抗オステオポンチン抗体およびその用途
【課題】リウマチ性関節炎の病因を明確にし、より優れた治療法を提供する。
【解決手段】ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体。この抗体は、自己免疫疾患治療剤、リウマチ治療剤ないしリウマチ性関節炎の治療剤として有用である。また、このオステオポンチン抗体は、リウマチの診断薬および診断方法にも有用である。
【解決手段】ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体。この抗体は、自己免疫疾患治療剤、リウマチ治療剤ないしリウマチ性関節炎の治療剤として有用である。また、このオステオポンチン抗体は、リウマチの診断薬および診断方法にも有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトオステオポンチン抗体および該抗体を用いた自己免疫疾患、リウマチおよびリウマチ性関節炎の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であり、ヒトの場合、ｍＲＮＡのスプライシング (splicing)の違いから、オステオポンチン−ａ（以下、「ＯＰＮ−ａ」という）、オステオポンチン−ｂ（以下、「ＯＰＮ−ｂ」という）およびオステオポンチン−ｃ（以下、「ＯＰＮ−ｃ」という）の少なくとも３つのアイソフォームが生じ得ることが知られている。（Y.Saitohet al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63）このうち、ＯＰＮ−ａの前駆体は、後記配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を持ち、分泌により、シグナルペプチドが切断され、Ｉ１７−Ｎ３１４の成熟体ＯＰＮ−ａがつくられると考えられている。また、成熟体ＯＰＮは、生体内のトロンビンにより１６８番目のアルギニン残基のＣ末端側で切断されて、Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントの２つになる。
上記のＯＰＮは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されている。ＯＰＮは、内部にＲＧＤ配列をもち（例えば、ＯＰＮ−ａでは、１５９〜１６１残基目）、このＲＧＤ配列を認識するαＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５等のインテグリンは、ＯＰＮの主な受容体であり、このうち、αＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５インテグリンは、血管の平滑筋細胞において細胞接着を媒介し、更にαＶβ３は、マクロファージ、リンパ球、内皮細胞および平滑筋細胞等の遊走に関係している。
さらに、これまでの研究から、ＯＰＮは、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を介してα９β１、α４β１およびα４β７インテグリンと結合することも明らかにされているが、これらのうちα４β１は、トロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１はトロンビン切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている。（Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry274,36328-36334 / P. M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79 /S.T.Barryet al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351）。これらのα９及びα４、β１及びβ７のインテグリンサブユニットは、相互にアミノ酸配列間の類似性が高い。そして、α４β１及びα４β７インテグリンは、主として、リンパ球と単球で見出されるが、好中球ではごくわずかに発現しているにすぎない。一方、α９β１は、好中球に選択的に高発現しておりVCAM-1やTenascin-Cなどを介して、好中球遊走に必須の機能を担っている。また、筋肉細胞や上皮細胞、肝細胞などで広く発現している。このように、インテグリンサブユニットα４とα９の細胞質ドメインは、それぞれ微妙に異なった細胞内シグナル伝達経路を通して、互いに協同して炎症部位への白血球の遊走と凝集を促し、それらの浸潤活性を増強することによって、様々な炎症反応に関与していると考えられる。
このように、様々な種類のインテグリンが、白血球の遊走を促進し、炎症反応に関与していることから、これらのインテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症剤としての可能性を有していると思われる。たとえば、インテグリンαＶβ３は、破骨細胞、血管内皮細胞および平滑筋細胞等で発現されており、αＶβ３インテグリンとその様々な結合リガンドとの結合を阻害することにより、例えば関節では、関節破壊抑制作用が期待できることから、抗αＶβ３抗体の開発が実際に行われている。
しかしながら、インテグリンファミリーに属する受容体は、広範な組織で普遍的に発現して生命活動維持に必須の機能を担っていることから、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療にインテグリンに対する抗体を用いると、他の部位でも同様の阻害がおこる可能性があり、副作用の発生も懸念される。
【０００３】
また、ＷＯ０１／７１３５８にはα４インテグリンとオステオポンチンとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法およびスクリーニングで得られた物質を用いた炎症疾患の治療方法等について開示されている。
リウマチ性関節炎の病因としては種々の因子が考えられており、多くの報告があるが確実なものはない。また、その治療法においても、現在知られているものは対症療法的なものであり、必ずしも満足できるものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、リウマチ性関節炎の病因を明確にし、より優れた治療法を提供することが強く求められており、本発明はこのような課題の解決をその目的とするものである。
また、リウマチ性関節炎は、変形性関節症などと識別し難く、このための診断方法の提供も本発明の課題の一つである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、リウマチ患者および変形性関節症患者で、関節腔液のＯＰＮ濃度が高値を示すことを知り、さらにリウマチ患者において、全ＯＰＮに占めるトロンビン開裂型のＮ末端フラグメントの割合が増大することを初めて見出し、ＯＰＮが、これらの疾患の発症に深く関わっていることに思い至った。そして、後記参考例で示すようにＯＰＮのノックアウトマウスを用いた実験によりこの事実を確認した。
また、ＯＰＮをトロンビンで切断したＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントについて、それぞれのフラグメントを区別して認識する抗体を作成し、それらを用いた試験により、リウマチ性関節炎患者では、特にトロンビンにより切断されたＮ末端フラグメントが関節腔内で高濃度を示すことを見出した。
本発明者らは、前述のリウマチ性関節炎患者に高い濃度で見出されるＮ末端フラグメントには、ヒト型インテグリンが認識するＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列が共に存在していることに着目し、これら両者の配列を同時にブロックする抗体は、ＯＰＮとインテグリンの結合を幅広く阻害し、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療に効果があるのではないかと予想した。
さらに、ＯＰＮは、腎臓・胎盤・卵巣・脳・皮膚などにも分布するが、主として骨組織に発現している。本発明者らは、リウマチ性関節炎の治療に際して、ＯＰＮとインテグリンの結合をＯＰＮ側により特異的な方法で遮断することが望ましいと考えた。その際、炎症には前述の多岐に渡るインテグリンが協同的に関与していると考えられるので、これらの多岐に渡るインテグリンとの結合が、より幅広く遮断されることが有効であると考えた。
【０００６】
そこで、ヒトＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する抗体を作成し、細胞接着および細胞遊走等の実験によりその効果を確認した。さらに、マウスＯＰＮの当該内部配列に対応する合成ペプチドに対する抗体を取得し、マウスの関節炎病態モデルを用いて、そのような抗体の治療薬としての効果を調べた。
すなわち、マウスＯＰＮは、ヒトＯＰＮとアミノ酸配列上で相同な位置にマウスのインテグリンによって認識されるＲＧＤ配列及びＳＬＡＹＧＬＲ配列を有しているので、これらの配列を同時にブロックする抗体として、Ｍ５抗体を取得した。このＭ５抗体とマウスＯＰＮおよびそのトロンビン消化物との結合は、ＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドで阻害され、またこのＭ５抗体は、ＴＮＦ-αで活性化したマウス脾臓由来の単球の遊走を阻害することが確認された。このＭ５抗体を、マウスのカルバリア（calvaria）器官培養系で調べてみたところ、骨破壊の抑制作用が観察された。さらに、マウスのコラーゲン関節炎モデルに、上記抗体を投与してみたところ、明らかに治療効果を示すことが確認された。
以上の結果は、ＲＧＤ配列、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とヒト型インテグリンの結合を同時にブロックする抗体が、ＯＰＮとインテグリンの結合を阻害し、リウマチ性関節炎等の治療に有効であることを強く示唆しており、さらに、若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチのみならず、乾癬性関節炎や乾癬の治療への効果が期待される。
また、臓器移植後の慢性拒絶は、血管や気管支の閉塞性病変を特徴としているが、その組織学的検討から、Ｔ細胞やマクロファージの活性化がサイトカイン、増殖因子の産生、血管内皮細胞障害を引き起こし、さらに血管平滑筋の増殖が線維化などを引き起こすために血管閉塞へ進展して行くと考えられている（P. Freese et al., (2001): Nephrol DialTransplant,16, 2401-2406 / J. R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88,1429-1441/ S. R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72,1138-1144）。そして、これらのマクロファージの活性化や血管平滑筋の線維化にはＯＰＮが必須の蛋白として機能することが報告されており（A. O’Regan et al., (2000): Int J Exp Pathol, 81,373-390）、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、単球や好中球の遊走を抑制することにより、このような線維化に向けての過程を抑制する可能性がある。
【０００７】
従って、臓器移植後の慢性拒絶反応を抑制し、臓器生着に寄与し、また、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ぶとう膜炎、ベーチェト病、多発性筋炎、糸状体増殖性腎炎、サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療への効果が期待される。
すなわち本発明は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を幅広く阻害する抗オステオポンチン抗体を提供するものである。
また本発明は、上記抗体を有効成分として含む自己免疫疾患治療剤、リウマチ治療剤ないしリウマチ性関節炎の治療剤を提供するものである。
更に本発明は、リウマチ患者ないしはリウマチ性関節炎患者に、前記の抗オステオポンチン抗体を投与し、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害することにより、自己免疫疾患、リウマチないしはリウマチ性関節炎を治療する方法を提供するものである。
また更に本発明は、上記オステオポンチン抗体を利用するリウマチの診断薬および診断方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体（以下、「ＯＰＮ阻害抗体」という）は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリン、例えばαｖβ１，αｖβ３，αｖβ５等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリン、例えばα９β１，α４β１、α４β７等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害できるものであればどのような抗体でもよい。ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列とは、ヒトＯＰＮの１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列を指し、その相当配列とは、他の哺乳動物のＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲに相当する配列を言い、例えばブタではヒトと同じくＳＶＶＹＧＬＲ、サルではＳＶＡＹＧＬＲ、マウスやラットではＳＬＡＹＧＬＲ、ウシではＳＶＡＹＧＬＫ、ウサギではＳＶＡＹＲＬＫである。本発明のＯＰＮ阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃや、これらのＮ末端フラグメント、あるいはアミノ酸配列ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を含んでいるペプチド（以下、これらを「ＯＰＮ関連ペプチド」と総称する）を抗原として用いることにより作成できる。なお、ここでいうＯＰＮのフラグメントとは、ＯＰＮがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントをいい、例えばトロンビンにより分解されたフラグメントをいう。
上記ヒトＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するＯＰＮ−ａの１５３番目バリン残基から１６９番目セリン残基までのペプチド（ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ）を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。抗原性を高めるためには、上記ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。
【０００９】
また、実験動物としてマウスを用い、ＯＰＮに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのＯＰＮに対応するＯＰＮ阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
上記ＯＰＮ関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記ＯＰＮ関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法 (B. F. Erlanger et al., (1954): J. Biol. Chem., 234, 1090-1094)または活性化エステル法（A.E.Karu et al., (1994): J. Agric. Food Chem., 42, 301-309）等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＯＰＮ関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
【００１０】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ＯＰＮ関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。
上記の方法によるＯＰＮ関連ペチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原として用いる抗体の作製法および当該抗体を用いる免疫化学的測定法について説明する。尚、抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
【００１１】
すなわち、まず、例えば、ＯＰＮ関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回、行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、ＯＰＮ阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてＯＰＮ阻害抗体を得ることもできる。
本発明の抗体をヒトあるいは動物の治療用途に用いる場合には、得られたＯＰＮ阻害抗体の定常領域を治療対象とするヒトあるいは動物の抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変したキメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）や当該動物化抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０２３９４００またはＥＰ０４５１２６参照）を用いることが望ましい。あるいは、治療対象とするヒトあるいは動物の抗体産生に関与する遺伝子を人為的に導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（当該動物型抗体）（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３またはＷＯ９７／０７６７１参照）を利用することが望ましい。
【００１２】
例えば、治療の対象がヒトであり、ＯＰＮ阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒトマウスキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。また、抗体産生のためにはファージディスプレー (phage display)法を用いることもできる。
このようにして得られたＯＰＮ阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したFv、ＦabやＦ(ab')２のかたちで用いることもできる。
かくして得られたＯＰＮ阻害抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、リウマチ性関節炎・若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチ・乾癬性関節炎・乾癬等の治療、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶとう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療に用いることができる。
本発明のＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、リウマチ治療剤あるいはリウマチ性関節炎治療剤として用いることができる。これらリウマチ治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい（自己免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じればよい）。また製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
