコバクテリウム（mycobacterium）属全体で保存されている遺伝子および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のみに特異的である遺伝子に対してプローブを設計した。ｐａｎ−マイコバクテリウムプローブは多種を認識したが、一方で結核菌（M.tuberculosis）プローブは非常に特異的であった（図２２Ｃ）。
【００６８】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）
表２に記載する生物同定用プローブを使用して、３個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）分離株を、５個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）遺伝子（ｉｌｅＳ、ｐｐｎＫ、ｐｙｒＢ、ｒｏｃＤ、およびｕｖｒＣ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（図３０）。同様に、３個のステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）分離株を、６個のステノトロホモナス・マルトフィリア（S.maltophilia）遺伝子（ｃｌｐＰ、ｄｎａＫ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＦ、ｓｄｈＡ、およびｓｅｃＤ）用に設計したプローブを使用して正確に同定した（表２および図３１）。
【００６９】
実施例２：方法の感度
図７〜１０中に示すように、本発明の方法は対象のそれぞれの病原体に特異的であり、臨床サンプル、例えば血液および尿中の１００個未満の細胞を検出する感度がある。
【００７０】
３病原体のそれぞれから単離したＲＮＡ（１ｎｇ）を２４遺伝子プローブセットでプローブ処理した（図７）。大腸菌（E.coli）遺伝子、左側、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）遺伝子、中央、および緑膿菌（P.aeruginosa）遺伝子、右側。大腸菌（E.coli）ＲＮＡ、上部。クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）中央、および緑膿菌（P.aeruginosa）、底部。ｙ軸は、デジタル遺伝子発現技術を使用することによって検出した、それぞれの遺伝子に関するカウントの数を示す。それぞれの生物由来のＲＮＡは、それぞれの病原体の容易な同定を可能にする異なる発現シグネチャーを示す。
【００７１】
この２４遺伝子プローブセットを使用して、１０，０００細胞、１０００細胞、および１００細胞由来の粗製大腸菌（E.coli）溶解物をプローブ処理した（図８）。異なる大腸菌（E.coli）の発現シグネチャーは、１００細胞まで区別可能であった。
【００７２】
臨床サンプルはスパイクした尿および血液サンプル（spiked urine and blood sample）でシミュレートした。スパイクした尿サンプルでは、尿サンプルは尿１ｍＬ当たり１０５の大腸菌（E.coli）細菌でスパイクした。サンプルは４℃で一晩冷蔵し、次いで粗製細菌サンプルを溶解し、大腸菌（E.coli）を同定するためにグラム陰性細菌に使用した２４遺伝子プローブセットでプローブ処理した（図９Ａ、上図、および９Ｂ）。血液は１０００ｃｆｕ／ｍｌでスパイクし、これも２４遺伝子プローブセットで検出した（図９Ａ、下図）。
【００７３】
（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ臨床微生物学研究室から得た）緑膿菌（P.aeruginosa）の２個の臨床分離株を、グラム陰性細菌に使用した２４遺伝子プローブセットでプローブ処理して、その遺伝子セットが同じ細菌属の別の臨床菌株を同定することができることを実証した（図１０）。
【００７４】
尿サンプル中の大腸菌（Escherichia coli）の直接同定。大腸菌（E.coli）菌株Ｋ１２を、培養後期の対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いで細菌は、１００，０００ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度まで健常ドナー由来の尿試料に加えた（ＯＤ６００により推定）。次いで尿サンプルを０時間、４時間、２４時間、もしくは４８時間室温で放置し、または２４時間４℃に置いた。１ｍｌのスパイクした尿を１分間１３，０００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットは１００マイクロリットルのＬＢ培地に再懸濁した。細菌はＢａｃｔｅｒｉａ ＲＮａｓｅ Ｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理し、次いでイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファー（ＲＬＴバッファー、Ｑｉａｇｅｎ）中で溶解した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。
【００７５】
患者尿試料のアリコートを直接アッセイして尿路感染症における大腸菌（E.coli）転写産物を検出した（図２２Ｄ）。生物の有無を評価する１つの測定基準に多数の転写産物からのシグナルを集めるために、それぞれのプローブからの加工していないカウントを対数変換し合計した。１７の大腸菌（E.coli）臨床分離株のセットに適用すると、それぞれの分離株は１３の非大腸菌（E.coli）サンプルのセットと容易に区別することができた（非大腸菌（E.coli）対照と比較してＺスコア＞６．５、図２２Ｅ）。
【００７６】
実施例３：病原体の薬剤感受性
大腸菌（Escherichia coli）におけるフルオロキノロンおよびアミノグリコシド耐性の確認（identification）。フルオロキノロンおよびアミノグリコシドへの曝露時の大腸菌（E.coli）に関する公開済みの発現アレイデータ（Sangurdekar DP、Srienc F、Khodursky AB.A classification based framework for quantitative description of large-scale microarray data.Genome Biol 2006;7(4):R32）を使用して、フルオロキノロンおよびアミノグリコシドへの曝露時に有意に下方または上方制御されると予想される遺伝子のセットを選択した。ｐａｎ感受性実験室菌株（Ｋ１２）、フルオロキノロン耐性臨床分離株１および２、およびゲンタマイシン耐性臨床分離株（Ｅ２７２９１８１およびＥＢ８９４９４０）を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。それぞれの培養物の２ｍｌアリコートを得て、抗生物質を８μｇ／ｍｌのシプロフロキサシンまたは１２８μｇ／ｍｌのゲンタマイシンの最終濃度までこれらのアリコートに加えた。培養物は３７℃で１０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。カウントはｐｒｏＣのカウントに標準化し、ここでもｐｒｏＣは実験間で最も比較可能であるようであった。それぞれの遺伝子に関する誘導倍率は、抗生物質曝露の有無の下でのカウントを比較することによって決定した。２個の耐性臨床分離株とそれを区別する薬剤感受性Ｋ１２菌株における誘導または抑制を示す、９プローブ（ｃａｒＡ、ｄｅｏＣ、ｆｌｇＦ、ｈｔｒＬ、ｒｅｃＡ、ｕｖｒＡ、ｙｂｈＫ、ｕｕｐ、およびｆａｂＤ）からの明らかなシグナルが存在した（図１１）。第１０のプローブ、ｗｂｂＫは誘導も抑制もされず、遺伝子と発現変化に関する有用な比較をもたらした。同様に、８遺伝子に対するプローブは、これらの遺伝子は、薬剤感受性Ｋ１２菌株において、抑制状態（ｆｌｇＦ、ｃｙｓＤ、ｇｌｎＡ、またはｏｐｇＧ）誘導状態（ｆｔｓＱ、ｂ１６４９、ｒｅｃＡ、ｄｉｎＤ）のいずれかであり、２個の耐性臨床分離株とそれを区別することを示す（図１２）。
【００７７】
スタフィロコッカス（Staphylococcus）におけるメチシリン耐性の確認。６個の黄色ブドウ球菌（S.aureus）臨床分離株を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。次いでそれぞれの培養物の２ｍｌアリコートを得て、クロキサシリンを２５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。培養物は３７℃で３０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。２個の別個のプローブを使用して（表２）、ｍｅｃＡの発現をメチシリン耐性であることが知られている４個の分離株において確認した。対照的に、メチシリン感受性であることが知られている２個の分離株において検出可能なｍｅｃＡ発現はなく、クロキサシリンの不在下では最小のｍｅｃＡ発現であった（図１３）。
【００７８】
エンテロコッカス（Enterococcus）におけるバンコマイシン耐性の確認。４個のエンテロコッカス（Enterococcus）臨床分離株を、対数期まで３７℃においてＬＢ培地中で増殖させた。２ｍｌアリコートを得て、バンコマイシンを１２８μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。培養物は３７℃で３０分間インキュベートした。５マイクロリットルのそれぞれの培養物を１００マイクロリットルのイソチオシアン酸グアニジン溶解バッファーに加え、５秒間攪拌した。製造者のプロトコールに従いｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍアッセイ中で溶解物を使用した。２個の別個のプローブを使用して（表２）、ｖａｎＡの発現をバンコマイシン耐性であることが知られている２個の分離株において確認した。対照的に、バンコマイシン感受性であることが知られている２個の分離株において検出可能なｖａｎＡ発現はなく、バンコマイシンの不在下では最小のｖａｎＡ発現であった（図１４）。４個の分離株のいずれにおいても検出可能なｖａｎＢ発現はなかった。
