抗ウイルス剤及びその製法
【課題】微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とする新型及び季節性のヒトインフルエンザウイルスに対して、抗ウイルス医薬品の提供。
【解決手段】微細藻類のコッコミクサより大半の脂質が除去された多糖体画分であり、微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなることを特徴とする抗ウイルス剤の製法であり、繰り返しの脂質除去工程を行うことによって大半の脂質が除去できるのであり、純度の高い抽出物を得ることができ、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する高い抗ウイルス活性を有するので医薬品として使用できる。
【解決手段】微細藻類のコッコミクサより大半の脂質が除去された多糖体画分であり、微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなることを特徴とする抗ウイルス剤の製法であり、繰り返しの脂質除去工程を行うことによって大半の脂質が除去できるのであり、純度の高い抽出物を得ることができ、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する高い抗ウイルス活性を有するので医薬品として使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コッコミクサ藻体より抽出したインフルエンザウイルス等に抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤及びその製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この種のコッコミクサ藻体から抽出した抗ウイルス剤としては、同一出願人に係る発明が公知になっている。この公知の抗ウイルス剤の抽出に用いたコッコミクサ藻体は、緑色植物門（Chlorophyta）、緑藻綱（Chlorophyceae）、クロロコッカム目（Chlorococcales）、クロロコッカム科（Chlorococcaceae）に属するコッコミクサ・ミロール（Coccomyxa minor）又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス（Coccomyxa gloeobotrydiformis）とする乾燥したコッコミクサ藻体にイオン交換水を加え、還流下で加熱抽出を行って得た抽出液を遠心分離し、上清を減圧濃縮して抽出物（ＣＥ）を得て、該抽出物を蒸留水による溶出画分し、および、蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分した多糖体画分（ＣＥ−１、ＣＥ−２、ＣＥ−３）を有効成分とするものである（特許文献１）。
【０００３】
そして、この抗ウイルス剤は、Ｒｉｂ（リボース）、Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｕｌ（グルコース）、Ｒｈａ（ラムノース）が主たる成分になっており、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示すというものである。
【０００４】
また、微細藻類のクロレラまたはコッコミクサ藻体から抽出した酸性多糖よりなる抗癌性物質も公知になっている。微細藻類から酸性多糖を抽出するには、微細藻類を熱水に懸濁して抽出処理し、遠心分離によりエキス分とウエットストラッジに分離し、ウエットストラッジに水を加えて撹拌しながら、アルカリ性基材によりｐＨを１０以上に調整してエキス分を抽出し、このエキス分を遠心分離し、分離したエキス分を撹拌しながらｐＨを３〜４に調整して酸性多糖の沈殿物を析出させて得られるものである（特許文献２）。
【０００５】
この酸性多糖よりなる抗癌性物質をマウスに投与して実験したところ、免疫の初期活性として、マクロファージ活性を有意に示し、中性多糖より活性能があることが明らかになり、また、マウスにＭＮＵ単独経口投与により３０週で前胃偏平上皮癌の発生が見られたが、酸性多糖の抗癌性物質を投与することによって前胃偏平上皮癌の抑制効果が明らかになったとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２４７７５７号公報
【特許文献２】特開２００１−２８８１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記公知例の抗ウイルス剤においては、イオン交換水を加えて加熱抽出した抽出物を蒸留水で溶出画分を行ったもの、さらにその溶出したものを無機塩溶液で溶出画分したものであるが、加熱抽出時に得られる抽出物は、遠心分離した上清を減圧濃縮して得た抽出物であって、リボース、ガラクトース、グルコース、ラムノースが主たる成分になっており、脂質の除去は行なっていないので高純度とはいえないのである。
【０００８】
また、前記酸性多糖よりなる抗癌性物質は、その成分については明確にしていないが、この種の微細藻類に含まれる多糖類はβ−グルカンが多いが、このβ−グルカンは、熱水で抽出される中性多糖であり、これには酸性多糖はほとんど含まれていないとしている。そのために、最初に９０℃の熱水で抽出処理して中性可溶画分を除外し、次に７０℃の熱水で撹拌処理しアルカリ性に調整してエキス分を抽出して分離し、分離したエキス分を別のタンクに移して撹拌しながら１Ｎ塩酸でｐＨ４調整して酸性多糖の析出を起こさせ、析出した酸性多糖を回収するというものであり、その成分は不明であるが、あくまでも抗癌性物質の範囲である。
【０００９】
従って、公知の技術は熱水による抽出が主体であり、抽出物中には多くの脂質が残存していることから、新型及び季節性のヒトインフルエンザウイルスに対して、抗ウイルス活性を抑制する効果が弱いので、その効果を高めること、即ち、高純度の抽出物にすることに解決課題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、種々研究の結果、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであるが、抽出の仕方によって抽出物の成分の相違と高純度にすることによって、抗ウイルス活性を抑制する効果を見出して本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の第１の発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを特徴とするものである。
【００１２】
この第１の発明において、前記多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすること、を付加的な構成要件として含むものである。
