抗癌剤として有用な新規のカチオン性１７α−置換−エストラジオール誘導体
本発明は、新規の一連の脂質ベースのカチオン性１７α−置換−エストラジオール誘導体を提供する。本発明は、更に、新規の一連の１７α−置換−エストラジオール誘導体の調製のための方法を提供する。本発明は、エストロゲン反応性細胞株におけるこれらの分子の高度に選択的な抗癌活性に関する情報も提供する。該化合物は、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）のような婦人科関連の癌細胞株に対して高レベルの毒性を誘発する。本発明のクラスの脂質ベースのカチオン性エストラジオール誘導体は、民族性にかかわらず、女性集団に最もよくみられる婦人科関連の癌の治療のための標的特異的に送達可能な抗癌剤の開発に特定の用途を見出されると思われる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤として有用な新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体に関する。特に、本発明は、エストロゲン受容体に対する天然リガンドであるエストラジオールの新規の一連の脂質ベースのカチオン性誘導体に関する。より詳細には、本発明は、化学式Ａの新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体に関する。
【０００２】
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【０００３】
本発明は、化学式Ａの新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体の調製方法にも関する。本発明は、エストロゲン反応性細胞株におけるこれらの分子の高度に選択的な抗癌活性に関する情報を提供する。本発明から最も恩恵を受けやすい医学分野は標的癌治療である。
【背景技術】
【０００４】
化学療法及び放射線療法は、癌の治療に対して最も一般的に用いられる現行の２つの臨床治療法である。大抵の場合、これらの手法は腫瘍の増殖を阻止するのに有効である。しかし、おそらく、不完全な細胞殺滅、又は薬剤耐性を獲得する細胞のせいで、疾患の再発が頻繁に生じる。正常細胞の非特異的集積及び殺滅という付加的な不利点もあり、ヒトにおいて修復不能な細胞毒性をもたらす。これは主に、通常、細胞傷害性薬物が標的性を有さないためである。現在必要なことは、癌特異的分子標的を用いて、例えば、乳癌細胞を標的としてそれらを殺滅するための乳癌特異的蛋白質、例えば、エストロゲン受容体を用いて、ある特定の由来の癌を標的とする、より新しい薬物を開発することである。
【０００５】
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、癌及び非癌表現型を有する、大部分が婦人科関連の細胞、主に、胸部、子宮及び卵巣細胞に存在する核ホルモン受容体である。ＥＲは血管内皮細胞においても強度に発現することが見出されており、一酸化窒素シンターゼの生成を調節し、故に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の正の生成及び調節に直接役立つ（３）。ＶＥＧＦは腫瘍塊の持続的増殖のための周知の血管新生因子の１つである。
【０００６】
ＥＲは２つのサブタイプα及びβを有する。この受容体はリガンド活性化転写因子であり、活性化と同時に核内に移動する。古典的には、ＥＲはホモ二量体としてエストロゲン
応答配列（ＥＲＥ）と称される特定のＤＮＡ配列に結合し、標的遺伝子の転写を正又は負に調節する。乳癌細胞において、それぞれの遺伝子のＥＲＥプロモーター活性を通じてＥＲはＢＣｌ−２，ＢＲＣＡ−１，ＶＥＧＦのような癌促進遺伝子を調節する（１）。従って、ＥＲは発癌作用の正の調節因子であり、故に、ＥＲは新規のＥＲ標的療法を設計することにより癌を治療するための非常に有用な標的として機能する。
【０００７】
最近、本出願人らは、ＥＲに対する天然リガンドであるエストロゲンが、ステルスカチオン性リポソーム系に結合すると、標的特異的に乳癌細胞への抗癌遺伝子送達を媒介することを示した（２）。ＥＲに対する内因性リガンドであるエストラジオールは化学修飾され、乳癌及び骨粗鬆症を含む様々な疾患を阻止するのに重要性が高いＥＲ機能を調節する。初期、即ち、エストロゲン応答期の間、乳癌は化学療法管理を通じて良好に阻止されうる。乳癌及び骨粗鬆症の治療のための新世代薬物を開発するため、１７−ベータエストラジオールには様々な構造修飾及び複数のプロアクティブな化学的成分が含まれる。この作用に対して挙げることが可能な複数の例がある：エンジイン系間において、ステロイド部分のエンジイン系に結合するエストラジオールの１７α−アルキニル結合体は、エストラジオールに匹敵するＥＲ親和性を有する。該化合物は、既知のクラスの抗癌剤であるエンジイン系のシクロ芳香族化によって生じるジイルラジカルの生成を通じ、抗癌標的プロドラッグとして一時的に機能する（４）。アルキル基サイズを有する１７−アルキルエストラジオールは、メチルからドデシルまでそれらの炭素鎖が広範に異なり、これも合成され試験されてステロイドスルファターゼ、即ち、正常細胞及び癌細胞における硫酸化エストロゲンの遊離エストロゲンへの転化に関与する酵素に対する優れた抑制作用を見出されている（５）。１７−αアジド−アルキニル基を含むエストラジオールはＥＲアゴニスト特性を有することが見出されている（６）。エストラジオールのＣ−１６位もＥＲ標的アンタゴニスト／アゴニストを合成するのに用いられる。該Ｃ−１６位は炭素鎖長及びアミド結合で導入され、抗エストロゲン特性を誘発する（７）。天然ホルモンであるエストラジオールの哺乳動物の内因性代謝産物である２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ２）の合成アナログも広範に合成されて検討され、代謝産物２−ＭＥ２自体が天然に有するものに比べて高い抗有糸分裂活性が見出されている（８〜１２）。該細胞における共有結合性ＤＮＡ付加物の形成により、ＥＲ陽性細胞に対してのみ遺伝毒性を有する、エストラジオールの７−α位におけるアニリンマスタード結合体が開発されている（１３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１７α−エストラジオール及びカチオン性二重鎖脂質部分を含む新規の一連のエストロゲン受容体に結合する化学的化合物の開発に関する。本明細書で述べる、この新規クラスのカチオン性エストラジオールの送達誘発性抗癌特性は、婦人科関連の癌細胞のみ、特に、乳癌細胞、また、子宮頸癌細胞に対して著しく指向性を示す。このクラスの分子の細胞毒性は、非婦人科関連の癌細胞及び非癌系統の場合、最小限から皆無である。これは、それぞれの細胞における細胞毒性が、おそらく、婦人科関連の癌表現型に深く関与するエストロゲン受容体を通じて媒介されるということを示す。