抗ストレス剤
【課題】抗ストレス効果を有する組成物を提供する。
【解決手段】ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤。
【解決手段】ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリエが、精神的・肉体的ストレスが胃酸分泌や胃粘膜障害に関与することを「ストレス学説」として提唱して以来、ストレスは胃・十二指腸潰瘍の主原因と考えられてきた。このような胃病変は「ストレス潰瘍」と呼ばれ、その代表的なものとして脳外科手術後のCurling潰瘍や広範囲熱傷時に発生するCushing潰瘍が有名である。また動物実験では、水浸拘束ストレス、コミュニケーションボックス（communication box）法による情動ストレスにより、胃粘膜障害を形成することができる。しかし、H. pyloriの分離・培養に成功して以来多くの研究が行われ、胃、十二指腸潰瘍の主な原因はH. pylori感染であると考えられるようになった。現在では、H. pylori感染、ＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド性抗炎症薬）、ストレスが胃粘膜障害の３大原因と考えられている。
【０００３】
H. pylori感染による胃・十二指腸における消化器疾患は、菌、宿主、環境因子の間で起こる複雑なクロストークによって引き起こされるので、H. pylori感染のみではその原因を十分に理解することは困難である。また、H. pylori陽性にもかかわらず消化器疾患を発症しないのに対して、H. pylori陰性の消化器疾患が観察されることもある。これらの相違は食事、喫煙、ストレス、ＮＳＡＩＤｓなどの薬剤、遺伝子多型、衛生状態などの様々な因子が消化器疾患に関与していることを示唆している。
【０００４】
これらの中でもストレスは古くから胃潰瘍などの消化器疾患の有力な原因であると考えられてきた。１９９６年の阪神・淡路大震災後、出血性胃潰瘍の増加が確認された。この原因として、震災によるストレス、H. pylori感染、そしてH. pyloriのＣａｇＡ陽性による胃粘膜障害の亢進という複合要因によって起こったとされている。
【０００５】
したがって、ストレス、特にH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスを抑制することができる薬剤の開発が望まれていた。
【０００６】
我が国固有の香辛料であるわさび（Wasabia japonica Matsumura）は、根茎及びその主成分であるイソチオシアネートに関して研究が行われてきた。しかし、ワサビ葉は、大量に採取可能であるが、食用に適さないこと等から、資源としては活用されていなかった。
【０００７】
したがって、ワサビ葉を有効に利用する方法の開発も望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ワサビ葉の抽出物が抗ストレス作用を有することを発見し、本発明を完成させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤を提供する。
したがって、本発明は、
１．ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤、
２．ワサビ葉の抽出物が、エタノール抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物である、上記１記載の抗ストレス剤、
３．ストレスがH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスである、上記１又は２に記載の抗ストレス剤、
に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明で用いるワサビとしては、アブラナ科ワサビ属のWasabia japonicaを挙げることができ、特にWasabia japonica Matsumuraが好ましい。これらのワサビは、水洗し汚れを除き、そのままでも用いるのが好ましい。
【００１１】
ワサビ葉をメタノールにて抽出し、溶媒を減圧下で留去させ、メタノール抽出物を得る。さらにメタノール抽出物を水に溶解し、ヘキサン、酢酸エチル、ｎ−ブタノールにて順次分配し、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物および水抽出物を得ることができる。
【００１２】
得られた抽出液は、そのままか、又は必要に応じ、中和、脱塩、濃縮して使用することができる。必要に応じ、さらに一般的な精製処理を行うこともできる。精製処理としては、有機溶媒による沈殿、硫安、食塩、塩化カリウム等を用いる塩析、透析、限外ろ過、逆浸透処理、デキストラン、ポリアクリルアミドゲル等を充填したカラムを用いるゲルろ過等を用いることができる。また、これらの処理を２つ以上組み合わせて行うこともできる。
【００１３】
以上の操作で得られた活性成分を含む抽出物は、そのまま抗ストレス剤として用いることができるが、通常は、さらに、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、熱風乾燥等によって乾燥することができる。
【００１４】
本発明の抽出物は、天然物に由来し、大量に摂取しても生体に悪影響を及ぼさないという利点を有することから、医薬品の原料として用いることができるほか、抽出物それ自体又は種々の栄養分を加えて、又は飲食品中に含有させた抗ストレス作用を有する機能性食品又は健康食品として提供することができる。具体的には、各種のビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば、栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには、粉末状としてそのままか、又は各種食品へ添加して用いることもできる。かかる抗ストレス剤としての本発明の抽出物の有効成分の含有量は、成人１日体重１kg当たり１０〜１０００mgであり、単回又は２〜３回に分けて摂取することができる。
【実施例】
【００１５】
わさび葉抽出物の調製
わさび葉（フレッシュ重量：９．０kg）をメタノールにて室温で３回抽出し、溶媒を減圧下で留去させ、メタノール抽出物を得た。さらにメタノール抽出物を水に溶解し、ヘキサン、酢酸エチル、ｎ−ブタノールにて順次分配し、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物および水抽出物を得た。
【００１６】