【００１３】
本発明の第２の発明に係る抗ウイルス剤の製法は、微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなることを特徴とするものである。
【００１４】
さらに、もう１つの抗ウイルス剤の製法は、前記第２の発明で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、 該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであるとともに、多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすることにより、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するという優れた効果を奏する。
【００１６】
更に、本発明に係る製法の発明は、揮発性溶剤を使用して超音波振とうを行なうことによって、成分中の脂質を除去し易くすると共に、繰り返しの脂質除去工程を行うことによって大半の脂質が除去できるのであり、純度の高い抽出物を得ることができ、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する高い抗ウイルス活性を有するので、例えば、健康食品の補助剤または医薬品として使用できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（１）図は、本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、赤血球凝集試験の手順を示す説明図であり、（２）図は赤血球凝集試験の原理を解り易く略示的に示した説明図である。
【図２】本発明に係る抗ウイルス剤の細胞毒性（傷害性）試験において、高濃度の範囲まで細胞毒性（傷害性）が全くないことを示すグラフである。
【図３】本発明に係る抗ウイルス剤の試験に供した新型インフルエンザおよび現在流行中の季節性インフルエンザそれぞれのウイルス株に対する増殖阻害効果を示したグラフである。
【図４】ヒトＡ型インフルエンザウイルスの全て（３つ）の亜型への有効性を検討するために、３種類の古典的インフルエンザウイルス株を使用し、抗ウイルス剤の増殖阻害効果を調べたグラフである。
【図５】本発明に係る抗ウイルス剤の添加時間による抗ウイルス効果への影響を調べるために、ウイルス感染過程の様々な時間に抗ウイルス剤を添加した、その添加、存在時間を示した図である。
【図６】同抗ウイルス剤の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響をＭＤＣＫ細胞の細胞傷害度で評価したグラフである。
【図７】同抗ウイルス剤の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響を生成ウイルス量、即ちＨＡテストで評価したグラフである。
【図８】同抗ウイルス剤とインフルエンザウイルスの相互作用によるＨＡ活性の阻害機序を解り易く示した説明図である。
【図９】インフルエンザワクチン、既存の抗ウイルス剤の阻害機序を解り易く模擬的に示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る抗ウイルス剤の原料としては、微細藻類の一種である乾燥したコッコミクサ藻体が用いられる。
この乾燥したコッコミクサ藻体を揮発性の溶剤と一緒に超音波振とう遠心濃縮機により振とう及び遠心分離を行なうと共に、揮発性の溶剤で複数回の脱脂操作を行い、その後、所要時間に亘り熱湯抽出し、該熱湯抽出物を遠心分離により固液分離し、分離した液層を濃縮し凍結乾燥して第１の発明に係る中性の熱水抽出物を得る。
【００１９】
さらに、上記分離して得られた固層に所要量の水を加え、アルカリ性に調整し所要時間撹拌して抽出を行ない、遠心分離にて液層を回収し、該回収した液層を酸性に調整し低温にて所要時間静置して沈殿物を生成させ、該沈殿物を遠心分離して固形物として回収し、複数回の洗浄操作を行なってもう１つの実施の形態に係るアルカリ抽出物を得る。得られた抽出物は揮発性溶剤で複数回の脱脂操作を行った後、凍結乾燥するものである。
【００２０】
［実施例等］
次に、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
[コッコミクサの水溶性多糖体の抽出方法]
乾燥したコッコミクサ藻体２ｇに１００ｍｌのベンゼン：メタノール（２：１）からなる揮発性溶剤を入れ、超音波処理を１０分行った後、５０℃に加温した状態で３時間振とう及び遠心分離を行なった後に、同様の揮発性溶剤、即ち、ベンゼン：メタノール（２：１）を１００ｍｌ入れて脱脂操作を少なくとも３回繰り返して行ない、遠心分離により溶剤を除去する。
この脱脂後のパウダー状になったものに１００ｍｌの水を加え、９０℃に加熱して３時間撹拌抽出した。所要時間保冷後に遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って固液分離した。分離して回収した液層は濃縮し、該濃縮液を凍結乾燥して中性多糖体(推定)の乾燥粉末を得た。つまり、コッコミクサから０．２６ｇの熱水抽出物（ＣｍＮＥ）を得た。
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
なお、複数回の脱脂処理を行うことによって有効成分中の大半の脂質が除去される。
【００２１】
[コッコミクサのアルカリ抽出多糖体の抽出方法]
前記水溶性多糖体の抽出工程で遠心分離後に得られた固層（含水率７５％）に水１Ｌを加え、所要のアルカリ溶液、例えば、１０％ＫＯＨにてｐＨ９〜１１に調整した。調整した液を６０℃に加温して３０分間撹拌抽出を行なった。所要時間保冷後に遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し液層を回収した。回収した液に所要の酸性溶液、例えば、１０％ＨＣｌを添加しｐＨ４に調整し浮遊物を確認した後、沈殿物を得るために４℃で１２時間静置した。沈殿物は遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し固形物として回収した。この固形物の回収操作、即ち、加水、撹拌洗浄、遠心分離を３回繰り返して得られた洗浄後の沈殿物を凍結乾燥し、酸性多糖体（推定）を得た。つまり、コッコミクサから０．１ｇのアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）を得た。
その後、凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
乾燥物を、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌに懸濁し、クロロホルム：メタノールで脱脂処理を行った後、ＤＥＡＥカラムにて分画処理した。
