抗ウイルス治療
本出願は、抗ウイルス治療を向上させるための処置、および抗ウイルス治療が有効かどうかを決定するための方法に関する。特に、本出願は、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法、および前記決定の実施のためのキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス治療を向上させるための処置、および抗ウイルス治療が有効であるかどうかを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は、健康にとって深刻な脅威であり、動物および人間の病的状態の主な原因であることが知られている。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界中で慢性肝臓疾患の主な原因である。Ｃ型肝炎の重要かつ顕著な特徴は、その慢性化への傾向である。７０％を超える感染した個体において、ＨＣＶは、数十年にわたる持続的感染を確立し、肝硬変および肝細胞癌へと導く可能性がある。
【０００３】
ＨＣＶ生物学における興味深い仮説として、ウイルスのＮＳ３−４Ａプロテアーゼはウイルス性タンパク質をプロセシングするだけでなく、ウイルス感染を検出してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の転写活性化を誘導する細胞内感覚経路の構成要素を切断して不活性化することが提案されている。ＮＳ３−４Ａの標的の１つは、ＴＲＩＦ（ＩＦＮβを誘導するＴＩＲドメイン含有アダプター）であり、それは、ＴＬＲ３（ｔｏｌｌ様受容体３）によるエンドソームにおけるｄｓＤＮＡ検出とＩＦＮβの誘導との間を本質的に結びつけるものである。最近になって、レチノイン酸誘導性遺伝子−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）およびＭＤＡ５（ヘリカード）がｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された。どちらのセンサーもＣａｒｄｉｆ（ＩＰＳ−１、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡとしても知られている）を通してシグナル伝達し、ＩＦＮβ産生を誘導する。Ｃａｒｄｉｆは、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａにより切断されて、不活性化され得る。ｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された、２つのＲＮＡヘリカーゼであるＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５は、Ｃａｒｄｉｆを通してＩＦＮβ産生を誘導するように作用する。
【０００４】
Ｉ型ＩＦＮは、先天免疫系の重大な構成要素であるだけでなく、ＣＨＣに対する現行の治療法の最も重要な構成要素でもある。現行の標準治療法は、週１回のペグ化ＩＦＮα（ｐｅｇＩＦＮα）の皮下注射および毎日の経口抗ウイルス剤リバビリンの摂取からなる。このレジメンは、患者の約５５％において全体的な持続性ウイルス陰性化（sustained virological response, ＳＶＲ）を達成し、遺伝子型の間で有意差がある。ＳＶＲは、処置中の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの消失、および治療停止後少なくとも６カ月間のその非存在の継続として定義される。ＳＶＲを達成する患者の長期フォローアップのいくつかの研究により、この応答が、９５％を超える患者において永続的であることが実証されている。ＳＶＲの確率は、処置に対する初期応答に強く依存する。１２週間の治療後、少なくとも２ｌｏｇ１０のウイルス量(viral load)の降下として定義される早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ）を示さない患者は、ＳＶＲを生じる可能性は極めて低く、これらの患者では処置を停止することができる。他方、ＥＶＲを有する患者は、治癒する可能性がかなりあり、その６５％がＳＶＲを達成する。４週間の処置後の血清ＨＣＶ ＲＮＡ検出不能として定義される急速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）を生じる患者では、予後はさらに良い。それらのうち、ＳＶＲを達成するのは、８５％を超えるであろう。残念なことに、遺伝子型１を有する患者の２０％未満、遺伝子型２または３を有する患者の約６０％がＲＶＲを示す。治療に対する初期応答について重要である宿主因子は、現在知られていない。
【０００５】
Ｉ型ＩＦＮは、数百個の遺伝子（ＩＳＧ、インターフェロン活性化遺伝子(interferon stimulated gene)）の制御を通して強力な抗ウイルス効果をもたらす。ＩＳＧの転写活性化は、休止細胞では通常合成されず、かつ細胞内の非ウイルス特異的抗ウイルス状態を確立するタンパク質を誘導する。インターフェロンは、多数のサイトカインおよび成長因子により用いられる細胞シグナル伝達のパラダイムである、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することによってそれらの合成を誘導する。全てのＩ型ＩＦＮは、同じ細胞表面受容体（ＩＦＮＡＲ）に結合し、受容体関連ヤヌスキナーゼファミリーメンバー、Ｊａｋ１およびＴｙｋ２を活性化する。その後、そのキナーゼは、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）およびＳＴＡＴ２をリン酸化して活性化する。活性化ＳＴＡＴは、核へ移行し、そこで、それらは、ＩＳＧのプロモーター内の特定のＤＮＡエレメントと結合する。ＩＳＧの多くは、抗ウイルス活性を有するが、脂質代謝、アポトーシス、タンパク質分解、および炎症性細胞応答に関与するものもある。多くのウイルスと同様に、ＨＣＶは、おそらく複数のレベルで、ＩＦＮ系に干渉する。ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＨＣＶタンパク質を発現する細胞およびトランスジェニックマウス、ならびにＣＨＣを有する患者の肝臓生検において、阻害されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＣＶタンパク質のＮＳ５ＡおよびＥ２は、重要な非特異的抗ウイルスタンパク質であるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）と結合して、不活性化する。しかしながら、ＣＨＣを有する患者において治療的に適用されたＩＦＮに対する応答にとって重要である分子機構は、現在知られていない。
【０００６】
ＩＦＮ経路に多くの異なるレベルで干渉するＨＣＶの能力は、ＨＣＶが慢性感染を確立することに成功することの根底にある機構である可能性が高い（２）。しかしながら、全く矛盾したことに、ＨＣＶに急性または慢性感染したチンパンジーにおいて、数百個のＩＳＧが肝臓において誘導されている（１６、１７）。それでもなお、内因性ＩＦＮ系の活性化にもかかわらず、ウイルスは、慢性感染した動物から排除されない（１８）。チンパンジーに関して得られた結果をヒトに当てはめることは難しく、それは、これらの種の間にＨＣＶ感染の病理生物学におけるいくつかの重要な違いがあるからである。ＨＣＶに急性感染したたいていのチンパンジーは、自発的にそのウイルスを排除するが、ヒトにおける感染ではほとんど慢性になる。他方、慢性感染したチンパンジーはめったにＩＦＮで治癒することはあり得ないが、ＣＨＣを有する患者の半分より多くが処置に成功している（１９）。
【０００７】
ＩＳＧの誘導はまた、ＣＨＣを有する多くの患者の処置前の肝臓生検に見出され、このことはＨＣＶ感染が内因性ＩＦＮ系の活性化へと導き得ることをやはり実証している（２０）。特に、ＩＳＧの発現が事前に上昇している患者は、最初の発現が低い患者と比較した場合、治療に対する応答が悪い傾向にあった（２０）。この治療に対する異なる応答の原因はわかっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、本発明者らが、ｐｅｇＩＦＮαでの治療前と治療中の慢性肝炎の患者の肝臓生検と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のペア試料（paired sample）におけるＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた研究に基づいている。さらに、生化学的データおよび分子データを処置に対する応答に相関づけた。その研究は、添付の実施例でより詳細に述べられている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、肝臓のウイルス感染を有する一部の被験体が、ＩＦＮシグナル伝達経路が活性化ＩＳＧを伴う刺激状態にあるような、「事前活性化」の状態にあることを明らかにした。本発明者らは、そのような個体が、後でＩＦＮおよび抗ウイルス剤で処置された場合、その抗ウイルス処置に対する応答が悪く、または応答がなかったことを見出している。対照的に、感染した被験体の別の群は、ＩＦＮ受容体の事前刺激（およびＩＳＧの刺激）を生じていないように見え、この群は、抗ウイルス治療に対して良く応答した（すなわち、急速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）を有した）。さらに、被験体が処置に対する不良応答者であるかどうか、またはいくつかの特定の遺伝子（それらの一部はＩＳＧ遺伝子である）の発現レベルに従ってＲＶＲを有するかどうかを決定することが可能である。換言すれば、本発明者らは、その発現レベルから被験体が抗ウイルス処置に対して応答するかどうかが予測される、予後遺伝子マーカーである１セットの遺伝子を同定した。
【００１０】
これにより、本発明者らは、肝臓のウイルス感染を患っている被験体についての処置レジメンを臨床医が決定するのを助ける方法を開発することができることを理解するに至る。感染個体の遺伝子発現は、対照（すなわち、ウイルス感染のない被験体）の遺伝子発現と比較することができる。
【００１１】
（対照と比較して）変化した遺伝子発現を有する感染被験体は、処置レジメンにおけるＩＦＮの使用から恩恵を受ける可能性が低いであろう（すなわち、これらの個体はＲＶＲを生じないと予想されるであろう）が、対照発現と比較して遺伝子発現がほとんど変化しなかった感染被験体は、ＩＦＮ治療から恩恵を受け、ＲＶＲを有する可能性が高い。当業者は、ＩＳＧの活性化がより良いウイルス排除と関連があり、処置に対して応答が悪い一部の被験体とは関連がないと予想するであろうから、本発明者らはこれらを相関づけてみて驚いた。
【００１２】
肝臓のウイルス感染を有する、「応答者」の被験体および「非応答者」の被験体における遺伝子発現レベルの研究、例えば、Ｃｈｅｎら（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８巻、１４３７〜１４４４ページが以前にあったが、本発明の一部として行われた調査では、どれが予後マーカーとして働くかを決定するためにより非常に広い遺伝子のセットを研究した。さらに、本発明者らはまた、抗ウイルス処置前および処置後に採取された試料における遺伝子発現レベルを分析し、この情報を用いて、予後遺伝子マーカーを同定したが、以前の研究は、処置前に採取された試料に存在する遺伝子発現レベルに処置の転帰を相関づけることを試みただけである。したがって、下記に示された予後遺伝子マーカーの同定に繋がるデータセットは、以前の研究におけるものよりもはるかに完全かつロバスト（robust）であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】肝臓およびＰＢＭＣにおける遺伝子発現のｐｅｇＩＦＮ−α２ｂ誘導性制御を示す図である。
【図２】ＨＣＶ感染患者におけるｐｅｇＩＦＮα２ｂ誘導性遺伝子制御は、ＲＶＲ患者の肝臓と非ＲＶＲ患者の肝臓との間、および肝臓とＰＢＭＣとの間に大きな違いを示すことを表す図である。
【図３】選択されたＩＳＧおよびＰＰ２Ａの触媒サブユニットのＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す図である。
【図４】肝臓生検におけるＪａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の分析を示す図である。
【図５】全ての患者生検試料における遺伝子発現の主なパターンはヒートマップとして示されている。
【図６】分類基準として４週間目での処置に対する応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣにおける教師あり分類予測（supervised classifier prediction）を示す図である。
【図７】肝臓生検におけるリン酸化ＳＴＡＴ１の免疫組織化学的染色の半定量的評価を示す図である（Ａ）。ｐｅｇＩＦＮα２ｂに応答したＳＴＡＴ−ＤＮＡ結合の誘導が、非ＲＲ患者の大部分において障害されることを示す図である（Ｂ）。
【図８】ヒトインターフェロンαのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図９−１】ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図９−２】ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１０−１】ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１０−２】ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１】ヒトインターフェロン受容体２ｂのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２】ヒトインターフェロン受容体２ｃのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
したがって、本発明の第１の態様において、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）以下の遺伝子群：
（ｉ）ＫＹＮＵ；ＰＡＨ；ＬＯＣ１２９６０７；ＤＤＣ；ＦＯＬＨ１；ＹＢＸ１；ＢＣＨＥ；ＡＣＡＤＬ；ＡＣＳＭ３；ＮＡＲＦ；ＳＬＰＩ；ＲＰＳ５；ＲＰＬ３；ＲＰＬＰ０；ＴＲＩＭ５、およびＨＥＲＣ５；
（ｉｉ）ＨＴＡＴＩＰ２；ＣＤＫ４；ＩＦＩ４４Ｌ；およびＫＬＨＤＣ３；
（ｉｉｉ）Ｃ７；ＩＦ；ＩＦＩ２７；ＩＦＩＴ１；ＯＡＳ２；Ｇ１Ｐ２；ＯＡＳ１；ＩＲＦ７；ＲＳＡＤ２；ＩＦＩ４４；ＯＡＳ３；ＳＩＧＩＲＲ；およびＩＦＩＴ２；
（ｉｖ）ＲＡＢ４Ａ；ＰＰＰ１Ｒ１Ａ；ＰＰＭ１Ｅ；ＥＮＰＰ２；ＣＡＰ２；ＡＤＣＹ１；ＣＡＢＹＲ；ＥＶＩ１；ＰＴＧＦＲＮ；ＴＲＩＭ５５；およびＩＬ２８ＲＡ；
（ｖ）ＭＭＥ；ＫＣＮＮ２；ＳＬＣ１６Ａ１０；ＡＭＯＴＬ１；ＳＰＰ２；ＬＲＣＨ４；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ；ＴＳＰＹＬ５；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ；ＰＨＴＦ１；ＺＮＦ６８４；ＧＳＴＭ５；ＦＬＪ２００３５；ＦＩＳ；ＰＡＲＰ１２；Ｃ１４ｏｒｆ２１；ＰＮＰＴ１；ＦＬＪ３９０５１；ＧＡＬＮＴＬＩ；ＯＳＢＰＬ１Ａ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＴＸＮＲＤ２；ＬＯＣ２０１７２５、ＴＯＭＭ７；ＳＲＰＸ２；ＤＣＮ；ＰＳＭＡＬ；ＭＩＣＡＬＬ２；ＦＬＪ３００４６；ＳＡＭＤ９；ＡＮＫＲＤ３５；ＬＯＣ２８４０１３；ＬＯＣ４０２５６０；およびＬＯＣ１４７６４６
の各々から少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における前記遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む。
【００１５】
本発明の一実施形態では、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示す。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示す。
【００１７】
本発明の第１の態様において評価された遺伝子のそれぞれに関するさらなる情報は、添付された実施例の表２に提供されている。特に、本発明者らは、遺伝子のそれぞれについてＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ識別番号を与え、それによって、各遺伝子を特定的に同定することができる。
【００１８】
本発明の第１の態様の方法は臨床医にとって非常に有益となることが認識されるだろう。ＩＦＮはタンパク質成長因子であり、ＩＦＮを含む医薬調製物は製造する費用が高い。それゆえに、ＩＦＮが適切かつ費用効率が高い方法で用いられることになると確信することは、臨床医にとって非常に重要である。さらに、費用とは無関係に、できる限り迅速に肝臓のウイルス感染を除去することが望ましいことが多い。それゆえに、臨床医がＩＦＮを投与し、その後、それが有益な効果を生じないことを発見するのは、（代わりの治療を利用するのに費やすことができた）時間を無駄にしている。したがって、本発明の第１の態様の方法は、臨床医が被験体を２つの集団に分類することができるため、その大きな助けとなる。１つの集団は、上記および表２に列挙された遺伝子の変化した発現を示し、したがって、ＩＦＮでの処置から恩恵を受けないであろう。上記および表２に列挙された遺伝子の発現が対照試料と有意には異ならない他方の集団は、ＩＦＮでの治療から恩恵を受けるであろう。
【００１９】
別の実施形態において、（処置から４時間後、異なる形で発現した）表３の遺伝子の発現は同じような方法で用いることができると考えられる。
【００２０】
「抗ウイルス治療」とは、ＩＦＮ活性の刺激を含むウイルス感染を低下させるための任意の処置レジメンを意味する。そのようなレジメンは、Ｉ型ＩＦＮ活性を刺激し、かつ／またはＩＦＮ活性化遺伝子（IFN stimulated gene）（ＩＳＧ）を誘導する化合物の使用を含んでもよい。治療は、ＩＦＮそれ自体または他のＩＦＮ受容体アゴニストでの処置を含んでもよい。例えば、治療は、ペグ化ＩＦＮα（ｐｅｇＩＦＮα）を利用してもよい。
【００２１】
治療はＩＦＮ活性の刺激のみを含んでもよい。しかしながら、本発明者らは、本発明の第１の態様による方法が、既知の抗ウイルス剤と併用したＩＦＮ活性の刺激剤を含む併用療法の使用を含む抗ウイルス治療の有効性を予測するのに特に有用であることを見出している。多くの抗ウイルス剤が当技術分野にとって公知であり、本発明の方法は、いくつかの異なる併用療法の有効性を評価するために用いることができる。しかしながら、本発明者らは、本発明の第１の態様の方法が、抗ウイルス剤リバビリンと併用して用いられるＩＦＮ活性の刺激剤での治療の有効性を予測するのに特に価値があることを見出している。
【００２２】
本発明の第１の態様の方法を、抗ウイルス治療としてのｐｅｇＩＦＮαおよびリバビリンの有用性を予測するために用いることが最も好ましい。
【００２３】
本発明の第１の態様の方法は、Ｂ型肝炎ウイルス感染およびＣ型肝炎ウイルス感染を含む、肝臓のいくつかの異なるウイルス感染の処置の有効性を評価するために用いることができる。その方法をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療の有効性を評価するために利用することが最も好ましい。本発明者らは、本発明の方法を、急速ウイルス陰性化を生じることが予想される被験体（ＲＶＲ）と生じるとは予想されない被験体（非ＲＶＲ）を識別するのに特に有用であることを見出した。
【００２４】
本発明に従って用いることができる被験体における遺伝子発現を表す試料は、被験体によって発現されている遺伝子に関する情報を提供することができる任意の試料を包含する。
【００２５】
適切な試料の例として、生検、外科手術中に切除された試料、血液試料、尿試料、痰試料、脳脊髄液試料、および（唾液スワブ試料などの）スワブ試料が挙げられる。試料の供給源は、被験体が有する可能性があるウイルス感染の型に依存することが認識されているであろう。
【００２６】
試料が肝臓組織由来であることが最も好ましい。肝臓試料は、方法がＨＣＶ感染を有する被験体を評価するために適用される場合、特に有益であることが見出されている。末梢血白血球がＩＦＮへの曝露前または曝露後に遺伝子発現の有意な変化を示さないのに対して、肝臓試料由来の遺伝子発現を分析することによってＲＶＲを非ＲＶＲ被験体と区別することができることを本発明者らは見出して驚いた。
【００２７】
適切な試料として、組織学的切片または凍結切片などの組織切片を挙げることができる。切片の由来する被験体における遺伝子発現を表す情報を提供することができるような方法でそのような切片を調製することができる方法は、当業者によく知られているであろうし、遺伝子発現を調べる場合、用いる予定である技術を参照して選択されるべきである。
【００２８】
被験体由来の組織の一部を含む試料の使用が企図されるが、遺伝子発現を表す試料が、そのような組織から取られた適切な抽出物を含むことが一般的に好ましくあり得、前記抽出物は、被験体における遺伝子発現に関する情報を提供する調査能力がある。被験体における遺伝子発現に関する情報を提供することができる組織抽出物の作製のために用いることができる適切なプロトコールは当業者によく知られているであろう。好ましいプロトコールは、遺伝子発現が調べられることになっている様式を参照して選択することができる。
【００２９】
肝臓由来の試料の場合、適切な調製工程は、実施例の１．１．１および１．１．３に開示されている。
【００３０】
「対照試料」とは、肝臓のウイルス感染に罹っていない個体に由来している、被験体由来の試料に等価の試料を意味する。対照試料を構成する等価の組織もしくは器官の試料、またはそのような試料由来の抽出物は、対照試料における遺伝子発現に関する情報の供給源として直接用いてもよいが、「理想の」対照試料における選択された遺伝子（または複数の遺伝子）の発現に関する情報を参照データの形として提供することができることが認識されているであろうし、一般的に好ましい。そのような参照データは、選択された対照組織における遺伝子発現を示す表の形で提供されてもよい。あるいは、参照データは、選択された対照組織における遺伝子発現を示す検索情報（retrievable information）を含むコンピュータソフトウェアの形で供給されてもよい。例えば、参照データは、被験体における各遺伝子群から選択された少なくとも１つの選択された遺伝子（複数可）の発現の対照組織試料における同じ遺伝子の発現との比較を可能にするアルゴリズムの形で提供されてもよい。
【００３１】
対照試料における上記および表２に列挙された遺伝子の発現が、対照試料を構成する組織または器官の試料の処理によって調べられることになっている場合、そのような処理は、被験体由来の試料を処理するために用いられる同じ方法を用いて行われることが好ましい。被験体試料および対照試料のそのような同等の処理(parallel processing)により、（組織を処理する選択された方法および調査される遺伝子発現に関連したいかなるアーチファクトも被験体試料および対照試料の両方に当てはまるであろうから）これらの組織における遺伝子発現の比較がお互いに対して標準化される信頼度がより大きくなる。
【００３２】
本発明の第１の態様による方法は、各遺伝子群から選択された少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の分析を含み得る。上記および表２または３に列挙された遺伝子の変化した発現が抗ウイルス治療の有効性を決定するのに用いることができるという知見は驚きであり、これは、（ＳＴＡＴ１をコードする遺伝子などの）特定の遺伝子の発現はＨＣＶ感染と関連づけられていたが、上記および表２に列挙された遺伝子のほとんどは、ＩＦＮ制御型遺伝子発現に、または治療がウイルス感染を処置するのに有効である可能性に関連しているとして同定されることは以前には決してなかったからである。さらに、これらの遺伝子のＩＦＮ活性との関連に関係なく、ＩＳＧの発現の増加が、その後のＩＦＮ処置に対する不良応答と関連することは全く予想されなかった。
【００３３】
本発明者らは、その発現レベルが抗ウイルス治療の転帰(outcome)についての予後マーカーであり得る合計８３個の異なる遺伝子を同定している。これらの遺伝子は、それらの機能に従って以下の５つの異なる群に区分されている：群（ｉ）は細胞代謝に関与していると考えられる；群（ｉｉ）は細胞周期に関与していると考えられる；群（ｉｉｉ）は免疫応答に関与していると考えられる；群（ｉｖ）はシグナル伝達に関与していると考えられる；群（ｖ）はそれぞれ、上記で示されたいかなる特定の群にも割り当てられない。この区分は、各遺伝子群由来の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが、被験体が抗ウイルス治療に応答性である可能性を決定するために評価される、本発明の方法に示されている。本発明者らはさらに、これらの遺伝子のサブセットが特別の価値を有し、かつそれらの各群の少なくとも１つのメンバーの発現レベルが分析される場合、その目的にとって有効であり得ることを見出している。
【００３４】
本発明の方法は、上記に列挙された少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、または７８個の分析に基づいていることが好ましい。
【００３５】
上記および表２または３に列挙された遺伝子の発現は、試料における遺伝子発現を表す標的分子の分析によって調べることができる。試料における標的分子の存在または非存在は、一般的に、適切なプローブ分子を用いて検出される。そのような検出は、遺伝子発現に関する情報を提供し、それによって、被験体試料に生じている遺伝子発現と対照試料に生じている発現との比較が可能になる。プローブは、一般的に、遺伝子発現を直接、または間接的に表す標的分子に特異的に結合する能力がある。その後、そのようなプローブの結合は、評価され、遺伝子発現と相関づけられて、被験体における遺伝子発現と対照における遺伝子発現との有効な予後比較を可能にする。
【００３６】
「変化した発現」とは、上記で論じられているように、遺伝子発現が、対照と比較したとき、試料において上昇している場合、または低下している場合の両方を含む。
【００３７】
逆に、「変化していない発現」とは、上記で論じられているように、遺伝子発現が、対照と比較したとき、試料において上昇も低下もしていない場合を含む。
【００３８】
遺伝子発現が変化しているか、変化していないかの評価は、日常的な統計解析方法を用いて行うことができる。
【００３９】
標的分子はペプチドまたはポリペプチドであり得る。ペプチドまたはポリペプチドの量は、特異的結合分子、例えば抗体を用いて決定することができる。好ましい例では、試料に存在する特定の標的タンパク質の量は、試料における標的タンパク質の生物活性を参照して評価してもよい。この様式での発現の評価および比較は、酵素活性を有するタンパク質標的の場合、特に適している。試料に存在するタンパク質標的の量の測定の適切な技術として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびウェスタンブロッティングなどのアプタマーおよび抗体に基づいた技術が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
核酸は、本発明の第３の態様による遺伝子発現を評価するための好ましい標的分子を代表する。
【００４１】
本発明の目的のための「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖かまたは二本鎖かのいずれかの形でのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことは理解されているであろう。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、これらの用語は、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で機能することができる天然のヌクレオチドの既知の類似体を包含すると解釈されるべきである。
【００４２】
さらに、本発明に従って用いるのに適した標的核酸は、「完全長」核酸（例えば、完全長遺伝子転写産物）を含む必要はなく、プローブ分子の特異的結合を可能にするのに十分な長さを含むことだけを必要とする。
【００４３】
核酸標的分子がｍＲＮＡ遺伝子転写産物およびそのような転写産物の人工産物であることが好ましい。遺伝子転写産物から生じる人工標的分子の好ましい例として、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡが挙げられ、それらのいずれも、周知のプロトコールまたは市販されているキットもしくは試薬を用いて作製することができる。
【００４４】
本発明の第１の態様の方法の好ましい実施形態において、適切な試料から採取された細胞を溶解するプロセス（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．製などの市販されている溶解緩衝液を用いて達成してもよい）、続いて（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．製のＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉスピンカラムなどの）市販されている核酸分子分離カラムを用いる可溶化液の遠心分離によって、ＲＮＡ標的分子を単離するように試料を処理することができる。ＲＮＡ抽出のための他の方法として、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ， Ｎ．（１９８７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２巻、１５６ページ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート方法のバリエーションが挙げられる。この様式で得られたＲＮＡは、適切な標的分子自体を構成する場合もあり、または遺伝子発現を表す標的分子の産生のための鋳型としての役割を果たす場合もある。
【００４５】
被験体試料または対照試料由来のＲＮＡは、例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、ｃＤＮＡ合成の基質として用いることが好ましい場合がある。その後、結果として生じたｃＤＮＡを、ＢｉｏＡｒｒａｙ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてビオチン化ｃＲＮＡに変換し、このｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を用いて反応混合液から精製してもよい。
【００４６】
遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの抽出または精製の必要性なしに、被験体試料または対照試料由来の組織において直接測定できる。例えば、目的とする被験体試料または対照試料に存在し、かつそれらにおける遺伝子発現を表すｍＲＮＡを、そのような組織の適切に固定された切片または生検を用いて調べてもよい。この種の試料の使用は、発現の比較が行われる迅速性に関して有利である可能性があり、加えて、試料を作製するために用いることができる組織処理が比較的安価で簡単である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術は、この種の組織試料において遺伝子発現を調べかつ比較することができる好ましい方法を代表する。被験体試料または対照試料における遺伝子発現を表すＲＮＡの利用可能性を維持する、目的とする組織の処理のための技術は、当業者には周知である。
【００４７】
しかしながら、被験体試料または対照試料における遺伝子発現を表すｍＲＮＡを抽出し、収集する技術もまた当業者に周知であり、本発明者らは、そのような技術が本発明に従って有利に用いることができることを見出している。被験体試料または対照試料由来の抽出されたｍＲＮＡを含む試料は、本発明の第３の態様の方法に用いるのに好ましい場合があるが、これは、そのような抽出物が、もとの組織を含む試料についての場合より容易に調べられる傾向にあるからである。例えば、遺伝子発現の比較を可能にする適切な標的分子は、被験体由来の組織の試料または対照組織の試料から単離された全ＲＮＡを含んでもよい。
【００４８】
さらに、抽出されたＲＮＡを容易に増幅して、被験体試料または対照試料における遺伝子発現に関する情報の増加を得ることが可能なｍＲＮＡ試料の増大を生じさせることができる。ｍＲＮＡ集団の抽出および増幅の技術の適切な例は周知であり、下記でより詳細に考察されている。
【００４９】
例として、本発明に従って用いるのに適した核酸標的を生じるための核酸の単離および精製の方法は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ１、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）の第３章に詳細に記載されている。
【００５０】
好ましい方法において、全核酸は、実施例に記載された技術を用いて所与の試料から単離してもよい。
【００５１】
遺伝子発現の調査および比較の前に核酸標的を増幅することが望ましい場合、試料の由来する被験体組織または対照組織において増幅された核酸の相対頻度について維持または調節する方法を用いることが好ましい可能性がある。
【００５２】
「定量的」増幅の適切な方法は当業者に周知である。１つのよく知られた例である定量的ＰＣＲは、対照試料と被験体試料との間で量が変化しないことが知られている対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するために用いることができる内部標準を提供する。
【００５３】
上記で概略を述べた方法に加えて、遺伝子転写産物特異的生成物の増幅をシグナルの発生へと結びつける任意のテクノロジーもまた定量化に適し得ることを当業者は認識しているであろう。好ましい例は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの最初の逆転写を組み込むことによって特定のｍＲＮＡ転写産物の正確な定量化に適するようにさせている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＵＳ４６８３１９５およびＵＳ４６８３２０２）への便利な改良を採用している。さらなる重要な改良によって、反応が進行する最中のリアルタイムでの蓄積ＰＣＲ産物の測定が可能になる。
【００５４】
多くの場合、関連する試料において（上記および表２に列挙された１つ以上の遺伝子を表す）標的分子の存在を示す能力があるプローブ分子を用いて被験体試料または対照試料における遺伝子発現の程度を評価することが好ましい可能性がある。
【００５５】
本発明の方法で用いるプローブは、調べることになっている遺伝子発現の（直接的または間接的な）産物を参照して選択することができる。適切なプローブの例として、適切な特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、および結合タンパク質または小分子が挙げられる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の方法に従って用いるのに適した好ましいプローブを構成する。適切なオリゴヌクレオチドプローブの作製は当業者に周知である（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４））。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは多数の会社から市販されている。
【００５７】
本発明の目的のために、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の型の化学結合を通して相補的配列の核酸標的分子へ特異的にハイブリダイズする能力があるオリゴヌクレオチドを含むように選ぶことができる。そのような結合は、通常は相補的塩基対形成を通して、水素結合形成を通して通常行うことができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブは、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでもよい。加えて、ホスホジエステル結合以外の結合を、このバリエーションがオリゴヌクレオチドプローブのその標的へのハイブリダイゼーションに干渉しない限り、オリゴヌクレオチドプローブ（複数可）中の塩基を連結するのに用いてもよい。したがって、本発明の方法に用いるのに適したオリゴヌクレオチドプローブは、構成物の塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合によって連結されているペプチド核酸であってもよい。
【００５８】
本明細書に用いられる場合、語句「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が（全ての細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなどの）複雑な混合物中に存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブのストリンジェントな条件下での優先的な特定の標的ヌクレオチド配列への結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズを指す。一実施形態において、プローブは特定の標的分子にのみ結合し、二本鎖形成し、またはハイブリダイズすることができる。
