感熱応答性ポリリシン
【課題】生理条件下で感熱応答性を発現する生分解性と生体適合性を有する新規な刺激応答性高分子を提供すること。
【解決手段】１，２−エポキシアルカン（特に１，２−エポキシブタン）を導入した新規なポリリシン（特に、ポリ（ε−Ｌ−リシン））誘導体，該誘導体を含有する感熱応答性を有する水溶液組成物、および該ポリリシン誘導体を使用するアニオン性化合物の濃縮、分離方法。
【解決手段】１，２−エポキシアルカン（特に１，２−エポキシブタン）を導入した新規なポリリシン（特に、ポリ（ε−Ｌ−リシン））誘導体，該誘導体を含有する感熱応答性を有する水溶液組成物、および該ポリリシン誘導体を使用するアニオン性化合物の濃縮、分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
温度の外部刺激に応答してその物性を大きく変化させる刺激応答性高分子（ポリリシン）に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度、ｐＨ、光、電場などの外部刺激に応答してその物性を大きく変化させる刺激応答性高分子は、クロマトグラフィー担体やインテリジェント型のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）担体などの生医学材料として数多く研究されている。
【０００３】
近年では高機能ドラッグキャリアーとして生体内での使用を想定し、生分解性と生体適合性を有する刺激応答性高分子に関する研究が国内外で行われている。しかし、これまでに報告されている方法は、1)合成過程が多段階であり複雑である、2)分解生成物の安全性に疑問が残るなどの問題点を有している。
【０００４】
例えば、納豆の粘りの主成分であるポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）側鎖のカルボキシル基にアルキル基を適量導入してγ−ＰＧＡ分子鎖全体の親・疎水バランスを制御することより、温度刺激に応答可能なプロピル化γ−ＰＧＡの合成がなされている（非特許文献１）。しかしながらγ−ＰＧＡは生理条件下（生体内の環境と同じｐＨ（７．４）、塩濃度（１５０ｍＭ）の環境）で感熱応答性を発現しないなどの問題点がある。
【０００５】
また、ポリ（αＬ−リシン）をコレステロールで疎水化した例も報告されている（非特許文献２）。しかしこの例は、コレステロールをコアとして水中でナノサイズの粒子を作る技術であり、刺激応答性を有する高分子を提供するものではない。
【非特許文献１】Shimokuri, T.; Kaneko, T.; Akashi, M. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2004, 42, 4492-4501.
【非特許文献２】Akiyoshi, K. et al., Macromolecules 2000, 33, 6752-6756
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、生理条件下で感熱応答性を発現する生分解性と生体適合性を有する新規な刺激応答性高分子を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らが鋭意研究した結果、上記目的は、ポリリシンを両親媒化することにより達成できることを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は１，２−エポキシアルカンを導入したポリリシン誘導体に関する。
【０００９】
本発明で使用するポリリシンの構成モノマーであるリシンは、Ｌ体、Ｄ体またはそれらの混合物いずれの構成単位でもよい。すなわちポリリシンとしてはポリ（ε−Ｌ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ、Ｌ−リシン）、ポリ（α−Ｌ−リシン）、ポリ（α−Ｄ−リシン）、ポリ（α−Ｄ、Ｌ−リシン）いずれであってもよい。Ｌ体が自然に存在する形態であり、従って、Ｌ−リシンで構成されるポリリシンが通常使用される。中でも、ポリ（ε−Ｌ−リシン）（ε−ＰＬ）はstreptomyces albulus 346により産生される微生物由来、即ち天然由来のポリアミノ酸であり、Ｌ−リシンのホモポリマーであり、側鎖に修飾可能な１級アミノ基を有している。このε−ＰＬは食品添加物として使用されているなど生体への安全性が高い。
【００１０】
生理条件下で感熱応答性を発現する生分解性と生体適合性を有する新規な刺激応答性高分子を提供することを目的としていることから、ポリリシンは、水に溶けるものを使用するようにする。生理条件下、生体適合性という条件に限定されず、感熱応答性という特性を目的とするのであれば、水に溶けるものだけに限定される必要はない。
【００１１】
ポリリシンの分子量は、リシンの重合度を調整することにより調整可能であり、必要に応じて適宜選択すればよい。
【００１２】
通常は数平均分子量（Ｍｎ）が数千〜200000、好ましくは数千〜100000のものを使用するようにすればよい。分子量が低いものを使用すると、感熱応答性を発現するための駆動力である分子間相互作用が弱く、応答性が発現しにくい可能性が予想される。分子量が高すぎるものを使用すると、合成過程において高分子量体のポリリシン同士がコンプレックスを形成し、効率的に疎水基を導入できない可能性がある。
【００１３】
ポリリシンの商品としては、微生物由来のポリ（ε−Ｌ−リシン）（数平均分子量4700：商品名ポリリジン塩酸塩：チッソ社製）等を入手可能である。
【００１４】
ポリリシンに導入される１，２−エポキシアルカンは、アルカンの炭素数が４以上、好ましくは４又は５の１，２−エポキシブタン又は１，２−エポキシペンタン、より好ましくは１，２−エポキシブタンである。アルカンの炭素数が３以下では、感熱応答性を発現させることができない。また、炭素数が多すぎる１，２−エポキシアルカンは、水に溶けないので、それをポリリシンに導入する際には、合成的工夫が必要となる。
【００１５】
ポリリシンへの１，２−エポキシアルカンへの導入は、ポリリシンを適当な溶媒に溶解させ、所定量の１，２−エポキシアルカンを添加溶解させて、ポリリシンの第１アミンのエポキシ基への求核開環反応させることにより行うことができる。結果的にポリリシンの第１アミンにヒドロキシアルキル基が導入される。
【００１６】
例えば、ポリリシンとしてポリ（ε−Ｌ−リシン）、１，２−エポキシアルカンとして１，２−エポキシブタンを使用する場合は、水を溶媒とする水溶液中で一段階で合成可能である。１，２−エポキシアルカンとして１，２−エポキシペンタンを使用する場合は、１，２−エポキシペンタンが水に溶けないので、ポリ（ε−Ｌ−リシン）に一旦１，２−エポキシブタン導入して、１，２−エポキシペンタンが溶解可能な有機溶媒に溶解可能な程度まで疎水性を付与し、有機溶媒中で１，２−エポキシペンタンを反応導入させるようにすればよい。