抽出物の有効成分は、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコース等からなる脱脂された純度の高い多糖体である。
【００２２】
[試験]
検体として、本発明で得たコッコミクサのアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）を用いて、抗インフルエンザウイルス活性を検証した。そのアルカリ抽出物をＤＰＢＳ（-）で高濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を調整し、該溶液を段階的に希釈することで試験した。
【００２３】
ウイルス株について：
試験のために入手したＡ型ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）については、第１グループとして、新型及び現在流行中の季節性インフルエンザウイルスと、第２グループとして過去に流行した季節性インフルエンザウイルスとに分けられる。
第１グループ：
1） Ａ/Ｃalifornia/０７/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
2） Ａ/Ｎarita/１/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
3） Ａ/Ｂrisbane/５９/２００７(Ｈ1Ｎ1) : Ｈ1Ｎ1亜型（流行中の季節性）
4） Ａ/Ｕruguai/７１６/２００７(Ｈ3Ｎ2) : Ｈ3Ｎ2亜型（流行中の季節性）
第２グループ：
1）Ａ/ＷＳＮ/１９３３/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
2）Ａ/ＵＳＳＲ/１９７７/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
3）Ａ/Ａdachi/１９５７/Ｈ2Ｎ2 : Ｈ2Ｎ2亜型（古典的な季節性）
4) Ａ/Ａichi/１９６８/Ｈ3Ｎ2 : Ｈ3Ｎ2亜型（古典的な季節性）
【００２４】
細胞株として：
インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の感染実験で繁用される成犬の腎臓から樹立された上皮様細胞株であるＭＤＣＫ（Mardin-Darby canine kindney ）細胞を使用した。細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ液体培地で３７℃、５％ＣＯ２で継代培養したものを使用した。
【００２５】
細胞傷害性試験：
ＭＤＣＫ細胞を９６well plate（ウェルプレート）へ播種し、１２時間培養して細胞を吸着させた後、新鮮なＭＥＭ−１０％ＦＢＳに培地交換した。その際、高濃度に調整したアルカリ抽出物の溶液を各終濃度になるように添加した。溶液添加後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した時点で終濃度５００ｕｇ／ｍｌとなるようＭＴＴを添加し、同条件のインキュベーター内で３時間培養し色素を取り込ませた。その後、色素を含む培地を取り除き、ＤＭＳＯ（１００ｕｌ／well）を加え沈殿を溶解し５７０ｎｍの吸光度を測定した。予め作成しておいて検量線を元に細胞のviabiltyを決定した。
【００２６】
抗ウイルス活性の測定：
４８well plate(ウェルプレート) に培養したＭＤＣＫ細胞を前記アルカリ抽出物の溶液（１０−２０００ｕｇ／ｍｌ）で２時間処理後、６ＰＦＵ（プラーク形成単位）／細胞でインフルエンザウイルスを感染させ、感染４８時間後に収穫した。ウイルス量は鶏赤血球凝集試験（ＨＡ test）にて測定し、赤血球濃度からウイルス粒子数を換算し、増殖阻止活性を評価した。
【００２７】
赤血球凝集試験（ＨＡ test）の手順：
図１（1）に示したように、９６ウェルを１２列８行（Ａ〜Ｈ）に整列して並べて、
1） 各ウェルに生理食塩水を５０ｕｌずつ添加する。
2） 前記第１と第２グループの８種類の各ウイルスサンプル液５０ｕｌを採って、第１列Ａから順にＨ行まで添加する。第１列のウェルＡ〜Ｈだけが計１００ｕｌとなる。
3） ２倍段階希釈：第１列の各ウェルの溶液をピペッティングにより混和した後、５０ｕｌだけ吸い取り、これを次の第２列のウェルに加える。第２列のウェルが１００ｕｌになるが、第１列と同様にピペッティングで混和した後、５０ｕｌだけ吸い取りこれを次の第３列のウェルに加える。この操作を第３列以降のウェルについても順次行うことにより、２倍段階希釈列を作成する。
4） １％鶏赤血球を５０ｕｌずつ第１２列から第１列まで加える。ＡからＨ行全てについて行なう。
5） 血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価（血球凝集価）とする。
【００２８】
赤血球凝集試験（ＨＡ test）の原理については、図１（2）に示したように、赤血球の数とウイルスの数とによって、赤血球が凝集する状態を理解し易いように示したものであり、第７列目まではウイルスの数が勝って凝集しており、第８列目も赤血球の数とウイルスの数とが同数でかろうじて凝集し、第９列目以降は赤血球の数が多いので凝集しないことを示している。そして、結果の解釈としては、次のとおりである。
1） ＨＡ価（血球凝集価）：血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価とする。
2） 即ち、上記のＨＡ価は、２８＝２５６となる。
3） １％ｃＲＢＣ＝（１×１０７ cells／ml）を使用して上記結果を得た場合、サンプル原液のウイルス濃度は、２８×（１×１０７）＝２５６×１０７＝２．６×１０９粒子／mlとなる。
【００２９】
前記細胞傷害試験において、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図２に示したように、４０００ｕｇ／ｍｌまで全く細胞毒性を示さなかった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についても同様の試験（データは示していない）を行なったが、アルカリ抽出物と同様に細胞毒性は無かった。
【００３０】
また、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図３及び図４に示したように、第１及び第２グループの各ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）に対して、１０ｕｇ／ｍｌ以上で有意な抗ウイルス活性を示し、１００ｕｇ／ｍｌ以上で未処理の１／１００以下にウイルス増殖を抑制したことが明確になった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についてもほぼ同等の抗ウイルス活性（データは示していない）が認められた。