わさび葉の酢酸エチル抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物を低用量群（１０mg/kg B.W./day）、中用量群（５０mg/kg/day）、高用量群（２００mg/kg B.W./day）になるよう生理食塩水２００μlに溶解した。対照群には生理食塩水を用いた。
【００１７】
わさび葉抽出物の投与および拘束ストレス実験
スナネズミを７日間馴化させ、各群６時間絶食後、試料の経口投与を１０日間行った。１０日目の投与後に絶食し、絶食後スナネズミの四肢を結紮してコルクボードに固定し、３０、９０、２７０分間ストレスを負荷した。拘束後、ネンブタールを４０mg/kgになるように腹腔内に投与した。ヘパリンナトリウム注射液を入れた２６Ｇの注射針で大動脈から採血を行い、コメットアッセイに血液を使用後、残りを３０００rpm、１０minで遠心し血漿を得た。続いて胃を摘出し、滅菌シャーレ上で胃大弯を切開し、胃内容物を取り除いた。胃は、１／２を組織染色用として１０％ホルマリン溶液中で固定し、さらに１／２を８−オキソデオキシグアニン（８−ｏｘｏｄＧ）測定用、感染群ではＣＦＵｓ測定用に用いた。なお、血漿および８−ｏｘｏｄＧ測定用の胃はそれぞれの測定直前まで−８０℃で凍結保存した。各種測定項目は以下に記載した。
【００１８】
各種測定項目
（１）胃の重量の測定
胃内容物を取り出した後、胃の湿重量を計量した。
【００１９】
（２）胃内のH. pylori生菌数の測定
摘出した胃を細開後、生理食塩水１．０mlを加え、細切した胃に滅菌生食注６．０mlを加え、ホモジナイズした。ホモジネートを滅菌生食注で１０倍、１００倍に希釈し、それぞれ１００μlをニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地（日水製薬株式会社）に蒔きコンラージ棒で引き伸ばした。アネロパック角型ジャーに培地、アネロパック・ヘリコ（三菱ガス化学株式会社）、雰囲気の保湿用の精製水を入れ、３７℃で５日間培養後、コロニー数を計測した。
【００２０】
（３）胃内pHの測定
胃内容物のpHをCOMPACT pH METER B-2１１（HORIBA）で測定した。
【００２１】
（４）胃粘膜剥離状態の観察
摘出した胃の大弯側を幽門から噴門まで切開し、内容物を除去した後、粘膜面を表にして形を整え、インジゴカーミン液を滴下した。余分な液を除き、粘膜の剥離を目視により確認した。
【００２２】
（５）胃組織標本の作製
組織を１０％ホルマリン溶液に浸漬し固定した後、自動包理装置（ETP-１５０C、SAKURA）を用いて病理用パラフィン（Histologie、Merck）に包理した。その後、３〜４μmに薄切し、プレパラートを作成し、定法に従ってヘマトキシリンエオシン染色を施した。
【００２３】
（６）胃粘膜障害スコアの判定
肉眼所見で正常な状態を０点、浮腫：１点、びらん：２点、びらん多発：３点、潰瘍４点として、胃粘膜障害の状態を数値化し、各群の平均値を胃粘膜障害スコアとした。浮腫は胃の組織間隙に水分が大量に貯留した状態、びらんは組織欠損が粘膜のみの浅い状態、潰瘍は組織欠損が粘膜下層、筋層や漿膜まで達した状態である。
【００２４】
（７）胃粘膜出血スコアの判定
肉眼所見で出血のない状態を０点、小出血点：１点、小出血点多発：２点、出血班：３点、出血班多発：４点として、胃粘膜出血の状態を数値化し、各群の平均値を胃粘膜出血スコアとした。
【００２５】
（８）胃組織中の８−ｏｘｏｄＧ量の測定
１．ＤＮＡの抽出
解凍した約１５０mgの胃組織に、氷冷０．３Mスクロース溶液１mlを加えテフロン（登録商標）ガラスホモジナイザーでホモジネートし、さらに、氷冷スクロース溶液２mlで、遠沈管に移し、遠心した。上清を捨てた後、ペレットを氷冷生理食塩水１mlで２回洗い、粗核分画を得た。これ以降の処理・反応はアルゴン雰囲気下で行った。粗核分画を１％ＳＤＳ溶液３５０μlに再懸濁し、２５mg/mlプロテナーゼＫ ５０μlを加え、時々懸濁しながらインキュベーションした。その後、７M ＮａＩ０．４ml、イソプロピルアルコール０．８mlを加えよく混和し、−２０℃、１０min以上放置し、遠心しＤＮＡを得た。ＤＮＡペレットを氷冷７０％ エタノール１mlで２回洗い、ｓｓｃ３００μl、ＲＮａｓｅを加え、インキュベーションした。反応後、Ｓｅｖａｇ（クロロホルム／イソミルアルコール＝１：１、ｖ／ｖ）４００μlを加え、遠心し、上清を他のエッペンドルフチュ−ブに移し、ＰＥＧ３００μlを加え、４℃で一晩静置した。遠心し得られたＤＮＡペレットを、氷冷７０％ エタノール１mlで２回洗った。沈殿物にChelex処理水５０μlを加え、アルゴン置換後、−８０℃で保管した。なお、特にことわりがない限り、遠心は３０００rpm、2０min、４℃、超遠心は１５０００rpm、１０min、４℃、インキュベーションは３７℃で行った。
【００２６】
２．ＤＮＡの濃度測定
抽出したＤＮＡをＣｈｅｌｅｘ水で５０倍に希釈し、２６０nmの波長における吸光度を吸光光度計により測定し、次式により抽出したＤＮＡ量を算出した。２６０nmの吸光度１．０が５０μg/mlに相当する。３２０nmの波長はバックグラウンドを示す。ＤＮＡ濃度（μg/ml）＝吸光度（２６０nm-３２０nm）×５０（μg/ml）×５０（希釈率）
【００２７】
ＤＮＡの加水分解
解凍した２５μg相当のＤＮＡ水溶液にＣｈｅｌｅｘ水を加え２２．５mlとし、２００mM酢酸ナトリウムバッファー（pH４．８）２．５μg、ヌクレアーゼＰ１ ６単位を加えて、アルゴン置換後、インキュベーション（３７℃、３０min）した。反応後、１M Tris-HCl １．５μl、アルカリホスホターゼ２単位を添加して、アルゴン置換後、インキュベーション（３７℃、１hr）した。反応後、加水分解溶液をUltrafree-C３LGC（MilliPore）にいれ、遠心分離（１４０００rpm、１０min）してタンパク質をろ過除去し、ヌクレオシドを得た。
【００２８】
ＨＰＬＣによる８−ｏｘｏｄＧの定量
８−ｏｘｏｄＧは、Mightysil RP-18 GP 150-4.6(５μm)（関東化学株式会社）を接続したＥＣＤ（ESA CoulechemII5200、Bedford）と組み合わせたＨＰＬＣ（LC-10ポンプ、Shimadzu）を用いて測定した。使用溶媒は、１２．５mMクエン酸、３０mM水酸化ナトリウム、２５mM酢酸ナトリウム、１０mM酢酸を含む０．６％メタノール（pH５．１）で、流量は１．０ml/min、ＥＣＤの加電圧は３５０mVとした。また、８−ｏｘｏｄＧ量は同時にＵＶＤ（UVD-10、Shimadzu）によって測定されたｄＧ量あたりの数に換算した。
【００２９】
