抗生物質の分解方法及びこれに用いる微生物
【課題】 微生物を用いて抗生物質を分解する方法及びこれに用いる微生物を提供する。
【解決手段】 抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)又はグラム陽性低GC含量細菌、グラム陽性高GC含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
【解決手段】 抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)又はグラム陽性低GC含量細菌、グラム陽性高GC含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の分解方法及びこれに用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における沿岸域では、真珠、ハマチ及びブリなどの養殖魚生産が盛んに行われている。多くの養殖漁場では、需要の拡大に伴い富栄養が進行し、貧酸素化及び赤潮などの環境劣化、過密養殖などによる周年の魚病の発生が頻発している。そのため、魚類海面養殖では魚病発生時だけでなく、感染予防のために、現在、多種多様な抗生物質が大猟に使用されている。養殖における抗生物質の薬効については魚病研究者によって精力的に調べられており、バクテリア及び病原菌の抑制に著しい効果を有することが報告されている。しかしながら、環境水中における抗生物質の基礎的研究は少なく、それら知見は限られている。
【０００３】
現在、抗生物質の大量使用により、水域、海底土壌中に大量の抗生物質が残留しており、環境汚染、耐性菌の出現、食物連鎖による人体への摂取など、人的及び物的に与える影響が危惧される。実際、医薬品として人体に抗生物質が使用される場合、必ずいくつかの副作用が伴うことは周知の事実である。このような副作用が、環境を経由して、人体に現れる可能性は高い。従って、持続的な養殖魚生産には、魚病予防に対する有効性及び経済性だけでなく、人体及び環境に対する安全性を兼ね備えた抗生物質の投薬技術を確立する必要があった。
【０００４】
特許文献１では、ＫＮ菌を用いて豚尿に含まれる抗生物質を分解し無害化することが記載されている。ＫＮ菌は、複数の菌種が混在する微生物群であり、従って、抗生物質に対して複数の微生物の相乗的な分解作用を有するものと考えられる。しかし、複数の微生物が混在するという原理上、ＫＮ菌の保存やバイオレメディエーションの実施の際に、時間の経過とともに微生物種の組成の変化や微生物間での遺伝子組換えが生じ、抗生物質に対する分解能力が低下するという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−９４０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、微生物を用いて抗生物質を分解する方法及びこれに用いる微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
（２）プロテオバクテリアに属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリアに属する微生物である（１）記載の分解方法。
（３）γ−プロテオバクテリアに属する微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である（２）記載の分解方法。
（４）グラム陽性低ＧＣ含量細菌に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物である（１）記載の分解方法。
（５）グラム陽性高ＧＣ含量細菌に属する微生物がＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属する微生物である（１）記載の分解方法。
（６）アンピシリンを分解しうる能力を有するＲＡ４株。
（７）オキシテトラサイクリン塩酸塩を分解しうる能力を有するＲＯ１株。
（８）チアンフェニコールを分解しうる能力を有するＲＴ１株
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、微生物を用いて抗生物質を効果的に分解することができる。従って、水域や海底土壌中の抗生物質を分解し、浄化することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いる微生物としては、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌、又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質分解しうる能力を有する微生物であれば、特に制限はない。
【００１０】
本発明者らは、高知県浦ノ内湾の海底土壌から３８株の抗生物質を代謝する細菌株を得た。
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＴ１株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号１）、既知の細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに対し、９８．９％の相同性を示し、グラム陽性低ＧＣ含量細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属すると同定された。ＲＴ１株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７１で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００１１】
ＲＴ１株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で黄褐色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１２】
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＯ１株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号２）、既知の細菌Ｓｗｉｎｅ ｍａｎｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍに対し、９９．６％の相同性を示し、グラム陽性高ＧＣ含量細菌、特にＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属すると同定された。ＲＯ１株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７２で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００１３】