【００３１】
さらに、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）の抗ウイルス効果の作用機序を調べるために、抽出物の添加時間（time of addition）のウイルス増殖への影響を次のI〜Vに従って調べた。
I. ＭＤＣＫ細胞をＣｍＡＥでウイルス感染前に３時間処理した場合。
II. ウイルス感染中のみにＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
III. ウイルス感染中から４８時間後にＣｍＡＥが存在した場合。
IV. 感染処理後３時間以降にＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
V. 感染処理後６時間以降にＣｍＡＥが倍地中に存在した場合。
【００３２】
図５は、ウイルス感染に対するＣｍＡＥの添加時間による有効性を示したもので、ウイルス感染時を-1hpiとした場合（-1hpiで吸着開始し0hpiで侵入開始）に、I．感染3時間前に添加し感染時に除去、II．感染時に添加し１時間後に除去、III．感染時に添加しその後ずっと存在、IV．感染4時間後に添加しその後ずっと存在、V．感染7時間後に添加しその後ずっと存在、の条件で実験した。そして、ＩＦＶの増殖過程をＭＤＣＫ細胞の細胞障害度、つまり、ウイルスの細胞傷害活性で評価したところ、図６に示したように、ウイルスの侵入時にアルカリ抽出物が存在することによって、血球（細胞）へのウイルス吸着がなされないこと、即ち、抗ウイルス活性を示すことが明らかになった。
【００３３】
次に、ＨＡテストでアルカリ抽出物の添加時間におけるウイルス増殖への影響を培養液中に回収されるウイルス量で評価したところ、図７に示したように、前記II．とIII．のウイルス吸着、ウイルス侵入時に加えて、前記IV．とV．のウイルス吸着及びウイルス侵入後であっても、アルカリ抽出物が存在することによって、ウイルスの増殖が抑制され続け、回収時まで存在しているとその間抗ウイルス効果を示すことが判明した。
【００３４】
図６と図７の結果の相違はＣｍＡＥに赤血球凝集を抑制する効果があると推定されたので、アルカリ抽出物のインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）への影響を調べたところ、鶏赤血球（ｃＲＢＣ）とＩＦＶを混合する際に、ＣｍＡＥを添加すると濃度依存性にインフルエンザウイルスの鶏赤血球凝集活性を抑制することが明らかになった。
【００３５】
図８は、ＣｍＡＥの赤血球凝集抑制機構の推定図であって、ＩＦＶは自身のＨＡ蛋白質によって鶏赤血球（ｃＲＢＣ）表面のシアロ糖鎖と次々に結合しＩＦＶ−ｃＲＢＣネットワークを形成することによって赤血球凝集を起こすのである。しかし、その際に、ＣｍＡＥが存在するとＩＦＶとｃＲＢＣの相互作用を何らかの要因でネットワーク形成を阻害するために赤血球凝集を抑制すると考えられる。
【００３６】
一般に、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）は、図９に示すように、自身のＨＡ（赤血球凝集素）タンパク質によって、動物細胞表面のシアロ糖鎖と結合して細胞に吸着後、細胞内に侵入して増殖を開始する。この活性は鶏赤血球（ｃＲＢＣ）においては、インフルエンザウイルスと鶏赤血球との凝集体（集合体）を形成する鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）に置き換えられると推定される。つまり、抗ウイルス剤は、ＩＦＶが受容体に結合し細胞に吸着・侵入する過程を阻害し抗ウイルス効果を発揮すると考えられる。
【００３７】
今回の実験結果からして、ＣｍＡＥの有する赤血球凝集抑制効果から、ＣｍＡＥの抗ウイルス効果はＩＦＶのＨＡ蛋白質と細胞のシアロ糖鎖の相互作用を何らかの機構で阻害するために細胞内へのエントリーを阻止することによって発揮されたと考えられる。
【００３８】
以上の結果から、ＣｍＡＥが予め存在すれば、ＩＦＶの細胞への侵入を阻止できるし、ＩＦＶの増殖時に存在しても、放出された仔ウイルスの新たな未感染細胞への感染を阻止できるため、予防・治療の両方に使用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、本発明に係る熱湯抽出物（ＣｍＮＥ）及びアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）はインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の細胞へのエントリーという最も基本的なステップを阻害するため、実験に供したウイルス株だけでなく、他のウイルスに対しても抗ウイルス効果を奏する可能性が考えられる。例えば、同様のステップを辿るパラインフルエンザウイルス、ムンプウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等にも有効に抗ウイルス効果を発揮するものと考えられ、健康食品または医薬品として広く利用できるのである。
なお、本願発明の抗ウイルス剤における抽出物（ＣｍＡＥおよびＣｍＮＥ）中の脂質除去による抗ウイルス効果について、ＩＦＶはエンベロープ（外套）という脂質をまとった構造物であり、該エンベロープという脂質と好んで相互作用するように、抽出物中の抗ＩＦＶ活性物質における脂質をできるだけ多く除去しておくことで、両者間の相互作用がより有効に活性化するのであり、また、ＩＦＶ以外の脂質にも作用するはずであるから、他のウイルスにも有効に作用すると考えられる。
【符号の説明】
【００４０】
なし
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コッコミクサ藻体より抽出したインフルエンザウイルス等に抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤及びその製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この種のコッコミクサ藻体から抽出した抗ウイルス剤としては、同一出願人に係る発明が公知になっている。この公知の抗ウイルス剤の抽出に用いたコッコミクサ藻体は、緑色植物門（Chlorophyta）、緑藻綱（Chlorophyceae）、クロロコッカム目（Chlorococcales）、クロロコッカム科（Chlorococcaceae）に属するコッコミクサ・ミロール（Coccomyxa minor）又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス（Coccomyxa gloeobotrydiformis）とする乾燥したコッコミクサ藻体にイオン交換水を加え、還流下で加熱抽出を行って得た抽出液を遠心分離し、上清を減圧濃縮して抽出物（ＣＥ）を得て、該抽出物を蒸留水による溶出画分し、および、蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分した多糖体画分（ＣＥ−１、ＣＥ−２、ＣＥ−３）を有効成分とするものである（特許文献１）。