（９）全血液を用いたコメットアッセイ
以下の実験で、細胞試料を扱う際は、紫外線吸収膜付蛍光灯下で処理した。血液をＰＢＳ−で２倍に希釈した。スライドガラス（松浪硝子工業株式会社）にまずプレコートとして０．７％アガー溶液５０μlを滴下し、他のスライドガラスの側面を用いてアガーを薄くのばし、乾燥機（５０℃）中で１時間以上静置した。次に、第１層として０．７％アガー溶液７５μlを滴下し、スライドガラスをかぶせてアガーを広げ、水平な場所に静置した。次いで、かぶせたスライドガラスを外し、第２層として調製した細胞試料と１．４％アガー溶液を１:１で混合した細胞混濁液７５μlを滴下し、第１層の時と同様にしてアガーを広げ、水平な場所に静置した。さらに、第３層として１．４％アガー溶液とPBS-を１:１で混合した混合液７５μlを滴下し、同様にアガーを広げ、水平な場所に静置した。アガー固化後、スライドガラスを外して細胞標本とした。溶解溶液中に細胞標本を浸し、氷上で１時間放置した。溶解溶液から取り出した細胞標本をＦｐｇバッファーに浸し、５分ごとに３回、新しいものと交換した。その後、アガーの上にＦｐｇ溶液１μg/ml（対照にはＦｐｇバッファー）８０μlを滴下し、カバーガラスをかぶせて重層し、３７℃、１５分間、湿度を保った箱中で反応させた。周囲を氷で冷やした水平型電気泳動槽にプレパラートを並べ、電気泳動溶液を満たし、細胞ＤＮＡの巻き戻し（unwinding）とアルカリ不安定性部位発現のために１０分間静置した。その後、電気泳動（２５V、３００mA、１５min）を行った。この際、電気泳動溶液を１０℃以下に保った。泳動後、スライドガラス上の過剰なアルカリ分を０．４MＴｒｉｓバッファー（２ml/スライド）で中和した。０．４ＭＴｒｉｓバッファーは５分ごと２回新しいものと交換した。中和した後、エチジウムブロミド溶液５０μlをスライド上に滴下し、カバーガラスをかけた。直ちに観察しない場合は、中和した後１００％エタノールに１０分間浸して取り出し、冷暗所で保存した。画像解析装置（Comet Analyzer、YOU WORKS）を取り付けた蛍光顕微鏡（Olympus）を用いてＧ励起波長で観察した。プレパラート１枚につき、細胞５０個をカウントしTail momentを求めた。
【００３０】
（１０）統計学的解析
得られた実験群の個々の値は、平均±ＳＤで表し、統計学的検定はダネット検定でｐ<０．０５をもって有意とした。また、コメットアッセイは得られた実験群の個々の値は、平均±ＳＥＭで表し、統計学的検定はマンホイットニーＵ検定で行い、ｐ＜０．０５をもって有意とした。
【００３１】
実験結果
１．わさび葉抽出物による胃の重量および胃内のH. pylori生菌数への影響
胃の重量および胃内のH. pylori生菌数を表１に示した。胃の重量は１００g体重に換算して表記した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃の重量への影響は認められなかった。しかし、H. pylori感染により、非感染群と比較して、胃の重量は０．８３g増加し有意な差を認め、わさび葉抽出物により胃の重量が、低用量群で０．１８g、中用量群で０．１６g減少し有意な差を示したが、高用量群では０．０９g減少したが有意な差は認められなかった。一方、H. pylori生菌数は胃当たりのＣＦＵｓの対数で表記した。わさび葉抽出物はH. pylori感染によるＣＦＵｓへの影響を認められなかった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
２．わさび葉抽出物による胃内pH、胃粘膜傷害および胃粘膜出血への影響
胃内pH、胃粘膜傷害および出血スコアを表２に示した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃内pHへの影響は認められなかった。また、感染群と比較して、pHは０．５上昇したが有意な差は示さず、わさび葉抽出物各群において０．４程度の減少を示したが有意な差は認められなかった。また、非感染群において、ストレス負荷により３０、９０minで０．５程度上昇したが有意な差は示さず、２７０minで１．１上昇し有意な差を認めた。わさび葉抽出物により、９０minで０．６程度減少し有意な差を示した。しかし、２７０minでは０．５以上減少し抑制傾向は確認されたが有意な差は示さなかった。H. pylori感染群において、ストレス負荷により９０minで１．６、２７０minで３．４上昇し有意な差を認めた。また、わさび葉抽出物により、９０minにおいては、中用量群で変化は認めなかったが、高用量群で１．５減少し有意な差を示した。２７０minにおいては、中用量群で３．２減少し有意な差を示したが、高用量群では１．５減少したが有意な差は認められなかった。
【００３４】
【表２】
＊Table８を表２として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００３５】
胃粘膜面をインジゴカーミン染色した組織標本を図１に示した。インジゴカーミン液は、胃内視鏡検査において、がん組織など異常部分と、正常粘膜の境界を検索するために汎用されている。正常胃粘膜の凹部分に分布しこれを青色に可視化するため、正常粘膜の範囲を目視で観察するのに適している。非感染群ではストレス負荷０min（a）、２７０min（b）ともに、粘膜面は濃染し粘膜の剥離はみられなかった。しかし、H. pylori感染群では、ストレス負荷０min（c）では、粘膜は青染し、剥離は認められなかったが、ストレス負荷２７０min（d）では、粘膜表面全体に、染まりが淡く粘膜が剥離している様子が観察された。
【００３６】
胃組織に対するストレスの影響を検討するために、ヘマトキシリンエオジン染色像を図２に示した。H. pylori非感染群において、ストレス負荷０min（a）では、粘膜厚が揃い、粘膜表面は粘液で覆われていた（正常像）が、ストレス負荷２７０min（b）では、粘液が剥がれ、粘膜表面が、不揃いになり、浅いびらんを呈している。H. pylori感染群においては、ストレス負荷０minでも、胃腺構造が崩れた部分が散見され、顕著な白血球（リンパ球）浸潤が観察された（c）。この状態に２７０minストレス負荷を加えると、胃腺の崩壊はより顕著になり、粘膜筋板あるいは、粘膜下層に及ぶ組織融解がみられた（d）。
【００３７】