ＲＯ１株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で黄褐色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１４】
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＡ４株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号３）、既知の細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｌｏｓａに対する相同性が９１．８％であることから、γ−プロテオバクテリア群のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する新菌株と同定された。ＲＡ４株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７３で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１５】
ＲＡ４株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で茶色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１６】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報はＤＤＢＪデータベース中のFASTA SEARCHで既知細菌種との比較を行った(Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D.J. Lipman; Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。系統樹は、前記データベースで検索された既知細菌種を含め、近隣結合法に基づき作成した。ブーツストラップ値はPCソフトCLUSTAL W ver. 1.7 より決定した(Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nuc. Aci. Res. 22: 4673-4680 (1994))。
【００１７】
ＲＴ１株及びＲＯ１株について、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いて作成した系統樹を図１に示す。
【００１８】
ＲＡ４株について、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いて作成した系統樹を図２に示す。
本発明においては、前記のようにして得られた菌株を変異誘発処理して得られる変異株を用いてもよい。
【００１９】
変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことができる。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原を用いてもよい。
【００２０】
微生物の培養に際しては、通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。
【００２１】
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独又は組合せて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
【００２２】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸、アミノ酸などが単独又は組合せて用いられる。
【００２３】
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水和物、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類；チアミン塩酸塩などのビタミン類を加える。
【００２４】
本発明の対象となる抗生物質としては、魚類の養殖に用いられる水産用抗生物質、例えば、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン及びピペラシリンナトリウムなどのペニシリン系抗生物質、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びドキシサイクリン塩酸塩などのテトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール及びチアンフェニコールなどのクロラムフェニコール系抗生物質、ジョサマイシン、リンコマイシン、エリスロマシインなどのマクロライド系抗生物質、その他オキソリン酸、オレアンドマシン、ニフルスチレン酸ナトリウム、スルフイソゾールナトリウム、ミロキサシン等が挙げられる。本発明は、ペニシリン系、テトラサイクリン系及びクロラムフェニコール系の抗生物質、特に、アンピシリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びチアンフェニコールの分解に有効である。
【００２５】
細菌による抗生物質の分解
予め培地中で細菌を前培養する。培地を容器に注ぎ、オートクレーブ処理した後、前培養物を接種する。培養後、ＨＰＬＣによって培養物中の抗生物質を定量する。
【００２６】
本発明の分解方法において、処理時のｐＨは、通常４〜１０、好ましくは６〜８、処理温度は、通常５〜３５℃、好ましくは２０〜２５℃、処理時間は、通常１週間以上、好ましくは２週間以上である。また、分解の際には、細菌の増殖を促進するため、十分な空気を通気し、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水和物、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類；チアミン塩酸塩などのビタミン類を加えることが好ましい。
【００２７】
海底土壌の場合、抗生物質汚染環境から海底土壌を処理施設へ運搬した後、土壌に分解細菌培養物を加え、数日間適温で保温する。土壌中の抗生物質濃度を測定し、抗生物質濃度が基準値以下であれば、土壌を環境中に戻す。
【００２８】
水質汚染の場合、抗生物質汚染環境から水を吸い上げ、分解細菌のバイオフィルムを通過させ、抗生物質を分解する。水質を検査した後、抗生物質濃度が基準値以下であれば、水を再び環境に排出する。これらの一連の操作は、水処理施設内に水を循環させることで行う。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）スクリーニング
滅菌後の試験管に、高知県浦の内湾より得られた海底土壌を１ｇとり、ろ過海水１０ｍｌに懸濁させ、室温で静置培養を行った。その後、上澄み液０．０５ｍｌを抗生物質含有寒天培地に塗沫し、３０℃インキュベーター内で一週間培養した。形成したコロニーを分解細菌とし、これを別の寒天培地に単離した。色、形状、生長具合など目視により種を分類した。