【０００３】
そして、この抗ウイルス剤は、Ｒｉｂ（リボース）、Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｕｌ（グルコース）、Ｒｈａ（ラムノース）が主たる成分になっており、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示すというものである。
【０００４】
また、微細藻類のクロレラまたはコッコミクサ藻体から抽出した酸性多糖よりなる抗癌性物質も公知になっている。微細藻類から酸性多糖を抽出するには、微細藻類を熱水に懸濁して抽出処理し、遠心分離によりエキス分とウエットストラッジに分離し、ウエットストラッジに水を加えて撹拌しながら、アルカリ性基材によりｐＨを１０以上に調整してエキス分を抽出し、このエキス分を遠心分離し、分離したエキス分を撹拌しながらｐＨを３〜４に調整して酸性多糖の沈殿物を析出させて得られるものである（特許文献２）。
【０００５】
この酸性多糖よりなる抗癌性物質をマウスに投与して実験したところ、免疫の初期活性として、マクロファージ活性を有意に示し、中性多糖より活性能があることが明らかになり、また、マウスにＭＮＵ単独経口投与により３０週で前胃偏平上皮癌の発生が見られたが、酸性多糖の抗癌性物質を投与することによって前胃偏平上皮癌の抑制効果が明らかになったとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２４７７５７号公報
【特許文献２】特開２００１−２８８１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記公知例の抗ウイルス剤においては、イオン交換水を加えて加熱抽出した抽出物を蒸留水で溶出画分を行ったもの、さらにその溶出したものを無機塩溶液で溶出画分したものであるが、加熱抽出時に得られる抽出物は、遠心分離した上清を減圧濃縮して得た抽出物であって、リボース、ガラクトース、グルコース、ラムノースが主たる成分になっており、脂質の除去は行なっていないので高純度とはいえないのである。
【０００８】
また、前記酸性多糖よりなる抗癌性物質は、その成分については明確にしていないが、この種の微細藻類に含まれる多糖類はβ−グルカンが多いが、このβ−グルカンは、熱水で抽出される中性多糖であり、これには酸性多糖はほとんど含まれていないとしている。そのために、最初に９０℃の熱水で抽出処理して中性可溶画分を除外し、次に７０℃の熱水で撹拌処理しアルカリ性に調整してエキス分を抽出して分離し、分離したエキス分を別のタンクに移して撹拌しながら１Ｎ塩酸でｐＨ４調整して酸性多糖の析出を起こさせ、析出した酸性多糖を回収するというものであり、その成分は不明であるが、あくまでも抗癌性物質の範囲である。
【０００９】
従って、公知の技術は熱水による抽出が主体であり、抽出物中には多くの脂質が残存していることから、新型及び季節性のヒトインフルエンザウイルスに対して、抗ウイルス活性を抑制する効果が弱いので、その効果を高めること、即ち、高純度の抽出物にすることに解決課題を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、種々研究の結果、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであるが、抽出の仕方によって抽出物の成分の相違と高純度にすることによって、抗ウイルス活性を抑制する効果を見出して本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明の第１の発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを特徴とするものである。
【００１２】
この第１の発明において、前記多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすること、を付加的な構成要件として含むものである。
【００１３】
本発明の第２の発明に係る抗ウイルス剤の製法は、微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなることを特徴とするものである。
【００１４】
さらに、もう１つの抗ウイルス剤の製法は、前記第２の発明で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、 該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであるとともに、多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすることにより、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するという優れた効果を奏する。
【００１６】
更に、本発明に係る製法の発明は、揮発性溶剤を使用して超音波振とうを行なうことによって、成分中の脂質を除去し易くすると共に、繰り返しの脂質除去工程を行うことによって大半の脂質が除去できるのであり、純度の高い抽出物を得ることができ、新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する高い抗ウイルス活性を有するので、例えば、健康食品の補助剤または医薬品として使用できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（１）図は、本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、赤血球凝集試験の手順を示す説明図であり、（２）図は赤血球凝集試験の原理を解り易く略示的に示した説明図である。
【図２】本発明に係る抗ウイルス剤の細胞毒性（傷害性）試験において、高濃度の範囲まで細胞毒性（傷害性）が全くないことを示すグラフである。
【図３】本発明に係る抗ウイルス剤の試験に供した新型インフルエンザおよび現在流行中の季節性インフルエンザそれぞれのウイルス株に対する増殖阻害効果を示したグラフである。
【図４】ヒトＡ型インフルエンザウイルスの全て（３つ）の亜型への有効性を検討するために、３種類の古典的インフルエンザウイルス株を使用し、抗ウイルス剤の増殖阻害効果を調べたグラフである。
【図５】本発明に係る抗ウイルス剤の添加時間による抗ウイルス効果への影響を調べるために、ウイルス感染過程の様々な時間に抗ウイルス剤を添加した、その添加、存在時間を示した図である。