H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃粘膜傷害スコアは高用量群で０．６点上昇を認めるものの有意な差は示さなかった。しかし、感染群との比較では、２．８点上昇し有意な差を認め、中用量群で０．８点減少し有意な差を示したが、その他の群では有意な差は示さなかった。また、非感染群におけるストレス負荷の影響は、９０minで上昇傾向を示し、２７０minで１．６点上昇し有意な差を認めた。また、中用量群では影響は認めなかったが、高用量群では９０minでは２．２点上昇し有意な差を認め、２７０minにおいても１点上昇したが有意な差は認めなかった。感染群に対するストレス負荷は、時間依存的に上昇し２７０minで１点上昇し有意な差を示した。また、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、高用量群では影響を示さず、中用量群で１点減少したものの有意な差は示さなかった。２７０minでは、中用量群で２点、高用量群で０．６点減少し有意な差を示した。
【００３８】
H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃粘膜出血スコアへの有意な差は認めなかった。また、感染群との比較では、３点上昇し有意な差を示したが、わさび葉抽出物は出血に対して影響を認めなかった。また、非感染群におけるストレス負荷の影響は、９０minで上昇傾向を示し、２７０minで１．４点上昇し有意な差を示した。わさび葉抽出物は、９０minで０．６点以上減少したが有意な差は認めず、２７０minでは各群影響を認めなかった。感染群に対するストレス負荷は、出血に有意な差を示さなかった。わさび葉抽出物は、９０minにおいて、中用量群で０．８点減少したが有意な差は認めなかった。２７０minでは、中用量群で１．５点減少し有意な差を示したが、高用量群では有意な差を示さなかった。
【００３９】
３．わさび葉抽出物による胃組織中の８-oxodG量への影響
胃組織中の８-oxodG量を表３に示した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による８-oxodG量は高用量群で３０％上昇したが有意な差は認められなかった。また、感染群と比較して、８-oxodG量は１４５％程度上昇し有意な差を認め、わさび葉抽出物により８-oxodG量が中用量群で３４％程度、高用量群で２７％程度減少し有意な差を示したが、低用量群では１１％程度上昇したが有意な差は認められなかった。また、ストレス負荷による影響は、非感染群においては時間依存的に上昇し、９０min以降８-oxodG量の増加を認め、２７０minで８-oxodG量は１６７％程度上昇し有意な差を示し、わさび葉抽出物により、２７０minにおいて、中用量群で３２％程度、高用量群では４２％程度の８-oxodG量の減少を確認し有意な差を示した。また、感染群におけるストレスの影響は３０minで１７％程度上昇し、９０minで２０％程度上昇したが有意な差は示さず、２７０minで４２％程度上昇し有意な差を示した。また、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、中用量群で４６％程度、高用量群で３１％程度減少し有意な差を示し、２７０minにおいては、中用量群で４１％程度、高用量群で４８％程度減少し有意な差を示した。
【００４０】
【表３】
＊Table9を表３として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００４１】
４．わさび葉抽出物による血液中の酸化的DNA損傷への影響
コメットアッセイの結果を表４に示した。Ｆｐｇ（−）の結果については、非感染群において、わさび葉抽出物は各群３０％程度減少し有意な差を認めた。しかし、感染群と比較して４３％上昇したが有意な差は認めなかったが、非感染群と同様にわさび葉抽出物は中用量群で抑制効果を認め有意な差を示した。感染群との比較では、４３％上昇したが有意な差は認めず、低用量群で３４％上昇し有意な差を示した。非感染群におけるストレス負荷は、９０minまで影響を示さず、２７０minで４２％上昇し、有意な差を示した。また、２７０minにおいて、わさび葉抽出物により２０％以上減少し有意な差を認めた。感染群では、ストレス負荷による有意な差は認めなかった。しかし、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、６％以上上昇し有意な差を示した。Ｆｐｇ（＋）の結果については、非感染群において、わさび葉抽出物は中用量群で３１％減少し有意な差を示した。感染群と比較して４６０％上昇し有意な差を認めたが、低用量群で１３％減少し抑制傾向を示し、中用量、高用量群で２７％程度減少し有意な差を認めた。非感染群における、ストレス負荷は時間依存的な上昇を示し、９０minで１６％上昇し、２７０minで１１３％上昇し有意な上昇を認めた。この上昇に対して、わさび葉抽出物は各群１０〜３８％減少し有意な差を認めた。感染群において、ストレス負荷は３０minで影響はなく、９０minで８％上昇、２７０minで２８％上昇し有意な差を認めた。これに対して、わさび葉抽出物は２１〜３３％減少を示し有意な差を示した。
【００４２】
【表４】
＊Table10を表４として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００４３】
本発明の抽出物は、安全かつ廉価であり、その抗ストレス効果を利用した薬剤や機能性食品の原料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】胃粘膜面をインジゴカーミン染色した組織標本である。
【図２】胃組織をヘマトキシリンエオジン染色した組織標本である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
セリエが、精神的・肉体的ストレスが胃酸分泌や胃粘膜障害に関与することを「ストレス学説」として提唱して以来、ストレスは胃・十二指腸潰瘍の主原因と考えられてきた。このような胃病変は「ストレス潰瘍」と呼ばれ、その代表的なものとして脳外科手術後のCurling潰瘍や広範囲熱傷時に発生するCushing潰瘍が有名である。また動物実験では、水浸拘束ストレス、コミュニケーションボックス（communication box）法による情動ストレスにより、胃粘膜障害を形成することができる。しかし、H. pyloriの分離・培養に成功して以来多くの研究が行われ、胃、十二指腸潰瘍の主な原因はH. pylori感染であると考えられるようになった。現在では、H. pylori感染、ＮＳＡＩＤｓ（非ステロイド性抗炎症薬）、ストレスが胃粘膜障害の３大原因と考えられている。
【０００３】