【００５９】
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイズが最小限であるような条件を指す。いくつかの実施形態において、プローブは、ストリンジェントな条件下でその標的以外の配列にハイブリダイズすることができない。ストリジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【００６０】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択することができる。Ｔｍは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの５０％が標的核酸に平衡状態でハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下における）である。標的核酸は一般的に、過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される。例として、ストリンジェントな条件は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成してもよい。
【００６１】
オリゴヌクレオチドプローブは、適切な代表試料において相補的核酸配列（すなわち、核酸標的）を検出するために用いることができる。そのような相補的結合は、オリゴヌクレオチドを、特定の遺伝子の発現を検出し、それによりそれらの比較を可能にするために用いることができる、たいていの技術の基礎を形成する。好ましいテクノロジーは、複数の遺伝子の発現の同時定量化を可能にし、それらには、定量的逆転写ＰＣＲテクノロジーなどの種（species）の増幅と定量化がリアルタイムに連動されているテクノロジー、ならびにアレイテクノロジーなどの増幅された種（species）の定量化を増幅後に行うテクロノジーが挙げられる。
【００６２】
アレイテクノロジーは、各プローブが開示された遺伝子に優先的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、被験体試料または対照試料内の遺伝子発現を表す試料のハイブリダイゼーションを含む。アレイテクノロジーは、例えば、それらの物理的な位置（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．によって商業的に提供されているような２次元アレイにおけるグリッド）、または別のフィーチャー（feature）（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＩｎｃまたはＬｕｍｉｎｅｘ Ｉｎｃによって商業的に提供されているような標識ビーズ）との結合によって、特定のオリゴヌクレオチド配列の一意的な同定を提供する。オリゴヌクレオチドアレイは、（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃによって商業的に提供されているような光照射合成によって）ｉｎ ｓｉｔｕで合成してもよいし、またはあらかじめ形成して、（ＡｇｉｌｅｎｔまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商業的に提供されているような）接触型テクノロジーもしくはインクジェットテクノロジーによってスポットしてもよい。（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に提供されているように）ｃＤＮＡ配列の全体または部分もまた、アレイテクノロジーのプローブとして機能し得ることは当業者にとって明らかであろう。
【００６３】
オリゴヌクレオチドプローブは、（例えば、遺伝子発現を表すｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ標的分子によって）遺伝子発現を検出および比較するために、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングなどのブロッティング技術に用いることができる。サザンブロッティングまたはノーザンブロッティング技術に用いるのに適した技術および試薬は当業者によく知られているであろう。簡単に述べると、ＤＮＡ（サザンブロッティングの場合）またはＲＮＡ（ノーザンブロッティングの場合）標的分子を含む試料が、アクリルアミドまたはアガロースなどの材料のゲルを浸透するそれらの能力に従って分離される。ゲルの浸透は、毛細管作用または電場の活性によって推進することができる。標的分子の分離が達成されたならば、これらの分子を、（例えば、ベーキングまたは紫外線照射によって）膜に固定化する前に薄膜（典型的にはナイロンまたはニトロセルロース）へ移動させる。その後、遺伝子発現を、膜に結合した標的分子へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって検出および比較することができる。
【００６４】
特定の状況において、遺伝子発現を比較するための伝統的なハイブリダイゼーションプロトコールの使用が問題となる可能性がある。例えば、ブロッティング技術は、おおよそ同じ分子量の２つ以上の遺伝子産物の間を区別することが難しい可能性があり、そのような大きさが同じような産物はゲルを用いて分離することが困難であるためである。したがって、そのような状況においては、下記の技術などの代替技術を用いて遺伝子発現を比較することが好ましい場合がある。
【００６５】
被験体における遺伝子発現を表す試料中の遺伝子発現は、高密度オリゴヌクレオチドアレイテクノロジーを用いて適切な核酸試料内の全体的な転写産物レベルに関して評価してもよい。そのようなテクノロジーは、オリゴヌクレオチドプローブが、例えば共有結合によって、固体支持体に繋ぎ止められているアレイを用いる。固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのこれらのアレイは、遺伝子発現の比較のための本発明の方法およびキットに用いる好ましい構成要素と言える。多数のそのようなプローブをこのように付着させて、上記および表２に列挙された遺伝子から選択された多数の遺伝子の発現の比較に適したアレイを提供することができる。したがって、上記および表２に列挙された各遺伝子群から選択された１つより多い遺伝子の発現を比較することが望ましい本発明の方法の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドアレイが特に好ましくあり得ることが認識されているであろう。
【００６６】
遺伝子発現を表す核酸標的の比較に用いることができる他の適切な方法として、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）；またはローリングサークルＤＮＡ増幅（ＲＣＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
プローブを容易に検出できるようにプローブを標識することが通常望ましい。本発明に従って用いるのに適したプローブまたは標的の標識化に用いることができる検出可能な部分の例として、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。適切な検出可能な部分として、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、および比色物質が挙げられる。これらの検出可能な部分は、反対であることが示されない限り、本発明の方法に用いることができる全ての型のプローブまたは標的における取込みに適している。
【００６８】
適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質などが挙げられる；発光物質の例として、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；適切な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、または３２Ｐが挙げられる；適切な比色物質の例として、コロイド金、または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。
【００６９】
そのような標識を検出する手段は当業者に周知である。例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができる；蛍光マーカーは、放射された光を検出する光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与え、酵素の基質への作用によって生じる反応生成物を検出することによって検出することができ、比色標識は、着色した標識を単純に可視化することによって検出される。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態において、蛍光標識プローブまたは標的を、レーザー共焦点スキャナを用いて、スキャンして蛍光検出してもよい。
【００７１】
標識核酸プローブまたは標的の場合、適切な標識化を行うのは、ハイブリダイゼーションの前でもハイブリダイゼーション中でもハイブリダイゼーションの後でもよい。好ましい実施形態において、本発明の方法に用いる核酸プローブまたは標的は、ハイブリダイゼーションの前に標識される。蛍光標識が特に好ましく、それが用いられる場合、核酸プローブのそれらの核酸標的へのハイブリダイゼーションの定量化は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量化による。定量化は、核酸に取り込まれたハプテンと結合する蛍光標識試薬からでもよい。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションの分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）などの適切な分析ソフトウェアを用いて達成することができる。
【００７３】
有効な定量化は、アレイの自動スキャニングを可能にする自動ステージを装着することができ、かつ蛍光強度情報の自動化された測定、記録、およびその後の処理のためのデータ収集システムを装備することができる蛍光顕微鏡を用いて達成してもよい。そのような自動化のための適切な配置は通常のことであり、当業者に周知である。
【００７４】
好ましい実施形態において、ハイブリダイズした核酸は、核酸に付着した１つ以上の検出可能な部分を検出することによって検出される。検出可能な部分は、当業者に周知のいくつかの手段のいずれかによって取り込むことができる。しかしながら、好ましい実施形態において、そのような部分は、試料核酸（プローブまたは標的）の調製における増幅工程中に同時に取り込まれる。したがって、例えば、検出可能な部分で標識されたプライマーまたはヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記部分で標識された増幅産物が供給されるであろう。好ましい実施形態において、蛍光標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いる転写増幅は、転写された核酸へ標識を組み込む。
【００７５】
あるいは、適切な検出可能な部分は、もとの核酸試料（例えば、目的とする組織由来のｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に、またはもとの核酸の増幅が完了した後の増幅産物に直接付加してもよい。蛍光標識などの標識を核酸に付着させる手段は当業者によく知られており、例えば、ニックトランスレーション、または核酸のリン酸化（kinasing）、続いての、試料核酸に（適切なフルオロフォアなどの）標識を連結する核酸リンカーの付着（ライゲーション）による（例えば、標識ＲＮＡでの）末端標識が挙げられる。
【００７６】
本発明の第１の態様の方法はヒト被験体に関連して用いるのに最も適しているが、それはまた、非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ、ネコ）においてウイルス感染の治療コースを決定するのにも有用であり得ることは理解されているであろう。
【００７７】
本発明の別の方法は、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法を含み、その方法は
（ａ）下記の表３に列挙された遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む。
【００７８】
本方法の一実施形態において、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示している。
【００７９】
本方法の別の実施形態において、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示している。
【００８０】
本発明のこの態様を実施するために用いる技術は、本発明の第１の態様に関連して上記に提供されている。特定の遺伝子は異なるが、当業者は、この方法に従って評価されるべき標的分子を同定することも、用いることができる特異的結合作用物質を同定することも理解し、それを行うことができるであろう。
【００８１】
本発明者らは、ＩＦＮ処置に良く応答する感染被験体と応答しない感染被験体との違いを調べる研究を拡大し、ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達を調査した。
【００８２】
ＩＦＮはインターフェロン受容体に結合し、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化する。この活性化における中心的事象は、ＳＴＡＴ１のリン酸化である。本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂで処置された場合、たいていの被験体において、ＳＴＡＴ１リン酸化が誘導されることを見出した。しかしながら、ＳＴＡＴ１リン酸化と、抗ウイルス治療における被験体のＩＦＮ処置に対する応答性との間に相関はないように思われた。しかしながら、本発明者らは、試料内を調べると、ＳＴＡＴ１の位置に関して応答者と非応答者に違いがあることを見出して驚いた。ＳＴＡＴ１は、核へ移行し、ＩＳＧのプロモーター内の特定の応答エレメントに二量体として結合することが知られている。全ての急速応答型被験体は、ｐｅｇＩＦＮα２ｂでの処置後、ＳＴＡＴ１位置にＩＦＮ誘導性シフトを生じた。対照的に、非応答型被験体（すなわち、事前に活性化されたＩＦＮシグナル伝達を有する被験体）は、検出可能なＳＴＡＴ１シフトを生じなかった；むしろ、肝細胞の大部分はすでにかなりの核染色を有した。
【００８３】
したがって、本発明の第２の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法が提供され、その方法は、被験体由来の試料を調べて、ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定する工程を含む。
【００８４】
添付の実施例に示されているように、本発明者らは、肝臓細胞におけるＳＴＡＴ１の位置が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対する被験体の応答性についての予後マーカーであることを決定している。そのデータにおいて、非ＲＶＲ被験体（すなわち、抗ウイルス治療に対して非応答者）から採取された肝臓試料中の肝細胞の大部分が、抗ウイルス治療の前にすでにＳＴＡＴ１のかなりの核染色を有したのに対して、ＲＶＲ被験体由来の肝臓試料中の肝細胞は最小の核染色を有するだけであることが示されている。この全く予想されなかった知見は、当技術分野において開示も示唆もされていない。
【００８５】
したがって、肝臓試料中の肝細胞の大部分がＳＴＡＴ１についての核染色を有する場合には、その被験体は、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して非応答性である可能性が高い。逆に、肝臓試料中の最小数の肝細胞がＳＴＡＴ１についての核染色を有する場合には、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高い。
【００８６】
いくつかの実施形態において、試料は肝臓試料である。またいくつかの実施形態において、方法は、肝細胞におけるＳＴＡＴ１の細胞内位置を調べる。
【００８７】
肝臓試料においてＳＴＡＴ１タンパク質の位置を決定するための方法は当技術分野において日常的である。そのような方法の例は、市販されている抗ＳＴＡＴ抗体または他の特異的結合実体を用いる標準免疫組織化学法である。添付された実施例は、肝臓試料においてＳＴＡＴ１タンパク質の位置を決定するための詳細な方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法において調べられるＳＴＡＴ１タンパク質は、リン酸化ＳＴＡＴ１である。
【００８８】
「被験体」とは、本発明の第１の態様に関して上記で定義された被験体を含む。いくつかの実施形態において、被験体はヒトである。
【００８９】
上記で示されているように、本発明は、ｐｅｇＩＦＮαでの治療前および治療中に慢性肝炎を有する患者の肝臓生検と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のペア試料において本発明者らがＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた研究に基づいている；これは添付された実施例でより詳細に記載されている。
【００９０】
本発明者らは、内因性ＩＦＮ系が多くの感染患者において常に活性化されていることを明らかにした。さらに、本発明者らは、事前に活性化されたＩＦＮ系を有する患者をＩＦＮ治療に対する不良応答と相関づけて驚いた。この知見は、直観と相容れないことであり、なぜなら、能動先天免疫系はＩＦＮα治療中にウイルスを排除するように助けると予想されるからである。
【００９１】
本発明者らは、肝臓生検においてＩＳＧ発現を分析し、ＨＣＶが驚くべきことに内因性ＩＦＮ系を誘導する（遮断しない）患者もあれば、ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導しない（ＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆを切断することによる可能性がある）患者もあるのだが、この違いが慢性感染を維持するＨＣＶの能力に全く影響を及ぼさないことをさらに結論づけた。
【００９２】
ＩＦＮ系を事前に活性化しない患者において、本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂが４時間以内に肝臓において多くのＩＳＧのロバストな（亜）最大上方制御（robust (sub-) maximal up-regulation）を誘導することを見出した。驚くべきことに、そのような高ＩＳＧ発現レベルは、後になって４週間目で急速ウイルス陰性化を示さない患者の処置前生検にすでに存在していた。
【００９３】
内因性ＩＦＮ系の事前活性化は、ＨＣＶ遺伝子型１（および４）に感染した患者の肝臓生検において、遺伝子型２または３に感染した患者のものよりも頻繁に見られることも見出した。これは興味そそることであり、なぜなら、遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１を有する患者の５０％未満と比較して、患者の８０％を超えて治癒し得ることはよく知られているからである。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度がＨＣＶ遺伝子型に依存するという本発明者らの知見によって、ＨＣＶ遺伝子型の異なる処置感受性について説明がつく。
【００９４】
本発明者らは、これらのデータから、ＨＣＶがＩＦＮシグナル伝達に干渉し、それによって治療に対する応答を障害することが明らかにされることを理解した。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害は、なぜ内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化がＨＣＶの自発的排除をもたらさないのかを説明している。本発明者らはいかなる仮説によっても縛られるつもりはないが、ＩＦＮαがＨＣＶに感染している肝細胞において抗ウイルス状態を誘導しないことをこれが意味すると考える。多くの患者の肝臓で観察されるＩＳＧの上方制御は、その後、非感染肝細胞においてのみ起こるであろう。肝臓生検に見出されるＩＳＧの強い誘導は、そのようなモデルと矛盾せず、なぜなら、感染肝細胞より非感染肝細胞が多くあるからである。ＩＦＮβ産生は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦの切断に成功していないウイルスに感染した肝細胞に生じるであろう。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導性阻害のため、分泌されたＩＦＮβは、これらの感染した肝細胞において抗ウイルス状態を誘導せずに、感染していない隣接細胞においてのみ誘導するであろう。
【００９５】
本発明者らは、ＨＣＶと免疫系との間の相互作用の新しい理解は、ＨＣＶ感染などのウイルス感染についての処置レジメンの計画および選択に大いに関連性があることを理解した。したがって、ウイルス感染を処置する新規な手段を提供することが本発明の特定の実施形態の目的である。
【００９６】
本発明の第３の態様によれば、肝臓のウイルス感染の予防または処置のためのＩＦＮ系の活性化を低下させる作用物質の使用が提供される。
【００９７】
本発明の第４の態様によれば、肝臓のウイルス感染の予防または処置のための薬物の製造におけるＩＦＮ系の活性化を低下させる作用物質が提供される。
【００９８】
上記および実施例で説明したように、本発明者らは、ウイルス感染を有する一部の被験体がＩＦＮ系の活性化（および関連したＩＳＧの上方制御）を生じ、これがその後のＩＦＮでの抗ウイルス治療に対する不良応答に関連していると理解している。これは、そのような事前活性化を防ぐ、本発明の第３または第４の態様による作用物質が、ＩＦＮ経路の活性を低下させるのに有用であり、かつＩＦＮを利用するその後の抗ウイルス治療に対してより良く応答するように被験体を有効に「プライム」することの理解へと導く。当業者は被験体におけるＩＦＮ活性の増加がより良いウイルス排除(viral clearance)と関連しており、処置に対して応答が悪い被験体の一部とは関連していないと予想したであろうから、本発明者らはこれらの相関づけを行って驚いた。
【００９９】
したがって、本発明の第３または第４の態様に従って用いられる作用物質を、（非感染対照の被験体と比較して）ＩＦＮ系の活性化の増加も生じているウイルス感染を有する被験体を処置するために用いることが好ましい。
【０１００】
「低下させる」とは、ＩＳＧの発現レベルが対照組織における発現レベルと有意には異ならないようにＩＳＧの刺激を低下させるのに作用物質が有効であることを意味する。
【０１０１】
作用物質は、Ｂ型肝炎ウイルス感染およびＣ型肝炎ウイルス感染を含む、肝臓のいくつかの異なるウイルス感染の処置に用いることができる。作用物質は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防し、または低下させるために用いられることが最も好ましい。
【０１０２】
本発明に従って用いることができる作用物質の例として、作用物質がＩＦＮαポリペプチドに結合し、ＩＦＮ機能活性を阻止することができる場合、例えば、抗体ならびにそれらの断片および誘導体（例えば、ドメイン抗体またはＦａｂ）が挙げられる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮα受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２ａ、ＩＦＮＡＲ２ｂ、またはＩＦＮＡＲ２ｃ）においてアンタゴニストとして作用することによってＩＦＮ系に対する競合的阻害剤として作用することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮ経路における酵素または他の分子を阻害することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮαポリペプチドをコードするｍＲＮＡへ、そのｍＲＮＡの減少、およびそれに従って、ＩＦＮαポリペプチドの減少をもたらすような様式で結合することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮαをコードする核酸配列へ、それがＩＦＮαポリペプチドをコードする転写されるｍＲＮＡの量の低下をもたらすような様式で結合することができる。例えば、作用物質は、ＩＦＮα遺伝子のコード領域もしくは非コード領域へ、またはＩＦＮのＤＮＡ５’もしくは３’へ結合し、それによってそのタンパク質の発現を低下させることができる。
【０１０３】
本発明の第３または第４の態様の作用物質が、ＩＦＮαポリペプチド、ＩＦＮα受容体、またはＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸に結合することが好ましい。
【０１０４】
いくつかの異なるヒトインターフェロンαポリペプチド配列がある。これらの配列のアラインメントは図８に示されている。このアラインメントから、以下のコンセンサス配列が決定されている。この情報を当業者が用いてＩＦＮαポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１０５】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドに結合する場合、作用物質が、天然型へと正しく折り畳まれているタンパク質によって規定されるエピトープに結合することが好ましい。種間およびまた遺伝子型間にいくつかの配列変動性があり得ることは認識されているであろう。したがって、他の好ましいエピトープは、遺伝子の変異体由来の等価の領域を含む。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の等価の領域は、上記の本発明の第１の態様に概要を示しているように、配列類似性と同一性のツール、およびデータベース検索方法を用いて同定することができる。
【０１０６】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドの保存領域またはその断片に結合することが最も好ましい。図８におけるＩＦＮαポリペプチド配列のアラインメントからわかるように、異なるポリペプチド間で保存されているいくつかのアミノ酸配列領域がある。そのような保存領域の例は、その図に示された「コンセンサス」配列の位置１６１〜１７４であると考えられる。
【０１０７】
そのような領域に結合する作用物質は、ＩＦＮα活性に特に劇的な効果を生じ、それゆえにＩＦＮ系の事前活性化を阻止し、それによって抗ウイルス治療を受ける被験体からのＨＣＶの排除を向上させるのに特に効果がある。
【０１０８】
作用物質がＩＦＮ受容体に結合する場合、作用物質がＩＦＮ受容体に結合し、ＩＦＮαのＩＦＮ受容体への結合を阻害することが好ましい。
【０１０９】
いくつかの異なるインターフェロン受容体がある。これらのアミノ酸配列は図９に示されている。この情報を当業者が用いて、ＩＦＮ受容体ポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１１０】
作用物質が、天然型へと正しく折り畳まれているＩＦＮ受容体タンパク質によって規定される受容体上のエピトープに結合することが好ましい。種間およびまた遺伝子型間にいくつかの配列変動性があり得ることは認識されているであろう。したがって、他の好ましいエピトープは、受容体遺伝子の変異体由来の等価の領域を含む。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の等価の領域は、上記の本発明の第１の態様に概要を示しているように、配列類似性と同一性のツール、およびデータベース検索方法を用いて同定することができる。
【０１１１】
本発明の第３または第４の態様の実施形態において、作用物質は抗体またはその断片である。
【０１１２】
ポリペプチド活性を調節するための作用物質としての抗体の使用はよく知られている。実際に、抗体に基づいた治療剤は、ますます薬に用いられつつある。上記で示したように、本発明者らは、抗体を用いて、ＩＦＮ系をそれに結合することによって中和することができ、またはＩＦＮ受容体の阻害剤として作用することができることを理解した。したがって、そのような作用物質が、ＨＣＶ感染の処置を向上させるための薬剤として大きな有用性があることは明らかである。さらに、そのような抗体は、上記の本発明のさらなる態様に示された予後的方法に用いることができる。
【０１１３】
ヒト被験体を処置するのに用いる抗体は、
（ａ）ＩＦＮαポリペプチドそれ自体もしくはＩＦＮαポリペプチド由来のいくつかのペプチド、またはＩＦＮαポリペプチドに見出されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチド；または
（ｂ）ＩＦＮ受容体もしくはＩＦＮ受容体由来のいくつかのペプチド、またはＩＦＮ受容体に見出されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチド
に対して産生することができる。
【０１１４】
抗体は、ヒトＩＦＮαポリペプチド、ヒトＩＦＮ受容体、ならびにそれらのペプチド誘導体および断片由来の抗原構造に対して産生されることが好ましい。
【０１１５】
抗体は、抗原を動物へ注入することによってポリクローナル血清として産生してもよい。好ましいポリクローナル抗体は、当技術分野に公知の技術を用いて動物（例えば、ウサギ）に抗原（ＩＦＮαポリペプチドの全部または断片）を接種することによって産生することができる。
【０１１６】
あるいは、抗体は、モノクローナルであってもよい。通常のハイブリドーマ技術は、そのような抗体を産生するために用いることができる。本発明に用いるモノクローナル抗体を作製するために用いられる抗原は、ポリクローナル血清を作製するために用いられるのと同じであってもよい。
【０１１７】
最も単純な形において、抗体または免疫グロブリンタンパク質は、γ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）クラスの抗体によって通常例示されるＹ形分子である。分子は、それぞれ約５０ｋＤと２５ｋＤの２つの同一の重（Ｈ）鎖と２つの同一の軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖からなる。各軽鎖は、ジスルフィド結合および非共有結合によって重鎖に結合している（Ｈ−Ｌ）。２つの同一のＨ−Ｌ鎖組合せは、２つのＨ鎖間の同様の非共有結合およびジスルフィド結合によってお互いに連結され、基本的な４つの鎖の免疫グロブリン構造（Ｈ−Ｌ）２を形成している。
【０１１８】
軽鎖免疫グロブリンは、１つのＶドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成され、一方、重鎖は、１つのＶドメイン、およびＨ鎖アイソタイプに依存して、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）からなる。
【０１１９】
各軽鎖または重鎖のＮ末端領域には、配列の点で大きく異なり、かつ抗原への特異的結合に関与する可変（Ｖ）ドメインがある。抗原についての抗体特異性は、実際には、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られたＶ領域内のアミノ酸配列によって決定される。各Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域は、３つのそのようなＣＤＲを有し、抗体の抗原結合部位を形成するのが、全６つの組合せである。あまり変異を示さず、かつ超可変ループを支える残りのＶ領域アミノ酸は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【０１２０】
可変ドメインを超えた領域（Ｃドメイン）は、配列の点では比較的不変である。本発明による抗体の特徴的なフィーチャー（characterising feature）は、ＶＨおよびＶＬのドメインであることが認識されているであろう。ＣＨドメインおよびＣＬドメインの正確な性質は、全体的に見ると、本発明にとって重大な意味をもたないことがさらに認識されているであろう。実際、本発明に用いる好ましい抗体は、非常に異なるＣＨドメインおよびＣＬドメインを有してもよい。さらに、下記でより十分に論じているように、好ましい抗体機能性誘導体は、Ｃドメインなしで可変ドメインを含んでもよい（例えば、ｓｃＦｖ抗体）。
【０１２１】
本発明の第３または第４の態様による作用物質であると考えられる好ましい抗体は、ＶＬドメイン（第１ドメイン）およびＶＨドメイン（第２ドメイン）を有してもよい。それらの誘導体は、７５％配列同一性、例えば、９０％配列同一性、または少なくとも９５％配列同一性を有し得る。ほとんどの配列変異はフレームワーク領域（ＦＲ）に生じてもよいが、抗体およびそれらの機能性誘導体のＣＤＲの配列はほとんど保存されているべきである。
【０１２２】
本発明の第３または第４の態様の作用物質のいくつかの好ましい実施形態は、可変ドメインと定常ドメインの両方を有する分子に関する。しかしながら、本質的に、少しの定常領域も含まず、抗体の可変領域を含む抗体断片（例えば、ｓｃＦＶ抗体またはＦＡｂ）もまた、本発明に包含されることが認識される。
【０１２３】
本発明の第３または第４の態様の作用物質であると考えられるｓｃＦＶ抗体断片は、ＩＦＮポリペプチドに対して産生された抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインの全体を含んでもよい。ＶＨドメインとＶＬドメインは、適切なリンカーペプチドによって分離していてもよい。
【０１２４】
１つの種において作製された抗体、特にｍＡｂは、異なる種を処置するのに用いられる場合、いくつかの重篤な欠点を有することが知られている。例えば、マウス抗体がヒトに用いられる場合、それらは、血清中循環半減期が短い傾向にあり、処置されることになっている患者の免疫系によって外来タンパク質として認識され得る。これは、望ましくないヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の発生を引き起こす可能性がある。これは、抗体の頻繁な投与が必要とされる場合、それが抗体の排除を促進し、その治療効果を遮断し、過敏症反応を誘発し得るため、特に問題となる。これらの因子は、ヒト治療におけるマウスモノクローナル抗体の使用を制限し、ヒト化抗体を作製する抗体操作テクノロジーの開発を促している。
【０１２５】
それゆえに、ＩＦＮ活性を低下させる能力がある抗体が、ヒト被験体においてＨＣＶ感染を処置するための治療剤として用いられることになっている場合、非ヒト源の抗体およびそれらの断片はヒト化されることが好ましい。
【０１２６】
ヒト化は、（例えば、非ヒトハイブリドーマで作製されたモノクローナル抗体由来の）Ｖ領域配列をヒト抗体由来のＣ領域（および理想的には、Ｖ領域由来のＦＲ）配列とスプライシングすることによって達成することができる。その結果として生じた「操作された」抗体は、それらが由来している非ヒト抗体よりもヒトにおいて免疫原性が少なく、それゆえ、臨床用途により良く適している。
【０１２７】
ヒト化抗体は、組換えＤＮＡテクロノジーを用いて齧歯類免疫グロブリン定常領域がヒト抗体の定常領域に置き換えられているキメラモノクローナル抗体であってもよい。その後、キメラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子は、適切な制御エレメントを含む発現ベクターへクローン化し、完全にグリコシル化された抗体を産生するために哺乳類細胞へ導入することができる。このプロセスのために適切なヒトＨ鎖Ｃ領域遺伝子を選択することによって、抗体の生物活性をあらかじめ決定することができる。そのようなキメラ抗体は、本発明に従って癌を処置または予防するために用いることができる。
【０１２８】
抗体のさらなるヒト化は、抗体のＣＤＲグラフトまたは再形成（reshaping）を含めてもよい。そのような抗体は、（抗体の抗原結合部位を形成する）非ヒト抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲをヒト抗体の対応するフレームワーク領域へ移植することによって作製される。
【０１２９】
ヒト化抗体断片は、本発明に従って用いる好ましい作用物質と言える。ＩＦＮαポリペプチドまたはＩＦＮ受容体上のエピトープを認識するヒトＦＡｂは、可変鎖ヒト抗体のファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。（例えば、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓまたはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されたような）当技術分野に公知の技術を用いて、本発明による作用物質として用いることができるＦａｂを作製することができる。簡単に述べると、ヒトコンビナトリアルＦａｂ抗体ライブラリーは、一本鎖Ｆｖライブラリー由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をＦａｂディスプレイベクターへ移入することによって作製することができる。このライブラリーは、２．１×１０１０個の異なる抗体断片を生じ得る。その後、ペプチドは、所望の結合性質を有する抗体断片をライブラリーから同定するための「ベイト（bait）」として用いることができる。
【０１３０】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、本発明のこの実施形態に従って用いることができるもう１つの好ましい作用物質と言える。ｄＡｂは、抗体の最小の機能性結合単位であり、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に対応する。そのようなｄＡｂは、約１３ｋＤａ（完全抗体のサイズの約１／１０（またはそれ未満）に相当）の分子量を有し得る。