【００７９】
生物同定のための転写産物の検出以外に、可動性遺伝因子（mobile genetic element）にコードされる遺伝子の検出は、特定分離株に関する多くのゲノム詳細をもたらすことができる。例えば、スタフィロコッカス（Staphylococci）においてメチシリン耐性を与えるｍｅｃＡｍＲＮＡ、およびエンテロコッカス（Enterococci）においてバンコマイシン耐性を与えるｖａｎＡｍＲＮＡに関して、細菌分離株をプローブ処理した。いずれの場合も、ＭＲＳＡおよびバンコマイシン耐性エンテロコッカス（Enterococcus）（ＶＲＥ）の迅速な同定を可能にする関連転写産物を検出した（図２２Ｆ）。したがって、ＲＮＡの直接検出は、知られている耐性因子の検出を可能にし得る。さらに、このアプローチは、食物媒介病原体における水平的遺伝子間交流によって得られる病原性因子、すなわち、腸管出血性（Enterohemorrhagic）または志賀毒素産生性（Shigatoxigenic）大腸菌（E.coli）における志賀毒素などの、他の遺伝因子による分離株の区別を可能にする。
【００８０】
ＴＢにおける薬剤耐性の確認。２４遺伝子プローブセットを公開済みの遺伝子発現データから確認して、イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、およびフルオロキノロンを含めた異なる抗生物質への曝露時の薬剤感受性ＴＢの発現変化を確認することができる発現シグネチャーを確認した（図１５〜１８）。薬剤曝露後の誘導または抑制の程度は表３中に示す。
【００８１】
Ａ６０００．３における対数期の結核菌（M.tuberculosis）細胞を、４個の異なる薬剤（イソニアジド、０．４μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン、２μｇ／ｍｌ；オフロキサシン、５μｇ／ｍｌ；リファンピシン０．５μｇ／ｍｌ）の１つの存在下でインクウェル容器（１０ｍｌ体積、平行培養）中で増殖させた。薬剤処理開始後の示した時間で（図１５）、遠心分離（３０００×ｇ、５分間）により培養物を採取し、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁し、ビーズで刺激した（１００ｎｍガラスビーズ、最高速度、２回の１分間パルス）。クロロホルム（０．２ｍｌ）をサンプルに加え、６０００×ｇで５分間の遠心分離後、水相を分析用に回収した。
【００８２】
サンプルは１：１０に希釈し、製造者のプロトコールに従い表２中に記載するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブセットを使用して分析した。それぞれの転写産物の相対量を３個のハウスキーピング遺伝子（ｓｉｇＡ、ｒｐｏＢ、およびｍｐｔ６４）の平均カウントに標準化することによって最初に計算し、次いでデータは、未処理対照由来のサンプルに対する倍率変化としてプロットする。ボックスは、薬剤特異的誘導の以前の痕跡に基づいて選択したプローブを示す（Boshoff et al、J Biol Chem.2004、279(38):40174-84.)。
【００８３】
薬剤耐性ＴＢ菌株は、イソニアジドへの曝露時に発現シグネチャーの誘導を明らかに示す薬剤感受性菌株とは対照的に、イソニアジドへの曝露時に発現シグネチャー誘導を示さない（図１６）。イソニアジド感受性と耐性のＴＢ菌株を比較する３個のスキャッタープロットを図１６中に示し、それぞれのドットは２４遺伝子プローブの１つを表す。軸はデジタル遺伝子発現技術（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標））によって測定した転写産物の数を表す。左−薬剤処理の不在下でのイソニアジド耐性菌株とイソニアジド感受性菌株における発現の比較。中央−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド感受性菌株（drug treated vs. drug untreated isoniazid sensitive strain）における発現の比較。右−薬剤処理と薬剤未処理のイソニアジド耐性菌株における発現の比較。
【００８４】
異なる遺伝子のセットを、図１７中に示すように薬剤に応じて、薬剤感受性結核菌（M.tuberculosis）において誘導する。薬剤感受性と薬剤耐性の結核菌（M.tuberculosis）の転写応答。（Ａ）本明細書に記載するようにＩＮＨ（０．４μｇ／ｍｌ）で処理した菌株Ａ５０（ＩＮＨ−Ｒ）。（Ｂ）ＳＭ−ＲクローンＳ１０は２μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで処理した。差次的遺伝子誘導をＴＢ２４遺伝子プローブセットのデジタル遺伝子発現により測定して確かなシグネチャーを明らかにすることができ、薬剤感受性を確認することができる（図１８）。
【００８５】
３個のハウスキーピング遺伝子、ｍｐｔ６４、ｒｐｏＢ、およびｓｉｇＡを標準化に使用した。それぞれの実験サンプル用に、実験遺伝子に関する加工していないカウントはこれら３個のハウスキーピング遺伝子の加工していないカウントの平均に標準化し、対照遺伝子に対する多量の試験遺伝子の指標を与えた。誘導または抑制は、非薬剤曝露サンプルと比較した、薬剤曝露サンプルにおけるこれらの標準化カウントの変化として定義する。この方法を使用して、以下の遺伝子は、イソニアジド、リファンピン、フルオロキノロン、およびストレプトマイシンへの曝露後に薬剤感受性ＴＢにおいて誘導または抑制されることが分かった。
【００８６】
イソニアジド：薬剤依存性誘導用：ｋａｓＡ、ｆａｄＤ３２、ａｃｃＤ６、ｅｆｐＡ、およびＲｖ３６７５．１。
リファンピン：薬剤依存性誘導用：ｂｉｏＤ、ｈｉｓＩ、ｅｒａ、およびＲｖ２２９６。
フルオロキノロン：薬剤依存性誘導用：ｒｐｓＲ、ａｌｋＡ、ｒｅｃＡ、ｌｔｐ１、およびｌｈｒ、薬剤依存性抑制用：ｋａｓＡおよびａｃｃＤ６。
ストレプトマイシン：薬剤依存性誘導用：ＣＨＰ、ｂｃｐＢ、ｇｃｖＢ、およびｇｒｏＥＬ。
【００８７】
実施例４：デジタル遺伝子発現および分子バーコードを使用した、薬剤感受性および耐性のＴＢを同定するための表現型発現シグネチャーベースの試験
この実施例は、痰中のＴＢの診断および耐性プロファイルの迅速な決定のための、表現型発現シグネチャーベースの試験を記載する。この方法は、バーコード化対分子プローブ（barcoded, paired molecular probe）のプローブセットの作製によって、その発現プロファイルがＴＢを独自に検出して薬剤耐性と感受性の菌株を区別する遺伝子の検出に基づく。遺伝子の選択は、無菌培養（複製と非複製状態の両方）におけるＴＢ、細胞培養マクロファージにおけるＴＢ、および痰においてスパイクしたＴＢを含めた様々な増殖条件下でマイクロアレイを使用して得た発現プロファイルデータの、バイオインフォマティクスによる解析によって決定した。
【００８８】
Ａ．ＴＢを同定するためのシグネチャーの定義
複製と非複製のＴＢの両方由来のｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズする分子プローブセットを確認している。これらのプローブは、全増殖条件下に多量に存在し、全ＴＢ菌株中で保存されるｍＲＮＡに特異的である。１６ＳｒＲＮＡ（Ａｍｐｌｉｃｏｒ、Ｒｏｃｈｅ）またはＩＳ６１１０領域（Ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ）を認識するＴＢを確認するための特有ＤＮＡ配列は以前に定義されているが、これらの定義された領域は、デジタル遺伝子発現におけるシグネチャーに必要とされる最適特性を有していない。１６ＳｒＲＮＡは、その長さのため低レベルの遺伝的変異性に耐え得る５０塩基オリゴマー遺伝子プローブを使用して、異なる種間で区別可能であったマイコバクテリア種間で十分分岐していない。ゲノムのＩＳ６１１０領域は、全増殖条件下においてそれがＴＢを同定するための確かなシグナルとして使用することができるほど十分高いレベルでは発現されない。したがって、他のマイコバクテリア種由来のＴＢの同定を可能にする発現シグネチャーを記載する。
【００８９】
ｉ．保存型ＴＢ遺伝子に関するバイオインフォマティクスによる遺伝子解析。 他のマイコバクテリア種に優るＴＢの検出に特有の発現シグネチャーを定義している。一般に、シグネチャーに含めるのに最適な遺伝子は、１．感度を増大するために高い発現レベル（高いｍＲＮＡコピー数）を有すること、２．全ＴＢ菌株中で高度に保存されていること、および高度に保存された配列を有すること、ならびに３．全ての他のマイコバクテリア種よりＴＢゲノムに非常に特異的であることの基準を満たす。このような遺伝子は、全ての他の配列決定済みマイコバクテリア種（すなわち、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（M.avium-intracellulaire）、マイコバクテリウム・カンサシ（M.kansaii）、マイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）、マイコバクテリウム・アブセサス（M.abscessus））中に存在しない利用可能なＴＢゲノムにおける保存型遺伝子のバイオインフォマティクスによる解析を使用して同定した。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで配列決定された臨床分離株由来の４０を超えるＴＢゲノムが分析のために利用可能である。
【００９０】