【００３１】
用いた培地組成は、１０００ｍｌのろ過海水に対し、バクトペプトン５ｇ、酵母エキス１ｇ、グルコース１０ｇ、寒天１５ｇ、そして抗生物質が１×１０−４Ｍになるよう加えた。
【００３２】
結果
各抗生物質を含んだ培地から目視により６〜１０種の分解細菌が分離され、計３８株得られた。
これらは前培養として抗生物質（１×１０−４Ｍ）含有液体培地に移植し、３０℃インキュベーター内に静置培養した。また、抗生物質寒天培地に植えかえし３０℃インキュベーター内に静置培養した後に、冷蔵庫内に保存した。寒天培地に培養したものは、一ヶ月後に植えかえをし、維持培養した。
【００３３】
（実施例２）細菌の同定
細菌からのＤＮＡ抽出
液体培地に細菌を植えかえ、３７℃で１〜２日間振とう培養し、細菌培養（１０ｍｌ）を遠心管にとり、３０００ｒｐｍで２０分間遠心した。ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（５００μｌ）で菌体を再懸濁した後、マイクロチューブに移し、１０％ＳＤＳ（６０μｌ）を加え、緩やかに攪拌後、５０℃で３０分間インキュベーションした。さらに１０ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６０μｌ）６μｌと１０ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（６μｌ）を加え、５０℃で３０分間インキュベーションした。これに等量のフェノール（ｐＨ８）を加え、緩やかに攪拌し、常温で１２０００ｒｐｍで５分間遠心後、水層を新しいマイクロチューブに取り、５Ｍ ＮａＣｌ（１００μｌ）とＣＴＡＢ（８０μｌ）を加えて緩やかに攪拌し、６０℃で１０分間インキュベーションした。等量のクロロホルム−イソアミルアルコール混液を加え緩やかに攪拌し、常温で１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、水層を新しいマイクロチューブにとり、２倍量の１００％エタノールを加えた。これを−３０℃で一晩インキュベーションし、ＤＮＡを析出させた。
【００３４】
４℃で１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上清を取り除き、沈殿に７０％エタノール（５００μｌ）を加え、４℃で１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清はピペットマンを用いて完全に取り除き、沈殿をドライアップした。これに超純水５０μｌを加え懸濁させ、ゲノムＤＮＡ量を測定した。
【００３５】
測定用試料は、ＤＮＡ懸濁溶液から１μｌとり、６９９μｌの超純水に溶解し、波長２００〜３００ｎｍ吸光度を測定し、２６０ｎｍＯＤ１＝５０ｎｇ／μｌの割合でＤＮＡ量を換算し、懸濁液中のＤＮＡ量を算出した。
【００３６】
ＰＣＲ
ＰＣＲ用のマイクロチューブを使用し、下記の成分を氷上で混合した。ＰＣＲにマイクロチューブし、下記の温度設定で１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅反応を開始した。
【００３７】
Ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）・・１０μｌ
ｄＮＴＰ・・・・・・・・・・・・ ８μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ ２７Ｆ・・・・・・１０ｐｍｏｌ
Ｐｒｉｍｅｒ １４９２Ｒ・・・・１０ｐｍｏｌ
ＤＮＡ・・・・・・・・・・・・１００ｎｇ
Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・・・０．５μｌ
ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ・・・・・・・・・・Ｘμｌ
ｔｏｔａｌ・・・・・・・・・・・ １００μｌ
［温度設定］
９４℃ １０：００
(1) ９４℃ １：００
(2) ５６℃ ２：００
(3) ７２℃ ２：００
７２℃ ７：００
４℃
(1)〜(3)の操作を３０回繰り返す。
【００３８】
確認電気泳動
ＴＡＥバッファーに１．５％のアガロースを加えゲル混合液を調整し、電子レンジでゲルを溶解させ室温で冷ました後に、ゲル作成容器に注ぎゲルを固めた。泳動槽にＴＡＥバッファーを注ぎ、ゲルをセットした。
【００３９】
ＰＣＲ産物（１．０μｌ）、６×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１．０μｌ）及び滅菌脱イオン水（４．０μｌ）を混合した試料を、それぞれのレーンにアプライし、３０分ほど泳動した後、エチジウムブロマイド入りタッパーにゲルを移し、１５分間染色した後に２５４ｎｍ ＵＶ励起でバンドを確認した。
【００４０】
シークエンス用ＰＣＲ産物の精製
寒天からＰＣＲ産物を切り出し、穴開きマイクロチューブの中に入れ、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、下のマイクロチューブに寒天を落した。同量のフェノールを加えｖｏｒｔｅｘし、液体窒素中に１分間静置後、室温で融解させた。融解した試料を室温、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移した後、水層と等量のフェノール・クロロホルム（１：１）を加えた。室温で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移した後、水層量の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウムと等量の２−プロパノールを加え、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えｖｏｒｔｅｘし、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。水分を完全に取り除いた後、１０μｌのＴＥに件濁させ、電気泳動によってＰＣＲ産物１μｌを供し、産物量を確認する。
【００４１】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の決定
下記の成分を氷上で混合、下記の温度設定で反応を開始する。
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ・・・・・・１μｌ
希釈液・・・・・・・・・・・・・・７μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ２７Ｆ・・・・・・３．２ｐｍｏｌ
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ・・・・１０〜５０ｎｇ
ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ・・・・・・・・Ｘμｌ