【０１３１】
本発明の第３および第４の態様の別の実施形態によれば、ペプチドはＩＦＮαポリペプチド活性を低下させるために用いることができる。そのようなペプチドは、本発明に従って用いる他の好ましい作用物質と言える。これらのペプチドは、例えば、ペプチドのライブラリーから、ライブラリーのどのメンバーがＩＦＮαポリペプチドの活性または発現を低下させることができるかを同定することによって単離することができる。適切なライブラリーは、ファージディスプレイ技術を用いて作製することができる。
【０１３２】
アプタマーは、本発明の第３または第４の態様のもう１つの好ましい作用物質と言える。アプタマーは、特定の配列依存的形をとり、アプタマーとリガンドの間の鍵と鍵穴の適合に基づいた特異的な標的リガンドに結合する核酸分子である。典型的には、アプタマーは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）のいずれかを含み得る。アプタマーは、核酸標的および非核酸標的のどちらと結合するのにも用いることができる。したがって、ＩＦＮαを認識し、その活性または発現を低下させるアプタマーを作製することができる。適切なアプタマーは、ランダム配列プールから選択してもよく、そこから、選択された標的分子に高親和性で結合する特異的なアプタマーを同定することができる。
【０１３３】
所望の特異性を有するアプタマーの作製および選択のための方法は、当業者によく知られており、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮（exponential enrichment）によるリガンドの系統的進化法（systematic evolution））プロセスが挙げられる。簡単に述べると、オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の反復プロセスによって大量の機能性核酸の単離、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を可能にする。
【０１３４】
アンチセンス分子は、本発明の第３または第４の態様に従って用いるもう１つの好ましい作用物質と言える。アンチセンス分子は、典型的には、一本鎖核酸であり、遺伝子によって産生された相補的核酸配列に特異的に結合し、それを不活性化し、有効にその遺伝子を「オフ」にすることができる。当業者は認識していることであるが、その分子は、それが、「センス」配列と呼ばれる遺伝子のｍＲＮＡに相補的であるため、「アンチセンス」と名付けられている。アンチセンス分子は、典型的には、長さが１５〜３５塩基のＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的類似体である。アンチセンス核酸は、特定の遺伝子のｍＲＮＡに結合し、その発現を阻止するために実験的に用いられている。これは、癌、糖尿病、および炎症性疾患の処置のための薬物として「アンチセンス治療」の開発に繋がっている。アンチセンス薬物は、ヒト治療的使用としてＵＳ ＦＤＡによって最近、認可された。したがって、ＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子を設計することによって、細胞におけるＩＦＮαポリペプチドの発現を低下させ、それによって、ＩＦＮα活性を低下させ、ＨＣＶ感染に見られる事前活性化を低下させることが可能であろう。ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、図８に提供されている。
【０１３５】
ときに短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られている、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明の第３または第４の態様に従って用いるさらなる好ましい作用物質と言える。上記で示されているように、本発明者らは、ＩＦＮ系の事前活性化が抗ウイルス治療に対する抵抗性と関連していることを理解した。したがって、ＩＦＮα発現を低下させることができるｓｉＲＮＡ分子は、ＨＣＶ感染の処置のための薬剤の調製において大きな有用性があることは明らかである。２０〜２５ヌクレオチド長クラスのＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路（ＲＮＡｉ）に関与し、それによって、ｓｉＲＮＡは特定の遺伝子の発現の低下を引き起こすことができ、または具体的には、そのようなｍＲＮＡの翻訳に干渉し、それによって、そのｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の発現を阻害することができる。ｓｉＲＮＡは、いずれかの末端上に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する短い（通常、２１ヌクレオチド）二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）という、詳細に明らかにされた構造を有する。各鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでこの構造は、長いｄｓＲＮＡかまたはヘアピンＲＮＡのいずれかをｓｉＲＮＡへ変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡはまた、様々なトランスフェクション方法によって外因的に（人為的に）細胞に導入し、目的とする遺伝子の特異的ノックダウンを引き起こすことができる。本質的に、配列が知られているいかなる遺伝子もこのように、適切に合わせて作製されたｓｉＲＮＡ（tailored siRNA）との配列相補性に基づいて標的にすることができる。目的とする本質的にいかなる遺伝子もノックダウンする能力を考えると、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、基本生物学および応用生物学の両方において大きな関心を生み出している。様々な生物学的経路における重要な遺伝子を同定するように設計される大規模ＲＮＡｉスクリーニングの数が増加している。疾患プロセスもまた多数の遺伝子の活性に依存しているため、いくつかの状況において、遺伝子の活性をｓｉＲＮＡでオフにすることは治療的利益を生じ得ることは予想される。したがって、それらの知見は、生物医学研究および薬物開発のためにＲＮＡｉを利用することへの関心の高まりを引き起こしている。治療的ＲＮＡｉ治験の最近の第Ｉ相の結果により、ｓｉＲＮＡが耐容性が良く、かつ適切な薬物動態学的性質を有することが実証されている。したがって、ｓｉＲＮＡおよび関連のＲＮＡｉ導入方法は、予見できる将来において重要な新しいクラスの薬物になりそうな気配である。ＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸へと設計されたｓｉＲＮＡ分子は、ＩＦＮαの発現を低下させ、それに従って、ＩＦＮ系の事前活性化の低下をもたらすために用いることができる。したがって、本発明のこの態様の実施形態において、作用物質はＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補的配列を有するｓｉＲＮＡ分子である。
【０１３６】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は図８に提供されている。
【０１３７】
そのような情報を用いて、ＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補的配列を有するｓｉＲＮＡ分子を設計することは、単純で、かつ十分当業者が対応できる範囲内である。例えば、簡単なインターネット検索によって、ｓｉＲＮＡ分子を設計するために用いることができる多数のウェブサイトが得られる。
【０１３８】
「ｓｉＲＮＡ分子」とは、ｓｉＲＮＡ分子を構成するその２つの一本鎖ＲＮＡのそれぞれに加えて、二本鎖の２０〜２５ヌクレオチド長ＲＮＡ分子も含む。
【０１３９】
ｓｉＲＮＡはヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形で用いられることが最も好ましい。そのようなｓｈＲＮＡは、（例えば、約９ヌクレオチドの）スペーサー配列によって連結される２つの相補的ｓｉＲＮＡ分子を含み得る。相補的ｓｉＲＮＡ分子は、それらが共に結合するように折り畳み得る。
【０１４０】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを切断する能力があるリボザイムは、本発明の第３または第４の態様のもう１つの好ましい作用物質と言える。
【０１４１】
本発明の第３または第４の態様の作用物質は、処置されることになっている被験体においてＩＦＮ系の活性化を低下させることができるが、被験体に与えられたその後の抗ウイルス治療の活性を低下させることはできないことが好ましい。
【０１４２】
例えば、本発明の第３または第４の態様の作用物質が抗体またはその断片である場合、作用物質は、内因性ＩＦＮαポリペプチドと結合し、その活性を低下させることができるが、外因的に供給されたＩＦＮαポリペプチドについてはできないことが好ましい。当技術分野において日常的な方法、および本発明のこの態様においてあらかじめ提供される情報を用いて、そのような抗体を得ることは可能である。
【０１４３】
本発明により必要とされる作用物質の量は、生物活性および生物学的利用率によって決定され、それらがまた投与様式および作用物質の物理化学的性質に依存している。投与頻度もまた、上記の因子、および特に、標的組織または処置されることになっている被験体内での作用物質の半減期によって影響されるであろう。
【０１４４】
製薬産業に通常利用されるものなどの公知の手順（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）を用いて、作用物質の特定の製剤および正確な（１日用量および投与頻度などの）治療レジメンを確立することができる。
【０１４５】
一般的に、作用物質の０．０１μｇ／ｋｇ体重〜０．１ｇ／ｋｇ体重の１日用量が、ＨＣＶ感染を処置するための処置レジメンに用いることができる；例えば、１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４６】
例として、本発明による抗体の適切な用量は、１０μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、いくつかの実施形態においては、約６ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４７】
１日用量は単回投与（例えば、単回の連日注射または吸入器からの単一用量）として与えてもよい。あるいは、作用物質（例えば、抗体またはアプタマー）は１日に２回またはそれ以上の回数での投与を必要とする場合もある。
【０１４８】
本発明による薬剤は、治療有効量の作用物質および医薬的に許容されるビヒクルを含むべきである。
【０１４９】
「治療有効量」は、被験体に投与された場合、癌の増殖または転移を阻害または予防する、本発明による作用物質の任意の量である。
【０１５０】
「被験体」は、脊椎動物、哺乳動物、家畜、またはヒトであってもよい。処置されることになっている被験体はヒトであることが好ましい。この場合、作用物質は、ヒト治療に最も適しているように設計してもよい（例えば、上記で論じられているように、抗体のヒト化）。しかしながら、獣医学で目的とする他の動物（例えば、ウマ、イヌ、またはネコ）を処置するために作用物質を用いてもよいことは理解され得ることであろう。
【０１５１】
本明細書で言及される場合、「医薬的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物を製剤化するのに有用であるとして当業者に知られている任意の生理学的ビヒクルである。
【０１５２】
一実施形態において、薬剤は、約０．０１μｇ〜０．５ｇの作用物質を含んでもよい。組成物における作用物質の量は、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、または約１ｍｇ〜１０ｍｇであり得る。したがって、組成物は、約２ｍｇ〜５ｍｇの作用物質を含み得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）の作用物質、いくつかの実施形態においては、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）を含む。組成物の残りの部分はビヒクルを含んでもよい。
【０１５４】
核酸作用物質は、リポソーム内への取込みによって被験体に送達することができる。あるいは、「裸の」ＤＮＡ分子を、適切な手段、例えば、直接的エンドサイトーシス摂取によって被験体の細胞へ挿入してもよい。核酸分子は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合、または弾道的衝撃（ballistic bombardment）によって、処置されることになっている被験体の細胞へ導入することができる。例えば、導入(transfer)は、コーティングされた金粒子での弾道的トランスフェクション、ＤＮＡ分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）、およびＤＮＡ分子の標的組織へ直接の局所適用または注射による直接的ＤＮＡ摂取（例えば、エンドサイトーシス）を提供する手段によることができる。
【０１５５】
抗体またはその機能性誘導体はいくつかの方法で用いることができる。例えば、全身投与が必要とされる場合、抗体またはその誘導体は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形で経口で摂取することができる組成物内に含めることができる。抗体またはその誘導体が、血流への注射によって投与されることが好ましい。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）であってもよい。あるいは、抗体は肝臓へ直接、注射してもよい。
【０１５６】
核酸またはポリペプチドの治療用実体は、特に、組成物が用いられることになっている様式に依存する、いくつかの異なる形を有する医薬組成物中で組み合わせてもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチ、リポソームの形、またはヒトもしくは動物に投与することができる任意の他の適切な形をとることができる。本発明の組成物のビヒクルは、それが与えられる被験体によって十分許容され、かつ標的の細胞、組織、または器官への治療用物質の送達を可能にすることができるものであるべきことは認識されているであろう。
【０１５７】
好ましい実施形態において、医薬的ビヒクルは液体であり、医薬組成物は溶液の形をとる。別の実施形態において、医薬的ビヒクルはゲルであり、組成物はクリームなどの形をとる。
【０１５８】
そのような治療用実体を含む組成物はいくつかの方法で用いることができる。例えば、全身投与が必要とされる場合、実体は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形で経口で摂取することができる組成物内に含めることができる。あるいは、組成物は、血流への注射によって投与することができる。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）であってもよい。実体は吸入によって（例えば、鼻腔内に）投与してもよい。
【０１５９】
治療用実体はまた、徐放性または遅延放出性デバイス内に組み込んでもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、化合物は、数週間またはさらに数カ月間かけて放出され得る。そのようなデバイスは、実体での長期間処置が必要とされ、かつそれが通常、頻回の投与（例えば、少なくとも連日注射）を必要とするだろう場合、特に有利であり得る。
【０１６０】
本発明の第１の態様の作用物質は、ＩＦＮ（例えば、ｐｅｇＩＦＮ）およびリバビリンなどの抗ウイルス剤を用いる抗ウイルス治療での処置を受けようとしている患者を前処置するのに特に有用である。それゆえに、作用物質はウイルス感染した個体にＩＦＮおよびリバビリンでの治療が開始される前に投与することが好ましい。
【０１６１】
本発明の第３および第４の態様に関して定義された作用物質での前処置と抗ウイルス治療との間の時間の長さは、用いられる作用物質に依存し得る。例えば、作用物質が処置されることになっている被験体におけるＩＦＮ系の活性化を低下させることができるが、被験体に与えられるその後の抗ウイルス治療の活性を低下させることはできない場合、時間の長さは、非常に短くあり得る。例えば、被験体は、同時に、または併用処置レジメンでも処置することができる。
【０１６２】
作用物質を区別していない（not distinguishing）場合には、時間の長さは作用物質の性質に依存し得る。例えば、外因的に供給された抗体は、ヒト身体から排除されるために約４〜６週間かかることが知られている。したがって、作用物質がＩＦＮαポリペプチドもしくは受容体、またはＩＦＮ系の他のそのようなメンバーに対する抗体である場合、その後の抗ウイルス治療は、患者に４〜６週間後、例えば、少なくとも６週間後、供給することができる。
【０１６３】
技術者が本発明の第１の態様の方法を実施するために必要とされる様々な要素は、キットの中へ組み込んでもよい。
【０１６４】
したがって、本発明の第５の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するためのキットであって、
（ｉ）上記に列挙され、および表２に示された各遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段と、任意で
（ｉｉ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段と
を含むキットが提供される。
【０１６５】
「上記に列挙され、および表２に示された各遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段」とは、試料における遺伝子発現を表す分子を標的にすることができる、本発明の第１の態様において示した特異的結合分子を含む。いくつかの実施形態において、特異的結合分子はオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、または上記で述べた結合タンパク質もしくは小分子である。
【０１６６】
「試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段」とは、上記の本発明の第１の態様において述べた対照試料を含める。そこに述べられた対照参照データも含む。
【０１６７】
本発明の第５の態様のキットはまた、
（ｉｉｉ）前記遺伝子の発現を分析するための適切な緩衝液および試薬
を含んでもよい。
【０１６８】
キットで提供される緩衝液および試薬は、液体の形をとってもよく、いくつかの実施形態において、あらかじめ測定されたアリコートとして提供されてもよい。あるいは、緩衝液および試薬は、希釈のために濃縮された形（またはさらに粉末の形）でもよい。
【０１６９】
技術者が本発明の第２の態様の方法を実施するのに必要とされる様々な要素はキットへと組み込んでもよい。
【０１７０】
したがって、本発明の第６の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン活性（ＩＦＮ）の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するためのキットであって、被験体由来の試料を調べてＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための手段を含むキットが提供される。
【０１７１】
「被験体由来の試料を調べてＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための手段」とは、ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定することができる、本発明の第２の態様において示した特異的結合分子を含む。いくつかの実施形態において、前記特異的結合分子は、抗ＳＴＡＴ抗体；いくつかの実施形態において、抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体である。
【０１７２】
本発明の第６の態様のキットはまた、
（ｉｉｉ）ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための適切な緩衝液および試薬
を含む。
【０１７３】
キットで提供される緩衝液および試薬は、液体の形をとってもよく、いくつかの実施形態において、あらかじめ測定されたアリコートとして提供されてもよい。あるいは、緩衝液および試薬は、希釈のために濃縮された形（またはさらに粉末の形）でもよい。
【０１７４】
（任意の添付された特許請求の範囲、要約、および図面を含む）本明細書に記載された特徴の全ておよび／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互排他的である組合せを除き、上記態様のいずれとも任意の組合せで組み合わせてもよい。
【０１７５】
これから、以下の実施例および図を参照して本発明をさらに記載する。
【０１７６】
［図１ 肝臓およびＰＢＭＣにおける遺伝子発現のｐｅｇＩＦＮ−α２ｂ誘導性制御］
（Ａ）急速応答者は、非ＲＲ患者より、ｐｅｇＩＦＮ−α２ｂに応答して肝臓において有意により多い遺伝子を上方制御または下方制御する。肝臓生検およびＰＢＭＣにおける７５％を超える患者で有意水準ｐ＜０．０１（レーン１、２、５、および６）およびｐ＜０．０５（レーン３、４、７、および８）で２倍より大きく変化した遺伝子の平均（＋ＳＥＭ）数が示されている。ＲＲ患者群と非ＲＲ患者群との差は、肝臓生検において有意であったが、ＰＢＭＣにおいては有意ではなかった（図ではマンホイットニー検定のｐ値が示されている）。
（Ｂ）６つの非ＲＲ生検試料および６つのランダムに選択されたＲＲ生検試料の５０％より多くにおける、ｐｅｇＩＦＮ−αに応答して２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に上方制御または下方制御された遺伝子のベン図。
（Ｃ）６人のランダムに選択されたＲＲ患者の５０％より多くの生検およびＰＢＭＣ試料における、ｐｅｇＩＦＮ−αに応答して２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に上方制御または下方制御された遺伝子のベン図。
【０１７７】
［図２ ＨＣＶ感染患者におけるｐｅｇＩＦＮα２ｂ誘導性遺伝子制御は、ＲＶＲ患者の肝臓と非ＲＶＲ患者の肝臓との間、および肝臓とＰＢＭＣとの間に大きな違いを示す］
（Ａ）５つのＩＳＧ（Ｍｘ１、ビペリン、Ｍｄａ５／ヘリカード、ＯＡＳ１、ＵＳＰ１８）が、ＲＲ患者においてＢ−１とＢ−２との間で２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に制御された遺伝子のリストから選択された。非ＲＲ患者の肝臓において、これらの遺伝子の発現は処置前（レーン２５〜３０）にすでに高く、ｐｅｇＩＦＮα後（レーン３１〜３６）、さらには増加しなかった。ＲＲ患者において、処置前発現（レーン１５〜１４）は対照（レーン１〜４）と類似しており、ｐｅｇＩＦＮαは強い上方制御を誘導する（レーン１５〜２４）。ＲＲ患者および非ＲＲ患者の両方において、ＰＢＭＣ（レーン３７〜４６および５７〜６２）では事前活性化は見出されず、ｐｅｇＩＦＮαは、これらの遺伝子を強く誘導する（レーン４７〜５６および６３〜６８）。ｙ軸は絶対発現値を示す。
（Ｂ）ＲＲ患者および非ＲＲ患者の両方における、ｐｅｇＩＦＮ−α２ｂに応答して肝臓で上方制御された遺伝子（ＣＣＬ８）の例。ＰＢＭＣにおける発現値はレーン３７〜６８に示されている。
【０１７８】
［図３ 選択されたＩＳＧおよびＰＰ２Ａの触媒サブユニットのＲＴ−ｑＰＣＲ分析］
（Ａ）ＵＳＰ１８ ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ分析はアレイデータを裏付けている。個々の患者におけるＢ−１とＢ−２の間でのＵＳＰ１８ ｍＲＮＡの倍数誘導（fold induction）が示されている。
（Ｂ）処置前生検における選択されたＩＳＧの発現レベルは、初期非応答（ＰＮＲ＝１２週間目での２ｌｏｇ未満のウイルス量の降下）を示す患者においてより早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ＝１２週間目での２ｌｏｇを超えるウイルス量の降下）を示す患者において低い。
（Ｃ）遺伝子型１および４を有する患者群（治療が「困難」）内ならびに遺伝子型２および３を有する群（治療が「容易」）内の両方において、ＰＮＲ患者は、ＵＳＰ１８およびＩＦＩ１２７の高い処置前発現レベルを有する。
パネルＢおよびＣにおいて、ｙ軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する発現を示す。統計的有意性をマンホイットニー検定で検定した。Ｎ＝各群における患者数。
（Ｄ）持続性ウイルス陰性化（ＳＶＲ＝処置終了から６カ月後検出不可能なＨＣＶ ＲＮＡ）または処置終了時応答（ＥｏＴＲ）を有する患者は、ＰＮＲを有するまたはＥｏＴＲをもたない患者においてよりＵＳＰ１８およびＩＦＩ２７の有意に低い発現を示す。
【０１７９】
［図４ 肝臓生検におけるＪａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の分析］
（Ａ）ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射前（Ｂ−１）および注射後（Ｂ−２）に収集された肝臓生検の抽出物におけるＳＴＡＴ１リン酸化。抽出物を、ＰＹ（７０１）−ＳＴＡＴ１に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。シグナルを、積分強度を計算するＯｄｙｓｓｅｙイメージングソフトウェアを用いて定量化した（キロカウント×ｍｍ２）。値は、Ｂ−２試料におけるリン酸化の倍数増加を表す。ＲＲ患者番号は青色で、非ＲＲ患者は赤色で示されている。ブロットを切り取り、試料の各ペアのローディング対照として用いられる全ＳＴＡＴ１について再調査（reprobe）した。
（Ｂ）ＲＲ患者および非ＲＲ患者のＢ−１およびＢ−２の代表例。ＲＲ患者（患者４番）の処置前生検において明らかな核染色はない。核の薄青色はヘマトキシリンでの対比染色から生じている。ｐｅｇＩＦＮαから４時間後、たいていの肝細胞は強い核染色を示す。非ＲＲ患者（患者１２番）において、処置前生検において弱い核染色がすでに存在しており、ｐｅｇＩＦＮαは肝細胞においてほとんど変化を引き起こさない。明らかな核染色の増加はクッパー細胞に限局している。
【０１８０】
［図５ 全ての患者の生検試料における遺伝子発現の主なパターンはヒートマップとして示されている］
＜０．０５のｐ値を有する全ＲＲの５０％より多くにおいて２倍より大きく変化している２５２個の遺伝子のリストを用いてマップを作成した。生発現値の色コード化は左側に示されている。多くの遺伝子は、対照患者、およびＲＲ患者の処置前生検（Ｂ−１）において低い発現レベルを有する。ＲＲ患者において、ｐｅｇＩＦＮαは上方制御を誘導する（Ｂ−２）。非ＲＲ患者において遺伝子の大部分は、処置前生検試料（Ｂ−１）においてすでに強く誘導されており、それから、ｐｅｇＩＦＮα後（Ｂ−２）、さらなる誘導は見出されない。
【０１８１】
［図６ 分類基準として４週間目での処置に対する応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣにおける教師あり分類予測（supervised classifier prediction）］
（Ａ）２つの応答群のＢ−１生検を用いる教師あり分類予測により、４．３％の誤分類率をもつ処置の転帰の最良の予測因子として２９個の遺伝子（３３個の転写産物）のリストがもたらされた。
（Ｂ）２つの応答群のＢ−２生検を用いる教師あり分類予測により、１９．５％の誤分類率をもつ処置の転帰の最良の予測因子として１６個の遺伝子（１６個の転写産物）のリストが明らかにされた。
（ＣおよびＤ）ＰＢＭＣ−１およびＰＢＭＣ−２試料の教師あり分類予測によっては、用いられた４つの統計的検定（サポートベクターマシン、スパース線形判別分析、フィッシャー線形判別分析、Ｋ近傍法）のいずれを用いても予測遺伝子の有用なリストは作成されなかった。誤分類率は、ＰＢＭＣ−１について３８．５％、ＰＢＭＣ−２について４２．６％であった。
【０１８２】
［図７］
（Ａ）肝臓生検におけるリン酸化ＳＴＡＴ１の免疫組織化学的染色の半定量的評価
肝細胞の核染色を、示された患者（患者番号は表１の番号に対応する）のＢ−１試料（青色）およびＢ−２試料（赤色）における２００個の肝細胞での繰り返しカウント（５回）によって定量化した。６人の非ＲＲ患者のうちの５人において、かなりの割合の肝細胞が、処置前生検においてすでに弱いが明らかな核染色を生じた。全てのＲＲ患者は、処置前の核においてリン酸化ＳＴＡＴ１シグナルを生じなかったが、ｐｅｇＩＦＮα後、強い誘導を示した。
（Ｂ）ｐｅｇＩＦＮα２ｂに応答したＳＴＡＴ−ＤＮＡ結合の誘導が、非ＲＲ患者の大部分において障害される
Ｂ−１試料およびＢ−２試料由来の核抽出物を、放射標識ＳＩＥ−ｍ６７オリゴヌクレオチドプローブを用いるＥＭＳＡで分析した。アスタリスク（＊）は、オリゴヌクレオチド配列と結合している活性化ＳＴＡＴ１二量体のシグナルを示す。ゲルシフトパネルより上の数字は、表１にすでに用いられている患者番号を表す。上部パネルは、４週間目に急速応答を有する１０人の患者（番号１〜１０）を示す。下部パネルは、６人の非ＲＲ患者（番号１１〜１６）を示す。
【０１８３】
［図８ ヒトインターフェロンαのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８４】
［図９ ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８５】
［図１０ ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８６】
［図１１ ヒトインターフェロン受容体２ｂのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８７】
［図１２ ヒトインターフェロン受容体２ｃのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【実施例１】
【０１８８】
１．１ 方法
１．１．１ 被験体試料および処置
２００６年１月から２００７年４月まで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの外来肝臓診療所の紹介を受けたＣＨＣを有する患者に、研究目的として彼らの診断的肝臓生検（Ｂ−１）の一部を用いる許可を求めた。その後、ペグ化ＩＦＮα２ｂ（ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ）およびリバビリン（Ｒｅｂｅｔｏｌ、どちらもＥｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で処置された患者に、この研究に参加してくれるよう頼んだ。１６人の患者が、１．５μｇ／ｋｇ体重のｐｅｇＩＦＮα２ｂ（ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ）の最初の注射から４時間後、２回目の肝臓生検（Ｂ−２）を受けることに同意した。彼らの全ては白色人種であった。リバビリンの初回投与を、さらなる交絡因子を避けるためにこの２回目の生検後に行った。プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの倫理委員会によって承認された。書面のインフォームドコンセントを全ての患者から入手した。ＰＢＭＣ単離のための血液を、処置前および最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、収集した。患者をｐｅｇＩＦＮα２ｂ（１．５μｇ／ｋｇ体重）およびリバビリン（体重に基づいた投与：＜６５ｋｇ：８００ｍｇ／日（mg/d）；６５〜８５ｋｇ：１ｇ／日；＞８５ｋｇ：１．２ｇ／日）で処置した。ＨＣＶ ＲＮＡを処置開始前、ならびに処置の４週間目および１２週間目に定量化した。処置期間は、遺伝子型２／３を有する患者については２４週間、遺伝子型１については４８週間であった。非ＣＨＣ対照として、局所性病変の超音波ガイド下の肝臓生検を受けた４人の患者から、局所性病変の外側の正常肝臓組織からの生検についてのインフォームドコンセントを得た。ＣＨＣを有する９６人の追加の患者（彼らの１人を除く全てが白色人種であった）由来の処置前肝臓生検を、選択されたＩＳＧについてのＲＴ−ｑＰＣＲに用いた。
【０１８９】
１６人の慢性感染ＨＣＶ被験体由来のペアのヒト肝臓生検試料を入手した。２００６年１月から２００７年４月まで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの外来肝臓診療所の紹介を受けた慢性Ｃ型肝炎を有する全被験体に、研究目的として彼らの診断的肝臓生検の一部を用いる許可を求めた。肝臓生検を、同心型針電極を用いる超音波ガイド下の技術によって採取した。
【０１９０】
Ｍｅｔａｖｉｒスコアリングシステムによって肝臓疾患のグレード付けおよびステージングのための日常的な病理組織学的精密検査についての２つの２０〜２５ｍｍ長の生検検体の切除後、残りの５〜２０ｍｍ長の生検円柱をＢ１（生検１として）と標識し、さらなる研究参加者の処置前試料として保存した。ペグ化ＩＦＮα２ｂ（Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をこの研究に参加した全被験体に処方した。２回目の生検（Ｂ２）を、最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、実施した。リバビリンの初回投与を、さらなる交絡因子を避けるためにこの２回目の生検後に行った。プロトコールは、ＢａｓｅｌのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓの倫理委員会によって承認された。書面のインフォームドコンセントを全被験体から入手した。
【０１９１】
加えて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単離のための血液を、処置前および最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、収集した。
【０１９２】
ＨＣＶ被験体は、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ（１．５μｇ／ｋｇ体重）およびリバビリン（体重に基づいた投与：＜６５ｋｇ：８００ｍｇ／日；６５〜８５ｋｇ：１ｇ／日；＜８５ｋｇ：１．２ｇ／日）での標準併用処置を受けた。ＨＣＶ−ＲＮＡを処置開始前、ならびに処置の４週間目および１２週間目に定量化した（表１）。処置期間は、遺伝子型２／３を有する患者については２４週間、遺伝子型１については４８週間である。研究に含まれる１６人の被験体から、２人の被験体（１０番および１６番）は、一次非応答を生じ、処置を１２週間目に中止した。残りの９人の被験体から、２人（１番、２番）が処置応答の終了で治療を完了している。
【０１９３】
非ＨＣＶ対照として、局所性病変（癌腫の転移）の超音波ガイド下の肝臓生検を受けた２人の被験体から、局所性病変の外側の正常肝臓組織からの生検についてのインフォームドコンセントを得た。再び、生検の一部を日常的な病理組織学的診断に用い、後で記載したように、残りの組織をＲＮＡの抽出に用いた。両方の対照試料は、日常的な病理組織学的検査(workup)において肝臓疾患の確認された非存在を示した。
【０１９４】
１．１．２ ＩＦＮα血清濃度の測定
処置前のｈＩＦＮα血清レベルおよび最初の注射から４時間後のｐｅｇＩＦＮα２ｂの血清濃度を、製造会社の使用説明書に従ってＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のヒトインターフェロンαＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。このＥＬＩＳＡキットは以前、非ペグ化ヒトＩＦＮαとペグ化ヒトＩＦＮαの両方を認識することが示されている３４。
【０１９５】
１．１．３ ヒト肝臓生検からの抽出物の調製
肝臓生検試料を、細胞全体、細胞質、および核の抽出物の調製に用いた。細胞全体抽出物について、試料を、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル、および１ｍｍｏｌ／ｌのバナジン酸塩を含む１００μｌの溶解緩衝液中でＤｏｕｎｃｅホモジナイズした。可溶化液を１４，０００ ｒｐｍで、４℃、５分間、遠心分離した。タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ）によって決定した。
【０１９６】
核抽出物および細胞質抽出物について、肝臓を、２００ｍｍｏｌ／ｌのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．６、１０ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＧＴＡ、０．２％のＮＰ−４０、１０％のグリセロール、および０．１ｍｍｏｌ／ｌのバナジン酸塩を含む低塩緩衝液に溶解した。１５，０００ ｒｐｍで５分間の遠心分離後、ペレットを高塩緩衝液（４２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを追加した低塩緩衝液）中に再懸濁した。遠心分離後、核抽出物のアリコートを、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）のために作製した。