上記製剤化に当たってのＯＰＮ阻害抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいはＯＰＮ阻害抗体の結合力価等により異なるが、例えば０.１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
このようにして得られた本発明の治療剤は、有効成分であるＯＰＮ阻害抗体がＯＰＮのＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列に強く結合し、ＯＰＮのこの部分とインテグリンとの結合を阻害することによって、結果的にリウマチ及びリウマチ性関節炎やそれ以外の自己免疫疾患の症状の増悪を押さえることができると期待される。
そして、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、インテグリン側でなくＯＰＮ側に特異的に結合するものであるため、インテグリンの他の重要な機能を阻害するおそれは少なく、副作用の問題は回避されるものと期待される。
【００１３】
更に本発明のＯＰＮ阻害抗体は、自己免疫疾患治療剤をスクリーニングする目的にも使用することができる。すなわち、前述のように、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、自己免疫疾患の治療剤となりうる。そこで、例えば、所定量のＯＰＮとインテグリンが存在する測定系内にスクリーニングするべき物質（被検物質）とＯＰＮ阻害抗体とを競合的に加えた反応系を構成し、使用したＯＰＮ阻害抗体の量に対するＯＰＮ−インテグリン間の結合の阻害程度を測定すれば、被検物質の自己免疫疾患治療剤としての利用可能性を評価することができる。
同様に、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、リウマチないしはリウマチ性関節炎の治療剤となりうるので、ＯＰＮ阻害抗体を用いて、上記と同様の反応系を構成すれば、リウマチないしはリウマチ性関節炎のスクリーニングに使用することができる。
更にまた、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、リウマチ診断剤として利用することができる。先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出されることが判明している。そこで、このＯＰＮ阻害抗体を用いて検体中のＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントの量を測定すれば、リウマチの診断に役立てることができる。その手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができる。
上記手法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より好ましい方法の例としては、例えば本発明のＯＰＮ阻害抗体を担体上に固相化し、本発明のＯＰＮ阻害抗体とはＯＰＮ上の異なる部位を認識する抗体を標識化することにより、ＯＰＮまたはそのN末端フラグメントを検出することができ、これをリウマチ性関節炎の診断薬とすることができる。
上記抗体を標識するにあたり使用される標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＰ」という）等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
【００１４】
より具体的なＯＰＮアイソフォームの検出方法について、サンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、（ａ）本発明のＯＰＮアイソフォームに対する抗体を担体に固相化し、次いで、（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、（ｃ）これに各種濃度のＯＰＮアイソフォームを含む検体を加え、ＯＰＮアイソフォーム−抗体複合体を生成させた後、（ｄ）標識した抗ＯＰＮアイソフォーム抗体を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に（ｅ）担体に結合した標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の遊離ＯＰＮアイソフォームの量を決定することができる。
まず、（ａ）工程において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１−２０μｇ／ｍｌが適している。また、緩衝液の量は、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で、より好ましくは、２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
また、（ｂ）工程のブロッキングについては、次の段階で添加する検体中のＯＰＮには抗原抗体反応とは無関係に担体に吸着される部分が存在する場合があるので、そのような非特異的吸着を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ」、大日本製薬、コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０.０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。
次いで（ｃ）工程において、ＯＰＮアイソフォームを含む検体を固相化抗体と接触させることにより、固相化抗体でＯＰＮアイソフォームを捕捉し、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させる。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
更に（ｄ）工程において、固相化抗体に捕捉されたＯＰＮアイソフォームの別のエピトープを認識する標識抗体を加え、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、（ｃ）工程において前記したものが使用される。
上記（ｄ）工程において使用される標識抗体は、（ａ）工程の固相化抗体と異なるエピトープを認識するものであることが要求される。例えば固相化抗体としてＯＰＮアイソフォームの前半領域を認識するポリクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ＨＲＰまたはＡＰ等）を結合した標識抗体としては、ＯＰＮアイソフォームの後半領域を認識するポリクローナル抗体を用いることが好ましい。このように異なる部位を認識する抗体を用いることで、選択スプライシングにより生じるＯＰＮアイソフォームを高感度でかつ特異的に測定できる。
（ｄ）工程において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５,０００−１０,０００倍、好ましくは最終測定時の最大吸光度が１.５−２．０となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約３７℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を結合することができる。
最後に（ｅ）工程において、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＯＰＮの量を算出することができる。
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させることにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるＡＰを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
既知の濃度のＯＰＮアイソフォームを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のＯＰＮアイソフォームの濃度を算出できる。
上記した本発明のＯＰＮアイソフォームの検出方法は、ＯＰＮの働きの解明や、ＯＰＮの関連する疾患の診断、治療のために使用されるが、その使用方法の一例としては、トロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントと非切断型ＯＰＮを区別して検出することにより、炎症異常の有無を検出し、例えばリウマチと変形性関節症を区別する炎症異常の検出キットを挙げることができる。
先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節腔内では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出される傾向があるが、変形性関節炎患者ではそのような傾向は有意に低い。このように、関節腔内のＯＰＮ中に占めるＮ末端フラグメントの割合がそれぞれの患者では異なっているので、リウマチと変形性関節症を区別して診断する為には、ＯＰＮ全体の中に占めるＮ末端フラグメントの割合を測定できればよい。
【００１５】
より具体的な例としては、ＯＰＮの３種のアイソフォーム、ＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂおよびＯＰＮ−ｃのすべてに共通に存在する下記３種の配列について、それぞれのペプチドに対する抗体を作製する。
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）（１）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ
（Ｋ１７０からＥ１８７＋Ｃ）（２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ
（Ｉ１７からＱ３１＋Ｃ） （３）
このうち、配列（１）は、トロンビン切断部位のＮ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメント上で共通に存在する。一方、配列（２）は、トロンビン切断部位よりＣ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮでは存在するが、Ｎ末端側フラグメントには含まれない。また、配列（３）は、ＯＰＮのＮ末端側１７番目から３１番目までのアミノ残基に対応し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメントで共通に存在する。 リウマチ患者と変形性関節症患者の鑑別の為の診断キットは、上記の３種の配列のペプチドそれぞれに対する抗体を利用した２種類の免疫検出試薬から構成することができる。 すなわち、第一の免疫検出試薬では、上記の配列（３）および（２）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮを定量する。その際、例えば、配列（３）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（２）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。また、第二の免疫検出試薬では、上記の配列（１）および（３）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮとトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントを合わせた総量を定量する。その際、例えば、配列（１）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（３）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。そして、同一の患者検体に対する上記の２種類の免疫検出試薬による結果を比較照合することにより、該患者における全ＯＰＮ中に占めるトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントの割合を明らかにすることができ、リウマチと変形性関節症の区別が可能となる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。
実 施 例 １
ＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白のクローニング、構築、精製および
試薬：
クローニング及び蛋白精製については、基本的に、文献（S. Kon et al., (2000): J. Cell. Biochem., 77, 487-498）に記載の方法に従って行った。
ヒトＯＰＮのアイソフォームであるａ，ｂについては、そのｃＤＮＡを次のようにして得た。ヒト腎癌細胞株であるＮＲＣ−１２細胞から調整したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型とし、下記ＯＰＮ−５、ＯＰＮ−３プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、それぞれシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂの全長をコードするｃＤＮＡを得た。
次に、上記文献に記載したようにして、このようにしてクローニングしたＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ４Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＥＣ２.５.１.１８）遺伝子と同じリーディングフレームとなるように挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を用いてＧＳＴ融合蛋白として発現させた（以下、このようにして得られたＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白を、それぞれ、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ」，「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ」という）。
ＯＰＮ−５：
５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧ
ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＧＣ−３'
ＯＰＮ−３：
５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡ
ＡＧＡＴＧＣＡＣＴＡＴＣ−３'
ヒトＯＰＮ−ｃアイソフォームをコードするｃＤＮＡについては、上記のＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型とし、二段階ＰＣＲにより作製した。一段階目はＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｃｔ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｔ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行い、二つのＰＣＲ産物を混ぜ、熱を加え徐々に冷却することによりアニールさせ、酵素を加えて伸長させた。次いで二段階目として、ＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ｃの全長をコードするｃＤＮＡを得た。このアイソフォームｃｃＤＮＡは、アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴ融合蛋白を作製した（以後、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ」という）。
ＯＰＮｃｔ−３：
５'−ＡＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣ
ＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣ−３'
ＯＰＮｃｔ−５：
５'−ＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣ
ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣ−３'
ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりアミノ末端側半分（Ｍ１−Ｒ１６８）をコードするｃＤＮＡは、上記のＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型として、ＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｎｈ−３プライマーを用いてＰＣＲをうことによって、得られた。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ」という）。
ＯＰＮｎｈ−３：
５'−ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＣＣＡＴＡＡ
ＡＣＣＡＣＡＣＴ−３'
ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりカルボキシル基側のオステオポンチンタンパク質（ｈＯＰＮＣｈａｌｆ）は、二段階ＰＣＲによりＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型として作製した。一段階目はＯＰＮ−５、下記のＯＰＮｃｈ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｈ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行った。二段階目はＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりカルボキシル基側ＯＰＮタンパク質を作製した。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ」とする）。
ＯＰＮｃｈ−３：
５'−ＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣ
ＣＴＡＧＧＡＧ−３'
ＯＰＮｃｈ−５：
５'−ＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＡＧＡＡＧＴＴ
ＴＣＧＣＡＧＡ−３'
種々の組換えＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白は、常法に従って大腸菌より調製し、上記文献で述べた方法によりグルタチオン−セファローズカラムを使用して、精製した。このうち、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ蛋白については、連結部分をプレシジョン・プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ；アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社）で開裂させることによって、ＧＳＴ蛋白部分を取り除き、ＯＰＮのアミノ末端側半分（Ｉ１７−Ｒ１６８）のみから構成される蛋白（以下、「ｎＯＰＮ」という）を得た。