従って、本発明のクラスのカチオン性エストラジオール誘導体は、エストロゲン受容体に関連する癌に対する抗癌治療に今後の適用を見出すと思われる。更に、本発明のクラスの化合物はそれらの構造にカチオン性部分を有し、しかも、至適カーボン鎖長を有するカチオン基はカチオン性リポソームのような凝集性を有し得、これは、該分子がＤＮＡ（ポリアニオン性の生物学的に重要な高分子）に結合するのに役立ちうる。従って、本発明のクラスの分子は、癌を治療することを目的に、ＥＲに関連する癌細胞へのＤＮＡ送達剤として機能し得、Carolyn M. Klinge. Nucleic Acid Research, 2001, 29, 2905-2919; Reddy B.S. and Banerjee R. Angewandte Chemie Int. Ed., 2005, 44, 6723-6727; Ken L. Chambliss and Philip W. Shaul, Endocrine Review, 2006, 23, 665-686; Jones et. al. J. Org. Chem., 2001;
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5-4478; Kasiotis et. al. Steroids, 2006, 71 , 249-255; Pelletier et. al. Steroids, 1994, 59, 536- 547; Rao et. al. Steroids, 2002, 67, 1079-1089; Cushman et. al. J. Med. Chem., 1995, 38, 2041-2049; Sachdeva Y. et. al. World Patent No. 9840398, 1998; Purohit A et. al. Int. J. Cancer 2000, 85, 584-589; Brueggemeier R. W.
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照しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体を提供する。
【００１０】
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００１１】
本発明の一実施形態では、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は脂肪族炭化水素鎖であり、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ１及びＲ２が独立して水素又は脂肪族炭化水素鎖であると、Ｒ３はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基又は水素原子であり、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。
【００１４】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ３はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１５】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ３は水素原子であり、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１６】
本発明の更に別の実施形態では、化学式Ａの代表的化合物は次のようになる：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
【００１７】
本発明の更に別の実施形態では、該化合物は、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞株由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態では、１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）は、５０μＭの前記化合物の濃度にて４時間の処理及び６日間のアッセイ期後、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、Ｈｅｌａ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８からなる群より選択される癌細胞株に対し、２〜１０％の範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率パーセントを示す。
【００１９】
本発明は、更に、
ａ）カチオン性エストラジオール誘導体、
ｂ）コリピド（co-lipid）並びに
ｃ）医薬的に許容可能な担体、補助剤又は添加剤を任意に有するポリアニオン化合物
を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
一実施形態では、
ａ．カチオン性エストラジオール誘導体、
ｂ．コリピド（co-lipid）並びに
ｃ．医薬的に許容可能な担体、補助剤又は添加剤を任意に有するポリアニオン化合物を含む該医薬組成物は、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。
【００２１】
本発明の更に別の実施形態では、カチオン性エストラジオール誘導体とコリピド（co-lipid）のモル比は約１：１である。
【００２２】
本発明の更に別の実施形態では、カチオン性エストラジオール誘導体及びコリピド（co-lipid）を含む総脂質とポリアニオン化合物（ＤＮＡ）のモル比は１：１〜８：１の範囲である。
【００２３】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるカチオン性エストラジオール誘導体は一般化学式Ａの化合物を含む。
【００２４】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油
性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００２５】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるコリピド（co-lipid）は、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）からなる群より選択される。
【００２６】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるポリアニオン化合物は、治療上重要な蛋白質、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド又は蛋白質をコードすることが可能である。