【０１９７】
１．１．４ ウェスタンブロットおよび電気泳動移動度シフトアッセイ
ヒト肝臓可溶化液由来の１０μｇの総タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にロードし、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に転写した。膜を３％のＢＳＡ／ミルク（１：１）−０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中、１時間、ブロッキングし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で洗浄し、一次抗体と４℃で一晩、インキュベートした。
【０１９８】
タンパク質を、リン酸化ＳＴＡＴ１（ＰＹ（７０１）−ＳＴＡＴ１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＳＴＡＴ１（カルボキシ末端；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的な一次抗体で検出した。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後、膜を赤外蛍光二次ヤギ抗マウス（ＩＲＤｙｅ ６８０）または抗ウサギ（ＩＲＤｙｅ ８００）抗体（どちらもＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）と室温で１時間、インキュベートした。ブロットをＬＩ−ＣＯＲ製のＯｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムによって分析した。赤外画像を一回のスキャンで獲得し、シグナルを積分強度を用いて定量化した。
【０１９９】
ローディング対照として、膜を剥離し、抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。
【０２００】
２μｇの核抽出物およびＳＴＡＴ応答エレメント配列に対応する３２Ｐ放射標識ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド血清誘導性エレメント（ＳＩＥ）−ｍ６７を用いて、ＥＭＳＡを行った。
【０２０１】
１．１．５ 免疫組織化学
標準間接免疫ペルオキシダーゼ手順を免疫組織化学のために用いた（ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。４ｍｍ厚の切片をパラフィンブロックから切り取り、再水和し、前処理し（ＥＲ２溶液中２０分間）、リン酸化ＳＴＡＴ１に対するウサギモノクローナル抗体（希釈１：２００、＃９１６７Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。全染色手順（脱水、前処理、インキュベーション、対比染色、およびマウンティング）を自動染色装置（Ｂｏｎｄ（登録商標）、Ｖｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を用いて行った。核リン酸化ＳＴＡＴ１染色の定量化について、各患者のＢ−１試料およびＢ−２試料のそれぞれについて２００個の肝細胞を５回、カウントした。補足的な図３において、標準偏差を有する平均値が示されている。
【０２０２】
１．１．６ ＲＮＡ単離およびマイクロアレイ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社の使用説明書に従い、肝臓試料およびＰＢＭＣ試料から抽出した。ＲＮＡを分注し、−８０℃で保存した。転写産物あたり１１個の完全マッチ／ミスマッチプローブ対を有する５６，０００個を越える転写産物および変異体を表すＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイを用いるマイクロアレイ分析によって肝臓およびＰＢＭＣにおいて遺伝子発現を評価した。マイクロアレイハイブリダイゼーションを、ＢａｓｅｌのＦｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈのゲノム機能解析施設で行った。各試料由来の全ＲＮＡ（１〜２μｇ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ１サイクル増幅キットを用いて製造会社の使用説明書の通り、逆転写し、ビオチン化した。（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの使用説明書の通り）ビオチン化ｃＲＮＡ（２０μｇ）をマグネシウムとの加熱により断片化し、１５μｇの断片化ｃＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズした。品質管理およびバックグラウンド標準化を、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＲｅｆｉｎｅｒ ４．１を用いて行った。発現値の推定を、Ｒｅｆｉｎｅｒ ４．１． ＬＯＷＥＳＳ標準化におけるＧＣ−ＲＭＡ実行を用いて得て、およびプレゼントコールされた(called present)（検出Ｐ値＜０．０４）遺伝子の５００の値への中央値スケーリングを、Ｇｅｎｅｄａｔａ’ｓ Ａｎａｌｙｓｔ ４．１パッケージにおいて実行した。ＬＯＷＥＳＳ標準化データをこの明細書においては「生」発現値と呼ぶ。本発明者らはまた、各遺伝子を、１．０におけるその発現レベルを中央に置くためにその中央値で割ることによって、遺伝子に点別割り算(point-wise division)を実行した。このスケーリングされたデータは、変化の大きさおよび方向を示すだけで、絶対的発現レベルについては示さない。スケーリングされたデータをクラスタリング分析に用いた。断りのない限り、全ての他の分析については、生データを用いて行った。
【０２０３】
データ分析をＧｅｎｅｄａｔａ ＡＧのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｔ ４．１を用いて実行した。遺伝子は、Ｐ＜０．０５でのｔ検定を合格し、各群内の患者の少なくとも６０％においてペア患者試料の間で１．３、１．５、２、および５、またはそれ以上の倍数変化中央値(median fold change)を有することが要求された。分類基準として４週間目における応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣの教師あり分類予測(supervised classifier prediction)として、４つの統計的検定を用いた（サポートベクターマシン、スパース線形判別分析、フィッシャー線形判別分析、Ｋ近傍法）。誤分類率は、用いられた検定ごとに決定することができ、最低率のものを選択した。
【０２０４】
１．１．７ ＲＮＡ単離、逆転写、およびＳＹＢＲ−ＰＣＲ
アレイデータを、ＳＴＡＴ１、ＩＰ１０、ＵＳＰ１８、ＩＦＩ２７、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３を含むいくつかのＩＦＮ制御遺伝子の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって検証した。
【０２０５】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従い、肝臓から全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってＲＮＡを逆転写した。反応混合物を７０℃で５分間、その後、３７℃で１時間、インキュベートした。反応を、９５℃で５分間、加熱することによって停止した。ＳＹＢＲ緑色蛍光（ＳＹＢＲ緑色ＰＣＲマスターミックス：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に基づいてＳＹＢＲ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＳＴＡＴ１、誘導性タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＵＳＰ１８、ＩＦＩ２７、およびＰＰ２Ａｃについてのプライマーをエキソン−イントロン接合部にわたって設計した。プライマー配列は表４に示されている。サイクル閾値における差（ΔＣＴ）を、内部対照の役割を果たすＧＡＰＤＨのＣＴ値をＳＴＡＴ１または目的とする他の転写産物のＣＴ値から引き算することによって導いた。全ての反応を、ＡＢＩ ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２連で実行した。転写産物のｍＲＮＡ発現レベルを、式：２−ΔＣＴを用いてΔＣＴ値からＧＡＰＤＨに対して計算した。ペア肝臓生検試料における発現の変化を式：２∧（ΔＣＴＢ−１−ΔＣＴＢ−２）に従って倍数変化として計算した。
【０２０６】
ボックスプロット図、独立ｔ検定（unpaired t-test）、およびマンホイットニー検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍのＭａｃｉｎｔｏｓｈ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン４．００を用いて実行した。
【０２０７】
１．２ 結果
患者および処置に対する応答
この研究に含まれる１６人の患者である、６人の女性および１０人の男性を週１回の皮下注射のｐｅｇＩＦＮ２αｂと１日２回の経口リバビリンの体重調整型併用で処置した。彼ら全員は処置前生検（Ｂ−１）およびｐｅｇＩＦＮα２ｂの最初の注射から４時間後に採取される２回目の生検（Ｂ−２）の２回の肝臓生検を受けた。本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後に遺伝子発現を分析するよう選択しており、その理由は、チンパンジーの肝臓におけるｐｅｇＩＦＮαによるＩＳＧの誘導の反応速度がこの時点で最大であり、続いて、多数の遺伝子の急速な下方制御があったからである（２２）。本発明者らは、おそらくいくつかの遅発型誘導性ＩＳＧの上方制御を見逃した可能性があるが、急速な下方制御により、より遅い時点を用いる場合、より多くのＩＳＧを見逃すことになったであろうと理解する。
【０２０８】
患者のうちの７人はＨＣＶ遺伝子型（ＧＴ）１に、２人はＧＴ４に、４人はＧＴ３に、３人がＧＴ２に感染していた。４週間の処置後に陰性血清ＨＣＶ ＲＮＡであった８人の患者、および最初の４週間内にウイルス価の３ｌｏｇより大きい降下があった２人の患者を急速応答者（ＲＲ）と分類し、一方、６人の患者が１．５ｌｏｇ未満のウイルス量低下を示し、非ＲＲと分類した（表１）。
【０２０９】
血清ＩＦＮα濃度は、処置前の全患者において検出限界より下であり、以前に発表された薬物動態学的データ（２４）に従って、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射の４時間後に得られた試料において３４〜３６０ｐｇ／ｍｌであった（データ示さず）。注射後４週間目のウイルス陰性化と４時間目における血清ＩＦＮα濃度との間に有意な相関はなかった。さらに、血清ＩＦＮαレベルにおける差にもかかわらず、全患者はＰＭＢＣにおいて同様のＩＳＧ誘導を示した（下記参照）。
【０２１０】
標的遺伝子のＩＦＮ誘導性制御
Ｂ−１試料およびＢ−２試料においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０アレイを用いて遺伝子発現を分析し、最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射の前（ＰＢＭＣ−１）およびその注射から４時間後（ＰＢＭＣ−２）に得られた血液から単離されたＰＢＭＣにおいても分析した。各患者について、処置後試料において（処置前と比較して）２倍より大きく上方制御または下方制御された遺伝子を同定し、遺伝子リストに保存した。その後、本発明者らは、１０人のＲＲ患者および６人の非ＲＲ患者それぞれからランダムに選択された４人の患者の群を７つおよび３つ作った。各群において、４人の患者のうちの少なくとも３人において有意に（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）変化した遺伝子を同定し、カウントした。７つのＲＲ群の肝臓生検において、制御された遺伝子の平均数（±ＳＥＭ）は、有意水準ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５、それぞれにおいて７６．７１（±１７．４６）および１９６．７（±３１．５５）であった。３つの非ＲＲ群において、これらの数は、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５、それぞれについて１１．６７（±３．７６）および２８．３３（±６．１２）であった。ＲＲ群と非ＲＲ群の間の差は統計的に有意であった（図１Ａ）。ＲＲ試料および非ＲＲ試料に見出される有意に制御された遺伝子において重複があった。例として、非ＲＲ生検試料の５０％より多くにおいて、Ｂ１とＢ２との間で２倍より大きく変化した３６個の遺伝子のうちの３０個は、ランダムに選択されたＲＲ患者の５０％より多くにおいて変化した１７７個の遺伝子の中にも存在した（図１Ｂ）。
【０２１１】
驚くほどのことではないが、制御された遺伝子の多くは、既知のＩＳＧを表している。しかしながら、本発明者らの予想に反して、これらのＩＳＧの発現レベルは、非ＲＲと比較して、ＲＲ患者由来のｐｅｇＩＦＮα２ｂ処置後生検においては高くなかった。むしろ、非ＲＲ患者試料は、Ｂ−１においてすでにＩＳＧ発現がより高いレベルであり、それゆえ、Ｂ−２試料における倍数変化はほんのわずかであった。これは、５つのＩＳＧの例において図２Ａに示されている。それらの遺伝子は、Ｃ型肝炎なしの個体由来の生検およびＲＲ患者のＢ−１の生検において非常に低い発現を示す。６人の非ＲＲ患者は、処置前にこれらの遺伝子の高い発現を生じ、ｐｅｇＩＦＮα２ａ投与は、それらの発現を増加させず、または最小限のみ増加させた。このルールの例外は極少数であった（例は図２Ｂに示されている）。これらの遺伝子は、全患者において、処置前生検において低い発現を示したが、ｐｅｇＩＦＮα２ｂがそれらを誘導した。とは言っても、遺伝子発現の主なパターンは図２Ａに示されたのと似ていた。ＲＲ群においてＢ−１とＢ−２の間で２倍より大きく有意に（ｐ＜０．０５）変化した２５２個の遺伝子の発現のリストおよびヒートマップは、補足情報（ＳＩ）表２およびＳＩ 図６において全生検試料について示されている。
【０２１２】
肝臓およびＰＢＭＣにおいてｐｅｇＩＦＮα２ｂで制御された遺伝子のかなりの重複があった（図１Ｃ）。興味深いことに、全患者において、ｐｅｇＩＦＮα２ｂは肝臓においてよりＰＢＭＣにおいてより多くの遺伝子を制御した。しかしながら、ＲＲと非ＲＲの間のＰＢＭＣにおけるＩＳＧの上方制御の差は有意ではなかった（図１Ａ）。ＲＲ患者および非ＲＲ患者において、ＩＳＧの事前活性化はＰＢＭＣにおいて見出されず、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ処置がＩＳＧ制御に同じ効果を生じた（ＳＩ 図５）。これは、慢性ＨＣＶ感染が肝臓におけるＩＦＮ系に強い局所効果を生じるが、ＰＢＭＣにおいてほとんど効果を生じないことを示す。
【０２１３】
処置に対する応答を予測する遺伝子のサブセット
アレイデータの教師あり分類分析により、本発明者らの場合、４週間目における急速応答対非応答である、転帰を最も良く予測する遺伝子のサブセットの同定が可能になる。全ての肝臓生検およびＰＢＭＣデータセットを、分類基準として処置の４週間目の応答を用いる教師あり分類予測に供した。ＰＢＭＣ試料について、分析によって、処置の転帰を予測することができる遺伝子のサブセットが同定されなかった。対照的に、１９．５％のエラー発生率（error rate）で、処置に対する応答を予測する肝臓Ｂ−２試料において１６個の遺伝子のサブセットが同定された。さらに良い予測が、処置前生検Ｂ−１における２９個の遺伝子のサブセットに関して可能であり、エラー発生率は４．３％であった。このセットにおいて、ｐｅｇＩＦＮα２ｂによって上方制御された２２個の遺伝子があった（表２）。したがって、７６％の最良予測因子遺伝子はＩＳＧを表す。
【０２１４】
処置前生検から設定された最良予測因子においてＩＳＧが優勢であることに反して、Ｂ−２生検の分析に由来する１６個の最良予測因子遺伝子の３個（１９％）のみがＩＳＧであった（表３）。これらの結果は、Ｂ−２におけるＩＳＧの発現レベルがＲＲ試料と非ＲＲ試料の間で異ならず、したがって応答者と非応答者の識別に適さないという図２に示された知見を支持する。上記で論じられたＢ−１およびＢ−２の肝臓生検リストに存在する非ＩＳＧの中で、シグナル伝達、細胞周期制御、アポトーシス、およびアミノ酸代謝において機能を果たす遺伝子がある。
【０２１５】
肝臓生検におけるＩＳＧ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析
ペア肝臓生検のアレイ分析により、治療の転帰についてのＢ−１生検におけるＩＳＧ発現の重要性が浮き彫りにされた。これらのデータを確認するために、本発明者らは、Ｂ１生検およびＢ２生検を受けた１６人の患者ならびにＣＨＣを有する９６人の追加の患者の処置前生検において選択されたＩＳＧ（ＵＳＰ１８、Ｓｔａｔ１、ＩＰ１０、ＩＦＩ２７）の発現をリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定した。ペア生検を受けた１６人の患者において、ＲＴ−ｑＰＣＲ値はアレイ発現によく一致し、アレイデータの品質を確証した（図３Ａ、およびデータ示さず）。治療前生検における全ての４つのＩＳＧの発現は、ＥＶＲ群とＰＮＲ群の間で有意に異なっており（図３Ｃ）、肝臓におけるＩＳＧの処置前発現とＩＦＮα治療に対する応答との間の逆相関があるという結論をさらに支持していた。ＩＳＧの有意な上方制御は、１２週間目における非応答、および最終処置の転帰とも相関した。
【０２１６】
処置前ＩＳＧ発現レベルはＨＣＶ遺伝子型と相関する
本発明者らは、ＨＣＶ遺伝子型（ＧＴ）に関してＩＳＧの発現を分析した。興味深いことに、調べたＩＳＧは、「治療が困難な」ＧＴ １およびＧＴ ４に感染した患者において、８０％を超える患者において治療に成功することができるＧＴ ２およびＧＴ ３に感染した患者よりも、有意に高い発現を示した。重要なことには、ＩＳＧの発現レベルは、ＨＣＶ ＧＴとは無関係に非ＲＲ患者においてＲＲ患者より高かった。したがって、非ＲＲ患者におけるＩＳＧ発現レベルの増加は、ＧＴ １が非ＲＲ群において大きな比率を占めるという事実だけで説明することができない。むしろ、ＨＣＴ ＧＴ １およびＧＴ ４を有する患者は、彼らの肝臓においてＩＳＧの発現が増加している頻度がより高いという事実が、ＩＦＮ治療に対するこれらの患者の不良応答についてのもっともらしい説明を与えている。
【０２１７】
非応答者はＰＰ２Ａｃのより高い発現を有する
本発明者らは以前、ＰＰ２Ａの触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）が、対照と比較してＣＨＣを有する患者の肝臓において過剰発現していること、およびＰＰ２Ａｃの過剰発現がＩＦＮαシグナル伝達を阻害することを示している（１４、２５）。したがって、本発明者らは、１２週間目の処置応答がわかっている患者群におけるＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡレベルを分析した。ＥＶＲ群の患者は、ＰＮＲ患者よりＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡの発現が有意に少なかった（図３Ｂ）。
【０２１８】
ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達
注射されたｐｅｇＩＦＮα２ｂはＩＦＮ受容体と結合し、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化する。この活性化における中心的事象は、ＳＴＡＴ１のチロシン７０１におけるリン酸化である（２６）。本発明者らは、リン酸化部位特異的（phospho-specific）ＳＴＡＴ１抗体を用いるウェスタンブロットによって全てのＢ−１生検およびＢ−２生検からの抽出物を分析した（図４Ａ）。リン酸化ＳＴＡＴ１バンドの半定量的分析によって、ＲＲ患者における３．６倍の導入中央値(median induction)、および非ＲＲ患者における１．６倍の導入中央値が明らかにされた（ｐ＝０．０３）。
【０２１９】
リン酸化ＳＴＡＴ１は、核へ移行し、ＩＳＧプロモーターの特異的応答エレメントに二量体として結合する（２６）。抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体を用いる免疫組織化学による核移行の評価は、おそらく、生検材料に存在する肝細胞におけるＳＴＡＴ１活性化と他の細胞におけるＳＴＡＴ１活性化とを識別することを可能にするはずである。ＲＶＲ患者のペア生検の分析により、Ｂ−１試料におけるわずかな核染色、およびｐｅｇＩＦＮαの注射後のＢ−２試料におけるほとんどの肝細胞核の強い染色が明らかにされた（図４Ｂ）。対照的に、１人（１１番）を除く全ての非ＲＶＲ患者は、顕著に異なる染色パターンを示した。処置前生検において、肝細胞の大部分は、すでにかなりの核染色を有し、それはＢ−２試料において増加しなかった。非ＲＶＲ患者のＢ−２試料における核染色の明らかな増加は、クッパー細胞（肝臓マクロファージ）におけるＳＴＡＴ１の核移行から生じ、肝細胞からは生じなかった（図４Ｂ）。クッパー細胞および場合により、混入した血液細胞におけるＳＴＡＴ１の活性化が、ウェスタンブロッティングで観察されるＳＴＡＴ１リン酸化の増加に寄与した可能性がある（図４Ａ）。
【０２２０】
シグナル伝達経路における次の工程は、核リン酸化ＳＴＡＴ１のＩＳＧのプロモーターエレメントへの結合である。したがって、本発明者らは、Ｂ−１生検およびＢ２生検の抽出物におけるＳＴＡＴ１ ＤＮＡ結合を電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）を実行することによって評価した。全ての急速応答者は、Ｂ−２試料においてＳＴＡＴ１ ＤＮＡ結合の著しい増加を示した。対照的に、たいていの非ＲＶＲ患者は、ｐｅｇＩＦＮα適用でゲルシフトシグナルのわずかな増加を示し、またはシグナルの増加を示さなかった。
【０２２１】
これらのデータは、免疫組織化学的検査およびＥＭＳＡアッセイが、リン酸化ＳＴＡＴ１についてのウェスタン分析の結果より治療の転帰と良く相関することを示す。総合すれば、データは、ＲＶＲ患者と非ＲＶＲ患者の間のＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の実質的差を実証している。
【０２２２】
１．３ 考察
ＩＦＮ治療に対するＨＣＶ感染患者の異なる応答の根底にある考えられる機構についてより学ぶために、本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα治療前および治療中にＣＨＣを有する患者から収集されたペア肝臓生検においてＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた。同じ患者から得られた２つの肝臓試料におけるＩＦＮシグナル伝達の比較、および同じ患者に由来するマッチングしたＰＢＭＣ試料におけるＩＳＧ誘導との比較により、治療に対して応答が悪い患者が彼らのＩＦＮ系の事前活性化を示すこと、および事前活性化が肝臓に限局されており、ＰＢＭＣにおいては明らかではないことの明確な証拠を得ることが可能になった。重要なことには、治療に対する将来の応答者を意味する、低い最初のＩＳＧ発現を有する患者において、ｐｅｇＩＦＮαに応答したＩＦＮ系の活性化は、治療前も治療後も、非応答者で見られたものを超えなかった。これは、将来の非応答者である、ＩＦＮ系の最初の事前活性化を有する患者は、ＩＳＧ発現の下流の工程でいくつかの欠陥を有し、彼らを内因性ＩＦＮおよびＩＦＮ治療の両方に対して抵抗性にさせていることを示唆し得るものであった。
【０２２３】
ＩＦＮα処置は、１人の患者を除く全員においてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導した。非ＲＶＲ試料と比較してＲＶＲにおいてより強いＳＴＡＴ１活性化の傾向があった。しかしながら、免疫組織化学的分析によって、より顕著な違いが明らかにされた。非ＲＶＲ試料において、ｐｅｇＩＦＮαは、核ＳＴＡＴ１蓄積が主に肝細胞で誘導されたＲＶＲ試料とは違って、クッパー細胞において核ＳＴＡＴ１移行を強く誘導した。興味深いことに、（１人だけ例外として）非ＲＶＲ患者は、処置前生検にすでに存在する核リン酸化ＳＴＡＴ１を有した。これは、ＩＳＧ転写産物がより遅い非応答者の処置前生検で上方制御されているという観察と一致する。どのようにこのＪａｋ−ＳＴＡＴ経路の事前活性化が非ＲＶＲ患者におけるＩＦＮ系の治療抵抗性と関係しているかはさらなる研究を必要とする。
【０２２４】
ここ数年にわたって、ＨＣＶの先天免疫系への干渉への重要な洞察が得られている。第一に、一連の見事な論文により、ＩＦＮβ誘導のＴＬＲ３−ＴＲＩＦ−ＩＲＦ３シグナル伝達経路とＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５−Ｃａｒｄｉｆシグナル伝達経路の両方を阻害するＨＣＶの能力が実証された（２７〜３３）。このＨＣＶの能力は、なぜそのウイルスは慢性感染を確立することが多いのかの説明に役立ち得る。しかしながら、本発明者らのデータおよび以前に発表された結果（２０）により、内因性ＩＦＮ系が多くの患者において常に活性化されていることが実証されている。さらに、事前に活性化されたＩＦＮ系を有する患者は、ＩＦＮ治療に対して応答が悪いように思われる。この知見は、反直感的である（能動先天免疫系はＩＦＮα治療中にウイルスを排除するように助けると予想される）が、チンパンジーおよびヒト患者からの他の発表されたデータによって概ね支持されている（１６、１７、２０）。肝臓生検におけるＩＳＧ発現の分析から、ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導する（または少なくとも遮断しない）患者もいれば、ＨＣＶがおそらくＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆを切断することによって内因性ＩＦＮ系を首尾よく抑圧する患者もいることは明らかである。逆説的なことに、この違いは、慢性感染を維持するＨＣＶの能力へ明らかな影響を与えていない。
【０２２５】
事前活性化されていないＩＦＮ系をもたない患者において、ｐｅｇＩＦＮα２ｂは、４時間以内に肝臓で多数のＩＳＧのロバストな上方制御を誘導した。類似した高ＩＳＧ発現は、後に４週間目で急速なウイルス陰性化を示さなかった患者の処置前生検にすでに存在していた。なぜ後者の患者が、ＩＦＮ系の強い活性化にもかかわらず慢性ＨＣＶ感染を自発的に解決しないのかについては幾分困惑している。１つの可能性として、どちらの場合にも上方制御されているＩＳＧタンパク質は異なる転写後修飾を有することである。別のシナリオとしては、内因性ＩＦＮαと外因性ＩＦＮαの両方に対する非応答が、ＨＣＶの排除に特異的に必要とされる数個の重大なＩＳＧの誘導の欠損によって引き起こされる可能性がある。本発明者らはこの可能性を排除することはできないが、ペア肝臓試料で行ったアレイ分析によっては、急速応答者において特異的に上方制御されたＩＳＧは明らかにされなかった。さらに、このモデルでは、なぜ内因性ＩＦＮ系の事前活性化が後での処置に対する非応答とそれほど密接に関連づけられるのかを説明することができない。
【０２２６】
あるいは、インターフェロン応答の誘導の反応速度は決定的であり得た。事前に活性化されたＩＦＮ系をもたない患者において、処置中の外因性ＩＦＮαの注射は、たいていの肝臓細胞において非常に急速に抗ウイルス状態を誘導するはずであり、ＨＣＶはＩＦＮ誘導性防御から逃避するのに「十分な」時間をもたないであろう。他方、抗ウイルス状態の増強（built-up）は、細胞内抗ウイルス防御系に適応しかつ逃れるのに十分な時間をＨＣＶに与えるであろう他の患者群においては遅くあり得、それがまたその後のＩＦＮ治療に対して抵抗性にさせている。
【０２２７】
どのようにして内因性ＩＦＮ系の誘導がＩＦＮα治療の成功を損なうのであろうか？明らかに、ＩＦＮシグナル伝達を阻害するネガティブフィードバックループの活性化が役割を果たし得る。ネガティブ制御因子のうち顕著な候補は、ＩＦＮ受容体に結合し、かつＪａｋ１およびＴｙｋ２の活性を阻害する２つのＩＦＮ誘導性タンパク質である、サイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）およびＳＯＣＳ３（３４）；ならびに、ＩＦＮα受容体２（ＩＦＮＡＲ２）に結合し、Ｊａｋ１のそれへのアクセスを遮断するＩＦＮ活性化タンパク質である、最近になって記載された抑制因子Ｕｂｐ４３（３５）である。しかしながら、本発明者らは、非ＲＶＲ患者と比較してＲＶＲのｐｅｇＩＦＮα２ｂ刺激された肝臓生検におけるこれらのネガティブ抑制因子の発現レベルの有意な差を見出すことができなかった（データ示さず）。さらに、ＳＯＣＳおよびＵｂｐ４３などのネガティブ抑制因子の一般的な上方制御は、ＩＦＮ治療に対して応答が悪い患者のサブセットにおいて多数のＩＳＧの観察された強い構成的発現と矛盾している。ＩＦＮαシグナル伝達が実際、肝臓細胞の大部分においてＳＯＣＳおよびＵｂｐ４３の誘導によって阻害されたとすれば、処置前肝臓においてＩＳＧのそのような顕著な事前活性化を観察するはずはないであろう。
【０２２８】
特に、試験されたＩＳＧの事前活性化は、ＨＣＶ遺伝子型１および４に感染した患者の肝臓生検において、遺伝子型２または３に感染したものより頻繁に起こっていた。遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１での感染の５０％未満と比較して、８０％を超える患者において治癒することができることは周知である（４）。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度はＨＣＶ遺伝子型に依存するという本発明者らの知見によって、この異なる感受性を説明することができる。
【０２２９】
おそらく、ＨＣＶ遺伝子型２および３は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦのより有効な切断によって肝臓における先天免疫の活性化を阻止するのにより多く成功する。しかしながら、内因性ＩＦＮ系の誘導を阻止することのウイルスの成功は、ＩＦＮα治療に対して感受性がより高いという代償の上で成り立っているであろう。注目すべきは、遺伝子型３ ＨＣＶに感染したただ１匹のチンパンジーは、遺伝子型１に感染した動物より低いＩＳＧ発現レベルを有することが示されている（１７）。
【０２３０】
本発明者らは以前、ＨＣＶがＩＦＮα誘導性シグナル伝達を、タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａを上方制御することによってＪａｋ−ＳＴＡＴ経路を介して阻害することを示している（１２、１４、２５、３６）。ＰＰ２Ａは、スキャフォールディングＡサブユニット、制御Ｂサブユニット、および触媒Ｃサブユニットのヘテロ三量体複合体である。ＰＰ２Ａｃサブユニット発現は、遺伝子型３より遺伝子型１に感染した患者の肝臓において有意に高い（２５）。この研究で示されているように、ＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡの発現は、応答者より、後での非応答者の生検において高い。これらのデータは、ＩＦＮシグナル伝達へのＨＣＶ干渉が治療に対する応答を障害するモデルを支持する。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害はまた、なぜ内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化がＨＣＶの自発的排除をもたらさないのかを説明することができる。もし、全ての肝細胞がＨＣＶに感染するとは限らない、いや、むしろ少数であると仮定するならば、非ＲＶＲ患者の処置前生検に観察されるＩＳＧの誘導は、主に非感染肝細胞において起こり得る。感染細胞において、ＩＦＮは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害のために無効であろう。その系の事前活性化に関与するＩＦＮは、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦを切断するのに成功していないウイルスに感染した肝細胞によって分泌されるであろう。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導性阻害のため、分泌されたＩＦＮβは、抗ウイルス状態を感染した肝細胞において誘導せずに、むしろ感染していない隣接細胞において誘導するであろう。ＣＨＣの病理生物学へのさらなる洞察を得るために、将来的な研究は、単細胞レベルでの分析に焦点を合わせるべきである。残念なことに、肝臓生検におけるＨＣＶ感染した肝細胞の検出は、まだ十分ではなく、そのような研究を困難にさせている。
【０２３１】
免疫防御系からのＨＣＶ回避の正確な機構はまだ解明されていないままであるが、内因性ＩＦＮ系の事前活性化によるＣ型肝炎治療の障害は今、十分明らかにされている。この事前活性化が可逆的プロセスであるかどうかを調べることは興味深いであろう。中和抗ＩＦＮα／β抗体、またはＩＦＮ応答を遮断する他の因子の処置前の注射が、内因性ＩＦＮ系を「ナイーブ」状態へ戻すことができて、ＩＦＮαに基づく治療に対する応答を増強する可能性がある。
【０２３２】
【表１】
【０２３３】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【０２３４】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【０２３５】
（ｃ）１．４ 参考文献
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス治療を向上させるための処置、および抗ウイルス治療が有効であるかどうかを決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は、健康にとって深刻な脅威であり、動物および人間の病的状態の主な原因であることが知られている。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、世界中で慢性肝臓疾患の主な原因である。Ｃ型肝炎の重要かつ顕著な特徴は、その慢性化への傾向である。７０％を超える感染した個体において、ＨＣＶは、数十年にわたる持続的感染を確立し、肝硬変および肝細胞癌へと導く可能性がある。
【０００３】
ＨＣＶ生物学における興味深い仮説として、ウイルスのＮＳ３−４Ａプロテアーゼはウイルス性タンパク質をプロセシングするだけでなく、ウイルス感染を検出してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の転写活性化を誘導する細胞内感覚経路の構成要素を切断して不活性化することが提案されている。ＮＳ３−４Ａの標的の１つは、ＴＲＩＦ（ＩＦＮβを誘導するＴＩＲドメイン含有アダプター）であり、それは、ＴＬＲ３（ｔｏｌｌ様受容体３）によるエンドソームにおけるｄｓＤＮＡ検出とＩＦＮβの誘導との間を本質的に結びつけるものである。最近になって、レチノイン酸誘導性遺伝子−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）およびＭＤＡ５（ヘリカード）がｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された。どちらのセンサーもＣａｒｄｉｆ（ＩＰＳ−１、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡとしても知られている）を通してシグナル伝達し、ＩＦＮβ産生を誘導する。Ｃａｒｄｉｆは、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａにより切断されて、不活性化され得る。ｄｓＲＮＡの細胞内センサーとして同定された、２つのＲＮＡヘリカーゼであるＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５は、Ｃａｒｄｉｆを通してＩＦＮβ産生を誘導するように作用する。
【０００４】
Ｉ型ＩＦＮは、先天免疫系の重大な構成要素であるだけでなく、ＣＨＣに対する現行の治療法の最も重要な構成要素でもある。現行の標準治療法は、週１回のペグ化ＩＦＮα（ｐｅｇＩＦＮα）の皮下注射および毎日の経口抗ウイルス剤リバビリンの摂取からなる。このレジメンは、患者の約５５％において全体的な持続性ウイルス陰性化（sustained virological response, ＳＶＲ）を達成し、遺伝子型の間で有意差がある。ＳＶＲは、処置中の検出可能なＨＣＶ ＲＮＡの消失、および治療停止後少なくとも６カ月間のその非存在の継続として定義される。ＳＶＲを達成する患者の長期フォローアップのいくつかの研究により、この応答が、９５％を超える患者において永続的であることが実証されている。ＳＶＲの確率は、処置に対する初期応答に強く依存する。１２週間の治療後、少なくとも２ｌｏｇ１０のウイルス量(viral load)の降下として定義される早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ）を示さない患者は、ＳＶＲを生じる可能性は極めて低く、これらの患者では処置を停止することができる。他方、ＥＶＲを有する患者は、治癒する可能性がかなりあり、その６５％がＳＶＲを達成する。４週間の処置後の血清ＨＣＶ ＲＮＡ検出不能として定義される急速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）を生じる患者では、予後はさらに良い。それらのうち、ＳＶＲを達成するのは、８５％を超えるであろう。残念なことに、遺伝子型１を有する患者の２０％未満、遺伝子型２または３を有する患者の約６０％がＲＶＲを示す。治療に対する初期応答について重要である宿主因子は、現在知られていない。
