抗プロテインＳモノクローナル抗体
【課題】優れたアフィニティタグであるプロテインＳに対して、操作が簡便で、精度、特異性、再現性に優れた検出手段及び精製手段を開発すること。
【解決手段】Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含有する測定試薬、当該モノクローナル抗体を使用するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法、プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【解決手段】Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含有する測定試薬、当該モノクローナル抗体を使用するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法、プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ）のプロテインＳに対して特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の結晶構造解析あるいはプロテオーム解析などでは、タンパク質を大量に発現・精製することが大変重要である。従来、このような目的には、目的のタンパク質にアフィニティタグ（親和性物質）を付加し、この目的タンパク質を含む試料をアフィニティタグに親和性を有する担体に接触させて担体に目的タンパク質を吸着させ、さらに夾雑物を洗浄、除去した担体から吸着物を脱離させることにより、目的タンパク質を濃縮、精製する方法が知られている。
【０００３】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは土壌に生息するグラム陰性の粘液細菌の一種で、直径０．５〜１μｍ、長さ５〜１０μｍの長桿形の細胞形態を有する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは通常の栄養状態においては好気的な二分裂の増殖を行い、抗生物質や加水分解酵素を分泌し、土壌中の高分子有機態や他の微生物を栄養源として利用しているが、それらの有機体が欠乏したり、細胞密度が高くなったりすると細胞が集まり、胞子を形成する子実体形成過程の分化に転じる独特な生活環を持っている。
【０００４】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの子実体で形成される胞子は、プロテインＳと呼ばれる主要コートタンパク質で覆われる。プロテインＳは、２つのカルシウム結合ドメインを有し、カルシウム依存的にＭ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子表面に集合する。タンパク質をプロテインＳとの融合タンパク質として発現させた場合には、その産生量と可溶性が向上することが知られている（特許文献１）。これらのプロテインＳの特性をアフィニティタグとして利用する方法、すなわち、目的のタンパク質を調製する際に、目的タンパク質をプロテインＳとの融合タンパク質として発現させ、カルシウム存在下でＭ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子上に融合タンパク質を結合させ、その後融合タンパク質を溶出させるタンパク質の精製方法が考案されている（特許文献１）。
しかしながら、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子は当該粘菌を培養して調製する以外の方法がなく、精製用担体としての供給に問題がある。また、胞子は生物体であり、品質、安定性を保つことが難しい。さらに、胞子は不溶性であるため、融合タンパク質の検出手段として使用することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０９６９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
優れたアフィニティタグであるプロテインＳに対して、操作が簡便で、精度、特異性、再現性に優れた検出手段及び精製手段の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意努力を重ね、従来入手されていなかった、プロテインＳを特異的に認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体の創成に成功し、当該モノクローナル抗体を使用することにより、従来の課題が解決されること、すなわち当該モノクローナル抗体がプロテインＳを利用した目的タンパク質の調製に際して、当該タンパク質の検出、定量、精製に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、
［１］Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［２］モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆである［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［３］モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆである［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［４］［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むプロテインＳ測定試薬、
［５］［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体又は［４］記載のプロテインＳ測定試薬を使用することを特徴とする被験試料中のプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法、
［６］以下の工程を包含するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法；
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化担体に固定化した［１］記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、操作が簡便で、かつ測定精度が高く、特異性並びに再現性にも優れた抗プロテインＳ抗体が安定して提供される。
本発明の試薬は、被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳを分子内に含有するタンパク質（例えばプロテインＳと他のタンパク質との融合タンパク質）を検出、定量することができ、さらにプロテインＳをタグとしたプロテインＳと他のタンパク質との融合タンパク質の精製に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ウェスタンブロッティング解析を示す図である。
【図２】図２は、プロテインＳ融合タンパク質の精製を示す図である。
【図３】図３は、プロテインＳ融合タンパク質の精製を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において「プロテインＳ」とは、約１９ｋＤａのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの粘菌胞子の主要コートタンパク質を意味する。プロテインＳをコードする遺伝子は２つあり、遺伝子１及び遺伝子２と呼ばれている。天然のプロテインＳは遺伝子２の翻訳産物であるが、本明細書においては、いずれの遺伝子の翻訳産物であってもよい。プロテインＳをコードする核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０１７４５、遺伝子１由来のプロテインＳのアミノ酸配列についてはＡＡＡ２５４０６、遺伝子２由来のプロテインＳのアミノ酸配列についてはＡＡＡ２５４０７に開示されている。
【００１２】
本発明において「プロテインＳを分子内に含有するタンパク質」とは、分子内にプロテインＳ又はその一部（フラグメント）のアミノ酸配列を含有するタンパク質を意味する。特に限定するものではないが、例えば、目的の任意のタンパク質とプロテインＳ又はそのフラグメントとの融合タンパク質（以下プロテインＳ融合タンパク質と記載する）が例示される。本発明に使用されるプロテインＳ融合タンパク質は、プロテインＳ又はそのフラグメントが目的のタンパク質のＮ末端、Ｃ末端のどちらかに結合している融合タンパク質、両方に結合している融合タンパク質の両方が含まれる。さらに、本発明に使用されるプロテインＳ融合タンパク質は、別のタグ配列を含有していてもよい。本明細書において、プロテインＳのフラグメントとは、プロテインＳのＮ末端側の配列を有するポリペプチド、Ｃ末端側の配列を有するポリペプチド、中央部分の配列を有するポリペプチドのいずれもが含まれる。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ２５４０７のアミノ酸番号１〜９２の配列に相当する、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが含まれる。プロテイン融合タンパク質は、プロテインＳ又はそのフラグメントを１個又は複数含有し得る。特に限定はされないが、Ｈｉｓタグ、２つのプロテインＳのＮ末端ポリペプチド及び目的のタンパク質を含むプロテインＳ融合タンパク質である配列表の配列番号１の塩基配列にコードされるタンパク質が例示される。
【００１３】
本発明において「モノクローナル抗体」とは、単一クローンの抗体生産細胞が分泌する抗体を意味し、単クローン（性）抗体ともいう。特定の抗原決定基を認識する抗体であり、アミノ酸配列の一次構造が均一である。本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法により調製されるハイブリドーマが産生する抗体に加えて、抗体産生細胞のｍＲＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製された抗体も含まれる。
【００１４】
（１）本発明の抗プロテインＳモノクローナル抗体
本発明は抗プロテインＳモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、簡便で、かつ測定精度が高く、特異性並びに再現性よくプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を検出することができる。例えば、ウェスタンブロッティング解析に使用することができる。
【００１５】
また、本発明の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントも本発明で使用する抗体に含まれる。
【００１６】
さらに、得られたモノクローナル抗体を基に、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体であっても良い。このような抗体は、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造され得る。前記ハイブリドーマは、抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞と融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、プロテインＳを認識する抗体を産生するクローンを取捨選択し、さらに本発明の目的に好適なクローンを選別することによって初めて樹立される。