ｉｉ．候補遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現プロファイル分析。 痰中のＴＢバチルス（bacilli）を検出するための分子プローブの選択に関する第二の基準は、それらが非常に多量で安定状態のｍＲＮＡとハイブリダイズして最高感度をもたらすことである。このようなｍＲＮＡは、必須ハウスキーピング遺伝子に対応すると予想される。Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｔｂｄｂ．ｏｒｇ）で作成されたデータベース中の既存の公に入手可能な発現データのバイオインフォマティクスによる解析と、複製許容可能（対数増殖）および炭素枯渇、静止期、および低酸素により誘導される非複製条件下での候補遺伝子の高レベルの発現を確認するための発現プロファイリングを使用したＴＢ菌株Ｈ３７Ｒｖに関する実験発現プロファイルの組合せを使用して、遺伝子が選択されている。Ｈ３７Ｒｖに関する発現プロファイリング実験を、確立しているＴＢの炭素枯渇モデル（７Ｈ９／チロキサポール中で５週間枯渇）、静止期増殖、および嫌気的増殖に関するＷａｙｎｅモデル（密封チューブ中でゆっくり攪拌する培養）を使用して実施する。ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること、および配列決定を使用してｃＤＮＡ分子をカウントすることによって、Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を使用して発現プロファイルを決定する。発現レベルを確認するためのこの定量法は、マイクロアレイデータよりデジタル遺伝子発現を使用して得られるレベルを反映する可能性が高く、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍで確立された方法である。レーン当たり７５ｂｐリードおよび１０００万リードとして配列決定レーン当たり１２サンプルを多重化することができる。
【００９１】
ｉｉｉ．ＴＢを同定するための発現シグネチャーのプローブ選択。 デジタル遺伝子発現技術は２個の５０ヌクレオチドプローブと対象のｍＲＮＡのハイブリダイゼーションに基づくので、遺伝子中の２個の５０塩基対領域は、非特異的ハイブリダイゼーションを最小にするためゲノム内に特異的であり、配列決定したＴＢゲノムから証明される最小多型を含有する（Ａｉ）および（Ａｉｉ）から同定する。プローブはバイオインフォマティクスにより選択して、５℃の融解温度範囲内、最小ｍＲＮＡ二次構造に適合させる。プローブは（多数の菌株、すなわちＨ３７Ｒｖ、ＣＤＣ１５５１、Ｆ１１、Ｅｒｄｍａｎを含めた）複製および非複製ＴＢ、マイコバクテリウム・マリヌム（M.marinum）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラーレ（M.avium-intracellulaire）、マイコバクテリウム・カンサシ（M.kansaii）、およびマイコバクテリウム・ホルツイツム（M.fortuitum）から単離したｍＲＮＡに対して試験して、利用可能な技術を使用してプローブセット全体の特異性を確認した。プローブはこれら他のマイコバクテリア種用に選択することができ、これらによって痰由来のこれらの病原体の同定も可能にする。イントラセルラーレ・バチルス（intracellular bacilli）を同定する能力をマクロファージ感染モデルで試験して、宿主ｍＲＮＡの存在下でＴＢｍＲＮＡを検出する能力を実証する。最後に、アッセイの感度を、試験サンプル中のＴＢバチルス（bacilli）（したがって細胞溶解物中に存在するｍＲＮＡ）の数をタイトレーションする（titrating down）ことによって決定する。デジタル遺伝子発現を使用する全ての実験は、同じ遺伝子セットに対して定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して確認する。セットの改良および精錬は反復式に行う。
【００９２】
Ｂ．感受性ＴＢと耐性ＴＢを区別するためのシグネチャーの定義
薬剤感受性と耐性の菌株を区別するプロファイルを得ることができる、それぞれ個々のＴＢ用薬剤への曝露時に特異的に誘導されるｍＲＮＡとハイブリダイズする分子プローブのセットが同定されている。イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン、およびモキシフロキサシンへの曝露に関するシグネチャーが決定されている。
【００９３】
シグネチャーに含めるのに理想的な遺伝子に関する前述の特性（すなわち、ＴＢ菌株中で保存されていること、ＴＢゲノムに特異的であること）に加えて、いくつか他の特性が薬剤耐性のシグネチャーに関する遺伝子選択において優先される。薬剤耐性は薬剤感受性と薬剤耐性の菌株における転写産物誘導間の差によって決定されるので、理想的な遺伝子候補は所与の薬剤への曝露時に薬剤感受性菌株において高度に誘導される。これらの遺伝子は、初期に早急に誘導されるのが理想的である。この時間期間は、かなりの程度で診断試験全体の迅速性を決定するからである。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用したデータに基づいて、わずか１〜２時間以内に薬剤曝露に対する転写応答を観察する（図１９）。ｍＲＮＡ分子の半減期を考慮すると、遺伝子抑制ではなく遺伝子誘導の利用がより迅速で検出可能な応答をもたらす。
【００９４】
イソニアジドおよびストレプトマイシンに関する記載した全ての実験に関して、野生型、完全薬剤感受性Ｈ３７Ｒｖと比較するために使用する単剤耐性菌株のセット（a set of singly resistant strain）を作製したＢＳＬ３設定で、ＴＢ菌株Ｈ３７Ｒｖを使用した。リファンピンが研究室における感染という予期せぬ事象における治療オプションであることを確実にするために、増殖にリシンおよびパントテン酸の添加を必要とするＴＢの栄養要求株（ｌｙｓＡ、ｐａｎＣ）においてリファンピン耐性変異体を作製する。
【００９５】
最後に、任意または全ての抗生物質に対する一般的なストレス応答ではなく、それぞれの抗生物質に特有であるシグネチャーを同定している。この特異性の理論的根拠は、臨床設定で、多くの患者は異なる抗生物質で経験的に既に治療されており、したがっていくつかの一般的なストレス応答が、痰サンプル中のバチルス（bacilli）において既に活性化されている可能性があることである。しかしながら、試験および分析で薬剤特異的応答は保たれる。
【００９６】
ｉ．抗生物質に対する曝露に応答した発現プロファイリング。 薬剤感受性と耐性の菌株Ｈ３７Ｒｖにおける転写応答を区別する候補遺伝子を同定するための発現プロファイリングを実施する。痰中のバチルス（bacilli）の複製状態または転写活性は知られていないので、（５週間の炭素枯渇モデルによって誘導した）非複製状態のバチルス（bacilli）において追加的実験を実施する。薬剤曝露に次いで応答し得るいくらかの基底転写（basal transcription）を刺激するために、非複製状態のバチルス（bacilli）が富栄養培地（７Ｈ９／ＯＡＤＣ）中での短時間（ｔ１）の「増殖刺激」を必要とするかどうか決定する（図２０）。薬剤感受性と耐性の菌株を区別するための確かなシグネチャーおよび最適薬剤濃度を得るための薬剤曝露に必要とされる最適時間期間（ｔ２）も決定して、確かな、再現可能な応答を得る。これらの実験は、個々の抗生物質のそれぞれについて実施する。
【００９７】
完全非複製状態は、痰中のバチルス（bacilli）が非複製状態、休眠状態である場合の、「最悪のシナリオ」（すなわち、必要とされ得る最長の時間）である。実際、患者の痰中のバチルス（bacilli）からの発現プロファイリングを調べた刊行物に基づくと、発現プロファイリングが痰中のバチルス（bacilli）から直接得られたとして、この時間は必要とされる場合は必ず非常に短い。（特に、この刊行物のデータを分析中にさらに取り込んで、痰中の細菌において考えられる遺伝子候補への最初の見通しをもたらす。）プロファイリング実験のマトリックス（a matrix of profiling experimants）を実施し、それぞれのｔ１に関して０、１、および２時間からリッチ７Ｈ９／ＯＡＤＣ培地への曝露時間（ｔ１）、およびそれぞれの抗生物質への曝露時間（ｔ２）を変える。ｔ１とｔ２のそれぞれのセットに関して、抗生物質濃度をそれぞれの抗生物質に関して、感受性と耐性のＨ３７Ｒｖ菌株の両方に関して１×、３×、および５×最小阻害濃度（ＭＩＣ）から変えて、最適パラメーターを決定する。発現プロファイリングを使用して、確かな、再現可能なプロファイルを生成するのに最適な条件を同定する。
【００９８】
最適条件（ｔ１およびｔ２）に基づいて、発現プロファイリングをこれらの条件下で薬剤感受性および耐性のＨ３７Ｒｖ菌株において実施する。バイオインフォマティクスによる解析を実施して、誘導のレベルが薬剤耐性菌株と比較して薬剤感受性菌株において高い各薬剤に関して遺伝子を同定する（抑制のレベルが薬剤耐性菌株と比較して薬剤感受性菌株において高いリファンピン以外）。発現のレベルを薬剤感受性と薬剤耐性の菌株の間で比較し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって確認する。
【００９９】
ｉｉ．薬剤耐性を確認するための解析アルゴリズムの開発。 最適アルゴリズムを決定して、（標準ＭＩＣ測定によって定義される）感受性と耐性の菌株を区別する遺伝子セットに関する発現率を分析する。この方法の長所の１つは大部分の例（すなわち、ＴＢ抗生物質に事前に曝露されていない例）に関するものであり、所与の抗生物質に曝露した菌株と曝露していない同じ菌株の間で遺伝子発現レベルの比較を行うことができる。定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１．抗生物質への曝露なし、２．イソニアジドへの曝露、３．リファンピンへの曝露、４．エタンブトールへの曝露、５．ストレプトマイシンへの曝露、および６．モキシフロキサシンへの曝露を含む条件下でＨ３７Ｒｖ由来のｍＲＮＡレベルを測定する。抗生物質への曝露後の所与の遺伝子からの発現のレベルは、定常状態のハウスキーピング遺伝子のセット（すなわち、ハウスキーピング遺伝子の転写を刺激する主なシグマ因子をコードするｓｉｇＡ、およびＲＮＡポリメラーゼの合成サブユニットをコードするｒｐｏＢ）からの発現のレベルに標準化し、抗生物質への曝露の不在下での同じ遺伝子の発現の同じ標準化レベルと比較する。標準感受性菌株と耐性対照菌株の比較も行う（図２１）。理想としては、特定薬剤への曝露は、薬剤感受性菌株において高レベル、Ａ＞＞Ｂ、一方で薬剤曝露に対して感受性がない薬剤耐性菌株に関して、Ａ＝Ｂの遺伝子発現を誘導する。（リファンピンの機構、すなわちＡ＝Ｃ＜＜Ｂ＝Ｄを考慮して、最も短い半減期を有するｍＲＮＡの遺伝子抑制を検出する、リファンピンに関しては例外である。）転写レベルの広いダイナミックレンジのため、Ｃ／Ｄの比が最大であり、したがって感受性と耐性の菌株の明白で確かな区別を可能にする遺伝子を選択する。さらに、他の抗生物質を用いて誘導される応答の重複がないように、それぞれ個々の抗生物質に関して、最適な、独自の遺伝子セットを選択している。