H. pylori感染による胃・十二指腸における消化器疾患は、菌、宿主、環境因子の間で起こる複雑なクロストークによって引き起こされるので、H. pylori感染のみではその原因を十分に理解することは困難である。また、H. pylori陽性にもかかわらず消化器疾患を発症しないのに対して、H. pylori陰性の消化器疾患が観察されることもある。これらの相違は食事、喫煙、ストレス、ＮＳＡＩＤｓなどの薬剤、遺伝子多型、衛生状態などの様々な因子が消化器疾患に関与していることを示唆している。
【０００４】
これらの中でもストレスは古くから胃潰瘍などの消化器疾患の有力な原因であると考えられてきた。１９９６年の阪神・淡路大震災後、出血性胃潰瘍の増加が確認された。この原因として、震災によるストレス、H. pylori感染、そしてH. pyloriのＣａｇＡ陽性による胃粘膜障害の亢進という複合要因によって起こったとされている。
【０００５】
したがって、ストレス、特にH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスを抑制することができる薬剤の開発が望まれていた。
【０００６】
我が国固有の香辛料であるわさび（Wasabia japonica Matsumura）は、根茎及びその主成分であるイソチオシアネートに関して研究が行われてきた。しかし、ワサビ葉は、大量に採取可能であるが、食用に適さないこと等から、資源としては活用されていなかった。
【０００７】
したがって、ワサビ葉を有効に利用する方法の開発も望まれていた。
【０００８】
そこで、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ワサビ葉の抽出物が抗ストレス作用を有することを発見し、本発明を完成させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤を提供する。
したがって、本発明は、
１．ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤、
２．ワサビ葉の抽出物が、エタノール抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物である、上記１記載の抗ストレス剤、
３．ストレスがH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスである、上記１又は２に記載の抗ストレス剤、
に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明で用いるワサビとしては、アブラナ科ワサビ属のWasabia japonicaを挙げることができ、特にWasabia japonica Matsumuraが好ましい。これらのワサビは、水洗し汚れを除き、そのままでも用いるのが好ましい。
【００１１】
ワサビ葉をメタノールにて抽出し、溶媒を減圧下で留去させ、メタノール抽出物を得る。さらにメタノール抽出物を水に溶解し、ヘキサン、酢酸エチル、ｎ−ブタノールにて順次分配し、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物および水抽出物を得ることができる。
【００１２】
得られた抽出液は、そのままか、又は必要に応じ、中和、脱塩、濃縮して使用することができる。必要に応じ、さらに一般的な精製処理を行うこともできる。精製処理としては、有機溶媒による沈殿、硫安、食塩、塩化カリウム等を用いる塩析、透析、限外ろ過、逆浸透処理、デキストラン、ポリアクリルアミドゲル等を充填したカラムを用いるゲルろ過等を用いることができる。また、これらの処理を２つ以上組み合わせて行うこともできる。
【００１３】
以上の操作で得られた活性成分を含む抽出物は、そのまま抗ストレス剤として用いることができるが、通常は、さらに、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、熱風乾燥等によって乾燥することができる。
【００１４】
本発明の抽出物は、天然物に由来し、大量に摂取しても生体に悪影響を及ぼさないという利点を有することから、医薬品の原料として用いることができるほか、抽出物それ自体又は種々の栄養分を加えて、又は飲食品中に含有させた抗ストレス作用を有する機能性食品又は健康食品として提供することができる。具体的には、各種のビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば、栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには、粉末状としてそのままか、又は各種食品へ添加して用いることもできる。かかる抗ストレス剤としての本発明の抽出物の有効成分の含有量は、成人１日体重１kg当たり１０〜１０００mgであり、単回又は２〜３回に分けて摂取することができる。
【実施例】
【００１５】
わさび葉抽出物の調製
わさび葉（フレッシュ重量：９．０kg）をメタノールにて室温で３回抽出し、溶媒を減圧下で留去させ、メタノール抽出物を得た。さらにメタノール抽出物を水に溶解し、ヘキサン、酢酸エチル、ｎ−ブタノールにて順次分配し、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、ｎ−ブタノール抽出物および水抽出物を得た。
【００１６】
わさび葉の酢酸エチル抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物を低用量群（１０mg/kg B.W./day）、中用量群（５０mg/kg/day）、高用量群（２００mg/kg B.W./day）になるよう生理食塩水２００μlに溶解した。対照群には生理食塩水を用いた。
【００１７】
わさび葉抽出物の投与および拘束ストレス実験
スナネズミを７日間馴化させ、各群６時間絶食後、試料の経口投与を１０日間行った。１０日目の投与後に絶食し、絶食後スナネズミの四肢を結紮してコルクボードに固定し、３０、９０、２７０分間ストレスを負荷した。拘束後、ネンブタールを４０mg/kgになるように腹腔内に投与した。ヘパリンナトリウム注射液を入れた２６Ｇの注射針で大動脈から採血を行い、コメットアッセイに血液を使用後、残りを３０００rpm、１０minで遠心し血漿を得た。続いて胃を摘出し、滅菌シャーレ上で胃大弯を切開し、胃内容物を取り除いた。胃は、１／２を組織染色用として１０％ホルマリン溶液中で固定し、さらに１／２を８−オキソデオキシグアニン（８−ｏｘｏｄＧ）測定用、感染群ではＣＦＵｓ測定用に用いた。なお、血漿および８−ｏｘｏｄＧ測定用の胃はそれぞれの測定直前まで−８０℃で凍結保存した。各種測定項目は以下に記載した。
【００１８】
各種測定項目
（１）胃の重量の測定
胃内容物を取り出した後、胃の湿重量を計量した。
