抗体誘導性の断片の成長
本発明は、薬物候補の合成中に小分子断片の成長を導くことに寄与するように抗体−タンパク質標的相互作用から得られる接触残基情報を使用することを含む、創薬のための改良された方法に関する。特に、本発明は、リード最適化中に小分子断片の成長を誘導し、それにしたがって標的タンパク質の生物活性を変化させ得る小分子化合物を生成するための、抗体−タンパク質標的相互作用から得られる原子構造情報の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物候補の合成中に小分子断片の成長を導くことに寄与するように抗体−タンパク質標的相互作用から得られる接触残基情報を使用することを含む、創薬のための改良された方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、リード最適化中に小分子断片の成長を誘導し、それにより標的タンパク質の生物活性を変化させ得る小分子化合物を生成するための、抗体−タンパク質相互作用から得られる原子構造情報の使用に関する。本発明は、同定された化合物の治療上の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
小分子断片又は化合物断片のスクリーニングは、製薬業界において化学的なヒットを生成する手段として急速に承認を得た。断片に基づいた創薬は、効力単独ではなく結合効率に焦点が合わせられ、断片自体は新規薬物を開発するための最初の構成要素として使用され得る。同様に、それらの断片のサイズが小さいので、標的タンパク質に結合する化合物を同定するために、大きい化合物のライブラリーと比較して化合物の小ライブラリーをスクリーニングする必要がある。一般には、いったん標的タンパク質に結合する断片が同定されると、結晶学的な試験から、断片がそのタンパク質のどこに結合するかについての構造情報が得られる。この情報を使用することにより、隣接部位に結合している断片を鋳型にさらに結合させることができる、又は高分子量の構造を、例えば活性部位の他のポケット内に成長させるための開始点として、個々の断片を使用することができる（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１、４５〜５４を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化合物断片の成長は、現在、標的タンパク質についての入手可能な構造情報の量に制限されている。そのような構造情報は、例えば、リガンド、受容体及び／又は小分子阻害物質の存在下又は非存在下における標的タンパク質の活性部位又は受容体結合部位を含み得る。この構造情報により、標的断片を成長させるための標的タンパク質の適切な領域に対する有用な指針がもたらされ得るが、断片の成長が導かれ得る事前検証された部位又は接触原子は必ずしももたらされない。したがって、化合物断片の成長は、本質的に試行錯誤の行き当たりばったりのプロセスである。
【０００５】
したがって、化合物断片を成長させるための改良された方法を提供することが当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
抗体は、抗原結合特異性及び高い親和性が付与された非常に有用な治療剤である。所与のタンパク質標的に対して、標的タンパク質に結合する機能修飾抗体を得ることが可能であり、各抗体はそのタンパク質の異なる部位において結合する可能性がある。今まで、抗体の構造を模倣するペプチド模倣薬を設計するために抗体の結合についての構造情報が使用されてきた（例えば、Ｐａｒｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、１９４〜１９８；Ｃａｓｓｅｔら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３０７、１９８〜２０５を参照されたい）。本発明では、機能修飾抗体がどこに、どのように標的タンパク質に結合するかについての構造情報を使用して、化合物断片の成長を誘導するために使用することができる、標的タンパク質と抗体の両方の事前検証された接触原子をもたらし、したがって抗体誘導性の断片成長によって生成された化合物が標的タンパク質の活性の有効なモジュレーターになる可能性を増大させる。さらに、抗体接触情報を使用することにより、化合物の合成が、このタンパク質の新しい、これまで未開拓の部位に対して導かれ得る。
【０００７】
一例では、本発明は、標的タンパク質の活性を変化させ得る小分子化合物を生成する方法であって、
（ａ）標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる１種又は複数の抗体又はその断片を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抗体の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成し、相互作用し、抗体の結合部位内にある、標的タンパク質と抗体の１種又は複数の接触原子対を同定するステップと、
（ｃ）標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた断片のうちの１種又は複数の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で標的タンパク質に結合する化合物断片を選択するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を、場合により、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された抗体の接触原子のうちの１種又は複数と同じ化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことによって成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）において作製された候補化合物のうちの１種又は複数を、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について試験するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）において試験された候補化合物が、標的タンパク質の活性を調節する又は改善された結合性親和性若しくはリガンド効率を有する場合に、それを選択するステップと、
（ｉ）場合により、ステップ（ｈ）において同定された候補化合物を使用してさらに化学反応及びスクリーニングを行って、標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物を生成するステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
ステップ（ａ）〜（ｄ）を正確にその順序通りに行う必要はないことを理解されたい。一例では、ステップ（ａ）及び（ｃ）をステップ（ｂ）及び（ｄ）の前に行うことができる。一例では、ステップ（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）をステップ（ｂ）の前に行うことができる。一例では、ステップ（ｃ）及び（ｄ）をステップ（ａ）及び（ｂ）の前に行うことができる。ある特定のステップを必要に応じて順次又は平行して行うことができることも理解されたい。例えば、ステップ（ａ）及び（ｃ）を平行して行い、ステップ（ａ）及び（ｃ）の後にステップ（ｂ）及び（ｄ）も平行して行うことができる。
【０００９】
標的タンパク質
本発明の標的タンパク質は、別の分子の結合による影響を受けやすい任意の種類のタンパク質又はポリペプチドであってよい。標的の典型的なカテゴリーとして、酵素、サイトカイン、受容体、トランスポーター及びチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、疾患の始まり、発生又は成立において機能を有することが公知である。本発明では、望ましい様式で標的タンパク質の活性を調節する、例えば、標的タンパク質の活性を阻害する又は標的タンパク質の活性を刺激する抗体及び化合物を同定する。
【００１０】
本発明において使用するための標的ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド又は生物活性断片又はその誘導体であってよい。標的ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で周知のプロセスによって調製することができる、又は天然の生物学的供給源から回収することができる。本出願では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、他に特に指定がなければ、互換的に使用される。標的ポリペプチドは、一部の例では、融合タンパク質、例えば親和性タグに融合したタンパク質などの大きなタンパク質の一部であり得る。一部の例では、標的タンパク質は細胞の表面で自然に発現し得、細胞表面発現タンパク質を組換え細胞又は天然に存在する細胞集団のいずれかとして使用することができる。
【００１１】
本発明の方法において使用される標的タンパク質の正確な性質は、当該方法の異なる段階において変動し得、例えば、標的タンパク質の断片又はドメイン又は突然変異体を、ある特定のスクリーニング方法又は構造の表示において必要に応じて使用できることを理解されたい。一部の例では、これらには生物活性がなくてよい。
【００１２】
各標的タンパク質の活性を決定するための適切なスクリーニング方法は、当技術分野で公知であり得、又は実験的に考案され得る。したがって、そのようなスクリーニング方法により、標的タンパク質の活性に対する抗体又は候補化合物の効果を決定することが可能になる。そのようなスクリーニング方法として、例えば、受容体／リガンド相互作用を検出するシグナル伝達アッセイ、又は酵素活性アッセイが挙げられる。各スクリーニング方法は、標的タンパク質の性質に左右されること、及び２種以上のスクリーニング方法を使用してよいことを理解されたい。
【００１３】
本発明の方法では、候補化合物、化合物断片又は抗体を、それぞれ、標的タンパク質の生物活性に対するその影響について試験することができる。例えば、標的タンパク質に結合する同定された抗体及び化合物を、標準のスクリーニング形式によって、化合物又は抗体の阻害活性又は刺激活性を決定するための生物学的アッセイに導入することができ、又はその代わりに又はそれに加えて、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅなどの結合又は遮断を決定するための結合アッセイが適切であり得る。
【００１４】
本発明の方法で作製される抗体の例として、中和抗体、拮抗性抗体又は作動性抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。一例では、したがって、当該方法のステップ（ａ）において同定された抗体は、標的タンパク質の生物活性に対する中和、拮抗又は作動によって標的タンパク質の生物活性を変化させる。一例では、したがって、当該方法のステップ（ａ）において同定された抗体は、標的タンパク質の生物活性を刺激又は阻害することによって標的タンパク質の生物活性を変化させる。一例では、抗体は、所与のタンパク質のシグナル伝達活性などの生物活性を、例えば、標的タンパク質受容体のうちの１種又は複数に対する標的タンパク質の結合を遮断することによって中和することができる抗体である「中和抗体」であってよい。そのような例では、本発明の方法によって生成された小分子化合物も同様に、標的タンパク質受容体のうちの１種又は複数に対する標的タンパク質の結合を遮断し、そのタンパク質の生物活性を中和し得る。標的タンパク質の活性に関連して本明細書で使用する「調節する」及び「変化させる」という用語は、互換的に使用される。
【００１５】
抗体
本発明において使用するための機能修飾抗体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。当該方法のステップ（ａ）において得られた機能修飾抗体は、本明細書において下記されている方法のうちの１種又は複数を用いて生成されることが好ましい。
【００１６】
標的ポリペプチド又は標的ポリペプチドを発現している細胞を使用して、標的ポリペプチドを特異的に認識する抗体を作製することができる。動物の免疫化が必要である場合、周知の及び通例のプロトコールを用いてポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に投与することによって、標的ポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、Ｖｏｌ４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ブタ又はラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ）などの多くの温血動物を免疫化することができる。
【００１７】
本発明において使用するための抗体として、任意の適切なクラスの全抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４などのサブクラス及びその機能的に活性な断片又は誘導体を挙げることができ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体であってよい。
【００１８】
したがって、本発明において使用するための抗体は、全長の重鎖及び軽鎖又はその断片を有する完全な抗体分子を含んでよく、これらに限定されないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ Ｖドメインなど）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及び上記のいずれかのエピトープ結合性断片であってよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９〜２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作出及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照されたい）。本発明において使用するための他の抗体断片として、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載のＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多特異性、例えば二重特異性を含んでよく、又は単一特異性であってよい（例えば、ＷＯ ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００１９】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、生体適合性のフレームワーク構造に組み込まれた１種又は複数のＣＤＲを含む結合剤も含み得る。一例では、生体適合性のフレームワーク構造は、局所表面領域内の抗原に結合する１種又は複数のアミノ酸配列（例えばＣＤＲ、可変領域など）を提示することができる立体構造的に安定な、構造的な支持体又はフレームワーク又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその一部分を含む。そのような構造は、天然に存在するポリペプチド又はポリペプチドの「折りたたみ」（構造モチーフ）であってよく、又は天然に存在するポリペプチド又は折りたたみと比較して、アミノ酸の追加、欠失又は置換などの１つ又は複数の修飾を有してよい。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種（又は２つ以上の種）のポリペプチドに由来してよい。
【００２０】
一般には、生体適合性のフレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質の足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくものを使用することができる（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ及びＵｈｌｅｎ、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、４６３〜４６９を参照されたい）。
【００２１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ダルピン（Ｄａｒｐｉｎ）、フィロマー（Ｐｈｙｌｏｍｅｒ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、アプタマー、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、微小体、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）及びＫｕｎｉｔｚドメインを含めた、生物学的足場に基づく結合剤も含み得る。
【００２２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。
【００２３】
本発明において使用するための抗体は、単一リンパ球抗体法を用いて、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７に記載の方法によって特異的な抗体を作製するために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによって生成することもできる。
【００２４】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種からの１種又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えばＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなく、ＣＤＲの特異性決定残基だけを移行する必要があり得ることを理解されたい（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲを得た非ヒト種に由来する１種又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでよい。
【００２５】
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。
【００２６】
本発明において使用するための抗体は、当技術分野で公知の、及びＢｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ、１９９７ １８７ ９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１〜２８０）及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に記載のものを含めた種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。
【００２７】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト由来である又は実質的にヒト由来の配列と同一であり、それらが必ずしも同じ抗体からのものではない抗体である。完全ヒト抗体の例として、例えば上記のファージディスプレイ法によって作製された抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子が、例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般用語で記載のそれらのヒト対応物と交換されたマウスによって産生された抗体を挙げることができる。
【００２８】
一例では、本発明において使用するための抗体は、ラクダ又はラマなどのラクダ科の動物に由来してよい。ラクダ科の動物は、重鎖抗体と称される軽鎖を欠く抗体の機能クラスを持つ（Ｈａｍｅｒｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４４６〜４４８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６、２３０〜２３５）。これらの重鎖抗体の抗原結合部位は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨＨ）によってもたらされる３つの超可変ループ（Ｈ１〜Ｈ３）に限定されている。ＶＨＨの第１の結晶構造により、Ｈ１ループ及びＨ２ループは従来の抗体に対して定義された公知の正準構造クラスに制限されないことが明らかになった（Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３００、８３〜９１）。ＶＨＨのＨ３ループは、従来の抗体のものよりも平均して長い（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９、２６１〜２９６）。ヒトコブラクダ重鎖抗体の大部分は、その抗体が生じた対象である酵素の活性部位に結合しやすい（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ、１７、３５１２〜３５２０）。一例では、Ｈ３ループは、残りのパラトープから突出し、ニワトリ卵白リゾチームの活性部位に挿入されることが示された（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、８０３〜８１１）。したがって、多くの場合従来の抗体はタンパク質表面の間隙を避けるが、ラクダ科の動物の重鎖抗体は、Ｈ３ループによって形成されるＶＨＨの緻密な扁長形状に主に起因して、酵素活性部位に入ることができることが実証されている（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔら、２００６、ＰＮＡＳ、１０３、１２、４５８６〜４５９１及びＷＯ９７０４９８０５）。
【００２９】
これらのループは他の足場及びこれらの足場に作製されたＣＤＲライブラリーにおいて提示され得ることが示唆されている（例えば、ＷＯ０３０５０５３１及びＷＯ９７０４９８０５を参照されたい）。したがって、本明細書の上部において詳述したように、そのようなループ及びＣＤＲを含有する足場を本発明において使用することができる。
【００３０】
一例では、本発明において使用するための抗体は、サメなどの軟骨魚類に由来してよい。軟骨魚類(サメ、ガンギエイ、エイ及びキメラ)は、ＩｇＮＡＲとして公知の非定型的な免疫グロブリンアイソタイプを持つ。ＩｇＮＡＲは軽鎖を伴わないＨ鎖ホモ二量体である。各Ｈ鎖は１つの可変ドメインと５つの定常ドメインを有する。ＩｇＮＡＲ Ｖドメイン（又はＶ−ＮＡＲドメイン）は２つの密接に関連するサブタイプ、Ｉ及びＩＩに分類できるいくつもの非正準システインを担持する。ＩＩ型Ｖ領域は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３に、ラクダ科の動物ＶＨＨドメインにおいて観察されるドメイン限定ジスルフィド結合と類似したドメイン限定ジスルフィド結合を形成することが提唱されている付加的なシステインを有する。そこでＣＤＲ３はより広がった立体構造をとり、ラクダ科の動物のＶＨＨと類似した抗体フレームワークから突出すると思われる。実際に、上記のＶＨＨドメインと同様に、ある特定のＩｇＮＡＲ ＣＤＲ３残基についても、ニワトリ卵白リゾチーム活性部位に結合できることが実証されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５、１７７０〜１７７３）。
【００３１】
ＶＨＨ及びＩｇＮＡＲ Ｖドメインを作製する方法の例は、例えば、Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８、１７（１３）、３５１２〜２０；Ｌｉｕら、２００７、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７、７８；Ｓａｅｒｅｎｓら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（５）、５１９６５〜７２に記載されている。
【００３２】