【００１７】
ポリリシンへの１，２−エポキシアルカンへの導入により、ポリリシンに疎水性を付与することができる。
【００１８】
例えば、ポリ（ε−Ｌ−リシン）は、１．２−エポキシブタンの導入率（ポリリシンの第１アミンへの１，２−エポキシアルカンの導入の割合）が、１４％を超えると、ＤＭＳＯ，エタノール等の有機溶媒溶解性が改善される。導入率は、合成の際の１．２−エポキシブタン等の１，２−エポキシアルカンの仕込量を変えることにより調整できる。
【００１９】
さらに、ポリリシンの親疎水バランスを制御することにより、感熱応答性を付与することができる。本発明において「感熱応答性」とは、温度刺激により可逆的に引き起こされる相分離現象を意味している。相分離温度は疎水基の導入率５９％以上）、ポリマー濃度（０．１２５〜２．０ｗｔ％）、ｐＨ（７以上、好ましくは７．４以上）を変化させることにより制御可能である。相分離温度は導入率の上昇に伴い低温側にシフトする。例えばポリ（ε−Ｌ−リシン）に１，２−エポキシブタンを５９％程度以上導入すると、ＮａＣｌ（１．０Ｍ）、ｐＨ１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）中で相分離温度が観測される。なお、本実施例で使用したｐＨ１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）の組成は、リン酸水素二ナトリウム・水酸化ナトリウム水溶液を意味しており、塩濃度が、１５０ｍＭであることは生理条件に近い。
【００２０】
感熱応答性は、主鎖の構造によりそのメカニズムが異なる。例えばポリ（ε−Ｌ−リシン）に１，２−エポキシブタンを導入したポリリシン誘導体（ε−ＰＬ−Ｂ）は、コアセルベートにより感熱応答性を発現し、ポリ（α−Ｌ−リシン）に１．２−エポキシブタンを導入したポリリシン誘導体は、コイル・グロビュール転移により感熱応答性を発現する。
【００２１】
ε−ＰＬ−Ｂは、相分離状態で形成するコアセルベート滴内に疎水性相互作用と静電相互作用を駆動力としてアニオン性化合物、例えばアニオン性色素、アニオン性のタンパク質、DNA、RNA等を分離、濃縮することが可能である。
【発明の効果】
【００２２】
１，２−エポキシアルカンを導入した新規なポリリシン誘導体を提供した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（実施例１）
ポリ［Ｎα−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（ε−ＰＬ−Ｂ）の合成
ポリ（ε−Ｌ−リシン）（ε−ＰＬ）（商品名：ポリリジン塩酸塩：チッソ株式会社製）８２０ｍｇ（５．０unit mmol）を２５ｍｌの超純水に溶解後、所定量（下記表１に記載）のブチレンオキサイドを加えて４０℃で２４時間反応させた。
【化１】
【００２４】
反応終了後、分子量分画５００の透析膜を使用して蒸留水で透析を行い、凍結乾燥によりポリマーを精製した。生成物の構造確認は１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲを使用して行った。
【００２５】
図１にε−ＰＬ−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲチャートを示した。すべてのピークはε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂに由来する。
【００２６】
２−ヒドロキシブチル基の導入率はε−ＰＬ−Ｂ主鎖のメチンに起因するピークと側鎖のメチル基に起因するピークの積算値の比から算出した。２−ヒドロキシブチル基の導入率は１４から９３％であった。
【００２７】
溶解性試験
ポリマー濃度０．２重量％の濃度で、ε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂの種々の溶媒に対する溶解性を試験した。結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
ε−ＰＬは超純水に対しては溶解性を示したが、有機溶媒に対しては不溶であった。一方、導入率１４〜９３％のε−ＰＬ−Ｂは、超純水に対して溶解性を示し、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）への溶解性が改善された。これらの結果からε−ＰＬ側鎖に２−ヒドロキシブチル基を導入することでε−ＰＬの分子間相互作用を解消し、有機溶媒に対する溶解性を向上させることが可能となったことがわかる。
【００３０】
ε−ＰＬ−Ｂの感熱応答性評価
ε−ＰＬ−Ｂの感熱応答性は、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルを用いて温度変化に対する溶液の光透過率測定を行うことにより評価した。
【００３１】
ε−ＰＬ−Ｂを超純水、ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）に溶解（ポリマー濃度は超純水およびＮａＣｌ水溶液では１ｗｔ％とし、緩衝液中では０．２５ｗｔ％とした）させ、スリット幅１ｍｍの石英セルに入れて５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。加熱・冷却速度は１℃／ｍｉｎとし、相分離温度は透過率９０％の時の温度とした。
【００３２】
２−ヒドロキシブチル基導入率１４，３７，５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率測定から得られた相分離温度を表２に示した。
ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）（ポリマー濃度１ｗｔ％）のε−ＰＬ−Ｂ水溶液の光過率変化と９３％ε−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４，１０，１２）（ポリマー濃度０．２５ｗｔ％）の光透過率変化（相分離温度）をそれぞれ図２(ａ)−(ｃ)と図３(ａ)−(ｃ)に示した。図２(ａ)、図３(ａ)は、加熱過程での透過率変化、図２(ｂ)、図３(ｂ)は、冷却過程での透過率変化、図２(ｃ)は、相分離温度の疎水基の導入率依存性を示す。図３(ｃ)は、相分離温度の水素イオン濃度依存性を示している。
【００３３】
【表２】
【００３４】
超純水に溶解したε−ＰＬ−Ｂ（１４〜９３％）のすべてのサンプルは、超純水中で感熱応答性を示さなかった。ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）中では２−ヒドロキシブチル基の導入率５９％以上のε−ＰＬ−Ｂは感熱応答性を発現した。また、図２(ｃ)によると相分離温度は導入率の上昇に伴い低温側にシフトしていることがわかる。