【０１００】
ｉｉｉ．ＴＢバチルス（bacilli）のシグネチャーに対する事前の抗生物質に対する曝露の影響の解析。 患者を抗生物質で事前に治療した場合においても耐性パターンを確認するための、これらのシグネチャーの有効性を測定するために、薬剤感受性および耐性のＴＢバチルス（bacilli）（複製、非複製、マクロファージ内）を、この試験の適用前にＴＢ特有の設定で患者に施すことができる一般的な抗生物質である、アモキシシリン、セファロスポリン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびエリスロマイシンに事前に曝す。現在のＴＢ薬剤の異なる組合せへのＴＢバチルス（bacilli）の事前の曝露をさらに実施して、このような事前の曝露が、このような応答を検出する問題の転写応答能力にも干渉するかどうか決定する。独自のシグネチャーが保たれ、したがって耐性を決定する問題の能力は妨害されないはずである。対象の遺伝子のセットの遺伝子発現レベルは定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定する。
【０１０１】
ｉｖ．耐性プロファイルを確認するための発現シグネチャーのプローブ選択。
Ｓｕｂ−ａｉｍ Ｂｉにおいて得たデータに基づいて、抗生物質への曝露に対する転写応答に関するシグネチャーをもたらす候補遺伝子のセットを選択する。ＴＢゲノム中で高度に保存された領域内の、それぞれの遺伝子に関する２個の５０塩基対領域を選択する。プローブはバイオインフォマティクスにより選択して、５℃の融解温度範囲内、最小ｍＲＮＡ二次構造に適合させる。これらのプローブを使用して、最初に複製または非複製状態である無菌培養中のバチルス（bacilli）、本発明者らが現在研究室に有する細胞培養マクロファージ感染モデル中のイントラセルラーレ・バチルス（intracellular bacilli）、および異なる抗生物質の組合せに事前に曝した細菌を含む、前に記載した条件下で利用可能な技術を使用して、薬剤感受性と耐性の菌株を比較する。全ての結果は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって得たデータと比較する。セットの改良および精錬は反復式に行う。
【０１０２】
Ｃ．分子バーコードを用いたデジタル遺伝子発現用のサンプル処理の最適化。
発現シグネチャーを確認するためのプローブセットの定義に加えて、第二の大きな課題は、サンプルの処理を最適化して、サンプル内に存在するバチルス（bacilli）からのデジタル遺伝子発現を測定することである。ＴＢ症例の大部分は肺が発端であり、処理するサンプルの大部分は患者の痰であるので、感染ＴＢバチルス（bacilli）からｍＲＮＡ測定値を得るための痰サンプルの処理を最適化する。（抗生物質で治療されていない）健常な、非感染患者から回収した痰を、複製または非複製（炭素枯渇）状態のいずれかであるＴＢバチルス（bacilli）でスパイクした、スパイク痰モデルを使用する。対処すべき問題としては、様々な粘性の痰の処理、痰サンプル内のＴＢバチルス（bacilli）の効率よい溶解が挙げられる。デジタル遺伝子発現の主な利点の１つは、粗製細胞溶解物、固定組織サンプル、全血および尿中の細胞、ダニ（tick）の粗製溶解物由来の細胞、および４００ｍＭのイソチオシアン酸グアニジン（ＧＩＴＣ）、ポリアクリルアミド、およびトリゾールを含有するサンプルを含めた非常に粗製状態のサンプルにおいて、ｍＲＮＡがそのそれぞれのプローブとハイブリダイズする能力である。したがって一次適用は、痰内の細菌の溶解後に精製ステップが必要とされないことを示唆する。全血、尿、または固定組織サンプルからの精製は必要とされていないからである。唯一の要件は、プローブとｍＲＮＡの間の接触を可能にする十分な混合である。
【０１０３】
これらの実験用に、非感染状態の痰をＢｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）の試料バンクから得る。試料バンクは、ＢＷＨ病理部のＬｙｎ Ｂｒｙ、ＭＤ、ＰｈＤにより管理されるＩＲＢ制御機関である。廃棄用の痰は、研究室内で全ての処理が終了した後に得る（一般に回収の１２〜２４時間以内）。事前の４８時間以内にいかなる抗生物質も与えていない被験体のみから、痰を回収する。全てのサンプルが確認されるわけではないので、保護された健康情報は得られない。試料研究室の現在の負担に基づいて、必要な量の痰（２５〜５０ｍＬ）を数週間以内に得る。
【０１０４】
ｉ．痰の処理。 痰サンプルは細菌量、コンシステンシー、および粘性が様々である。いくつかのアプローチを試験して、細菌が培地条件で殺菌レベルの抗生物質と接触する迅速性、およびハイブリダイゼーション用のオリゴマープローブへの曝露を最大にする。無処理、注射針を介した痰の移動、リゾチームおよび／またはＤＮａｓｅ、嚢胞性線維症患者由来の痰を処理するために標準的に使用されるＳｐｕｔａｌｙｓｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；０．１％ＤＴＴ）を用いた処理、またはある最小変性剤（すなわちＧＩＴＣ）へのサンプルの単純な希釈を含めた、痰を処理するいくつかの方法を使用する。痰はＨ３７Ｒｖでスパイクし、その粘性を変えるための様々な方法によって処理し、それらを実施して任意のこれらの方法がこの技術に干渉するかどうか決定する。
【０１０５】
ｉｉ．ＴＢバチルス（bacilli）でスパイクした痰中の細菌溶解。 細菌細胞を効率よく溶解するため、転写および酵素ベースのｍＲＮＡ分解を抑制するため、およびｍＲＮＡをプローブにアクセス可能にするための、いくつかのアプローチをアッセイ中で使用する。痰中の細菌の転写応答を調べた以前の試験は、サンプルにＧＴＣまたは類似の試薬を最初に加えて転写応答を抑制した。次いで遠心分離を使用して、ＧＴＣ処理後に痰サンプル由来の細菌を濃縮することができる。マイコバクテリア（mycobacteria）の溶解は一般に、物理的手段、すなわち０．１ｍｌのガラスまたはジルコニウムビーズを用いた均質化によって実施する。このような物理的手段を利用して処理した痰内の細菌を破壊し、ＴＢバチルス（bacilli）検出用に１Ａから設計したプローブセットを使用して、非感染ヒト痰にスパイクしたバチルス（bacilli）を分析する。
【０１０６】
他の方法を、ファージ溶解を含めた、現場ベースの考慮事項により影響を受ける可能性がある溶解に使用する。ファージ、またはより最適には、精製ファージリシン（１つまたは複数）の添加によって、細菌溶解のための、低コストの、単純で、かつ非電気的な選択肢をもたらすことができる。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ研究室（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、ペプチドグリカンを酵素的に加水分解し浸透圧溶解をもたらす精製バクテリオファージリシンを使用した、いくつかのグラム陽性種の迅速で完全な溶解を近年実証している。Ｈａｔｆｕｌｌ研究室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）は、数種の溶解性マイコバクテリオファージ由来のＬｙｓＡ酵素の活性を特徴付けるため、およびその性能を最適化するために現在作業している。精製リシンの不在下で、調査を実施して、高ＭＯＩ感染のＴＢおよびＤ２９などの溶解性バクテリオファージが痰中のＴＢを効率よく溶解することができるかどうかを決定する。どのようにしてこの手法が細菌の転写プロファイルに影響を与えるかは、現在明らかではない。それはおそらく、ファージの結合、進入、および二次溶解性を妨害し得る変性剤の不在下で起こる必要があるからである。マイコバクテリオファージＴＭ４は、ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を有する構造タンパク質Ｔｍｐをさらに発現し、このためそれを高ＭＯＩでの細胞溶解の迅速な手段として使用することができる。溶解後、内因性ＲＮＡｓｅ活性を不活性化するＧＩＴＣ、ＲＮＡｌａｔｅｒ、または他の試薬でｍＲＮＡを安定状態にする。
【０１０７】
実施例５：
細菌および真菌培養： 大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、緑膿菌（P.aeruginosa）、プロビデンシア・スチュアリティ（Providencia stuartii）、プロテウス・ミラビリス（P.mirabilis）、霊菌（S.marcescens）、エンテロバクター・アエロゲネス（E.aerogenes）、エンテロバクター・クロアカエ（E.cloacae）、モルガネラ・モルガニー（M.morganii）、クレブシエラ・オキシトカ（K.oxytoca）、カンジダ・フロインディ（C.freundii）、またはカンジダ・アルビカンス（C.albicans）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。混合実験用に、ＯＤ６００によって決定した等数の細菌をＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）分析用に溶解前に組み合わせた。マイコバクテリウム（Mycobacterium）分離株は、以下に記載するように採取または抗生物質への曝露まで、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９培地中で対数増殖中期まで増殖させた。