標的タンパク質の間隙に結合する突出ＣＤＲを持つある特定のＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ及び他のそのような抗体ドメイン及び構造の能力を考えると、一例では、これらの抗体は、本発明において使用するために好ましい抗体である。同様に、これらのＣＤＲの凸状性を考えると、標的タンパク質の結合部位は多くの場合、比較的小さく集中的であり、近接して位置している接触原子のクラスターを同定するためのこれらの有用な抗体を、化合物断片の成長において使用するために適切なものにしている。したがって一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＶＨＨドメイン抗体又はそれに由来する１種又は複数のＣＤＲなどのＶＨＨ抗体又はそのエピトープ結合断片である。一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＩｇＮＡＲ Ｖドメイン又はＶ−ＮＡＲドメイン又はそれに由来する１種又は複数のＣＤＲなどのＩｇＮＡＲ抗体又はそのエピトープ結合断片である。一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＶＨＨドメイン抗体又はＩｇＮＡＲ抗体に由来するＣＤＲ３を含む、ＣＤＲ３含有抗体又はＣＤＲ３含有足場タンパク質である。一般には、そのような抗体又は足場は、１０アミノ酸を超える長さのＣＤＲ３領域を含有する。一例では、ＣＤＲ３領域は、２０アミノ酸を超える長さである。一例では、ＣＤＲ３領域は、最大３０アミノ酸の長さである。一例では、ＣＤＲ３領域は、２０〜３０アミノ酸の長さである。
【００３３】
本発明において使用される機能修飾抗体分子は、標的タンパク質に対して、好ましくはナノモル又はピコモルの高い結合親和性を有することが好ましい。一例では、本発明において使用される中和抗体分子は、標的タンパク質に対して、好ましくはナノモル又はピコモルの高い結合親和性を有することが好ましい。親和性は、天然又は組換えの標的タンパク質を使用するＢＩＡｃｏｒｅを含めた当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約１０ｎＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約１ｎＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約５００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約２００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、約５０ｐＭ以上の結合親和性を有する。本発明の方法で生成された抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて変化させることができることを理解されたい。そのような変異型は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含めたいくつもの親和性突然変異プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、これらの親和性突然変異の方法を考察している。
【００３４】
本発明では、本明細書において上記した適切なスクリーニング方法を用いて決定されたように、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の活性を望ましい様式で変化させる１種又は複数の抗体が得られる。一実施形態では、１種の抗体又はその断片が本発明の方法で生成される。一実施形態では、標的タンパク質に結合する２種の抗体又はその断片が作製される。一実施形態では、標的タンパク質に結合する３種の抗体又はその断片が作製される。一実施形態では、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる３種以上の抗体又はその断片のパネルが作製される。そのような抗体のパネルは３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種又は１０種又はそれ以上の抗体を含んでよいことを理解されたい。抗体のそれぞれが、標的タンパク質の活性を同程度又は異なる程度に調節し得ること、及びそれらは標的タンパク質の同じ位置、類似した位置、重複した位置又は異なる位置において結合し得ることも理解されたい。さらに、抗体のそれぞれは、同じ手段又は異なる手段によって生成することができ、例えばそれらは同種又は異なる種から得ることができ、且つ／又は、例えばヒト化又はキメラなど同じ種類又は異なる種類の抗体であってよく、且つ／又は、それらは例えばＶＨＨ又はＩｇＮＡＲドメインなど、異なる形式であってよい。別の例では、単一の親抗体から、例えば突然変異誘発によって２種以上の抗体を得ることができ、したがって、異なる位置で標的タンパク質に結合し、且つ／又は異なる親和性を持ち、且つ／又は標的タンパク質の活性を調節するさまざまな能力を持つ３種以上の関連する抗体のパネルが生成される。さらに、そのような突然変異誘発は、抗体及び標的タンパク質の両方の決定的な残基／接触原子の同定を可能にすることにより、抗体の接触原子の検証を助け、且つ／又はファルマコフォア部位に優先順位を付けるために、アラニンスキャニングなどの方法によって抗体のパネルを生成するために使用することができる。したがって、一実施形態では、当該方法のステップ（ａ）において得られる少なくとも１つの抗体は、当該方法のステップ（ａ）において得られる別の抗体の突然変異誘発によって生成される。
【００３５】
抗体：標的の３Ｄ構造の表示
本発明では、本明細書に記載の適切なスクリーニング方法を用いて決定されたように、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を望ましい様式で変化させる（例えば阻害活性又は刺激活性）１種又は複数の抗体が得られる。その後、抗体がどこで標的タンパク質に結合しているか、及び標的タンパク質及び抗体のどのアミノ酸残基、したがってどの原子が互いに接触している又は相互作用するかについての情報を得るために、標的タンパク質と複合した少なくとも１つのそのような抗体の三次元構造の表示を生成する。標的タンパク質に結合し、その活性を調節する２種以上の抗体が得られた場合、標的タンパク質と複合した抗体のそれぞれについて構造情報を得ることが好ましい。ステップ（ａ）及び（ｂ）は反復性であってよいこと、及び別の抗体を得る前に、各抗体の標的タンパク質と関連付けた３Ｄ構造を生成してよいことを理解されたい。
【００３６】
当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて抗体：標的タンパク質複合体の三次元構造の表示を生成することができる。そのような方法の例として、ＮＭＲ及びＸ線結晶構造解析が挙げられる。Ｘ線結晶構造解析を使用することが好ましい。本明細書において上記したように、標的タンパク質は成熟タンパク質又はその適切な断片又は誘導体であってよい。
【００３７】
Ｘ線結晶は、一般には、抗体又は抗体断片と複合した野生型又は突然変異型の標的タンパク質に対応する結晶化したポリペプチド複合体を含み、ここで抗体断片は、例えば本明細書において上記した抗体ＶＨＨドメイン、ＩｇＮＡＲドメイン、ｄＡｂ断片、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片である。そのような結晶として、結晶化したタンパク質：抗体断片複合体が実質的に純粋であるネイティブな結晶、及び結晶化したタンパク質：抗体断片複合体が、これらに限定されないが、阻害物質、拮抗物質、抗体又は１種又は複数の受容体を含めた１種又は複数の付加的な化合物を伴うポリ結晶が挙げられる。
【００３８】
作製された結晶は、結晶化ポリペプチド（単数又は複数）の三次元Ｘ線回折構造を、高解析度、好ましくは約３Å超、一般には約１Å〜約３Åの範囲の解析度で決定可能にするのに十分な質であることが好ましい。一般に、結晶は、実質的に純粋なポリペプチド複合体を、ポリペプチド複合体を沈殿させるために必要な濃度をちょうど下回る濃度で沈殿剤を含む水性緩衝液に溶解させることによって成長させる。次いで水を制御蒸発によって除去して沈殿条件を生じ、これを結晶成長が終わるまで維持する。上記の方法に従って調製されたネイティブな結晶を、所望の複合体のポリ結晶に添加する化合物を含む溶剤に浸漬することによってポリ結晶を調製する。或いは、ポリ結晶は、ポリペプチド複合体を上記の方法による化合物の存在下で共結晶化することによって調製することができる。
【００３９】
得られた三次元構造情報は、一般には、結晶化したポリペプチド複合体又はポリ複合体の原子構造座標、又は、その一部分、例えば、抗体結合部位又は中和エピトープなどの原子構造座標を含むが、原子構造座標のベクトル表示などの他の構造情報を含み得る。
【００４０】
抗体−標的タンパク質複合体に関する三次元構造情報は、原子構造座標を含むことが好ましい。構造情報は、抗体が結合した標的タンパク質の結合部位の全て又は一部を含むことが好ましい。
【００４１】
本発明では、三次元構造情報を使用して、当技術分野で公知の適切なモデル及びコンピュータプログラムを用いて（例えば、ＣＣＰ４ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（１９９４）、Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ；Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ、Ｄ５０、７６０〜７６３を参照されたい）標的タンパク質と複合した抗体の三次元表示を生成する。次いでこの３Ｄ表示を使用して、標的タンパク質の抗体結合部位（単数又は複数）内にある、標的タンパク質及び抗体の１種又は複数の接触残基又は接触原子を同定する。抗体結合部位において互いに接触している又は相互作用する、標的タンパク質の各原子と抗体の各原子を同定して、抗体−標的タンパク質の原子対を同定する。２種以上の抗体−標的タンパク質複合体の構造が生成される場合、そのときは、各抗体の結合部位において１種又は複数の原子、好ましくは１種又は複数の原子対を同定する。一般には、各抗体の結合部位の各原子対を同定する。
【００４２】
一般には、本発明の抗体結合部位は、本発明の方法で同定された抗体と接触している又は相互作用する標的タンパク質の残基又は原子１種又は複数、及び標的タンパク質とそれらの接触又は相互作用を生じる抗体の１種又は複数の残基又は原子とを含む。
【００４３】
一例では、抗体の結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、可変領域及び定常領域を含めた抗体の任意の一部と接触している又は相互作用する原子であり、これらの領域内の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含む。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体の可変領域と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域内の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、ＣＤＲ及び可変領域フレームワークの任意の一部のいずれか１つと接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、軽鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、重鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲのうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体重鎖ＣＤＲ３の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨドメインのＣＤＲ３と接触している原子である。
【００４４】
一例では、抗体の結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、標的タンパク質の任意の一部と相互作用する又は接触している接触原子である。したがって、結合部位内にある抗体の接触原子は、一般には可変領域及び／又は定常領域の内部にあり、これらの領域内の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含む。一例では、結合部位における抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触している又は相互作用する抗体の可変領域内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体の軽鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体の重鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、抗体の接触原子は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域内の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、ＣＤＲ及び可変領域フレームワークの任意の一部のいずれか１つ内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲのうち１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体重鎖ＣＤＲ３の任意の一部内の原子である。一例では、抗体の結合部位内にある抗体の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨドメインのＣＤＲ３内の原子である。
【００４５】
例えば、抗体及び標的タンパク質の異なる部分間の２つ以上の相互作用がある場合、抗体と接触している又は相互作用している標的タンパク質の残基又は原子の結合部位又はクラスターが２つ以上あることを理解されたい。したがって、一例では、いったん各抗体−標的タンパク質複合体の３Ｄ構造の表示が生成されたら、抗体結合部位を目視検査によって決定し、選択することができる。例えば、標的タンパク質の構造的特徴及び／又は標的タンパク質のトポグラフィー及び／又はこれらの部位が新薬の開発につながると考えられるかどうかによって、適切な抗体結合部位を同定することができる。例えば、抗体が標的タンパク質の天然に存在する溝又は間隙に結合する場合、又は抗体が結合した結果そのような溝又は間隙が生成される場合、そのような部位が好ましいことがある。実際に、これらの部位は、例えば受容体又はリガンド結合のための部位としてすでに公知であり得る。或いは、抗体が結合することによってこれまで未知の機能修飾部位が初めて明らかになる可能性があり、これらの部位が好ましいことがある。一例では、結合部位は抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨ抗体のＤＲＨ３と接触している部位であると考えられ得る。場合によって、２箇所以上の部位が選択され得ることを理解されたい。
【００４６】
標的タンパク質に結合する抗体が２種以上得られた場合、これらの抗体のそれぞれの結合部位からもたらされた構造情報集団を「プール」して１種又は複数の抗体結合部位を選択するために役立たせることができることも理解されたい。例えば、機能修飾抗体がある特定の位置で頻繁に結合する場合、その結合部位が優先的に選択され得る。２種以上の抗体−標的タンパク質複合体３Ｄ構造が決定された場合、この情報を組み合わせて、本発明において使用することができる標的タンパク質及び／又は抗体の抗体結合部位、したがって原子の選択を補助することができる。例えば、抗体の大部分が標的タンパク質の特定の領域において結合する場合、その領域内で頻繁に起こる相互作用が優先的に選択され得る。したがって、２種以上の抗体からの接触原子対、例えば、第１の抗体のＣＤＲＨ２からの接触原子対及び第２の抗体のＣＤＲＨ３からの接触原子対をステップ（ｂ）において同定することができ、ステップ（ｆ）において、そのような接触原子対を使用して化合物断片の成長を誘導する。
【００４７】
一例では、抗体結合部位において少なくとも１つの標的タンパク質の接触原子が同定される。一例では、抗体結合部位内にある少なくとも１つの抗体の接触原子が同定される。一例では、少なくとも１つの標的タンパク質の接触原子及びそれと相互作用する抗体の接触原子が同定される、すなわち、少なくとも１つの原子対が同定される。抗体と標的タンパク質原子との間の分子間相互作用は、一般には水素結合及びファンデルワールス非極性相互作用などの静電気的相互作用である。抗体結合部位内の全ての抗体−標的タンパク質接触原子対が同定されることが好ましい。
【００４８】
所与の結合部位、例えば標的タンパク質の結合部位及び抗体の結合部位において２つ以上の接触原子対が同定される場合、タンパク質の接触原子は、本明細書において下記したように、続く断片の成長において有用になるために、互いに適切な距離内にあることが好ましい。一例では、結合部位において同定された接触原子は、最短の非共有結合性の原子相互作用又は水素結合の距離、及び同じ結合部位内にあると考えられ得るタンパク質原子間の最長距離に基づいて、互いに適切な距離内、一般には約１Å〜約３０Åにあることが理想的である。同定されたタンパク質の接触原子について、実験的なタンパク質突然変異誘発試験又は分子力学自由エネルギー計算などのコンピュータを用いた方法によって優先順位を付けることができる［Ｍｏｒｅｉｒａら Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｆｅｂ；２８（３）：６４４〜５４］。
【００４９】
化合物断片のスクリーニング
本発明の方法のステップ（ｃ）において、標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片が得られる。
【００５０】
本発明において使用するための化合物断片は、一般には６００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は５００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は４００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は３５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は３００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は２５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は２００Ｄａ未満の分子量を有する。そのような断片は、一般には小さく、単純な化合物であり、通常小数の置換基を持つわずか１つ又は２つの環からなる。
【００５１】
そのような化合物断片のライブラリーをスクリーニングすることにより、通常、少ない標的タンパク質との相互作用を介するのみ、したがって、これらは通常、低親和性相互作用ではあるが、標的タンパク質に非常に効率的に結合する小さい化合物断片を同定することが可能になる。これらの化合物断片ヒットは、より大きく、潜在的にはるかに効力があり、薬らしいリード化合物を形成するために、組み合わせる、例えば合併又は連結することができる構成要素とみなすことができる。或いは、これらのヒットは、標的タンパク質とのますます大きな相互作用を獲得しているリード化合物に合成的に発展させることができる「種」又は「アンカーポイント」であり得る。一例では、両方の手法を合わせて、スクリーニングするための次の化合物を生成することができる。
【００５２】
一般には、断片に基づくスクリーニングは、いくつもの化合物断片、一般には数千種の化合物をスクリーニングして高マイクロモルからミリモルまでの範囲内のＫｄ値を持つ親和性の低い断片を見出すことを伴う。断片に基づくスクリーニング方法の総説については、Ｈａｊｄｕｋ及びＧｒｅｅｒ、２００７、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．６（３）、２１１〜２１９を参照されたい。
【００５３】
適切な化合物断片ライブラリーは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて設計することができ、それによってライブラリーに含まれる化合物断片についての選択は、望ましい化学官能性又は望ましくない化学官能性及び溶解性、形状、柔軟性又は分光特性などの、ライブラリーに置かれ得る他の制約の存在又は非存在に基づき得る。さらに、その後の断片における化学反応に対する戦略も、ライブラリーの設計に影響を与え得る。断片ライブラリーの戦略についての総説は、Ｂａｕｒｉｎら、２００４、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ、４４、２１５７〜２１６６；Ｈｕｂｂａｒｄら、２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、１０、２８９〜２９７；Ｚａｒｔｉｅｒ及びＳｈａｐｉｒｏ、２００５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、９、３６６〜３７０に提供されている。
【００５４】
本発明の方法では、化合物断片を、標的タンパク質への結合について直接又は仮想的にのいずれかでスクリーニングする。結合情報は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。例えば、異なる手法の概要は、書籍「創薬における断片に基づく手法（Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」（Ｊａｈｎｋｅ、Ｅｒｌａｎｓｏｎ、Ｍａｎｎｈｏｌｄ、Ｋｕｂｉｎｙｉ＆Ｆｏｌｋｅｒｓ（２００６）、Ｗｉｌｅｙより出版）及びＲｅｅｓ及び共同研究者らの総説（Ｒｅｅｓら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３、６６０〜６７２）に示されている。
【００５５】
化合物断片のタンパク質への結合を決定するために有用な実験方法として、下記の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質のＸ線結晶構造解析［Ｈａｒｔｓｈｏｒｎら（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８、４０３〜４１３］。タンパク質のＸ線結晶構造解析を用いた効率的な断片のスクリーニングには、標的タンパク質の予め形成された結晶を断片の反応混液に浸漬する必要がある。Ｘ線データを収集した後の反応混液からの断片の同定は、得られた電子密度を手動又は自動で分析することに依存する。これらの試験の結果は、どの断片がタンパク質標的に結合するか、及び活性部位における実際の結合の立体配置に関する情報である。実際の結合の強度又は親和性についての情報は得られない。
【００５６】
断片が対象の標的タンパク質に結合した結果としてのＮＭＲスペクトルの化学シフトを同定し、解釈することを伴う、ＮＭＲに基づくスクリーニング［Ｓｈｕｋｅｒら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１Ａ、１５３１〜１５３４］又はＮＭＲによる構造活性相関（ＳＡＲ）。結果は、タンパク質標的に結合する断片に関する情報である。一般には、実際の結合の強度又は親和性の情報は得られない。標的固定化ＮＭＲスクリーニングを使用することもできる（Ｖａｎｗｅｔｓｗｉｎｋｅｌら、２００５、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２（２）：２０７〜２１６）。
【００５７】
断片の標的タンパク質への結合を安定化させるためにジスルフィド結合を使用すること［ＤｅＬａｎｏ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２、１４〜２０］。これは、タンパク質の表面にシステインと称される硫黄含有アミノ酸を置くことにより、硫黄含有断片の集団に対するタンパク質をスクリーニングするために実現される。システインの近くに結合する断片は、タンパク質とジスルフィド結合を形成し、タンパク質の重量を増加させ、質量分析によって断片を検出することが可能になる。結果は、タンパク質に結合する断片の一覧である。断片の結合強度に関する詳細な情報は得られない。
【００５８】
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（ＵＳＡ）のアプリケーションノート［「分離すれば低下するか？ＩＴＣによるリガンドの低親和性実在分子種の研究（Ｄｉｖｉｄｅｄ ｗｅ ｆａｌｌ？ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＩＴＣ）」、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ、ＵＳＡ、２００５］に記載されている、断片−タンパク質の結合プロセスによる熱生成を測定し、エントロピー基準及びエンタルピー基準などの熱力学的パラメータに変換する、マイクロカロリメトリーに基づく断片のスクリーニング。この実験の結果は、結合断片のアイデンティティー、及び場合により、対応する結合親和性である。