【００３５】
ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）中では導入率５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液において温度変化に対する透過率変化が観察された。また、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液中でも導入率５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液は可逆的な透過率変化が観察された。図３(ｃ)によると、ｐＨを変化させることにより相分離温度をコントロールできることが分かる。データは示していないが相分離温度はポリマー濃度、ｐＨ、イオン強度、導入率により制御することが可能であった。
【００３６】
また、相分離温度以上において示差走査型熱重量測定により相分離温度付近での水の明確な吸熱ピークが観察されず、顕微鏡写真から、濃厚相による液滴が観察されたことからコアセルベートにより感熱応答性が発現していることが示唆された。
【００３７】
以上の結果から２−ヒドロキシブチル基を導入してε−ＰＬ分子鎖全体の親・疎水バランスを適度に調整し、無機塩の添加により水の極性を上げる、またはｐＨを上昇させることにより側鎖のアミノ基の静電反発を低下させることにより、２−ヒドロキシブチルの疎水性相互作用を強めれば、ε−ＰＬに感熱応答性を付与できることが明らかとなった。
【００３８】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のイオン性色素との複合化挙動
コアセルベートによる感熱応答性を発現したε−ＰＬ−Ｂは側鎖にアミノ基が残存している。そこでイオン性色素であるトリパンブルー（ＴＢ：アニオン性）とメチレンブルー（ＭＢ：カチオン性）を使用してε−ＰＬ−Ｂ水溶液の相分離温度前後での複合化挙動について観察した。
【００３９】
導入率９３％のε−ＰＬ−Ｂ（ε−ＰＬ−Ｂ９３）水溶液（ｐＨ７．４，ＬＣＳＴ（相分離温度）４５℃）中にＴＢとＭＢをそれぞれ１０μＭとなるように添加して相分離温度前後でのイオンコンプレックス形成について観察した。
【００４０】
相分離温度以下である２０℃ではε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液ではＴＢとＭＢはともに均一に溶解していることが確認された。これに対して相分離温度以上である５０℃ではアニオン性色素であるＴＢがコアセルベート滴に濃縮されて沈殿する様子が確認された。これは相分離温度以上では疎水性相互作用を駆動力としてε−ＰＬ−Ｂ９３が会合してコアセルベートによる濃厚相を形成し、静電相互作用によりアニオン性色素であるＴＢのみを液滴内に濃縮したために起こったと考えられる。
【００４１】
ＴＢの吸収波長である５７０ｎｍの吸光度を測定したところ５０℃のε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の上澄み液からはＴＢの吸収は観察されなかった。
【００４２】
以上の結果よりε−ＰＬ−Ｂ９３は感熱応答により形成するコアセルベート滴内に静電相互作用を介してアニオン性化合物、例えばアニオン性のタンパク質、ＤＮＡを捕捉できることも予想され、温度刺激を利用した分離材料としての利用が期待される。
【００４３】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のＣＤスペクトル測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）のＣＤスペクトルを、ｐＨ７.４，１０，１２、ポリマー濃度０．００５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭの条件下で測定した。結果を図４に示した。
【００４４】
ｐＨ７.４，１２の条件下でε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂはβ−シート構造をとることが明らかとなった。さらに加熱により、ε−ＰＬ−Ｂのβ構造は安定化することが分かる。
【００４５】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のＤＬＳ測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）、ｐＨ７．４、相分離温度４４℃、ポリマー濃度０．５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭの溶液を使用しε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）のＤＬＳを、２０、４０、６０℃条件下で測定した。結果を図５に示した。
【００４６】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液は相分離温度以上で２−ヒドロキシブチル基の疎水性相互作用を駆動力として粒径４００ｎｍ程度の会合体を形成した。
【００４７】
ポリ［Ｎε−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（α−ＰＬ−Ｂ）の合成
ポリ［Ｎα−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（ε−ＰＬ−Ｂ）と同様の方法でポリ［Ｎε−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（α−ＰＬ−Ｂ）を合成した。表３に合成結果と水に対する溶解性を示した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
２−ヒドロキシブチル基の導入率は５０，７２，８３，９５％であった。導入率が５０％，７２％のα−ＰＬ−Ｂは超純水に溶解したが、導入率８３％のα−ＰＬ−Ｂは超純水中で分散し、９５％のα−ＰＬ−Ｂは、超純水に対して不溶であった。
【００５０】
また導入率５０，７２％のα−ＰＬ−ＢはｐＨ７．４の緩衝液に対する溶解性を示したが、導入率８３％のα−ＰＬ−ＢはｐＨ７．４の緩衝液中で沈殿した。α−ＰＬ−Ｂは導入率の増加に伴い、水に対する溶解性が低下した。合成したα−ＰＬ−Ｂはε−ＰＬ−Ｂと比較して、同程度の導入率の場合では水に対する溶解性が低下することが明らかとなった。これはα−ＰＬ−Ｂは側鎖の疎水基の鎖長が長いためε−ＰＬ−Ｂと比較して強い疎水性相互作用が働くことに起因すると考えられる。