【０００５】
Ｉ型ＩＦＮは、数百個の遺伝子（ＩＳＧ、インターフェロン活性化遺伝子(interferon stimulated gene)）の制御を通して強力な抗ウイルス効果をもたらす。ＩＳＧの転写活性化は、休止細胞では通常合成されず、かつ細胞内の非ウイルス特異的抗ウイルス状態を確立するタンパク質を誘導する。インターフェロンは、多数のサイトカインおよび成長因子により用いられる細胞シグナル伝達のパラダイムである、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することによってそれらの合成を誘導する。全てのＩ型ＩＦＮは、同じ細胞表面受容体（ＩＦＮＡＲ）に結合し、受容体関連ヤヌスキナーゼファミリーメンバー、Ｊａｋ１およびＴｙｋ２を活性化する。その後、そのキナーゼは、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）およびＳＴＡＴ２をリン酸化して活性化する。活性化ＳＴＡＴは、核へ移行し、そこで、それらは、ＩＳＧのプロモーター内の特定のＤＮＡエレメントと結合する。ＩＳＧの多くは、抗ウイルス活性を有するが、脂質代謝、アポトーシス、タンパク質分解、および炎症性細胞応答に関与するものもある。多くのウイルスと同様に、ＨＣＶは、おそらく複数のレベルで、ＩＦＮ系に干渉する。ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達は、ＨＣＶタンパク質を発現する細胞およびトランスジェニックマウス、ならびにＣＨＣを有する患者の肝臓生検において、阻害されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＨＣＶタンパク質のＮＳ５ＡおよびＥ２は、重要な非特異的抗ウイルスタンパク質であるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）と結合して、不活性化する。しかしながら、ＣＨＣを有する患者において治療的に適用されたＩＦＮに対する応答にとって重要である分子機構は、現在知られていない。
【０００６】
ＩＦＮ経路に多くの異なるレベルで干渉するＨＣＶの能力は、ＨＣＶが慢性感染を確立することに成功することの根底にある機構である可能性が高い（２）。しかしながら、全く矛盾したことに、ＨＣＶに急性または慢性感染したチンパンジーにおいて、数百個のＩＳＧが肝臓において誘導されている（１６、１７）。それでもなお、内因性ＩＦＮ系の活性化にもかかわらず、ウイルスは、慢性感染した動物から排除されない（１８）。チンパンジーに関して得られた結果をヒトに当てはめることは難しく、それは、これらの種の間にＨＣＶ感染の病理生物学におけるいくつかの重要な違いがあるからである。ＨＣＶに急性感染したたいていのチンパンジーは、自発的にそのウイルスを排除するが、ヒトにおける感染ではほとんど慢性になる。他方、慢性感染したチンパンジーはめったにＩＦＮで治癒することはあり得ないが、ＣＨＣを有する患者の半分より多くが処置に成功している（１９）。
【０００７】
ＩＳＧの誘導はまた、ＣＨＣを有する多くの患者の処置前の肝臓生検に見出され、このことはＨＣＶ感染が内因性ＩＦＮ系の活性化へと導き得ることをやはり実証している（２０）。特に、ＩＳＧの発現が事前に上昇している患者は、最初の発現が低い患者と比較した場合、治療に対する応答が悪い傾向にあった（２０）。この治療に対する異なる応答の原因はわかっていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、本発明者らが、ｐｅｇＩＦＮαでの治療前と治療中の慢性肝炎の患者の肝臓生検と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のペア試料（paired sample）におけるＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた研究に基づいている。さらに、生化学的データおよび分子データを処置に対する応答に相関づけた。その研究は、添付の実施例でより詳細に述べられている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、肝臓のウイルス感染を有する一部の被験体が、ＩＦＮシグナル伝達経路が活性化ＩＳＧを伴う刺激状態にあるような、「事前活性化」の状態にあることを明らかにした。本発明者らは、そのような個体が、後でＩＦＮおよび抗ウイルス剤で処置された場合、その抗ウイルス処置に対する応答が悪く、または応答がなかったことを見出している。対照的に、感染した被験体の別の群は、ＩＦＮ受容体の事前刺激（およびＩＳＧの刺激）を生じていないように見え、この群は、抗ウイルス治療に対して良く応答した（すなわち、急速ウイルス陰性化（ＲＶＲ）を有した）。さらに、被験体が処置に対する不良応答者であるかどうか、またはいくつかの特定の遺伝子（それらの一部はＩＳＧ遺伝子である）の発現レベルに従ってＲＶＲを有するかどうかを決定することが可能である。換言すれば、本発明者らは、その発現レベルから被験体が抗ウイルス処置に対して応答するかどうかが予測される、予後遺伝子マーカーである１セットの遺伝子を同定した。
【００１０】
これにより、本発明者らは、肝臓のウイルス感染を患っている被験体についての処置レジメンを臨床医が決定するのを助ける方法を開発することができることを理解するに至る。感染個体の遺伝子発現は、対照（すなわち、ウイルス感染のない被験体）の遺伝子発現と比較することができる。
【００１１】
（対照と比較して）変化した遺伝子発現を有する感染被験体は、処置レジメンにおけるＩＦＮの使用から恩恵を受ける可能性が低いであろう（すなわち、これらの個体はＲＶＲを生じないと予想されるであろう）が、対照発現と比較して遺伝子発現がほとんど変化しなかった感染被験体は、ＩＦＮ治療から恩恵を受け、ＲＶＲを有する可能性が高い。当業者は、ＩＳＧの活性化がより良いウイルス排除と関連があり、処置に対して応答が悪い一部の被験体とは関連がないと予想するであろうから、本発明者らはこれらを相関づけてみて驚いた。
【００１２】
肝臓のウイルス感染を有する、「応答者」の被験体および「非応答者」の被験体における遺伝子発現レベルの研究、例えば、Ｃｈｅｎら（２００５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８巻、１４３７〜１４４４ページが以前にあったが、本発明の一部として行われた調査では、どれが予後マーカーとして働くかを決定するためにより非常に広い遺伝子のセットを研究した。さらに、本発明者らはまた、抗ウイルス処置前および処置後に採取された試料における遺伝子発現レベルを分析し、この情報を用いて、予後遺伝子マーカーを同定したが、以前の研究は、処置前に採取された試料に存在する遺伝子発現レベルに処置の転帰を相関づけることを試みただけである。したがって、下記に示された予後遺伝子マーカーの同定に繋がるデータセットは、以前の研究におけるものよりもはるかに完全かつロバスト（robust）であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】肝臓およびＰＢＭＣにおける遺伝子発現のｐｅｇＩＦＮ−α２ｂ誘導性制御を示す図である。
【図２】ＨＣＶ感染患者におけるｐｅｇＩＦＮα２ｂ誘導性遺伝子制御は、ＲＶＲ患者の肝臓と非ＲＶＲ患者の肝臓との間、および肝臓とＰＢＭＣとの間に大きな違いを示すことを表す図である。
【図３】選択されたＩＳＧおよびＰＰ２Ａの触媒サブユニットのＲＴ−ｑＰＣＲ分析を示す図である。
【図４】肝臓生検におけるＪａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の分析を示す図である。
【図５】全ての患者生検試料における遺伝子発現の主なパターンはヒートマップとして示されている。
【図６】分類基準として４週間目での処置に対する応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣにおける教師あり分類予測（supervised classifier prediction）を示す図である。
【図７】肝臓生検におけるリン酸化ＳＴＡＴ１の免疫組織化学的染色の半定量的評価を示す図である（Ａ）。ｐｅｇＩＦＮα２ｂに応答したＳＴＡＴ−ＤＮＡ結合の誘導が、非ＲＲ患者の大部分において障害されることを示す図である（Ｂ）。
【図８】ヒトインターフェロンαのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図９−１】ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図９−２】ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１０−１】ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１０−２】ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１１】ヒトインターフェロン受容体２ｂのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【図１２】ヒトインターフェロン受容体２ｃのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
したがって、本発明の第１の態様において、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）以下の遺伝子群：
（ｉ）ＫＹＮＵ；ＰＡＨ；ＬＯＣ１２９６０７；ＤＤＣ；ＦＯＬＨ１；ＹＢＸ１；ＢＣＨＥ；ＡＣＡＤＬ；ＡＣＳＭ３；ＮＡＲＦ；ＳＬＰＩ；ＲＰＳ５；ＲＰＬ３；ＲＰＬＰ０；ＴＲＩＭ５、およびＨＥＲＣ５；
（ｉｉ）ＨＴＡＴＩＰ２；ＣＤＫ４；ＩＦＩ４４Ｌ；およびＫＬＨＤＣ３；
（ｉｉｉ）Ｃ７；ＩＦ；ＩＦＩ２７；ＩＦＩＴ１；ＯＡＳ２；Ｇ１Ｐ２；ＯＡＳ１；ＩＲＦ７；ＲＳＡＤ２；ＩＦＩ４４；ＯＡＳ３；ＳＩＧＩＲＲ；およびＩＦＩＴ２；
（ｉｖ）ＲＡＢ４Ａ；ＰＰＰ１Ｒ１Ａ；ＰＰＭ１Ｅ；ＥＮＰＰ２；ＣＡＰ２；ＡＤＣＹ１；ＣＡＢＹＲ；ＥＶＩ１；ＰＴＧＦＲＮ；ＴＲＩＭ５５；およびＩＬ２８ＲＡ；
（ｖ）ＭＭＥ；ＫＣＮＮ２；ＳＬＣ１６Ａ１０；ＡＭＯＴＬ１；ＳＰＰ２；ＬＲＣＨ４；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ；ＴＳＰＹＬ５；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ；ＰＨＴＦ１；ＺＮＦ６８４；ＧＳＴＭ５；ＦＬＪ２００３５；ＦＩＳ；ＰＡＲＰ１２；Ｃ１４ｏｒｆ２１；ＰＮＰＴ１；ＦＬＪ３９０５１；ＧＡＬＮＴＬＩ；ＯＳＢＰＬ１Ａ；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＴＸＮＲＤ２；ＬＯＣ２０１７２５、ＴＯＭＭ７；ＳＲＰＸ２；ＤＣＮ；ＰＳＭＡＬ；ＭＩＣＡＬＬ２；ＦＬＪ３００４６；ＳＡＭＤ９；ＡＮＫＲＤ３５；ＬＯＣ２８４０１３；ＬＯＣ４０２５６０；およびＬＯＣ１４７６４６
の各々から少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における前記遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む。
【００１５】
本発明の一実施形態では、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示す。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示す。
【００１７】
本発明の第１の態様において評価された遺伝子のそれぞれに関するさらなる情報は、添付された実施例の表２に提供されている。特に、本発明者らは、遺伝子のそれぞれについてＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ識別番号を与え、それによって、各遺伝子を特定的に同定することができる。
【００１８】
本発明の第１の態様の方法は臨床医にとって非常に有益となることが認識されるだろう。ＩＦＮはタンパク質成長因子であり、ＩＦＮを含む医薬調製物は製造する費用が高い。それゆえに、ＩＦＮが適切かつ費用効率が高い方法で用いられることになると確信することは、臨床医にとって非常に重要である。さらに、費用とは無関係に、できる限り迅速に肝臓のウイルス感染を除去することが望ましいことが多い。それゆえに、臨床医がＩＦＮを投与し、その後、それが有益な効果を生じないことを発見するのは、（代わりの治療を利用するのに費やすことができた）時間を無駄にしている。したがって、本発明の第１の態様の方法は、臨床医が被験体を２つの集団に分類することができるため、その大きな助けとなる。１つの集団は、上記および表２に列挙された遺伝子の変化した発現を示し、したがって、ＩＦＮでの処置から恩恵を受けないであろう。上記および表２に列挙された遺伝子の発現が対照試料と有意には異ならない他方の集団は、ＩＦＮでの治療から恩恵を受けるであろう。
【００１９】
別の実施形態において、（処置から４時間後、異なる形で発現した）表３の遺伝子の発現は同じような方法で用いることができると考えられる。
【００２０】
「抗ウイルス治療」とは、ＩＦＮ活性の刺激を含むウイルス感染を低下させるための任意の処置レジメンを意味する。そのようなレジメンは、Ｉ型ＩＦＮ活性を刺激し、かつ／またはＩＦＮ活性化遺伝子（IFN stimulated gene）（ＩＳＧ）を誘導する化合物の使用を含んでもよい。治療は、ＩＦＮそれ自体または他のＩＦＮ受容体アゴニストでの処置を含んでもよい。例えば、治療は、ペグ化ＩＦＮα（ｐｅｇＩＦＮα）を利用してもよい。
【００２１】
治療はＩＦＮ活性の刺激のみを含んでもよい。しかしながら、本発明者らは、本発明の第１の態様による方法が、既知の抗ウイルス剤と併用したＩＦＮ活性の刺激剤を含む併用療法の使用を含む抗ウイルス治療の有効性を予測するのに特に有用であることを見出している。多くの抗ウイルス剤が当技術分野にとって公知であり、本発明の方法は、いくつかの異なる併用療法の有効性を評価するために用いることができる。しかしながら、本発明者らは、本発明の第１の態様の方法が、抗ウイルス剤リバビリンと併用して用いられるＩＦＮ活性の刺激剤での治療の有効性を予測するのに特に価値があることを見出している。
【００２２】
本発明の第１の態様の方法を、抗ウイルス治療としてのｐｅｇＩＦＮαおよびリバビリンの有用性を予測するために用いることが最も好ましい。
【００２３】
本発明の第１の態様の方法は、Ｂ型肝炎ウイルス感染およびＣ型肝炎ウイルス感染を含む、肝臓のいくつかの異なるウイルス感染の処置の有効性を評価するために用いることができる。その方法をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療の有効性を評価するために利用することが最も好ましい。本発明者らは、本発明の方法を、急速ウイルス陰性化を生じることが予想される被験体（ＲＶＲ）と生じるとは予想されない被験体（非ＲＶＲ）を識別するのに特に有用であることを見出した。
【００２４】
本発明に従って用いることができる被験体における遺伝子発現を表す試料は、被験体によって発現されている遺伝子に関する情報を提供することができる任意の試料を包含する。
【００２５】
適切な試料の例として、生検、外科手術中に切除された試料、血液試料、尿試料、痰試料、脳脊髄液試料、および（唾液スワブ試料などの）スワブ試料が挙げられる。試料の供給源は、被験体が有する可能性があるウイルス感染の型に依存することが認識されているであろう。
【００２６】
試料が肝臓組織由来であることが最も好ましい。肝臓試料は、方法がＨＣＶ感染を有する被験体を評価するために適用される場合、特に有益であることが見出されている。末梢血白血球がＩＦＮへの曝露前または曝露後に遺伝子発現の有意な変化を示さないのに対して、肝臓試料由来の遺伝子発現を分析することによってＲＶＲを非ＲＶＲ被験体と区別することができることを本発明者らは見出して驚いた。
【００２７】
適切な試料として、組織学的切片または凍結切片などの組織切片を挙げることができる。切片の由来する被験体における遺伝子発現を表す情報を提供することができるような方法でそのような切片を調製することができる方法は、当業者によく知られているであろうし、遺伝子発現を調べる場合、用いる予定である技術を参照して選択されるべきである。
【００２８】
被験体由来の組織の一部を含む試料の使用が企図されるが、遺伝子発現を表す試料が、そのような組織から取られた適切な抽出物を含むことが一般的に好ましくあり得、前記抽出物は、被験体における遺伝子発現に関する情報を提供する調査能力がある。被験体における遺伝子発現に関する情報を提供することができる組織抽出物の作製のために用いることができる適切なプロトコールは当業者によく知られているであろう。好ましいプロトコールは、遺伝子発現が調べられることになっている様式を参照して選択することができる。
【００２９】
肝臓由来の試料の場合、適切な調製工程は、実施例の１．１．１および１．１．３に開示されている。
【００３０】
「対照試料」とは、肝臓のウイルス感染に罹っていない個体に由来している、被験体由来の試料に等価の試料を意味する。対照試料を構成する等価の組織もしくは器官の試料、またはそのような試料由来の抽出物は、対照試料における遺伝子発現に関する情報の供給源として直接用いてもよいが、「理想の」対照試料における選択された遺伝子（または複数の遺伝子）の発現に関する情報を参照データの形として提供することができることが認識されているであろうし、一般的に好ましい。そのような参照データは、選択された対照組織における遺伝子発現を示す表の形で提供されてもよい。あるいは、参照データは、選択された対照組織における遺伝子発現を示す検索情報（retrievable information）を含むコンピュータソフトウェアの形で供給されてもよい。例えば、参照データは、被験体における各遺伝子群から選択された少なくとも１つの選択された遺伝子（複数可）の発現の対照組織試料における同じ遺伝子の発現との比較を可能にするアルゴリズムの形で提供されてもよい。
【００３１】
対照試料における上記および表２に列挙された遺伝子の発現が、対照試料を構成する組織または器官の試料の処理によって調べられることになっている場合、そのような処理は、被験体由来の試料を処理するために用いられる同じ方法を用いて行われることが好ましい。被験体試料および対照試料のそのような同等の処理(parallel processing)により、（組織を処理する選択された方法および調査される遺伝子発現に関連したいかなるアーチファクトも被験体試料および対照試料の両方に当てはまるであろうから）これらの組織における遺伝子発現の比較がお互いに対して標準化される信頼度がより大きくなる。
【００３２】
本発明の第１の態様による方法は、各遺伝子群から選択された少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現の分析を含み得る。上記および表２または３に列挙された遺伝子の変化した発現が抗ウイルス治療の有効性を決定するのに用いることができるという知見は驚きであり、これは、（ＳＴＡＴ１をコードする遺伝子などの）特定の遺伝子の発現はＨＣＶ感染と関連づけられていたが、上記および表２に列挙された遺伝子のほとんどは、ＩＦＮ制御型遺伝子発現に、または治療がウイルス感染を処置するのに有効である可能性に関連しているとして同定されることは以前には決してなかったからである。さらに、これらの遺伝子のＩＦＮ活性との関連に関係なく、ＩＳＧの発現の増加が、その後のＩＦＮ処置に対する不良応答と関連することは全く予想されなかった。
【００３３】
本発明者らは、その発現レベルが抗ウイルス治療の転帰(outcome)についての予後マーカーであり得る合計８３個の異なる遺伝子を同定している。これらの遺伝子は、それらの機能に従って以下の５つの異なる群に区分されている：群（ｉ）は細胞代謝に関与していると考えられる；群（ｉｉ）は細胞周期に関与していると考えられる；群（ｉｉｉ）は免疫応答に関与していると考えられる；群（ｉｖ）はシグナル伝達に関与していると考えられる；群（ｖ）はそれぞれ、上記で示されたいかなる特定の群にも割り当てられない。この区分は、各遺伝子群由来の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルが、被験体が抗ウイルス治療に応答性である可能性を決定するために評価される、本発明の方法に示されている。本発明者らはさらに、これらの遺伝子のサブセットが特別の価値を有し、かつそれらの各群の少なくとも１つのメンバーの発現レベルが分析される場合、その目的にとって有効であり得ることを見出している。
【００３４】
本発明の方法は、上記に列挙された少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、または７８個の分析に基づいていることが好ましい。
【００３５】
上記および表２または３に列挙された遺伝子の発現は、試料における遺伝子発現を表す標的分子の分析によって調べることができる。試料における標的分子の存在または非存在は、一般的に、適切なプローブ分子を用いて検出される。そのような検出は、遺伝子発現に関する情報を提供し、それによって、被験体試料に生じている遺伝子発現と対照試料に生じている発現との比較が可能になる。プローブは、一般的に、遺伝子発現を直接、または間接的に表す標的分子に特異的に結合する能力がある。その後、そのようなプローブの結合は、評価され、遺伝子発現と相関づけられて、被験体における遺伝子発現と対照における遺伝子発現との有効な予後比較を可能にする。
【００３６】
「変化した発現」とは、上記で論じられているように、遺伝子発現が、対照と比較したとき、試料において上昇している場合、または低下している場合の両方を含む。
【００３７】
逆に、「変化していない発現」とは、上記で論じられているように、遺伝子発現が、対照と比較したとき、試料において上昇も低下もしていない場合を含む。
【００３８】
遺伝子発現が変化しているか、変化していないかの評価は、日常的な統計解析方法を用いて行うことができる。
【００３９】
標的分子はペプチドまたはポリペプチドであり得る。ペプチドまたはポリペプチドの量は、特異的結合分子、例えば抗体を用いて決定することができる。好ましい例では、試料に存在する特定の標的タンパク質の量は、試料における標的タンパク質の生物活性を参照して評価してもよい。この様式での発現の評価および比較は、酵素活性を有するタンパク質標的の場合、特に適している。試料に存在するタンパク質標的の量の測定の適切な技術として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびウェスタンブロッティングなどのアプタマーおよび抗体に基づいた技術が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
核酸は、本発明の第３の態様による遺伝子発現を評価するための好ましい標的分子を代表する。
【００４１】
本発明の目的のための「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖かまたは二本鎖かのいずれかの形でのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことは理解されているであろう。さらに、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、これらの用語は、天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で機能することができる天然のヌクレオチドの既知の類似体を包含すると解釈されるべきである。
【００４２】
さらに、本発明に従って用いるのに適した標的核酸は、「完全長」核酸（例えば、完全長遺伝子転写産物）を含む必要はなく、プローブ分子の特異的結合を可能にするのに十分な長さを含むことだけを必要とする。
【００４３】
核酸標的分子がｍＲＮＡ遺伝子転写産物およびそのような転写産物の人工産物であることが好ましい。遺伝子転写産物から生じる人工標的分子の好ましい例として、ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡが挙げられ、それらのいずれも、周知のプロトコールまたは市販されているキットもしくは試薬を用いて作製することができる。
【００４４】
本発明の第１の態様の方法の好ましい実施形態において、適切な試料から採取された細胞を溶解するプロセス（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．製などの市販されている溶解緩衝液を用いて達成してもよい）、続いて（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．製のＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉスピンカラムなどの）市販されている核酸分子分離カラムを用いる可溶化液の遠心分離によって、ＲＮＡ標的分子を単離するように試料を処理することができる。ＲＮＡ抽出のための他の方法として、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ， Ｎ．（１９８７） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２巻、１５６ページ、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネート方法のバリエーションが挙げられる。この様式で得られたＲＮＡは、適切な標的分子自体を構成する場合もあり、または遺伝子発現を表す標的分子の産生のための鋳型としての役割を果たす場合もある。
【００４５】
被験体試料または対照試料由来のＲＮＡは、例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて、ｃＤＮＡ合成の基質として用いることが好ましい場合がある。その後、結果として生じたｃＤＮＡを、ＢｉｏＡｒｒａｙ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用いてビオチン化ｃＲＮＡに変換し、このｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ）を用いて反応混合液から精製してもよい。
【００４６】
遺伝子発現を表すｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの抽出または精製の必要性なしに、被験体試料または対照試料由来の組織において直接測定できる。例えば、目的とする被験体試料または対照試料に存在し、かつそれらにおける遺伝子発現を表すｍＲＮＡを、そのような組織の適切に固定された切片または生検を用いて調べてもよい。この種の試料の使用は、発現の比較が行われる迅速性に関して有利である可能性があり、加えて、試料を作製するために用いることができる組織処理が比較的安価で簡単である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術は、この種の組織試料において遺伝子発現を調べかつ比較することができる好ましい方法を代表する。被験体試料または対照試料における遺伝子発現を表すＲＮＡの利用可能性を維持する、目的とする組織の処理のための技術は、当業者には周知である。
【００４７】
しかしながら、被験体試料または対照試料における遺伝子発現を表すｍＲＮＡを抽出し、収集する技術もまた当業者に周知であり、本発明者らは、そのような技術が本発明に従って有利に用いることができることを見出している。被験体試料または対照試料由来の抽出されたｍＲＮＡを含む試料は、本発明の第３の態様の方法に用いるのに好ましい場合があるが、これは、そのような抽出物が、もとの組織を含む試料についての場合より容易に調べられる傾向にあるからである。例えば、遺伝子発現の比較を可能にする適切な標的分子は、被験体由来の組織の試料または対照組織の試料から単離された全ＲＮＡを含んでもよい。
【００４８】
さらに、抽出されたＲＮＡを容易に増幅して、被験体試料または対照試料における遺伝子発現に関する情報の増加を得ることが可能なｍＲＮＡ試料の増大を生じさせることができる。ｍＲＮＡ集団の抽出および増幅の技術の適切な例は周知であり、下記でより詳細に考察されている。
【００４９】
例として、本発明に従って用いるのに適した核酸標的を生じるための核酸の単離および精製の方法は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ１、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）の第３章に詳細に記載されている。
【００５０】
好ましい方法において、全核酸は、実施例に記載された技術を用いて所与の試料から単離してもよい。
【００５１】
遺伝子発現の調査および比較の前に核酸標的を増幅することが望ましい場合、試料の由来する被験体組織または対照組織において増幅された核酸の相対頻度について維持または調節する方法を用いることが好ましい可能性がある。
【００５２】
「定量的」増幅の適切な方法は当業者に周知である。１つのよく知られた例である定量的ＰＣＲは、対照試料と被験体試料との間で量が変化しないことが知られている対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するために用いることができる内部標準を提供する。
【００５３】
上記で概略を述べた方法に加えて、遺伝子転写産物特異的生成物の増幅をシグナルの発生へと結びつける任意のテクノロジーもまた定量化に適し得ることを当業者は認識しているであろう。好ましい例は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの最初の逆転写を組み込むことによって特定のｍＲＮＡ転写産物の正確な定量化に適するようにさせている、ポリメラーゼ連鎖反応（ＵＳ４６８３１９５およびＵＳ４６８３２０２）への便利な改良を採用している。さらなる重要な改良によって、反応が進行する最中のリアルタイムでの蓄積ＰＣＲ産物の測定が可能になる。
【００５４】
多くの場合、関連する試料において（上記および表２に列挙された１つ以上の遺伝子を表す）標的分子の存在を示す能力があるプローブ分子を用いて被験体試料または対照試料における遺伝子発現の程度を評価することが好ましい可能性がある。
【００５５】
本発明の方法で用いるプローブは、調べることになっている遺伝子発現の（直接的または間接的な）産物を参照して選択することができる。適切なプローブの例として、適切な特異性を有するオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、および結合タンパク質または小分子が挙げられる。
【００５６】
オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の方法に従って用いるのに適した好ましいプローブを構成する。適切なオリゴヌクレオチドプローブの作製は当業者に周知である（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４））。オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは多数の会社から市販されている。
【００５７】
本発明の目的のために、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の型の化学結合を通して相補的配列の核酸標的分子へ特異的にハイブリダイズする能力があるオリゴヌクレオチドを含むように選ぶことができる。そのような結合は、通常は相補的塩基対形成を通して、水素結合形成を通して通常行うことができる。適切なオリゴヌクレオチドプローブは、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含んでもよい。加えて、ホスホジエステル結合以外の結合を、このバリエーションがオリゴヌクレオチドプローブのその標的へのハイブリダイゼーションに干渉しない限り、オリゴヌクレオチドプローブ（複数可）中の塩基を連結するのに用いてもよい。したがって、本発明の方法に用いるのに適したオリゴヌクレオチドプローブは、構成物の塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合によって連結されているペプチド核酸であってもよい。
【００５８】
本明細書に用いられる場合、語句「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が（全ての細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなどの）複雑な混合物中に存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブのストリンジェントな条件下での優先的な特定の標的ヌクレオチド配列への結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズを指す。一実施形態において、プローブは特定の標的分子にのみ結合し、二本鎖形成し、またはハイブリダイズすることができる。
【００５９】
用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列へのハイブリダイズが最小限であるような条件を指す。いくつかの実施形態において、プローブは、ストリンジェントな条件下でその標的以外の配列にハイブリダイズすることができない。ストリジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境下では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。
【００６０】
一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択することができる。Ｔｍは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの５０％が標的核酸に平衡状態でハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下における）である。標的核酸は一般的に、過剰に存在するため、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される。例として、ストリンジェントな条件は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で少なくとも約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、温度が少なくとも約３０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成してもよい。
【００６１】
オリゴヌクレオチドプローブは、適切な代表試料において相補的核酸配列（すなわち、核酸標的）を検出するために用いることができる。そのような相補的結合は、オリゴヌクレオチドを、特定の遺伝子の発現を検出し、それによりそれらの比較を可能にするために用いることができる、たいていの技術の基礎を形成する。好ましいテクノロジーは、複数の遺伝子の発現の同時定量化を可能にし、それらには、定量的逆転写ＰＣＲテクノロジーなどの種（species）の増幅と定量化がリアルタイムに連動されているテクノロジー、ならびにアレイテクノロジーなどの増幅された種（species）の定量化を増幅後に行うテクロノジーが挙げられる。
【００６２】
アレイテクノロジーは、各プローブが開示された遺伝子に優先的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、被験体試料または対照試料内の遺伝子発現を表す試料のハイブリダイゼーションを含む。アレイテクノロジーは、例えば、それらの物理的な位置（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．によって商業的に提供されているような２次元アレイにおけるグリッド）、または別のフィーチャー（feature）（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＩｎｃまたはＬｕｍｉｎｅｘ Ｉｎｃによって商業的に提供されているような標識ビーズ）との結合によって、特定のオリゴヌクレオチド配列の一意的な同定を提供する。オリゴヌクレオチドアレイは、（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃによって商業的に提供されているような光照射合成によって）ｉｎ ｓｉｔｕで合成してもよいし、またはあらかじめ形成して、（ＡｇｉｌｅｎｔまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって商業的に提供されているような）接触型テクノロジーもしくはインクジェットテクノロジーによってスポットしてもよい。（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に提供されているように）ｃＤＮＡ配列の全体または部分もまた、アレイテクノロジーのプローブとして機能し得ることは当業者にとって明らかであろう。
【００６３】