【００５９】
親和性が低い断片の結合を測定するために適応されたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイも記載されている［Ｂｏｅｈｍら（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３、２６６４〜２６７４］。これらの実験の結果は、特定のタンパク質標的に対して対応する結合親和性を持つ断片のセットである。
【００６０】
沈降分析は、断片／タンパク質相互作用を測定することが記載されている新規技術である［Ｌｅｂｏｗｉｔｚら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１、２０６７〜２０７９］。沈降平衡により、溶液中の平衡状態での成分濃度が測定され、沈降平衡実験からの読み取り値は、吸光度対距離曲線である。これらの実験の結果は、特定のタンパク質標的に対して結合親和性を示す断片のアイデンティティーである。
【００６１】
固相検出は、一般用語では、バイオ受容体とシグナル伝達物質の両方を組み合わせて断片のタンパク質への結合を検出する、共通の作用原理を共有する幅広い技術を包含する。最もよく知られている固相検出法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）であり、Ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって最初に記載され、実行された。このプロセスは、所有権を使用した化学マイクロアレイの高度に平行な生産、高度に定義された表面化学、続くＳＰＲイメージングによる１０，０００断片までのタンパク質相互作用の同時検出を伴う。相互作用のデータを物理化学的な化合物データと組み合わせてアレイの結果を解釈する。ＳＰＲの具体的な一例はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）であり、これは断片のライブラリーをスクリーニングするために使用されている（Ｍｅｔｚら、２００３、Ｍｅｔｈ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、１９、２１３〜２３６及びＮｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２、５９０〜５９４）。代替的な固相検出法として、Ａｋｕｂｉｏ Ｌｔｄ（ＵＫ）が商品化した破壊事象走査（ｒｕｐｔｕｒｅ ｅｖｅｎｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＲＥＶＳ）及び音響共鳴プロファイリング（ｒｅｓｏｎａｎｔ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＲＡＰ）技術、反射干渉（ＲＩｆ）、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、及びＣｏｎｃｅｎｔｒｉｓ ＧｍｂＨ（Ｓｕｉｓｓｅ）が商品化したマイクロカンチレバー技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
キャピラリー電気泳動法も、断片／タンパク質相互作用を測定するためのツールとして言及されてきた［Ｃａｒｂｅｃｋら（１９９８）Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１、３４３〜３５０］。
【００６３】
上記の方法のうちの１つ又は複数を用いることができることを理解されたい。例えば、ＮＭＲを使用して断片の結合を決定することができ、また、これをＢＩＡｃｏｒｅ（商標）スクリーニングと組み合わせて親和性及び同定された断片ヒットの「順位」を決定することができる。一例では、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を使用して標的タンパク質への結合及び親和性を同時に決定する。
【００６４】
断片−結合データを生成するための上記の実験手法に捕捉して、文献ソースから集めた情報も、ある特定の断片の、特異的な標的タンパク質に対する親和性についての知見の生成において有用であり得る。
【００６５】
断片結合のデータを収集するためにどんな手法を用いても、結果は、標的タンパク質に結合することが公知である、又はそう考えられている化合物断片構造の一覧である。解離値又はＩＣ５０値の形式の定量的な親和性情報が有用であるが、必須ではない。
【００６６】
公的に入手可能なデータなどの標的タンパク質に関する適切な構造情報がすでに利用可能である場合、仮想的なスクリーニング方法を使用して標的タンパク質に結合することが予想される断片を同定することができることを理解されたい。化合物断片のタンパク質への結合を決定するために有用な仮想的なスクリーニング方法として、ＧＬＩＤＥ［Ｆｒｉｅｓｎｅｒら Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｒ ２５；４７（７）：１７３９〜４９］及びＧＯＬＤ［Ｊｏｎｅｓら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｐｒ ４；２６７（３）：７２７〜４８］が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、上記のタンパク質の接触原子は、構造に基づく仮想的なスクリーニング方法における計算パラメータとして使用することができるファーマコアの特徴を同定し得る。
【００６７】
一例では、種々の異なる化学断片を用いて標的タンパク質結晶の構造を探索して、そのような候補分子と標的タンパク質との間の相互作用に最適な部位を決定することができる。次いで、これらの部位に密接に結合すると思われる小分子断片を設計し、場合により、合成し、標的タンパク質に結合するそれらの能力について試験することができる。
【００６８】
別の例では、小分子データベースのコンピュータによるスクリーニングを使用して、標的タンパク質に全部又は一部が結合し得る化学断片を同定する。このスクリーニング方法及びその有用性は、当技術分野で周知である。例えば、そのようなコンピュータモデリング技法は、ＷＯ９７／１６１７７及びＷＯ２００７／０１１３９２に記載されている。
【００６９】
一実施形態では、コンピュータによるスクリーニング方法は、候補断片を合成し、その候補断片を本明細書において上記した通り標的タンパク質に結合する能力についてスクリーニングするステップをさらに含む。
【００７０】
一般には、本発明の方法のステップ（ｃ）において、標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片が同定される。一例では、２種以上の断片が同定される。一例では、３種以上の断片が同定される。一例では、４種以上の断片が同定される。一例では、５種以上の断片が同定される。一例では、１０種以上の断片が同定される。一例では、２０種以上の断片が同定される。一例では、５０種以上の断片が同定される。
【００７１】
例えば、数多くの断片が同定される場合、同定された断片全てがさらなる３Ｄ構造解析のために選択されるのではない可能性があることを理解されたい。ある特定の断片を、その総合的な取扱い易さ及び／又はリピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ ｒｕｌｅ ｏｆ ｆｉｖｅ）（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、１９９７、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ、２３、３〜２５）に準拠する可能性に基づいて選択することができる。
【００７２】
その代わりに、又はそれに加えて、断片の標的タンパク質に対する親和性が決定されている場合、この親和性を使用して、親和性又はリガンド効率が最も高い断片がさらなる試験に進むよう断片に順位を付けることができる。リガンド効率は、サイズによって基準化された結合親和性である（すなわち、抗力／サイズ）。
【００７３】
その代わりに、又はそれに加えて、標的タンパク質に結合することが公知の化合物断片の類似体を、例えば、予測される改善された結合性又は総合的な取扱い易さに基づいて同定し、選択することができる。直接又は仮想的にのいずれかで、これらの類似体を標的タンパク質への結合について試験することができることを理解されたい。
【００７４】
その代わりに、又はそれに加えて、本明細書において上記した通り同定された抗体のうちの１種又は複数を使用して行う競合アッセイに基づいて、同定された抗体のうちの１種又は複数と同じ領域において結合する断片が選択されるように、例えば、抗体の存在下で標的タンパク質に結合することができない化合物断片が優先的に選択されるよう化合物断片に順位を付けることができる。
【００７５】
上記の異なる因子を組み合わせて使用して、３Ｄ構造解析を用いるための１種又は複数の化合物断片を選択することができる可能性がある。
【００７６】
化合物断片の３Ｄ構造解析
本発明の方法のステップ（ｄ）において、選択された化合物断片のうちの１種又は複数について、三次元構造の表示を標的タンパク質と組み合わせて生成する。そのような構造の表示のための適切な方法として、Ｘ線結晶構造解析及びＮＭＲが挙げられる。Ｘ線結晶構造解析を使用することが好ましい。
【００７７】
生成された三次元構造表示により、化合物断片が標的タンパク質にどのように結合するか、及び標的タンパク質のどこに結合するかについての情報がもたらされる。次いで、この情報を使用して、１種又は複数の機能修飾抗体の標的タンパク質への結合について得られた３Ｄ構造情報と比較することができる。Ｓｙｂｙｌ［ｗｗｗ．ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ］などの分子モデリングプログラムを使用して同定された重要な相互作用を用いて構造に基づくドラッグデザインのためのファルマコフォアを生成することができる。
【００７８】
本発明の方法によって同定された抗体結合部位内又はそれと同じ付近で標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を、１種又は複数の候補小分子化合物を、例えば化合物断片の成長によって合成することに使用するために、ステップ（ｅ）において選択する。
【００７９】
一例では、化合物断片が、抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体の１種又は複数のタンパク質接触原子と分子間相互作用する場合、それを選択する。分子間相互作用として、水素結合又は疎水性ファンデルワールス相互作用などの静電気的相互作用が挙げられる。
【００８０】
一例では、化合物断片が抗体結合部位の付近で分子間相互作用する場合に、それを選択する。分子間相互作用として、水素結合又は疎水性ファンデルワールス相互作用などの静電気的相互作用が挙げられる。一例では、化合物断片が、ステップ（ｂ）において抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体１種又は複数のタンパク質接触原子の付近で分子間相互作用する場合に、それを選択する。本明細書で使用される「の付近で」という用語は、１〜３０Åの距離を指す。一例では、「の付近で」という用語は、１〜２０Å又は１〜１０Åの距離を指す。一例では、化合物断片が、ステップ（ｂ）において抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体の１種又は複数のタンパク質接触原子の１〜３０Å以内で分子間相互作用する場合に、これを選択する。
【００８１】
上記のように、どの抗体結合部位が化合物断片の標的になるはずであるかを選択すること、したがって、どの断片が選択され得るかは、２種以上の抗体の集合データ又は例えば抗体結合部位データ及び既知リガンド又は受容体結合部位に基づき得る。標的タンパク質の同じ領域において結合する２種以上の抗体が同定されている場合、標的タンパク質において同定された、抗体と相互作用する接触原子を、断片の成長に使用するために組み合わせることができる。
【００８２】
例えば、標的タンパク質の所与の領域において結合する抗体の頻度を用いて、標的タンパク質の残基又は原子と相互作用する抗体残基又は原子の位置と一致させるための化学的空間又は３Ｄ位置の特定の領域への断片の成長又はアナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）を誘導することができる。したがって、得られた、結合した抗体−標的タンパク質の接触情報を使用して、標的タンパク質の特定の領域まで化合物断片の成長を導き、且つ／又はその領域において結合する化合物断片の選択を補助することができ、且つ／又は標的タンパク質の特定の領域内の残基の複合集団をもたらして化合物断片の成長を誘導することができ、且つ／又は化合物断片の成長を化学的空間又は３Ｄ位置のある特定の領域まで導くことができる。
【００８３】
ステップ（ｃ）及び（ｄ）は反復性であってよく、別の化合物断片を得る前に、標的タンパク質と関連付けた化合物断片の３Ｄ構造を生成してよいことを理解されたい。さらに、ステップ（ｃ）及び（ｄ）は、ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で結合する化合物断片が同定されるまで繰り返すことができる。
【００８４】
化合物断片の成長
いったん抗体結合部位内又はその付近における化合物断片の結合が同定されると、所与の抗体結合部位（単数又は複数）から得られた接触原子情報を使用して化合物断片の成長を誘導して候補小分子化合物又はそのような化合物のライブラリーを生成することができる。
【００８５】
一般には、そのような標的誘導性の合成の目的は、モジュラー方式で分子を構築して、標的タンパク質に対する結合親和性が個々の部分又は断片よりも高く、標的タンパク質に対して所望の生物学的効果を及ぼすことができる分子集合体を作製することである。このプロセスにおいて、他の構造情報、例えばリガンド、阻害物質、他の化合物断片からの情報を、抗体接触情報と組み合わせて用いることができることを理解されたい。
【００８６】
化合物断片（単数又は複数）−標的タンパク質相互作用及び抗体−標的タンパク質相互作用から得られた構造情報を使用して、任意の適切な断片の集合／成長／合理的方法を用いて新規小分子候補化合物を生成するために選択された断片（単数又は複数）を成長させることができる。そのような方法として、ＮＭＲによるＳＡＲ、動的ライブラリー、アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）及び仮想的なスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
断片に基づいてリードを生成し、その後、効力が高いヒット類似体及び小分子を合理的に設計する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｚｃｚｅｐａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００３）、１２５（１４）、４０８７〜４０９６；Ｒａｉｍｕｎｄｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）、４７（１２）、３１１１〜３１３０、Ｂｒａｉｓｔｅｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００３）、１２５（１３）、３７１４〜３７１５、Ｈｕｔｈら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（２００７）、７０（１）、１〜１２、Ｐｅｔｒｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）、４９（２）、６５６〜６６３、Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、５０（２４）、５９０３〜５９１１、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、５０（２４）、５９１２〜５９２５及びＨｕｂｂａｒｄら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、７（１６）、１５６８〜１５８１を参照されたい。
【００８８】
一般には、そのような化合物断片を成長させる方法として、リード化合物を最適化するための、反復性構造に基づくドラッグデザインが挙げられる。方法として、スクリーニングによって同定された化合物断片の最近接化合物断片又は類似化合物断片を同定するための、化合物断片の「アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）」も挙げられ、これらの化合物断片は、次いで標的タンパク質への結合についてスクリーニングすることができる。
【００８９】
同定された断片（単数又は複数）の成長は、タンパク質表面の付加的なサブサイトに結合する官能性を付加することによって行うことができる。これは、断片と同じ下部構造を含有する化合物について入手可能な化学物質のデータベースを検索することによって、又は断片の重要な付加点に官能性を付加する小ライブラリーを合成することによって実現することができる。断片の標的タンパク質への結合の場所及び方向並びに同じ付近で結合する抗体から得られた構造情報を使用して、コンピュータによる検索又はライブラリー合成を誘導することができる。リガンド結合などの付加的な関連する構造情報が入手可能である場合、これも断片の成長を誘導するために使用できることを理解されたい。
【００９０】
したがって、化合物断片を「成長させること」は、官能性を付加すること、小ライブラリーを作り上げること、データベースを検索すること、コンピュータによる検索及び／又は「アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）」を含めた、いくつもの作業を包含し得る。
【００９１】
一般には、本発明の方法において化合物断片を「成長させること」は、
（１）抗体結合部位内にあると同定された標的タンパク質の接触原子と相互作用し、且つ／又は
（２）抗体結合部位内の抗体接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占める
ように化学合成を導くことを含む。
【００９２】
一例では、当該方法のステップ（ｆ）は、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された１種又は複数の抗体の接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことにより、ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成することを含む。抗体の各接触原子は、ステップ（ｂ）において同定された抗体−標的タンパク質原子対からの対応する接触原子であることが好ましい。
【００９３】
断片の成長が、抗体結合部位内の抗体接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように導かれた場合、断片は、抗体に用いられるのと同じ分子間相互作用又は分子形状を組み込み得る。この分子間相互作用として、例えば、静電気的相互作用、水素結合、疎水性相互作用又はファンデルワールス相互作用が挙げられる。
【００９４】
したがって、抗体接触原子の空間位置及び分子間相互作用の種類を用いることにより、断片を成長させて抗体の標的タンパク質の接触原子との相互作用を模倣することができる。この空間位置を、本明細書では３Ｄ位置又は化学的空間と称する。したがって、同じ化学的空間又は３Ｄ位置が、３Ｄ表示、例えばＸ線結晶構造解析において同定され得る。これは、特に異なる原子が用いられる場合、抗体原子の位置と正確に同じである必要はないが、ほとんど同等であり、類似した化学的空間を占め得ることを理解されたい。
【００９５】
断片の成長が、抗体と同じ３Ｄ位置又は化学的空間を占める原子を組み込まずに標的タンパク質の原子と相互作用するように導かれた場合、抗体原子の性質及び抗体原子の標的タンパク質との相互作用をさらに使用して、例えば仮想的なスクリーニングツール及び／又はモデリングツールを使用することにより、同等の相互作用を生じる別の適切な位置まで断片を成長させることができる。
【００９６】
上記のように、標的タンパク質の同じ領域において結合する２種以上の抗体が同定されている場合、同定された接触原子を、断片の成長に使用するために組み合わせることができる。この情報を使用して１種又は複数の新しい相互作用を断片に同時に組み込むことができ、又はそれらを反復的に生成することができる。ステップ（ｅ）において選択された化合物が、段階的に成長して、ステップ（ｂ）において同じ抗体又は異なる抗体から同定された別の接触原子と相互作用し得るように、ステップ（ｆ）〜（ｈ）は反復性であってよいことを理解されたい。同様にステップ（ｉ）は、この、ステップ（ｈ）において選択された候補化合物に対する反復性のさらなる改善の概念を包含する。
【００９７】
一連の新しい化合物を生成することができ、次いでこれらを標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は標的タンパク質への改善された結合性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力についてスクリーニングすることができる。これは、さらなる化学反応及び断片の成長の反復性ラウンドを伴ってよく、場合により、抗体結合構造の表示から同定された、標的タンパク質の接触原子との１つ又は複数の別の相互作用が組み込まれることを理解されたい。
【００９８】
したがって、一実施形態では、本発明は、標的タンパク質の活性を変化させる小分子化合物を生成するために使用することができる候補化合物又は候補化合物のライブラリーを生成する方法を提供する。
【００９９】
これらの方法を用いて生成された候補小分子化合物（単数又は複数）は、次いで、標的タンパク質の生物活性を変化させるその能力について、本明細書に記載の適切なスクリーニング方法を用いて試験することができる。そのような小分子化合物は、一般には＜６５０Ｄａのサイズであり、ペプチド模倣体ではない。
【０１００】
当該方法のステップ（ｆ）において生成された１種又は複数の候補化合物は、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は改善されたリガンド効率及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について、ステップ（ｇ）において試験される。上記のように、化合物断片の成長は、反復性であってよく、したがって、ステップ（ｆ）及び（ｇ）は、２回以上繰り返されてよい。したがって、ステップ（ｆ）において作製され、ステップ（ｇ）において試験された候補化合物は、薬物として使用するためにその化学構造をさらに変化させる必要がない、標的タンパク質の活性を変化させる小分子化合物になる可能性を有する。或いは、ステップ（ｆ）において作製され、ステップ（ｇ）において試験された候補化合物は、小分子化合物を生成するために、さらなる修飾、例えば、標的タンパク質の活性を調節する程度まで改善すること、及び／又は化合物をより薬らしくすることを必要とし得る。したがって、ステップ（ｈ）において選択された化合物は、本明細書において下記したように、薬物として使用するために必要な程度に標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物であり得る。或いは、ステップ（ｈ）において選択された化合物は、適切な小分子化合物を生成するためにさらなる化学反応及びスクリーニングが必要な候補化合物であり得る。したがって、本発明の方法のステップ（ｉ）において、さらなる化学反応は、場合により、ステップ（ｆ）及び（ｇ）を繰り返して、（ｈ）において選択された断片を、ステップ（ｂ）において同じ抗体又は異なる抗体から同定された１種又は複数の別の接触原子と相互作用するように成長させることにより、場合により、ステップ（ｈ）において選択された化合物に対して行われる。
【０１０１】