【００５１】
ｐＨ７．４の緩衝液に対する溶解性を示した導入率５０，７２％のα−ＰＬ−Ｂの感熱応答性について検討し、水に分散した導入率８３％の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。
【００５２】
図６に導入率５０％（ポリマー濃度：１ｗｔ％），導入率７２％（ポリマー濃度：１ｗｔ％，０．２ｗｔ％）のα−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４）の温度変化に対する光透過率測定の結果を示した。
【００５３】
導入率７２％のサンプルのみ官能応答性を示すことが確認されたが、透過率変化の乱れが観察された。相分離温度以上でのα−ＰＬ−Ｂ水溶液を観察するとポリマーの析出および沈殿が観察された。
【００５４】
ＤＳＣ測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）、α−ＰＬ−Ｂ（導入率７２％）について、ｐＨ７．４、ポリマー濃度０．５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭ、加熱・冷却速度２℃／分の条件下で、ＤＳＣ測定を行った。結果を図７に示す。
【００５５】
ＤＳＣ測定の結果より、ε−ＰＬ−Ｂは、液−液相分離であるコアセルベートにより感熱応答性を発現し、α−ＰＬ−Ｂは、液−固相分離であるコイル・グロビュール移転により感熱応答性を発現することが確認された。また、図７よりα−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４）の相分離温度は約６５℃であることがわかる。
【００５６】
ε−ＰＬ−Ｂの相分離状態では液一液相分離であったのでポリマーの沈殿は確認されなかったが、α−ＰＬ−Ｂは、側鎖の疎水基の鎖長が長いため、ε−ＰＬ−Ｂと比較して強い疎水性相互作用が働き、α−ＰＬ−Ｂ７２水溶液は温度刺激に応答して疎水性相互作用を駆動力としたポリマーの会合が起こり析出したと考えられる。
【００５７】
図８に、水分散性を示したα−ＰＬ−Ｂ８３のＤＬＳ測定の結果を示した。２０℃と５０℃で測定したα−ＰＬ−Ｂ８３の平均粒径はそれぞれ１７７ｎｍと１８３ｎｍであった。α−ＰＬ−Ｂ８３は２−ヒドロキシブチル基の疎水性相互作用を駆動力として水中で比較的単分散な会合体を形成することが確認された。また、分散状態でのα−ＰＬ−Ｂ８３のゼータ電位測定を行ったところ表面電位は３５ｍＶであり、表面にアミノ基が集積された会合体を形成していることが明らかとなった。
【００５８】
本実施例においては、ポリリシンとして、ポリ（ε−Ｌ−リシン）およびポリ（α−Ｌ−リシン）を使用した実施例を示しているが、ポリ（ε−Ｄ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ、Ｌ−リシン）（リシンモノマー単位がＤ体とＬ体の混合物）、ポリ（α−Ｄ−リシン）、ポリ（α−Ｄ、Ｌ−リシン）も同様に使用できると考えている。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のポリリシン誘導体は、新規な生分解性分離材料、アニオン性ドラッグのキャリアへの応用が可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ε−ＰＬ−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図２ａ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率の温度依存性（加熱過程）を示す図。
【図２ｂ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率の温度依存性（冷却過程）を示す図。
【図２ｃ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の相分離温度の導入率依存性を示す図。
【図３ａ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の透過率の温度依存性（加熱過程）を示す図。
【図３ｂ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の透過率の温度依存性（冷却過程）を示す図。
【図３ｃ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の相分離温度の水素イオン濃度依存性を示す図。
【図４】ε−ＰＬ−Ｂ９３のＣＤスペクトルを示す図。
【図５】ε−ＰＬ−Ｂ９３のＤＬＳ測定の結果を示す図。
【図６】α−ＰＬ−Ｂ水溶液の温度変化に対する光透過率を示す図。
【図７】ε−ＰＬ−Ｂ９３％、α−ＰＬ−Ｂ７２％のＤＳＣ測定結果を示す図。
【図８】α−ＰＬ−Ｂ８３のＤＬＳ測定の結果を示す図。
【技術分野】
【０００１】
温度の外部刺激に応答してその物性を大きく変化させる刺激応答性高分子（ポリリシン）に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度、ｐＨ、光、電場などの外部刺激に応答してその物性を大きく変化させる刺激応答性高分子は、クロマトグラフィー担体やインテリジェント型のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）担体などの生医学材料として数多く研究されている。
【０００３】
近年では高機能ドラッグキャリアーとして生体内での使用を想定し、生分解性と生体適合性を有する刺激応答性高分子に関する研究が国内外で行われている。しかし、これまでに報告されている方法は、1)合成過程が多段階であり複雑である、2)分解生成物の安全性に疑問が残るなどの問題点を有している。
【０００４】
例えば、納豆の粘りの主成分であるポリ（γ−グルタミン酸）（γ−ＰＧＡ）側鎖のカルボキシル基にアルキル基を適量導入してγ−ＰＧＡ分子鎖全体の親・疎水バランスを制御することより、温度刺激に応答可能なプロピル化γ−ＰＧＡの合成がなされている（非特許文献１）。しかしながらγ−ＰＧＡは生理条件下（生体内の環境と同じｐＨ（７．４）、塩濃度（１５０ｍＭ）の環境）で感熱応答性を発現しないなどの問題点がある。
【０００５】
また、ポリ（αＬ−リシン）をコレステロールで疎水化した例も報告されている（非特許文献２）。しかしこの例は、コレステロールをコアとして水中でナノサイズの粒子を作る技術であり、刺激応答性を有する高分子を提供するものではない。
【非特許文献１】Shimokuri, T.; Kaneko, T.; Akashi, M. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2004, 42, 4492-4501.