ｔｏｔａｌ・・・・・・・・・・・２０μｌ
［温度設定］
９４℃ ５：００
(1) ９６℃ ０：１０
(2) ５０℃ ０：０５
(3) ６０℃ ４：００
４℃
(1)〜(3)の操作を２５回繰り返す。
【００４２】
反応液２０μｌに１００％エタノール６４μｌと滅菌水１６μｌを加え、室温に１５分間放置した。室温、１５０００ｒｐｍで、２０分間遠心し、上清を完全に取り除き、７０％エタノール２５０μｌ加え、ｖｏｌｔｅｘを用いて撹拌した後、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈澱をドライアップした。ＴＳＲ１２．５μｌを加えてｖｏｌｔｅｘし、シークエンスにかけた。
【００４３】
相同性が９８％未満であったＲＴ１株、ＲＴ６株、ＲＴ８株、ＲＡ３株、ＲＡ４株及びＲＯ１株の６種が新種であることが見い出された。本来、ＰＣＲ法による塩基配列情報の読み間違いが１０００分の１の確立で起こり、突然変異の確立など総合し相同性が９９．８％未満であるものを新種とするが、今回経験上ＰＣＲ法による塩基配列情報の読み間違いが約２％起こるものとし、確実に新種であると判断できる相同性を９８％未満とした。
【００４４】
（実施例３）分解能力の確認
スクリーニングにより得られた分解細菌を、寒天培地と同組成の液体培地で一週間３０℃インキュベーター内で前培養を行った。その後ガラス製試験管に同組成の液体培地９ｍｌを入れ、前培養した細菌を１ｍｌ植えつけ、３０℃インキュベーター内に三週間静置培養した。一週間毎にその液体培地中の抗生物質濃度をＨＰＬＣで測定することで、分解能力の確認を行った。結果を図３〜５に示す。
【００４５】
チアンフェニコール分解細菌である、ＲＴ１株及びＲＴ６株は、２週間後にそれぞれ２割及び６割の分解率を示した（図３）。
アンピシリン分解細菌である、ＲＡ３株とＲＡ４株は２週間後に７〜８割の分解率を示した（図４）。
オキシテトラサイクリン塩酸塩分解細菌である、ＲＯ１株は、２週間後に４割の分解率を示した（図５）。
【００４６】
（実施例４）海底土壌中における分解能力の確認
浦ノ内湾より採取した海底土壌１ｇをオートクレーブで滅菌し（１２１℃、２０分）、抗生物質を１０−４Ｍ／ｇとなるように添加した。予め前培養した分解細菌株（ＲＴ１株、ＲＴ６株、ＲＴ８株、ＲＡ３株、ＲＡ４株）の培養液０．１ｍｌをそれぞれ加えてよく混合した。この際、必要に応じて、分解細菌の増殖を促進するために空気や栄養分（例えば、硝酸塩、リン酸塩、ビタミン類等）を加え、分解細菌の活性を高めた。３０℃インキュベーター内で一週間静置培養した。一週間後に試料中の抗生物質濃度を測定して分解率を求めた。結果以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
分解能力確認実験で液体培地中で分解能力を示した菌株が、海底土壌中でも分解活性を示すことが確認された。また、これら分解細菌種が活性を発揮するために十分な空気を添加することが好ましいことも明らかとなった。
【００４９】
（実施例５）分解細菌の生長速度と分解速度
３０ｍｌポリカーボネートを培養用容器として用い、（実施例３）と同組成の液体培地２９ｍｌに前培養した細菌を１ｍｌ植えつけ、３７℃バイオシェーカー内で培養を行った。分解細菌の生長量は５４０ｎｍにおける濁度として、専用セルホルダーに３０ｍｌポリカーボネート容器をおいて、分光光度計で直接測定した。培地中の抗生物質は、マイクロチューブに１ｍｌ採取後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心、０．４５μｍメンブランフィルターでろ過し、ＨＰＬＣを用い以下の測定条件で測定した。
（ａ）カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０２ ＨＱ 移動相：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ３．１）
（ｂ）カラム：ＯＤＳ ＲＰ−１８ ＧＰ 移動相：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４：ＡＮ＝８０：２０
（ｃ）カラム：ＯＤＳ ＲＰ−１８ ＧＰ 移動相：１０ｍＭ ＴＦＡ：ＡＮ＝８０：２０
分解能力確認実験でアンピシリンに対し高い分解能力を示したＲＡ３株、ＲＡ４株について、その生長量と分解割合の経時変化を調べた。その結果を図６及び７に示す。
【００５０】
ＲＡ３株は一日目、ＲＡ４株は二日目に対数的に増殖し、それと同時にアンピシリンを速い速度で分解することが確認された。これは、これら分解細菌が生長の際にアンピシリンを代謝していることを示している。したがってＲＡ３株、ＲＡ４株は、アンピシリンをはじめペニシリン系の抗生物質が持つβラクタム環を分解する酵素、ラクタマーゼを放出している可能性が高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】抗生物質分解菌の系統学的位置付けを示す図である。
【図２】抗生物質分解菌の系統学的位置付けを示す図である。
【図３】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図４】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図５】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図６】ＲＡ３株について、その生長量と分解割合の経時変化を示す図である。
【図７】ＲＡ４株について、その生長量と分解割合の経時変化を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の分解方法及びこれに用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における沿岸域では、真珠、ハマチ及びブリなどの養殖魚生産が盛んに行われている。多くの養殖漁場では、需要の拡大に伴い富栄養が進行し、貧酸素化及び赤潮などの環境劣化、過密養殖などによる周年の魚病の発生が頻発している。そのため、魚類海面養殖では魚病発生時だけでなく、感染予防のために、現在、多種多様な抗生物質が大猟に使用されている。養殖における抗生物質の薬効については魚病研究者によって精力的に調べられており、バクテリア及び病原菌の抑制に著しい効果を有することが報告されている。しかしながら、環境水中における抗生物質の基礎的研究は少なく、それら知見は限られている。
【０００３】
現在、抗生物質の大量使用により、水域、海底土壌中に大量の抗生物質が残留しており、環境汚染、耐性菌の出現、食物連鎖による人体への摂取など、人的及び物的に与える影響が危惧される。実際、医薬品として人体に抗生物質が使用される場合、必ずいくつかの副作用が伴うことは周知の事実である。このような副作用が、環境を経由して、人体に現れる可能性は高い。従って、持続的な養殖魚生産には、魚病予防に対する有効性及び経済性だけでなく、人体及び環境に対する安全性を兼ね備えた抗生物質の投薬技術を確立する必要があった。