【図６】同抗ウイルス剤の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響をＭＤＣＫ細胞の細胞傷害度で評価したグラフである。
【図７】同抗ウイルス剤の添加、存在時間による抗ウイルス効果への影響を生成ウイルス量、即ちＨＡテストで評価したグラフである。
【図８】同抗ウイルス剤とインフルエンザウイルスの相互作用によるＨＡ活性の阻害機序を解り易く示した説明図である。
【図９】インフルエンザワクチン、既存の抗ウイルス剤の阻害機序を解り易く模擬的に示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る抗ウイルス剤の原料としては、微細藻類の一種である乾燥したコッコミクサ藻体が用いられる。
この乾燥したコッコミクサ藻体を揮発性の溶剤と一緒に超音波振とう遠心濃縮機により振とう及び遠心分離を行なうと共に、揮発性の溶剤で複数回の脱脂操作を行い、その後、所要時間に亘り熱湯抽出し、該熱湯抽出物を遠心分離により固液分離し、分離した液層を濃縮し凍結乾燥して第１の発明に係る中性の熱水抽出物を得る。
【００１９】
さらに、上記分離して得られた固層に所要量の水を加え、アルカリ性に調整し所要時間撹拌して抽出を行ない、遠心分離にて液層を回収し、該回収した液層を酸性に調整し低温にて所要時間静置して沈殿物を生成させ、該沈殿物を遠心分離して固形物として回収し、複数回の洗浄操作を行なってもう１つの実施の形態に係るアルカリ抽出物を得る。得られた抽出物は揮発性溶剤で複数回の脱脂操作を行った後、凍結乾燥するものである。
【００２０】
［実施例等］
次に、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
[コッコミクサの水溶性多糖体の抽出方法]
乾燥したコッコミクサ藻体２ｇに１００ｍｌのベンゼン：メタノール（２：１）からなる揮発性溶剤を入れ、超音波処理を１０分行った後、５０℃に加温した状態で３時間振とう及び遠心分離を行なった後に、同様の揮発性溶剤、即ち、ベンゼン：メタノール（２：１）を１００ｍｌ入れて脱脂操作を少なくとも３回繰り返して行ない、遠心分離により溶剤を除去する。
この脱脂後のパウダー状になったものに１００ｍｌの水を加え、９０℃に加熱して３時間撹拌抽出した。所要時間保冷後に遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って固液分離した。分離して回収した液層は濃縮し、該濃縮液を凍結乾燥して中性多糖体(推定)の乾燥粉末を得た。つまり、コッコミクサから０．２６ｇの熱水抽出物（ＣｍＮＥ）を得た。
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
なお、複数回の脱脂処理を行うことによって有効成分中の大半の脂質が除去される。
【００２１】
[コッコミクサのアルカリ抽出多糖体の抽出方法]
前記水溶性多糖体の抽出工程で遠心分離後に得られた固層（含水率７５％）に水１Ｌを加え、所要のアルカリ溶液、例えば、１０％ＫＯＨにてｐＨ９〜１１に調整した。調整した液を６０℃に加温して３０分間撹拌抽出を行なった。所要時間保冷後に遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し液層を回収した。回収した液に所要の酸性溶液、例えば、１０％ＨＣｌを添加しｐＨ４に調整し浮遊物を確認した後、沈殿物を得るために４℃で１２時間静置した。沈殿物は遠心分離（１５０００ｒｐｍ）し固形物として回収した。この固形物の回収操作、即ち、加水、撹拌洗浄、遠心分離を３回繰り返して得られた洗浄後の沈殿物を凍結乾燥し、酸性多糖体（推定）を得た。つまり、コッコミクサから０．１ｇのアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）を得た。
その後、凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
乾燥物を、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌに懸濁し、クロロホルム：メタノールで脱脂処理を行った後、ＤＥＡＥカラムにて分画処理した。
抽出物の有効成分は、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコース等からなる脱脂された純度の高い多糖体である。
【００２２】
[試験]
検体として、本発明で得たコッコミクサのアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）を用いて、抗インフルエンザウイルス活性を検証した。そのアルカリ抽出物をＤＰＢＳ（-）で高濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液を調整し、該溶液を段階的に希釈することで試験した。
【００２３】
ウイルス株について：
試験のために入手したＡ型ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）については、第１グループとして、新型及び現在流行中の季節性インフルエンザウイルスと、第２グループとして過去に流行した季節性インフルエンザウイルスとに分けられる。
第１グループ：
1） Ａ/Ｃalifornia/０７/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
2） Ａ/Ｎarita/１/２００９(Ｈ1Ｎ1)pdm : Ｈ1Ｎ1亜型（２００９年新型）
3） Ａ/Ｂrisbane/５９/２００７(Ｈ1Ｎ1) : Ｈ1Ｎ1亜型（流行中の季節性）
4） Ａ/Ｕruguai/７１６/２００７(Ｈ3Ｎ2) : Ｈ3Ｎ2亜型（流行中の季節性）
第２グループ：
1）Ａ/ＷＳＮ/１９３３/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
2）Ａ/ＵＳＳＲ/１９７７/Ｈ1Ｎ1 : Ｈ1Ｎ1亜型（古典的な季節性）
3）Ａ/Ａdachi/１９５７/Ｈ2Ｎ2 : Ｈ2Ｎ2亜型（古典的な季節性）
4) Ａ/Ａichi/１９６８/Ｈ3Ｎ2 : Ｈ3Ｎ2亜型（古典的な季節性）
【００２４】
細胞株として：
インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の感染実験で繁用される成犬の腎臓から樹立された上皮様細胞株であるＭＤＣＫ（Mardin-Darby canine kindney ）細胞を使用した。細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ液体培地で３７℃、５％ＣＯ２で継代培養したものを使用した。
【００２５】
細胞傷害性試験：