【００１９】
（２）胃内のH. pylori生菌数の測定
摘出した胃を細開後、生理食塩水１．０mlを加え、細切した胃に滅菌生食注６．０mlを加え、ホモジナイズした。ホモジネートを滅菌生食注で１０倍、１００倍に希釈し、それぞれ１００μlをニッスイプレート・ヘリコバクター寒天培地（日水製薬株式会社）に蒔きコンラージ棒で引き伸ばした。アネロパック角型ジャーに培地、アネロパック・ヘリコ（三菱ガス化学株式会社）、雰囲気の保湿用の精製水を入れ、３７℃で５日間培養後、コロニー数を計測した。
【００２０】
（３）胃内pHの測定
胃内容物のpHをCOMPACT pH METER B-2１１（HORIBA）で測定した。
【００２１】
（４）胃粘膜剥離状態の観察
摘出した胃の大弯側を幽門から噴門まで切開し、内容物を除去した後、粘膜面を表にして形を整え、インジゴカーミン液を滴下した。余分な液を除き、粘膜の剥離を目視により確認した。
【００２２】
（５）胃組織標本の作製
組織を１０％ホルマリン溶液に浸漬し固定した後、自動包理装置（ETP-１５０C、SAKURA）を用いて病理用パラフィン（Histologie、Merck）に包理した。その後、３〜４μmに薄切し、プレパラートを作成し、定法に従ってヘマトキシリンエオシン染色を施した。
【００２３】
（６）胃粘膜障害スコアの判定
肉眼所見で正常な状態を０点、浮腫：１点、びらん：２点、びらん多発：３点、潰瘍４点として、胃粘膜障害の状態を数値化し、各群の平均値を胃粘膜障害スコアとした。浮腫は胃の組織間隙に水分が大量に貯留した状態、びらんは組織欠損が粘膜のみの浅い状態、潰瘍は組織欠損が粘膜下層、筋層や漿膜まで達した状態である。
【００２４】
（７）胃粘膜出血スコアの判定
肉眼所見で出血のない状態を０点、小出血点：１点、小出血点多発：２点、出血班：３点、出血班多発：４点として、胃粘膜出血の状態を数値化し、各群の平均値を胃粘膜出血スコアとした。
【００２５】
（８）胃組織中の８−ｏｘｏｄＧ量の測定
１．ＤＮＡの抽出
解凍した約１５０mgの胃組織に、氷冷０．３Mスクロース溶液１mlを加えテフロン（登録商標）ガラスホモジナイザーでホモジネートし、さらに、氷冷スクロース溶液２mlで、遠沈管に移し、遠心した。上清を捨てた後、ペレットを氷冷生理食塩水１mlで２回洗い、粗核分画を得た。これ以降の処理・反応はアルゴン雰囲気下で行った。粗核分画を１％ＳＤＳ溶液３５０μlに再懸濁し、２５mg/mlプロテナーゼＫ ５０μlを加え、時々懸濁しながらインキュベーションした。その後、７M ＮａＩ０．４ml、イソプロピルアルコール０．８mlを加えよく混和し、−２０℃、１０min以上放置し、遠心しＤＮＡを得た。ＤＮＡペレットを氷冷７０％ エタノール１mlで２回洗い、ｓｓｃ３００μl、ＲＮａｓｅを加え、インキュベーションした。反応後、Ｓｅｖａｇ（クロロホルム／イソミルアルコール＝１：１、ｖ／ｖ）４００μlを加え、遠心し、上清を他のエッペンドルフチュ−ブに移し、ＰＥＧ３００μlを加え、４℃で一晩静置した。遠心し得られたＤＮＡペレットを、氷冷７０％ エタノール１mlで２回洗った。沈殿物にChelex処理水５０μlを加え、アルゴン置換後、−８０℃で保管した。なお、特にことわりがない限り、遠心は３０００rpm、2０min、４℃、超遠心は１５０００rpm、１０min、４℃、インキュベーションは３７℃で行った。
【００２６】
２．ＤＮＡの濃度測定
抽出したＤＮＡをＣｈｅｌｅｘ水で５０倍に希釈し、２６０nmの波長における吸光度を吸光光度計により測定し、次式により抽出したＤＮＡ量を算出した。２６０nmの吸光度１．０が５０μg/mlに相当する。３２０nmの波長はバックグラウンドを示す。ＤＮＡ濃度（μg/ml）＝吸光度（２６０nm-３２０nm）×５０（μg/ml）×５０（希釈率）
【００２７】
ＤＮＡの加水分解
解凍した２５μg相当のＤＮＡ水溶液にＣｈｅｌｅｘ水を加え２２．５mlとし、２００mM酢酸ナトリウムバッファー（pH４．８）２．５μg、ヌクレアーゼＰ１ ６単位を加えて、アルゴン置換後、インキュベーション（３７℃、３０min）した。反応後、１M Tris-HCl １．５μl、アルカリホスホターゼ２単位を添加して、アルゴン置換後、インキュベーション（３７℃、１hr）した。反応後、加水分解溶液をUltrafree-C３LGC（MilliPore）にいれ、遠心分離（１４０００rpm、１０min）してタンパク質をろ過除去し、ヌクレオシドを得た。
【００２８】
ＨＰＬＣによる８−ｏｘｏｄＧの定量
８−ｏｘｏｄＧは、Mightysil RP-18 GP 150-4.6(５μm)（関東化学株式会社）を接続したＥＣＤ（ESA CoulechemII5200、Bedford）と組み合わせたＨＰＬＣ（LC-10ポンプ、Shimadzu）を用いて測定した。使用溶媒は、１２．５mMクエン酸、３０mM水酸化ナトリウム、２５mM酢酸ナトリウム、１０mM酢酸を含む０．６％メタノール（pH５．１）で、流量は１．０ml/min、ＥＣＤの加電圧は３５０mVとした。また、８−ｏｘｏｄＧ量は同時にＵＶＤ（UVD-10、Shimadzu）によって測定されたｄＧ量あたりの数に換算した。
【００２９】
（９）全血液を用いたコメットアッセイ
以下の実験で、細胞試料を扱う際は、紫外線吸収膜付蛍光灯下で処理した。血液をＰＢＳ−で２倍に希釈した。スライドガラス（松浪硝子工業株式会社）にまずプレコートとして０．７％アガー溶液５０μlを滴下し、他のスライドガラスの側面を用いてアガーを薄くのばし、乾燥機（５０℃）中で１時間以上静置した。次に、第１層として０．７％アガー溶液７５μlを滴下し、スライドガラスをかぶせてアガーを広げ、水平な場所に静置した。次いで、かぶせたスライドガラスを外し、第２層として調製した細胞試料と１．４％アガー溶液を１:１で混合した細胞混濁液７５μlを滴下し、第１層の時と同様にしてアガーを広げ、水平な場所に静置した。さらに、第３層として１．４％アガー溶液とPBS-を１:１で混合した混合液７５μlを滴下し、同様にアガーを広げ、水平な場所に静置した。アガー固化後、スライドガラスを外して細胞標本とした。溶解溶液中に細胞標本を浸し、氷上で１時間放置した。溶解溶液から取り出した細胞標本をＦｐｇバッファーに浸し、５分ごとに３回、新しいものと交換した。その後、アガーの上にＦｐｇ溶液１μg/ml（対照にはＦｐｇバッファー）８０μlを滴下し、カバーガラスをかぶせて重層し、３７℃、１５分間、湿度を保った箱中で反応させた。周囲を氷で冷やした水平型電気泳動槽にプレパラートを並べ、電気泳動溶液を満たし、細胞ＤＮＡの巻き戻し（unwinding）とアルカリ不安定性部位発現のために１０分間静置した。その後、電気泳動（２５V、３００mA、１５min）を行った。この際、電気泳動溶液を１０℃以下に保った。泳動後、スライドガラス上の過剰なアルカリ分を０．４MＴｒｉｓバッファー（２ml/スライド）で中和した。０．４ＭＴｒｉｓバッファーは５分ごと２回新しいものと交換した。中和した後、エチジウムブロミド溶液５０μlをスライド上に滴下し、カバーガラスをかけた。直ちに観察しない場合は、中和した後１００％エタノールに１０分間浸して取り出し、冷暗所で保存した。画像解析装置（Comet Analyzer、YOU WORKS）を取り付けた蛍光顕微鏡（Olympus）を用いてＧ励起波長で観察した。プレパラート１枚につき、細胞５０個をカウントしTail momentを求めた。