オリゴヌクレオチドプローブは、（例えば、遺伝子発現を表すｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ標的分子によって）遺伝子発現を検出および比較するために、サザンブロッティングまたはノーザンブロッティングなどのブロッティング技術に用いることができる。サザンブロッティングまたはノーザンブロッティング技術に用いるのに適した技術および試薬は当業者によく知られているであろう。簡単に述べると、ＤＮＡ（サザンブロッティングの場合）またはＲＮＡ（ノーザンブロッティングの場合）標的分子を含む試料が、アクリルアミドまたはアガロースなどの材料のゲルを浸透するそれらの能力に従って分離される。ゲルの浸透は、毛細管作用または電場の活性によって推進することができる。標的分子の分離が達成されたならば、これらの分子を、（例えば、ベーキングまたは紫外線照射によって）膜に固定化する前に薄膜（典型的にはナイロンまたはニトロセルロース）へ移動させる。その後、遺伝子発現を、膜に結合した標的分子へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって検出および比較することができる。
【００６４】
特定の状況において、遺伝子発現を比較するための伝統的なハイブリダイゼーションプロトコールの使用が問題となる可能性がある。例えば、ブロッティング技術は、おおよそ同じ分子量の２つ以上の遺伝子産物の間を区別することが難しい可能性があり、そのような大きさが同じような産物はゲルを用いて分離することが困難であるためである。したがって、そのような状況においては、下記の技術などの代替技術を用いて遺伝子発現を比較することが好ましい場合がある。
【００６５】
被験体における遺伝子発現を表す試料中の遺伝子発現は、高密度オリゴヌクレオチドアレイテクノロジーを用いて適切な核酸試料内の全体的な転写産物レベルに関して評価してもよい。そのようなテクノロジーは、オリゴヌクレオチドプローブが、例えば共有結合によって、固体支持体に繋ぎ止められているアレイを用いる。固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのこれらのアレイは、遺伝子発現の比較のための本発明の方法およびキットに用いる好ましい構成要素と言える。多数のそのようなプローブをこのように付着させて、上記および表２に列挙された遺伝子から選択された多数の遺伝子の発現の比較に適したアレイを提供することができる。したがって、上記および表２に列挙された各遺伝子群から選択された１つより多い遺伝子の発現を比較することが望ましい本発明の方法の実施形態において、そのようなオリゴヌクレオチドアレイが特に好ましくあり得ることが認識されているであろう。
【００６６】
遺伝子発現を表す核酸標的の比較に用いることができる他の適切な方法として、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）；またはローリングサークルＤＮＡ増幅（ＲＣＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６７】
プローブを容易に検出できるようにプローブを標識することが通常望ましい。本発明に従って用いるのに適したプローブまたは標的の標識化に用いることができる検出可能な部分の例として、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。適切な検出可能な部分として、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、および比色物質が挙げられる。これらの検出可能な部分は、反対であることが示されない限り、本発明の方法に用いることができる全ての型のプローブまたは標的における取込みに適している。
【００６８】
適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質などが挙げられる；発光物質の例として、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；適切な放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、または３２Ｐが挙げられる；適切な比色物質の例として、コロイド金、または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。
【００６９】
そのような標識を検出する手段は当業者に周知である。例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出することができる；蛍光マーカーは、放射された光を検出する光検出器を用いて検出することができる。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与え、酵素の基質への作用によって生じる反応生成物を検出することによって検出することができ、比色標識は、着色した標識を単純に可視化することによって検出される。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態において、蛍光標識プローブまたは標的を、レーザー共焦点スキャナを用いて、スキャンして蛍光検出してもよい。
【００７１】
標識核酸プローブまたは標的の場合、適切な標識化を行うのは、ハイブリダイゼーションの前でもハイブリダイゼーション中でもハイブリダイゼーションの後でもよい。好ましい実施形態において、本発明の方法に用いる核酸プローブまたは標的は、ハイブリダイゼーションの前に標識される。蛍光標識が特に好ましく、それが用いられる場合、核酸プローブのそれらの核酸標的へのハイブリダイゼーションの定量化は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量化による。定量化は、核酸に取り込まれたハプテンと結合する蛍光標識試薬からでもよい。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションの分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）などの適切な分析ソフトウェアを用いて達成することができる。
【００７３】
有効な定量化は、アレイの自動スキャニングを可能にする自動ステージを装着することができ、かつ蛍光強度情報の自動化された測定、記録、およびその後の処理のためのデータ収集システムを装備することができる蛍光顕微鏡を用いて達成してもよい。そのような自動化のための適切な配置は通常のことであり、当業者に周知である。
【００７４】
好ましい実施形態において、ハイブリダイズした核酸は、核酸に付着した１つ以上の検出可能な部分を検出することによって検出される。検出可能な部分は、当業者に周知のいくつかの手段のいずれかによって取り込むことができる。しかしながら、好ましい実施形態において、そのような部分は、試料核酸（プローブまたは標的）の調製における増幅工程中に同時に取り込まれる。したがって、例えば、検出可能な部分で標識されたプライマーまたはヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記部分で標識された増幅産物が供給されるであろう。好ましい実施形態において、蛍光標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いる転写増幅は、転写された核酸へ標識を組み込む。
【００７５】
あるいは、適切な検出可能な部分は、もとの核酸試料（例えば、目的とする組織由来のｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に、またはもとの核酸の増幅が完了した後の増幅産物に直接付加してもよい。蛍光標識などの標識を核酸に付着させる手段は当業者によく知られており、例えば、ニックトランスレーション、または核酸のリン酸化（kinasing）、続いての、試料核酸に（適切なフルオロフォアなどの）標識を連結する核酸リンカーの付着（ライゲーション）による（例えば、標識ＲＮＡでの）末端標識が挙げられる。
【００７６】
本発明の第１の態様の方法はヒト被験体に関連して用いるのに最も適しているが、それはまた、非ヒト動物（例えば、ウマ、イヌ、ネコ）においてウイルス感染の治療コースを決定するのにも有用であり得ることは理解されているであろう。
【００７７】
本発明の別の方法は、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法を含み、その方法は
（ａ）下記の表３に列挙された遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む。
【００７８】
本方法の一実施形態において、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示している。
【００７９】
本方法の別の実施形態において、対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示している。
【００８０】
本発明のこの態様を実施するために用いる技術は、本発明の第１の態様に関連して上記に提供されている。特定の遺伝子は異なるが、当業者は、この方法に従って評価されるべき標的分子を同定することも、用いることができる特異的結合作用物質を同定することも理解し、それを行うことができるであろう。
【００８１】
本発明者らは、ＩＦＮ処置に良く応答する感染被験体と応答しない感染被験体との違いを調べる研究を拡大し、ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達を調査した。
【００８２】
ＩＦＮはインターフェロン受容体に結合し、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化する。この活性化における中心的事象は、ＳＴＡＴ１のリン酸化である。本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂで処置された場合、たいていの被験体において、ＳＴＡＴ１リン酸化が誘導されることを見出した。しかしながら、ＳＴＡＴ１リン酸化と、抗ウイルス治療における被験体のＩＦＮ処置に対する応答性との間に相関はないように思われた。しかしながら、本発明者らは、試料内を調べると、ＳＴＡＴ１の位置に関して応答者と非応答者に違いがあることを見出して驚いた。ＳＴＡＴ１は、核へ移行し、ＩＳＧのプロモーター内の特定の応答エレメントに二量体として結合することが知られている。全ての急速応答型被験体は、ｐｅｇＩＦＮα２ｂでの処置後、ＳＴＡＴ１位置にＩＦＮ誘導性シフトを生じた。対照的に、非応答型被験体（すなわち、事前に活性化されたＩＦＮシグナル伝達を有する被験体）は、検出可能なＳＴＡＴ１シフトを生じなかった；むしろ、肝細胞の大部分はすでにかなりの核染色を有した。
【００８３】
したがって、本発明の第２の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法が提供され、その方法は、被験体由来の試料を調べて、ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定する工程を含む。
【００８４】
添付の実施例に示されているように、本発明者らは、肝臓細胞におけるＳＴＡＴ１の位置が、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対する被験体の応答性についての予後マーカーであることを決定している。そのデータにおいて、非ＲＶＲ被験体（すなわち、抗ウイルス治療に対して非応答者）から採取された肝臓試料中の肝細胞の大部分が、抗ウイルス治療の前にすでにＳＴＡＴ１のかなりの核染色を有したのに対して、ＲＶＲ被験体由来の肝臓試料中の肝細胞は最小の核染色を有するだけであることが示されている。この全く予想されなかった知見は、当技術分野において開示も示唆もされていない。
【００８５】
したがって、肝臓試料中の肝細胞の大部分がＳＴＡＴ１についての核染色を有する場合には、その被験体は、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して非応答性である可能性が高い。逆に、肝臓試料中の最小数の肝細胞がＳＴＡＴ１についての核染色を有する場合には、インターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高い。
【００８６】
いくつかの実施形態において、試料は肝臓試料である。またいくつかの実施形態において、方法は、肝細胞におけるＳＴＡＴ１の細胞内位置を調べる。
【００８７】
肝臓試料においてＳＴＡＴ１タンパク質の位置を決定するための方法は当技術分野において日常的である。そのような方法の例は、市販されている抗ＳＴＡＴ抗体または他の特異的結合実体を用いる標準免疫組織化学法である。添付された実施例は、肝臓試料においてＳＴＡＴ１タンパク質の位置を決定するための詳細な方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法において調べられるＳＴＡＴ１タンパク質は、リン酸化ＳＴＡＴ１である。
【００８８】
「被験体」とは、本発明の第１の態様に関して上記で定義された被験体を含む。いくつかの実施形態において、被験体はヒトである。
【００８９】
上記で示されているように、本発明は、ｐｅｇＩＦＮαでの治療前および治療中に慢性肝炎を有する患者の肝臓生検と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のペア試料において本発明者らがＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた研究に基づいている；これは添付された実施例でより詳細に記載されている。
【００９０】
本発明者らは、内因性ＩＦＮ系が多くの感染患者において常に活性化されていることを明らかにした。さらに、本発明者らは、事前に活性化されたＩＦＮ系を有する患者をＩＦＮ治療に対する不良応答と相関づけて驚いた。この知見は、直観と相容れないことであり、なぜなら、能動先天免疫系はＩＦＮα治療中にウイルスを排除するように助けると予想されるからである。
【００９１】
本発明者らは、肝臓生検においてＩＳＧ発現を分析し、ＨＣＶが驚くべきことに内因性ＩＦＮ系を誘導する（遮断しない）患者もあれば、ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導しない（ＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆを切断することによる可能性がある）患者もあるのだが、この違いが慢性感染を維持するＨＣＶの能力に全く影響を及ぼさないことをさらに結論づけた。
【００９２】
ＩＦＮ系を事前に活性化しない患者において、本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂが４時間以内に肝臓において多くのＩＳＧのロバストな（亜）最大上方制御（robust (sub-) maximal up-regulation）を誘導することを見出した。驚くべきことに、そのような高ＩＳＧ発現レベルは、後になって４週間目で急速ウイルス陰性化を示さない患者の処置前生検にすでに存在していた。
【００９３】
内因性ＩＦＮ系の事前活性化は、ＨＣＶ遺伝子型１（および４）に感染した患者の肝臓生検において、遺伝子型２または３に感染した患者のものよりも頻繁に見られることも見出した。これは興味そそることであり、なぜなら、遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１を有する患者の５０％未満と比較して、患者の８０％を超えて治癒し得ることはよく知られているからである。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度がＨＣＶ遺伝子型に依存するという本発明者らの知見によって、ＨＣＶ遺伝子型の異なる処置感受性について説明がつく。
【００９４】
本発明者らは、これらのデータから、ＨＣＶがＩＦＮシグナル伝達に干渉し、それによって治療に対する応答を障害することが明らかにされることを理解した。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害は、なぜ内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化がＨＣＶの自発的排除をもたらさないのかを説明している。本発明者らはいかなる仮説によっても縛られるつもりはないが、ＩＦＮαがＨＣＶに感染している肝細胞において抗ウイルス状態を誘導しないことをこれが意味すると考える。多くの患者の肝臓で観察されるＩＳＧの上方制御は、その後、非感染肝細胞においてのみ起こるであろう。肝臓生検に見出されるＩＳＧの強い誘導は、そのようなモデルと矛盾せず、なぜなら、感染肝細胞より非感染肝細胞が多くあるからである。ＩＦＮβ産生は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦの切断に成功していないウイルスに感染した肝細胞に生じるであろう。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導性阻害のため、分泌されたＩＦＮβは、これらの感染した肝細胞において抗ウイルス状態を誘導せずに、感染していない隣接細胞においてのみ誘導するであろう。
【００９５】
本発明者らは、ＨＣＶと免疫系との間の相互作用の新しい理解は、ＨＣＶ感染などのウイルス感染についての処置レジメンの計画および選択に大いに関連性があることを理解した。したがって、ウイルス感染を処置する新規な手段を提供することが本発明の特定の実施形態の目的である。
【００９６】
本発明の第３の態様によれば、肝臓のウイルス感染の予防または処置のためのＩＦＮ系の活性化を低下させる作用物質の使用が提供される。
【００９７】
本発明の第４の態様によれば、肝臓のウイルス感染の予防または処置のための薬物の製造におけるＩＦＮ系の活性化を低下させる作用物質が提供される。
【００９８】
上記および実施例で説明したように、本発明者らは、ウイルス感染を有する一部の被験体がＩＦＮ系の活性化（および関連したＩＳＧの上方制御）を生じ、これがその後のＩＦＮでの抗ウイルス治療に対する不良応答に関連していると理解している。これは、そのような事前活性化を防ぐ、本発明の第３または第４の態様による作用物質が、ＩＦＮ経路の活性を低下させるのに有用であり、かつＩＦＮを利用するその後の抗ウイルス治療に対してより良く応答するように被験体を有効に「プライム」することの理解へと導く。当業者は被験体におけるＩＦＮ活性の増加がより良いウイルス排除(viral clearance)と関連しており、処置に対して応答が悪い被験体の一部とは関連していないと予想したであろうから、本発明者らはこれらの相関づけを行って驚いた。
【００９９】
したがって、本発明の第３または第４の態様に従って用いられる作用物質を、（非感染対照の被験体と比較して）ＩＦＮ系の活性化の増加も生じているウイルス感染を有する被験体を処置するために用いることが好ましい。
【０１００】
「低下させる」とは、ＩＳＧの発現レベルが対照組織における発現レベルと有意には異ならないようにＩＳＧの刺激を低下させるのに作用物質が有効であることを意味する。
【０１０１】
作用物質は、Ｂ型肝炎ウイルス感染およびＣ型肝炎ウイルス感染を含む、肝臓のいくつかの異なるウイルス感染の処置に用いることができる。作用物質は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防し、または低下させるために用いられることが最も好ましい。
【０１０２】
本発明に従って用いることができる作用物質の例として、作用物質がＩＦＮαポリペプチドに結合し、ＩＦＮ機能活性を阻止することができる場合、例えば、抗体ならびにそれらの断片および誘導体（例えば、ドメイン抗体またはＦａｂ）が挙げられる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮα受容体（例えば、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２ａ、ＩＦＮＡＲ２ｂ、またはＩＦＮＡＲ２ｃ）においてアンタゴニストとして作用することによってＩＦＮ系に対する競合的阻害剤として作用することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮ経路における酵素または他の分子を阻害することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮαポリペプチドをコードするｍＲＮＡへ、そのｍＲＮＡの減少、およびそれに従って、ＩＦＮαポリペプチドの減少をもたらすような様式で結合することができる。あるいは、作用物質は、ＩＦＮαをコードする核酸配列へ、それがＩＦＮαポリペプチドをコードする転写されるｍＲＮＡの量の低下をもたらすような様式で結合することができる。例えば、作用物質は、ＩＦＮα遺伝子のコード領域もしくは非コード領域へ、またはＩＦＮのＤＮＡ５’もしくは３’へ結合し、それによってそのタンパク質の発現を低下させることができる。
【０１０３】
本発明の第３または第４の態様の作用物質が、ＩＦＮαポリペプチド、ＩＦＮα受容体、またはＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸に結合することが好ましい。
【０１０４】
いくつかの異なるヒトインターフェロンαポリペプチド配列がある。これらの配列のアラインメントは図８に示されている。このアラインメントから、以下のコンセンサス配列が決定されている。この情報を当業者が用いてＩＦＮαポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１０５】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドに結合する場合、作用物質が、天然型へと正しく折り畳まれているタンパク質によって規定されるエピトープに結合することが好ましい。種間およびまた遺伝子型間にいくつかの配列変動性があり得ることは認識されているであろう。したがって、他の好ましいエピトープは、遺伝子の変異体由来の等価の領域を含む。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の等価の領域は、上記の本発明の第１の態様に概要を示しているように、配列類似性と同一性のツール、およびデータベース検索方法を用いて同定することができる。
【０１０６】
作用物質がＩＦＮαポリペプチドの保存領域またはその断片に結合することが最も好ましい。図８におけるＩＦＮαポリペプチド配列のアラインメントからわかるように、異なるポリペプチド間で保存されているいくつかのアミノ酸配列領域がある。そのような保存領域の例は、その図に示された「コンセンサス」配列の位置１６１〜１７４であると考えられる。
【０１０７】
そのような領域に結合する作用物質は、ＩＦＮα活性に特に劇的な効果を生じ、それゆえにＩＦＮ系の事前活性化を阻止し、それによって抗ウイルス治療を受ける被験体からのＨＣＶの排除を向上させるのに特に効果がある。
【０１０８】
作用物質がＩＦＮ受容体に結合する場合、作用物質がＩＦＮ受容体に結合し、ＩＦＮαのＩＦＮ受容体への結合を阻害することが好ましい。
【０１０９】
いくつかの異なるインターフェロン受容体がある。これらのアミノ酸配列は図９に示されている。この情報を当業者が用いて、ＩＦＮ受容体ポリペプチドに対する結合作用物質を開発することができる。
【０１１０】
作用物質が、天然型へと正しく折り畳まれているＩＦＮ受容体タンパク質によって規定される受容体上のエピトープに結合することが好ましい。種間およびまた遺伝子型間にいくつかの配列変動性があり得ることは認識されているであろう。したがって、他の好ましいエピトープは、受容体遺伝子の変異体由来の等価の領域を含む。さらなるＩＦＮポリペプチド由来の等価の領域は、上記の本発明の第１の態様に概要を示しているように、配列類似性と同一性のツール、およびデータベース検索方法を用いて同定することができる。
【０１１１】
本発明の第３または第４の態様の実施形態において、作用物質は抗体またはその断片である。
【０１１２】
ポリペプチド活性を調節するための作用物質としての抗体の使用はよく知られている。実際に、抗体に基づいた治療剤は、ますます薬に用いられつつある。上記で示したように、本発明者らは、抗体を用いて、ＩＦＮ系をそれに結合することによって中和することができ、またはＩＦＮ受容体の阻害剤として作用することができることを理解した。したがって、そのような作用物質が、ＨＣＶ感染の処置を向上させるための薬剤として大きな有用性があることは明らかである。さらに、そのような抗体は、上記の本発明のさらなる態様に示された予後的方法に用いることができる。
【０１１３】
ヒト被験体を処置するのに用いる抗体は、
（ａ）ＩＦＮαポリペプチドそれ自体もしくはＩＦＮαポリペプチド由来のいくつかのペプチド、またはＩＦＮαポリペプチドに見出されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチド；または
（ｂ）ＩＦＮ受容体もしくはＩＦＮ受容体由来のいくつかのペプチド、またはＩＦＮ受容体に見出されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むペプチド
に対して産生することができる。
【０１１４】
抗体は、ヒトＩＦＮαポリペプチド、ヒトＩＦＮ受容体、ならびにそれらのペプチド誘導体および断片由来の抗原構造に対して産生されることが好ましい。
【０１１５】
抗体は、抗原を動物へ注入することによってポリクローナル血清として産生してもよい。好ましいポリクローナル抗体は、当技術分野に公知の技術を用いて動物（例えば、ウサギ）に抗原（ＩＦＮαポリペプチドの全部または断片）を接種することによって産生することができる。
【０１１６】
あるいは、抗体は、モノクローナルであってもよい。通常のハイブリドーマ技術は、そのような抗体を産生するために用いることができる。本発明に用いるモノクローナル抗体を作製するために用いられる抗原は、ポリクローナル血清を作製するために用いられるのと同じであってもよい。
【０１１７】
最も単純な形において、抗体または免疫グロブリンタンパク質は、γ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）クラスの抗体によって通常例示されるＹ形分子である。分子は、それぞれ約５０ｋＤと２５ｋＤの２つの同一の重（Ｈ）鎖と２つの同一の軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖からなる。各軽鎖は、ジスルフィド結合および非共有結合によって重鎖に結合している（Ｈ−Ｌ）。２つの同一のＨ−Ｌ鎖組合せは、２つのＨ鎖間の同様の非共有結合およびジスルフィド結合によってお互いに連結され、基本的な４つの鎖の免疫グロブリン構造（Ｈ−Ｌ）２を形成している。
【０１１８】
軽鎖免疫グロブリンは、１つのＶドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成され、一方、重鎖は、１つのＶドメイン、およびＨ鎖アイソタイプに依存して、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）からなる。
【０１１９】
各軽鎖または重鎖のＮ末端領域には、配列の点で大きく異なり、かつ抗原への特異的結合に関与する可変（Ｖ）ドメインがある。抗原についての抗体特異性は、実際には、超可変ループまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られたＶ領域内のアミノ酸配列によって決定される。各Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域は、３つのそのようなＣＤＲを有し、抗体の抗原結合部位を形成するのが、全６つの組合せである。あまり変異を示さず、かつ超可変ループを支える残りのＶ領域アミノ酸は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【０１２０】
可変ドメインを超えた領域（Ｃドメイン）は、配列の点では比較的不変である。本発明による抗体の特徴的なフィーチャー（characterising feature）は、ＶＨおよびＶＬのドメインであることが認識されているであろう。ＣＨドメインおよびＣＬドメインの正確な性質は、全体的に見ると、本発明にとって重大な意味をもたないことがさらに認識されているであろう。実際、本発明に用いる好ましい抗体は、非常に異なるＣＨドメインおよびＣＬドメインを有してもよい。さらに、下記でより十分に論じているように、好ましい抗体機能性誘導体は、Ｃドメインなしで可変ドメインを含んでもよい（例えば、ｓｃＦｖ抗体）。
【０１２１】
本発明の第３または第４の態様による作用物質であると考えられる好ましい抗体は、ＶＬドメイン（第１ドメイン）およびＶＨドメイン（第２ドメイン）を有してもよい。それらの誘導体は、７５％配列同一性、例えば、９０％配列同一性、または少なくとも９５％配列同一性を有し得る。ほとんどの配列変異はフレームワーク領域（ＦＲ）に生じてもよいが、抗体およびそれらの機能性誘導体のＣＤＲの配列はほとんど保存されているべきである。
【０１２２】
本発明の第３または第４の態様の作用物質のいくつかの好ましい実施形態は、可変ドメインと定常ドメインの両方を有する分子に関する。しかしながら、本質的に、少しの定常領域も含まず、抗体の可変領域を含む抗体断片（例えば、ｓｃＦＶ抗体またはＦＡｂ）もまた、本発明に包含されることが認識される。
【０１２３】
本発明の第３または第４の態様の作用物質であると考えられるｓｃＦＶ抗体断片は、ＩＦＮポリペプチドに対して産生された抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインの全体を含んでもよい。ＶＨドメインとＶＬドメインは、適切なリンカーペプチドによって分離していてもよい。
【０１２４】
１つの種において作製された抗体、特にｍＡｂは、異なる種を処置するのに用いられる場合、いくつかの重篤な欠点を有することが知られている。例えば、マウス抗体がヒトに用いられる場合、それらは、血清中循環半減期が短い傾向にあり、処置されることになっている患者の免疫系によって外来タンパク質として認識され得る。これは、望ましくないヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の発生を引き起こす可能性がある。これは、抗体の頻繁な投与が必要とされる場合、それが抗体の排除を促進し、その治療効果を遮断し、過敏症反応を誘発し得るため、特に問題となる。これらの因子は、ヒト治療におけるマウスモノクローナル抗体の使用を制限し、ヒト化抗体を作製する抗体操作テクノロジーの開発を促している。
【０１２５】
それゆえに、ＩＦＮ活性を低下させる能力がある抗体が、ヒト被験体においてＨＣＶ感染を処置するための治療剤として用いられることになっている場合、非ヒト源の抗体およびそれらの断片はヒト化されることが好ましい。
【０１２６】
ヒト化は、（例えば、非ヒトハイブリドーマで作製されたモノクローナル抗体由来の）Ｖ領域配列をヒト抗体由来のＣ領域（および理想的には、Ｖ領域由来のＦＲ）配列とスプライシングすることによって達成することができる。その結果として生じた「操作された」抗体は、それらが由来している非ヒト抗体よりもヒトにおいて免疫原性が少なく、それゆえ、臨床用途により良く適している。
【０１２７】
ヒト化抗体は、組換えＤＮＡテクロノジーを用いて齧歯類免疫グロブリン定常領域がヒト抗体の定常領域に置き換えられているキメラモノクローナル抗体であってもよい。その後、キメラＨ鎖およびＬ鎖遺伝子は、適切な制御エレメントを含む発現ベクターへクローン化し、完全にグリコシル化された抗体を産生するために哺乳類細胞へ導入することができる。このプロセスのために適切なヒトＨ鎖Ｃ領域遺伝子を選択することによって、抗体の生物活性をあらかじめ決定することができる。そのようなキメラ抗体は、本発明に従って癌を処置または予防するために用いることができる。
【０１２８】
抗体のさらなるヒト化は、抗体のＣＤＲグラフトまたは再形成（reshaping）を含めてもよい。そのような抗体は、（抗体の抗原結合部位を形成する）非ヒト抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲをヒト抗体の対応するフレームワーク領域へ移植することによって作製される。
【０１２９】
ヒト化抗体断片は、本発明に従って用いる好ましい作用物質と言える。ＩＦＮαポリペプチドまたはＩＦＮ受容体上のエピトープを認識するヒトＦＡｂは、可変鎖ヒト抗体のファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。（例えば、ＭｏｒｐｈｏｓｙｓまたはＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって開発されたような）当技術分野に公知の技術を用いて、本発明による作用物質として用いることができるＦａｂを作製することができる。簡単に述べると、ヒトコンビナトリアルＦａｂ抗体ライブラリーは、一本鎖Ｆｖライブラリー由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をＦａｂディスプレイベクターへ移入することによって作製することができる。このライブラリーは、２．１×１０１０個の異なる抗体断片を生じ得る。その後、ペプチドは、所望の結合性質を有する抗体断片をライブラリーから同定するための「ベイト（bait）」として用いることができる。
【０１３０】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、本発明のこの実施形態に従って用いることができるもう１つの好ましい作用物質と言える。ｄＡｂは、抗体の最小の機能性結合単位であり、ヒト抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に対応する。そのようなｄＡｂは、約１３ｋＤａ（完全抗体のサイズの約１／１０（またはそれ未満）に相当）の分子量を有し得る。
【０１３１】
本発明の第３および第４の態様の別の実施形態によれば、ペプチドはＩＦＮαポリペプチド活性を低下させるために用いることができる。そのようなペプチドは、本発明に従って用いる他の好ましい作用物質と言える。これらのペプチドは、例えば、ペプチドのライブラリーから、ライブラリーのどのメンバーがＩＦＮαポリペプチドの活性または発現を低下させることができるかを同定することによって単離することができる。適切なライブラリーは、ファージディスプレイ技術を用いて作製することができる。
【０１３２】
アプタマーは、本発明の第３または第４の態様のもう１つの好ましい作用物質と言える。アプタマーは、特定の配列依存的形をとり、アプタマーとリガンドの間の鍵と鍵穴の適合に基づいた特異的な標的リガンドに結合する核酸分子である。典型的には、アプタマーは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）、または一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）のいずれかを含み得る。アプタマーは、核酸標的および非核酸標的のどちらと結合するのにも用いることができる。したがって、ＩＦＮαを認識し、その活性または発現を低下させるアプタマーを作製することができる。適切なアプタマーは、ランダム配列プールから選択してもよく、そこから、選択された標的分子に高親和性で結合する特異的なアプタマーを同定することができる。
【０１３３】
所望の特異性を有するアプタマーの作製および選択のための方法は、当業者によく知られており、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮（exponential enrichment）によるリガンドの系統的進化法（systematic evolution））プロセスが挙げられる。簡単に述べると、オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択の反復プロセスによって大量の機能性核酸の単離、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を可能にする。
【０１３４】
アンチセンス分子は、本発明の第３または第４の態様に従って用いるもう１つの好ましい作用物質と言える。アンチセンス分子は、典型的には、一本鎖核酸であり、遺伝子によって産生された相補的核酸配列に特異的に結合し、それを不活性化し、有効にその遺伝子を「オフ」にすることができる。当業者は認識していることであるが、その分子は、それが、「センス」配列と呼ばれる遺伝子のｍＲＮＡに相補的であるため、「アンチセンス」と名付けられている。アンチセンス分子は、典型的には、長さが１５〜３５塩基のＤＮＡ、ＲＮＡ、または化学的類似体である。アンチセンス核酸は、特定の遺伝子のｍＲＮＡに結合し、その発現を阻止するために実験的に用いられている。これは、癌、糖尿病、および炎症性疾患の処置のための薬物として「アンチセンス治療」の開発に繋がっている。アンチセンス薬物は、ヒト治療的使用としてＵＳ ＦＤＡによって最近、認可された。したがって、ＩＦＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子を設計することによって、細胞におけるＩＦＮαポリペプチドの発現を低下させ、それによって、ＩＦＮα活性を低下させ、ＨＣＶ感染に見られる事前活性化を低下させることが可能であろう。ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、図８に提供されている。
【０１３５】