【非特許文献２】Akiyoshi, K. et al., Macromolecules 2000, 33, 6752-6756
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、生理条件下で感熱応答性を発現する生分解性と生体適合性を有する新規な刺激応答性高分子を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らが鋭意研究した結果、上記目的は、ポリリシンを両親媒化することにより達成できることを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は１，２−エポキシアルカンを導入したポリリシン誘導体に関する。
【０００９】
本発明で使用するポリリシンの構成モノマーであるリシンは、Ｌ体、Ｄ体またはそれらの混合物いずれの構成単位でもよい。すなわちポリリシンとしてはポリ（ε−Ｌ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ、Ｌ−リシン）、ポリ（α−Ｌ−リシン）、ポリ（α−Ｄ−リシン）、ポリ（α−Ｄ、Ｌ−リシン）いずれであってもよい。Ｌ体が自然に存在する形態であり、従って、Ｌ−リシンで構成されるポリリシンが通常使用される。中でも、ポリ（ε−Ｌ−リシン）（ε−ＰＬ）はstreptomyces albulus 346により産生される微生物由来、即ち天然由来のポリアミノ酸であり、Ｌ−リシンのホモポリマーであり、側鎖に修飾可能な１級アミノ基を有している。このε−ＰＬは食品添加物として使用されているなど生体への安全性が高い。
【００１０】
生理条件下で感熱応答性を発現する生分解性と生体適合性を有する新規な刺激応答性高分子を提供することを目的としていることから、ポリリシンは、水に溶けるものを使用するようにする。生理条件下、生体適合性という条件に限定されず、感熱応答性という特性を目的とするのであれば、水に溶けるものだけに限定される必要はない。
【００１１】
ポリリシンの分子量は、リシンの重合度を調整することにより調整可能であり、必要に応じて適宜選択すればよい。
【００１２】
通常は数平均分子量（Ｍｎ）が数千〜200000、好ましくは数千〜100000のものを使用するようにすればよい。分子量が低いものを使用すると、感熱応答性を発現するための駆動力である分子間相互作用が弱く、応答性が発現しにくい可能性が予想される。分子量が高すぎるものを使用すると、合成過程において高分子量体のポリリシン同士がコンプレックスを形成し、効率的に疎水基を導入できない可能性がある。
【００１３】
ポリリシンの商品としては、微生物由来のポリ（ε−Ｌ−リシン）（数平均分子量4700：商品名ポリリジン塩酸塩：チッソ社製）等を入手可能である。
【００１４】
ポリリシンに導入される１，２−エポキシアルカンは、アルカンの炭素数が４以上、好ましくは４又は５の１，２−エポキシブタン又は１，２−エポキシペンタン、より好ましくは１，２−エポキシブタンである。アルカンの炭素数が３以下では、感熱応答性を発現させることができない。また、炭素数が多すぎる１，２−エポキシアルカンは、水に溶けないので、それをポリリシンに導入する際には、合成的工夫が必要となる。
【００１５】
ポリリシンへの１，２−エポキシアルカンへの導入は、ポリリシンを適当な溶媒に溶解させ、所定量の１，２−エポキシアルカンを添加溶解させて、ポリリシンの第１アミンのエポキシ基への求核開環反応させることにより行うことができる。結果的にポリリシンの第１アミンにヒドロキシアルキル基が導入される。
【００１６】
例えば、ポリリシンとしてポリ（ε−Ｌ−リシン）、１，２−エポキシアルカンとして１，２−エポキシブタンを使用する場合は、水を溶媒とする水溶液中で一段階で合成可能である。１，２−エポキシアルカンとして１，２−エポキシペンタンを使用する場合は、１，２−エポキシペンタンが水に溶けないので、ポリ（ε−Ｌ−リシン）に一旦１，２−エポキシブタン導入して、１，２−エポキシペンタンが溶解可能な有機溶媒に溶解可能な程度まで疎水性を付与し、有機溶媒中で１，２−エポキシペンタンを反応導入させるようにすればよい。
【００１７】
ポリリシンへの１，２−エポキシアルカンへの導入により、ポリリシンに疎水性を付与することができる。
【００１８】
例えば、ポリ（ε−Ｌ−リシン）は、１．２−エポキシブタンの導入率（ポリリシンの第１アミンへの１，２−エポキシアルカンの導入の割合）が、１４％を超えると、ＤＭＳＯ，エタノール等の有機溶媒溶解性が改善される。導入率は、合成の際の１．２−エポキシブタン等の１，２−エポキシアルカンの仕込量を変えることにより調整できる。
【００１９】
さらに、ポリリシンの親疎水バランスを制御することにより、感熱応答性を付与することができる。本発明において「感熱応答性」とは、温度刺激により可逆的に引き起こされる相分離現象を意味している。相分離温度は疎水基の導入率５９％以上）、ポリマー濃度（０．１２５〜２．０ｗｔ％）、ｐＨ（７以上、好ましくは７．４以上）を変化させることにより制御可能である。相分離温度は導入率の上昇に伴い低温側にシフトする。例えばポリ（ε−Ｌ−リシン）に１，２−エポキシブタンを５９％程度以上導入すると、ＮａＣｌ（１．０Ｍ）、ｐＨ１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）中で相分離温度が観測される。なお、本実施例で使用したｐＨ１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）の組成は、リン酸水素二ナトリウム・水酸化ナトリウム水溶液を意味しており、塩濃度が、１５０ｍＭであることは生理条件に近い。
【００２０】
感熱応答性は、主鎖の構造によりそのメカニズムが異なる。例えばポリ（ε−Ｌ−リシン）に１，２−エポキシブタンを導入したポリリシン誘導体（ε−ＰＬ−Ｂ）は、コアセルベートにより感熱応答性を発現し、ポリ（α−Ｌ−リシン）に１．２−エポキシブタンを導入したポリリシン誘導体は、コイル・グロビュール転移により感熱応答性を発現する。
【００２１】