ＭＤＣＫ細胞を９６well plate（ウェルプレート）へ播種し、１２時間培養して細胞を吸着させた後、新鮮なＭＥＭ−１０％ＦＢＳに培地交換した。その際、高濃度に調整したアルカリ抽出物の溶液を各終濃度になるように添加した。溶液添加後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した時点で終濃度５００ｕｇ／ｍｌとなるようＭＴＴを添加し、同条件のインキュベーター内で３時間培養し色素を取り込ませた。その後、色素を含む培地を取り除き、ＤＭＳＯ（１００ｕｌ／well）を加え沈殿を溶解し５７０ｎｍの吸光度を測定した。予め作成しておいて検量線を元に細胞のviabiltyを決定した。
【００２６】
抗ウイルス活性の測定：
４８well plate(ウェルプレート) に培養したＭＤＣＫ細胞を前記アルカリ抽出物の溶液（１０−２０００ｕｇ／ｍｌ）で２時間処理後、６ＰＦＵ（プラーク形成単位）／細胞でインフルエンザウイルスを感染させ、感染４８時間後に収穫した。ウイルス量は鶏赤血球凝集試験（ＨＡ test）にて測定し、赤血球濃度からウイルス粒子数を換算し、増殖阻止活性を評価した。
【００２７】
赤血球凝集試験（ＨＡ test）の手順：
図１（1）に示したように、９６ウェルを１２列８行（Ａ〜Ｈ）に整列して並べて、
1） 各ウェルに生理食塩水を５０ｕｌずつ添加する。
2） 前記第１と第２グループの８種類の各ウイルスサンプル液５０ｕｌを採って、第１列Ａから順にＨ行まで添加する。第１列のウェルＡ〜Ｈだけが計１００ｕｌとなる。
3） ２倍段階希釈：第１列の各ウェルの溶液をピペッティングにより混和した後、５０ｕｌだけ吸い取り、これを次の第２列のウェルに加える。第２列のウェルが１００ｕｌになるが、第１列と同様にピペッティングで混和した後、５０ｕｌだけ吸い取りこれを次の第３列のウェルに加える。この操作を第３列以降のウェルについても順次行うことにより、２倍段階希釈列を作成する。
4） １％鶏赤血球を５０ｕｌずつ第１２列から第１列まで加える。ＡからＨ行全てについて行なう。
5） 血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価（血球凝集価）とする。
【００２８】
赤血球凝集試験（ＨＡ test）の原理については、図１（2）に示したように、赤血球の数とウイルスの数とによって、赤血球が凝集する状態を理解し易いように示したものであり、第７列目まではウイルスの数が勝って凝集しており、第８列目も赤血球の数とウイルスの数とが同数でかろうじて凝集し、第９列目以降は赤血球の数が多いので凝集しないことを示している。そして、結果の解釈としては、次のとおりである。
1） ＨＡ価（血球凝集価）：血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のＨＡ価とする。
2） 即ち、上記のＨＡ価は、２８＝２５６となる。
3） １％ｃＲＢＣ＝（１×１０７ cells／ml）を使用して上記結果を得た場合、サンプル原液のウイルス濃度は、２８×（１×１０７）＝２５６×１０７＝２．６×１０９粒子／mlとなる。
【００２９】
前記細胞傷害試験において、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図２に示したように、４０００ｕｇ／ｍｌまで全く細胞毒性を示さなかった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についても同様の試験（データは示していない）を行なったが、アルカリ抽出物と同様に細胞毒性は無かった。
【００３０】
また、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）は、図３及び図４に示したように、第１及び第２グループの各ヒトインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）に対して、１０ｕｇ／ｍｌ以上で有意な抗ウイルス活性を示し、１００ｕｇ／ｍｌ以上で未処理の１／１００以下にウイルス増殖を抑制したことが明確になった。また、熱水抽出物（ＣｍＮＥ）についてもほぼ同等の抗ウイルス活性（データは示していない）が認められた。
【００３１】
さらに、アルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）の抗ウイルス効果の作用機序を調べるために、抽出物の添加時間（time of addition）のウイルス増殖への影響を次のI〜Vに従って調べた。
I. ＭＤＣＫ細胞をＣｍＡＥでウイルス感染前に３時間処理した場合。
II. ウイルス感染中のみにＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
III. ウイルス感染中から４８時間後にＣｍＡＥが存在した場合。
IV. 感染処理後３時間以降にＣｍＡＥが培地中に存在した場合。
V. 感染処理後６時間以降にＣｍＡＥが倍地中に存在した場合。
【００３２】
図５は、ウイルス感染に対するＣｍＡＥの添加時間による有効性を示したもので、ウイルス感染時を-1hpiとした場合（-1hpiで吸着開始し0hpiで侵入開始）に、I．感染3時間前に添加し感染時に除去、II．感染時に添加し１時間後に除去、III．感染時に添加しその後ずっと存在、IV．感染4時間後に添加しその後ずっと存在、V．感染7時間後に添加しその後ずっと存在、の条件で実験した。そして、ＩＦＶの増殖過程をＭＤＣＫ細胞の細胞障害度、つまり、ウイルスの細胞傷害活性で評価したところ、図６に示したように、ウイルスの侵入時にアルカリ抽出物が存在することによって、血球（細胞）へのウイルス吸着がなされないこと、即ち、抗ウイルス活性を示すことが明らかになった。
【００３３】
次に、ＨＡテストでアルカリ抽出物の添加時間におけるウイルス増殖への影響を培養液中に回収されるウイルス量で評価したところ、図７に示したように、前記II．とIII．のウイルス吸着、ウイルス侵入時に加えて、前記IV．とV．のウイルス吸着及びウイルス侵入後であっても、アルカリ抽出物が存在することによって、ウイルスの増殖が抑制され続け、回収時まで存在しているとその間抗ウイルス効果を示すことが判明した。
【００３４】
図６と図７の結果の相違はＣｍＡＥに赤血球凝集を抑制する効果があると推定されたので、アルカリ抽出物のインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）への影響を調べたところ、鶏赤血球（ｃＲＢＣ）とＩＦＶを混合する際に、ＣｍＡＥを添加すると濃度依存性にインフルエンザウイルスの鶏赤血球凝集活性を抑制することが明らかになった。
【００３５】
図８は、ＣｍＡＥの赤血球凝集抑制機構の推定図であって、ＩＦＶは自身のＨＡ蛋白質によって鶏赤血球（ｃＲＢＣ）表面のシアロ糖鎖と次々に結合しＩＦＶ−ｃＲＢＣネットワークを形成することによって赤血球凝集を起こすのである。しかし、その際に、ＣｍＡＥが存在するとＩＦＶとｃＲＢＣの相互作用を何らかの要因でネットワーク形成を阻害するために赤血球凝集を抑制すると考えられる。