一方、ＯＰＮ−ａの全長 （Ｍ１−Ｎ３１４）をコードするｃＤＮＡについては、さらに、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）ベクター（インビトロゲン社）に挿入し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬（株）社製）にトランスフェクトした（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞」という）。 この細胞より得られた糖鎖結合型のＯＰＮ−ａ（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ」という）については、以下のようにして精製した。即ち、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞の培養上清をＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂカラム（アマルシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ＵＬＴＲＯＧＥＬＡｃＡ４４カラム（ＢｉｏＳｅｐｒａ ＳＡ製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに付し、これに引き続いて、ＲＥＳＯＵＲＣＥＲＰＣカラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社製）での逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
免疫感作や結合の研究に用いた種々のペプチドは、シグマ・ゲノシス・ジャパン社から入手し、あるいは、ペプチド合成機（モデル４３２Ａ、パーキンエルマーライフサイエンス社）でＦｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）法により化学合成した後、Ｃ18逆相カラムクロマトグラフィーで精製することにより得た。
実 施 例 ２
モノクローナル抗体の製造：
下に示すような、ヒトＯＰＮの内部配列に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
ペプチド１；
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）
ペプチド２；
ＣＩＤＳＱＥＬＳＫＶＳＲＥＦＨＳＨ（Ｃ＋Ｉ２６１からＨ２７６）
このうち、ペプチド１は、それぞれαｖβ３とα９β１インテグリンレセプターを認識するＲＧＤとＳＶＶＹＧＬＲ配列を有する。
これらのペプチドを、サイログロブリン（thyroglobulin）と結合させ、常法に従ってマウスの免疫に用いた。続いて、免疫されたマウスから脾細胞（splenocytes）を分離し、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と細胞融合に付した。そして、文献（M.Kinebuchiet al., (1991): J. Immunol., 146, 3721-3728) に述べた方法により、免疫に使用したペプチドに反応するハイブリドーマを選択した。
ペプチド１および２で免疫したマウスから、それぞれ２Ｋ１および４Ｃ１と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体２Ｋ１を産生するハイブリドーマについて、２００１年６月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 1 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７８８３として寄託した。また、モノクローナル抗体５３（ｍＡｂ５３）は、全長組換えヒトＯＰＮで免疫することにより得られたものである（D.S.Bautista at al., (1994): J. Biol. Chem., 269, 23280-23285）。
実 施 例 ３
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とモノクローナル抗体の反応性：
実施例２で得られたモノクローナル抗体２Ｋ１および４Ｃ１のＯＰＮおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンブロット法を用いて試験した。２Ｋ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆと反応することがわかった。また、４Ｃ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆと反応することがわかった。更に、これらのモノクローナル抗体は、大腸菌から生産した糖鎖非結合型の組換えＯＰＮと結合するばかりでなく、糖鎖結合型ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ蛋白及びそのトロンビン消化物（以下、「トロンビン開裂ＯＰＮ」という）とも反応した。
実 施 例 ４
モノクローナル抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
モノクローナル抗体がＯＰＮに対する細胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、９６穴プレートを、４℃で一晩、種々の濃度のＣＨＯ／ＯＰＮ−ａでプレコートし、次いで１０分間、３７℃の条件で０.５％ＢＳＡのＰＢＳにより非特異的接着をブロックするための処理を行った。ヒト線繊維芽細胞ＴＩＧ−７またはインテグリンα９サブユニットｃＤＮＡで形質転換したＳＷ４８０細胞（以下、「α９形質転換ＳＷ４８０細胞」という）を、０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭに懸濁させ、細胞懸濁液（細胞濃度は、５×１０４細胞／ウエル）２００μｌを、種々の濃度のモノクローナル抗体または合成ペプチドの存在または不存在下でＣＨＯ／ＯＰＮ−ａまたはｎＯＰＮでプレコートした９６穴プレートに注入し、１時間、３７℃でインキュベートした。
培地をプレートから除去し、全てのウエルを０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２回洗浄した。接着した細胞は固定し、２０％メタノール中の０.５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。
全てのウエルは、水で３回すすぎ、接着した細胞は２０％酢酸により転溶させた。各ウエルから得られた結果物の上清をイムノリーダーで分析し、５９０ｎｍの吸収をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために測定した。全てのアッセイは、３回行い、少なくとも３つの独立した実験を行った。示される値は、少なくとも３つの別々の実験の平均である。
ＴＩＧ−７はＯＰＮに良く接着することが知られているが、図１のＡに示されているように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で阻害され、コントロールペプチド（ＯＰＮのＣ末部分であるＫ２９６−Ｎ３１４）（１００μｇ／ｍｌ）で阻害されないので、ＲＧＤ依存である。また、図１のＢに示すように、２００μｇ／ｍｌの２Ｋ１抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかになった。更に、図１のＣに示すように、２Ｋ１の細胞接着阻害効果は、ｍＡｂ５３が示すものに匹敵し、濃度依存的である。なお、２Ｋ１およびｍＡｂ５３は、ＴＩＧ−７細胞のビトロネクチン（ＶＮ）やフィブロネクチン（ＦＮ）への接着は阻害しない。
図２は、ｎＯＰＮおよびビトロネクチンと、α９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着に対するモノクローナル抗体の阻害を示した図面である。図２のＡに示すように、１μｇ／ｍｌのビトロネクチンとα９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）で阻害されることからＲＧＤ依存である。３μｇ／ｍｌのｎＯＰＮに対するα９形質転換ＳＷ４８０細胞の接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）と抗α９β１モノクローナル抗体であるＹ９Ａ２(A. Wang et al., (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15,664-672)を併用することにより阻害されることから、ＲＧＤ依存および非依存性の接着である。また、図２のＢは、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮおよびビトロネクチンの接着に対する２Ｋ１の影響を示している。α９形質転換ＳＷ４８０細胞とビトロネクチンの接着は、２Ｋ１により阻害されないが、ｎＯＰＮとの接着は２Ｋ１により阻害される。この結果、２Ｋ１はＲＧＤ依存性の接着阻害能を保持していることが判明した。
実 施 例 ５
モノクローナル抗体によるＯＰＮ−誘導単球遊走の阻害：
Ｕ９３７細胞を用いた細胞遊走試験は、ＣｈｅｍｏＴｘ１０１−８システム（ニューロプローブ社）を用いて行った。細胞は、０.１％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２×１０6／ｍｌとなるように調整し、フィルター（ポアサイズ８μｍ）の上層に加え、下層にはＯＰＮタンパク質を加えた。
ＣｈｅｍｏＴｘプレートは、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間静置した。静置後、フィルターをメタノールで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ−Ｅ）で染色した。フィルターの裏面まで遊走した細胞数を顕微鏡下、倍率４００倍で算定した。試験は３回行い、その平均をデータとした。この結果を図３に示す。
図３ａは、表示された濃度における、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに対するＵ９３７細胞の細胞遊走を示す。また、図３ｂは、５０μｇ／ｍｌの抗原特異精製された２Ｋ１、ｍＡｂ５３または対照であるマウスＩｇＧの存在または不存在下、１０μｇ／ｍｌの各ＯＰＮを用いた阻害アッセイである。
図３ａおよび図３ｂに示されるように、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆは、ヒト単球細胞Ｕ９３７の遊走を濃度依存的に誘導する（Ａ）。２Ｋ１抗体は、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆにより誘導された単球細胞遊走を明らかに阻害する。これに対し、ｍＡｂ５３は、全長ＯＰＮにより誘導される単球細胞遊走を阻害するだけである（Ｂ）。
参 考 例 １
ＯＰＮと関節炎誘発：
関節炎におけるＯＰＮの働きを明らかにするため、常法に従ってＯＰＮ遺伝子欠損マウス（S. R. Rittling et al., (1998): J. Bone Mminer.Res.,13 (7), 1101-1111）を人工的に作製し、正常なマウスと比較実験を行った。
ＯＰＮ遺伝子欠損マウス（ＯＰＮ−／−）と正常マウス（ＯＰＮ＋／＋）のそれぞれに、関節炎を引き起こす薬剤として市販されている関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Arthrogen-CIA（登録商標） mAb, Arthritogenic mAb cocktail、岩井化学薬品社製）を用い、製品添付書類に従い投与し、関節炎を惹起し、その程度を観察した。対照としては、両マウスに生理食塩水を投与したものを用いた。
関節炎の程度は、下記に従った関節炎スコアと、投与１０日後のリストの腫れで比較した。この結果を図４および図５に示す。
図４から明らかなように、関節炎用カクテル／リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」という）を投与された正常マウスでは、４日目から関節炎スコアが上昇し、１０日目で最高（１２以上）に達した。これに対し、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスでは、５日目から関節炎スコアは上昇するものの、最高でも４以下であった。また、生理食塩水を投与した群では、いずれも関節炎スコアの上昇が見られなかった。
また、図５に見るように、リストの腫れ（手首の腫れ）もＯＰＮ遺伝子欠損マウスは正常マウスに比べて明らかに弱く、関節炎に対しＯＰＮが関係していることが明らかである。
実 施 例 ６
２Ｋ１抗体のヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、２Ｋ１抗体のサイトカイン活性化ヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性を調べた。好中球遊走阻害活性についての結果を表１に、単球遊走阻害活性についての結果を表２にそれぞれ示す。
＜ 実験方法 ＞
健常人ヒト末梢血からフィコール（Ficoll）法にて単核球画分と好中球画分を分離した（P. M.Daftarianet al., (1996): Journal of Immunology, 157, 12-20）。単球はフィコールと血清の中間層を採取し、フラスコにて３７℃で１時間培養した後に付着した細胞を用いた。単球画分を採取した残りの赤血球層に３％デキストラン−ＰＢＳを５倍量加えて赤血球を凝集させてから、１５０×ｇ、４℃で５分間遠心した。
凝集した赤血球が沈殿し、上清には好中球が懸濁状態で存在するので、この画分を５００×ｇ、室温で２０分間遠心すると好中球が得られた。このようにして得られた単球と好中球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。
遊走実験は４８−ウエル マイクロ ケモタキシス チャンバー（micro chemotaxis chamber）（Neuro ProbeInc.製）を用いて行った。トロンビン開裂ＯＰＮに、２Ｋ１抗体を種々の濃度で添加したものを予め３７℃で１５分間放置してから、ローワー チェンバー（Lower chamber）に加えた（ヒトＯＰＮ最終濃度は 10μｇ／ｍＬ）。その上からポリカーボネートフィルター（ポアサイズ ５μｍ）を載せて、さらにアッパー チェンバー（Upper chamber）に５０μＬの細胞懸濁液（２×１０6cells／ｍＬ）を加えた。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養してから、ポリカーボネートフィルターを取り外して、フィルター上側表面の細胞を除去してから、フィルターの裏側に浸潤した細胞をディフ−クイック（Diff-Quick）（Baxter社製）にて染色した。染色した細胞数を４０倍の倍率下で計測した。この結果は６ウエルの平均細胞数（cells／ｍｍ３）±ＳＤとして示した。
＜ 実験結果 ＞
２Ｋ１抗体は、ＴＮＦ−αで活性化したヒト末梢血好中球および単球のトロンビン開裂ＯＰＮに対する遊走を阻害した。
好中球遊走阻害：
【表１】
単球遊走阻害：
【表２】
実 施 例 ７
Ｍ５抗体の製造：
下に示すような、マウスＯＰＮの内部配列（Ｃ＋Ｖ１３８からＲ１５３）に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
Ｍ５ペプチド：
ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ
このペプチドをサイログログリンと結合し、これを用い常法に従ってウサギを免疫した。免疫されたウサギの抗血清を採取し、Ｍ５ペプチドＮ末のシステインとチオールセファロースビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）とをジスルフィド結合により結合させたカラムを用いてＭ５抗体を製造した。
実 施 例 ８
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とＭ５抗体の反応性：
実施例７で得られたＭ５抗体のＯＰＮ、およびそのトロンビン消化物に対する結合能はウエスタンブロット法を用いて試験した。用いたＯＰＮはＣＨＯ細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えマウスＯＰＮを用いた。Ｍ５抗体はＯＰＮおよびそのトロンビン消化物と反応した。
実 施 例 ９
Ｍ５抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
Ｍ５抗体がＯＰＮに対する細胞接着を阻害するかどうかを、文献（S. Kon et al., (2002): J. Cell. Biochem., 84(2),420-432）に述べた方法で調べた。ＯＰＮは、プレシジョン・プロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）によりＧＳＴ部を除去した全長マウスＯＰＮ（以下、「ｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴ」という）を使用した。細胞はマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。
図６に示されているように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞はｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴに対し濃度依存的に接着する。また、図７に示すように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍＬ）で阻害されるので、ＲＧＤ依存である。図８に示すように、２００μｇ／ｍＬのＭ５抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかとなった。
実 施 例 １０
Ｍ５抗体のマウス脾臓由来単核球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、Ｍ５抗体のサイトカイン活性化マウス脾臓由来単球遊走に対する阻害活性を調べた。この結果を表３に示す。
＜ 実験方法 ＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞をスライドガラスですり潰して単細胞にしてから、フラスコにて３７℃で１時間培養して付着した細胞を単球として用いた。この単球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。遊走実験は、前記実施例６のヒトの場合と同様の方法で行った。
＜ 実験結果 ＞
Ｍ５抗体は、全長マウスＯＰＮ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）をウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ社製）にて切断した得られたトロンビン切断型マウスＯＰＮに対するＴＮＦ−αで活性化したマウス脾臓由来単球の遊走を阻害した。
【表３】
実 施 例 １１
Ｍ５抗体の骨破壊抑制作用：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスカルバリア器官培養系における骨破壊抑制作用を調べた、この結果を表４に示す。
＜ 実験方法 ＞
生後１日目の仔マウスの頭蓋骨を切り出し、その半分を大きさを揃えてから２４ウエルプレートの各ウエルに入れた。これらに、ヒトパラチロイドホルモン（Parathyroid hormone，ＰＴＨ ）(１−３４)を最終濃度が１０ｎＭになるようにＤ−ＭＥＭ培養液（１０％ウシ血清添加）に添加したものを加えて骨破壊を引き起こした。Ｍ５抗体は、最終濃度２００μｇ／ｍＬになるように添加した。３７℃で１週間培養した後に、骨から培養液中へ遊離したカルシウム量をカルシウムＥテストワコー（和光純薬）にて定量した。
＜ 実験結果 ＞
ＰＴＨ未添加では、７．０２ｍｇ／ｍＬのカルシウム値を示したが、ＰＴＨ添加により、９．１１ｍｇ／ｍＬと骨からのカルシウムの遊離促進が見られた。 Ｍ５抗体を２００μｇ／ｍＬの濃度で添加しておくと、骨吸収が約７０％阻害されることが確認された。
【表４】
実 施 例 １２
Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果を調べた。関節炎スコアについての結果を表５に、足浮腫に対する結果を表６に、体重変化についての結果を表７に、摂餌量変化についての結果を表８にそれぞれ示す。
＜ 実験方法 ＞