ε−ＰＬ−Ｂは、相分離状態で形成するコアセルベート滴内に疎水性相互作用と静電相互作用を駆動力としてアニオン性化合物、例えばアニオン性色素、アニオン性のタンパク質、DNA、RNA等を分離、濃縮することが可能である。
【発明の効果】
【００２２】
１，２−エポキシアルカンを導入した新規なポリリシン誘導体を提供した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（実施例１）
ポリ［Ｎα−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（ε−ＰＬ−Ｂ）の合成
ポリ（ε−Ｌ−リシン）（ε−ＰＬ）（商品名：ポリリジン塩酸塩：チッソ株式会社製）８２０ｍｇ（５．０unit mmol）を２５ｍｌの超純水に溶解後、所定量（下記表１に記載）のブチレンオキサイドを加えて４０℃で２４時間反応させた。
【化１】
【００２４】
反応終了後、分子量分画５００の透析膜を使用して蒸留水で透析を行い、凍結乾燥によりポリマーを精製した。生成物の構造確認は１Ｈ−ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲを使用して行った。
【００２５】
図１にε−ＰＬ−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲチャートを示した。すべてのピークはε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂに由来する。
【００２６】
２−ヒドロキシブチル基の導入率はε−ＰＬ−Ｂ主鎖のメチンに起因するピークと側鎖のメチル基に起因するピークの積算値の比から算出した。２−ヒドロキシブチル基の導入率は１４から９３％であった。
【００２７】
溶解性試験
ポリマー濃度０．２重量％の濃度で、ε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂの種々の溶媒に対する溶解性を試験した。結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】
ε−ＰＬは超純水に対しては溶解性を示したが、有機溶媒に対しては不溶であった。一方、導入率１４〜９３％のε−ＰＬ−Ｂは、超純水に対して溶解性を示し、エタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）への溶解性が改善された。これらの結果からε−ＰＬ側鎖に２−ヒドロキシブチル基を導入することでε−ＰＬの分子間相互作用を解消し、有機溶媒に対する溶解性を向上させることが可能となったことがわかる。
【００３０】
ε−ＰＬ−Ｂの感熱応答性評価
ε−ＰＬ−Ｂの感熱応答性は、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルを用いて温度変化に対する溶液の光透過率測定を行うことにより評価した。
【００３１】
ε−ＰＬ−Ｂを超純水、ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）に溶解（ポリマー濃度は超純水およびＮａＣｌ水溶液では１ｗｔ％とし、緩衝液中では０．２５ｗｔ％とした）させ、スリット幅１ｍｍの石英セルに入れて５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。加熱・冷却速度は１℃／ｍｉｎとし、相分離温度は透過率９０％の時の温度とした。
【００３２】
２−ヒドロキシブチル基導入率１４，３７，５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率測定から得られた相分離温度を表２に示した。
ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）（ポリマー濃度１ｗｔ％）のε−ＰＬ−Ｂ水溶液の光過率変化と９３％ε−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４，１０，１２）（ポリマー濃度０．２５ｗｔ％）の光透過率変化（相分離温度）をそれぞれ図２(ａ)−(ｃ)と図３(ａ)−(ｃ)に示した。図２(ａ)、図３(ａ)は、加熱過程での透過率変化、図２(ｂ)、図３(ｂ)は、冷却過程での透過率変化、図２(ｃ)は、相分離温度の疎水基の導入率依存性を示す。図３(ｃ)は、相分離温度の水素イオン濃度依存性を示している。
【００３３】
【表２】
【００３４】
超純水に溶解したε−ＰＬ−Ｂ（１４〜９３％）のすべてのサンプルは、超純水中で感熱応答性を示さなかった。ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液（塩濃度１５０ｍＭ）中では２−ヒドロキシブチル基の導入率５９％以上のε−ＰＬ−Ｂは感熱応答性を発現した。また、図２(ｃ)によると相分離温度は導入率の上昇に伴い低温側にシフトしていることがわかる。
【００３５】
ＮａＣｌ水溶液（１．０Ｍ）中では導入率５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液において温度変化に対する透過率変化が観察された。また、ｐＨ７．４，１０，１２の緩衝液中でも導入率５９，７３，８０，９３％のε−ＰＬ−Ｂ水溶液は可逆的な透過率変化が観察された。図３(ｃ)によると、ｐＨを変化させることにより相分離温度をコントロールできることが分かる。データは示していないが相分離温度はポリマー濃度、ｐＨ、イオン強度、導入率により制御することが可能であった。
【００３６】
また、相分離温度以上において示差走査型熱重量測定により相分離温度付近での水の明確な吸熱ピークが観察されず、顕微鏡写真から、濃厚相による液滴が観察されたことからコアセルベートにより感熱応答性が発現していることが示唆された。
【００３７】
以上の結果から２−ヒドロキシブチル基を導入してε−ＰＬ分子鎖全体の親・疎水バランスを適度に調整し、無機塩の添加により水の極性を上げる、またはｐＨを上昇させることにより側鎖のアミノ基の静電反発を低下させることにより、２−ヒドロキシブチルの疎水性相互作用を強めれば、ε−ＰＬに感熱応答性を付与できることが明らかとなった。