【００３６】
一般に、インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）は、図９に示すように、自身のＨＡ（赤血球凝集素）タンパク質によって、動物細胞表面のシアロ糖鎖と結合して細胞に吸着後、細胞内に侵入して増殖を開始する。この活性は鶏赤血球（ｃＲＢＣ）においては、インフルエンザウイルスと鶏赤血球との凝集体（集合体）を形成する鶏赤血球凝集活性（ＨＡ活性）に置き換えられると推定される。つまり、抗ウイルス剤は、ＩＦＶが受容体に結合し細胞に吸着・侵入する過程を阻害し抗ウイルス効果を発揮すると考えられる。
【００３７】
今回の実験結果からして、ＣｍＡＥの有する赤血球凝集抑制効果から、ＣｍＡＥの抗ウイルス効果はＩＦＶのＨＡ蛋白質と細胞のシアロ糖鎖の相互作用を何らかの機構で阻害するために細胞内へのエントリーを阻止することによって発揮されたと考えられる。
【００３８】
以上の結果から、ＣｍＡＥが予め存在すれば、ＩＦＶの細胞への侵入を阻止できるし、ＩＦＶの増殖時に存在しても、放出された仔ウイルスの新たな未感染細胞への感染を阻止できるため、予防・治療の両方に使用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したように、本発明に係る熱湯抽出物（ＣｍＮＥ）及びアルカリ抽出物（ＣｍＡＥ）はインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）の細胞へのエントリーという最も基本的なステップを阻害するため、実験に供したウイルス株だけでなく、他のウイルスに対しても抗ウイルス効果を奏する可能性が考えられる。例えば、同様のステップを辿るパラインフルエンザウイルス、ムンプウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス等にも有効に抗ウイルス効果を発揮するものと考えられ、健康食品または医薬品として広く利用できるのである。
なお、本願発明の抗ウイルス剤における抽出物（ＣｍＡＥおよびＣｍＮＥ）中の脂質除去による抗ウイルス効果について、ＩＦＶはエンベロープ（外套）という脂質をまとった構造物であり、該エンベロープという脂質と好んで相互作用するように、抽出物中の抗ＩＦＶ活性物質における脂質をできるだけ多く除去しておくことで、両者間の相互作用がより有効に活性化するのであり、また、ＩＦＶ以外の脂質にも作用するはずであるから、他のウイルスにも有効に作用すると考えられる。
【符号の説明】
【００４０】
なし
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、
該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有すること
を特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすること
を特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、
揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、
脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、
熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
【請求項４】
前記請求項３で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、
抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、
回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、
該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、
洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
【請求項１】
微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、
該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型及び季節性のＡ型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有すること
を特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
前記多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすること
を特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
微細藻類のコッコミクサと揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、
揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、
脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、
熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
【請求項４】
前記請求項３で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、
抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、
回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、
該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、
洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２２４５５４（Ｐ２０１２−２２４５５４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９０８６１（Ｐ２０１１−９０８６１）
【出願日】平成２３年４月１５日（２０１１．４．１５）
【出願人】（３９９１２７６０３）株式会社日健総本社 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月１５日（２０１１．４．１５）
【出願人】（３９９１２７６０３）株式会社日健総本社 (19)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]