【００３０】
（１０）統計学的解析
得られた実験群の個々の値は、平均±ＳＤで表し、統計学的検定はダネット検定でｐ<０．０５をもって有意とした。また、コメットアッセイは得られた実験群の個々の値は、平均±ＳＥＭで表し、統計学的検定はマンホイットニーＵ検定で行い、ｐ＜０．０５をもって有意とした。
【００３１】
実験結果
１．わさび葉抽出物による胃の重量および胃内のH. pylori生菌数への影響
胃の重量および胃内のH. pylori生菌数を表１に示した。胃の重量は１００g体重に換算して表記した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃の重量への影響は認められなかった。しかし、H. pylori感染により、非感染群と比較して、胃の重量は０．８３g増加し有意な差を認め、わさび葉抽出物により胃の重量が、低用量群で０．１８g、中用量群で０．１６g減少し有意な差を示したが、高用量群では０．０９g減少したが有意な差は認められなかった。一方、H. pylori生菌数は胃当たりのＣＦＵｓの対数で表記した。わさび葉抽出物はH. pylori感染によるＣＦＵｓへの影響を認められなかった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
２．わさび葉抽出物による胃内pH、胃粘膜傷害および胃粘膜出血への影響
胃内pH、胃粘膜傷害および出血スコアを表２に示した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃内pHへの影響は認められなかった。また、感染群と比較して、pHは０．５上昇したが有意な差は示さず、わさび葉抽出物各群において０．４程度の減少を示したが有意な差は認められなかった。また、非感染群において、ストレス負荷により３０、９０minで０．５程度上昇したが有意な差は示さず、２７０minで１．１上昇し有意な差を認めた。わさび葉抽出物により、９０minで０．６程度減少し有意な差を示した。しかし、２７０minでは０．５以上減少し抑制傾向は確認されたが有意な差は示さなかった。H. pylori感染群において、ストレス負荷により９０minで１．６、２７０minで３．４上昇し有意な差を認めた。また、わさび葉抽出物により、９０minにおいては、中用量群で変化は認めなかったが、高用量群で１．５減少し有意な差を示した。２７０minにおいては、中用量群で３．２減少し有意な差を示したが、高用量群では１．５減少したが有意な差は認められなかった。
【００３４】
【表２】
＊Table８を表２として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００３５】
胃粘膜面をインジゴカーミン染色した組織標本を図１に示した。インジゴカーミン液は、胃内視鏡検査において、がん組織など異常部分と、正常粘膜の境界を検索するために汎用されている。正常胃粘膜の凹部分に分布しこれを青色に可視化するため、正常粘膜の範囲を目視で観察するのに適している。非感染群ではストレス負荷０min（a）、２７０min（b）ともに、粘膜面は濃染し粘膜の剥離はみられなかった。しかし、H. pylori感染群では、ストレス負荷０min（c）では、粘膜は青染し、剥離は認められなかったが、ストレス負荷２７０min（d）では、粘膜表面全体に、染まりが淡く粘膜が剥離している様子が観察された。
【００３６】
胃組織に対するストレスの影響を検討するために、ヘマトキシリンエオジン染色像を図２に示した。H. pylori非感染群において、ストレス負荷０min（a）では、粘膜厚が揃い、粘膜表面は粘液で覆われていた（正常像）が、ストレス負荷２７０min（b）では、粘液が剥がれ、粘膜表面が、不揃いになり、浅いびらんを呈している。H. pylori感染群においては、ストレス負荷０minでも、胃腺構造が崩れた部分が散見され、顕著な白血球（リンパ球）浸潤が観察された（c）。この状態に２７０minストレス負荷を加えると、胃腺の崩壊はより顕著になり、粘膜筋板あるいは、粘膜下層に及ぶ組織融解がみられた（d）。
【００３７】
H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃粘膜傷害スコアは高用量群で０．６点上昇を認めるものの有意な差は示さなかった。しかし、感染群との比較では、２．８点上昇し有意な差を認め、中用量群で０．８点減少し有意な差を示したが、その他の群では有意な差は示さなかった。また、非感染群におけるストレス負荷の影響は、９０minで上昇傾向を示し、２７０minで１．６点上昇し有意な差を認めた。また、中用量群では影響は認めなかったが、高用量群では９０minでは２．２点上昇し有意な差を認め、２７０minにおいても１点上昇したが有意な差は認めなかった。感染群に対するストレス負荷は、時間依存的に上昇し２７０minで１点上昇し有意な差を示した。また、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、高用量群では影響を示さず、中用量群で１点減少したものの有意な差は示さなかった。２７０minでは、中用量群で２点、高用量群で０．６点減少し有意な差を示した。
【００３８】
H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による胃粘膜出血スコアへの有意な差は認めなかった。また、感染群との比較では、３点上昇し有意な差を示したが、わさび葉抽出物は出血に対して影響を認めなかった。また、非感染群におけるストレス負荷の影響は、９０minで上昇傾向を示し、２７０minで１．４点上昇し有意な差を示した。わさび葉抽出物は、９０minで０．６点以上減少したが有意な差は認めず、２７０minでは各群影響を認めなかった。感染群に対するストレス負荷は、出血に有意な差を示さなかった。わさび葉抽出物は、９０minにおいて、中用量群で０．８点減少したが有意な差は認めなかった。２７０minでは、中用量群で１．５点減少し有意な差を示したが、高用量群では有意な差を示さなかった。