抗体産生細胞には、プロテインＳ又はそのフラグメントや、これらを含むポリペプチドを抗原（免疫原）として免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。前記の抗原は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓから精製して、又はこれら抗原をコードする遺伝子を使用して遺伝子工学的に組換えタンパク質として調製することができる。また、化学的にプロテインＳやフラグメント等を合成して調製することができる。かくして得られた抗原を、そのまま単独で動物の免疫に使用することができる。また、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパク質と結合させた抗原、又はＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合した抗原を、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用してもよい。あるいは抗原を直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用することもできる。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を投与することにより行われる。例えば、抗原−アジュバント混合物を２〜３週間に１回の間隔で３〜７回投与することにより、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を分取することができる。また、抗原−アジュバント混合物を１回投与し、約２〜３週間後に免疫動物のリンパ節から抗体産生細胞を分取することができる。
【００１８】
骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてプロテインＳを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むプロテインＳ融合タンパク質と反応する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）やＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用することで達成される。
【００１９】
例えば、本発明の一態様として、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質と反応することを特徴とする抗プロテインＳモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆにより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆが挙げられる。ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆは、平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６として寄託されている。
また、本発明の一態様として、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質と反応することを特徴とする抗プロテインＳモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆにより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆが挙げられる。ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆは、平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７として寄託されている。
【００２０】
本発明は前記の抗体を産生する細胞、すなわち本発明のモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを産生するハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、本発明のモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを産生するハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを包含する。
【００２１】
（２）本発明のプロテインＳ測定試薬及び測定方法
本発明のプロテインＳ測定試薬は、被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を測定可能な試薬であって、前記（１）記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とする。本発明の測定試薬は、菌体培養物などの被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を、簡便、精度、特異性並びに再現性よく定量することができる。
【００２２】
本発明の一態様として、本発明はさらにハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ及びハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを含むプロテインＳ測定試薬である。
【００２３】
本発明の測定試薬は、０．１５６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を検出することが可能である。
【００２４】
本発明の測定試薬が測定対象とする被験試料には特に限定はなく、菌体培養物、細胞培養物、細菌、細胞、これらの抽出物及び培養上清等が例示される。前記菌体は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えば大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。前記細胞は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。
【００２５】
本発明の測定試薬の好適な態様は、測定方法として固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法を含むエンザイムイムノアッセイに用いることができる、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の測定試薬である。その一態様として、プロテインＳを認識する２種の抗体を使用する二抗体サンドイッチ法によりプロテインＳの検出を行う測定試薬が例示される。このような試薬の一例として、上記（１）に記載する抗プロテインＳモノクローナル抗体２種を構成成分とする測定試薬が挙げられる。これらの抗体のうち、一方は固相抗体（１次抗体）、他方は標識抗体（２次抗体）として使用することができる。ここで、固相抗体とは適切な不溶性担体に固定化された抗体を意味し、標識抗体とは適切な標識物質により標識化された抗体を意味する。固相抗体はプロテインＳとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被験物質であるプロテインＳをトラップするために使用され、トラップされた前記の被験物質を検出するために標識抗体が使用される。特に（１）に記載するモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを固相抗体、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを標識抗体とする測定試薬が好適に使用できる。
【００２６】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、タンパク質などを用いて標識化され、標識抗体が作製される。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、ビオチンのような化合物を用いることができる。本発明の測定試薬において、標識抗体は溶液又は凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。
【００２７】
固相抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体表面に、当業者には公知の方法によって、プロテインＳを認識する本発明の抗体を結合させることによって調製される。また、固相抗体を調製するための抗体、担体及び固相化に必要な試薬を、固定化する前の段階で提供しても良い。前記目的に使用される抗体も、本発明の固相抗体に含まれる。
【００２８】
本発明の測定試薬の態様としては、本発明の一態様の２種のモノクローナル抗体に加えて、様々な試薬、材料、器具等を適宜含有させることができる。本発明の測定試薬を構成するモノクローナル抗体を吸着させるための吸着プレートを含んでいてもよい。また、標識した抗体を検出するための試薬、使用する際にコントロールとなる試薬を含んでいてもよい。
【００２９】
（３）本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法
本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法は、固定化用担体に固定化した前記（１）に記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を使用し、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を捕捉することを特徴とする方法であり、以下の工程を包含する。
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化用担体に固定化した前記（１）に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程。
【００３０】
工程（ａ）において、固定化用担体への抗体の固定化手段としては、（Ｉ）疎水性相互作用や静電相互作用にもとづく吸着による固定化、（ＩＩ）予め捕捉部に導入した、抗体と反応性を有する官能基との化学結合による固定化、（ＩＩＩ）予め捕捉部に導入した、抗体と特異的に結合する物質との相互作用による固定化、などを利用することができる。
【００３１】
（ＩＩ）に記述の官能基としては、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドラジド基、カルボジイミド基、エポキシ基、チオール基、ヒドロキシル基、各種の無水環、マレイミドなどを好適に用いることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基がより好ましい。官能基の導入には、プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射、火炎処理、薬剤処理、表面グラフト重合、カップリング剤処理、官能基を有する物質のコーティングなどの手段を用いることができる。
【００３２】
（ＩＩＩ）に記述の、抗体と特異的に結合する物質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、固定化したい抗体に対する抗体（二次抗体）、アビジン及びその誘導体、ビオチン及びその誘導体、各種金属イオンなどを用いることができる。ただし、アビジン、ビオチン及びそれらの誘導体を用いる場合には、抗体にそれぞれビオチンあるいはアビジンを導入しておく必要がある。プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬによる抗体の固定化は、抗原との結合能を阻害しにくいため、特に好ましく用いることができる。
【００３３】
固定化用担体は、被験試料中に含まれるプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の捕捉効率を高めるため、被験試料と接触する面積を可能な限り大きくすることが好ましい。この観点から、固定化担体は、微小な粒子又は多孔体などであることが好ましい。前記粒子としてはガラス、各種プラスチック、ゲル状物質、金属、セラミック粉末などが利用可能であり、その好ましい粒径は、直径が０．００１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０１〜５００μｍ、さらに好ましくは０．０１〜１００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。多孔体としては多孔質ポリマー、多孔質ガラス、多孔質プラスチック、多孔質セラミック、金属の焼結体などが利用可能であり、その好ましい孔径は、０．００１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０１〜５００μｍ、さらに好ましくは０．０１〜１００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。