本発明による小分子化合物は、一般には６５０Ｄａ未満のサイズであり、ペプチドではない。一例では、本発明の小分子化合物は６００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、本発明の小分子化合物は５５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、本発明の小分子化合物は５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【０１０２】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、リピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ ｒｕｌｅ ｏｆ ｆｉｖｅ）（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、１９９７、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ、２３、３〜２５）の少なくとも１つに準拠し、全てに準拠することが好ましい。
【０１０３】
したがって、一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、５個以下の水素結合供与体（１つ又は複数の水素原子を伴う窒素原子又は酸素原子）を含有する。
【０１０４】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、１０個以下の水素結合受容体（窒素原子又は酸素原子）を含有する。
【０１０５】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、５未満のオクタノール／水分配係数ｌｏｇＰを有する。
【０１０６】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、以下の基準に対する３つ以上の違反を有さない：
５つ以下の水素結合供与体（１つ又は複数の水素原子を伴う窒素原子又は酸素原子）を含有する
１０個以下の水素結合受容体（窒素原子又は酸素原子）を含有する
５未満のオクタノール／水分配係数ｌｏｇＰを有する。
５００ダルトン未満の分子量
【０１０７】
組成物／治療用途
本発明の方法によって同定された化合物は、病的状況の治療及び／又は予防において有用であり得、本発明は、本発明の化合物を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１種又は複数と一緒に含む医薬組成物又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬品を製造するための本発明の化合物の使用が提供される。組成物は、通常、薬学的に許容される担体を標準的に含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含み得る。
【０１０８】
本発明は、標的タンパク質に媒介される又は標的タンパク質レベルの上昇に関連付けられる病的障害の治療又は予防において使用するための、本発明の方法によって作製される化合物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明の例
【実施例】
【０１１０】
ここで、本発明を例のみの目的で、以下を参照して記載する。
図１ａ 側鎖残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２及びＡｓｎ１（濃い灰色の球体及び棒）を持つ抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）並びに標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｂ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）及び標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｃ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）、標的タンパク質（白い分子表面）及び抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）
図１ｄ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｅ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ２で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｆ ＮＣＥ断片が成長してＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
図１ｇ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基、Ｔｙｒ２で定義されるフェノール基及びＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
【０１１１】
（例１）
抗体：標的複合体の構造
標的タンパク質（サイトカイン）を、標準のプロトコールを使用して細菌発現系において過剰発現させた（例えば、Ｂａｎｅｙｘ［１９９９］「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の発現（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、４１１〜４２１に記載されている）。簡単に述べると、標的遺伝子をコードするベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細菌（Ｏｒｉｇａｍｉ ｓｔｒａｉｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に導入し、形質転換した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えることによってタンパク質の発現を誘導し、誘導した１６〜２０時間後に細胞を回収した。細胞を再懸濁することによって標的タンパク質を抽出し、それらをｂａｓｉｃ Ｚ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）を通過させた。次いで遠心分離によって溶解物を透明にし、溶解物にＮｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ）２〜４ｍｌを加え、試料を４℃で２時間攪拌した。その後、Ｎｉ−ＮＴＡ ｂｅａｄｓを洗い流し、タンパク質を２５０〜５００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液に溶出させた。溶出した物質を、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌなどの適切なタンパク質緩衝液でゲル濾過することによってさらに精製した。
【０１１２】
標的サイトカインに結合する抗体を、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８１に記載の方法を用いて単離した。抗体は、ｐＭの親和性で標的サイトカインに結合し、そのサイトカインの生物活性を中和することができる。結晶構造解析において使用するために、抗体のＦａｂ断片をクローン化し、発現させ、精製した。
【０１１３】
抗体のＦａｂ断片を、標準のプロトコールを使用して一過性の哺乳動物細胞培養物において発現させた（例えば、Ａｒｉｃｅｓｃｕら［２００６］「真核生物の発現：構造プロテオミクスのための開発（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６２：１１１４〜１１２４に記載されている）。簡単に述べると、ヒト胎児の腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターＤＮＡでトランスフェクトした。ベクターは、発現された重鎖及び軽鎖が培地中に分泌されるように、ターゲティング配列を含有した。６日後、細胞を遠心分離によって培地から分離し、親和性クロマトグラフィー（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ｒｅｓｉｎ；ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＵＫ）とゲル濾過を組み合わせて用いることによってタンパク質を培地から精製した。
【０１１４】
化学量論的な量の抗体を標的タンパク質に加えることによって抗体：：標的複合体を生成し、その後４℃で２時間インキュベートし、その後ゲル濾過を使用して精製した。精製された抗体：：標的複合体を、結晶化に適したレベルまで濃縮した（この場合は８ｍｇ／ｍＬ）。Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｒｏｂｏｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／ＵＫ）を使用してシッティングドロップ（Ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）結晶化試験を設定した。本明細書に記載の標的タンパク質について、５〜１０日以内に、２００ｍＭの硫酸アンモニウム、１００ｍＭのＭＥ緩衝液（ｐＨ６．５）、２２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００のリザーバー溶液と平衡した、４ｍｇ／ｍｌの精製された抗体：：標的複合体、１００ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００を含有するシッティングドロップ８００ｎｌ中に回折品質結晶が成長した。結晶を８０％のリザーバーと２０％のグリセロールを含有する溶液中で凍結保護し、液体窒素、１００Ｋで急速冷凍した。
【０１１５】
回折データをＤｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｉｄｃｏｔ／ＵＫ）ｂｅａｍｌｉｎｅ Ｉ０２で収集し、コンピュータプログラムＭＯＳＦＬＭを使用して加工した（Ｌｅｓｌｉｅ［１９９９］「高分子の回折データの統合（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ５５：１６９６〜１７０２）。抗体：：標的複合体の結晶構造を、標的タンパク質の既知構造及び抗体をプログラムＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙら［２００７］「Ｐｈａｓｅｒ結晶学的ソフトウェア（Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ４０：６５８〜６７４）の検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。分子置換溶液を、プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ［２００４］「Ｃｏｏｔ：分子グラフィックのためのモデル構築ツール（Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６０：２１２６〜２１３２）を使用して再構築し、プログラムＣＣＰ４ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４［１９９４］「ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：タンパク質結晶構造解析のためのプログラム（Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ５０：７６０〜７６３）を使用して精製した。
【０１１６】
結晶構造を解析することにより、抗体が標的タンパク質のどこに結合したかが明らかになり、抗体結合部位内の接触原子対、すなわち、抗体結合部位内の標的タンパク質の原子と抗体の原子が同定された。
【０１１７】
標的：：断片複合体の構造
上記の通り、標的タンパク質を発現させ、精製し、結晶化した。
小分子断片のライブラリーを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００に基づいたスクリーニング方法で標的サイトカインへの特異的な結合についてスクリーニングすることによってＮＣＥ断片を得た。標的サイトカインを、溶液相からの結合しているＮＣＥ断片と一緒にチップの表面に結合させた。断片の結合は、再生ステップを必要としないために十分に弱かった。このアッセイ形式において、この特異的な断片についての典型的な結合の方形波プロファイルを得た。同定された断片は、４００μＭの結合親和性を有した。
【０１１８】
標的タンパク質を、アポ型に結晶化し、続いてその結晶を、断片を含有する緩衝溶液に浸漬した。回折データをＳｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｖｉｌｌｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で収集し、プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥ（Ｋａｂｓｃｈ［１９９３］「最初未知の対称及びセル定数の結晶からの回転回折データの自動加工（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｕｎｋｎｏｗｎ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２６：７９５〜８００）を使用して加工した。標的：：断片複合体の構造を、標的タンパク質の既知構造を検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。分子置換溶液を、プログラムＣＯＯＴを使用して再構築し、プログラムＣＣＰ４ ｐｒｏｇｒａｍを使用して精製した。
【０１１９】
抗体誘導性の断片の成長を例示している方法
本例では、高い親和性のＦａｂ断片、中和抗体及び標的サイトカインの複合体の第１の結晶構造を得、抗体結合部位と同じ標的サイトカインに同じ付近で結合する小分子断片の第２の結晶構造を得た。
【０１２０】
抗体を、選択リンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄ）に従って生成し、その標的との相互作用の親和性を確証するためのＢｉａｃｏｒｅによって、及び機能修飾特性を確証するためのバイオアッセイにおいて、スクリーニングした。抗体は、ｐＭの親和性を有する標的サイトカインに結合し、そのサイトカインの生物活性を中和することができた。抗体のＦａｂ断片をクローン化し、発現させ、精製して結晶構造解析を補助した。
【０１２１】
小分子断片のライブラリーから、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００に基づいたスクリーニング方法で標的サイトカインへの特異的な結合が実証されたＮＣＥ断片を得た。標的サイトカインを溶液相からの結合しているＮＣＥ断片と一緒にチップの表面に結合させた。断片の結合は、再生ステップを必要としないために十分に弱かった。このアッセイ形式において、この特異的な断片についての典型的な結合の方形波プロファイルを得た。同定された断片は、標的サイトカインに対して４００μＭの結合親和性及び２０５の分子量を有した。
【０１２２】
予想通り、抗体は、断片と比較して、いくつもの付加的な原子を使って抗原と接触し、特異的且つ誘導性の様式で断片を成長させる機会を与えて抗体−検証された接触原子及びそれらの標的サイトカインの表面に対する三次元空間における場所及び小分子断片に対する三次元空間における場所を生かしている。
【０１２３】
抗体のＦａｂ断片と標的サイトカインとの間のそのような相互作用の１つは、抗体のＣＤＲ３重鎖の第１のチロシン(Ｔｙｒ１)とタンパク質標的のトリプトファン残基との間にあり、エッジ−表面（ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）パイ−パイスタッキング相互作用を形成している。抗体のＦａｂ断片と標的サイトカインとの間の別の相互作用は、抗体のＦａｂ断片のＣＤＲ２重鎖領域のアスパラギン（Ａｓｎ１）とタンパク質標的のアルギニン残基との間の水素結合である。別の相互作用は、抗体のＣＤＲ２重鎖領域の第２のチロシン(Ｔｙｒ２)とタンパク質標的のアルギニンとの間にあり、陽イオン−パイ接触を形成する。ＮＣＥ断片は、これらの相互作用の４Å以内の部位に結合するが、これらの場所における適切な構造を欠いているので、３つの特異的な接触を生かすことができない。
【０１２４】
断片の中心に対して適切な場所における抗体の相互作用を模倣する構造モチーフを特色とする第１の断片の類似体を、さらなる分析のために優先的に選択することができる。そのような類似体として、Ｔｙｒ１若しくはＴｙｒ２を模倣するためのフェノール環又はＡｓｎ１を模倣するための一級アミドを挙げることができるが、これらに限定されない。或いは、抗体からのこれらの相互作用を適切な場所で模倣している構造を持つ新しい化合物を特異的に合成することができる。図１は、この様式でどのように断片が成長し得るか、及び新しい断片がどのように抗体のＦａｂ断片残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２又はＡｓｎ１で観察される類似の相互作用を通して結合が増強したことを実証することが予想され得るかを示している。
【０１２５】
図１ａ 側鎖残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２及びＡｓｎ１（濃い灰色の球体及び棒）を持つ抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）並びに標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｂ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）及び標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｃ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）、標的タンパク質（白い分子表面）及び抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）
図１ｄ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｅ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ２で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｆ ＮＣＥ断片が成長してＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
図１ｇ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基、Ｔｙｒ２で定義されるフェノール基及びＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
【０１２６】
抗体がすでに、付加的な化学物質と、現存する断片に対するその場所の両方について検証されたので、化合物断片を成長させることによって生成された新しい候補断片は、市販の類似体からの無作為な置換による、又は無作為な選択による成長と比較して親和性及び／又は効力が増加している確率が高いことが予想され得る。
【０１２７】
結合の増加又は効力の増加の確認は、適切なアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＲＥＴスクリーニングによって、又は適切な細胞に基づくアッセイにおいて得られ得る。
【０１２８】
断片を成長させるための新しい機会及び付随する効力の増加を探求することができるように、合成された断片の新しい結晶構造を得、抗体−標的複導体の構造と比較するという点において当該方法は反復性であることが予測される。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【図１（ｄ）】
【図１（ｅ）】
【図１（ｆ）】
【図１（ｇ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物候補の合成中に小分子断片の成長を導くことに寄与するように抗体−タンパク質標的相互作用から得られる接触残基情報を使用することを含む、創薬のための改良された方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、リード最適化中に小分子断片の成長を誘導し、それにより標的タンパク質の生物活性を変化させ得る小分子化合物を生成するための、抗体−タンパク質相互作用から得られる原子構造情報の使用に関する。本発明は、同定された化合物の治療上の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
小分子断片又は化合物断片のスクリーニングは、製薬業界において化学的なヒットを生成する手段として急速に承認を得た。断片に基づいた創薬は、効力単独ではなく結合効率に焦点が合わせられ、断片自体は新規薬物を開発するための最初の構成要素として使用され得る。同様に、それらの断片のサイズが小さいので、標的タンパク質に結合する化合物を同定するために、大きい化合物のライブラリーと比較して化合物の小ライブラリーをスクリーニングする必要がある。一般には、いったん標的タンパク質に結合する断片が同定されると、結晶学的な試験から、断片がそのタンパク質のどこに結合するかについての構造情報が得られる。この情報を使用することにより、隣接部位に結合している断片を鋳型にさらに結合させることができる、又は高分子量の構造を、例えば活性部位の他のポケット内に成長させるための開始点として、個々の断片を使用することができる（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１、４５〜５４を参照されたい）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
化合物断片の成長は、現在、標的タンパク質についての入手可能な構造情報の量に制限されている。そのような構造情報は、例えば、リガンド、受容体及び／又は小分子阻害物質の存在下又は非存在下における標的タンパク質の活性部位又は受容体結合部位を含み得る。この構造情報により、標的断片を成長させるための標的タンパク質の適切な領域に対する有用な指針がもたらされ得るが、断片の成長が導かれ得る事前検証された部位又は接触原子は必ずしももたらされない。したがって、化合物断片の成長は、本質的に試行錯誤の行き当たりばったりのプロセスである。
【０００５】
したがって、化合物断片を成長させるための改良された方法を提供することが当技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
抗体は、抗原結合特異性及び高い親和性が付与された非常に有用な治療剤である。所与のタンパク質標的に対して、標的タンパク質に結合する機能修飾抗体を得ることが可能であり、各抗体はそのタンパク質の異なる部位において結合する可能性がある。今まで、抗体の構造を模倣するペプチド模倣薬を設計するために抗体の結合についての構造情報が使用されてきた（例えば、Ｐａｒｋら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１８、１９４〜１９８；Ｃａｓｓｅｔら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３０７、１９８〜２０５を参照されたい）。本発明では、機能修飾抗体がどこに、どのように標的タンパク質に結合するかについての構造情報を使用して、化合物断片の成長を誘導するために使用することができる、標的タンパク質と抗体の両方の事前検証された接触原子をもたらし、したがって抗体誘導性の断片成長によって生成された化合物が標的タンパク質の活性の有効なモジュレーターになる可能性を増大させる。さらに、抗体接触情報を使用することにより、化合物の合成が、このタンパク質の新しい、これまで未開拓の部位に対して導かれ得る。
【０００７】
一例では、本発明は、標的タンパク質の活性を変化させ得る小分子化合物を生成する方法であって、
（ａ）標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる１種又は複数の抗体又はその断片を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抗体の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成し、相互作用し、抗体の結合部位内にある、標的タンパク質と抗体の１種又は複数の接触原子対を同定するステップと、