関節炎の惹起には、コラーゲンに特異的な４つのエピトープを認識する関節炎惹起抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Arthrogen-CIA（登録商標） mAb, Arthritogenic mAb cocktail、岩井化学薬品社製）を用いた。マウスに、この関節炎カクテルを静脈内投与し、その３日後にＬＰＳ（１００μｇ）を腹腔内投与することにより惹起した。関節炎はＬＰＳ投与後３日目から観察され、６日目で最大となった。
Ｍ５抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、４０μｇ，１５０μｇまたは４００μｇの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはウサギＩｇＧ投与群（投与量：４００μｇ）をおいた。また、抗マウスＴＮＦ−α抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、２００μｇ／マウスの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはラットＩｇＧ投与群（投与量：２００μｇ）をおいた。また、ＭＴＸについては、ＬＰＳ投与日から一日一回の頻度で経口（投与量：３．２ｍｇ／ｋｇ）で投与した。その際、ＭＴＸは、０．５％ メチルセルロース溶液５ｍｌに溶解したものを用いた。そのコントロール群としては、０．５％ メチルセルロース溶液５ｍｌをおいた。
評価は、１群５匹ずつで、関節炎スコア、足浮腫、体重変化、摂餌量の４項目に関して行った。
＜ 実験結果 ＞
Ｍ５抗体は、表５から表８に示すようにマウス関節炎モデル（治療効果）に対し、関節炎スコアの改善、発症遅延や足浮腫の改善など明確な抑制作用を示した。関節炎の発症は、用量依存的に抑制され、その程度は、抗マウスＴＮＦ−α抗体（投与量：２００μｇ／マウス）投与による効果を上回るものであった。これに対して、ＭＴＸはほとんど薬効を示さなかった。
さらに、本モデルのノーマル群では、ＬＰＳ投与後３日間で、約３ｇという著しい体重減少が観察され、この傾向は、減少率はやや緩和されるものの、３−６日目まで続いた。これに対し、Ｍ５抗体（１５０μｇ，４００μｇ）投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群では、明らかな体重減少の改善が認められた。また、摂餌量については、ＬＰＳ投与後３日目までは、いずれの薬剤についても激しい体重減少が観察されたが、３−６日目にかけては、Ｍ５抗体投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群で改善が認められた。関節スコアに対する効果を表５に、足浮腫抑制効果を表６に、体重変化および摂餌量変化をそれぞれ表７および表８に示す。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
実 施 例 １３
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドの入手：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をオースペップ（Ａｕｓｐｅｐ Ｉｎｃ．，Ｐａｒｋｉｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より購入した。それらのアミノ酸配列は、下記の（１）から（３）の通りである。
ｈＯＰＮ５： ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）（１）
ｈＯＰＮ３： ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ
（Ｋ１７０からＥ１８７＋Ｃ）（２）
ｈＯＰＮ１： ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ
（Ｉ１７からＱ３１＋Ｃ） （３）
実 施 例 １４
免疫用抗原の作製：
免疫原として、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体をＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法により、以下のようにして作製した。なお、結合体を作るにあたり、サイログロブリンとＯＰＮ関連フラグメントペプチドとＥＭＣＳのモル比をそれぞれ１：３００：４００とした。
実施例１３の各ＯＰＮ関連フラグメントペプチド４ｍｇを、それぞれ約１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、１ｍｌの０.０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.０）に５ｍｇのサイログロブリンを溶解したものと、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０μｇ／μｌとをそれぞれ上述モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体溶液を作製した。この複合体溶液を３つに分け、その各々に上記ＯＰＮ関連フラグメントペプチド溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイクログロブリンとの結合体溶液を作製した。
この結合体溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合体として１０μｇ／μｌになるように濃度調製した。このようにして得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を免疫用抗原として用いた。
実 施 例 １５
スクリーニング用抗原の作製：
スクリーニング用ＯＰＮタンパク質として、ＧＳＴとヒトＯＰＮアイソフォームとの融合蛋白であるＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ、トロンビン開裂部位よりアミノ基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ）、及びカルボキシル基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ）は、それぞれ実施例１に述べた方法により調製し、抗血清のＯＰＮに対する反応性に用いた。
実 施 例 １６
免 疫 感 作 ：
免疫用抗原として、実施例１４において得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を用い、ウサギに免疫を行った。免疫は、１週間、または２週間おきに結合体溶液１００μｌ（１００μｇ）を投与することにより行った。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。８回免疫後、採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とした。
実 施 例 １７
抗血清のＯＰＮに対する反応性：
実施例１３で調製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドを１０μｇ／ｍｌになるように０.１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９.５）に希釈し、５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートに固相した。ＰＢＳにて洗浄、０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％ ＮａＮ３溶液でブロッキングした後、実施例１６で得た抗血清の１００倍希釈液を順次２倍希釈し、ウェルに５０μｌ入れ、３７℃にて３０分間反応させた。
反応終了後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて４回洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＩＢＬ社製）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０.４ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）と０.０３％過酸化水素水を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ、室温で１５分間遮光状態で放置し、発色させた。発色後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
一方、実施例１５で調製したＯＰＮタンパク質を用いて、ウエスタンブロット法にて抗血清の反応性を調べた。その結果、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１およびｈＯＰＮ５に対する抗血清は、ＧＳＴ-ＯＰＮ-ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ， ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆには反応しなかった。一方、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗血清は、ＧＳＴ-ＯＰＮ-ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ， ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆには反応しなかった。
実 施 例 １８
抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの
結合体作製：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３とｈＯＰＮ１に対する抗体とＨＲＰとの結合体作製は以下のように作製した。各抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体２０ｍｇをペプシン消化し、ゲル濾過することにより抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体のＦ（ａｂ'）２フラグメントを精製し、２−メルカプトエタノールを用いることによりＦ（ａｂ'）２フラグメントをＦａｂ'フラグメントに還元した。ＨＲＰとＥＭＣＳとを、３７℃で６０分反応させ、ゲル濾過することによりＨＲＰ−ＥＭＣＳ結合体を作製し、さらにこれと抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体Ｆａｂ'フラグメントとを４℃で一晩反応させ、ゲル濾過することによりＥＭＣＳ架橋による抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体を作製した。
実 施 例 １９
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せで１−３、５−１の２種類の系を作製した。このうち、１−３系は以下のように作製した。１０μｇ／ｍｌのＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１に対する抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例１８で作製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗体とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。このようにｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた固相プレートとｈＯＰＮ３に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを１−３系とした。
同様にして、ｈＯＰＮ５に対する抗体を用いた固相プレートと、ｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを５−１系として構築した。
実 施 例 ２０
サンドイッチＥＬＩＳＡ系による被験者におけるオステオ
ポンチンの測定：
ＯＰＮタンパク質の測定は以下のように行った。１−３系及び５−１系のサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに被験者から採取した血漿および関節腔液サンプルを含む溶液を１００μｌ加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄、それぞれの系に特異的な標識抗体を１００μｌ加え、４℃で３０分反応させた。反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１００μｌ加え、室温、遮光下３０分放置した。１Ｎ硫酸で反応を止め、吸光度４５０ｎｍで測定した。
上記の方法により測定したリウマチ患者関節腔液（１３例）のＯＰＮ値を表９に、変形性関節症患者関節腔液（１２例）のＯＰＮ値を表１０に示す。また、リウマチ患者血漿（１６例）のＯＰＮ値を表１１に、変形性関節症患者血漿（７例）のＯＰＮ値を表１２に、正常人血漿（６例）のＯＰＮ値を表１３に示す。
これらの結果から明らかなように、血漿中ＯＰＮ値との比較において、１−３の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者および健常人間で、有意差は認められなかった。しかしながら、５−１の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者ともに健常人との比較において、その測定値は有意に高く、その程度はリウマチ性関節炎患者に優位であった。このことは、５−１の系が反映する総ＯＰＮ量が関節炎全般における診断の有効性を示唆するものである。
一方、リウマチ性関節炎患者および変形性関節症患者の関節腔液のＯＰＮ値は、血漿におけるＯＰＮ値と比較して上昇しており、局所でのＯＰＮ産生が強く示唆された。
また、関節腔液中ＯＰＮ値のリウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者間での比較において、１−３および５−１のいずれの系でも、リウマチ性関節炎患者は、変形性関節症患者と比較し、ＯＰＮ値が有意に高かった。
さらに新しい指標として１−３系／５−１系のＯＰＮ値比の検討を行った。この指標は、トロンビン開裂ＯＰＮの割合を比較することができる。リウマチ性関節炎患者の血漿および関節腔液のＯＰＮ値は1以下、変形性関節症患者では2以上となり、有意差が認められた。
したがって、１−３系／５−１系のＯＰＮ値を利用することにより、リウマチ患者と変形性関節症患者を区別することが可能となる早期の検査方法として利用できる。
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＯＰＮに対するＲＧＤ依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
【図２】図２は、抗体２Ｋ１による、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮのＲＧＤ依存性、およびＲＧＤ非依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
【図３ａ】図３ａは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走を示す図面である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走の、抗体による抑制を示す図面である。
【図４】図４は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の関節炎スコアの経時変化を示す図面である。
【図５】図５は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の手首の腫れを比較した図面である。
【図６】図６は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の濃度依存的な接着を示す図面である。
【図７】図７は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着をＧＲＧＤＳＰペプチドが阻害することを示す図面である。
【図８】図８は、抗体Ｍ５によるマウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着阻害を示す図面である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトオステオポンチン抗体および該抗体を用いた自己免疫疾患、リウマチおよびリウマチ性関節炎の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）は、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であり、ヒトの場合、ｍＲＮＡのスプライシング (splicing)の違いから、オステオポンチン−ａ（以下、「ＯＰＮ−ａ」という）、オステオポンチン−ｂ（以下、「ＯＰＮ−ｂ」という）およびオステオポンチン−ｃ（以下、「ＯＰＮ−ｃ」という）の少なくとも３つのアイソフォームが生じ得ることが知られている。（Y.Saitohet al., (1995): Laboratory Investigation, 72, 55-63）このうち、ＯＰＮ−ａの前駆体は、後記配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を持ち、分泌により、シグナルペプチドが切断され、Ｉ１７−Ｎ３１４の成熟体ＯＰＮ−ａがつくられると考えられている。また、成熟体ＯＰＮは、生体内のトロンビンにより１６８番目のアルギニン残基のＣ末端側で切断されて、Ｎ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントの２つになる。
上記のＯＰＮは、多種の生理学的病理学的に重要な機能を担っており、例えば、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体が媒介する細胞溶解の阻害等の機能を持っている。この多様な機能は、多種の細胞表面受容体により媒介されている。ＯＰＮは、内部にＲＧＤ配列をもち（例えば、ＯＰＮ−ａでは、１５９〜１６１残基目）、このＲＧＤ配列を認識するαＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５等のインテグリンは、ＯＰＮの主な受容体であり、このうち、αＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５インテグリンは、血管の平滑筋細胞において細胞接着を媒介し、更にαＶβ３は、マクロファージ、リンパ球、内皮細胞および平滑筋細胞等の遊走に関係している。
さらに、これまでの研究から、ＯＰＮは、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を介してα９β１、α４β１およびα４β７インテグリンと結合することも明らかにされているが、これらのうちα４β１は、トロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１はトロンビン切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている。（Y. Yokosaki et al., (1999): The Journal of Biological Chemistry274,36328-36334 / P. M. Green et al., (2001): FEBS Letters 503, 75-79 /S.T.Barryet al., (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351）。これらのα９及びα４、β１及びβ７のインテグリンサブユニットは、相互にアミノ酸配列間の類似性が高い。そして、α４β１及びα４β７インテグリンは、主として、リンパ球と単球で見出されるが、好中球ではごくわずかに発現しているにすぎない。一方、α９β１は、好中球に選択的に高発現しておりVCAM-1やTenascin-Cなどを介して、好中球遊走に必須の機能を担っている。また、筋肉細胞や上皮細胞、肝細胞などで広く発現している。このように、インテグリンサブユニットα４とα９の細胞質ドメインは、それぞれ微妙に異なった細胞内シグナル伝達経路を通して、互いに協同して炎症部位への白血球の遊走と凝集を促し、それらの浸潤活性を増強することによって、様々な炎症反応に関与していると考えられる。