【００３４】
抗体が固定化された担体（以下固定化抗体と記載する）は、カラムなどに充填されていてもよい。この場合、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料との接触は、試料をカラムにアプライし、重力又は吸引により試料をカラムに通すことにより実施される。
【００３５】
また、固定化抗体とプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料との接触は、固定化抗体をプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料中に懸濁、分散させることにより実施することができる。この場合、固定化抗体を添加した試料を振とう又は撹拌し、その後遠心分離又は静置することにより固定化抗体を回収することができる。
【００３６】
プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料を、固定化抗体と接触させた後、固定化抗体を洗浄することができる。プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質が結合する固定化抗体を洗浄することにより、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製純度を向上させることができる。
【００３７】
工程（ｂ）において、固定化抗体からプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を溶出（離脱）させる手段としては、ｐＨ変化、塩濃度の変化、各種有機溶剤、界面活性剤による溶出などの一般的な方法が利用可能である。
【００３８】
本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法により、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上の純度のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質に精製することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１ Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのプロテインＳ（ＰｒＳ）とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＥ（ＭａｚＥ−Ｓａ）の融合タンパク質の発現、精製。
プロテインＳとＭａｚＥ−Ｓａの融合タンパク質の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５９巻、第６１０５〜６１０９頁（１９８４）及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）の記載を参考にして、２つのプロテインＳのＮ末端ポリペプチド及びそのＣ末端側に目的のタンパク質としてＭａｚＥ−Ｓａが接続された融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）及びその両端に制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ認識配列を有するＤＮＡを合成し、これを制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）ベクターの制限酵素サイトＮｃｏ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間に挿入した発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａを構築した。ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａは、そのＮ末端側からヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ、ＭａｚＥ−Ｓａが並んだ形のキメラタンパク質の発現ベクターである。
【００４１】
このプラスミドベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰを用いてプロテインＳとＭａｚＥ−Ｓａとの融合タンパク質を精製した。
【００４２】
実施例２ 抗体の作製
（１）抗原免疫・細胞融合
実施例１で調製した１ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質０．２ｍＬと、１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）０．１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの架橋剤ＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ社製）５０μＬを混合し、室温で４５分反応後、１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、架橋抗原を調製した。１ｍｇ／ｍＬの架橋抗原０．３ｍＬをフロイント完全アジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ社製）とエマルジョンを形成させてからＣ５７ＢＬ６マウス２匹に等分して投与した。その後、眼窩静脈血清中の抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終追加免疫を実施した。この最終免疫３日後に、２匹のマウスの脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄し脾臓細胞とした後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓細胞：ミエローマ）の割合で混合し、遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、そのあとは無血清培地１ｍＬを同様に一定速度で加え、合計４０ｍＬまで加え、この操作で細胞融合を実施した。
上記操作により多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。
【００４３】
（２）ＨＡＴ選択
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅ ｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞であった。
【００４４】
（３）スクリーニング
実施例１で調製したプロテインＳ融合タンパク質、ならびにＭａｚＥ−Ｓａを他のタンパク質に代えて同様に調製したプロテインＳ融合タンパク質をそれぞれ２μｇ／ｍＬ ＰＢＳの濃度で調製し、５０μＬ／ウェルで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加して、４℃で一晩放置して物理吸着させた。翌日、抗原溶液を捨てて、２５％ブロッカーカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を２００μＬ／ウェルになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で一晩放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上でイムノプレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間反応を行った。その後、標識抗体液を捨て、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルで、洗浄液を充分に除き、ＰＯＤ基質であるＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を５０μＬ／ウェルで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、等量の１Ｎ 硫酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで陽性株を確認し、２種類のプロテインＳ融合タンパク質のいずれにも特異的に反応する株の選抜を試みた。
【００４５】
（４）陽性株選抜とクローニング、株樹立
（３）に示す厳格なスクリーニングの結果、プロテインＳに特異的に反応する株は、試験した９５９ウェルに含まれる１０，０００以上のコロニー（株）中わずかに７株であった。この７株を用い、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗プロテインＳ抗体産生ハイブリドーマ７種類について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保することができた。
【００４６】
（５）マウス腹水採取
プロテインＳに反応性を示した前記のハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をｓｃｉｄ（Ｔ、Ｂ細胞欠損型）マウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。
【００４７】
（６）抗体精製
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに供した。平衡化緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂にアプライし、波長２８０ｎｍの吸光度がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。溶出画分は、ただちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることが初めて確認された。
【００４８】
実施例３ 抗体の選抜
（１）測定系構築のための抗体の選抜
実施例２（１）〜（６）の操作で得られた７種類の抗体に過ヨウ素酸法によってＰＯＤ標識を施した。過ヨウ素酸法は、ＰＯＤの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。すべての抗体について抗原との結合活性を保持した状態で酵素標識抗体とすることができた。これらの標識抗体を、同じ７種類の固相抗体と組みあわて、合計４９通りの組み合わせで、プロテインＳを定量できる系をスクリーニングした。本スクリーニングによって、高感度にプロテインＳを測りこむことのできる測定系をようやく１種類得ることに成功した。その組合せは、固相抗体としてモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、標識抗体としてモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを使用するものであった。モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを産生するハイブリドーマＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを産生するハイブリドーマＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８ＦはそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６、ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７として平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４９】