【０１０８】
耐性実験室細菌菌株の誘導： 大腸菌（E.coli）実験室菌株Ｊ５３および定義済みｇｙｒＡフルオロキノロン耐性染色体変異体（ｇｙｒＡ１−Ｇ８１Ｄ；ｇｙｒＡ２−Ｓ８３Ｌ）を、Ｈｏｏｐｅｒ ｌａｂ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡから得た。プラズマ媒介性キノロン耐性決定基（ｏｑｘＡＢ、ｑｎｒＢ、ａａｃ６−Ｉｂ）は、これらのプラスミドを含有することが以前に決定された臨床分離株から精製した。大腸菌（E.coli）親菌株Ｊ５３をこれらのプラスミドで形質転換し、それらの存在はＰＣＲによって確認した。
【０１０９】
ウイルスおよびプラスモジウム（plasmodium）感染： ＨｅＬａ細胞（１×１０６）、２９３Ｔ細胞（２×１０５）、およびヒト末梢血単球（５×１０５）を、示したＭＯＩで、それぞれＨＳＶ−１菌株ＫＯＳおよびＨＳＶ−１菌株１８６Ｓｙｎ＋、インフルエンザＡ ＰＲ８、またはＨＩＶ−１ＮＬ−ＡＤＡに感染させた。主要赤血球細胞（５×１０９）は、それらが示したレベルの寄生虫血症に達するまで、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）菌株３Ｄ７に感染させた。示した時間で、細胞はＰＢＳで１回洗浄し採取した。
【０１１０】
抗生物質への曝露： 大腸菌（E.coli）または緑膿菌（P.aeruginosa）の培養物をＬＢ中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。次いで培養物を２つのサンプルに分け、その１つは抗生物質で処理した（大腸菌（E.coli）、１０分間：シプロフロキサシン４〜８μｇ／ｍｌまたは３００ｎｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン６４または１２８μｇ／ｍｌ、またはアンピシリン５００μｇ／ｍｌ；緑膿菌（P.aeruginosa）、３０分間：シプロフロキサシン１６μｇ／ｍｌ）。処理部分と未処理部分の両方を２００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃に維持し、黄色ブドウ球菌（S.aureus）またはエンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）の培養物をＬＢ中で約１のＯＤ６００まで増殖させた。次いで培養物は、３０分間それぞれクロキサシリン（２５μｇ／ｍＬ）またはバンコマイシン（１２８μｇ／ｍＬ）に曝した。
【０１１１】
結核菌（M.tuberculosis）の培養物を対数増殖中期まで増殖させ、次いで０．２のＯＤ６００に標準化した。２ｍｌのそれぞれの培養物を、無抗生物質または以下の（最終濃度の）：イソニアジド０．２〜１．０μｇ／ｍｌ；ストレプトマイシン５μｇ／ｍｌ、リファンピシン０．５μｇ／ｍｌ、またはシプロフロキサシン５μｇ／ｍｌの１つのいずれかで処理した。プレートは密封し、攪拌せずに３または６時間インキュベートした。次いで溶解物を作製し、表６中に列挙するプローブを使用して、前に記載したように分析した。
【０１１２】
サンプル処理： グラム陰性分離株に関して、５〜１０μｌの培養物を１００μｌのＲＬＴバッファーに直接加えて攪拌した。臨床試料に関して、大腸菌（E.coli）菌尿路感染症を有することが臨床研究室によって決定された患者由来の２０μｌの尿は、１００μｌのＲＬＴバッファーに直接加えた。マイコバクテリア（mycobacteria）に関して、１．５ｍｌの培養物を遠心分離し、次いでビーズ刺激による機械的破壊有りまたは無しでＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、初期水相を分析用に回収した。ウイルスおよび寄生虫のＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌおよびクロロホルムを使用して同様に調製した。全ての溶解物に関して、標準的なＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プロトコールに従い３〜５μｌをハイブリダイゼーションにおいて直接使用した。加工していないカウントをサンプル用の全プローブの平均に標準化し、それぞれの遺伝子に関する誘導倍率は抗生物質処理サンプルと未処理サンプルを比較することにより決定した。
【０１１３】
生物同定用プローブの選択： 生物の差次的検出用のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを選択するため、関連生物の全ての公に入手可能な配列決定ゲノムを比較した。その種の全ての配列決定ゲノムに関するＣＤＳ長の少なくとも７０％にわたり少なくとも５０％の同一性を有するコード配列（ＣＤＳ）を選択することによって、各種内で保存された遺伝子を同定した。ＣＤＳは重複５０量体に破壊し、試験中に種内で完全に保存され任意の多種中のＣＤＳと５０％を超えない同一性を有する５０量体のみを保持した。遺伝子発現オムニバスにおいて入手可能な公開済みの発現データを概観し、大部分の条件下で十分な発現がある遺伝子を選択した。特有の結核菌（M.tuberculosis）プローブを同定するために、公開済みのマイクロアレイデータを使用して、２クラス：結核菌（M.tuberculosis）複合体に特有な遺伝子（ＢＬＡＳＴＮを使用した非冗長データベースにおいて任意の他の遺伝子と７０％を超える同一性、全ての入手可能な結核菌（M.tuberculosis）およびマイコバクテリウム・ボビス（M.bovis）ゲノム中で保存されている）、および結核菌（M.tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（M.avium）、およびヨーネ菌（M.paratuberculosis）を含めた臨床上関連があるマイコバクテリア（mycobacteria）のセット中で８５％を超える同一性を有する遺伝子の１つの範疇に入る高度に発現された遺伝子を同定した。カンジダ・アルビカンス（C.albicans）用プローブを、そのプローブセット中に含まれた１０のさらなる病原体生物の完全ゲノムと比較して特有な、カンジダ・アルビカンス（C.albicans）ゲノムの５０量体セグメントに対して設計した。ウイルス用プローブは、同じファミリー内のウイルス間（すなわち、ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の間）で低度に保存されたウイルス（すなわち、全てのＨＳＶ−２またはＨＩＶ−１分離株）内で高度に保存された遺伝子に対して設計した。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）用プローブは、寄生虫の生活環の血液段階（blood stage）のそれぞれで多量に発現された遺伝子に対して設計した。全てのプローブをスクリーニングしてヒトＲＮＡとのクロスハイブリダイゼーションを回避した。
【０１１４】
プローブセット： グラム陰性生物の同定用に、大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（K.pneumoniae）、および緑膿菌（P.aeruginosa）用プローブを含有するプールしたプローブセットを使用した。マイコバクテリウム（mycobacterial）生物の同定用に、特に結核菌（M.tuberculosis）種特異的プローブおよびより広範囲のマイコバクテリウム（mycobacterial）属用プローブが、微生物病原体に対するより広範囲のプローブセットであった。
【０１１５】
応答の有無を測定するために、様々な抗菌剤への曝露時に差次的に制御される遺伝子用にプローブを設計した（Sangurdekar et al、Genome Biology 7、R32(2006); Anderson et al、Infect.Immun.76、1423-1433、(2008); Brazas and Hancock、Antimicrob.Agents Chemother.49、3222-3227、(2005)）。シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、またはアンピシリンに野生型大腸菌（E.coli）Ｋ−１２を１０〜３０分間曝した後、それぞれの抗生物質に関する薬剤感受性発現シグネチャーを同時に定義する転写レベルの予想された変化を観察した（図２３Ａおよび２３Ｂ、表７）。これらのシグネチャーは対応する耐性菌株では誘導されなかった（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０１１６】
表現型試験の確立した方法は数週間〜数ヶ月を要するので、迅速な表現型による薬剤感受性試験は、結核において特に顕著な影響を与える可能性がある（Minion et al、Lancet Infect Dis 10、688-698、(2010)）。抗結核薬イソニアジド、シプロフロキサシン、およびストレプトマイシンに応答した発現シグネチャーによって、３〜６時間の抗生物質への曝露後に感受性と耐性の分離株を区別することができた（図２３Ｃ）。転写プロファイルにおけるいくつかの遺伝子は機構特異的である（すなわち、シプロフロキサシンに関してｒｅｃＡ、ａｌｋＡ、およびｌｈｒ、ストレプトマイシンに関してｇｒｏＥＬ、およびイソニアジドに関してｋａｓＡおよびａｃｃＤ６）。他の遺伝子、特にミコール酸合成または中間代謝と関係がある遺伝子は、多数の抗生物質に応答して下方制御され、増殖から損傷修復へのシフトを示す。
【０１１７】