このように、様々な種類のインテグリンが、白血球の遊走を促進し、炎症反応に関与していることから、これらのインテグリン活性を阻害する薬剤は、潜在的には抗炎症剤としての可能性を有していると思われる。たとえば、インテグリンαＶβ３は、破骨細胞、血管内皮細胞および平滑筋細胞等で発現されており、αＶβ３インテグリンとその様々な結合リガンドとの結合を阻害することにより、例えば関節では、関節破壊抑制作用が期待できることから、抗αＶβ３抗体の開発が実際に行われている。
しかしながら、インテグリンファミリーに属する受容体は、広範な組織で普遍的に発現して生命活動維持に必須の機能を担っていることから、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療にインテグリンに対する抗体を用いると、他の部位でも同様の阻害がおこる可能性があり、副作用の発生も懸念される。
【０００３】
また、ＷＯ０１／７１３５８にはα４インテグリンとオステオポンチンとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法およびスクリーニングで得られた物質を用いた炎症疾患の治療方法等について開示されている。
リウマチ性関節炎の病因としては種々の因子が考えられており、多くの報告があるが確実なものはない。また、その治療法においても、現在知られているものは対症療法的なものであり、必ずしも満足できるものではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、リウマチ性関節炎の病因を明確にし、より優れた治療法を提供することが強く求められており、本発明はこのような課題の解決をその目的とするものである。
また、リウマチ性関節炎は、変形性関節症などと識別し難く、このための診断方法の提供も本発明の課題の一つである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、リウマチ患者および変形性関節症患者で、関節腔液のＯＰＮ濃度が高値を示すことを知り、さらにリウマチ患者において、全ＯＰＮに占めるトロンビン開裂型のＮ末端フラグメントの割合が増大することを初めて見出し、ＯＰＮが、これらの疾患の発症に深く関わっていることに思い至った。そして、後記参考例で示すようにＯＰＮのノックアウトマウスを用いた実験によりこの事実を確認した。
また、ＯＰＮをトロンビンで切断したＮ末端フラグメント及びＣ末端フラグメントについて、それぞれのフラグメントを区別して認識する抗体を作成し、それらを用いた試験により、リウマチ性関節炎患者では、特にトロンビンにより切断されたＮ末端フラグメントが関節腔内で高濃度を示すことを見出した。
本発明者らは、前述のリウマチ性関節炎患者に高い濃度で見出されるＮ末端フラグメントには、ヒト型インテグリンが認識するＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列が共に存在していることに着目し、これら両者の配列を同時にブロックする抗体は、ＯＰＮとインテグリンの結合を幅広く阻害し、リウマチ性関節炎や変形性関節炎の治療に効果があるのではないかと予想した。
さらに、ＯＰＮは、腎臓・胎盤・卵巣・脳・皮膚などにも分布するが、主として骨組織に発現している。本発明者らは、リウマチ性関節炎の治療に際して、ＯＰＮとインテグリンの結合をＯＰＮ側により特異的な方法で遮断することが望ましいと考えた。その際、炎症には前述の多岐に渡るインテグリンが協同的に関与していると考えられるので、これらの多岐に渡るインテグリンとの結合が、より幅広く遮断されることが有効であると考えた。
【０００６】
そこで、ヒトＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する抗体を作成し、細胞接着および細胞遊走等の実験によりその効果を確認した。さらに、マウスＯＰＮの当該内部配列に対応する合成ペプチドに対する抗体を取得し、マウスの関節炎病態モデルを用いて、そのような抗体の治療薬としての効果を調べた。
すなわち、マウスＯＰＮは、ヒトＯＰＮとアミノ酸配列上で相同な位置にマウスのインテグリンによって認識されるＲＧＤ配列及びＳＬＡＹＧＬＲ配列を有しているので、これらの配列を同時にブロックする抗体として、Ｍ５抗体を取得した。このＭ５抗体とマウスＯＰＮおよびそのトロンビン消化物との結合は、ＲＧＤ配列を含むＧＲＧＤＳＰペプチドで阻害され、またこのＭ５抗体は、ＴＮＦ-αで活性化したマウス脾臓由来の単球の遊走を阻害することが確認された。このＭ５抗体を、マウスのカルバリア（calvaria）器官培養系で調べてみたところ、骨破壊の抑制作用が観察された。さらに、マウスのコラーゲン関節炎モデルに、上記抗体を投与してみたところ、明らかに治療効果を示すことが確認された。
以上の結果は、ＲＧＤ配列、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とヒト型インテグリンの結合を同時にブロックする抗体が、ＯＰＮとインテグリンの結合を阻害し、リウマチ性関節炎等の治療に有効であることを強く示唆しており、さらに、若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチのみならず、乾癬性関節炎や乾癬の治療への効果が期待される。
また、臓器移植後の慢性拒絶は、血管や気管支の閉塞性病変を特徴としているが、その組織学的検討から、Ｔ細胞やマクロファージの活性化がサイトカイン、増殖因子の産生、血管内皮細胞障害を引き起こし、さらに血管平滑筋の増殖が線維化などを引き起こすために血管閉塞へ進展して行くと考えられている（P. Freese et al., (2001): Nephrol DialTransplant,16, 2401-2406 / J. R. Waller et al., (2001): British Journal of Surgery, 88,1429-1441/ S. R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72,1138-1144）。そして、これらのマクロファージの活性化や血管平滑筋の線維化にはＯＰＮが必須の蛋白として機能することが報告されており（A. O’Regan et al., (2000): Int J Exp Pathol, 81,373-390）、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、単球や好中球の遊走を抑制することにより、このような線維化に向けての過程を抑制する可能性がある。
【０００７】
従って、臓器移植後の慢性拒絶反応を抑制し、臓器生着に寄与し、また、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ぶとう膜炎、ベーチェト病、多発性筋炎、糸状体増殖性腎炎、サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療への効果が期待される。
すなわち本発明は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を幅広く阻害する抗オステオポンチン抗体を提供するものである。
また本発明は、上記抗体を有効成分として含む自己免疫疾患治療剤、リウマチ治療剤ないしリウマチ性関節炎の治療剤を提供するものである。
更に本発明は、リウマチ患者ないしはリウマチ性関節炎患者に、前記の抗オステオポンチン抗体を投与し、オステオポンチンのＲＧＤ配列とインテグリンの結合および／または、ＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害することにより、自己免疫疾患、リウマチないしはリウマチ性関節炎を治療する方法を提供するものである。
また更に本発明は、上記オステオポンチン抗体を利用するリウマチの診断薬および診断方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を認識するインテグリンとＯＰＮまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体（以下、「ＯＰＮ阻害抗体」という）は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリン、例えばαｖβ１，αｖβ３，αｖβ５等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリン、例えばα９β１，α４β１、α４β７等とＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ，ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害できるものであればどのような抗体でもよい。ＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列とは、ヒトＯＰＮの１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列を指し、その相当配列とは、他の哺乳動物のＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲに相当する配列を言い、例えばブタではヒトと同じくＳＶＶＹＧＬＲ、サルではＳＶＡＹＧＬＲ、マウスやラットではＳＬＡＹＧＬＲ、ウシではＳＶＡＹＧＬＫ、ウサギではＳＶＡＹＲＬＫである。本発明のＯＰＮ阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃや、これらのＮ末端フラグメント、あるいはアミノ酸配列ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列またはその相当配列を含んでいるペプチド（以下、これらを「ＯＰＮ関連ペプチド」と総称する）を抗原として用いることにより作成できる。なお、ここでいうＯＰＮのフラグメントとは、ＯＰＮがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントをいい、例えばトロンビンにより分解されたフラグメントをいう。
上記ヒトＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するＯＰＮ−ａの１５３番目バリン残基から１６９番目セリン残基までのペプチド（ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ）を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。抗原性を高めるためには、上記ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。
【０００９】
また、実験動物としてマウスを用い、ＯＰＮに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのＯＰＮに対応するＯＰＮ阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
上記ＯＰＮ関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記ＯＰＮ関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法 (B. F. Erlanger et al., (1954): J. Biol. Chem., 234, 1090-1094)または活性化エステル法（A.E.Karu et al., (1994): J. Agric. Food Chem., 42, 301-309）等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＯＰＮ関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
【００１０】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ＯＰＮ関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。
上記の方法によるＯＰＮ関連ペチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原として用いる抗体の作製法および当該抗体を用いる免疫化学的測定法について説明する。尚、抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
【００１１】
すなわち、まず、例えば、ＯＰＮ関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回、行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、ＯＰＮ阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてＯＰＮ阻害抗体を得ることもできる。
本発明の抗体をヒトあるいは動物の治療用途に用いる場合には、得られたＯＰＮ阻害抗体の定常領域を治療対象とするヒトあるいは動物の抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変したキメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）や当該動物化抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０２３９４００またはＥＰ０４５１２６参照）を用いることが望ましい。あるいは、治療対象とするヒトあるいは動物の抗体産生に関与する遺伝子を人為的に導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（当該動物型抗体）（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３またはＷＯ９７／０７６７１参照）を利用することが望ましい。
【００１２】
例えば、治療の対象がヒトであり、ＯＰＮ阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒトマウスキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。また、抗体産生のためにはファージディスプレー (phage display)法を用いることもできる。
このようにして得られたＯＰＮ阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したFv、ＦabやＦ(ab')２のかたちで用いることもできる。
かくして得られたＯＰＮ阻害抗体は、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、リウマチ性関節炎・若年性関節リウマチや慢性リウマチ等のリウマチ・乾癬性関節炎・乾癬等の治療、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶとう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療に用いることができる。
本発明のＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは、リウマチ治療剤あるいはリウマチ性関節炎治療剤として用いることができる。これらリウマチ治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい（自己免疫疾患治療剤とする場合もこれに準じればよい）。また製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
上記製剤化に当たってのＯＰＮ阻害抗体の添加量は、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいはＯＰＮ阻害抗体の結合力価等により異なるが、例えば０.１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
このようにして得られた本発明の治療剤は、有効成分であるＯＰＮ阻害抗体がＯＰＮのＲＧＤ配列とＳＶＶＹＧＬＲ配列に強く結合し、ＯＰＮのこの部分とインテグリンとの結合を阻害することによって、結果的にリウマチ及びリウマチ性関節炎やそれ以外の自己免疫疾患の症状の増悪を押さえることができると期待される。
そして、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、インテグリン側でなくＯＰＮ側に特異的に結合するものであるため、インテグリンの他の重要な機能を阻害するおそれは少なく、副作用の問題は回避されるものと期待される。
【００１３】
更に本発明のＯＰＮ阻害抗体は、自己免疫疾患治療剤をスクリーニングする目的にも使用することができる。すなわち、前述のように、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、自己免疫疾患の治療剤となりうる。そこで、例えば、所定量のＯＰＮとインテグリンが存在する測定系内にスクリーニングするべき物質（被検物質）とＯＰＮ阻害抗体とを競合的に加えた反応系を構成し、使用したＯＰＮ阻害抗体の量に対するＯＰＮ−インテグリン間の結合の阻害程度を測定すれば、被検物質の自己免疫疾患治療剤としての利用可能性を評価することができる。
同様に、ＯＰＮのＲＧＤ配列とインテグリンの結合およびＳＶＶＹＧＬＲ配列とインテグリンとの結合を阻害する化合物は、リウマチないしはリウマチ性関節炎の治療剤となりうるので、ＯＰＮ阻害抗体を用いて、上記と同様の反応系を構成すれば、リウマチないしはリウマチ性関節炎のスクリーニングに使用することができる。
更にまた、本発明のＯＰＮ阻害抗体は、リウマチ診断剤として利用することができる。先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出されることが判明している。そこで、このＯＰＮ阻害抗体を用いて検体中のＯＰＮまたはそのＮ末端フラグメントの量を測定すれば、リウマチの診断に役立てることができる。その手法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）を利用することができる。
上記手法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より好ましい方法の例としては、例えば本発明のＯＰＮ阻害抗体を担体上に固相化し、本発明のＯＰＮ阻害抗体とはＯＰＮ上の異なる部位を認識する抗体を標識化することにより、ＯＰＮまたはそのN末端フラグメントを検出することができ、これをリウマチ性関節炎の診断薬とすることができる。
上記抗体を標識するにあたり使用される標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」という）、アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＰ」という）等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。
【００１４】
より具体的なＯＰＮアイソフォームの検出方法について、サンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。すなわち、まず、（ａ）本発明のＯＰＮアイソフォームに対する抗体を担体に固相化し、次いで、（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、（ｃ）これに各種濃度のＯＰＮアイソフォームを含む検体を加え、ＯＰＮアイソフォーム−抗体複合体を生成させた後、（ｄ）標識した抗ＯＰＮアイソフォーム抗体を加え、固相化抗原−抗体複合体と結合させ、最後に（ｅ）担体に結合した標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の遊離ＯＰＮアイソフォームの量を決定することができる。