【０００４】
特許文献１では、ＫＮ菌を用いて豚尿に含まれる抗生物質を分解し無害化することが記載されている。ＫＮ菌は、複数の菌種が混在する微生物群であり、従って、抗生物質に対して複数の微生物の相乗的な分解作用を有するものと考えられる。しかし、複数の微生物が混在するという原理上、ＫＮ菌の保存やバイオレメディエーションの実施の際に、時間の経過とともに微生物種の組成の変化や微生物間での遺伝子組換えが生じ、抗生物質に対する分解能力が低下するという問題があった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−９４０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、微生物を用いて抗生物質を分解する方法及びこれに用いる微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
（２）プロテオバクテリアに属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリアに属する微生物である（１）記載の分解方法。
（３）γ−プロテオバクテリアに属する微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である（２）記載の分解方法。
（４）グラム陽性低ＧＣ含量細菌に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物である（１）記載の分解方法。
（５）グラム陽性高ＧＣ含量細菌に属する微生物がＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属する微生物である（１）記載の分解方法。
（６）アンピシリンを分解しうる能力を有するＲＡ４株。
（７）オキシテトラサイクリン塩酸塩を分解しうる能力を有するＲＯ１株。
（８）チアンフェニコールを分解しうる能力を有するＲＴ１株
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、微生物を用いて抗生物質を効果的に分解することができる。従って、水域や海底土壌中の抗生物質を分解し、浄化することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いる微生物としては、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌、又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質分解しうる能力を有する微生物であれば、特に制限はない。
【００１０】
本発明者らは、高知県浦ノ内湾の海底土壌から３８株の抗生物質を代謝する細菌株を得た。
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＴ１株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号１）、既知の細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに対し、９８．９％の相同性を示し、グラム陽性低ＧＣ含量細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属に属すると同定された。ＲＴ１株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７１で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００１１】
ＲＴ１株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で黄褐色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１２】
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＯ１株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号２）、既知の細菌Ｓｗｉｎｅ ｍａｎｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍに対し、９９．６％の相同性を示し、グラム陽性高ＧＣ含量細菌、特にＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属すると同定された。ＲＯ１株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７２で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【００１３】
ＲＯ１株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で黄褐色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１４】
高知県浦ノ内湾の海底土壌から得られた株のうち、ＲＡ４株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により（配列番号３）、既知の細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｌｏｓａに対する相同性が９１．８％であることから、γ−プロテオバクテリア群のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する新菌株と同定された。ＲＡ４株は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２００７３で、２００４年５月３１日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。
【００１５】
ＲＡ４株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で茶色のコロニーを形成し、抗生物質のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００１６】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報はＤＤＢＪデータベース中のFASTA SEARCHで既知細菌種との比較を行った(Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D.J. Lipman; Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。系統樹は、前記データベースで検索された既知細菌種を含め、近隣結合法に基づき作成した。ブーツストラップ値はPCソフトCLUSTAL W ver. 1.7 より決定した(Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nuc. Aci. Res. 22: 4673-4680 (1994))。