これらの複合応答を、感受性と耐性の菌株を区別するための、１つの定量的測定基準にまとめるために、各実験サンプルから、対照抗生物質感受性サンプルの中心からの発現応答の平均二乗距離（ＭＳＤ）の測定基準を利用した。抗生物質感受性菌株は密集し、したがって小さいＭＳＤを有する。逆に抗生物質耐性菌株は、より大きな値、平均的感受性菌株と同様の形式で抗生物質に応答しなかった多数の遺伝子の結果を有する。ＭＳＤは、標準偏差、大腸菌（E.coli）（図２４Ａ、２４Ｂ、２７、および２８）または結核菌（M.tuberculosis）（図２４Ｃおよび２９）の感受性分離株の平均範囲内のサンプルの数を示す、点の（dimensionless）Ｚスコアとして報告される。
【０１１８】
発現プロファイルは遺伝子型ではなく表現型を反映するので、様々な機構によって媒介される耐性は、１つの統合された発現シグネチャーを使用して測定することができる。シプロフロキサシン感受性大腸菌（E.coli）菌株Ｊ５３の転写応答は、異なる耐性機構を有する一連の同質遺伝子変異体、フルオロキノロン標的遺伝子トポイソメラーゼｇｙｒＡに一種の変異（Ｇ８１ＤまたはＳ８３Ｌ）を有する２つ、およびａａｃ（６’）−Ｉｂ（アセチル化、不活性酵素）、ｑｎｒＢ（ｇｙｒＡの活性部位を遮断する）、およびｏｑｘＡＢ（排出ポンプ）を含むエピソームキノロン耐性遺伝子を有する３つと比較した。親菌株と比較して、全てのＪ５３誘導体は、耐性を示す大きなＺスコアを有していた（図２４Ｂ）。
【０１１９】
イソニアジドに対する応答を、一連の感受性臨床および実験室分離株、およびｋａｔＧ（Ｓ３１５Ｔ）、プロドラッグ活性化に必要なカタラーゼに変異を有するＨ３７Ｒｖ由来実験室菌株、およびｉｎｈＡ（Ｃ−１５Ｔ）、イソニアジドの標的のプロモーターに変異を有する臨床分離株を含む、２個のイソニアジド耐性菌株において比較した。それらの異なる耐性機構のため、これら２個の菌株はイソニアジドに対して異なるレベルの耐性を有し、ｋａｔＧ変異体は高レベルの耐性（６．４μｇ／ｍＬを超えるまで最小阻害濃度（ＭＩＣ）の１００倍を超える増大）を有し、一方ｉｎｈＡプロモーター変異は０．４μｇ／ｍＬまでわずか８倍のＭＩＣの増大をもたらす。低いイソニアジド濃度（０．２μｇ／ｍＬ）への曝露はいずれの耐性菌株においても転写応答を誘導することができなかったが、高いイソニアジド濃度（１μｇ／ｍＬ）では、ｋａｔＧ変異体と対照的に、ｉｎｈＡ変異体は感受性がある形式で応答する（図２４Ｃ）。したがって、この方法は機構独立性であるだけでなく、高レベルと低レベルの耐性を区別するための比較測定値も与えることができる。
【０１２０】
最後に、細菌、ウイルス、真菌から寄生虫の範囲の病原体においてＲＮＡはほぼユニバーサルなので、広範囲の感染因子にわたり適用可能である１つの診断プラットフォームにＲＮＡ検出を組み込むことができる。大きな混合型病原体用プローブのプールを使用して、本発明者らは、真菌病原体カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）（図２５Ａ）；用量依存式に細胞培養中にヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus）（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス（influenza virus）および単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus-2）（ＨＳＶ−２）（図２５Ｂ〜Ｄ）；および感染赤血球における熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）生活環の異なる段階（図２５Ｅ）を同定するためのシグナルを直接かつ特異的に検出することができた。
【０１２１】
薬剤感受性に関する距離の測定基準である平均二乗距離のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）によるデータの分析および計算： 全ての薬剤処理サンプルに関して、それぞれのプローブに関する加工していないＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）カウントを、それぞれのサンプル用の全ての関連（すなわち、種に適した）プローブの平均に最初に標準化した。転写レベルの変化倍率は、抗生物質処理サンプル中のそれぞれのプローブに関する標準化カウントと、それぞれの試験条件に関する未処理ベースラインサンプル中の対応するカウントを比較することによって決定した。
【０１２２】
定性発現シグネチャーを感受性または耐性のバイナリ形式の結果に変換するために、同じ薬剤に曝した感受性菌株のそれからのサンプルの転写プロファイルの平均二乗距離（ＭＳＤ）を計算するためのアルゴリズムを開発した。薬剤感受性実験におけるＭＳＤ測定基準は以下のように計算した：
１．サンプル量の変動を、加工していない値（raw value）をサンプル中の全ての関連プローブについてのカウントの平均数に標準することによって補正する。
２．本発明者らがＰｊと示す一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。この分析は薬剤感受性分離株と薬剤耐性分離株の間で差次的に変化したプローブに限られる。
３．薬剤感受性菌株の複製はＮｓａｍｐとして定義する。それぞれの複製に関して、薬剤処理前後のそれぞれのプローブＰｊに関する標準化カウントは
【数１】
または
【数２】
で示し、ｉはサンプルインデックスを表す。
４．「対数誘導比」を次に算定する：
【数３】
このように比を対数変換することによって、いずれか１つのプローブが計算したＭＳＤを占めるのを妨げる。
５．薬剤感受性サンプルの平均誘導比、
【数４】
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数５】
６．ＭＳＤを、（インデックスｉの）薬剤感受性菌株の複製それぞれに関して次いで計算する、これは全ての薬剤感受性サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数６】
７．耐性菌株に関する誘導比、
【数７−１】
は感受性菌株のそれと同様に計算する：
【数７−２】
８．薬剤耐性菌株に関するＭＳＤを、薬剤感受性集団の中心と比較して計算する：
【数８】
【０１２３】
大部分の感受性菌株は平均的感受性菌株と同様に挙動するので、
【数９】
の典型的な値は、耐性菌株に関する典型的な値
【数１０】
と比較して小さい。
【０１２４】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１１】
の値は平均からの偶発偏差数（random deviation）の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって、薬剤感受性集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１２】
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１３】
【０１２５】
この測定基準を、異なる抗生物質に対して試験した多数の研究室および臨床分離株の分析に適用し、そのデータは図２４、２７、２８および２９中に示す。
【０１２６】
生物同定のための距離測定基準の計算： 多数のプローブからの情報をバイナリ形式の結果に変換するために、それぞれのプローブに関する加工していないカウントを対数変換した。このように比を対数変換することによって、いずれか１つのプローブが分析を占めるのを妨げる。次いでこれらの対数変換カウントを技術反復間で平均する。
【０１２７】
Ｐｊと示される一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを記載したように選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。
【数１４−１】
【０１２８】
生物同定は擬似または異なる生物と比較して転写産物を検出する能力に依存するので、対象の生物なしで調製したサンプル中のバックグラウンドレベルのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）カウントをしたがって使用して対照中心を定義した。これらの対照サンプルの中心
【数１４−２】
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数１５】
【０１２９】
ＭＳＤを、（インデックスｉの）実験サンプルの平均技術反復に関して次いで計算する、これは全ての対照サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数１６】
【０１３０】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１７】
の値は平均からの偶発偏差数の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって本発明者らは、対照集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１８】
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１９】
【０１３１】
この測定基準を、図２６および表４中に示す関連細菌種に関して試験した多数の研究室分離株および臨床分離株の分析に適用した。その生物に関してＭＳＤが２を超えた場合に、特定生物として菌株を同定した。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
本明細書に記載するＲＮＡ発現シグネチャーの直接測定は、培養中および患者試料に直接由来する一定範囲の病原体の迅速な同定をもたらすことができる。特に、抗生物質への曝露に対する表現型による応答によって感受性菌株と耐性菌株を区別することができ、したがって共通応答に様々な耐性機構を組み込む非常に早期の迅速な感受性の決定をもたらすことができる。この原理は、病原体ＲＮＡが広範囲の臨床設定および感染性疾患に適用可能である一診断プラットフォームの基盤を形成するパラダイムシフトとなり、病原体の同定および迅速な表現型による抗微生物感受性試験を同時にもたらす。