（２）プロテインＳ測定系
確立した測定系を使用した測定方法を以下に示す。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ溶液を１００μＬ／ウェルで投入し、４℃で一晩放置する。翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロッカーカゼイン／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ウェルで投入し、４℃一晩放置し、前記抗体が結合しなかった部分をタンパク質ブロックする。翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｂ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ウェルに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｃ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ酵素標識抗体液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ＴＭＢＺ溶液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｅ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するプロテインＳの濃度を読み取る。
【００５０】
プロテインＳの標準品として、実施例１と同様の方法で、Ｈｉｓタグ及び配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ連結したポリペプチドを調製した。上記測定系により、プロテインＳ標準品を測定した結果を表１に示す。上記測定系は、必要サンプル量が１００μＬ／ウェルであり、０．１５６ｎｇ／ｍＬのプロテインＳも検出可能で、極めて高感度な測定系であることを確認した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（３）同時再現性試験
実施例２（２）記載の測定系により、実施例３（２）で調製したプロテインＳ標準品を２５％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳで希釈して作成した３種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表２に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（４）日差再現性試験
実施例２（２）記載の測定系で、三日間にわたり３種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表３に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
（５）添加回収試験
実施例２（２）記載の測定系でプロテインＳの添加回収試験を行った。各種濃度の検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からプロテインＳ量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表４に結果を示すように、添加回収率１００．４％から１１９．１％（平均値１０８．３８％）と良好な結果が得られた。
【００５７】
【表４】
【００５８】
実施例４ ウェスタンブロッティング
実施例２（１）で調製したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを酵素標識してウェスタンブロッティングを行った。ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２（タカラバイオ社製）ベクターに、ヒトＯｃｔ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４）又はヒトＬｉｎ２８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４．４）を導入したｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２−Ｏｃｔ４及びｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２−Ｌｉｎ２８を構築し、プロテインＳとヒトＯｃｔ４又はヒトＬｉｎ２８の融合タンパク質サンプルを調製した。ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２ベクターは、目的タンパク質とプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ連結したポリペプチド（ＰｒｏＳ２）との融合タンパク質を発現するベクターである。対照として、プロテインＳをコードする配列を含まないｐＣｏｌｄ（登録商標）Ｉベクター、目的タンパク質をコードする配列を含まないｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２ベクターの発現タンパク質サンプルを調製した。これらのタンパク質サンプル２μＬをＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰＡＧＥ、１０％Ｂｉｓ、インビトロジェン社製）にアプライし、電気泳動後ＰＶＤＦ膜（ＩＰＶＨ０００ １０、ミリポア社製）にトランスファーした。このＰＶＤＦ膜を、５０％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳ中で振とう後、１μｇ／ｍＬのＰＯＤ標識したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ、２５％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳ中で振とうして反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＰＯＤ基質であるＴＭＢ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ社製）を使用して発色させた。Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルのＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色と、ＰＶＤＦ膜のＰＯＤ標識抗体の発色結果を図１に示す。図１に示すとおり、本発明の抗体を使用して良好にウェスタンブロッティング解析を実施することができた。
【００５９】
実施例５ 抗体固定化樹脂によるプロテインＳ融合タンパク質の精製
（１）抗体固定化樹脂の調製
樹脂１ｇ（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＧＥヘルスバイオサイエンス製）を用意し、グラスフィルター（３Ｇ）上で１ｍＭ 塩酸溶液により洗浄と膨潤を繰り返した。カップリングバッファー［０．２５Ｍ ＮａＣｌ含む０．２Ｍ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）］で洗浄した樹脂と、前日よりカップリングバッファーで透析した１０ｍｇのモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを混合し、室温で２時間振とうした。グラスフィルターにより反応液を除去し、樹脂を０．２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８．０）と混合して樹脂の残りの活性基をブロックした。その後、カップリングバッファー、溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）及び０．２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．３）で洗浄し、樹脂をＰＢＳに懸濁して０．１％となるようにアジ化ナトリウムを添加した。
【００６０】
（２）抗体固定化樹脂のプロテインＳ融合タンパク質捕捉能力
実施例５（１）で調製した抗体固定化樹脂（５０％スラリー）１ｍＬを１０００×ｇで１分間遠心し、上清を捨てて４８０μＬのＰＢＳを添加した。そこに、実施例１で調製した５５６ｎｇ／μＬのプロテインＳ融合タンパク質２０μＬを添加し、４℃で６０分間静置した。その後、４℃、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を素通りサンプルとして除去した。樹脂に溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）２５０μＬ加え、５回のピペッティング操作により静かに混合して５分間静置した後、４℃、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を溶出サンプルとして回収した。上記プロテインＳ融合タンパク質、素通りサンプル、溶出サンプルを各５μＬ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりプロテインＳ融合タンパク質の挙動を解析した。その結果を図２に示す。添加したプロテインＳ融合タンパク質を１００％とした場合、素通りサンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は約１１％、溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は７３％であった。本発明の抗体を固定化した樹脂は、７０％以上の回収率でプロテインＳ融合タンパク質を捕捉することが可能であることが示された。
【００６１】
（３）抗体固定化樹脂によるプロテインＳ融合タンパク質の精製
実施例１のプロテインＳ融合タンパク質発現大腸菌を２５ｍＬの培地で培養し、遠心分離により菌体沈殿物を得た。菌体をＰＢＳ ２．５ｍＬに懸濁し１０分間超音波破砕した。破砕物を４℃、１００００×ｇで２０分間遠心し、上清を得た。実施例５（１）で調製した抗体固定化樹脂２ｍＬにＰＢＳ ８ｍＬを添加し、これを１５ｍＬ容のチューブに移して２ｍＬの上記菌体破砕物上清を添加した。抗体固定化樹脂と菌体破砕物上清を４℃で６０分間混合した後、樹脂を１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、樹脂に１ｍＬの溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）を加え、５回のピペッティング操作により静かに混合して２０分間室温で静置した後、溶出サンプルとして回収した。上記菌体破砕物上清と溶出サンプルを各５μＬ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。その結果を図３に示す。図３の矢印はプロテインＳ融合タンパク質のバンドを示す。菌体破砕物上清中と溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質量はほぼ同量で、溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は不純物が除去され、純度が７８％と極めて純度の高いタンパク質を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上の結果は、本発明のプロテインＳ抗体及び測定試薬を使用する検出系は、プロテインＳを特異的に高感度で測定し、性能的にも安定な系であることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
SEQ ID NO:1 ; Nucleotide sequence encoding a fusion protein consisting of His-tag, proteinS and MazE-Sa.