【００１７】
ＲＴ１株及びＲＯ１株について、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いて作成した系統樹を図１に示す。
【００１８】
ＲＡ４株について、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いて作成した系統樹を図２に示す。
本発明においては、前記のようにして得られた菌株を変異誘発処理して得られる変異株を用いてもよい。
【００１９】
変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことができる。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原を用いてもよい。
【００２０】
微生物の培養に際しては、通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。
【００２１】
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独又は組合せて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
【００２２】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸、アミノ酸などが単独又は組合せて用いられる。
【００２３】
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水和物、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類；チアミン塩酸塩などのビタミン類を加える。
【００２４】
本発明の対象となる抗生物質としては、魚類の養殖に用いられる水産用抗生物質、例えば、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン及びピペラシリンナトリウムなどのペニシリン系抗生物質、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びドキシサイクリン塩酸塩などのテトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール及びチアンフェニコールなどのクロラムフェニコール系抗生物質、ジョサマイシン、リンコマイシン、エリスロマシインなどのマクロライド系抗生物質、その他オキソリン酸、オレアンドマシン、ニフルスチレン酸ナトリウム、スルフイソゾールナトリウム、ミロキサシン等が挙げられる。本発明は、ペニシリン系、テトラサイクリン系及びクロラムフェニコール系の抗生物質、特に、アンピシリン、オキシテトラサイクリン塩酸塩及びチアンフェニコールの分解に有効である。
【００２５】
細菌による抗生物質の分解
予め培地中で細菌を前培養する。培地を容器に注ぎ、オートクレーブ処理した後、前培養物を接種する。培養後、ＨＰＬＣによって培養物中の抗生物質を定量する。
【００２６】
本発明の分解方法において、処理時のｐＨは、通常４〜１０、好ましくは６〜８、処理温度は、通常５〜３５℃、好ましくは２０〜２５℃、処理時間は、通常１週間以上、好ましくは２週間以上である。また、分解の際には、細菌の増殖を促進するため、十分な空気を通気し、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水和物、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類；チアミン塩酸塩などのビタミン類を加えることが好ましい。
【００２７】
海底土壌の場合、抗生物質汚染環境から海底土壌を処理施設へ運搬した後、土壌に分解細菌培養物を加え、数日間適温で保温する。土壌中の抗生物質濃度を測定し、抗生物質濃度が基準値以下であれば、土壌を環境中に戻す。
【００２８】
水質汚染の場合、抗生物質汚染環境から水を吸い上げ、分解細菌のバイオフィルムを通過させ、抗生物質を分解する。水質を検査した後、抗生物質濃度が基準値以下であれば、水を再び環境に排出する。これらの一連の操作は、水処理施設内に水を循環させることで行う。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）スクリーニング
滅菌後の試験管に、高知県浦の内湾より得られた海底土壌を１ｇとり、ろ過海水１０ｍｌに懸濁させ、室温で静置培養を行った。その後、上澄み液０．０５ｍｌを抗生物質含有寒天培地に塗沫し、３０℃インキュベーター内で一週間培養した。形成したコロニーを分解細菌とし、これを別の寒天培地に単離した。色、形状、生長具合など目視により種を分類した。
【００３１】
用いた培地組成は、１０００ｍｌのろ過海水に対し、バクトペプトン５ｇ、酵母エキス１ｇ、グルコース１０ｇ、寒天１５ｇ、そして抗生物質が１×１０−４Ｍになるよう加えた。
【００３２】
結果
各抗生物質を含んだ培地から目視により６〜１０種の分解細菌が分離され、計３８株得られた。
これらは前培養として抗生物質（１×１０−４Ｍ）含有液体培地に移植し、３０℃インキュベーター内に静置培養した。また、抗生物質寒天培地に植えかえし３０℃インキュベーター内に静置培養した後に、冷蔵庫内に保存した。寒天培地に培養したものは、一ヶ月後に植えかえをし、維持培養した。
【００３３】
（実施例２）細菌の同定
細菌からのＤＮＡ抽出
液体培地に細菌を植えかえ、３７℃で１〜２日間振とう培養し、細菌培養（１０ｍｌ）を遠心管にとり、３０００ｒｐｍで２０分間遠心した。ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（５００μｌ）で菌体を再懸濁した後、マイクロチューブに移し、１０％ＳＤＳ（６０μｌ）を加え、緩やかに攪拌後、５０℃で３０分間インキュベーションした。さらに１０ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（６０μｌ）６μｌと１０ｍｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ（６μｌ）を加え、５０℃で３０分間インキュベーションした。これに等量のフェノール（ｐＨ８）を加え、緩やかに攪拌し、常温で１２０００ｒｐｍで５分間遠心後、水層を新しいマイクロチューブに取り、５Ｍ ＮａＣｌ（１００μｌ）とＣＴＡＢ（８０μｌ）を加えて緩やかに攪拌し、６０℃で１０分間インキュベーションした。等量のクロロホルム−イソアミルアルコール混液を加え緩やかに攪拌し、常温で１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、水層を新しいマイクロチューブにとり、２倍量の１００％エタノールを加えた。これを−３０℃で一晩インキュベーションし、ＤＮＡを析出させた。