【０１３７】
参考文献
【表５】
【０１３８】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するわけでなく、それを例示することを目的とすることは理解されよう。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
【表８】
【０１４２】
【表９−１】
【表９−２】
【表９−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体の薬剤感受性を決定する方法であって、
病原体を含むサンプルを提供するステップ；
サンプルと１つまたは複数の試験化合物を接触させて試験サンプルを提供するステップ；
病原体から試験サンプル中にメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが、耐性がある生物と比較して試験化合物に感受性がある生物中で差次的に発現される標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こる、ステップ；
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ；および
試験化合物の存在下で標的ｍＲＮＡのレベルと参照レベルを比較するステップであって、標的ｍＲＮＡの参照レベルと比較した標的ｍＲＮＡのレベルの違いが、病原体が試験化合物に対して感受性であるか、または耐性であるかを示すステップ
を含む、方法。
【請求項２】
試験化合物が病原体に対する既知の治療または潜在的な治療である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、サンプルを２つ以上の試験化合物と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルを４時間未満１つまたは複数の試験化合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
感染性疾患の病原体を同定する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、
参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す、方法。
【請求項６】
試験サンプルが、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、および子宮頸部／膣スワブからなる群から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
試験サンプルが複数の異なる感染性疾患の病原体または非病原性生物を含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の核酸プローブが表２から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項９】
病原体が細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１０】
病原体が結核菌（Mycobacterium tuberculosis）である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１１】
プローブとの接触前にｍＲＮＡが粗製状態である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、ｍＲＮＡを増殖するステップを含まない、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、酵素的、化学的、または機械的に細胞を溶解するステップを含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、マイクロ流体デバイスの使用を含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、病原体感染をモニタリングするために使用される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１６】
病原体が被験体からのサンプル中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体がヒトである、請求項５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験体用の治療を決定または選択するステップ、および、必要に応じて、被験体に治療を施すステップをさらに含む、請求項５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
被験体用の治療を選択する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡ間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、必要に応じて、被験体からのサンプル中の病原体を同定するステップと、
請求項１に記載の方法を使用して病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
病原体が感受性のある薬剤を、被験体を治療する際に使用するために選択するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
被験体における病原体による感染をモニタリングするための方法であって、
第一の時点に、病原体を含む第一のサンプルを得るステップ；
請求項１に記載の方法を使用して第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；
必要に応じて、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ；
第二の時点に、病原体を含む第二のサンプルを得るステップ；
請求項１に記載の方法を使用して第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；および
第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性と第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を比較し、それによって被験体における感染をモニタリングするステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
被験体が免疫無防備状態である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ、ならびに、請求項１に記載の方法を使用して選択した治療に対する、第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップを含み、病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあるかを示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるまたは治療に耐性がある状態になりつつあることを示し、前記方法が、被験体に異なる治療を施すステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の集団内における病原体による感染をモニタリングする方法であって、
第一の時点に、集団内の被験体から第一の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、請求項１に記載の方法を使用して第一の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプルにおける感染性疾患の病原体を同定するステップと、
必要に応じて、被験体に治療を施すステップと、
第二の時点に、集団内の被験体から第二の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体からの試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、請求項１に記載の方法を使用して第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプル中の感染性疾患の病原体を同定するステップと、
第一の複数のサンプルおよび第二の複数のサンプルにおける、病原体の薬剤感受性および必要に応じて病原体のアイデンティティーを比較し、それによって被験体の集団内の感染をモニタリングするステップと
を含む方法。
【請求項２５】
固形支持体と結合した複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドが表２から選択される１つまたは複数の遺伝子と選択的にハイブリダイズする、複数のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１〜２２７またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２５に記載の複数のポリヌクレオチド。
【請求項１】
病原体の薬剤感受性を決定する方法であって、
病原体を含むサンプルを提供するステップ；
サンプルと１つまたは複数の試験化合物を接触させて試験サンプルを提供するステップ；
病原体から試験サンプル中にメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが、耐性がある生物と比較して試験化合物に感受性がある生物中で差次的に発現される標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こる、ステップ；
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ；および