【００３９】
３．わさび葉抽出物による胃組織中の８-oxodG量への影響
胃組織中の８-oxodG量を表３に示した。H. pylori非感染群において、わさび葉抽出物による８-oxodG量は高用量群で３０％上昇したが有意な差は認められなかった。また、感染群と比較して、８-oxodG量は１４５％程度上昇し有意な差を認め、わさび葉抽出物により８-oxodG量が中用量群で３４％程度、高用量群で２７％程度減少し有意な差を示したが、低用量群では１１％程度上昇したが有意な差は認められなかった。また、ストレス負荷による影響は、非感染群においては時間依存的に上昇し、９０min以降８-oxodG量の増加を認め、２７０minで８-oxodG量は１６７％程度上昇し有意な差を示し、わさび葉抽出物により、２７０minにおいて、中用量群で３２％程度、高用量群では４２％程度の８-oxodG量の減少を確認し有意な差を示した。また、感染群におけるストレスの影響は３０minで１７％程度上昇し、９０minで２０％程度上昇したが有意な差は示さず、２７０minで４２％程度上昇し有意な差を示した。また、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、中用量群で４６％程度、高用量群で３１％程度減少し有意な差を示し、２７０minにおいては、中用量群で４１％程度、高用量群で４８％程度減少し有意な差を示した。
【００４０】
【表３】
＊Table9を表３として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００４１】
４．わさび葉抽出物による血液中の酸化的DNA損傷への影響
コメットアッセイの結果を表４に示した。Ｆｐｇ（−）の結果については、非感染群において、わさび葉抽出物は各群３０％程度減少し有意な差を認めた。しかし、感染群と比較して４３％上昇したが有意な差は認めなかったが、非感染群と同様にわさび葉抽出物は中用量群で抑制効果を認め有意な差を示した。感染群との比較では、４３％上昇したが有意な差は認めず、低用量群で３４％上昇し有意な差を示した。非感染群におけるストレス負荷は、９０minまで影響を示さず、２７０minで４２％上昇し、有意な差を示した。また、２７０minにおいて、わさび葉抽出物により２０％以上減少し有意な差を認めた。感染群では、ストレス負荷による有意な差は認めなかった。しかし、わさび葉抽出物は、９０minにおいて、６％以上上昇し有意な差を示した。Ｆｐｇ（＋）の結果については、非感染群において、わさび葉抽出物は中用量群で３１％減少し有意な差を示した。感染群と比較して４６０％上昇し有意な差を認めたが、低用量群で１３％減少し抑制傾向を示し、中用量、高用量群で２７％程度減少し有意な差を認めた。非感染群における、ストレス負荷は時間依存的な上昇を示し、９０minで１６％上昇し、２７０minで１１３％上昇し有意な上昇を認めた。この上昇に対して、わさび葉抽出物は各群１０〜３８％減少し有意な差を認めた。感染群において、ストレス負荷は３０minで影響はなく、９０minで８％上昇、２７０minで２８％上昇し有意な差を認めた。これに対して、わさび葉抽出物は２１〜３３％減少を示し有意な差を示した。
【００４２】
【表４】
＊Table10を表４として挿入してください。説明を日本語にしてください。
【００４３】
本発明の抽出物は、安全かつ廉価であり、その抗ストレス効果を利用した薬剤や機能性食品の原料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】胃粘膜面をインジゴカーミン染色した組織標本である。
【図２】胃組織をヘマトキシリンエオジン染色した組織標本である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤。
【請求項２】
ワサビ葉の抽出物が、エタノール抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物である、請求項１記載の抗ストレス剤。
【請求項３】
ストレスがH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスである、請求項１又は２に記載の抗ストレス剤。
【請求項１】
ワサビ葉の抽出物を含む、抗ストレス剤。
【請求項２】
ワサビ葉の抽出物が、エタノール抽出物及びｎ−ブタノール抽出物の混合物である、請求項１記載の抗ストレス剤。
【請求項３】
ストレスがH. pylori感染又はストレス負荷が誘導する酸化ストレスである、請求項１又は２に記載の抗ストレス剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２３０９７５（Ｐ２００８−２３０９７５Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６８８５９（Ｐ２００７−６８８５９）
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１日 ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｗｅｂ／及びｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｐｃ／ｉｐｄｆｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｉ＝９５２を通じて発表 平成１９年３月５日 社団法人日本薬学会発行の「日本薬学会第１２７年会講演要旨集」に発表
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１６日（２００７．３．１６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１日 ｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｗｅｂ／及びｈｔｔｐ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｐｈａｒｍ．ｏｒ．ｊｐ／１２７／ｐｃ／ｉｐｄｆｖｉｅｗ．ａｓｐ？ｉ＝９５２を通じて発表 平成１９年３月５日 社団法人日本薬学会発行の「日本薬学会第１２７年会講演要旨集」に発表
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
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