（ｃ）標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた断片のうちの１種又は複数の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で標的タンパク質に結合する化合物断片を選択するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を、場合により、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された抗体の接触原子のうちの１種又は複数と同じ化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことによって成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）において作製された候補化合物のうちの１種又は複数を、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について試験するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）において試験された候補化合物が、標的タンパク質の活性を調節する又は改善された結合性親和性若しくはリガンド効率を有する場合に、それを選択するステップと、
（ｉ）場合により、ステップ（ｈ）において同定された候補化合物を使用してさらに化学反応及びスクリーニングを行って、標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物を生成するステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
ステップ（ａ）〜（ｄ）を正確にその順序通りに行う必要はないことを理解されたい。一例では、ステップ（ａ）及び（ｃ）をステップ（ｂ）及び（ｄ）の前に行うことができる。一例では、ステップ（ａ）、（ｃ）及び（ｄ）をステップ（ｂ）の前に行うことができる。一例では、ステップ（ｃ）及び（ｄ）をステップ（ａ）及び（ｂ）の前に行うことができる。ある特定のステップを必要に応じて順次又は平行して行うことができることも理解されたい。例えば、ステップ（ａ）及び（ｃ）を平行して行い、ステップ（ａ）及び（ｃ）の後にステップ（ｂ）及び（ｄ）も平行して行うことができる。
【０００９】
標的タンパク質
本発明の標的タンパク質は、別の分子の結合による影響を受けやすい任意の種類のタンパク質又はポリペプチドであってよい。標的の典型的なカテゴリーとして、酵素、サイトカイン、受容体、トランスポーター及びチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、疾患の始まり、発生又は成立において機能を有することが公知である。本発明では、望ましい様式で標的タンパク質の活性を調節する、例えば、標的タンパク質の活性を阻害する又は標的タンパク質の活性を刺激する抗体及び化合物を同定する。
【００１０】
本発明において使用するための標的ポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド又は生物活性断片又はその誘導体であってよい。標的ポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で周知のプロセスによって調製することができる、又は天然の生物学的供給源から回収することができる。本出願では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、他に特に指定がなければ、互換的に使用される。標的ポリペプチドは、一部の例では、融合タンパク質、例えば親和性タグに融合したタンパク質などの大きなタンパク質の一部であり得る。一部の例では、標的タンパク質は細胞の表面で自然に発現し得、細胞表面発現タンパク質を組換え細胞又は天然に存在する細胞集団のいずれかとして使用することができる。
【００１１】
本発明の方法において使用される標的タンパク質の正確な性質は、当該方法の異なる段階において変動し得、例えば、標的タンパク質の断片又はドメイン又は突然変異体を、ある特定のスクリーニング方法又は構造の表示において必要に応じて使用できることを理解されたい。一部の例では、これらには生物活性がなくてよい。
【００１２】
各標的タンパク質の活性を決定するための適切なスクリーニング方法は、当技術分野で公知であり得、又は実験的に考案され得る。したがって、そのようなスクリーニング方法により、標的タンパク質の活性に対する抗体又は候補化合物の効果を決定することが可能になる。そのようなスクリーニング方法として、例えば、受容体／リガンド相互作用を検出するシグナル伝達アッセイ、又は酵素活性アッセイが挙げられる。各スクリーニング方法は、標的タンパク質の性質に左右されること、及び２種以上のスクリーニング方法を使用してよいことを理解されたい。
【００１３】
本発明の方法では、候補化合物、化合物断片又は抗体を、それぞれ、標的タンパク質の生物活性に対するその影響について試験することができる。例えば、標的タンパク質に結合する同定された抗体及び化合物を、標準のスクリーニング形式によって、化合物又は抗体の阻害活性又は刺激活性を決定するための生物学的アッセイに導入することができ、又はその代わりに又はそれに加えて、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅなどの結合又は遮断を決定するための結合アッセイが適切であり得る。
【００１４】
本発明の方法で作製される抗体の例として、中和抗体、拮抗性抗体又は作動性抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。一例では、したがって、当該方法のステップ（ａ）において同定された抗体は、標的タンパク質の生物活性に対する中和、拮抗又は作動によって標的タンパク質の生物活性を変化させる。一例では、したがって、当該方法のステップ（ａ）において同定された抗体は、標的タンパク質の生物活性を刺激又は阻害することによって標的タンパク質の生物活性を変化させる。一例では、抗体は、所与のタンパク質のシグナル伝達活性などの生物活性を、例えば、標的タンパク質受容体のうちの１種又は複数に対する標的タンパク質の結合を遮断することによって中和することができる抗体である「中和抗体」であってよい。そのような例では、本発明の方法によって生成された小分子化合物も同様に、標的タンパク質受容体のうちの１種又は複数に対する標的タンパク質の結合を遮断し、そのタンパク質の生物活性を中和し得る。標的タンパク質の活性に関連して本明細書で使用する「調節する」及び「変化させる」という用語は、互換的に使用される。
【００１５】
抗体
本発明において使用するための機能修飾抗体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。当該方法のステップ（ａ）において得られた機能修飾抗体は、本明細書において下記されている方法のうちの１種又は複数を用いて生成されることが好ましい。
【００１６】
標的ポリペプチド又は標的ポリペプチドを発現している細胞を使用して、標的ポリペプチドを特異的に認識する抗体を作製することができる。動物の免疫化が必要である場合、周知の及び通例のプロトコールを用いてポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に投与することによって、標的ポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、Ｖｏｌ４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ブタ又はラクダ科の動物（例えば、ラクダ、ラマ）などの多くの温血動物を免疫化することができる。
【００１７】
本発明において使用するための抗体として、任意の適切なクラスの全抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４などのサブクラス及びその機能的に活性な断片又は誘導体を挙げることができ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体であってよい。
【００１８】
したがって、本発明において使用するための抗体は、全長の重鎖及び軽鎖又はその断片を有する完全な抗体分子を含んでよく、これらに限定されないが、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ Ｖドメインなど）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及び上記のいずれかのエピトープ結合性断片であってよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９〜２１７を参照されたい）。これらの抗体断片を作出及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照されたい）。本発明において使用するための他の抗体断片として、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載のＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が挙げられる。多価抗体は、多特異性、例えば二重特異性を含んでよく、又は単一特異性であってよい（例えば、ＷＯ ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。
【００１９】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、生体適合性のフレームワーク構造に組み込まれた１種又は複数のＣＤＲを含む結合剤も含み得る。一例では、生体適合性のフレームワーク構造は、局所表面領域内の抗原に結合する１種又は複数のアミノ酸配列（例えばＣＤＲ、可変領域など）を提示することができる立体構造的に安定な、構造的な支持体又はフレームワーク又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその一部分を含む。そのような構造は、天然に存在するポリペプチド又はポリペプチドの「折りたたみ」（構造モチーフ）であってよく、又は天然に存在するポリペプチド又は折りたたみと比較して、アミノ酸の追加、欠失又は置換などの１つ又は複数の修飾を有してよい。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種（又は２つ以上の種）のポリペプチドに由来してよい。
【００２０】
一般には、生体適合性のフレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質の足場又は骨格に基づいている。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメイン及びテンドラミサト（ｔｅｎｄｒａｍｉｓａｔ）ドメインに基づくものを使用することができる（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ及びＵｈｌｅｎ、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、４６３〜４６９を参照されたい）。
【００２１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ダルピン（Ｄａｒｐｉｎ）、フィロマー（Ｐｈｙｌｏｍｅｒ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、アプタマー、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）、微小体、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）及びＫｕｎｉｔｚドメインを含めた、生物学的足場に基づく結合剤も含み得る。
【００２２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができる。
【００２３】
本発明において使用するための抗体は、単一リンパ球抗体法を用いて、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７に記載の方法によって特異的な抗体を作製するために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによって生成することもできる。
【００２４】
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種からの１種又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えばＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなく、ＣＤＲの特異性決定残基だけを移行する必要があり得ることを理解されたい（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲを得た非ヒト種に由来する１種又は複数のフレームワーク残基をさらに含んでよい。
【００２５】
キメラ抗体は、軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。
【００２６】
本発明において使用するための抗体は、当技術分野で公知の、及びＢｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ、１９９７ １８７ ９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１〜２８０）及びＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に記載のものを含めた種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。
【００２７】
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト由来である又は実質的にヒト由来の配列と同一であり、それらが必ずしも同じ抗体からのものではない抗体である。完全ヒト抗体の例として、例えば上記のファージディスプレイ法によって作製された抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子及び定常領域遺伝子が、例えば、ＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１及びＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般用語で記載のそれらのヒト対応物と交換されたマウスによって産生された抗体を挙げることができる。
【００２８】
一例では、本発明において使用するための抗体は、ラクダ又はラマなどのラクダ科の動物に由来してよい。ラクダ科の動物は、重鎖抗体と称される軽鎖を欠く抗体の機能クラスを持つ（Ｈａｍｅｒｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４４６〜４４８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６、２３０〜２３５）。これらの重鎖抗体の抗原結合部位は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨＨ）によってもたらされる３つの超可変ループ（Ｈ１〜Ｈ３）に限定されている。ＶＨＨの第１の結晶構造により、Ｈ１ループ及びＨ２ループは従来の抗体に対して定義された公知の正準構造クラスに制限されないことが明らかになった（Ｄｅｃａｎｎｉｅｒｅら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３００、８３〜９１）。ＶＨＨのＨ３ループは、従来の抗体のものよりも平均して長い（Ｎｇｕｙｅｎら、２００１、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９、２６１〜２９６）。ヒトコブラクダ重鎖抗体の大部分は、その抗体が生じた対象である酵素の活性部位に結合しやすい（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ、１７、３５１２〜３５２０）。一例では、Ｈ３ループは、残りのパラトープから突出し、ニワトリ卵白リゾチームの活性部位に挿入されることが示された（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、１９９６、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３、８０３〜８１１）。したがって、多くの場合従来の抗体はタンパク質表面の間隙を避けるが、ラクダ科の動物の重鎖抗体は、Ｈ３ループによって形成されるＶＨＨの緻密な扁長形状に主に起因して、酵素活性部位に入ることができることが実証されている（Ｄｅ Ｇｅｎｓｔら、２００６、ＰＮＡＳ、１０３、１２、４５８６〜４５９１及びＷＯ９７０４９８０５）。
【００２９】
これらのループは他の足場及びこれらの足場に作製されたＣＤＲライブラリーにおいて提示され得ることが示唆されている（例えば、ＷＯ０３０５０５３１及びＷＯ９７０４９８０５を参照されたい）。したがって、本明細書の上部において詳述したように、そのようなループ及びＣＤＲを含有する足場を本発明において使用することができる。
【００３０】
一例では、本発明において使用するための抗体は、サメなどの軟骨魚類に由来してよい。軟骨魚類(サメ、ガンギエイ、エイ及びキメラ)は、ＩｇＮＡＲとして公知の非定型的な免疫グロブリンアイソタイプを持つ。ＩｇＮＡＲは軽鎖を伴わないＨ鎖ホモ二量体である。各Ｈ鎖は１つの可変ドメインと５つの定常ドメインを有する。ＩｇＮＡＲ Ｖドメイン（又はＶ−ＮＡＲドメイン）は２つの密接に関連するサブタイプ、Ｉ及びＩＩに分類できるいくつもの非正準システインを担持する。ＩＩ型Ｖ領域は、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３に、ラクダ科の動物ＶＨＨドメインにおいて観察されるドメイン限定ジスルフィド結合と類似したドメイン限定ジスルフィド結合を形成することが提唱されている付加的なシステインを有する。そこでＣＤＲ３はより広がった立体構造をとり、ラクダ科の動物のＶＨＨと類似した抗体フレームワークから突出すると思われる。実際に、上記のＶＨＨドメインと同様に、ある特定のＩｇＮＡＲ ＣＤＲ３残基についても、ニワトリ卵白リゾチーム活性部位に結合できることが実証されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄら、２００４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５、１７７０〜１７７３）。
【００３１】
ＶＨＨ及びＩｇＮＡＲ Ｖドメインを作製する方法の例は、例えば、Ｌａｕｗｅｒｅｙｓら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８、１７（１３）、３５１２〜２０；Ｌｉｕら、２００７、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７、７８；Ｓａｅｒｅｎｓら、２００４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（５）、５１９６５〜７２に記載されている。
【００３２】
標的タンパク質の間隙に結合する突出ＣＤＲを持つある特定のＶＨＨ、ＩｇＮＡＲ及び他のそのような抗体ドメイン及び構造の能力を考えると、一例では、これらの抗体は、本発明において使用するために好ましい抗体である。同様に、これらのＣＤＲの凸状性を考えると、標的タンパク質の結合部位は多くの場合、比較的小さく集中的であり、近接して位置している接触原子のクラスターを同定するためのこれらの有用な抗体を、化合物断片の成長において使用するために適切なものにしている。したがって一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＶＨＨドメイン抗体又はそれに由来する１種又は複数のＣＤＲなどのＶＨＨ抗体又はそのエピトープ結合断片である。一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＩｇＮＡＲ Ｖドメイン又はＶ−ＮＡＲドメイン又はそれに由来する１種又は複数のＣＤＲなどのＩｇＮＡＲ抗体又はそのエピトープ結合断片である。一実施形態では、本発明において使用するための抗体は、ＶＨＨドメイン抗体又はＩｇＮＡＲ抗体に由来するＣＤＲ３を含む、ＣＤＲ３含有抗体又はＣＤＲ３含有足場タンパク質である。一般には、そのような抗体又は足場は、１０アミノ酸を超える長さのＣＤＲ３領域を含有する。一例では、ＣＤＲ３領域は、２０アミノ酸を超える長さである。一例では、ＣＤＲ３領域は、最大３０アミノ酸の長さである。一例では、ＣＤＲ３領域は、２０〜３０アミノ酸の長さである。
【００３３】
本発明において使用される機能修飾抗体分子は、標的タンパク質に対して、好ましくはナノモル又はピコモルの高い結合親和性を有することが好ましい。一例では、本発明において使用される中和抗体分子は、標的タンパク質に対して、好ましくはナノモル又はピコモルの高い結合親和性を有することが好ましい。親和性は、天然又は組換えの標的タンパク質を使用するＢＩＡｃｏｒｅを含めた当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約１０ｎＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約１ｎＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約５００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一例では、本発明において使用するための抗体分子は、約２００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、本発明において使用するための抗体分子は、約５０ｐＭ以上の結合親和性を有する。本発明の方法で生成された抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて変化させることができることを理解されたい。そのような変異型は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）及びセクシャルＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含めたいくつもの親和性突然変異プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、これらの親和性突然変異の方法を考察している。
【００３４】
本発明では、本明細書において上記した適切なスクリーニング方法を用いて決定されたように、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の活性を望ましい様式で変化させる１種又は複数の抗体が得られる。一実施形態では、１種の抗体又はその断片が本発明の方法で生成される。一実施形態では、標的タンパク質に結合する２種の抗体又はその断片が作製される。一実施形態では、標的タンパク質に結合する３種の抗体又はその断片が作製される。一実施形態では、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる３種以上の抗体又はその断片のパネルが作製される。そのような抗体のパネルは３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種又は１０種又はそれ以上の抗体を含んでよいことを理解されたい。抗体のそれぞれが、標的タンパク質の活性を同程度又は異なる程度に調節し得ること、及びそれらは標的タンパク質の同じ位置、類似した位置、重複した位置又は異なる位置において結合し得ることも理解されたい。さらに、抗体のそれぞれは、同じ手段又は異なる手段によって生成することができ、例えばそれらは同種又は異なる種から得ることができ、且つ／又は、例えばヒト化又はキメラなど同じ種類又は異なる種類の抗体であってよく、且つ／又は、それらは例えばＶＨＨ又はＩｇＮＡＲドメインなど、異なる形式であってよい。別の例では、単一の親抗体から、例えば突然変異誘発によって２種以上の抗体を得ることができ、したがって、異なる位置で標的タンパク質に結合し、且つ／又は異なる親和性を持ち、且つ／又は標的タンパク質の活性を調節するさまざまな能力を持つ３種以上の関連する抗体のパネルが生成される。さらに、そのような突然変異誘発は、抗体及び標的タンパク質の両方の決定的な残基／接触原子の同定を可能にすることにより、抗体の接触原子の検証を助け、且つ／又はファルマコフォア部位に優先順位を付けるために、アラニンスキャニングなどの方法によって抗体のパネルを生成するために使用することができる。したがって、一実施形態では、当該方法のステップ（ａ）において得られる少なくとも１つの抗体は、当該方法のステップ（ａ）において得られる別の抗体の突然変異誘発によって生成される。