まず、（ａ）工程において、抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１−１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１−２０μｇ／ｍｌが適している。また、緩衝液の量は、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で、より好ましくは、２０−１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーションが適している。
また、（ｂ）工程のブロッキングについては、次の段階で添加する検体中のＯＰＮには抗原抗体反応とは無関係に担体に吸着される部分が存在する場合があるので、そのような非特異的吸着を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やスキムミルク溶液を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ」、大日本製薬、コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを使用することもできる。具体的には、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩インキュベーションした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液としては特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０.０２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０.０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。
次いで（ｃ）工程において、ＯＰＮアイソフォームを含む検体を固相化抗体と接触させることにより、固相化抗体でＯＰＮアイソフォームを捕捉し、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム複合体を生成させる。反応は限定されるわけではないが、３７℃程度で約１時間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させる。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７.２）、０.０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。
更に（ｄ）工程において、固相化抗体に捕捉されたＯＰＮアイソフォームの別のエピトープを認識する標識抗体を加え、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を形成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応の蛋白質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、（ｃ）工程において前記したものが使用される。
上記（ｄ）工程において使用される標識抗体は、（ａ）工程の固相化抗体と異なるエピトープを認識するものであることが要求される。例えば固相化抗体としてＯＰＮアイソフォームの前半領域を認識するポリクローナル抗体を用いる場合、酵素（例えば、ＨＲＰまたはＡＰ等）を結合した標識抗体としては、ＯＰＮアイソフォームの後半領域を認識するポリクローナル抗体を用いることが好ましい。このように異なる部位を認識する抗体を用いることで、選択スプライシングにより生じるＯＰＮアイソフォームを高感度でかつ特異的に測定できる。
（ｄ）工程において使用される標識抗体の量は、担体に結合した固相化抗体に対して約５,０００−１０,０００倍、好ましくは最終測定時の最大吸光度が１.５−２．０となるように希釈した標識抗体を反応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いることができ、反応は限定されるわけではないが、約３７℃で約３０分間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、担体に抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体を結合することができる。
最後に（ｅ）工程において、固相化抗体−ＯＰＮアイソフォーム−標識抗体複合体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定することによって検量線からＯＰＮの量を算出することができる。
標識抗体の標識物として、酵素であるペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（ＴＭＢ）又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を含む発色基質溶液を使用することができる。発色反応は、限定されるわけではないが、発色基質溶液を加え約２５℃で約２０分間反応させた後、１Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させることにより行うことができる。ＴＭＢを使用する場合、発色は４５０ｎｍの吸光度により測定する。一方、標識物として、酵素であるＡＰを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
既知の濃度のＯＰＮアイソフォームを添加した反応液の吸光度により予め作成しておいた検量線を用いて、検体中のＯＰＮアイソフォームの濃度を算出できる。
上記した本発明のＯＰＮアイソフォームの検出方法は、ＯＰＮの働きの解明や、ＯＰＮの関連する疾患の診断、治療のために使用されるが、その使用方法の一例としては、トロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントと非切断型ＯＰＮを区別して検出することにより、炎症異常の有無を検出し、例えばリウマチと変形性関節症を区別する炎症異常の検出キットを挙げることができる。
先述のように、リウマチ性関節炎患者の関節腔内では、特にトロンビンにより切断されたＯＰＮのＮ末端フラグメントが高濃度で見出される傾向があるが、変形性関節炎患者ではそのような傾向は有意に低い。このように、関節腔内のＯＰＮ中に占めるＮ末端フラグメントの割合がそれぞれの患者では異なっているので、リウマチと変形性関節症を区別して診断する為には、ＯＰＮ全体の中に占めるＮ末端フラグメントの割合を測定できればよい。
【００１５】
より具体的な例としては、ＯＰＮの３種のアイソフォーム、ＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂおよびＯＰＮ−ｃのすべてに共通に存在する下記３種の配列について、それぞれのペプチドに対する抗体を作製する。
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）（１）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ
（Ｋ１７０からＥ１８７＋Ｃ）（２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ
（Ｉ１７からＱ３１＋Ｃ） （３）
このうち、配列（１）は、トロンビン切断部位のＮ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメント上で共通に存在する。一方、配列（２）は、トロンビン切断部位よりＣ末端側に存在し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮでは存在するが、Ｎ末端側フラグメントには含まれない。また、配列（３）は、ＯＰＮのＮ末端側１７番目から３１番目までのアミノ残基に対応し、トロンビン非切断型である全長ＯＰＮとＮ末端側フラグメントで共通に存在する。 リウマチ患者と変形性関節症患者の鑑別の為の診断キットは、上記の３種の配列のペプチドそれぞれに対する抗体を利用した２種類の免疫検出試薬から構成することができる。 すなわち、第一の免疫検出試薬では、上記の配列（３）および（２）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮを定量する。その際、例えば、配列（３）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（２）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。また、第二の免疫検出試薬では、上記の配列（１）および（３）で表されるペプチドに対する２種の抗体を用いて、検体中の両方の抗体で共通に認識されるトロンビン非切断型ＯＰＮとトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントを合わせた総量を定量する。その際、例えば、配列（１）のペプチドに対する抗体を担体に固相化し、患者由来の検体と反応させ、洗浄した後、標識抗体として配列（３）のペプチドに対する抗体を加え前述のサンドイッチ法と同様の方法で検出することができる。そして、同一の患者検体に対する上記の２種類の免疫検出試薬による結果を比較照合することにより、該患者における全ＯＰＮ中に占めるトロンビン切断により生成したＮ末端側フラグメントの割合を明らかにすることができ、リウマチと変形性関節症の区別が可能となる。
【実施例】
【００１６】
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。
実 施 例 １
ＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白のクローニング、構築、精製および
試薬：
クローニング及び蛋白精製については、基本的に、文献（S. Kon et al., (2000): J. Cell. Biochem., 77, 487-498）に記載の方法に従って行った。
ヒトＯＰＮのアイソフォームであるａ，ｂについては、そのｃＤＮＡを次のようにして得た。ヒト腎癌細胞株であるＮＲＣ−１２細胞から調整したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、それを鋳型とし、下記ＯＰＮ−５、ＯＰＮ−３プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、それぞれシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂの全長をコードするｃＤＮＡを得た。
次に、上記文献に記載したようにして、このようにしてクローニングしたＯＰＮ−ａ，ＯＰＮ−ｂ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ４Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＥＣ２.５.１.１８）遺伝子と同じリーディングフレームとなるように挿入し、大腸菌ＪＭ１０９を用いてＧＳＴ融合蛋白として発現させた（以下、このようにして得られたＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白を、それぞれ、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ」，「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ」という）。
ＯＰＮ−５：
５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＧ
ＣＡＧＴＧＡＴＴＴＧＣ−３'
ＯＰＮ−３：
５'−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡ
ＡＧＡＴＧＣＡＣＴＡＴＣ−３'
ヒトＯＰＮ−ｃアイソフォームをコードするｃＤＮＡについては、上記のＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型とし、二段階ＰＣＲにより作製した。一段階目はＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｃｔ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｔ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行い、二つのＰＣＲ産物を混ぜ、熱を加え徐々に冷却することによりアニールさせ、酵素を加えて伸長させた。次いで二段階目として、ＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりシグナルペプチド領域を含むヒトＯＰＮ−ｃの全長をコードするｃＤＮＡを得た。このアイソフォームｃｃＤＮＡは、アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴ融合蛋白を作製した（以後、「ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ」という）。
ＯＰＮｃｔ−３：
５'−ＡＣＡＣＡＧＣＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＡＡＣ
ＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣ−３'
ＯＰＮｃｔ−５：
５'−ＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣ
ＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣ−３'
ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりアミノ末端側半分（Ｍ１−Ｒ１６８）をコードするｃＤＮＡは、上記のＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型として、ＯＰＮ−５と下記のＯＰＮｎｈ−３プライマーを用いてＰＣＲをうことによって、得られた。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ」という）。
ＯＰＮｎｈ−３：
５'−ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＣＣＡＴＡＡ
ＡＣＣＡＣＡＣＴ−３'
ＯＰＮ−ａのトロンビン開裂部位よりカルボキシル基側のオステオポンチンタンパク質（ｈＯＰＮＣｈａｌｆ）は、二段階ＰＣＲによりＯＰＮ−ａ ｃＤＮＡを鋳型として作製した。一段階目はＯＰＮ−５、下記のＯＰＮｃｈ−３プライマー、下記のＯＰＮｃｈ−５とＯＰＮ−３プライマーでそれぞれＰＣＲを行った。二段階目はＯＰＮ−５とＯＰＮ−３プライマーでＰＣＲを行うことによりカルボキシル基側ＯＰＮタンパク質を作製した。アイソフォームａ、ｂと同様な方法でｐＧＥＸ４Ｔベクターに組み換え、ＧＳＴタンパク質を作製した（以後、「ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ」とする）。
ＯＰＮｃｈ−３：
５'−ＴＣＴＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣ
ＣＴＡＧＧＡＧ−３'
ＯＰＮｃｈ−５：
５'−ＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＡＧＡＡＧＴＴ
ＴＣＧＣＡＧＡ−３'
種々の組換えＧＳＴ−ＯＰＮ融合蛋白は、常法に従って大腸菌より調製し、上記文献で述べた方法によりグルタチオン−セファローズカラムを使用して、精製した。このうち、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ蛋白については、連結部分をプレシジョン・プロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ；アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社）で開裂させることによって、ＧＳＴ蛋白部分を取り除き、ＯＰＮのアミノ末端側半分（Ｉ１７−Ｒ１６８）のみから構成される蛋白（以下、「ｎＯＰＮ」という）を得た。
一方、ＯＰＮ−ａの全長 （Ｍ１−Ｎ３１４）をコードするｃＤＮＡについては、さらに、ｐｃＤＮＡ３.１（＋）ベクター（インビトロゲン社）に挿入し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（大日本製薬（株）社製）にトランスフェクトした（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞」という）。 この細胞より得られた糖鎖結合型のＯＰＮ−ａ（以下、「ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ」という）については、以下のようにして精製した。即ち、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ細胞の培養上清をＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂカラム（アマルシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ＵＬＴＲＯＧＥＬＡｃＡ４４カラム（ＢｉｏＳｅｐｒａ ＳＡ製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに付し、これに引き続いて、ＲＥＳＯＵＲＣＥＲＰＣカラム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社製）での逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。
免疫感作や結合の研究に用いた種々のペプチドは、シグマ・ゲノシス・ジャパン社から入手し、あるいは、ペプチド合成機（モデル４３２Ａ、パーキンエルマーライフサイエンス社）でＦｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）法により化学合成した後、Ｃ18逆相カラムクロマトグラフィーで精製することにより得た。
実 施 例 ２
モノクローナル抗体の製造：
下に示すような、ヒトＯＰＮの内部配列に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
ペプチド１；
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）
ペプチド２；
ＣＩＤＳＱＥＬＳＫＶＳＲＥＦＨＳＨ（Ｃ＋Ｉ２６１からＨ２７６）
このうち、ペプチド１は、それぞれαｖβ３とα９β１インテグリンレセプターを認識するＲＧＤとＳＶＶＹＧＬＲ配列を有する。
これらのペプチドを、サイログロブリン（thyroglobulin）と結合させ、常法に従ってマウスの免疫に用いた。続いて、免疫されたマウスから脾細胞（splenocytes）を分離し、ポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と細胞融合に付した。そして、文献（M.Kinebuchiet al., (1991): J. Immunol., 146, 3721-3728) に述べた方法により、免疫に使用したペプチドに反応するハイブリドーマを選択した。
ペプチド１および２で免疫したマウスから、それぞれ２Ｋ１および４Ｃ１と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体２Ｋ１を産生するハイブリドーマについて、２００１年６月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 1 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７８８３として寄託した。また、モノクローナル抗体５３（ｍＡｂ５３）は、全長組換えヒトＯＰＮで免疫することにより得られたものである（D.S.Bautista at al., (1994): J. Biol. Chem., 269, 23280-23285）。