【００３８】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のイオン性色素との複合化挙動
コアセルベートによる感熱応答性を発現したε−ＰＬ−Ｂは側鎖にアミノ基が残存している。そこでイオン性色素であるトリパンブルー（ＴＢ：アニオン性）とメチレンブルー（ＭＢ：カチオン性）を使用してε−ＰＬ−Ｂ水溶液の相分離温度前後での複合化挙動について観察した。
【００３９】
導入率９３％のε−ＰＬ−Ｂ（ε−ＰＬ−Ｂ９３）水溶液（ｐＨ７．４，ＬＣＳＴ（相分離温度）４５℃）中にＴＢとＭＢをそれぞれ１０μＭとなるように添加して相分離温度前後でのイオンコンプレックス形成について観察した。
【００４０】
相分離温度以下である２０℃ではε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液ではＴＢとＭＢはともに均一に溶解していることが確認された。これに対して相分離温度以上である５０℃ではアニオン性色素であるＴＢがコアセルベート滴に濃縮されて沈殿する様子が確認された。これは相分離温度以上では疎水性相互作用を駆動力としてε−ＰＬ−Ｂ９３が会合してコアセルベートによる濃厚相を形成し、静電相互作用によりアニオン性色素であるＴＢのみを液滴内に濃縮したために起こったと考えられる。
【００４１】
ＴＢの吸収波長である５７０ｎｍの吸光度を測定したところ５０℃のε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の上澄み液からはＴＢの吸収は観察されなかった。
【００４２】
以上の結果よりε−ＰＬ−Ｂ９３は感熱応答により形成するコアセルベート滴内に静電相互作用を介してアニオン性化合物、例えばアニオン性のタンパク質、ＤＮＡを捕捉できることも予想され、温度刺激を利用した分離材料としての利用が期待される。
【００４３】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のＣＤスペクトル測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）のＣＤスペクトルを、ｐＨ７.４，１０，１２、ポリマー濃度０．００５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭの条件下で測定した。結果を図４に示した。
【００４４】
ｐＨ７.４，１２の条件下でε−ＰＬとε−ＰＬ−Ｂはβ−シート構造をとることが明らかとなった。さらに加熱により、ε−ＰＬ−Ｂのβ構造は安定化することが分かる。
【００４５】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液のＤＬＳ測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）、ｐＨ７．４、相分離温度４４℃、ポリマー濃度０．５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭの溶液を使用しε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）のＤＬＳを、２０、４０、６０℃条件下で測定した。結果を図５に示した。
【００４６】
ε−ＰＬ−Ｂ水溶液は相分離温度以上で２−ヒドロキシブチル基の疎水性相互作用を駆動力として粒径４００ｎｍ程度の会合体を形成した。
【００４７】
ポリ［Ｎε−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（α−ＰＬ−Ｂ）の合成
ポリ［Ｎα−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（ε−ＰＬ−Ｂ）と同様の方法でポリ［Ｎε−（２−ヒドロキシブチル）リシン］（α−ＰＬ−Ｂ）を合成した。表３に合成結果と水に対する溶解性を示した。
【００４８】
【表３】
【００４９】
２−ヒドロキシブチル基の導入率は５０，７２，８３，９５％であった。導入率が５０％，７２％のα−ＰＬ−Ｂは超純水に溶解したが、導入率８３％のα−ＰＬ−Ｂは超純水中で分散し、９５％のα−ＰＬ−Ｂは、超純水に対して不溶であった。
【００５０】
また導入率５０，７２％のα−ＰＬ−ＢはｐＨ７．４の緩衝液に対する溶解性を示したが、導入率８３％のα−ＰＬ−ＢはｐＨ７．４の緩衝液中で沈殿した。α−ＰＬ−Ｂは導入率の増加に伴い、水に対する溶解性が低下した。合成したα−ＰＬ−Ｂはε−ＰＬ−Ｂと比較して、同程度の導入率の場合では水に対する溶解性が低下することが明らかとなった。これはα−ＰＬ−Ｂは側鎖の疎水基の鎖長が長いためε−ＰＬ−Ｂと比較して強い疎水性相互作用が働くことに起因すると考えられる。
【００５１】
ｐＨ７．４の緩衝液に対する溶解性を示した導入率５０，７２％のα−ＰＬ−Ｂの感熱応答性について検討し、水に分散した導入率８３％の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。
【００５２】
図６に導入率５０％（ポリマー濃度：１ｗｔ％），導入率７２％（ポリマー濃度：１ｗｔ％，０．２ｗｔ％）のα−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４）の温度変化に対する光透過率測定の結果を示した。
【００５３】
導入率７２％のサンプルのみ官能応答性を示すことが確認されたが、透過率変化の乱れが観察された。相分離温度以上でのα−ＰＬ−Ｂ水溶液を観察するとポリマーの析出および沈殿が観察された。
【００５４】
ＤＳＣ測定
ε−ＰＬ−Ｂ（導入率９３％）、α−ＰＬ−Ｂ（導入率７２％）について、ｐＨ７．４、ポリマー濃度０．５ｗｔ％、バッファー濃度１５０ｍＭ、加熱・冷却速度２℃／分の条件下で、ＤＳＣ測定を行った。結果を図７に示す。
【００５５】
ＤＳＣ測定の結果より、ε−ＰＬ−Ｂは、液−液相分離であるコアセルベートにより感熱応答性を発現し、α−ＰＬ−Ｂは、液−固相分離であるコイル・グロビュール移転により感熱応答性を発現することが確認された。また、図７よりα−ＰＬ−Ｂ水溶液（ｐＨ７．４）の相分離温度は約６５℃であることがわかる。