【００３５】
抗体：標的の３Ｄ構造の表示
本発明では、本明細書に記載の適切なスクリーニング方法を用いて決定されたように、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を望ましい様式で変化させる（例えば阻害活性又は刺激活性）１種又は複数の抗体が得られる。その後、抗体がどこで標的タンパク質に結合しているか、及び標的タンパク質及び抗体のどのアミノ酸残基、したがってどの原子が互いに接触している又は相互作用するかについての情報を得るために、標的タンパク質と複合した少なくとも１つのそのような抗体の三次元構造の表示を生成する。標的タンパク質に結合し、その活性を調節する２種以上の抗体が得られた場合、標的タンパク質と複合した抗体のそれぞれについて構造情報を得ることが好ましい。ステップ（ａ）及び（ｂ）は反復性であってよいこと、及び別の抗体を得る前に、各抗体の標的タンパク質と関連付けた３Ｄ構造を生成してよいことを理解されたい。
【００３６】
当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて抗体：標的タンパク質複合体の三次元構造の表示を生成することができる。そのような方法の例として、ＮＭＲ及びＸ線結晶構造解析が挙げられる。Ｘ線結晶構造解析を使用することが好ましい。本明細書において上記したように、標的タンパク質は成熟タンパク質又はその適切な断片又は誘導体であってよい。
【００３７】
Ｘ線結晶は、一般には、抗体又は抗体断片と複合した野生型又は突然変異型の標的タンパク質に対応する結晶化したポリペプチド複合体を含み、ここで抗体断片は、例えば本明細書において上記した抗体ＶＨＨドメイン、ＩｇＮＡＲドメイン、ｄＡｂ断片、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片である。そのような結晶として、結晶化したタンパク質：抗体断片複合体が実質的に純粋であるネイティブな結晶、及び結晶化したタンパク質：抗体断片複合体が、これらに限定されないが、阻害物質、拮抗物質、抗体又は１種又は複数の受容体を含めた１種又は複数の付加的な化合物を伴うポリ結晶が挙げられる。
【００３８】
作製された結晶は、結晶化ポリペプチド（単数又は複数）の三次元Ｘ線回折構造を、高解析度、好ましくは約３Å超、一般には約１Å〜約３Åの範囲の解析度で決定可能にするのに十分な質であることが好ましい。一般に、結晶は、実質的に純粋なポリペプチド複合体を、ポリペプチド複合体を沈殿させるために必要な濃度をちょうど下回る濃度で沈殿剤を含む水性緩衝液に溶解させることによって成長させる。次いで水を制御蒸発によって除去して沈殿条件を生じ、これを結晶成長が終わるまで維持する。上記の方法に従って調製されたネイティブな結晶を、所望の複合体のポリ結晶に添加する化合物を含む溶剤に浸漬することによってポリ結晶を調製する。或いは、ポリ結晶は、ポリペプチド複合体を上記の方法による化合物の存在下で共結晶化することによって調製することができる。
【００３９】
得られた三次元構造情報は、一般には、結晶化したポリペプチド複合体又はポリ複合体の原子構造座標、又は、その一部分、例えば、抗体結合部位又は中和エピトープなどの原子構造座標を含むが、原子構造座標のベクトル表示などの他の構造情報を含み得る。
【００４０】
抗体−標的タンパク質複合体に関する三次元構造情報は、原子構造座標を含むことが好ましい。構造情報は、抗体が結合した標的タンパク質の結合部位の全て又は一部を含むことが好ましい。
【００４１】
本発明では、三次元構造情報を使用して、当技術分野で公知の適切なモデル及びコンピュータプログラムを用いて（例えば、ＣＣＰ４ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４（１９９４）、Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ；Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ、Ｄ５０、７６０〜７６３を参照されたい）標的タンパク質と複合した抗体の三次元表示を生成する。次いでこの３Ｄ表示を使用して、標的タンパク質の抗体結合部位（単数又は複数）内にある、標的タンパク質及び抗体の１種又は複数の接触残基又は接触原子を同定する。抗体結合部位において互いに接触している又は相互作用する、標的タンパク質の各原子と抗体の各原子を同定して、抗体−標的タンパク質の原子対を同定する。２種以上の抗体−標的タンパク質複合体の構造が生成される場合、そのときは、各抗体の結合部位において１種又は複数の原子、好ましくは１種又は複数の原子対を同定する。一般には、各抗体の結合部位の各原子対を同定する。
【００４２】
一般には、本発明の抗体結合部位は、本発明の方法で同定された抗体と接触している又は相互作用する標的タンパク質の残基又は原子１種又は複数、及び標的タンパク質とそれらの接触又は相互作用を生じる抗体の１種又は複数の残基又は原子とを含む。
【００４３】
一例では、抗体の結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、可変領域及び定常領域を含めた抗体の任意の一部と接触している又は相互作用する原子であり、これらの領域内の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含む。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体の可変領域と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域内の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、ＣＤＲ及び可変領域フレームワークの任意の一部のいずれか１つと接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、軽鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、重鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲのうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの１つ又は複数の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位内にある標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体重鎖ＣＤＲ３の任意の一部と接触している又は相互作用する原子である。一例では、結合部位における標的タンパク質の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨドメインのＣＤＲ３と接触している原子である。
【００４４】
一例では、抗体の結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、標的タンパク質の任意の一部と相互作用する又は接触している接触原子である。したがって、結合部位内にある抗体の接触原子は、一般には可変領域及び／又は定常領域の内部にあり、これらの領域内の任意の側鎖原子及び主鎖原子を含む。一例では、結合部位における抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触している又は相互作用する抗体の可変領域内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体の軽鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体の重鎖のフレームワーク１、２、３又は４のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、抗体の接触原子は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域内の側鎖原子及び主鎖原子を含めた、ＣＤＲ及び可変領域フレームワークの任意の一部のいずれか１つ内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲのうち１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの１つ又は複数の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体のＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３の任意の一部内の原子である。一例では、結合部位内にある抗体の接触原子は、標的タンパク質と接触する又は相互作用する抗体重鎖ＣＤＲ３の任意の一部内の原子である。一例では、抗体の結合部位内にある抗体の接触原子は、抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨドメインのＣＤＲ３内の原子である。
【００４５】
例えば、抗体及び標的タンパク質の異なる部分間の２つ以上の相互作用がある場合、抗体と接触している又は相互作用している標的タンパク質の残基又は原子の結合部位又はクラスターが２つ以上あることを理解されたい。したがって、一例では、いったん各抗体−標的タンパク質複合体の３Ｄ構造の表示が生成されたら、抗体結合部位を目視検査によって決定し、選択することができる。例えば、標的タンパク質の構造的特徴及び／又は標的タンパク質のトポグラフィー及び／又はこれらの部位が新薬の開発につながると考えられるかどうかによって、適切な抗体結合部位を同定することができる。例えば、抗体が標的タンパク質の天然に存在する溝又は間隙に結合する場合、又は抗体が結合した結果そのような溝又は間隙が生成される場合、そのような部位が好ましいことがある。実際に、これらの部位は、例えば受容体又はリガンド結合のための部位としてすでに公知であり得る。或いは、抗体が結合することによってこれまで未知の機能修飾部位が初めて明らかになる可能性があり、これらの部位が好ましいことがある。一例では、結合部位は抗体のＣＤＲＨ３、例えばＶＨＨ抗体のＤＲＨ３と接触している部位であると考えられ得る。場合によって、２箇所以上の部位が選択され得ることを理解されたい。
【００４６】
標的タンパク質に結合する抗体が２種以上得られた場合、これらの抗体のそれぞれの結合部位からもたらされた構造情報集団を「プール」して１種又は複数の抗体結合部位を選択するために役立たせることができることも理解されたい。例えば、機能修飾抗体がある特定の位置で頻繁に結合する場合、その結合部位が優先的に選択され得る。２種以上の抗体−標的タンパク質複合体３Ｄ構造が決定された場合、この情報を組み合わせて、本発明において使用することができる標的タンパク質及び／又は抗体の抗体結合部位、したがって原子の選択を補助することができる。例えば、抗体の大部分が標的タンパク質の特定の領域において結合する場合、その領域内で頻繁に起こる相互作用が優先的に選択され得る。したがって、２種以上の抗体からの接触原子対、例えば、第１の抗体のＣＤＲＨ２からの接触原子対及び第２の抗体のＣＤＲＨ３からの接触原子対をステップ（ｂ）において同定することができ、ステップ（ｆ）において、そのような接触原子対を使用して化合物断片の成長を誘導する。
【００４７】
一例では、抗体結合部位において少なくとも１つの標的タンパク質の接触原子が同定される。一例では、抗体結合部位内にある少なくとも１つの抗体の接触原子が同定される。一例では、少なくとも１つの標的タンパク質の接触原子及びそれと相互作用する抗体の接触原子が同定される、すなわち、少なくとも１つの原子対が同定される。抗体と標的タンパク質原子との間の分子間相互作用は、一般には水素結合及びファンデルワールス非極性相互作用などの静電気的相互作用である。抗体結合部位内の全ての抗体−標的タンパク質接触原子対が同定されることが好ましい。
【００４８】
所与の結合部位、例えば標的タンパク質の結合部位及び抗体の結合部位において２つ以上の接触原子対が同定される場合、タンパク質の接触原子は、本明細書において下記したように、続く断片の成長において有用になるために、互いに適切な距離内にあることが好ましい。一例では、結合部位において同定された接触原子は、最短の非共有結合性の原子相互作用又は水素結合の距離、及び同じ結合部位内にあると考えられ得るタンパク質原子間の最長距離に基づいて、互いに適切な距離内、一般には約１Å〜約３０Åにあることが理想的である。同定されたタンパク質の接触原子について、実験的なタンパク質突然変異誘発試験又は分子力学自由エネルギー計算などのコンピュータを用いた方法によって優先順位を付けることができる［Ｍｏｒｅｉｒａら Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．２００７ Ｆｅｂ；２８（３）：６４４〜５４］。
【００４９】
化合物断片のスクリーニング
本発明の方法のステップ（ｃ）において、標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片が得られる。
【００５０】
本発明において使用するための化合物断片は、一般には６００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は５００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は４００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は３５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は３００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は２５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、化合物断片は２００Ｄａ未満の分子量を有する。そのような断片は、一般には小さく、単純な化合物であり、通常小数の置換基を持つわずか１つ又は２つの環からなる。
【００５１】
そのような化合物断片のライブラリーをスクリーニングすることにより、通常、少ない標的タンパク質との相互作用を介するのみ、したがって、これらは通常、低親和性相互作用ではあるが、標的タンパク質に非常に効率的に結合する小さい化合物断片を同定することが可能になる。これらの化合物断片ヒットは、より大きく、潜在的にはるかに効力があり、薬らしいリード化合物を形成するために、組み合わせる、例えば合併又は連結することができる構成要素とみなすことができる。或いは、これらのヒットは、標的タンパク質とのますます大きな相互作用を獲得しているリード化合物に合成的に発展させることができる「種」又は「アンカーポイント」であり得る。一例では、両方の手法を合わせて、スクリーニングするための次の化合物を生成することができる。
【００５２】
一般には、断片に基づくスクリーニングは、いくつもの化合物断片、一般には数千種の化合物をスクリーニングして高マイクロモルからミリモルまでの範囲内のＫｄ値を持つ親和性の低い断片を見出すことを伴う。断片に基づくスクリーニング方法の総説については、Ｈａｊｄｕｋ及びＧｒｅｅｒ、２００７、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．６（３）、２１１〜２１９を参照されたい。
【００５３】
適切な化合物断片ライブラリーは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて設計することができ、それによってライブラリーに含まれる化合物断片についての選択は、望ましい化学官能性又は望ましくない化学官能性及び溶解性、形状、柔軟性又は分光特性などの、ライブラリーに置かれ得る他の制約の存在又は非存在に基づき得る。さらに、その後の断片における化学反応に対する戦略も、ライブラリーの設計に影響を与え得る。断片ライブラリーの戦略についての総説は、Ｂａｕｒｉｎら、２００４、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ、４４、２１５７〜２１６６；Ｈｕｂｂａｒｄら、２００７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、１０、２８９〜２９７；Ｚａｒｔｉｅｒ及びＳｈａｐｉｒｏ、２００５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、９、３６６〜３７０に提供されている。
【００５４】
本発明の方法では、化合物断片を、標的タンパク質への結合について直接又は仮想的にのいずれかでスクリーニングする。結合情報は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて得ることができる。例えば、異なる手法の概要は、書籍「創薬における断片に基づく手法（Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）」（Ｊａｈｎｋｅ、Ｅｒｌａｎｓｏｎ、Ｍａｎｎｈｏｌｄ、Ｋｕｂｉｎｙｉ＆Ｆｏｌｋｅｒｓ（２００６）、Ｗｉｌｅｙより出版）及びＲｅｅｓ及び共同研究者らの総説（Ｒｅｅｓら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３、６６０〜６７２）に示されている。
【００５５】
化合物断片のタンパク質への結合を決定するために有用な実験方法として、下記の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質のＸ線結晶構造解析［Ｈａｒｔｓｈｏｒｎら（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８、４０３〜４１３］。タンパク質のＸ線結晶構造解析を用いた効率的な断片のスクリーニングには、標的タンパク質の予め形成された結晶を断片の反応混液に浸漬する必要がある。Ｘ線データを収集した後の反応混液からの断片の同定は、得られた電子密度を手動又は自動で分析することに依存する。これらの試験の結果は、どの断片がタンパク質標的に結合するか、及び活性部位における実際の結合の立体配置に関する情報である。実際の結合の強度又は親和性についての情報は得られない。
【００５６】
断片が対象の標的タンパク質に結合した結果としてのＮＭＲスペクトルの化学シフトを同定し、解釈することを伴う、ＮＭＲに基づくスクリーニング［Ｓｈｕｋｅｒら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１Ａ、１５３１〜１５３４］又はＮＭＲによる構造活性相関（ＳＡＲ）。結果は、タンパク質標的に結合する断片に関する情報である。一般には、実際の結合の強度又は親和性の情報は得られない。標的固定化ＮＭＲスクリーニングを使用することもできる（Ｖａｎｗｅｔｓｗｉｎｋｅｌら、２００５、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ、１２（２）：２０７〜２１６）。
【００５７】
断片の標的タンパク質への結合を安定化させるためにジスルフィド結合を使用すること［ＤｅＬａｎｏ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２、１４〜２０］。これは、タンパク質の表面にシステインと称される硫黄含有アミノ酸を置くことにより、硫黄含有断片の集団に対するタンパク質をスクリーニングするために実現される。システインの近くに結合する断片は、タンパク質とジスルフィド結合を形成し、タンパク質の重量を増加させ、質量分析によって断片を検出することが可能になる。結果は、タンパク質に結合する断片の一覧である。断片の結合強度に関する詳細な情報は得られない。
【００５８】
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ（ＵＳＡ）のアプリケーションノート［「分離すれば低下するか？ＩＴＣによるリガンドの低親和性実在分子種の研究（Ｄｉｖｉｄｅｄ ｗｅ ｆａｌｌ？ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＩＴＣ）」、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＬＬＣ、ＵＳＡ、２００５］に記載されている、断片−タンパク質の結合プロセスによる熱生成を測定し、エントロピー基準及びエンタルピー基準などの熱力学的パラメータに変換する、マイクロカロリメトリーに基づく断片のスクリーニング。この実験の結果は、結合断片のアイデンティティー、及び場合により、対応する結合親和性である。
【００５９】
親和性が低い断片の結合を測定するために適応されたｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイも記載されている［Ｂｏｅｈｍら（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３、２６６４〜２６７４］。これらの実験の結果は、特定のタンパク質標的に対して対応する結合親和性を持つ断片のセットである。
【００６０】
沈降分析は、断片／タンパク質相互作用を測定することが記載されている新規技術である［Ｌｅｂｏｗｉｔｚら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１１、２０６７〜２０７９］。沈降平衡により、溶液中の平衡状態での成分濃度が測定され、沈降平衡実験からの読み取り値は、吸光度対距離曲線である。これらの実験の結果は、特定のタンパク質標的に対して結合親和性を示す断片のアイデンティティーである。
【００６１】
固相検出は、一般用語では、バイオ受容体とシグナル伝達物質の両方を組み合わせて断片のタンパク質への結合を検出する、共通の作用原理を共有する幅広い技術を包含する。最もよく知られている固相検出法は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）であり、Ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって最初に記載され、実行された。このプロセスは、所有権を使用した化学マイクロアレイの高度に平行な生産、高度に定義された表面化学、続くＳＰＲイメージングによる１０，０００断片までのタンパク質相互作用の同時検出を伴う。相互作用のデータを物理化学的な化合物データと組み合わせてアレイの結果を解釈する。ＳＰＲの具体的な一例はＢＩＡｃｏｒｅ（商標）であり、これは断片のライブラリーをスクリーニングするために使用されている（Ｍｅｔｚら、２００３、Ｍｅｔｈ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、１９、２１３〜２３６及びＮｅｕｍａｎｎら、２００５、Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２、５９０〜５９４）。代替的な固相検出法として、Ａｋｕｂｉｏ Ｌｔｄ（ＵＫ）が商品化した破壊事象走査（ｒｕｐｔｕｒｅ ｅｖｅｎｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＲＥＶＳ）及び音響共鳴プロファイリング（ｒｅｓｏｎａｎｔ ａｃｏｕｓｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＲＡＰ）技術、反射干渉（ＲＩｆ）、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）、及びＣｏｎｃｅｎｔｒｉｓ ＧｍｂＨ（Ｓｕｉｓｓｅ）が商品化したマイクロカンチレバー技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
キャピラリー電気泳動法も、断片／タンパク質相互作用を測定するためのツールとして言及されてきた［Ｃａｒｂｅｃｋら（１９９８）Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１、３４３〜３５０］。
【００６３】
上記の方法のうちの１つ又は複数を用いることができることを理解されたい。例えば、ＮＭＲを使用して断片の結合を決定することができ、また、これをＢＩＡｃｏｒｅ（商標）スクリーニングと組み合わせて親和性及び同定された断片ヒットの「順位」を決定することができる。一例では、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を使用して標的タンパク質への結合及び親和性を同時に決定する。
【００６４】