【００３４】
４℃で１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した後、上清を取り除き、沈殿に７０％エタノール（５００μｌ）を加え、４℃で１５０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清はピペットマンを用いて完全に取り除き、沈殿をドライアップした。これに超純水５０μｌを加え懸濁させ、ゲノムＤＮＡ量を測定した。
【００３５】
測定用試料は、ＤＮＡ懸濁溶液から１μｌとり、６９９μｌの超純水に溶解し、波長２００〜３００ｎｍ吸光度を測定し、２６０ｎｍＯＤ１＝５０ｎｇ／μｌの割合でＤＮＡ量を換算し、懸濁液中のＤＮＡ量を算出した。
【００３６】
ＰＣＲ
ＰＣＲ用のマイクロチューブを使用し、下記の成分を氷上で混合した。ＰＣＲにマイクロチューブし、下記の温度設定で１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅反応を開始した。
【００３７】
Ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２含有）・・１０μｌ
ｄＮＴＰ・・・・・・・・・・・・ ８μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ ２７Ｆ・・・・・・１０ｐｍｏｌ
Ｐｒｉｍｅｒ １４９２Ｒ・・・・１０ｐｍｏｌ
ＤＮＡ・・・・・・・・・・・・１００ｎｇ
Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・・・０．５μｌ
ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ・・・・・・・・・・Ｘμｌ
ｔｏｔａｌ・・・・・・・・・・・ １００μｌ
［温度設定］
９４℃ １０：００
(1) ９４℃ １：００
(2) ５６℃ ２：００
(3) ７２℃ ２：００
７２℃ ７：００
４℃
(1)〜(3)の操作を３０回繰り返す。
【００３８】
確認電気泳動
ＴＡＥバッファーに１．５％のアガロースを加えゲル混合液を調整し、電子レンジでゲルを溶解させ室温で冷ました後に、ゲル作成容器に注ぎゲルを固めた。泳動槽にＴＡＥバッファーを注ぎ、ゲルをセットした。
【００３９】
ＰＣＲ産物（１．０μｌ）、６×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１．０μｌ）及び滅菌脱イオン水（４．０μｌ）を混合した試料を、それぞれのレーンにアプライし、３０分ほど泳動した後、エチジウムブロマイド入りタッパーにゲルを移し、１５分間染色した後に２５４ｎｍ ＵＶ励起でバンドを確認した。
【００４０】
シークエンス用ＰＣＲ産物の精製
寒天からＰＣＲ産物を切り出し、穴開きマイクロチューブの中に入れ、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心し、下のマイクロチューブに寒天を落した。同量のフェノールを加えｖｏｒｔｅｘし、液体窒素中に１分間静置後、室温で融解させた。融解した試料を室温、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移した後、水層と等量のフェノール・クロロホルム（１：１）を加えた。室温で１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、水層を新しいマイクロチューブに移した後、水層量の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウムと等量の２−プロパノールを加え、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。上清を捨て、７０％エタノールを１ｍｌ加えｖｏｒｔｅｘし、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心した。水分を完全に取り除いた後、１０μｌのＴＥに件濁させ、電気泳動によってＰＣＲ産物１μｌを供し、産物量を確認する。
【００４１】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の決定
下記の成分を氷上で混合、下記の温度設定で反応を開始する。
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ・・・・・・１μｌ
希釈液・・・・・・・・・・・・・・７μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ２７Ｆ・・・・・・３．２ｐｍｏｌ
ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ・・・・１０〜５０ｎｇ
ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ・・・・・・・・Ｘμｌ
ｔｏｔａｌ・・・・・・・・・・・２０μｌ
［温度設定］
９４℃ ５：００
(1) ９６℃ ０：１０
(2) ５０℃ ０：０５
(3) ６０℃ ４：００
４℃
(1)〜(3)の操作を２５回繰り返す。
【００４２】
反応液２０μｌに１００％エタノール６４μｌと滅菌水１６μｌを加え、室温に１５分間放置した。室温、１５０００ｒｐｍで、２０分間遠心し、上清を完全に取り除き、７０％エタノール２５０μｌ加え、ｖｏｌｔｅｘを用いて撹拌した後、室温、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、得られた沈澱をドライアップした。ＴＳＲ１２．５μｌを加えてｖｏｌｔｅｘし、シークエンスにかけた。
【００４３】
相同性が９８％未満であったＲＴ１株、ＲＴ６株、ＲＴ８株、ＲＡ３株、ＲＡ４株及びＲＯ１株の６種が新種であることが見い出された。本来、ＰＣＲ法による塩基配列情報の読み間違いが１０００分の１の確立で起こり、突然変異の確立など総合し相同性が９９．８％未満であるものを新種とするが、今回経験上ＰＣＲ法による塩基配列情報の読み間違いが約２％起こるものとし、確実に新種であると判断できる相同性を９８％未満とした。
【００４４】
（実施例３）分解能力の確認
スクリーニングにより得られた分解細菌を、寒天培地と同組成の液体培地で一週間３０℃インキュベーター内で前培養を行った。その後ガラス製試験管に同組成の液体培地９ｍｌを入れ、前培養した細菌を１ｍｌ植えつけ、３０℃インキュベーター内に三週間静置培養した。一週間毎にその液体培地中の抗生物質濃度をＨＰＬＣで測定することで、分解能力の確認を行った。結果を図３〜５に示す。
【００４５】
チアンフェニコール分解細菌である、ＲＴ１株及びＲＴ６株は、２週間後にそれぞれ２割及び６割の分解率を示した（図３）。
アンピシリン分解細菌である、ＲＡ３株とＲＡ４株は２週間後に７〜８割の分解率を示した（図４）。
オキシテトラサイクリン塩酸塩分解細菌である、ＲＯ１株は、２週間後に４割の分解率を示した（図５）。