試験化合物の存在下で標的ｍＲＮＡのレベルと参照レベルを比較するステップであって、標的ｍＲＮＡの参照レベルと比較した標的ｍＲＮＡのレベルの違いが、病原体が試験化合物に対して感受性であるか、または耐性であるかを示すステップ
を含む、方法。
【請求項２】
試験化合物が病原体に対する既知の治療または潜在的な治療である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、サンプルを２つ以上の試験化合物と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルを４時間未満１つまたは複数の試験化合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
感染性疾患の病原体を同定する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、
参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す、方法。
【請求項６】
試験サンプルが、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、および子宮頸部／膣スワブからなる群から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
試験サンプルが複数の異なる感染性疾患の病原体または非病原性生物を含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の核酸プローブが表２から選択される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項９】
病原体が細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１０】
病原体が結核菌（Mycobacterium tuberculosis）である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１１】
プローブとの接触前にｍＲＮＡが粗製状態である、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１２】
方法が、ｍＲＮＡを増殖するステップを含まない、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１３】
方法が、酵素的、化学的、または機械的に細胞を溶解するステップを含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１４】
方法が、マイクロ流体デバイスの使用を含む、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、病原体感染をモニタリングするために使用される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１６】
病原体が被験体からのサンプル中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
被験体がヒトである、請求項５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験体用の治療を決定または選択するステップ、および、必要に応じて、被験体に治療を施すステップをさらに含む、請求項５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
被験体用の治療を選択する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡ間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、必要に応じて、被験体からのサンプル中の病原体を同定するステップと、
請求項１に記載の方法を使用して病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
病原体が感受性のある薬剤を、被験体を治療する際に使用するために選択するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
被験体における病原体による感染をモニタリングするための方法であって、
第一の時点に、病原体を含む第一のサンプルを得るステップ；
請求項１に記載の方法を使用して第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；
必要に応じて、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ；
第二の時点に、病原体を含む第二のサンプルを得るステップ；
請求項１に記載の方法を使用して第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；および
第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性と第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を比較し、それによって被験体における感染をモニタリングするステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
被験体が免疫無防備状態である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
方法が、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ、ならびに、請求項１に記載の方法を使用して選択した治療に対する、第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップを含み、病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあるかを示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるまたは治療に耐性がある状態になりつつあることを示し、前記方法が、被験体に異なる治療を施すステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の集団内における病原体による感染をモニタリングする方法であって、
第一の時点に、集団内の被験体から第一の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、請求項１に記載の方法を使用して第一の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプルにおける感染性疾患の病原体を同定するステップと、
必要に応じて、被験体に治療を施すステップと、
第二の時点に、集団内の被験体から第二の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体からの試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、請求項１に記載の方法を使用して第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプル中の感染性疾患の病原体を同定するステップと、
第一の複数のサンプルおよび第二の複数のサンプルにおける、病原体の薬剤感受性および必要に応じて病原体のアイデンティティーを比較し、それによって被験体の集団内の感染をモニタリングするステップと
を含む方法。
【請求項２５】
固形支持体と結合した複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドが表２から選択される１つまたは複数の遺伝子と選択的にハイブリダイズする、複数のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１〜２２７またはそれらの任意の組合せを含む、請求項２５に記載の複数のポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２０１３−５２０２０６（Ｐ２０１３−５２０２０６Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５１４９（Ｐ２０１２−５５５１４９）
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６０９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６５３６
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１１０９６６３９）ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５９２０１７６３３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション (177)
【出願人】（５１１２３０６３５）ザ ブリガム アンド ウーメンズ ホスピタル，インク (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２６０９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６５３６
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１１０９６６３９）ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５９２０１７６３３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション (177)
【出願人】（５１１２３０６３５）ザ ブリガム アンド ウーメンズ ホスピタル，インク (2)
【Ｆターム（参考）】
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