断片−結合データを生成するための上記の実験手法に捕捉して、文献ソースから集めた情報も、ある特定の断片の、特異的な標的タンパク質に対する親和性についての知見の生成において有用であり得る。
【００６５】
断片結合のデータを収集するためにどんな手法を用いても、結果は、標的タンパク質に結合することが公知である、又はそう考えられている化合物断片構造の一覧である。解離値又はＩＣ５０値の形式の定量的な親和性情報が有用であるが、必須ではない。
【００６６】
公的に入手可能なデータなどの標的タンパク質に関する適切な構造情報がすでに利用可能である場合、仮想的なスクリーニング方法を使用して標的タンパク質に結合することが予想される断片を同定することができることを理解されたい。化合物断片のタンパク質への結合を決定するために有用な仮想的なスクリーニング方法として、ＧＬＩＤＥ［Ｆｒｉｅｓｎｅｒら Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００４ Ｍａｒ ２５；４７（７）：１７３９〜４９］及びＧＯＬＤ［Ｊｏｎｅｓら Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｐｒ ４；２６７（３）：７２７〜４８］が挙げられるが、これらに限定されない。一例では、上記のタンパク質の接触原子は、構造に基づく仮想的なスクリーニング方法における計算パラメータとして使用することができるファーマコアの特徴を同定し得る。
【００６７】
一例では、種々の異なる化学断片を用いて標的タンパク質結晶の構造を探索して、そのような候補分子と標的タンパク質との間の相互作用に最適な部位を決定することができる。次いで、これらの部位に密接に結合すると思われる小分子断片を設計し、場合により、合成し、標的タンパク質に結合するそれらの能力について試験することができる。
【００６８】
別の例では、小分子データベースのコンピュータによるスクリーニングを使用して、標的タンパク質に全部又は一部が結合し得る化学断片を同定する。このスクリーニング方法及びその有用性は、当技術分野で周知である。例えば、そのようなコンピュータモデリング技法は、ＷＯ９７／１６１７７及びＷＯ２００７／０１１３９２に記載されている。
【００６９】
一実施形態では、コンピュータによるスクリーニング方法は、候補断片を合成し、その候補断片を本明細書において上記した通り標的タンパク質に結合する能力についてスクリーニングするステップをさらに含む。
【００７０】
一般には、本発明の方法のステップ（ｃ）において、標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片が同定される。一例では、２種以上の断片が同定される。一例では、３種以上の断片が同定される。一例では、４種以上の断片が同定される。一例では、５種以上の断片が同定される。一例では、１０種以上の断片が同定される。一例では、２０種以上の断片が同定される。一例では、５０種以上の断片が同定される。
【００７１】
例えば、数多くの断片が同定される場合、同定された断片全てがさらなる３Ｄ構造解析のために選択されるのではない可能性があることを理解されたい。ある特定の断片を、その総合的な取扱い易さ及び／又はリピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ ｒｕｌｅ ｏｆ ｆｉｖｅ）（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、１９９７、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ、２３、３〜２５）に準拠する可能性に基づいて選択することができる。
【００７２】
その代わりに、又はそれに加えて、断片の標的タンパク質に対する親和性が決定されている場合、この親和性を使用して、親和性又はリガンド効率が最も高い断片がさらなる試験に進むよう断片に順位を付けることができる。リガンド効率は、サイズによって基準化された結合親和性である（すなわち、抗力／サイズ）。
【００７３】
その代わりに、又はそれに加えて、標的タンパク質に結合することが公知の化合物断片の類似体を、例えば、予測される改善された結合性又は総合的な取扱い易さに基づいて同定し、選択することができる。直接又は仮想的にのいずれかで、これらの類似体を標的タンパク質への結合について試験することができることを理解されたい。
【００７４】
その代わりに、又はそれに加えて、本明細書において上記した通り同定された抗体のうちの１種又は複数を使用して行う競合アッセイに基づいて、同定された抗体のうちの１種又は複数と同じ領域において結合する断片が選択されるように、例えば、抗体の存在下で標的タンパク質に結合することができない化合物断片が優先的に選択されるよう化合物断片に順位を付けることができる。
【００７５】
上記の異なる因子を組み合わせて使用して、３Ｄ構造解析を用いるための１種又は複数の化合物断片を選択することができる可能性がある。
【００７６】
化合物断片の３Ｄ構造解析
本発明の方法のステップ（ｄ）において、選択された化合物断片のうちの１種又は複数について、三次元構造の表示を標的タンパク質と組み合わせて生成する。そのような構造の表示のための適切な方法として、Ｘ線結晶構造解析及びＮＭＲが挙げられる。Ｘ線結晶構造解析を使用することが好ましい。
【００７７】
生成された三次元構造表示により、化合物断片が標的タンパク質にどのように結合するか、及び標的タンパク質のどこに結合するかについての情報がもたらされる。次いで、この情報を使用して、１種又は複数の機能修飾抗体の標的タンパク質への結合について得られた３Ｄ構造情報と比較することができる。Ｓｙｂｙｌ［ｗｗｗ．ｔｒｉｐｏｓ．ｃｏｍ］などの分子モデリングプログラムを使用して同定された重要な相互作用を用いて構造に基づくドラッグデザインのためのファルマコフォアを生成することができる。
【００７８】
本発明の方法によって同定された抗体結合部位内又はそれと同じ付近で標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を、１種又は複数の候補小分子化合物を、例えば化合物断片の成長によって合成することに使用するために、ステップ（ｅ）において選択する。
【００７９】
一例では、化合物断片が、抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体の１種又は複数のタンパク質接触原子と分子間相互作用する場合、それを選択する。分子間相互作用として、水素結合又は疎水性ファンデルワールス相互作用などの静電気的相互作用が挙げられる。
【００８０】
一例では、化合物断片が抗体結合部位の付近で分子間相互作用する場合に、それを選択する。分子間相互作用として、水素結合又は疎水性ファンデルワールス相互作用などの静電気的相互作用が挙げられる。一例では、化合物断片が、ステップ（ｂ）において抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体１種又は複数のタンパク質接触原子の付近で分子間相互作用する場合に、それを選択する。本明細書で使用される「の付近で」という用語は、１〜３０Åの距離を指す。一例では、「の付近で」という用語は、１〜２０Å又は１〜１０Åの距離を指す。一例では、化合物断片が、ステップ（ｂ）において抗体結合部位にあると同定された、標的タンパク質の１種又は複数のタンパク質接触原子及び／又は抗体の１種又は複数のタンパク質接触原子の１〜３０Å以内で分子間相互作用する場合に、これを選択する。
【００８１】
上記のように、どの抗体結合部位が化合物断片の標的になるはずであるかを選択すること、したがって、どの断片が選択され得るかは、２種以上の抗体の集合データ又は例えば抗体結合部位データ及び既知リガンド又は受容体結合部位に基づき得る。標的タンパク質の同じ領域において結合する２種以上の抗体が同定されている場合、標的タンパク質において同定された、抗体と相互作用する接触原子を、断片の成長に使用するために組み合わせることができる。
【００８２】
例えば、標的タンパク質の所与の領域において結合する抗体の頻度を用いて、標的タンパク質の残基又は原子と相互作用する抗体残基又は原子の位置と一致させるための化学的空間又は３Ｄ位置の特定の領域への断片の成長又はアナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）を誘導することができる。したがって、得られた、結合した抗体−標的タンパク質の接触情報を使用して、標的タンパク質の特定の領域まで化合物断片の成長を導き、且つ／又はその領域において結合する化合物断片の選択を補助することができ、且つ／又は標的タンパク質の特定の領域内の残基の複合集団をもたらして化合物断片の成長を誘導することができ、且つ／又は化合物断片の成長を化学的空間又は３Ｄ位置のある特定の領域まで導くことができる。
【００８３】
ステップ（ｃ）及び（ｄ）は反復性であってよく、別の化合物断片を得る前に、標的タンパク質と関連付けた化合物断片の３Ｄ構造を生成してよいことを理解されたい。さらに、ステップ（ｃ）及び（ｄ）は、ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で結合する化合物断片が同定されるまで繰り返すことができる。
【００８４】
化合物断片の成長
いったん抗体結合部位内又はその付近における化合物断片の結合が同定されると、所与の抗体結合部位（単数又は複数）から得られた接触原子情報を使用して化合物断片の成長を誘導して候補小分子化合物又はそのような化合物のライブラリーを生成することができる。
【００８５】
一般には、そのような標的誘導性の合成の目的は、モジュラー方式で分子を構築して、標的タンパク質に対する結合親和性が個々の部分又は断片よりも高く、標的タンパク質に対して所望の生物学的効果を及ぼすことができる分子集合体を作製することである。このプロセスにおいて、他の構造情報、例えばリガンド、阻害物質、他の化合物断片からの情報を、抗体接触情報と組み合わせて用いることができることを理解されたい。
【００８６】
化合物断片（単数又は複数）−標的タンパク質相互作用及び抗体−標的タンパク質相互作用から得られた構造情報を使用して、任意の適切な断片の集合／成長／合理的方法を用いて新規小分子候補化合物を生成するために選択された断片（単数又は複数）を成長させることができる。そのような方法として、ＮＭＲによるＳＡＲ、動的ライブラリー、アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）及び仮想的なスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
断片に基づいてリードを生成し、その後、効力が高いヒット類似体及び小分子を合理的に設計する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｚｃｚｅｐａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００３）、１２５（１４）、４０８７〜４０９６；Ｒａｉｍｕｎｄｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）、４７（１２）、３１１１〜３１３０、Ｂｒａｉｓｔｅｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（２００３）、１２５（１３）、３７１４〜３７１５、Ｈｕｔｈら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（２００７）、７０（１）、１〜１２、Ｐｅｔｒｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００６）、４９（２）、６５６〜６６３、Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、５０（２４）、５９０３〜５９１１、Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、５０（２４）、５９１２〜５９２５及びＨｕｂｂａｒｄら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）、７（１６）、１５６８〜１５８１を参照されたい。
【００８８】
一般には、そのような化合物断片を成長させる方法として、リード化合物を最適化するための、反復性構造に基づくドラッグデザインが挙げられる。方法として、スクリーニングによって同定された化合物断片の最近接化合物断片又は類似化合物断片を同定するための、化合物断片の「アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）」も挙げられ、これらの化合物断片は、次いで標的タンパク質への結合についてスクリーニングすることができる。
【００８９】
同定された断片（単数又は複数）の成長は、タンパク質表面の付加的なサブサイトに結合する官能性を付加することによって行うことができる。これは、断片と同じ下部構造を含有する化合物について入手可能な化学物質のデータベースを検索することによって、又は断片の重要な付加点に官能性を付加する小ライブラリーを合成することによって実現することができる。断片の標的タンパク質への結合の場所及び方向並びに同じ付近で結合する抗体から得られた構造情報を使用して、コンピュータによる検索又はライブラリー合成を誘導することができる。リガンド結合などの付加的な関連する構造情報が入手可能である場合、これも断片の成長を誘導するために使用できることを理解されたい。
【００９０】
したがって、化合物断片を「成長させること」は、官能性を付加すること、小ライブラリーを作り上げること、データベースを検索すること、コンピュータによる検索及び／又は「アナロギング（ａｎａｌｏｇｕｉｎｇ）」を含めた、いくつもの作業を包含し得る。
【００９１】
一般には、本発明の方法において化合物断片を「成長させること」は、
（１）抗体結合部位内にあると同定された標的タンパク質の接触原子と相互作用し、且つ／又は
（２）抗体結合部位内の抗体接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占める
ように化学合成を導くことを含む。
【００９２】
一例では、当該方法のステップ（ｆ）は、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された１種又は複数の抗体の接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことにより、ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成することを含む。抗体の各接触原子は、ステップ（ｂ）において同定された抗体−標的タンパク質原子対からの対応する接触原子であることが好ましい。
【００９３】
断片の成長が、抗体結合部位内の抗体接触原子と同じ又は類似した化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように導かれた場合、断片は、抗体に用いられるのと同じ分子間相互作用又は分子形状を組み込み得る。この分子間相互作用として、例えば、静電気的相互作用、水素結合、疎水性相互作用又はファンデルワールス相互作用が挙げられる。
【００９４】
したがって、抗体接触原子の空間位置及び分子間相互作用の種類を用いることにより、断片を成長させて抗体の標的タンパク質の接触原子との相互作用を模倣することができる。この空間位置を、本明細書では３Ｄ位置又は化学的空間と称する。したがって、同じ化学的空間又は３Ｄ位置が、３Ｄ表示、例えばＸ線結晶構造解析において同定され得る。これは、特に異なる原子が用いられる場合、抗体原子の位置と正確に同じである必要はないが、ほとんど同等であり、類似した化学的空間を占め得ることを理解されたい。
【００９５】
断片の成長が、抗体と同じ３Ｄ位置又は化学的空間を占める原子を組み込まずに標的タンパク質の原子と相互作用するように導かれた場合、抗体原子の性質及び抗体原子の標的タンパク質との相互作用をさらに使用して、例えば仮想的なスクリーニングツール及び／又はモデリングツールを使用することにより、同等の相互作用を生じる別の適切な位置まで断片を成長させることができる。
【００９６】
上記のように、標的タンパク質の同じ領域において結合する２種以上の抗体が同定されている場合、同定された接触原子を、断片の成長に使用するために組み合わせることができる。この情報を使用して１種又は複数の新しい相互作用を断片に同時に組み込むことができ、又はそれらを反復的に生成することができる。ステップ（ｅ）において選択された化合物が、段階的に成長して、ステップ（ｂ）において同じ抗体又は異なる抗体から同定された別の接触原子と相互作用し得るように、ステップ（ｆ）〜（ｈ）は反復性であってよいことを理解されたい。同様にステップ（ｉ）は、この、ステップ（ｈ）において選択された候補化合物に対する反復性のさらなる改善の概念を包含する。
【００９７】
一連の新しい化合物を生成することができ、次いでこれらを標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は標的タンパク質への改善された結合性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力についてスクリーニングすることができる。これは、さらなる化学反応及び断片の成長の反復性ラウンドを伴ってよく、場合により、抗体結合構造の表示から同定された、標的タンパク質の接触原子との１つ又は複数の別の相互作用が組み込まれることを理解されたい。
【００９８】
したがって、一実施形態では、本発明は、標的タンパク質の活性を変化させる小分子化合物を生成するために使用することができる候補化合物又は候補化合物のライブラリーを生成する方法を提供する。
【００９９】
これらの方法を用いて生成された候補小分子化合物（単数又は複数）は、次いで、標的タンパク質の生物活性を変化させるその能力について、本明細書に記載の適切なスクリーニング方法を用いて試験することができる。そのような小分子化合物は、一般には＜６５０Ｄａのサイズであり、ペプチド模倣体ではない。
【０１００】
当該方法のステップ（ｆ）において生成された１種又は複数の候補化合物は、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は改善されたリガンド効率及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について、ステップ（ｇ）において試験される。上記のように、化合物断片の成長は、反復性であってよく、したがって、ステップ（ｆ）及び（ｇ）は、２回以上繰り返されてよい。したがって、ステップ（ｆ）において作製され、ステップ（ｇ）において試験された候補化合物は、薬物として使用するためにその化学構造をさらに変化させる必要がない、標的タンパク質の活性を変化させる小分子化合物になる可能性を有する。或いは、ステップ（ｆ）において作製され、ステップ（ｇ）において試験された候補化合物は、小分子化合物を生成するために、さらなる修飾、例えば、標的タンパク質の活性を調節する程度まで改善すること、及び／又は化合物をより薬らしくすることを必要とし得る。したがって、ステップ（ｈ）において選択された化合物は、本明細書において下記したように、薬物として使用するために必要な程度に標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物であり得る。或いは、ステップ（ｈ）において選択された化合物は、適切な小分子化合物を生成するためにさらなる化学反応及びスクリーニングが必要な候補化合物であり得る。したがって、本発明の方法のステップ（ｉ）において、さらなる化学反応は、場合により、ステップ（ｆ）及び（ｇ）を繰り返して、（ｈ）において選択された断片を、ステップ（ｂ）において同じ抗体又は異なる抗体から同定された１種又は複数の別の接触原子と相互作用するように成長させることにより、場合により、ステップ（ｈ）において選択された化合物に対して行われる。
【０１０１】
本発明による小分子化合物は、一般には６５０Ｄａ未満のサイズであり、ペプチドではない。一例では、本発明の小分子化合物は６００Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、本発明の小分子化合物は５５０Ｄａ未満の分子量を有する。一例では、本発明の小分子化合物は５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【０１０２】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、リピンスキーのルールオブファイブ（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ ｒｕｌｅ ｏｆ ｆｉｖｅ）（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら、１９９７、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ、２３、３〜２５）の少なくとも１つに準拠し、全てに準拠することが好ましい。
【０１０３】
したがって、一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、５個以下の水素結合供与体（１つ又は複数の水素原子を伴う窒素原子又は酸素原子）を含有する。
【０１０４】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、１０個以下の水素結合受容体（窒素原子又は酸素原子）を含有する。
【０１０５】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、５未満のオクタノール／水分配係数ｌｏｇＰを有する。
【０１０６】
一例では、本発明の方法によって作製された小分子は、以下の基準に対する３つ以上の違反を有さない：
５つ以下の水素結合供与体（１つ又は複数の水素原子を伴う窒素原子又は酸素原子）を含有する
１０個以下の水素結合受容体（窒素原子又は酸素原子）を含有する
５未満のオクタノール／水分配係数ｌｏｇＰを有する。
５００ダルトン未満の分子量
【０１０７】
組成物／治療用途
本発明の方法によって同定された化合物は、病的状況の治療及び／又は予防において有用であり得、本発明は、本発明の化合物を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１種又は複数と一緒に含む医薬組成物又は診断用組成物も提供する。したがって、医薬品を製造するための本発明の化合物の使用が提供される。組成物は、通常、薬学的に許容される担体を標準的に含む滅菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含み得る。
【０１０８】
本発明は、標的タンパク質に媒介される又は標的タンパク質レベルの上昇に関連付けられる病的障害の治療又は予防において使用するための、本発明の方法によって作製される化合物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明の例
【実施例】
【０１１０】
ここで、本発明を例のみの目的で、以下を参照して記載する。
図１ａ 側鎖残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２及びＡｓｎ１（濃い灰色の球体及び棒）を持つ抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）並びに標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｂ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）及び標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｃ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）、標的タンパク質（白い分子表面）及び抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）
図１ｄ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｅ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ２で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｆ ＮＣＥ断片が成長してＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
図１ｇ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基、Ｔｙｒ２で定義されるフェノール基及びＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