SEQ ID NO:2 ; N terminal sequense of M. xanthus protein S
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ）のプロテインＳに対して特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の結晶構造解析あるいはプロテオーム解析などでは、タンパク質を大量に発現・精製することが大変重要である。従来、このような目的には、目的のタンパク質にアフィニティタグ（親和性物質）を付加し、この目的タンパク質を含む試料をアフィニティタグに親和性を有する担体に接触させて担体に目的タンパク質を吸着させ、さらに夾雑物を洗浄、除去した担体から吸着物を脱離させることにより、目的タンパク質を濃縮、精製する方法が知られている。
【０００３】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは土壌に生息するグラム陰性の粘液細菌の一種で、直径０．５〜１μｍ、長さ５〜１０μｍの長桿形の細胞形態を有する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは通常の栄養状態においては好気的な二分裂の増殖を行い、抗生物質や加水分解酵素を分泌し、土壌中の高分子有機態や他の微生物を栄養源として利用しているが、それらの有機体が欠乏したり、細胞密度が高くなったりすると細胞が集まり、胞子を形成する子実体形成過程の分化に転じる独特な生活環を持っている。
【０００４】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの子実体で形成される胞子は、プロテインＳと呼ばれる主要コートタンパク質で覆われる。プロテインＳは、２つのカルシウム結合ドメインを有し、カルシウム依存的にＭ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子表面に集合する。タンパク質をプロテインＳとの融合タンパク質として発現させた場合には、その産生量と可溶性が向上することが知られている（特許文献１）。これらのプロテインＳの特性をアフィニティタグとして利用する方法、すなわち、目的のタンパク質を調製する際に、目的タンパク質をプロテインＳとの融合タンパク質として発現させ、カルシウム存在下でＭ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子上に融合タンパク質を結合させ、その後融合タンパク質を溶出させるタンパク質の精製方法が考案されている（特許文献１）。
しかしながら、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ胞子は当該粘菌を培養して調製する以外の方法がなく、精製用担体としての供給に問題がある。また、胞子は生物体であり、品質、安定性を保つことが難しい。さらに、胞子は不溶性であるため、融合タンパク質の検出手段として使用することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／１０９６９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
優れたアフィニティタグであるプロテインＳに対して、操作が簡便で、精度、特異性、再現性に優れた検出手段及び精製手段の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは鋭意努力を重ね、従来入手されていなかった、プロテインＳを特異的に認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体の創成に成功し、当該モノクローナル抗体を使用することにより、従来の課題が解決されること、すなわち当該モノクローナル抗体がプロテインＳを利用した目的タンパク質の調製に際して、当該タンパク質の検出、定量、精製に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、
［１］Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［２］モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆである［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［３］モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆである［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体、
［４］［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むプロテインＳ測定試薬、
［５］［１］記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体又は［４］記載のプロテインＳ測定試薬を使用することを特徴とする被験試料中のプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法、
［６］以下の工程を包含するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法；
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化担体に固定化した［１］記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、操作が簡便で、かつ測定精度が高く、特異性並びに再現性にも優れた抗プロテインＳ抗体が安定して提供される。
本発明の試薬は、被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳを分子内に含有するタンパク質（例えばプロテインＳと他のタンパク質との融合タンパク質）を検出、定量することができ、さらにプロテインＳをタグとしたプロテインＳと他のタンパク質との融合タンパク質の精製に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ウェスタンブロッティング解析を示す図である。
【図２】図２は、プロテインＳ融合タンパク質の精製を示す図である。
【図３】図３は、プロテインＳ融合タンパク質の精製を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において「プロテインＳ」とは、約１９ｋＤａのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの粘菌胞子の主要コートタンパク質を意味する。プロテインＳをコードする遺伝子は２つあり、遺伝子１及び遺伝子２と呼ばれている。天然のプロテインＳは遺伝子２の翻訳産物であるが、本明細書においては、いずれの遺伝子の翻訳産物であってもよい。プロテインＳをコードする核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０１７４５、遺伝子１由来のプロテインＳのアミノ酸配列についてはＡＡＡ２５４０６、遺伝子２由来のプロテインＳのアミノ酸配列についてはＡＡＡ２５４０７に開示されている。
【００１２】
本発明において「プロテインＳを分子内に含有するタンパク質」とは、分子内にプロテインＳ又はその一部（フラグメント）のアミノ酸配列を含有するタンパク質を意味する。特に限定するものではないが、例えば、目的の任意のタンパク質とプロテインＳ又はそのフラグメントとの融合タンパク質（以下プロテインＳ融合タンパク質と記載する）が例示される。本発明に使用されるプロテインＳ融合タンパク質は、プロテインＳ又はそのフラグメントが目的のタンパク質のＮ末端、Ｃ末端のどちらかに結合している融合タンパク質、両方に結合している融合タンパク質の両方が含まれる。さらに、本発明に使用されるプロテインＳ融合タンパク質は、別のタグ配列を含有していてもよい。本明細書において、プロテインＳのフラグメントとは、プロテインＳのＮ末端側の配列を有するポリペプチド、Ｃ末端側の配列を有するポリペプチド、中央部分の配列を有するポリペプチドのいずれもが含まれる。例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ２５４０７のアミノ酸番号１〜９２の配列に相当する、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが含まれる。プロテイン融合タンパク質は、プロテインＳ又はそのフラグメントを１個又は複数含有し得る。特に限定はされないが、Ｈｉｓタグ、２つのプロテインＳのＮ末端ポリペプチド及び目的のタンパク質を含むプロテインＳ融合タンパク質である配列表の配列番号１の塩基配列にコードされるタンパク質が例示される。
【００１３】
本発明において「モノクローナル抗体」とは、単一クローンの抗体生産細胞が分泌する抗体を意味し、単クローン（性）抗体ともいう。特定の抗原決定基を認識する抗体であり、アミノ酸配列の一次構造が均一である。本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法により調製されるハイブリドーマが産生する抗体に加えて、抗体産生細胞のｍＲＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製された抗体も含まれる。
【００１４】
（１）本発明の抗プロテインＳモノクローナル抗体
本発明は抗プロテインＳモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、簡便で、かつ測定精度が高く、特異性並びに再現性よくプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を検出することができる。例えば、ウェスタンブロッティング解析に使用することができる。
【００１５】
また、本発明の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントも本発明で使用する抗体に含まれる。
【００１６】
さらに、得られたモノクローナル抗体を基に、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体であっても良い。このような抗体は、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造され得る。前記ハイブリドーマは、抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞と融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、プロテインＳを認識する抗体を産生するクローンを取捨選択し、さらに本発明の目的に好適なクローンを選別することによって初めて樹立される。
抗体産生細胞には、プロテインＳ又はそのフラグメントや、これらを含むポリペプチドを抗原（免疫原）として免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。前記の抗原は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓから精製して、又はこれら抗原をコードする遺伝子を使用して遺伝子工学的に組換えタンパク質として調製することができる。また、化学的にプロテインＳやフラグメント等を合成して調製することができる。かくして得られた抗原を、そのまま単独で動物の免疫に使用することができる。また、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパク質と結合させた抗原、又はＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合した抗原を、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用してもよい。あるいは抗原を直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用することもできる。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を投与することにより行われる。例えば、抗原−アジュバント混合物を２〜３週間に１回の間隔で３〜７回投与することにより、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を分取することができる。また、抗原−アジュバント混合物を１回投与し、約２〜３週間後に免疫動物のリンパ節から抗体産生細胞を分取することができる。
【００１８】
骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてプロテインＳを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むプロテインＳ融合タンパク質と反応する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）やＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用することで達成される。
【００１９】
例えば、本発明の一態様として、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質と反応することを特徴とする抗プロテインＳモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆにより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆが挙げられる。ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆは、平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６として寄託されている。
また、本発明の一態様として、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質と反応することを特徴とする抗プロテインＳモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆにより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆが挙げられる。ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆは、平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７として寄託されている。
【００２０】
本発明は前記の抗体を産生する細胞、すなわち本発明のモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを産生するハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、本発明のモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを産生するハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを包含する。
【００２１】
（２）本発明のプロテインＳ測定試薬及び測定方法
本発明のプロテインＳ測定試薬は、被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を測定可能な試薬であって、前記（１）記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とする。本発明の測定試薬は、菌体培養物などの被験試料中のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を、簡便、精度、特異性並びに再現性よく定量することができる。
【００２２】
本発明の一態様として、本発明はさらにハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ及びハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆより産生されるモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを含むプロテインＳ測定試薬である。
【００２３】
本発明の測定試薬は、０．１５６ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を検出することが可能である。
【００２４】
本発明の測定試薬が測定対象とする被験試料には特に限定はなく、菌体培養物、細胞培養物、細菌、細胞、これらの抽出物及び培養上清等が例示される。前記菌体は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えば大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。前記細胞は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。
【００２５】
本発明の測定試薬の好適な態様は、測定方法として固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法を含むエンザイムイムノアッセイに用いることができる、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の測定試薬である。その一態様として、プロテインＳを認識する２種の抗体を使用する二抗体サンドイッチ法によりプロテインＳの検出を行う測定試薬が例示される。このような試薬の一例として、上記（１）に記載する抗プロテインＳモノクローナル抗体２種を構成成分とする測定試薬が挙げられる。これらの抗体のうち、一方は固相抗体（１次抗体）、他方は標識抗体（２次抗体）として使用することができる。ここで、固相抗体とは適切な不溶性担体に固定化された抗体を意味し、標識抗体とは適切な標識物質により標識化された抗体を意味する。固相抗体はプロテインＳとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被験物質であるプロテインＳをトラップするために使用され、トラップされた前記の被験物質を検出するために標識抗体が使用される。特に（１）に記載するモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを固相抗体、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを標識抗体とする測定試薬が好適に使用できる。
【００２６】
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、タンパク質などを用いて標識化され、標識抗体が作製される。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、ビオチンのような化合物を用いることができる。本発明の測定試薬において、標識抗体は溶液又は凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。
【００２７】
固相抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体表面に、当業者には公知の方法によって、プロテインＳを認識する本発明の抗体を結合させることによって調製される。また、固相抗体を調製するための抗体、担体及び固相化に必要な試薬を、固定化する前の段階で提供しても良い。前記目的に使用される抗体も、本発明の固相抗体に含まれる。
【００２８】
本発明の測定試薬の態様としては、本発明の一態様の２種のモノクローナル抗体に加えて、様々な試薬、材料、器具等を適宜含有させることができる。本発明の測定試薬を構成するモノクローナル抗体を吸着させるための吸着プレートを含んでいてもよい。また、標識した抗体を検出するための試薬、使用する際にコントロールとなる試薬を含んでいてもよい。
【００２９】
（３）本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法
本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法は、固定化用担体に固定化した前記（１）に記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を使用し、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を捕捉することを特徴とする方法であり、以下の工程を包含する。
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化用担体に固定化した前記（１）に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程。
【００３０】
工程（ａ）において、固定化用担体への抗体の固定化手段としては、（Ｉ）疎水性相互作用や静電相互作用にもとづく吸着による固定化、（ＩＩ）予め捕捉部に導入した、抗体と反応性を有する官能基との化学結合による固定化、（ＩＩＩ）予め捕捉部に導入した、抗体と特異的に結合する物質との相互作用による固定化、などを利用することができる。
【００３１】
（ＩＩ）に記述の官能基としては、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドラジド基、カルボジイミド基、エポキシ基、チオール基、ヒドロキシル基、各種の無水環、マレイミドなどを好適に用いることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基がより好ましい。官能基の導入には、プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射、火炎処理、薬剤処理、表面グラフト重合、カップリング剤処理、官能基を有する物質のコーティングなどの手段を用いることができる。
【００３２】
（ＩＩＩ）に記述の、抗体と特異的に結合する物質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、固定化したい抗体に対する抗体（二次抗体）、アビジン及びその誘導体、ビオチン及びその誘導体、各種金属イオンなどを用いることができる。ただし、アビジン、ビオチン及びそれらの誘導体を用いる場合には、抗体にそれぞれビオチンあるいはアビジンを導入しておく必要がある。プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬによる抗体の固定化は、抗原との結合能を阻害しにくいため、特に好ましく用いることができる。
【００３３】
固定化用担体は、被験試料中に含まれるプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の捕捉効率を高めるため、被験試料と接触する面積を可能な限り大きくすることが好ましい。この観点から、固定化担体は、微小な粒子又は多孔体などであることが好ましい。前記粒子としてはガラス、各種プラスチック、ゲル状物質、金属、セラミック粉末などが利用可能であり、その好ましい粒径は、直径が０．００１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０１〜５００μｍ、さらに好ましくは０．０１〜１００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。多孔体としては多孔質ポリマー、多孔質ガラス、多孔質プラスチック、多孔質セラミック、金属の焼結体などが利用可能であり、その好ましい孔径は、０．００１〜１０００μｍ、より好ましくは０．０１〜５００μｍ、さらに好ましくは０．０１〜１００μｍであり、特に好ましくは０．１〜１００μｍである。
【００３４】
抗体が固定化された担体（以下固定化抗体と記載する）は、カラムなどに充填されていてもよい。この場合、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料との接触は、試料をカラムにアプライし、重力又は吸引により試料をカラムに通すことにより実施される。
【００３５】
また、固定化抗体とプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料との接触は、固定化抗体をプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料中に懸濁、分散させることにより実施することができる。この場合、固定化抗体を添加した試料を振とう又は撹拌し、その後遠心分離又は静置することにより固定化抗体を回収することができる。
【００３６】
プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を含有する試料を、固定化抗体と接触させた後、固定化抗体を洗浄することができる。プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質が結合する固定化抗体を洗浄することにより、プロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製純度を向上させることができる。
【００３７】