実 施 例 ３
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とモノクローナル抗体の反応性：
実施例２で得られたモノクローナル抗体２Ｋ１および４Ｃ１のＯＰＮおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンブロット法を用いて試験した。２Ｋ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆと反応することがわかった。また、４Ｃ１抗体はＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆと反応することがわかった。更に、これらのモノクローナル抗体は、大腸菌から生産した糖鎖非結合型の組換えＯＰＮと結合するばかりでなく、糖鎖結合型ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ蛋白及びそのトロンビン消化物（以下、「トロンビン開裂ＯＰＮ」という）とも反応した。
実 施 例 ４
モノクローナル抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
モノクローナル抗体がＯＰＮに対する細胞の接着を阻害するかどうかを以下の方法で調べた。まず、９６穴プレートを、４℃で一晩、種々の濃度のＣＨＯ／ＯＰＮ−ａでプレコートし、次いで１０分間、３７℃の条件で０.５％ＢＳＡのＰＢＳにより非特異的接着をブロックするための処理を行った。ヒト線繊維芽細胞ＴＩＧ−７またはインテグリンα９サブユニットｃＤＮＡで形質転換したＳＷ４８０細胞（以下、「α９形質転換ＳＷ４８０細胞」という）を、０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭに懸濁させ、細胞懸濁液（細胞濃度は、５×１０４細胞／ウエル）２００μｌを、種々の濃度のモノクローナル抗体または合成ペプチドの存在または不存在下でＣＨＯ／ＯＰＮ−ａまたはｎＯＰＮでプレコートした９６穴プレートに注入し、１時間、３７℃でインキュベートした。
培地をプレートから除去し、全てのウエルを０.２５％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２回洗浄した。接着した細胞は固定し、２０％メタノール中の０.５％クリスタルバイオレットで３０分間染色した。
全てのウエルは、水で３回すすぎ、接着した細胞は２０％酢酸により転溶させた。各ウエルから得られた結果物の上清をイムノリーダーで分析し、５９０ｎｍの吸収をウエルに接着した細胞の相対的数を求めるために測定した。全てのアッセイは、３回行い、少なくとも３つの独立した実験を行った。示される値は、少なくとも３つの別々の実験の平均である。
ＴＩＧ−７はＯＰＮに良く接着することが知られているが、図１のＡに示されているように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍｌ）で阻害され、コントロールペプチド（ＯＰＮのＣ末部分であるＫ２９６−Ｎ３１４）（１００μｇ／ｍｌ）で阻害されないので、ＲＧＤ依存である。また、図１のＢに示すように、２００μｇ／ｍｌの２Ｋ１抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかになった。更に、図１のＣに示すように、２Ｋ１の細胞接着阻害効果は、ｍＡｂ５３が示すものに匹敵し、濃度依存的である。なお、２Ｋ１およびｍＡｂ５３は、ＴＩＧ−７細胞のビトロネクチン（ＶＮ）やフィブロネクチン（ＦＮ）への接着は阻害しない。
図２は、ｎＯＰＮおよびビトロネクチンと、α９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着に対するモノクローナル抗体の阻害を示した図面である。図２のＡに示すように、１μｇ／ｍｌのビトロネクチンとα９形質転換ＳＷ４８０細胞との接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）で阻害されることからＲＧＤ依存である。３μｇ／ｍｌのｎＯＰＮに対するα９形質転換ＳＷ４８０細胞の接着は、２００μＭのＧＲＧＤＳＰペプチド（ＲＧＤ）と抗α９β１モノクローナル抗体であるＹ９Ａ２(A. Wang et al., (1996): Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 15,664-672)を併用することにより阻害されることから、ＲＧＤ依存および非依存性の接着である。また、図２のＢは、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮおよびビトロネクチンの接着に対する２Ｋ１の影響を示している。α９形質転換ＳＷ４８０細胞とビトロネクチンの接着は、２Ｋ１により阻害されないが、ｎＯＰＮとの接着は２Ｋ１により阻害される。この結果、２Ｋ１はＲＧＤ依存性の接着阻害能を保持していることが判明した。
実 施 例 ５
モノクローナル抗体によるＯＰＮ−誘導単球遊走の阻害：
Ｕ９３７細胞を用いた細胞遊走試験は、ＣｈｅｍｏＴｘ１０１−８システム（ニューロプローブ社）を用いて行った。細胞は、０.１％ＢＳＡを含むＤ−ＭＥＭで２×１０6／ｍｌとなるように調整し、フィルター（ポアサイズ８μｍ）の上層に加え、下層にはＯＰＮタンパク質を加えた。
ＣｈｅｍｏＴｘプレートは、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間静置した。静置後、フィルターをメタノールで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ−Ｅ）で染色した。フィルターの裏面まで遊走した細胞数を顕微鏡下、倍率４００倍で算定した。試験は３回行い、その平均をデータとした。この結果を図３に示す。
図３ａは、表示された濃度における、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに対するＵ９３７細胞の細胞遊走を示す。また、図３ｂは、５０μｇ／ｍｌの抗原特異精製された２Ｋ１、ｍＡｂ５３または対照であるマウスＩｇＧの存在または不存在下、１０μｇ／ｍｌの各ＯＰＮを用いた阻害アッセイである。
図３ａおよび図３ｂに示されるように、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆは、ヒト単球細胞Ｕ９３７の遊走を濃度依存的に誘導する（Ａ）。２Ｋ１抗体は、ＣＨＯ／ＯＰＮ−ａ、トロンビン開裂ＯＰＮおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆにより誘導された単球細胞遊走を明らかに阻害する。これに対し、ｍＡｂ５３は、全長ＯＰＮにより誘導される単球細胞遊走を阻害するだけである（Ｂ）。
参 考 例 １
ＯＰＮと関節炎誘発：
関節炎におけるＯＰＮの働きを明らかにするため、常法に従ってＯＰＮ遺伝子欠損マウス（S. R. Rittling et al., (1998): J. Bone Mminer.Res.,13 (7), 1101-1111）を人工的に作製し、正常なマウスと比較実験を行った。
ＯＰＮ遺伝子欠損マウス（ＯＰＮ−／−）と正常マウス（ＯＰＮ＋／＋）のそれぞれに、関節炎を引き起こす薬剤として市販されている関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Arthrogen-CIA（登録商標） mAb, Arthritogenic mAb cocktail、岩井化学薬品社製）を用い、製品添付書類に従い投与し、関節炎を惹起し、その程度を観察した。対照としては、両マウスに生理食塩水を投与したものを用いた。
関節炎の程度は、下記に従った関節炎スコアと、投与１０日後のリストの腫れで比較した。この結果を図４および図５に示す。
図４から明らかなように、関節炎用カクテル／リポポリサッカライド（以下、「ＬＰＳ」という）を投与された正常マウスでは、４日目から関節炎スコアが上昇し、１０日目で最高（１２以上）に達した。これに対し、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスでは、５日目から関節炎スコアは上昇するものの、最高でも４以下であった。また、生理食塩水を投与した群では、いずれも関節炎スコアの上昇が見られなかった。
また、図５に見るように、リストの腫れ（手首の腫れ）もＯＰＮ遺伝子欠損マウスは正常マウスに比べて明らかに弱く、関節炎に対しＯＰＮが関係していることが明らかである。
実 施 例 ６
２Ｋ１抗体のヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、２Ｋ１抗体のサイトカイン活性化ヒト末梢血白血球遊走に対する阻害活性を調べた。好中球遊走阻害活性についての結果を表１に、単球遊走阻害活性についての結果を表２にそれぞれ示す。
＜ 実験方法 ＞
健常人ヒト末梢血からフィコール（Ficoll）法にて単核球画分と好中球画分を分離した（P. M.Daftarianet al., (1996): Journal of Immunology, 157, 12-20）。単球はフィコールと血清の中間層を採取し、フラスコにて３７℃で１時間培養した後に付着した細胞を用いた。単球画分を採取した残りの赤血球層に３％デキストラン−ＰＢＳを５倍量加えて赤血球を凝集させてから、１５０×ｇ、４℃で５分間遠心した。
凝集した赤血球が沈殿し、上清には好中球が懸濁状態で存在するので、この画分を５００×ｇ、室温で２０分間遠心すると好中球が得られた。このようにして得られた単球と好中球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。
遊走実験は４８−ウエル マイクロ ケモタキシス チャンバー（micro chemotaxis chamber）（Neuro ProbeInc.製）を用いて行った。トロンビン開裂ＯＰＮに、２Ｋ１抗体を種々の濃度で添加したものを予め３７℃で１５分間放置してから、ローワー チェンバー（Lower chamber）に加えた（ヒトＯＰＮ最終濃度は 10μｇ／ｍＬ）。その上からポリカーボネートフィルター（ポアサイズ ５μｍ）を載せて、さらにアッパー チェンバー（Upper chamber）に５０μＬの細胞懸濁液（２×１０6cells／ｍＬ）を加えた。
３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間培養してから、ポリカーボネートフィルターを取り外して、フィルター上側表面の細胞を除去してから、フィルターの裏側に浸潤した細胞をディフ−クイック（Diff-Quick）（Baxter社製）にて染色した。染色した細胞数を４０倍の倍率下で計測した。この結果は６ウエルの平均細胞数（cells／ｍｍ３）±ＳＤとして示した。
＜ 実験結果 ＞
２Ｋ１抗体は、ＴＮＦ−αで活性化したヒト末梢血好中球および単球のトロンビン開裂ＯＰＮに対する遊走を阻害した。
好中球遊走阻害：
【表１】
単球遊走阻害：
【表２】
実 施 例 ７
Ｍ５抗体の製造：
下に示すような、マウスＯＰＮの内部配列（Ｃ＋Ｖ１３８からＲ１５３）に対応する合成ペプチドを用意し、免疫に使用した。
Ｍ５ペプチド：
ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ
このペプチドをサイログログリンと結合し、これを用い常法に従ってウサギを免疫した。免疫されたウサギの抗血清を採取し、Ｍ５ペプチドＮ末のシステインとチオールセファロースビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）とをジスルフィド結合により結合させたカラムを用いてＭ５抗体を製造した。
実 施 例 ８
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とＭ５抗体の反応性：
実施例７で得られたＭ５抗体のＯＰＮ、およびそのトロンビン消化物に対する結合能はウエスタンブロット法を用いて試験した。用いたＯＰＮはＣＨＯ細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えマウスＯＰＮを用いた。Ｍ５抗体はＯＰＮおよびそのトロンビン消化物と反応した。
実 施 例 ９
Ｍ５抗体によるＯＰＮに対する細胞接着の阻害：
Ｍ５抗体がＯＰＮに対する細胞接着を阻害するかどうかを、文献（S. Kon et al., (2002): J. Cell. Biochem., 84(2),420-432）に述べた方法で調べた。ＯＰＮは、プレシジョン・プロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）によりＧＳＴ部を除去した全長マウスＯＰＮ（以下、「ｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴ」という）を使用した。細胞はマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。
図６に示されているように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞はｍＯＰＮ／ｄｅ−ＧＳＴに対し濃度依存的に接着する。また、図７に示すように、この接着は明らかにＧＲＧＤＳＰペプチド（１００μｇ／ｍＬ）で阻害されるので、ＲＧＤ依存である。図８に示すように、２００μｇ／ｍＬのＭ５抗体はＯＰＮに対する細胞接着を阻害することが明らかとなった。
実 施 例 １０
Ｍ５抗体のマウス脾臓由来単核球遊走に対する阻害活性：
下記方法により、Ｍ５抗体のサイトカイン活性化マウス脾臓由来単球遊走に対する阻害活性を調べた。この結果を表３に示す。
＜ 実験方法 ＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞をスライドガラスですり潰して単細胞にしてから、フラスコにて３７℃で１時間培養して付着した細胞を単球として用いた。この単球をヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で一晩培養し、活性化したものを遊走実験に用いた。遊走実験は、前記実施例６のヒトの場合と同様の方法で行った。
＜ 実験結果 ＞
Ｍ５抗体は、全長マウスＯＰＮ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）をウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ社製）にて切断した得られたトロンビン切断型マウスＯＰＮに対するＴＮＦ−αで活性化したマウス脾臓由来単球の遊走を阻害した。
【表３】
実 施 例 １１
Ｍ５抗体の骨破壊抑制作用：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスカルバリア器官培養系における骨破壊抑制作用を調べた、この結果を表４に示す。
＜ 実験方法 ＞
生後１日目の仔マウスの頭蓋骨を切り出し、その半分を大きさを揃えてから２４ウエルプレートの各ウエルに入れた。これらに、ヒトパラチロイドホルモン（Parathyroid hormone，ＰＴＨ ）(１−３４)を最終濃度が１０ｎＭになるようにＤ−ＭＥＭ培養液（１０％ウシ血清添加）に添加したものを加えて骨破壊を引き起こした。Ｍ５抗体は、最終濃度２００μｇ／ｍＬになるように添加した。３７℃で１週間培養した後に、骨から培養液中へ遊離したカルシウム量をカルシウムＥテストワコー（和光純薬）にて定量した。
＜ 実験結果 ＞
ＰＴＨ未添加では、７．０２ｍｇ／ｍＬのカルシウム値を示したが、ＰＴＨ添加により、９．１１ｍｇ／ｍＬと骨からのカルシウムの遊離促進が見られた。 Ｍ５抗体を２００μｇ／ｍＬの濃度で添加しておくと、骨吸収が約７０％阻害されることが確認された。
【表４】
実 施 例 １２
Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果：
下記方法により、Ｍ５抗体のマウスコラーゲン関節炎モデルにおける効果を調べた。関節炎スコアについての結果を表５に、足浮腫に対する結果を表６に、体重変化についての結果を表７に、摂餌量変化についての結果を表８にそれぞれ示す。
＜ 実験方法 ＞
関節炎の惹起には、コラーゲンに特異的な４つのエピトープを認識する関節炎惹起抗体カクテル（商品名：関節炎用カクテル、Arthrogen-CIA（登録商標） mAb, Arthritogenic mAb cocktail、岩井化学薬品社製）を用いた。マウスに、この関節炎カクテルを静脈内投与し、その３日後にＬＰＳ（１００μｇ）を腹腔内投与することにより惹起した。関節炎はＬＰＳ投与後３日目から観察され、６日目で最大となった。
Ｍ５抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、４０μｇ，１５０μｇまたは４００μｇの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはウサギＩｇＧ投与群（投与量：４００μｇ）をおいた。また、抗マウスＴＮＦ−α抗体については、ＬＰＳ投与直前と３日後に、２００μｇ／マウスの用量で静脈内投与した。そのコントロール群にはラットＩｇＧ投与群（投与量：２００μｇ）をおいた。また、ＭＴＸについては、ＬＰＳ投与日から一日一回の頻度で経口（投与量：３．２ｍｇ／ｋｇ）で投与した。その際、ＭＴＸは、０．５％ メチルセルロース溶液５ｍｌに溶解したものを用いた。そのコントロール群としては、０．５％ メチルセルロース溶液５ｍｌをおいた。
評価は、１群５匹ずつで、関節炎スコア、足浮腫、体重変化、摂餌量の４項目に関して行った。
＜ 実験結果 ＞
Ｍ５抗体は、表５から表８に示すようにマウス関節炎モデル（治療効果）に対し、関節炎スコアの改善、発症遅延や足浮腫の改善など明確な抑制作用を示した。関節炎の発症は、用量依存的に抑制され、その程度は、抗マウスＴＮＦ−α抗体（投与量：２００μｇ／マウス）投与による効果を上回るものであった。これに対して、ＭＴＸはほとんど薬効を示さなかった。
さらに、本モデルのノーマル群では、ＬＰＳ投与後３日間で、約３ｇという著しい体重減少が観察され、この傾向は、減少率はやや緩和されるものの、３−６日目まで続いた。これに対し、Ｍ５抗体（１５０μｇ，４００μｇ）投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群では、明らかな体重減少の改善が認められた。また、摂餌量については、ＬＰＳ投与後３日目までは、いずれの薬剤についても激しい体重減少が観察されたが、３−６日目にかけては、Ｍ５抗体投与群及び抗マウスＴＮＦ−α抗体投与群で改善が認められた。関節スコアに対する効果を表５に、足浮腫抑制効果を表６に、体重変化および摂餌量変化をそれぞれ表７および表８に示す。
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
実 施 例 １３
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドの入手：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をオースペップ（Ａｕｓｐｅｐ Ｉｎｃ．，Ｐａｒｋｉｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より購入した。それらのアミノ酸配列は、下記の（１）から（３）の通りである。
ｈＯＰＮ５： ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（Ｃ＋Ｖ１５３からＳ１６９）（１）
ｈＯＰＮ３： ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ
（Ｋ１７０からＥ１８７＋Ｃ）（２）
ｈＯＰＮ１： ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ
（Ｉ１７からＱ３１＋Ｃ） （３）
実 施 例 １４
免疫用抗原の作製：