【００４６】
（実施例４）海底土壌中における分解能力の確認
浦ノ内湾より採取した海底土壌１ｇをオートクレーブで滅菌し（１２１℃、２０分）、抗生物質を１０−４Ｍ／ｇとなるように添加した。予め前培養した分解細菌株（ＲＴ１株、ＲＴ６株、ＲＴ８株、ＲＡ３株、ＲＡ４株）の培養液０．１ｍｌをそれぞれ加えてよく混合した。この際、必要に応じて、分解細菌の増殖を促進するために空気や栄養分（例えば、硝酸塩、リン酸塩、ビタミン類等）を加え、分解細菌の活性を高めた。３０℃インキュベーター内で一週間静置培養した。一週間後に試料中の抗生物質濃度を測定して分解率を求めた。結果以下の表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
分解能力確認実験で液体培地中で分解能力を示した菌株が、海底土壌中でも分解活性を示すことが確認された。また、これら分解細菌種が活性を発揮するために十分な空気を添加することが好ましいことも明らかとなった。
【００４９】
（実施例５）分解細菌の生長速度と分解速度
３０ｍｌポリカーボネートを培養用容器として用い、（実施例３）と同組成の液体培地２９ｍｌに前培養した細菌を１ｍｌ植えつけ、３７℃バイオシェーカー内で培養を行った。分解細菌の生長量は５４０ｎｍにおける濁度として、専用セルホルダーに３０ｍｌポリカーボネート容器をおいて、分光光度計で直接測定した。培地中の抗生物質は、マイクロチューブに１ｍｌ採取後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心、０．４５μｍメンブランフィルターでろ過し、ＨＰＬＣを用い以下の測定条件で測定した。
（ａ）カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０２ ＨＱ 移動相：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４（ｐＨ３．１）
（ｂ）カラム：ＯＤＳ ＲＰ−１８ ＧＰ 移動相：２０ｍＭ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４：ＡＮ＝８０：２０
（ｃ）カラム：ＯＤＳ ＲＰ−１８ ＧＰ 移動相：１０ｍＭ ＴＦＡ：ＡＮ＝８０：２０
分解能力確認実験でアンピシリンに対し高い分解能力を示したＲＡ３株、ＲＡ４株について、その生長量と分解割合の経時変化を調べた。その結果を図６及び７に示す。
【００５０】
ＲＡ３株は一日目、ＲＡ４株は二日目に対数的に増殖し、それと同時にアンピシリンを速い速度で分解することが確認された。これは、これら分解細菌が生長の際にアンピシリンを代謝していることを示している。したがってＲＡ３株、ＲＡ４株は、アンピシリンをはじめペニシリン系の抗生物質が持つβラクタム環を分解する酵素、ラクタマーゼを放出している可能性が高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】抗生物質分解菌の系統学的位置付けを示す図である。
【図２】抗生物質分解菌の系統学的位置付けを示す図である。
【図３】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図４】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図５】抗生物質分解菌の液体培地中における抗生物質の分解能を示す図である。
【図６】ＲＡ３株について、その生長量と分解割合の経時変化を示す図である。
【図７】ＲＡ４株について、その生長量と分解割合の経時変化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
【請求項２】
プロテオバクテリアに属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリアに属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項３】
γ−プロテオバクテリアに属する微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である請求項２記載の分解方法。
【請求項４】
グラム陽性低ＧＣ含量細菌に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項５】
グラム陽性高ＧＣ含量細菌に属する微生物がＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項６】
アンピシリンを分解しうる能力を有するＲＡ４株。
【請求項７】
オキシテトラサイクリン塩酸塩を分解しうる能力を有するＲＯ１株。
【請求項８】
チアンフェニコールを分解しうる能力を有するＲＴ１株。
【請求項１】
抗生物質を、プロテオバクテリア(Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陽性低ＧＣ含量細菌又はグラム陽性高ＧＣ含量細菌に属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを含む、抗生物質の分解方法。
【請求項２】
プロテオバクテリアに属し、かつ抗生物質を分解しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリアに属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項３】
γ−プロテオバクテリアに属する微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物である請求項２記載の分解方法。
【請求項４】
グラム陽性低ＧＣ含量細菌に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項５】
グラム陽性高ＧＣ含量細菌に属する微生物がＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項６】
アンピシリンを分解しうる能力を有するＲＡ４株。
【請求項７】
オキシテトラサイクリン塩酸塩を分解しうる能力を有するＲＯ１株。
【請求項８】
チアンフェニコールを分解しうる能力を有するＲＴ１株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−６２３７（Ｐ２００６−６２３７Ａ）
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１８９５７５（Ｐ２００４−１８９５７５）
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月２８日（２００４．６．２８）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
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