工程（ｂ）において、固定化抗体からプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質を溶出（離脱）させる手段としては、ｐＨ変化、塩濃度の変化、各種有機溶剤、界面活性剤による溶出などの一般的な方法が利用可能である。
【００３８】
本発明のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質の精製方法により、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上の純度のプロテインＳ又はプロテインＳ融合タンパク質に精製することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１ Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのプロテインＳ（ＰｒＳ）とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＥ（ＭａｚＥ−Ｓａ）の融合タンパク質の発現、精製。
プロテインＳとＭａｚＥ−Ｓａの融合タンパク質の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５９巻、第６１０５〜６１０９頁（１９８４）及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）の記載を参考にして、２つのプロテインＳのＮ末端ポリペプチド及びそのＣ末端側に目的のタンパク質としてＭａｚＥ−Ｓａが接続された融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）及びその両端に制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉ認識配列を有するＤＮＡを合成し、これを制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）ベクターの制限酵素サイトＮｃｏ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間に挿入した発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａを構築した。ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａは、そのＮ末端側からヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ、ＭａｚＥ−Ｓａが並んだ形のキメラタンパク質の発現ベクターである。
【００４１】
このプラスミドベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰを用いてプロテインＳとＭａｚＥ−Ｓａとの融合タンパク質を精製した。
【００４２】
実施例２ 抗体の作製
（１）抗原免疫・細胞融合
実施例１で調製した１ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質０．２ｍＬと、１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）０．１ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの架橋剤ＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ社製）５０μＬを混合し、室温で４５分反応後、１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、架橋抗原を調製した。１ｍｇ／ｍＬの架橋抗原０．３ｍＬをフロイント完全アジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ社製）とエマルジョンを形成させてからＣ５７ＢＬ６マウス２匹に等分して投与した。その後、眼窩静脈血清中の抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終追加免疫を実施した。この最終免疫３日後に、２匹のマウスの脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄し脾臓細胞とした後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓細胞：ミエローマ）の割合で混合し、遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、そのあとは無血清培地１ｍＬを同様に一定速度で加え、合計４０ｍＬまで加え、この操作で細胞融合を実施した。
上記操作により多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。
【００４３】
（２）ＨＡＴ選択
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅ ｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞であった。
【００４４】
（３）スクリーニング
実施例１で調製したプロテインＳ融合タンパク質、ならびにＭａｚＥ−Ｓａを他のタンパク質に代えて同様に調製したプロテインＳ融合タンパク質をそれぞれ２μｇ／ｍＬ ＰＢＳの濃度で調製し、５０μＬ／ウェルで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加して、４℃で一晩放置して物理吸着させた。翌日、抗原溶液を捨てて、２５％ブロッカーカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を２００μＬ／ウェルになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で一晩放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上でイムノプレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間反応を行った。その後、標識抗体液を捨て、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルで、洗浄液を充分に除き、ＰＯＤ基質であるＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を５０μＬ／ウェルで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、等量の１Ｎ 硫酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで陽性株を確認し、２種類のプロテインＳ融合タンパク質のいずれにも特異的に反応する株の選抜を試みた。
【００４５】
（４）陽性株選抜とクローニング、株樹立
（３）に示す厳格なスクリーニングの結果、プロテインＳに特異的に反応する株は、試験した９５９ウェルに含まれる１０，０００以上のコロニー（株）中わずかに７株であった。この７株を用い、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗プロテインＳ抗体産生ハイブリドーマ７種類について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保することができた。
【００４６】
（５）マウス腹水採取
プロテインＳに反応性を示した前記のハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をｓｃｉｄ（Ｔ、Ｂ細胞欠損型）マウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。
【００４７】
（６）抗体精製
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムに供した。平衡化緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂にアプライし、波長２８０ｎｍの吸光度がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。溶出画分は、ただちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることが初めて確認された。
【００４８】
実施例３ 抗体の選抜
（１）測定系構築のための抗体の選抜
実施例２（１）〜（６）の操作で得られた７種類の抗体に過ヨウ素酸法によってＰＯＤ標識を施した。過ヨウ素酸法は、ＰＯＤの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。すべての抗体について抗原との結合活性を保持した状態で酵素標識抗体とすることができた。これらの標識抗体を、同じ７種類の固相抗体と組みあわて、合計４９通りの組み合わせで、プロテインＳを定量できる系をスクリーニングした。本スクリーニングによって、高感度にプロテインＳを測りこむことのできる測定系をようやく１種類得ることに成功した。その組合せは、固相抗体としてモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、標識抗体としてモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを使用するものであった。モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆを産生するハイブリドーマＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを産生するハイブリドーマＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８ＦはそれぞれＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６、ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７として平成２１年６月９日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００４９】
（２）プロテインＳ測定系
確立した測定系を使用した測定方法を以下に示す。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ溶液を１００μＬ／ウェルで投入し、４℃で一晩放置する。翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロッカーカゼイン／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ウェルで投入し、４℃一晩放置し、前記抗体が結合しなかった部分をタンパク質ブロックする。翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｂ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ウェルに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｃ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ酵素標識抗体液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ＴＭＢＺ溶液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｅ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するプロテインＳの濃度を読み取る。
【００５０】
プロテインＳの標準品として、実施例１と同様の方法で、Ｈｉｓタグ及び配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ連結したポリペプチドを調製した。上記測定系により、プロテインＳ標準品を測定した結果を表１に示す。上記測定系は、必要サンプル量が１００μＬ／ウェルであり、０．１５６ｎｇ／ｍＬのプロテインＳも検出可能で、極めて高感度な測定系であることを確認した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
（３）同時再現性試験
実施例２（２）記載の測定系により、実施例３（２）で調製したプロテインＳ標準品を２５％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳで希釈して作成した３種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表２に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（４）日差再現性試験