免疫原として、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体をＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）法により、以下のようにして作製した。なお、結合体を作るにあたり、サイログロブリンとＯＰＮ関連フラグメントペプチドとＥＭＣＳのモル比をそれぞれ１：３００：４００とした。
実施例１３の各ＯＰＮ関連フラグメントペプチド４ｍｇを、それぞれ約１ｍｌの蒸留水に溶解した。一方、１ｍｌの０.０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.０）に５ｍｇのサイログロブリンを溶解したものと、ジメチルホルムアミドで溶解したＥＭＣＳ８０μｇ／μｌとをそれぞれ上述モル相当量になるように混合し、サイログロブリン−ＥＭＣＳ複合体溶液を作製した。この複合体溶液を３つに分け、その各々に上記ＯＰＮ関連フラグメントペプチド溶液を上述モル相当量加えることにより、ＥＭＣＳで架橋されたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイクログロブリンとの結合体溶液を作製した。
この結合体溶液を、ＰＢＳを用いて透析し、結合体として１０μｇ／μｌになるように濃度調製した。このようにして得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を免疫用抗原として用いた。
実 施 例 １５
スクリーニング用抗原の作製：
スクリーニング用ＯＰＮタンパク質として、ＧＳＴとヒトＯＰＮアイソフォームとの融合蛋白であるＧＳＴ−ＯＰＮ−ａ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ、ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃ、トロンビン開裂部位よりアミノ基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆ）、及びカルボキシル基側のＯＰＮフラグメント（ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆ）は、それぞれ実施例１に述べた方法により調製し、抗血清のＯＰＮに対する反応性に用いた。
実 施 例 １６
免 疫 感 作 ：
免疫用抗原として、実施例１４において得られたＯＰＮ関連フラグメントペプチドとサイログロブリンとの結合体を用い、ウサギに免疫を行った。免疫は、１週間、または２週間おきに結合体溶液１００μｌ（１００μｇ）を投与することにより行った。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。８回免疫後、採血を行い、血清を分離しこれを抗血清とした。
実 施 例 １７
抗血清のＯＰＮに対する反応性：
実施例１３で調製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドを１０μｇ／ｍｌになるように０.１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９.５）に希釈し、５０μｌ／ウェルにて９６ウェルプレートに固相した。ＰＢＳにて洗浄、０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％ ＮａＮ３溶液でブロッキングした後、実施例１６で得た抗血清の１００倍希釈液を順次２倍希釈し、ウェルに５０μｌ入れ、３７℃にて３０分間反応させた。
反応終了後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳにて４回洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＩＢＬ社製）を５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、０.４ｍｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）と０.０３％過酸化水素水を含む０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５）を１００μｌずつ各ウェルにいれ、室温で１５分間遮光状態で放置し、発色させた。発色後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに加え、反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
一方、実施例１５で調製したＯＰＮタンパク質を用いて、ウエスタンブロット法にて抗血清の反応性を調べた。その結果、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１およびｈＯＰＮ５に対する抗血清は、ＧＳＴ-ＯＰＮ-ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ， ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｎｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｃｈａｌｆには反応しなかった。一方、ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗血清は、ＧＳＴ-ＯＰＮ-ａ，ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｂ， ＧＳＴ−ＯＰＮ−ｃおよびＧＳＴ−Ｃｈａｌｆに反応するが、ＧＳＴ−Ｎｈａｌｆには反応しなかった。
実 施 例 １８
抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの
結合体作製：
ＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３とｈＯＰＮ１に対する抗体とＨＲＰとの結合体作製は以下のように作製した。各抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体２０ｍｇをペプシン消化し、ゲル濾過することにより抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体のＦ（ａｂ'）２フラグメントを精製し、２−メルカプトエタノールを用いることによりＦ（ａｂ'）２フラグメントをＦａｂ'フラグメントに還元した。ＨＲＰとＥＭＣＳとを、３７℃で６０分反応させ、ゲル濾過することによりＨＲＰ−ＥＭＣＳ結合体を作製し、さらにこれと抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体Ｆａｂ'フラグメントとを４℃で一晩反応させ、ゲル濾過することによりＥＭＣＳ架橋による抗ＯＰＮ関連フラグメントペプチド抗体とＨＲＰとの結合体を作製した。
実 施 例 １９
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築：
サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートと標識抗体の組合せで１−３、５−１の２種類の系を作製した。このうち、１−３系は以下のように作製した。１０μｇ／ｍｌのＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ１に対する抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。４℃一晩反応させた後、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、この状態をサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。実施例１８で作製したＯＰＮ関連フラグメントペプチドｈＯＰＮ３に対する抗体とＨＲＰとの結合抗体を標識抗体とした。このようにｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた固相プレートとｈＯＰＮ３に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを１−３系とした。
同様にして、ｈＯＰＮ５に対する抗体を用いた固相プレートと、ｈＯＰＮ１に対する抗体を用いた標識抗体の組合せを５−１系として構築した。
実 施 例 ２０
サンドイッチＥＬＩＳＡ系による被験者におけるオステオ
ポンチンの測定：
ＯＰＮタンパク質の測定は以下のように行った。１−３系及び５−１系のサンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートに被験者から採取した血漿および関節腔液サンプルを含む溶液を１００μｌ加え、３７℃で一時間反応させた。反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで４回洗浄、それぞれの系に特異的な標識抗体を１００μｌ加え、４℃で３０分反応させた。反応後、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１００μｌ加え、室温、遮光下３０分放置した。１Ｎ硫酸で反応を止め、吸光度４５０ｎｍで測定した。
上記の方法により測定したリウマチ患者関節腔液（１３例）のＯＰＮ値を表９に、変形性関節症患者関節腔液（１２例）のＯＰＮ値を表１０に示す。また、リウマチ患者血漿（１６例）のＯＰＮ値を表１１に、変形性関節症患者血漿（７例）のＯＰＮ値を表１２に、正常人血漿（６例）のＯＰＮ値を表１３に示す。
これらの結果から明らかなように、血漿中ＯＰＮ値との比較において、１−３の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者および健常人間で、有意差は認められなかった。しかしながら、５−１の系では、リウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者ともに健常人との比較において、その測定値は有意に高く、その程度はリウマチ性関節炎患者に優位であった。このことは、５−１の系が反映する総ＯＰＮ量が関節炎全般における診断の有効性を示唆するものである。
一方、リウマチ性関節炎患者および変形性関節症患者の関節腔液のＯＰＮ値は、血漿におけるＯＰＮ値と比較して上昇しており、局所でのＯＰＮ産生が強く示唆された。
また、関節腔液中ＯＰＮ値のリウマチ性関節炎患者、変形性関節症患者間での比較において、１−３および５−１のいずれの系でも、リウマチ性関節炎患者は、変形性関節症患者と比較し、ＯＰＮ値が有意に高かった。
さらに新しい指標として１−３系／５−１系のＯＰＮ値比の検討を行った。この指標は、トロンビン開裂ＯＰＮの割合を比較することができる。リウマチ性関節炎患者の血漿および関節腔液のＯＰＮ値は1以下、変形性関節症患者では2以上となり、有意差が認められた。
したがって、１−３系／５−１系のＯＰＮ値を利用することにより、リウマチ患者と変形性関節症患者を区別することが可能となる早期の検査方法として利用できる。
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＯＰＮに対するＲＧＤ依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
【図２】図２は、抗体２Ｋ１による、α９形質転換ＳＷ４８０細胞とｎＯＰＮのＲＧＤ依存性、およびＲＧＤ非依存性細胞接着の阻害を示す図面である。
【図３ａ】図３ａは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走を示す図面である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＯＰＮ−誘導細胞遊走の、抗体による抑制を示す図面である。
【図４】図４は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の関節炎スコアの経時変化を示す図面である。
【図５】図５は、ＯＰＮ遺伝子欠損マウスと正常マウスのそれぞれに、関節炎惹起抗体カクテル／ＬＰＳを投与した場合の手首の腫れを比較した図面である。
【図６】図６は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の濃度依存的な接着を示す図面である。
【図７】図７は、マウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着をＧＲＧＤＳＰペプチドが阻害することを示す図面である。
【図８】図８は、抗体Ｍ５によるマウスＯＰＮとＮＩＨ３Ｔ３の接着阻害を示す図面である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物でヒトを除く動物を免疫し、当該ヒトを除く動物から抗体を採取することにより得られるオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体。
【請求項２】
オステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドが、次の式（１）、（２）または（３）で表されるペプチドである請求項第１項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体。
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ （１）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ （２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
【請求項３】
請求項第２項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体３種のうち、２種の抗体の組み合わせを利用する第一の免疫検出試薬と、異なる２種の抗体の組み合わせを利用する第二の免疫検出試薬とを組み合わせてなる炎症異常の検出用キット。
【請求項４】
第一の免疫検出試薬で用いる２種の抗体が、それぞれ次の式（３）および（２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ （２）
で表されるオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドに対する抗体であり、第二の免疫検出試薬で用いる２種の抗体が、それぞれ次の式（１）および（３）
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ （１）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
で表されるオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドに対する抗体である請求項第３項記載の炎症異常の検出用キット。
【請求項５】
請求項第４項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチド（３）および（２）に対する抗体の組み合わせを用いてトロンビン非切断型である全長オステオポンチンを検出し、請求項第４項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチド（１）および（３）に対する抗体の組み合わせを用いてオステオポンチンのトロンビン切断型Ｎ末端フラグメントを検出し、トロンビン非切断型である全長オステオポンチン量とオステオポンチンのトロンビン切断型Ｎ末端フラグメント量の比率を出すことにより、リウマチ性関節炎と変形性関節症の炎症異常を鑑別する診断方法。
【請求項６】
請求項第５項記載の炎症異常の鑑別に関節腔液または血漿を使用する方法。
【請求項１】
オステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドと生体高分子化合物とを結合させ、当該結合物でヒトを除く動物を免疫し、当該ヒトを除く動物から抗体を採取することにより得られるオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体。
【請求項２】
オステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドが、次の式（１）、（２）または（３）で表されるペプチドである請求項第１項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体。
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ （１）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ （２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
【請求項３】
請求項第２項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対する抗体３種のうち、２種の抗体の組み合わせを利用する第一の免疫検出試薬と、異なる２種の抗体の組み合わせを利用する第二の免疫検出試薬とを組み合わせてなる炎症異常の検出用キット。
【請求項４】
第一の免疫検出試薬で用いる２種の抗体が、それぞれ次の式（３）および（２）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
ＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡＴＤＥＣ （２）
で表されるオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドに対する抗体であり、第二の免疫検出試薬で用いる２種の抗体が、それぞれ次の式（１）および（３）
ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ （１）
ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱＣ （３）
で表されるオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチドに対する抗体である請求項第３項記載の炎症異常の検出用キット。
【請求項５】
請求項第４項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチド（３）および（２）に対する抗体の組み合わせを用いてトロンビン非切断型である全長オステオポンチンを検出し、請求項第４項記載のオステオポンチンのアイソフォームに対応するフラグメントペプチド（１）および（３）に対する抗体の組み合わせを用いてオステオポンチンのトロンビン切断型Ｎ末端フラグメントを検出し、トロンビン非切断型である全長オステオポンチン量とオステオポンチンのトロンビン切断型Ｎ末端フラグメント量の比率を出すことにより、リウマチ性関節炎と変形性関節症の炎症異常を鑑別する診断方法。
【請求項６】
請求項第５項記載の炎症異常の鑑別に関節腔液または血漿を使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１０６７６７（Ｐ２００７−１０６７６７Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８１０２７（Ｐ２００６−２８１０２７）
【出願日】平成１８年１０月１６日（２００６．１０．１６）
【分割の表示】特願２００２−５７９９０７（Ｐ２００２−５７９９０７）の分割
【原出願日】平成１４年４月４日（２００２．４．４）
【出願人】（３９９０３２２８２）株式会社 免疫生物研究所 (14)
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１６日（２００６．１０．１６）
【分割の表示】特願２００２−５７９９０７（Ｐ２００２−５７９９０７）の分割
【原出願日】平成１４年４月４日（２００２．４．４）
【出願人】（３９９０３２２８２）株式会社 免疫生物研究所 (14)
【出願人】（０００００６６７７）アステラス製薬株式会社 (274)
【Ｆターム（参考）】
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