【０１１１】
（例１）
抗体：標的複合体の構造
標的タンパク質（サイトカイン）を、標準のプロトコールを使用して細菌発現系において過剰発現させた（例えば、Ｂａｎｅｙｘ［１９９９］「大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における組換えタンパク質の発現（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、４１１〜４２１に記載されている）。簡単に述べると、標的遺伝子をコードするベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細菌（Ｏｒｉｇａｍｉ ｓｔｒａｉｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に導入し、形質転換した。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加えることによってタンパク質の発現を誘導し、誘導した１６〜２０時間後に細胞を回収した。細胞を再懸濁することによって標的タンパク質を抽出し、それらをｂａｓｉｃ Ｚ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ）を通過させた。次いで遠心分離によって溶解物を透明にし、溶解物にＮｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ）２〜４ｍｌを加え、試料を４℃で２時間攪拌した。その後、Ｎｉ−ＮＴＡ ｂｅａｄｓを洗い流し、タンパク質を２５０〜５００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液に溶出させた。溶出した物質を、５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌなどの適切なタンパク質緩衝液でゲル濾過することによってさらに精製した。
【０１１２】
標的サイトカインに結合する抗体を、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３〜７８４８１に記載の方法を用いて単離した。抗体は、ｐＭの親和性で標的サイトカインに結合し、そのサイトカインの生物活性を中和することができる。結晶構造解析において使用するために、抗体のＦａｂ断片をクローン化し、発現させ、精製した。
【０１１３】
抗体のＦａｂ断片を、標準のプロトコールを使用して一過性の哺乳動物細胞培養物において発現させた（例えば、Ａｒｉｃｅｓｃｕら［２００６］「真核生物の発現：構造プロテオミクスのための開発（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６２：１１１４〜１１２４に記載されている）。簡単に述べると、ヒト胎児の腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターＤＮＡでトランスフェクトした。ベクターは、発現された重鎖及び軽鎖が培地中に分泌されるように、ターゲティング配列を含有した。６日後、細胞を遠心分離によって培地から分離し、親和性クロマトグラフィー（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ｒｅｓｉｎ；ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＵＫ）とゲル濾過を組み合わせて用いることによってタンパク質を培地から精製した。
【０１１４】
化学量論的な量の抗体を標的タンパク質に加えることによって抗体：：標的複合体を生成し、その後４℃で２時間インキュベートし、その後ゲル濾過を使用して精製した。精製された抗体：：標的複合体を、結晶化に適したレベルまで濃縮した（この場合は８ｍｇ／ｍＬ）。Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｒｏｂｏｔｉｃ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ／ＵＫ）を使用してシッティングドロップ（Ｓｉｔｔｉｎｇ−ｄｒｏｐ）結晶化試験を設定した。本明細書に記載の標的タンパク質について、５〜１０日以内に、２００ｍＭの硫酸アンモニウム、１００ｍＭのＭＥ緩衝液（ｐＨ６．５）、２２％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００のリザーバー溶液と平衡した、４ｍｇ／ｍｌの精製された抗体：：標的複合体、１００ｍＭの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−８０００を含有するシッティングドロップ８００ｎｌ中に回折品質結晶が成長した。結晶を８０％のリザーバーと２０％のグリセロールを含有する溶液中で凍結保護し、液体窒素、１００Ｋで急速冷凍した。
【０１１５】
回折データをＤｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｉｄｃｏｔ／ＵＫ）ｂｅａｍｌｉｎｅ Ｉ０２で収集し、コンピュータプログラムＭＯＳＦＬＭを使用して加工した（Ｌｅｓｌｉｅ［１９９９］「高分子の回折データの統合（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ５５：１６９６〜１７０２）。抗体：：標的複合体の結晶構造を、標的タンパク質の既知構造及び抗体をプログラムＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙら［２００７］「Ｐｈａｓｅｒ結晶学的ソフトウェア（Ｐｈａｓｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ４０：６５８〜６７４）の検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。分子置換溶液を、プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ［２００４］「Ｃｏｏｔ：分子グラフィックのためのモデル構築ツール（Ｃｏｏｔ：ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６０：２１２６〜２１３２）を使用して再構築し、プログラムＣＣＰ４ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ４［１９９４］「ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：タンパク質結晶構造解析のためのプログラム（Ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ５０：７６０〜７６３）を使用して精製した。
【０１１６】
結晶構造を解析することにより、抗体が標的タンパク質のどこに結合したかが明らかになり、抗体結合部位内の接触原子対、すなわち、抗体結合部位内の標的タンパク質の原子と抗体の原子が同定された。
【０１１７】
標的：：断片複合体の構造
上記の通り、標的タンパク質を発現させ、精製し、結晶化した。
小分子断片のライブラリーを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００に基づいたスクリーニング方法で標的サイトカインへの特異的な結合についてスクリーニングすることによってＮＣＥ断片を得た。標的サイトカインを、溶液相からの結合しているＮＣＥ断片と一緒にチップの表面に結合させた。断片の結合は、再生ステップを必要としないために十分に弱かった。このアッセイ形式において、この特異的な断片についての典型的な結合の方形波プロファイルを得た。同定された断片は、４００μＭの結合親和性を有した。
【０１１８】
標的タンパク質を、アポ型に結晶化し、続いてその結晶を、断片を含有する緩衝溶液に浸漬した。回折データをＳｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｖｉｌｌｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で収集し、プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥ（Ｋａｂｓｃｈ［１９９３］「最初未知の対称及びセル定数の結晶からの回転回折データの自動加工（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｕｎｋｎｏｗｎ ｓｙｍｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ２６：７９５〜８００）を使用して加工した。標的：：断片複合体の構造を、標的タンパク質の既知構造を検索モデルとして使用した分子置換によって解析した。分子置換溶液を、プログラムＣＯＯＴを使用して再構築し、プログラムＣＣＰ４ ｐｒｏｇｒａｍを使用して精製した。
【０１１９】
抗体誘導性の断片の成長を例示している方法
本例では、高い親和性のＦａｂ断片、中和抗体及び標的サイトカインの複合体の第１の結晶構造を得、抗体結合部位と同じ標的サイトカインに同じ付近で結合する小分子断片の第２の結晶構造を得た。
【０１２０】
抗体を、選択リンパ球抗体法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｔｈｏｄ）に従って生成し、その標的との相互作用の親和性を確証するためのＢｉａｃｏｒｅによって、及び機能修飾特性を確証するためのバイオアッセイにおいて、スクリーニングした。抗体は、ｐＭの親和性を有する標的サイトカインに結合し、そのサイトカインの生物活性を中和することができた。抗体のＦａｂ断片をクローン化し、発現させ、精製して結晶構造解析を補助した。
【０１２１】
小分子断片のライブラリーから、Ｂｉａｃｏｒｅ Ａ１００に基づいたスクリーニング方法で標的サイトカインへの特異的な結合が実証されたＮＣＥ断片を得た。標的サイトカインを溶液相からの結合しているＮＣＥ断片と一緒にチップの表面に結合させた。断片の結合は、再生ステップを必要としないために十分に弱かった。このアッセイ形式において、この特異的な断片についての典型的な結合の方形波プロファイルを得た。同定された断片は、標的サイトカインに対して４００μＭの結合親和性及び２０５の分子量を有した。
【０１２２】
予想通り、抗体は、断片と比較して、いくつもの付加的な原子を使って抗原と接触し、特異的且つ誘導性の様式で断片を成長させる機会を与えて抗体−検証された接触原子及びそれらの標的サイトカインの表面に対する三次元空間における場所及び小分子断片に対する三次元空間における場所を生かしている。
【０１２３】
抗体のＦａｂ断片と標的サイトカインとの間のそのような相互作用の１つは、抗体のＣＤＲ３重鎖の第１のチロシン(Ｔｙｒ１)とタンパク質標的のトリプトファン残基との間にあり、エッジ−表面（ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）パイ−パイスタッキング相互作用を形成している。抗体のＦａｂ断片と標的サイトカインとの間の別の相互作用は、抗体のＦａｂ断片のＣＤＲ２重鎖領域のアスパラギン（Ａｓｎ１）とタンパク質標的のアルギニン残基との間の水素結合である。別の相互作用は、抗体のＣＤＲ２重鎖領域の第２のチロシン(Ｔｙｒ２)とタンパク質標的のアルギニンとの間にあり、陽イオン−パイ接触を形成する。ＮＣＥ断片は、これらの相互作用の４Å以内の部位に結合するが、これらの場所における適切な構造を欠いているので、３つの特異的な接触を生かすことができない。
【０１２４】
断片の中心に対して適切な場所における抗体の相互作用を模倣する構造モチーフを特色とする第１の断片の類似体を、さらなる分析のために優先的に選択することができる。そのような類似体として、Ｔｙｒ１若しくはＴｙｒ２を模倣するためのフェノール環又はＡｓｎ１を模倣するための一級アミドを挙げることができるが、これらに限定されない。或いは、抗体からのこれらの相互作用を適切な場所で模倣している構造を持つ新しい化合物を特異的に合成することができる。図１は、この様式でどのように断片が成長し得るか、及び新しい断片がどのように抗体のＦａｂ断片残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２又はＡｓｎ１で観察される類似の相互作用を通して結合が増強したことを実証することが予想され得るかを示している。
【０１２５】
図１ａ 側鎖残基Ｔｙｒ１、Ｔｙｒ２及びＡｓｎ１（濃い灰色の球体及び棒）を持つ抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）並びに標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｂ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）及び標的タンパク質（白い分子表面）
図１ｃ ＮＣＥ断片（濃い灰色の分子表面）、標的タンパク質（白い分子表面）及び抗体のＦａｂ断片（黒い骨格）
図１ｄ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｅ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ２で定義されるフェノール基を組み込んでいる
図１ｆ ＮＣＥ断片が成長してＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
図１ｇ ＮＣＥ断片が成長してＴｙｒ１で定義されるフェノール基、Ｔｙｒ２で定義されるフェノール基及びＡｓｎ１側鎖で定義される酸素原子及び窒素原子を組み込んでいる
【０１２６】
抗体がすでに、付加的な化学物質と、現存する断片に対するその場所の両方について検証されたので、化合物断片を成長させることによって生成された新しい候補断片は、市販の類似体からの無作為な置換による、又は無作為な選択による成長と比較して親和性及び／又は効力が増加している確率が高いことが予想され得る。
【０１２７】
結合の増加又は効力の増加の確認は、適切なアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅ、ＦＲＥＴスクリーニングによって、又は適切な細胞に基づくアッセイにおいて得られ得る。
【０１２８】
断片を成長させるための新しい機会及び付随する効力の増加を探求することができるように、合成された断片の新しい結晶構造を得、抗体−標的複導体の構造と比較するという点において当該方法は反復性であることが予測される。
【図１（ａ）】
【図１（ｂ）】
【図１（ｃ）】
【図１（ｄ）】
【図１（ｅ）】
【図１（ｆ）】
【図１（ｇ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質の活性を変化させ得る小分子化合物を生成する方法であって、
（ａ）標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる１種又は複数の抗体又はその断片を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抗体の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成し、相互作用し、抗体の結合部位内にある、標的タンパク質と抗体の１種又は複数の接触原子対を同定するステップと、
（ｃ）標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた断片のうちの１種又は複数の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で標的タンパク質に結合する化合物断片を選択するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を、場合により、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された抗体の接触原子のうちの１種又は複数と同じ化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことによって成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）において作製された候補化合物のうちの１種又は複数を、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について試験するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）において試験された化合物が、標的タンパク質の活性を調節する又は改善された結合性親和性若しくはリガンド効率を有する場合に、それを選択するステップと、
（ｉ）場合により、ステップ（ｈ）において同定された化合物を使用してさらに化学反応及びスクリーニングを行って、標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物を生成するステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において得られた各抗体又はその断片が、完全な抗体、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＩｇＮＡＲ Ｖドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において２種以上の抗体が得られる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域内の接触原子とからなる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体のＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）において同定された各接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体のＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体重鎖ＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において２種以上の化合物が同定される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において得られた各化合物断片が、５００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）において選択された化合物断片が、ステップ（ｂ）において同定された接触原子対の１〜３０Å以内で標的タンパク質に結合する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｄ）において生成される三次元構造が、Ｘ線結晶構造解析によって生成される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法によって生成される小分子化合物。
【請求項１】
標的タンパク質の活性を変化させ得る小分子化合物を生成する方法であって、
（ａ）標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の生物活性を変化させる１種又は複数の抗体又はその断片を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた抗体の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成し、相互作用し、抗体の結合部位内にある、標的タンパク質と抗体の１種又は複数の接触原子対を同定するステップと、
（ｃ）標的タンパク質に結合する１種又は複数の化合物断片を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた断片のうちの１種又は複数の三次元構造の表示を標的タンパク質と関連付けて生成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）において同定された抗体結合部位内又はその付近で標的タンパク質に結合する化合物断片を選択するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において選択された化合物断片を、場合により、伸長した断片がステップ（ｂ）において同定された抗体の接触原子のうちの１種又は複数と同じ化学的空間又は３Ｄ位置を占めるように化合物断片の化学的成長を導くことによって成長させて、ステップ（ｂ）において同定された標的タンパク質の１種又は複数の接触原子と相互作用する１種又は複数の候補化合物を生成するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）において作製された候補化合物のうちの１種又は複数を、標的タンパク質に対する改善された親和性及び／又は改善された効力及び／又は標的タンパク質の生物活性を変化させる能力について試験するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）において試験された化合物が、標的タンパク質の活性を調節する又は改善された結合性親和性若しくはリガンド効率を有する場合に、それを選択するステップと、
（ｉ）場合により、ステップ（ｈ）において同定された化合物を使用してさらに化学反応及びスクリーニングを行って、標的タンパク質の活性を調節する小分子化合物を生成するステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において得られた各抗体又はその断片が、完全な抗体、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＩｇＮＡＲ Ｖドメインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において２種以上の抗体が得られる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域内の接触原子とからなる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体のＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）において同定された各接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体のＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）において同定された少なくとも１種の接触原子対が、相互作用する、標的タンパク質の接触原子と抗体重鎖ＣＤＲ内の接触原子とからなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）において２種以上の化合物が同定される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において得られた各化合物断片が、５００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）において選択された化合物断片が、ステップ（ｂ）において同定された接触原子対の１〜３０Å以内で標的タンパク質に結合する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）及び／又はステップ（ｄ）において生成される三次元構造が、Ｘ線結晶構造解析によって生成される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法によって生成される小分子化合物。
【公表番号】特表２０１２−５１５３３０（Ｐ２０１２−５１５３３０Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４４９２２（Ｐ２０１１−５４４９２２）
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００００４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９３４５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１２日（２０１０．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００００４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７９３４５
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]