実施例２（２）記載の測定系で、三日間にわたり３種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表３に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
【００５５】
【表３】
【００５６】
（５）添加回収試験
実施例２（２）記載の測定系でプロテインＳの添加回収試験を行った。各種濃度の検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からプロテインＳ量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表４に結果を示すように、添加回収率１００．４％から１１９．１％（平均値１０８．３８％）と良好な結果が得られた。
【００５７】
【表４】
【００５８】
実施例４ ウェスタンブロッティング
実施例２（１）で調製したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを酵素標識してウェスタンブロッティングを行った。ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２（タカラバイオ社製）ベクターに、ヒトＯｃｔ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０１．４）又はヒトＬｉｎ２８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４．４）を導入したｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２−Ｏｃｔ４及びｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２−Ｌｉｎ２８を構築し、プロテインＳとヒトＯｃｔ４又はヒトＬｉｎ２８の融合タンパク質サンプルを調製した。ｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２ベクターは、目的タンパク質とプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ連結したポリペプチド（ＰｒｏＳ２）との融合タンパク質を発現するベクターである。対照として、プロテインＳをコードする配列を含まないｐＣｏｌｄ（登録商標）Ｉベクター、目的タンパク質をコードする配列を含まないｐＣｏｌｄ（登録商標）ＰｒｏＳ２ベクターの発現タンパク質サンプルを調製した。これらのタンパク質サンプル２μＬをＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰＡＧＥ、１０％Ｂｉｓ、インビトロジェン社製）にアプライし、電気泳動後ＰＶＤＦ膜（ＩＰＶＨ０００ １０、ミリポア社製）にトランスファーした。このＰＶＤＦ膜を、５０％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳ中で振とう後、１μｇ／ｍＬのＰＯＤ標識したモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ、２５％ブロッカーカゼインを含むＰＢＳ中で振とうして反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＰＯＤ基質であるＴＭＢ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ社製）を使用して発色させた。Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルのＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）染色と、ＰＶＤＦ膜のＰＯＤ標識抗体の発色結果を図１に示す。図１に示すとおり、本発明の抗体を使用して良好にウェスタンブロッティング解析を実施することができた。
【００５９】
実施例５ 抗体固定化樹脂によるプロテインＳ融合タンパク質の精製
（１）抗体固定化樹脂の調製
樹脂１ｇ（ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ＧＥヘルスバイオサイエンス製）を用意し、グラスフィルター（３Ｇ）上で１ｍＭ 塩酸溶液により洗浄と膨潤を繰り返した。カップリングバッファー［０．２５Ｍ ＮａＣｌ含む０．２Ｍ ホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）］で洗浄した樹脂と、前日よりカップリングバッファーで透析した１０ｍｇのモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆを混合し、室温で２時間振とうした。グラスフィルターにより反応液を除去し、樹脂を０．２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８．０）と混合して樹脂の残りの活性基をブロックした。その後、カップリングバッファー、溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）及び０．２Ｍグリシンバッファー（ｐＨ２．３）で洗浄し、樹脂をＰＢＳに懸濁して０．１％となるようにアジ化ナトリウムを添加した。
【００６０】
（２）抗体固定化樹脂のプロテインＳ融合タンパク質捕捉能力
実施例５（１）で調製した抗体固定化樹脂（５０％スラリー）１ｍＬを１０００×ｇで１分間遠心し、上清を捨てて４８０μＬのＰＢＳを添加した。そこに、実施例１で調製した５５６ｎｇ／μＬのプロテインＳ融合タンパク質２０μＬを添加し、４℃で６０分間静置した。その後、４℃、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を素通りサンプルとして除去した。樹脂に溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）２５０μＬ加え、５回のピペッティング操作により静かに混合して５分間静置した後、４℃、１０００×ｇで１分間遠心し、上清を溶出サンプルとして回収した。上記プロテインＳ融合タンパク質、素通りサンプル、溶出サンプルを各５μＬ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりプロテインＳ融合タンパク質の挙動を解析した。その結果を図２に示す。添加したプロテインＳ融合タンパク質を１００％とした場合、素通りサンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は約１１％、溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は７３％であった。本発明の抗体を固定化した樹脂は、７０％以上の回収率でプロテインＳ融合タンパク質を捕捉することが可能であることが示された。
【００６１】
（３）抗体固定化樹脂によるプロテインＳ融合タンパク質の精製
実施例１のプロテインＳ融合タンパク質発現大腸菌を２５ｍＬの培地で培養し、遠心分離により菌体沈殿物を得た。菌体をＰＢＳ ２．５ｍＬに懸濁し１０分間超音波破砕した。破砕物を４℃、１００００×ｇで２０分間遠心し、上清を得た。実施例５（１）で調製した抗体固定化樹脂２ｍＬにＰＢＳ ８ｍＬを添加し、これを１５ｍＬ容のチューブに移して２ｍＬの上記菌体破砕物上清を添加した。抗体固定化樹脂と菌体破砕物上清を４℃で６０分間混合した後、樹脂を１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。最後に、樹脂に１ｍＬの溶出試薬（８Ｍ尿素／ＰＢＳ）を加え、５回のピペッティング操作により静かに混合して２０分間室温で静置した後、溶出サンプルとして回収した。上記菌体破砕物上清と溶出サンプルを各５μＬ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。その結果を図３に示す。図３の矢印はプロテインＳ融合タンパク質のバンドを示す。菌体破砕物上清中と溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質量はほぼ同量で、溶出サンプル中のプロテインＳ融合タンパク質は不純物が除去され、純度が７８％と極めて純度の高いタンパク質を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上の結果は、本発明のプロテインＳ抗体及び測定試薬を使用する検出系は、プロテインＳを特異的に高感度で測定し、性能的にも安定な系であることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
SEQ ID NO:1 ; Nucleotide sequence encoding a fusion protein consisting of His-tag, proteinS and MazE-Sa.
SEQ ID NO:2 ; N terminal sequense of M. xanthus protein S
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆである請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆである請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むプロテインＳ測定試薬。
【請求項５】
請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体又は請求項４記載のプロテインＳ測定試薬を使用することを特徴とする被験試料中のプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法。
【請求項６】
以下の工程を包含するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法；
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化担体に固定化した請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程。
【請求項１】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ由来プロテインＳを認識する抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１６）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ Ｓ６Ｓ−６Ｆである請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆ（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８１７）より産生され得るモノクローナル抗体ＰｒｏＳ−Ｃ５７Ｚ ７Ｂ−８Ｆである請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体を含むプロテインＳ測定試薬。
【請求項５】
請求項１記載の抗プロテインＳモノクローナル抗体又は請求項４記載のプロテインＳ測定試薬を使用することを特徴とする被験試料中のプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の測定方法。
【請求項６】
以下の工程を包含するプロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質の精製方法；
（ａ）プロテインＳ、そのフラグメント又は分子内にプロテインＳもしくはそのフラグメントを含有するタンパク質を含有する試料を、固定化担体に固定化した請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程；
（ｂ）前記（ａ）の固定化担体から捕捉されたタンパク質を溶出させる工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−３７７７５（Ｐ２０１１−３７７７５Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８７２７６（Ｐ２００９−１８７２７６）
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１２日（２００９．８．１２）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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