ときに短い干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られている、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明の第３または第４の態様に従って用いるさらなる好ましい作用物質と言える。上記で示されているように、本発明者らは、ＩＦＮ系の事前活性化が抗ウイルス治療に対する抵抗性と関連していることを理解した。したがって、ＩＦＮα発現を低下させることができるｓｉＲＮＡ分子は、ＨＣＶ感染の処置のための薬剤の調製において大きな有用性があることは明らかである。２０〜２５ヌクレオチド長クラスのＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経路（ＲＮＡｉ）に関与し、それによって、ｓｉＲＮＡは特定の遺伝子の発現の低下を引き起こすことができ、または具体的には、そのようなｍＲＮＡの翻訳に干渉し、それによって、そのｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の発現を阻害することができる。ｓｉＲＮＡは、いずれかの末端上に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する短い（通常、２１ヌクレオチド）二本鎖のＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）という、詳細に明らかにされた構造を有する。各鎖は、５’リン酸基および３’ヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでこの構造は、長いｄｓＲＮＡかまたはヘアピンＲＮＡのいずれかをｓｉＲＮＡへ変換する酵素であるダイサーによるプロセシングの結果である。ｓｉＲＮＡはまた、様々なトランスフェクション方法によって外因的に（人為的に）細胞に導入し、目的とする遺伝子の特異的ノックダウンを引き起こすことができる。本質的に、配列が知られているいかなる遺伝子もこのように、適切に合わせて作製されたｓｉＲＮＡ（tailored siRNA）との配列相補性に基づいて標的にすることができる。目的とする本質的にいかなる遺伝子もノックダウンする能力を考えると、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉは、基本生物学および応用生物学の両方において大きな関心を生み出している。様々な生物学的経路における重要な遺伝子を同定するように設計される大規模ＲＮＡｉスクリーニングの数が増加している。疾患プロセスもまた多数の遺伝子の活性に依存しているため、いくつかの状況において、遺伝子の活性をｓｉＲＮＡでオフにすることは治療的利益を生じ得ることは予想される。したがって、それらの知見は、生物医学研究および薬物開発のためにＲＮＡｉを利用することへの関心の高まりを引き起こしている。治療的ＲＮＡｉ治験の最近の第Ｉ相の結果により、ｓｉＲＮＡが耐容性が良く、かつ適切な薬物動態学的性質を有することが実証されている。したがって、ｓｉＲＮＡおよび関連のＲＮＡｉ導入方法は、予見できる将来において重要な新しいクラスの薬物になりそうな気配である。ＩＦＮαポリペプチドをコードする核酸へと設計されたｓｉＲＮＡ分子は、ＩＦＮαの発現を低下させ、それに従って、ＩＦＮ系の事前活性化の低下をもたらすために用いることができる。したがって、本発明のこの態様の実施形態において、作用物質はＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補的配列を有するｓｉＲＮＡ分子である。
【０１３６】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は図８に提供されている。
【０１３７】
そのような情報を用いて、ＩＦＮαポリヌクレオチドに対する相補的配列を有するｓｉＲＮＡ分子を設計することは、単純で、かつ十分当業者が対応できる範囲内である。例えば、簡単なインターネット検索によって、ｓｉＲＮＡ分子を設計するために用いることができる多数のウェブサイトが得られる。
【０１３８】
「ｓｉＲＮＡ分子」とは、ｓｉＲＮＡ分子を構成するその２つの一本鎖ＲＮＡのそれぞれに加えて、二本鎖の２０〜２５ヌクレオチド長ＲＮＡ分子も含む。
【０１３９】
ｓｉＲＮＡはヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の形で用いられることが最も好ましい。そのようなｓｈＲＮＡは、（例えば、約９ヌクレオチドの）スペーサー配列によって連結される２つの相補的ｓｉＲＮＡ分子を含み得る。相補的ｓｉＲＮＡ分子は、それらが共に結合するように折り畳み得る。
【０１４０】
ＩＦＮαポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを切断する能力があるリボザイムは、本発明の第３または第４の態様のもう１つの好ましい作用物質と言える。
【０１４１】
本発明の第３または第４の態様の作用物質は、処置されることになっている被験体においてＩＦＮ系の活性化を低下させることができるが、被験体に与えられたその後の抗ウイルス治療の活性を低下させることはできないことが好ましい。
【０１４２】
例えば、本発明の第３または第４の態様の作用物質が抗体またはその断片である場合、作用物質は、内因性ＩＦＮαポリペプチドと結合し、その活性を低下させることができるが、外因的に供給されたＩＦＮαポリペプチドについてはできないことが好ましい。当技術分野において日常的な方法、および本発明のこの態様においてあらかじめ提供される情報を用いて、そのような抗体を得ることは可能である。
【０１４３】
本発明により必要とされる作用物質の量は、生物活性および生物学的利用率によって決定され、それらがまた投与様式および作用物質の物理化学的性質に依存している。投与頻度もまた、上記の因子、および特に、標的組織または処置されることになっている被験体内での作用物質の半減期によって影響されるであろう。
【０１４４】
製薬産業に通常利用されるものなどの公知の手順（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実験、臨床試験など）を用いて、作用物質の特定の製剤および正確な（１日用量および投与頻度などの）治療レジメンを確立することができる。
【０１４５】
一般的に、作用物質の０．０１μｇ／ｋｇ体重〜０．１ｇ／ｋｇ体重の１日用量が、ＨＣＶ感染を処置するための処置レジメンに用いることができる；例えば、１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４６】
例として、本発明による抗体の適切な用量は、１０μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、いくつかの実施形態においては、約６ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４７】
１日用量は単回投与（例えば、単回の連日注射または吸入器からの単一用量）として与えてもよい。あるいは、作用物質（例えば、抗体またはアプタマー）は１日に２回またはそれ以上の回数での投与を必要とする場合もある。
【０１４８】
本発明による薬剤は、治療有効量の作用物質および医薬的に許容されるビヒクルを含むべきである。
【０１４９】
「治療有効量」は、被験体に投与された場合、癌の増殖または転移を阻害または予防する、本発明による作用物質の任意の量である。
【０１５０】
「被験体」は、脊椎動物、哺乳動物、家畜、またはヒトであってもよい。処置されることになっている被験体はヒトであることが好ましい。この場合、作用物質は、ヒト治療に最も適しているように設計してもよい（例えば、上記で論じられているように、抗体のヒト化）。しかしながら、獣医学で目的とする他の動物（例えば、ウマ、イヌ、またはネコ）を処置するために作用物質を用いてもよいことは理解され得ることであろう。
【０１５１】
本明細書で言及される場合、「医薬的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物を製剤化するのに有用であるとして当業者に知られている任意の生理学的ビヒクルである。
【０１５２】
一実施形態において、薬剤は、約０．０１μｇ〜０．５ｇの作用物質を含んでもよい。組成物における作用物質の量は、０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、例えば、約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、または約１ｍｇ〜１０ｍｇであり得る。したがって、組成物は、約２ｍｇ〜５ｍｇの作用物質を含み得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜９０％（ｗ／ｗ）の作用物質、いくつかの実施形態においては、１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）を含む。組成物の残りの部分はビヒクルを含んでもよい。
【０１５４】
核酸作用物質は、リポソーム内への取込みによって被験体に送達することができる。あるいは、「裸の」ＤＮＡ分子を、適切な手段、例えば、直接的エンドサイトーシス摂取によって被験体の細胞へ挿入してもよい。核酸分子は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合、または弾道的衝撃（ballistic bombardment）によって、処置されることになっている被験体の細胞へ導入することができる。例えば、導入(transfer)は、コーティングされた金粒子での弾道的トランスフェクション、ＤＮＡ分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）、およびＤＮＡ分子の標的組織へ直接の局所適用または注射による直接的ＤＮＡ摂取（例えば、エンドサイトーシス）を提供する手段によることができる。
【０１５５】
抗体またはその機能性誘導体はいくつかの方法で用いることができる。例えば、全身投与が必要とされる場合、抗体またはその誘導体は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形で経口で摂取することができる組成物内に含めることができる。抗体またはその誘導体が、血流への注射によって投与されることが好ましい。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）であってもよい。あるいは、抗体は肝臓へ直接、注射してもよい。
【０１５６】
核酸またはポリペプチドの治療用実体は、特に、組成物が用いられることになっている様式に依存する、いくつかの異なる形を有する医薬組成物中で組み合わせてもよい。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ハイドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル、経皮パッチ、リポソームの形、またはヒトもしくは動物に投与することができる任意の他の適切な形をとることができる。本発明の組成物のビヒクルは、それが与えられる被験体によって十分許容され、かつ標的の細胞、組織、または器官への治療用物質の送達を可能にすることができるものであるべきことは認識されているであろう。
【０１５７】
好ましい実施形態において、医薬的ビヒクルは液体であり、医薬組成物は溶液の形をとる。別の実施形態において、医薬的ビヒクルはゲルであり、組成物はクリームなどの形をとる。
【０１５８】
そのような治療用実体を含む組成物はいくつかの方法で用いることができる。例えば、全身投与が必要とされる場合、実体は、例えば、錠剤、カプセル、または液体の形で経口で摂取することができる組成物内に含めることができる。あるいは、組成物は、血流への注射によって投与することができる。注射は、静脈内（ボーラスまたは点滴）または皮下（ボーラスまたは点滴）であってもよい。実体は吸入によって（例えば、鼻腔内に）投与してもよい。
【０１５９】
治療用実体はまた、徐放性または遅延放出性デバイス内に組み込んでもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、化合物は、数週間またはさらに数カ月間かけて放出され得る。そのようなデバイスは、実体での長期間処置が必要とされ、かつそれが通常、頻回の投与（例えば、少なくとも連日注射）を必要とするだろう場合、特に有利であり得る。
【０１６０】
本発明の第１の態様の作用物質は、ＩＦＮ（例えば、ｐｅｇＩＦＮ）およびリバビリンなどの抗ウイルス剤を用いる抗ウイルス治療での処置を受けようとしている患者を前処置するのに特に有用である。それゆえに、作用物質はウイルス感染した個体にＩＦＮおよびリバビリンでの治療が開始される前に投与することが好ましい。
【０１６１】
本発明の第３および第４の態様に関して定義された作用物質での前処置と抗ウイルス治療との間の時間の長さは、用いられる作用物質に依存し得る。例えば、作用物質が処置されることになっている被験体におけるＩＦＮ系の活性化を低下させることができるが、被験体に与えられるその後の抗ウイルス治療の活性を低下させることはできない場合、時間の長さは、非常に短くあり得る。例えば、被験体は、同時に、または併用処置レジメンでも処置することができる。
【０１６２】
作用物質を区別していない（not distinguishing）場合には、時間の長さは作用物質の性質に依存し得る。例えば、外因的に供給された抗体は、ヒト身体から排除されるために約４〜６週間かかることが知られている。したがって、作用物質がＩＦＮαポリペプチドもしくは受容体、またはＩＦＮ系の他のそのようなメンバーに対する抗体である場合、その後の抗ウイルス治療は、患者に４〜６週間後、例えば、少なくとも６週間後、供給することができる。
【０１６３】
技術者が本発明の第１の態様の方法を実施するために必要とされる様々な要素は、キットの中へ組み込んでもよい。
【０１６４】
したがって、本発明の第５の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するためのキットであって、
（ｉ）上記に列挙され、および表２に示された各遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段と、任意で
（ｉｉ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段と
を含むキットが提供される。
【０１６５】
「上記に列挙され、および表２に示された各遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段」とは、試料における遺伝子発現を表す分子を標的にすることができる、本発明の第１の態様において示した特異的結合分子を含む。いくつかの実施形態において、特異的結合分子はオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、アプタマー、または上記で述べた結合タンパク質もしくは小分子である。
【０１６６】
「試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段」とは、上記の本発明の第１の態様において述べた対照試料を含める。そこに述べられた対照参照データも含む。
【０１６７】
本発明の第５の態様のキットはまた、
（ｉｉｉ）前記遺伝子の発現を分析するための適切な緩衝液および試薬
を含んでもよい。
【０１６８】
キットで提供される緩衝液および試薬は、液体の形をとってもよく、いくつかの実施形態において、あらかじめ測定されたアリコートとして提供されてもよい。あるいは、緩衝液および試薬は、希釈のために濃縮された形（またはさらに粉末の形）でもよい。
【０１６９】
技術者が本発明の第２の態様の方法を実施するのに必要とされる様々な要素はキットへと組み込んでもよい。
【０１７０】
したがって、本発明の第６の態様によれば、肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン活性（ＩＦＮ）の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するためのキットであって、被験体由来の試料を調べてＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための手段を含むキットが提供される。
【０１７１】
「被験体由来の試料を調べてＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための手段」とは、ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定することができる、本発明の第２の態様において示した特異的結合分子を含む。いくつかの実施形態において、前記特異的結合分子は、抗ＳＴＡＴ抗体；いくつかの実施形態において、抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体である。
【０１７２】
本発明の第６の態様のキットはまた、
（ｉｉｉ）ＳＴＡＴ１の細胞内位置を同定するための適切な緩衝液および試薬
を含む。
【０１７３】
キットで提供される緩衝液および試薬は、液体の形をとってもよく、いくつかの実施形態において、あらかじめ測定されたアリコートとして提供されてもよい。あるいは、緩衝液および試薬は、希釈のために濃縮された形（またはさらに粉末の形）でもよい。
【０１７４】
（任意の添付された特許請求の範囲、要約、および図面を含む）本明細書に記載された特徴の全ておよび／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互排他的である組合せを除き、上記態様のいずれとも任意の組合せで組み合わせてもよい。
【０１７５】
これから、以下の実施例および図を参照して本発明をさらに記載する。
【０１７６】
［図１ 肝臓およびＰＢＭＣにおける遺伝子発現のｐｅｇＩＦＮ−α２ｂ誘導性制御］
（Ａ）急速応答者は、非ＲＲ患者より、ｐｅｇＩＦＮ−α２ｂに応答して肝臓において有意により多い遺伝子を上方制御または下方制御する。肝臓生検およびＰＢＭＣにおける７５％を超える患者で有意水準ｐ＜０．０１（レーン１、２、５、および６）およびｐ＜０．０５（レーン３、４、７、および８）で２倍より大きく変化した遺伝子の平均（＋ＳＥＭ）数が示されている。ＲＲ患者群と非ＲＲ患者群との差は、肝臓生検において有意であったが、ＰＢＭＣにおいては有意ではなかった（図ではマンホイットニー検定のｐ値が示されている）。
（Ｂ）６つの非ＲＲ生検試料および６つのランダムに選択されたＲＲ生検試料の５０％より多くにおける、ｐｅｇＩＦＮ−αに応答して２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に上方制御または下方制御された遺伝子のベン図。
（Ｃ）６人のランダムに選択されたＲＲ患者の５０％より多くの生検およびＰＢＭＣ試料における、ｐｅｇＩＦＮ−αに応答して２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に上方制御または下方制御された遺伝子のベン図。
【０１７７】
［図２ ＨＣＶ感染患者におけるｐｅｇＩＦＮα２ｂ誘導性遺伝子制御は、ＲＶＲ患者の肝臓と非ＲＶＲ患者の肝臓との間、および肝臓とＰＢＭＣとの間に大きな違いを示す］
（Ａ）５つのＩＳＧ（Ｍｘ１、ビペリン、Ｍｄａ５／ヘリカード、ＯＡＳ１、ＵＳＰ１８）が、ＲＲ患者においてＢ−１とＢ−２との間で２倍を超えて有意（ｐ＜０．０５）に制御された遺伝子のリストから選択された。非ＲＲ患者の肝臓において、これらの遺伝子の発現は処置前（レーン２５〜３０）にすでに高く、ｐｅｇＩＦＮα後（レーン３１〜３６）、さらには増加しなかった。ＲＲ患者において、処置前発現（レーン１５〜１４）は対照（レーン１〜４）と類似しており、ｐｅｇＩＦＮαは強い上方制御を誘導する（レーン１５〜２４）。ＲＲ患者および非ＲＲ患者の両方において、ＰＢＭＣ（レーン３７〜４６および５７〜６２）では事前活性化は見出されず、ｐｅｇＩＦＮαは、これらの遺伝子を強く誘導する（レーン４７〜５６および６３〜６８）。ｙ軸は絶対発現値を示す。
（Ｂ）ＲＲ患者および非ＲＲ患者の両方における、ｐｅｇＩＦＮ−α２ｂに応答して肝臓で上方制御された遺伝子（ＣＣＬ８）の例。ＰＢＭＣにおける発現値はレーン３７〜６８に示されている。
【０１７８】
［図３ 選択されたＩＳＧおよびＰＰ２Ａの触媒サブユニットのＲＴ−ｑＰＣＲ分析］
（Ａ）ＵＳＰ１８ ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ分析はアレイデータを裏付けている。個々の患者におけるＢ−１とＢ−２の間でのＵＳＰ１８ ｍＲＮＡの倍数誘導（fold induction）が示されている。
（Ｂ）処置前生検における選択されたＩＳＧの発現レベルは、初期非応答（ＰＮＲ＝１２週間目での２ｌｏｇ未満のウイルス量の降下）を示す患者においてより早期ウイルス陰性化（ＥＶＲ＝１２週間目での２ｌｏｇを超えるウイルス量の降下）を示す患者において低い。
（Ｃ）遺伝子型１および４を有する患者群（治療が「困難」）内ならびに遺伝子型２および３を有する群（治療が「容易」）内の両方において、ＰＮＲ患者は、ＵＳＰ１８およびＩＦＩ１２７の高い処置前発現レベルを有する。
パネルＢおよびＣにおいて、ｙ軸は、ＧＡＰＤＨの発現に対する発現を示す。統計的有意性をマンホイットニー検定で検定した。Ｎ＝各群における患者数。
（Ｄ）持続性ウイルス陰性化（ＳＶＲ＝処置終了から６カ月後検出不可能なＨＣＶ ＲＮＡ）または処置終了時応答（ＥｏＴＲ）を有する患者は、ＰＮＲを有するまたはＥｏＴＲをもたない患者においてよりＵＳＰ１８およびＩＦＩ２７の有意に低い発現を示す。
【０１７９】
［図４ 肝臓生検におけるＪａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の分析］
（Ａ）ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射前（Ｂ−１）および注射後（Ｂ−２）に収集された肝臓生検の抽出物におけるＳＴＡＴ１リン酸化。抽出物を、ＰＹ（７０１）−ＳＴＡＴ１に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。シグナルを、積分強度を計算するＯｄｙｓｓｅｙイメージングソフトウェアを用いて定量化した（キロカウント×ｍｍ２）。値は、Ｂ−２試料におけるリン酸化の倍数増加を表す。ＲＲ患者番号は青色で、非ＲＲ患者は赤色で示されている。ブロットを切り取り、試料の各ペアのローディング対照として用いられる全ＳＴＡＴ１について再調査（reprobe）した。
（Ｂ）ＲＲ患者および非ＲＲ患者のＢ−１およびＢ−２の代表例。ＲＲ患者（患者４番）の処置前生検において明らかな核染色はない。核の薄青色はヘマトキシリンでの対比染色から生じている。ｐｅｇＩＦＮαから４時間後、たいていの肝細胞は強い核染色を示す。非ＲＲ患者（患者１２番）において、処置前生検において弱い核染色がすでに存在しており、ｐｅｇＩＦＮαは肝細胞においてほとんど変化を引き起こさない。明らかな核染色の増加はクッパー細胞に限局している。
【０１８０】
［図５ 全ての患者の生検試料における遺伝子発現の主なパターンはヒートマップとして示されている］
＜０．０５のｐ値を有する全ＲＲの５０％より多くにおいて２倍より大きく変化している２５２個の遺伝子のリストを用いてマップを作成した。生発現値の色コード化は左側に示されている。多くの遺伝子は、対照患者、およびＲＲ患者の処置前生検（Ｂ−１）において低い発現レベルを有する。ＲＲ患者において、ｐｅｇＩＦＮαは上方制御を誘導する（Ｂ−２）。非ＲＲ患者において遺伝子の大部分は、処置前生検試料（Ｂ−１）においてすでに強く誘導されており、それから、ｐｅｇＩＦＮα後（Ｂ−２）、さらなる誘導は見出されない。
【０１８１】
［図６ 分類基準として４週間目での処置に対する応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣにおける教師あり分類予測（supervised classifier prediction）］
（Ａ）２つの応答群のＢ−１生検を用いる教師あり分類予測により、４．３％の誤分類率をもつ処置の転帰の最良の予測因子として２９個の遺伝子（３３個の転写産物）のリストがもたらされた。
（Ｂ）２つの応答群のＢ−２生検を用いる教師あり分類予測により、１９．５％の誤分類率をもつ処置の転帰の最良の予測因子として１６個の遺伝子（１６個の転写産物）のリストが明らかにされた。
（ＣおよびＤ）ＰＢＭＣ−１およびＰＢＭＣ−２試料の教師あり分類予測によっては、用いられた４つの統計的検定（サポートベクターマシン、スパース線形判別分析、フィッシャー線形判別分析、Ｋ近傍法）のいずれを用いても予測遺伝子の有用なリストは作成されなかった。誤分類率は、ＰＢＭＣ−１について３８．５％、ＰＢＭＣ−２について４２．６％であった。
【０１８２】
［図７］
（Ａ）肝臓生検におけるリン酸化ＳＴＡＴ１の免疫組織化学的染色の半定量的評価
肝細胞の核染色を、示された患者（患者番号は表１の番号に対応する）のＢ−１試料（青色）およびＢ−２試料（赤色）における２００個の肝細胞での繰り返しカウント（５回）によって定量化した。６人の非ＲＲ患者のうちの５人において、かなりの割合の肝細胞が、処置前生検においてすでに弱いが明らかな核染色を生じた。全てのＲＲ患者は、処置前の核においてリン酸化ＳＴＡＴ１シグナルを生じなかったが、ｐｅｇＩＦＮα後、強い誘導を示した。
（Ｂ）ｐｅｇＩＦＮα２ｂに応答したＳＴＡＴ−ＤＮＡ結合の誘導が、非ＲＲ患者の大部分において障害される
Ｂ−１試料およびＢ−２試料由来の核抽出物を、放射標識ＳＩＥ−ｍ６７オリゴヌクレオチドプローブを用いるＥＭＳＡで分析した。アスタリスク（＊）は、オリゴヌクレオチド配列と結合している活性化ＳＴＡＴ１二量体のシグナルを示す。ゲルシフトパネルより上の数字は、表１にすでに用いられている患者番号を表す。上部パネルは、４週間目に急速応答を有する１０人の患者（番号１〜１０）を示す。下部パネルは、６人の非ＲＲ患者（番号１１〜１６）を示す。
【０１８３】
［図８ ヒトインターフェロンαのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８４】
［図９ ヒトインターフェロン受容体１のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８５】
［図１０ ヒトインターフェロン受容体２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８６】
［図１１ ヒトインターフェロン受容体２ｂのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【０１８７】
［図１２ ヒトインターフェロン受容体２ｃのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列］
【実施例１】
【０１８８】
１．１ 方法
１．１．１ 被験体試料および処置
２００６年１月から２００７年４月まで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの外来肝臓診療所の紹介を受けたＣＨＣを有する患者に、研究目的として彼らの診断的肝臓生検（Ｂ−１）の一部を用いる許可を求めた。その後、ペグ化ＩＦＮα２ｂ（ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ）およびリバビリン（Ｒｅｂｅｔｏｌ、どちらもＥｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で処置された患者に、この研究に参加してくれるよう頼んだ。１６人の患者が、１．５μｇ／ｋｇ体重のｐｅｇＩＦＮα２ｂ（ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ）の最初の注射から４時間後、２回目の肝臓生検（Ｂ−２）を受けることに同意した。彼らの全ては白色人種であった。リバビリンの初回投与を、さらなる交絡因子を避けるためにこの２回目の生検後に行った。プロトコールは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの倫理委員会によって承認された。書面のインフォームドコンセントを全ての患者から入手した。ＰＢＭＣ単離のための血液を、処置前および最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、収集した。患者をｐｅｇＩＦＮα２ｂ（１．５μｇ／ｋｇ体重）およびリバビリン（体重に基づいた投与：＜６５ｋｇ：８００ｍｇ／日（mg/d）；６５〜８５ｋｇ：１ｇ／日；＞８５ｋｇ：１．２ｇ／日）で処置した。ＨＣＶ ＲＮＡを処置開始前、ならびに処置の４週間目および１２週間目に定量化した。処置期間は、遺伝子型２／３を有する患者については２４週間、遺伝子型１については４８週間であった。非ＣＨＣ対照として、局所性病変の超音波ガイド下の肝臓生検を受けた４人の患者から、局所性病変の外側の正常肝臓組織からの生検についてのインフォームドコンセントを得た。ＣＨＣを有する９６人の追加の患者（彼らの１人を除く全てが白色人種であった）由来の処置前肝臓生検を、選択されたＩＳＧについてのＲＴ−ｑＰＣＲに用いた。
【０１８９】
１６人の慢性感染ＨＣＶ被験体由来のペアのヒト肝臓生検試料を入手した。２００６年１月から２００７年４月まで、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂａｓｅｌの外来肝臓診療所の紹介を受けた慢性Ｃ型肝炎を有する全被験体に、研究目的として彼らの診断的肝臓生検の一部を用いる許可を求めた。肝臓生検を、同心型針電極を用いる超音波ガイド下の技術によって採取した。
【０１９０】
Ｍｅｔａｖｉｒスコアリングシステムによって肝臓疾患のグレード付けおよびステージングのための日常的な病理組織学的精密検査についての２つの２０〜２５ｍｍ長の生検検体の切除後、残りの５〜２０ｍｍ長の生検円柱をＢ１（生検１として）と標識し、さらなる研究参加者の処置前試料として保存した。ペグ化ＩＦＮα２ｂ（Ｅｓｓｅｘ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をこの研究に参加した全被験体に処方した。２回目の生検（Ｂ２）を、最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、実施した。リバビリンの初回投与を、さらなる交絡因子を避けるためにこの２回目の生検後に行った。プロトコールは、ＢａｓｅｌのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓの倫理委員会によって承認された。書面のインフォームドコンセントを全被験体から入手した。
【０１９１】
加えて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単離のための血液を、処置前および最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後、収集した。
【０１９２】
ＨＣＶ被験体は、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ（１．５μｇ／ｋｇ体重）およびリバビリン（体重に基づいた投与：＜６５ｋｇ：８００ｍｇ／日；６５〜８５ｋｇ：１ｇ／日；＜８５ｋｇ：１．２ｇ／日）での標準併用処置を受けた。ＨＣＶ−ＲＮＡを処置開始前、ならびに処置の４週間目および１２週間目に定量化した（表１）。処置期間は、遺伝子型２／３を有する患者については２４週間、遺伝子型１については４８週間である。研究に含まれる１６人の被験体から、２人の被験体（１０番および１６番）は、一次非応答を生じ、処置を１２週間目に中止した。残りの９人の被験体から、２人（１番、２番）が処置応答の終了で治療を完了している。
【０１９３】
非ＨＣＶ対照として、局所性病変（癌腫の転移）の超音波ガイド下の肝臓生検を受けた２人の被験体から、局所性病変の外側の正常肝臓組織からの生検についてのインフォームドコンセントを得た。再び、生検の一部を日常的な病理組織学的診断に用い、後で記載したように、残りの組織をＲＮＡの抽出に用いた。両方の対照試料は、日常的な病理組織学的検査(workup)において肝臓疾患の確認された非存在を示した。
【０１９４】
１．１．２ ＩＦＮα血清濃度の測定
処置前のｈＩＦＮα血清レベルおよび最初の注射から４時間後のｐｅｇＩＦＮα２ｂの血清濃度を、製造会社の使用説明書に従ってＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のヒトインターフェロンαＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。このＥＬＩＳＡキットは以前、非ペグ化ヒトＩＦＮαとペグ化ヒトＩＦＮαの両方を認識することが示されている３４。
【０１９５】
１．１．３ ヒト肝臓生検からの抽出物の調製
肝臓生検試料を、細胞全体、細胞質、および核の抽出物の調製に用いた。細胞全体抽出物について、試料を、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＦ、１ｍｍｏｌ／ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル、および１ｍｍｏｌ／ｌのバナジン酸塩を含む１００μｌの溶解緩衝液中でＤｏｕｎｃｅホモジナイズした。可溶化液を１４，０００ ｒｐｍで、４℃、５分間、遠心分離した。タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ）によって決定した。
【０１９６】
核抽出物および細胞質抽出物について、肝臓を、２００ｍｍｏｌ／ｌのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．６、１０ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＧＴＡ、０．２％のＮＰ−４０、１０％のグリセロール、および０．１ｍｍｏｌ／ｌのバナジン酸塩を含む低塩緩衝液に溶解した。１５，０００ ｒｐｍで５分間の遠心分離後、ペレットを高塩緩衝液（４２０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを追加した低塩緩衝液）中に再懸濁した。遠心分離後、核抽出物のアリコートを、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）のために作製した。
【０１９７】
１．１．４ ウェスタンブロットおよび電気泳動移動度シフトアッセイ
ヒト肝臓可溶化液由来の１０μｇの総タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にロードし、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に転写した。膜を３％のＢＳＡ／ミルク（１：１）−０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中、１時間、ブロッキングし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で洗浄し、一次抗体と４℃で一晩、インキュベートした。
【０１９８】
タンパク質を、リン酸化ＳＴＡＴ１（ＰＹ（７０１）−ＳＴＡＴ１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＳＴＡＴ１（カルボキシ末端；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に特異的な一次抗体で検出した。ＴＢＳＴでの３回の洗浄後、膜を赤外蛍光二次ヤギ抗マウス（ＩＲＤｙｅ ６８０）または抗ウサギ（ＩＲＤｙｅ ８００）抗体（どちらもＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）と室温で１時間、インキュベートした。ブロットをＬＩ−ＣＯＲ製のＯｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステムによって分析した。赤外画像を一回のスキャンで獲得し、シグナルを積分強度を用いて定量化した。
【０１９９】
ローディング対照として、膜を剥離し、抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。
【０２００】
２μｇの核抽出物およびＳＴＡＴ応答エレメント配列に対応する３２Ｐ放射標識ＤＮＡ−オリゴヌクレオチド血清誘導性エレメント（ＳＩＥ）−ｍ６７を用いて、ＥＭＳＡを行った。
【０２０１】
１．１．５ 免疫組織化学
標準間接免疫ペルオキシダーゼ手順を免疫組織化学のために用いた（ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。４ｍｍ厚の切片をパラフィンブロックから切り取り、再水和し、前処理し（ＥＲ２溶液中２０分間）、リン酸化ＳＴＡＴ１に対するウサギモノクローナル抗体（希釈１：２００、＃９１６７Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とインキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。全染色手順（脱水、前処理、インキュベーション、対比染色、およびマウンティング）を自動染色装置（Ｂｏｎｄ（登録商標）、Ｖｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ−ｕｐｏｎ−Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を用いて行った。核リン酸化ＳＴＡＴ１染色の定量化について、各患者のＢ−１試料およびＢ−２試料のそれぞれについて２００個の肝細胞を５回、カウントした。補足的な図３において、標準偏差を有する平均値が示されている。
【０２０２】