【００５６】
ε−ＰＬ−Ｂの相分離状態では液一液相分離であったのでポリマーの沈殿は確認されなかったが、α−ＰＬ−Ｂは、側鎖の疎水基の鎖長が長いため、ε−ＰＬ−Ｂと比較して強い疎水性相互作用が働き、α−ＰＬ−Ｂ７２水溶液は温度刺激に応答して疎水性相互作用を駆動力としたポリマーの会合が起こり析出したと考えられる。
【００５７】
図８に、水分散性を示したα−ＰＬ−Ｂ８３のＤＬＳ測定の結果を示した。２０℃と５０℃で測定したα−ＰＬ−Ｂ８３の平均粒径はそれぞれ１７７ｎｍと１８３ｎｍであった。α−ＰＬ−Ｂ８３は２−ヒドロキシブチル基の疎水性相互作用を駆動力として水中で比較的単分散な会合体を形成することが確認された。また、分散状態でのα−ＰＬ−Ｂ８３のゼータ電位測定を行ったところ表面電位は３５ｍＶであり、表面にアミノ基が集積された会合体を形成していることが明らかとなった。
【００５８】
本実施例においては、ポリリシンとして、ポリ（ε−Ｌ−リシン）およびポリ（α−Ｌ−リシン）を使用した実施例を示しているが、ポリ（ε−Ｄ−リシン）、ポリ（ε−Ｄ、Ｌ−リシン）（リシンモノマー単位がＤ体とＬ体の混合物）、ポリ（α−Ｄ−リシン）、ポリ（α−Ｄ、Ｌ−リシン）も同様に使用できると考えている。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のポリリシン誘導体は、新規な生分解性分離材料、アニオン性ドラッグのキャリアへの応用が可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ε−ＰＬ−Ｂの１Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図２ａ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率の温度依存性（加熱過程）を示す図。
【図２ｂ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の透過率の温度依存性（冷却過程）を示す図。
【図２ｃ】ε−ＰＬ−Ｂ水溶液の相分離温度の導入率依存性を示す図。
【図３ａ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の透過率の温度依存性（加熱過程）を示す図。
【図３ｂ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の透過率の温度依存性（冷却過程）を示す図。
【図３ｃ】ε−ＰＬ−Ｂ９３水溶液の相分離温度の水素イオン濃度依存性を示す図。
【図４】ε−ＰＬ−Ｂ９３のＣＤスペクトルを示す図。
【図５】ε−ＰＬ−Ｂ９３のＤＬＳ測定の結果を示す図。
【図６】α−ＰＬ−Ｂ水溶液の温度変化に対する光透過率を示す図。
【図７】ε−ＰＬ−Ｂ９３％、α−ＰＬ−Ｂ７２％のＤＳＣ測定結果を示す図。
【図８】α−ＰＬ−Ｂ８３のＤＬＳ測定の結果を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−エポキシアルカンを導入したポリリシン誘導体。
【請求項２】
ポリリシンがポリ（ε−Ｌ−リシン）またはポリ（α−Ｌ−リシン）である、請求項１に記載のポリリシン誘導体。
【請求項３】
ポリリシンがポリ（ε−Ｌ−リシン）である、請求項１に記載のポリリシン誘導体。
【請求項４】
１，２−エポキシアルカンが、１，２−エポキシブタンである、請求項１または２に記載のポリリシン誘導体。
【請求項５】
１，２−エポキシアルカンが、ポリリシン誘導体の有する第１アミンに対して１４％以上導入された、請求項１〜４いずれかに記載のポリリシン誘導体。
【請求項６】
１，２−エポキシアルカンが、ポリリシン誘導体の有する第１アミンに対して１４％以上導入された、請求項１〜４いずれかに記載のポリリシン誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載のポリリシン誘導体を含有し、ｐＨが７以上に維持された感熱応答性を有する水溶液組成物。
【請求項８】
請求項１〜６いずれかに記載のポリリシン誘導体を使用することを特徴とする、アニオン性化合物の濃縮、分離方法。
【請求項１】
１，２−エポキシアルカンを導入したポリリシン誘導体。
【請求項２】
ポリリシンがポリ（ε−Ｌ−リシン）またはポリ（α−Ｌ−リシン）である、請求項１に記載のポリリシン誘導体。
【請求項３】
ポリリシンがポリ（ε−Ｌ−リシン）である、請求項１に記載のポリリシン誘導体。
【請求項４】
１，２−エポキシアルカンが、１，２−エポキシブタンである、請求項１または２に記載のポリリシン誘導体。
【請求項５】
１，２−エポキシアルカンが、ポリリシン誘導体の有する第１アミンに対して１４％以上導入された、請求項１〜４いずれかに記載のポリリシン誘導体。
【請求項６】
１，２−エポキシアルカンが、ポリリシン誘導体の有する第１アミンに対して１４％以上導入された、請求項１〜４いずれかに記載のポリリシン誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載のポリリシン誘導体を含有し、ｐＨが７以上に維持された感熱応答性を有する水溶液組成物。
【請求項８】
請求項１〜６いずれかに記載のポリリシン誘導体を使用することを特徴とする、アニオン性化合物の濃縮、分離方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−５６８７８（Ｐ２００８−５６８７８Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３８９４４（Ｐ２００６−２３８９４４）
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月４日（２００６．９．４）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【Ｆターム（参考）】
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