１．１．６ ＲＮＡ単離およびマイクロアレイ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社の使用説明書に従い、肝臓試料およびＰＢＭＣ試料から抽出した。ＲＮＡを分注し、−８０℃で保存した。転写産物あたり１１個の完全マッチ／ミスマッチプローブ対を有する５６，０００個を越える転写産物および変異体を表すＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイを用いるマイクロアレイ分析によって肝臓およびＰＢＭＣにおいて遺伝子発現を評価した。マイクロアレイハイブリダイゼーションを、ＢａｓｅｌのＦｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈのゲノム機能解析施設で行った。各試料由来の全ＲＮＡ（１〜２μｇ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ１サイクル増幅キットを用いて製造会社の使用説明書の通り、逆転写し、ビオチン化した。（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの使用説明書の通り）ビオチン化ｃＲＮＡ（２０μｇ）をマグネシウムとの加熱により断片化し、１５μｇの断片化ｃＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ ＧｅｎｅＣｈｉｐｓにハイブリダイズした。品質管理およびバックグラウンド標準化を、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＲｅｆｉｎｅｒ ４．１を用いて行った。発現値の推定を、Ｒｅｆｉｎｅｒ ４．１． ＬＯＷＥＳＳ標準化におけるＧＣ−ＲＭＡ実行を用いて得て、およびプレゼントコールされた(called present)（検出Ｐ値＜０．０４）遺伝子の５００の値への中央値スケーリングを、Ｇｅｎｅｄａｔａ’ｓ Ａｎａｌｙｓｔ ４．１パッケージにおいて実行した。ＬＯＷＥＳＳ標準化データをこの明細書においては「生」発現値と呼ぶ。本発明者らはまた、各遺伝子を、１．０におけるその発現レベルを中央に置くためにその中央値で割ることによって、遺伝子に点別割り算(point-wise division)を実行した。このスケーリングされたデータは、変化の大きさおよび方向を示すだけで、絶対的発現レベルについては示さない。スケーリングされたデータをクラスタリング分析に用いた。断りのない限り、全ての他の分析については、生データを用いて行った。
【０２０３】
データ分析をＧｅｎｅｄａｔａ ＡＧのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｔ ４．１を用いて実行した。遺伝子は、Ｐ＜０．０５でのｔ検定を合格し、各群内の患者の少なくとも６０％においてペア患者試料の間で１．３、１．５、２、および５、またはそれ以上の倍数変化中央値(median fold change)を有することが要求された。分類基準として４週間目における応答を用いる肝臓生検試料およびＰＢＭＣの教師あり分類予測(supervised classifier prediction)として、４つの統計的検定を用いた（サポートベクターマシン、スパース線形判別分析、フィッシャー線形判別分析、Ｋ近傍法）。誤分類率は、用いられた検定ごとに決定することができ、最低率のものを選択した。
【０２０４】
１．１．７ ＲＮＡ単離、逆転写、およびＳＹＢＲ−ＰＣＲ
アレイデータを、ＳＴＡＴ１、ＩＰ１０、ＵＳＰ１８、ＩＦＩ２７、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３を含むいくつかのＩＦＮ制御遺伝子の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって検証した。
【０２０５】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従い、肝臓から全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下でモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってＲＮＡを逆転写した。反応混合物を７０℃で５分間、その後、３７℃で１時間、インキュベートした。反応を、９５℃で５分間、加熱することによって停止した。ＳＹＢＲ緑色蛍光（ＳＹＢＲ緑色ＰＣＲマスターミックス：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に基づいてＳＹＢＲ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＳＴＡＴ１、誘導性タンパク質１０（ＩＰ１０）、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＵＳＰ１８、ＩＦＩ２７、およびＰＰ２Ａｃについてのプライマーをエキソン−イントロン接合部にわたって設計した。プライマー配列は表４に示されている。サイクル閾値における差（ΔＣＴ）を、内部対照の役割を果たすＧＡＰＤＨのＣＴ値をＳＴＡＴ１または目的とする他の転写産物のＣＴ値から引き算することによって導いた。全ての反応を、ＡＢＩ ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて２連で実行した。転写産物のｍＲＮＡ発現レベルを、式：２−ΔＣＴを用いてΔＣＴ値からＧＡＰＤＨに対して計算した。ペア肝臓生検試料における発現の変化を式：２∧（ΔＣＴＢ−１−ΔＣＴＢ−２）に従って倍数変化として計算した。
【０２０６】
ボックスプロット図、独立ｔ検定（unpaired t-test）、およびマンホイットニー検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍのＭａｃｉｎｔｏｓｈ用ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン４．００を用いて実行した。
【０２０７】
１．２ 結果
患者および処置に対する応答
この研究に含まれる１６人の患者である、６人の女性および１０人の男性を週１回の皮下注射のｐｅｇＩＦＮ２αｂと１日２回の経口リバビリンの体重調整型併用で処置した。彼ら全員は処置前生検（Ｂ−１）およびｐｅｇＩＦＮα２ｂの最初の注射から４時間後に採取される２回目の生検（Ｂ−２）の２回の肝臓生検を受けた。本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射から４時間後に遺伝子発現を分析するよう選択しており、その理由は、チンパンジーの肝臓におけるｐｅｇＩＦＮαによるＩＳＧの誘導の反応速度がこの時点で最大であり、続いて、多数の遺伝子の急速な下方制御があったからである（２２）。本発明者らは、おそらくいくつかの遅発型誘導性ＩＳＧの上方制御を見逃した可能性があるが、急速な下方制御により、より遅い時点を用いる場合、より多くのＩＳＧを見逃すことになったであろうと理解する。
【０２０８】
患者のうちの７人はＨＣＶ遺伝子型（ＧＴ）１に、２人はＧＴ４に、４人はＧＴ３に、３人がＧＴ２に感染していた。４週間の処置後に陰性血清ＨＣＶ ＲＮＡであった８人の患者、および最初の４週間内にウイルス価の３ｌｏｇより大きい降下があった２人の患者を急速応答者（ＲＲ）と分類し、一方、６人の患者が１．５ｌｏｇ未満のウイルス量低下を示し、非ＲＲと分類した（表１）。
【０２０９】
血清ＩＦＮα濃度は、処置前の全患者において検出限界より下であり、以前に発表された薬物動態学的データ（２４）に従って、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射の４時間後に得られた試料において３４〜３６０ｐｇ／ｍｌであった（データ示さず）。注射後４週間目のウイルス陰性化と４時間目における血清ＩＦＮα濃度との間に有意な相関はなかった。さらに、血清ＩＦＮαレベルにおける差にもかかわらず、全患者はＰＭＢＣにおいて同様のＩＳＧ誘導を示した（下記参照）。
【０２１０】
標的遺伝子のＩＦＮ誘導性制御
Ｂ−１試料およびＢ−２試料においてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ｐｌｕｓ２．０アレイを用いて遺伝子発現を分析し、最初のｐｅｇＩＦＮα２ｂ注射の前（ＰＢＭＣ−１）およびその注射から４時間後（ＰＢＭＣ−２）に得られた血液から単離されたＰＢＭＣにおいても分析した。各患者について、処置後試料において（処置前と比較して）２倍より大きく上方制御または下方制御された遺伝子を同定し、遺伝子リストに保存した。その後、本発明者らは、１０人のＲＲ患者および６人の非ＲＲ患者それぞれからランダムに選択された４人の患者の群を７つおよび３つ作った。各群において、４人の患者のうちの少なくとも３人において有意に（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）変化した遺伝子を同定し、カウントした。７つのＲＲ群の肝臓生検において、制御された遺伝子の平均数（±ＳＥＭ）は、有意水準ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５、それぞれにおいて７６．７１（±１７．４６）および１９６．７（±３１．５５）であった。３つの非ＲＲ群において、これらの数は、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５、それぞれについて１１．６７（±３．７６）および２８．３３（±６．１２）であった。ＲＲ群と非ＲＲ群の間の差は統計的に有意であった（図１Ａ）。ＲＲ試料および非ＲＲ試料に見出される有意に制御された遺伝子において重複があった。例として、非ＲＲ生検試料の５０％より多くにおいて、Ｂ１とＢ２との間で２倍より大きく変化した３６個の遺伝子のうちの３０個は、ランダムに選択されたＲＲ患者の５０％より多くにおいて変化した１７７個の遺伝子の中にも存在した（図１Ｂ）。
【０２１１】
驚くほどのことではないが、制御された遺伝子の多くは、既知のＩＳＧを表している。しかしながら、本発明者らの予想に反して、これらのＩＳＧの発現レベルは、非ＲＲと比較して、ＲＲ患者由来のｐｅｇＩＦＮα２ｂ処置後生検においては高くなかった。むしろ、非ＲＲ患者試料は、Ｂ−１においてすでにＩＳＧ発現がより高いレベルであり、それゆえ、Ｂ−２試料における倍数変化はほんのわずかであった。これは、５つのＩＳＧの例において図２Ａに示されている。それらの遺伝子は、Ｃ型肝炎なしの個体由来の生検およびＲＲ患者のＢ−１の生検において非常に低い発現を示す。６人の非ＲＲ患者は、処置前にこれらの遺伝子の高い発現を生じ、ｐｅｇＩＦＮα２ａ投与は、それらの発現を増加させず、または最小限のみ増加させた。このルールの例外は極少数であった（例は図２Ｂに示されている）。これらの遺伝子は、全患者において、処置前生検において低い発現を示したが、ｐｅｇＩＦＮα２ｂがそれらを誘導した。とは言っても、遺伝子発現の主なパターンは図２Ａに示されたのと似ていた。ＲＲ群においてＢ−１とＢ−２の間で２倍より大きく有意に（ｐ＜０．０５）変化した２５２個の遺伝子の発現のリストおよびヒートマップは、補足情報（ＳＩ）表２およびＳＩ 図６において全生検試料について示されている。
【０２１２】
肝臓およびＰＢＭＣにおいてｐｅｇＩＦＮα２ｂで制御された遺伝子のかなりの重複があった（図１Ｃ）。興味深いことに、全患者において、ｐｅｇＩＦＮα２ｂは肝臓においてよりＰＢＭＣにおいてより多くの遺伝子を制御した。しかしながら、ＲＲと非ＲＲの間のＰＢＭＣにおけるＩＳＧの上方制御の差は有意ではなかった（図１Ａ）。ＲＲ患者および非ＲＲ患者において、ＩＳＧの事前活性化はＰＢＭＣにおいて見出されず、ｐｅｇＩＦＮα２ｂ処置がＩＳＧ制御に同じ効果を生じた（ＳＩ 図５）。これは、慢性ＨＣＶ感染が肝臓におけるＩＦＮ系に強い局所効果を生じるが、ＰＢＭＣにおいてほとんど効果を生じないことを示す。
【０２１３】
処置に対する応答を予測する遺伝子のサブセット
アレイデータの教師あり分類分析により、本発明者らの場合、４週間目における急速応答対非応答である、転帰を最も良く予測する遺伝子のサブセットの同定が可能になる。全ての肝臓生検およびＰＢＭＣデータセットを、分類基準として処置の４週間目の応答を用いる教師あり分類予測に供した。ＰＢＭＣ試料について、分析によって、処置の転帰を予測することができる遺伝子のサブセットが同定されなかった。対照的に、１９．５％のエラー発生率（error rate）で、処置に対する応答を予測する肝臓Ｂ−２試料において１６個の遺伝子のサブセットが同定された。さらに良い予測が、処置前生検Ｂ−１における２９個の遺伝子のサブセットに関して可能であり、エラー発生率は４．３％であった。このセットにおいて、ｐｅｇＩＦＮα２ｂによって上方制御された２２個の遺伝子があった（表２）。したがって、７６％の最良予測因子遺伝子はＩＳＧを表す。
【０２１４】
処置前生検から設定された最良予測因子においてＩＳＧが優勢であることに反して、Ｂ−２生検の分析に由来する１６個の最良予測因子遺伝子の３個（１９％）のみがＩＳＧであった（表３）。これらの結果は、Ｂ−２におけるＩＳＧの発現レベルがＲＲ試料と非ＲＲ試料の間で異ならず、したがって応答者と非応答者の識別に適さないという図２に示された知見を支持する。上記で論じられたＢ−１およびＢ−２の肝臓生検リストに存在する非ＩＳＧの中で、シグナル伝達、細胞周期制御、アポトーシス、およびアミノ酸代謝において機能を果たす遺伝子がある。
【０２１５】
肝臓生検におけるＩＳＧ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析
ペア肝臓生検のアレイ分析により、治療の転帰についてのＢ−１生検におけるＩＳＧ発現の重要性が浮き彫りにされた。これらのデータを確認するために、本発明者らは、Ｂ１生検およびＢ２生検を受けた１６人の患者ならびにＣＨＣを有する９６人の追加の患者の処置前生検において選択されたＩＳＧ（ＵＳＰ１８、Ｓｔａｔ１、ＩＰ１０、ＩＦＩ２７）の発現をリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定した。ペア生検を受けた１６人の患者において、ＲＴ−ｑＰＣＲ値はアレイ発現によく一致し、アレイデータの品質を確証した（図３Ａ、およびデータ示さず）。治療前生検における全ての４つのＩＳＧの発現は、ＥＶＲ群とＰＮＲ群の間で有意に異なっており（図３Ｃ）、肝臓におけるＩＳＧの処置前発現とＩＦＮα治療に対する応答との間の逆相関があるという結論をさらに支持していた。ＩＳＧの有意な上方制御は、１２週間目における非応答、および最終処置の転帰とも相関した。
【０２１６】
処置前ＩＳＧ発現レベルはＨＣＶ遺伝子型と相関する
本発明者らは、ＨＣＶ遺伝子型（ＧＴ）に関してＩＳＧの発現を分析した。興味深いことに、調べたＩＳＧは、「治療が困難な」ＧＴ １およびＧＴ ４に感染した患者において、８０％を超える患者において治療に成功することができるＧＴ ２およびＧＴ ３に感染した患者よりも、有意に高い発現を示した。重要なことには、ＩＳＧの発現レベルは、ＨＣＶ ＧＴとは無関係に非ＲＲ患者においてＲＲ患者より高かった。したがって、非ＲＲ患者におけるＩＳＧ発現レベルの増加は、ＧＴ １が非ＲＲ群において大きな比率を占めるという事実だけで説明することができない。むしろ、ＨＣＴ ＧＴ １およびＧＴ ４を有する患者は、彼らの肝臓においてＩＳＧの発現が増加している頻度がより高いという事実が、ＩＦＮ治療に対するこれらの患者の不良応答についてのもっともらしい説明を与えている。
【０２１７】
非応答者はＰＰ２Ａｃのより高い発現を有する
本発明者らは以前、ＰＰ２Ａの触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）が、対照と比較してＣＨＣを有する患者の肝臓において過剰発現していること、およびＰＰ２Ａｃの過剰発現がＩＦＮαシグナル伝達を阻害することを示している（１４、２５）。したがって、本発明者らは、１２週間目の処置応答がわかっている患者群におけるＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡレベルを分析した。ＥＶＲ群の患者は、ＰＮＲ患者よりＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡの発現が有意に少なかった（図３Ｂ）。
【０２１８】
ＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達
注射されたｐｅｇＩＦＮα２ｂはＩＦＮ受容体と結合し、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化する。この活性化における中心的事象は、ＳＴＡＴ１のチロシン７０１におけるリン酸化である（２６）。本発明者らは、リン酸化部位特異的（phospho-specific）ＳＴＡＴ１抗体を用いるウェスタンブロットによって全てのＢ−１生検およびＢ−２生検からの抽出物を分析した（図４Ａ）。リン酸化ＳＴＡＴ１バンドの半定量的分析によって、ＲＲ患者における３．６倍の導入中央値(median induction)、および非ＲＲ患者における１．６倍の導入中央値が明らかにされた（ｐ＝０．０３）。
【０２１９】
リン酸化ＳＴＡＴ１は、核へ移行し、ＩＳＧプロモーターの特異的応答エレメントに二量体として結合する（２６）。抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体を用いる免疫組織化学による核移行の評価は、おそらく、生検材料に存在する肝細胞におけるＳＴＡＴ１活性化と他の細胞におけるＳＴＡＴ１活性化とを識別することを可能にするはずである。ＲＶＲ患者のペア生検の分析により、Ｂ−１試料におけるわずかな核染色、およびｐｅｇＩＦＮαの注射後のＢ−２試料におけるほとんどの肝細胞核の強い染色が明らかにされた（図４Ｂ）。対照的に、１人（１１番）を除く全ての非ＲＶＲ患者は、顕著に異なる染色パターンを示した。処置前生検において、肝細胞の大部分は、すでにかなりの核染色を有し、それはＢ−２試料において増加しなかった。非ＲＶＲ患者のＢ−２試料における核染色の明らかな増加は、クッパー細胞（肝臓マクロファージ）におけるＳＴＡＴ１の核移行から生じ、肝細胞からは生じなかった（図４Ｂ）。クッパー細胞および場合により、混入した血液細胞におけるＳＴＡＴ１の活性化が、ウェスタンブロッティングで観察されるＳＴＡＴ１リン酸化の増加に寄与した可能性がある（図４Ａ）。
【０２２０】
シグナル伝達経路における次の工程は、核リン酸化ＳＴＡＴ１のＩＳＧのプロモーターエレメントへの結合である。したがって、本発明者らは、Ｂ−１生検およびＢ２生検の抽出物におけるＳＴＡＴ１ ＤＮＡ結合を電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）を実行することによって評価した。全ての急速応答者は、Ｂ−２試料においてＳＴＡＴ１ ＤＮＡ結合の著しい増加を示した。対照的に、たいていの非ＲＶＲ患者は、ｐｅｇＩＦＮα適用でゲルシフトシグナルのわずかな増加を示し、またはシグナルの増加を示さなかった。
【０２２１】
これらのデータは、免疫組織化学的検査およびＥＭＳＡアッセイが、リン酸化ＳＴＡＴ１についてのウェスタン分析の結果より治療の転帰と良く相関することを示す。総合すれば、データは、ＲＶＲ患者と非ＲＶＲ患者の間のＩＦＮ誘導性Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達の実質的差を実証している。
【０２２２】
１．３ 考察
ＩＦＮ治療に対するＨＣＶ感染患者の異なる応答の根底にある考えられる機構についてより学ぶために、本発明者らは、ｐｅｇＩＦＮα治療前および治療中にＣＨＣを有する患者から収集されたペア肝臓生検においてＩＦＮ誘導性シグナル伝達およびＩＳＧ誘導を調べた。同じ患者から得られた２つの肝臓試料におけるＩＦＮシグナル伝達の比較、および同じ患者に由来するマッチングしたＰＢＭＣ試料におけるＩＳＧ誘導との比較により、治療に対して応答が悪い患者が彼らのＩＦＮ系の事前活性化を示すこと、および事前活性化が肝臓に限局されており、ＰＢＭＣにおいては明らかではないことの明確な証拠を得ることが可能になった。重要なことには、治療に対する将来の応答者を意味する、低い最初のＩＳＧ発現を有する患者において、ｐｅｇＩＦＮαに応答したＩＦＮ系の活性化は、治療前も治療後も、非応答者で見られたものを超えなかった。これは、将来の非応答者である、ＩＦＮ系の最初の事前活性化を有する患者は、ＩＳＧ発現の下流の工程でいくつかの欠陥を有し、彼らを内因性ＩＦＮおよびＩＦＮ治療の両方に対して抵抗性にさせていることを示唆し得るものであった。
【０２２３】
ＩＦＮα処置は、１人の患者を除く全員においてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導した。非ＲＶＲ試料と比較してＲＶＲにおいてより強いＳＴＡＴ１活性化の傾向があった。しかしながら、免疫組織化学的分析によって、より顕著な違いが明らかにされた。非ＲＶＲ試料において、ｐｅｇＩＦＮαは、核ＳＴＡＴ１蓄積が主に肝細胞で誘導されたＲＶＲ試料とは違って、クッパー細胞において核ＳＴＡＴ１移行を強く誘導した。興味深いことに、（１人だけ例外として）非ＲＶＲ患者は、処置前生検にすでに存在する核リン酸化ＳＴＡＴ１を有した。これは、ＩＳＧ転写産物がより遅い非応答者の処置前生検で上方制御されているという観察と一致する。どのようにこのＪａｋ−ＳＴＡＴ経路の事前活性化が非ＲＶＲ患者におけるＩＦＮ系の治療抵抗性と関係しているかはさらなる研究を必要とする。
【０２２４】
ここ数年にわたって、ＨＣＶの先天免疫系への干渉への重要な洞察が得られている。第一に、一連の見事な論文により、ＩＦＮβ誘導のＴＬＲ３−ＴＲＩＦ−ＩＲＦ３シグナル伝達経路とＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５−Ｃａｒｄｉｆシグナル伝達経路の両方を阻害するＨＣＶの能力が実証された（２７〜３３）。このＨＣＶの能力は、なぜそのウイルスは慢性感染を確立することが多いのかの説明に役立ち得る。しかしながら、本発明者らのデータおよび以前に発表された結果（２０）により、内因性ＩＦＮ系が多くの患者において常に活性化されていることが実証されている。さらに、事前に活性化されたＩＦＮ系を有する患者は、ＩＦＮ治療に対して応答が悪いように思われる。この知見は、反直感的である（能動先天免疫系はＩＦＮα治療中にウイルスを排除するように助けると予想される）が、チンパンジーおよびヒト患者からの他の発表されたデータによって概ね支持されている（１６、１７、２０）。肝臓生検におけるＩＳＧ発現の分析から、ＨＣＶが内因性ＩＦＮ系を誘導する（または少なくとも遮断しない）患者もいれば、ＨＣＶがおそらくＴＲＩＦおよび／またはＣａｒｄｉｆを切断することによって内因性ＩＦＮ系を首尾よく抑圧する患者もいることは明らかである。逆説的なことに、この違いは、慢性感染を維持するＨＣＶの能力へ明らかな影響を与えていない。
【０２２５】
事前活性化されていないＩＦＮ系をもたない患者において、ｐｅｇＩＦＮα２ｂは、４時間以内に肝臓で多数のＩＳＧのロバストな上方制御を誘導した。類似した高ＩＳＧ発現は、後に４週間目で急速なウイルス陰性化を示さなかった患者の処置前生検にすでに存在していた。なぜ後者の患者が、ＩＦＮ系の強い活性化にもかかわらず慢性ＨＣＶ感染を自発的に解決しないのかについては幾分困惑している。１つの可能性として、どちらの場合にも上方制御されているＩＳＧタンパク質は異なる転写後修飾を有することである。別のシナリオとしては、内因性ＩＦＮαと外因性ＩＦＮαの両方に対する非応答が、ＨＣＶの排除に特異的に必要とされる数個の重大なＩＳＧの誘導の欠損によって引き起こされる可能性がある。本発明者らはこの可能性を排除することはできないが、ペア肝臓試料で行ったアレイ分析によっては、急速応答者において特異的に上方制御されたＩＳＧは明らかにされなかった。さらに、このモデルでは、なぜ内因性ＩＦＮ系の事前活性化が後での処置に対する非応答とそれほど密接に関連づけられるのかを説明することができない。
【０２２６】
あるいは、インターフェロン応答の誘導の反応速度は決定的であり得た。事前に活性化されたＩＦＮ系をもたない患者において、処置中の外因性ＩＦＮαの注射は、たいていの肝臓細胞において非常に急速に抗ウイルス状態を誘導するはずであり、ＨＣＶはＩＦＮ誘導性防御から逃避するのに「十分な」時間をもたないであろう。他方、抗ウイルス状態の増強（built-up）は、細胞内抗ウイルス防御系に適応しかつ逃れるのに十分な時間をＨＣＶに与えるであろう他の患者群においては遅くあり得、それがまたその後のＩＦＮ治療に対して抵抗性にさせている。
【０２２７】
どのようにして内因性ＩＦＮ系の誘導がＩＦＮα治療の成功を損なうのであろうか？明らかに、ＩＦＮシグナル伝達を阻害するネガティブフィードバックループの活性化が役割を果たし得る。ネガティブ制御因子のうち顕著な候補は、ＩＦＮ受容体に結合し、かつＪａｋ１およびＴｙｋ２の活性を阻害する２つのＩＦＮ誘導性タンパク質である、サイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）およびＳＯＣＳ３（３４）；ならびに、ＩＦＮα受容体２（ＩＦＮＡＲ２）に結合し、Ｊａｋ１のそれへのアクセスを遮断するＩＦＮ活性化タンパク質である、最近になって記載された抑制因子Ｕｂｐ４３（３５）である。しかしながら、本発明者らは、非ＲＶＲ患者と比較してＲＶＲのｐｅｇＩＦＮα２ｂ刺激された肝臓生検におけるこれらのネガティブ抑制因子の発現レベルの有意な差を見出すことができなかった（データ示さず）。さらに、ＳＯＣＳおよびＵｂｐ４３などのネガティブ抑制因子の一般的な上方制御は、ＩＦＮ治療に対して応答が悪い患者のサブセットにおいて多数のＩＳＧの観察された強い構成的発現と矛盾している。ＩＦＮαシグナル伝達が実際、肝臓細胞の大部分においてＳＯＣＳおよびＵｂｐ４３の誘導によって阻害されたとすれば、処置前肝臓においてＩＳＧのそのような顕著な事前活性化を観察するはずはないであろう。
【０２２８】
特に、試験されたＩＳＧの事前活性化は、ＨＣＶ遺伝子型１および４に感染した患者の肝臓生検において、遺伝子型２または３に感染したものより頻繁に起こっていた。遺伝子型２および３の感染は、遺伝子型１での感染の５０％未満と比較して、８０％を超える患者において治癒することができることは周知である（４）。内因性ＩＦＮ系の事前活性化の頻度および程度はＨＣＶ遺伝子型に依存するという本発明者らの知見によって、この異なる感受性を説明することができる。
【０２２９】
おそらく、ＨＣＶ遺伝子型２および３は、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦのより有効な切断によって肝臓における先天免疫の活性化を阻止するのにより多く成功する。しかしながら、内因性ＩＦＮ系の誘導を阻止することのウイルスの成功は、ＩＦＮα治療に対して感受性がより高いという代償の上で成り立っているであろう。注目すべきは、遺伝子型３ ＨＣＶに感染したただ１匹のチンパンジーは、遺伝子型１に感染した動物より低いＩＳＧ発現レベルを有することが示されている（１７）。
【０２３０】
本発明者らは以前、ＨＣＶがＩＦＮα誘導性シグナル伝達を、タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ａを上方制御することによってＪａｋ−ＳＴＡＴ経路を介して阻害することを示している（１２、１４、２５、３６）。ＰＰ２Ａは、スキャフォールディングＡサブユニット、制御Ｂサブユニット、および触媒Ｃサブユニットのヘテロ三量体複合体である。ＰＰ２Ａｃサブユニット発現は、遺伝子型３より遺伝子型１に感染した患者の肝臓において有意に高い（２５）。この研究で示されているように、ＰＰ２Ａｃ ｍＲＮＡの発現は、応答者より、後での非応答者の生検において高い。これらのデータは、ＩＦＮシグナル伝達へのＨＣＶ干渉が治療に対する応答を障害するモデルを支持する。さらに、ＨＣＶによるＩＦＮαシグナル伝達の阻害はまた、なぜ内因性ＩＦＮ系の強い事前活性化がＨＣＶの自発的排除をもたらさないのかを説明することができる。もし、全ての肝細胞がＨＣＶに感染するとは限らない、いや、むしろ少数であると仮定するならば、非ＲＶＲ患者の処置前生検に観察されるＩＳＧの誘導は、主に非感染肝細胞において起こり得る。感染細胞において、ＩＦＮは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害のために無効であろう。その系の事前活性化に関与するＩＦＮは、Ｃａｒｄｉｆおよび／またはＴＲＩＦを切断するのに成功していないウイルスに感染した肝細胞によって分泌されるであろう。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のＨＣＶ誘導性阻害のため、分泌されたＩＦＮβは、抗ウイルス状態を感染した肝細胞において誘導せずに、むしろ感染していない隣接細胞において誘導するであろう。ＣＨＣの病理生物学へのさらなる洞察を得るために、将来的な研究は、単細胞レベルでの分析に焦点を合わせるべきである。残念なことに、肝臓生検におけるＨＣＶ感染した肝細胞の検出は、まだ十分ではなく、そのような研究を困難にさせている。
【０２３１】
免疫防御系からのＨＣＶ回避の正確な機構はまだ解明されていないままであるが、内因性ＩＦＮ系の事前活性化によるＣ型肝炎治療の障害は今、十分明らかにされている。この事前活性化が可逆的プロセスであるかどうかを調べることは興味深いであろう。中和抗ＩＦＮα／β抗体、またはＩＦＮ応答を遮断する他の因子の処置前の注射が、内因性ＩＦＮ系を「ナイーブ」状態へ戻すことができて、ＩＦＮαに基づく治療に対する応答を増強する可能性がある。
【０２３２】
【表１】
【０２３３】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【０２３４】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【０２３５】
（ｃ）１．４ 参考文献
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法であって、
（ａ）以下の遺伝子群：
（ｉ）ＬＯＣ１２９６０７；ＲＰＬＰ０；およびＨＥＲＣ５；
（ｉｉ）ＨＴＡＴＩＰ２；およびＩＦＩ４４Ｌ；
（ｉｉｉ）ＩＦＩ２７；ＩＦＩＴ１；Ｇ１Ｐ２；ＩＲＦ７；ＲＳＡＤ２；ＩＦＩ４４；ＯＡＳ３；およびＩＦＩＴ２；
（ｉｖ）ＬＡＭＰ３；ＨＥＲＣ６；ＬＯＣ２８６２０８；ＩＦＩＴ３；ＲＡＬＧＰＳ１；ＰＡＲＰ９；ＣＣＤＣ７５；およびＣＮＰ；
（ｖ）ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ；ＦＬＪ２００３５；ＰＡＲＰ１２；ＰＮＰＴ１；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＳＡＭＤ９；およびＬＯＣ４０２５６０
の各々から少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における前記遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ウイルス治療がペグ化ＩＦＮαを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗ウイルス治療がｐｅｇＩＦＮαおよびリバビリンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルス感染またはＣ型肝炎ウイルス感染である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
試料が肝臓組織を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個の遺伝子の発現が分析される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子発現が、試料におけるｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子発現が、試料において、遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドまたはポリペプチドの量が特異的結合分子を用いて決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１に列挙された遺伝子群の各々の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段と、任意で
（ｉｉ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段と
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１５】
試料における前記遺伝子発現を表す分子を標的にすることができる１以上の特異的結合分子を含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
肝臓のウイルス感染を有する被験体がインターフェロン（ＩＦＮ）活性の刺激を含む抗ウイルス治療に対して応答性である可能性を決定するための方法であって、
（ａ）以下の遺伝子群：
（ｉ）ＬＯＣ１２９６０７；ＲＰＬＰ０；およびＨＥＲＣ５；
（ｉｉ）ＨＴＡＴＩＰ２；およびＩＦＩ４４Ｌ；
（ｉｉｉ）ＩＦＩ２７；ＩＦＩＴ１；Ｇ１Ｐ２；ＩＲＦ７；ＲＳＡＤ２；ＩＦＩ４４；ＯＡＳ３；およびＩＦＩＴ２；
（ｉｖ）ＬＡＭＰ３；ＨＥＲＣ６；ＬＯＣ２８６２０８；ＩＦＩＴ３；ＲＡＬＧＰＳ１；ＰＡＲＰ９；ＣＣＤＣ７５；およびＣＮＰ；
（ｖ）ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ；ＦＬＪ２００３５；ＰＡＲＰ１２；ＰＮＰＴ１；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＳＡＭＤ９；およびＬＯＣ４０２５６０
の各々から少なくとも１つの遺伝子の発現について被験体由来の試料を分析する工程と、
（ｂ）試料における前記遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化した、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が低いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対照試料における同じ遺伝子の発現と比較して変化していない、試料における遺伝子の発現が、被験体が前記抗ウイルス治療に対して応答性である可能性が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗ウイルス治療がペグ化ＩＦＮαを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗ウイルス治療がｐｅｇＩＦＮαおよびリバビリンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルス感染またはＣ型肝炎ウイルス感染である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
試料が肝臓組織を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、２６個、２７個、２８個、または２９個の遺伝子の発現が分析される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子発現が、試料におけるｍＲＮＡ遺伝子転写産物の量、または前記ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの量を測定することによって決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子発現が、試料において、遺伝子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの量を測定することによって決定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドまたはポリペプチドの量が特異的結合分子を用いて決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
被験体がヒトである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１に列挙された遺伝子群の各々の少なくとも１つの遺伝子の発現を被験体由来の試料において分析するための手段と、任意で
（ｉｉ）試料における遺伝子の発現を対照試料における同じ遺伝子の発現と比較するための手段と
を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１５】
試料における前記遺伝子発現を表す分子を標的にすることができる１以上の特異的結合分子を含み、前記特異的結合分子がオリゴヌクレオチドプローブ、抗体、またはアプタマーである、請求項１４に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９−１】
【図９−２】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５１９５５１（Ｐ２０１１−５１９５５１Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０５４７０（Ｐ２０１１−５０５４７０）
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３０１７６
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【出願人】（５０４０５１９２８）ユニバーシティ ホスピタル バーゼル (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２０日（２００９．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４６４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３０１７６
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０２４０７３３６）ノバルティス・フォルシュングスシュティフトゥング・ツヴァイクニーダーラッスング・フリードリッヒ・ミーシェー・インスティトゥート・フォー・バイオメディカル・リサーチ (19)
【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇ Ｚｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｍｉｅｓｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【出願人】（５０４０５１９２８）ユニバーシティ ホスピタル バーゼル (2)
【Ｆターム（参考）】
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