【００２７】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるポリアニオン化合物は、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドからなる群より選択される。
【００２８】
本発明の更に別の実施形態では、用いられる核酸は環状若しくは線状プラスミド又はリボ核酸である。
【００２９】
本発明は、更に、一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体の合成のための方法を提供する。
【００３０】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７の整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から任意に選択される。）
前記方法は、
ａ．既知の方法によりエストロンから３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールを調製するステップ、
ｂ．無水有機溶媒中、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、上述の前記３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールのアルデヒド化合物をモノ−又はジ−アルキルアミンと反応させ、対応する二級又は三級アミンを得て、次に、有機溶媒中、ハロゲン化アルキルと反応させ、これに伴う三級又は四級化アミンをそれぞれ得て、中間体三級アミンの四級化が−１０℃〜５０℃の範囲の温度にて行われることを特徴とするステップ、
ｃ．既知の方法によりステップ（ｂ）において得られる上述の前記三級又は四級化アミンの芳香族ヒドロキシル基のシリル保護を脱保護し、次に、ハロゲン化物イオン交換樹脂を
用いてイオン交換クロマトグラフィーを行い、所望の化合物を得るステップを含む。
【００３１】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−又はジ−アルキルアミンは飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖を有する。
【００３２】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−又はジ−アルキルアミンの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖は、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素鎖からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−、ジ−アルキルアミンの炭化水素鎖は、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ａ）において用いられる有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン及び酢酸エチルからなる群より選択される。
【００３５】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｂ）において用いられる有機溶媒は、ジクロロメタン、メタノール及びこれらの混合物からなる群より選択される。
【００３６】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｂ）において用いられるハロゲン化アルキルは、Ｃ１〜Ｃ５ハロゲン化アルキルから選択される。
【００３７】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｃ）において用いられるハロゲン化物イオン交換樹脂は、塩化物、臭化物及びヨウ化物イオン交換樹脂からなる群より選択される。
【００３８】
本発明の更に別の実施形態では、化学式Ａの代表的化合物は次のようになる：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、一連の新規カチオン性エストラジオール誘導体の合成方法、並びに種々のヒト乳癌及び子宮頸癌細胞における、それらのエストロゲン受容体媒介性抗癌活性の評価に関する。１７β−エストラジオール部分を含む新規の脂質ベースのカチオン性誘導体は、エストロゲン受容体と直接／間接的に関連する癌細胞を標的として特異的に作用する抗癌剤として機能する。本発明から最も恩恵を受けやすい科学分野は標的癌治療である。
【００４０】
本発明において開示されるカチオン性エストラジオール誘導体に一般的な顕著な新規構造的特徴は、（１）正荷電窒素原子に直接結合する疎水基の存在及び（２）エストロゲン受容体に結合する１７β−エストラジオール基の存在を含む。これらの独特な構造的特徴が、本明細書で開示される新規カチオン性エストラジオール誘導体のエストロゲン受容体媒介性抗癌活性に直接的／間接的に有意に寄与すると考えられる。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、「カチオン性」とは四級化窒素又はプロトン化窒素原子上の正電荷を意味する。本発明の脂質ベースの誘導体のカチオン特性は、脂質ベースの誘導体と、特に、乳癌及び子宮頸癌細胞における原形質膜糖蛋白質のような細胞構成物との亢進的で選択的な相互作用に寄与しうる。この見地から生じる特異性の理由は未だ解明されていないが、このような脂質ベースのカチオン性誘導体と細胞膜構成物との相互作用の亢進は、分子に結合した状態である対象治療成分を癌細胞に良好に輸送するのにも重要な役
割を果たしうる。
【００４２】
本発明のカチオン性エストラジオール誘導体は、特定の一般的な構造的及び機能的な基を有する。そのようなものとして、前記カチオン性エストラジオール誘導体は次の一般化学式（Ａ）によって示されうる。
【００４３】
【化５】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はアルキル（Ｃ１〜Ｃ５、直鎖又は分枝鎖）である。；ｎは２から７の整数であり、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００４４】
本発明のカチオン性エストラジオール誘導体は、水溶液中にて脂質複合体又は凝集体の形成を促進し、或いは促進し得ない親油性ドメインを有する。しかし、エストラジオール部分の存在のため、分子は血清関連のＩｎ ｖｉｖｏ模倣状態において安定した可溶性状態を維持する。これは、主に疎水性の分子であるエストロゲンが、自然に「ポケットに入る」状態として血清蛋白質中に残留することにより、卵巣の外部へ自由に移動し、血管及びリンパ管体中を進み、乳房及び子宮のような対象臓器へ向かうという事実と一致する。
【００４５】
例示的な親油性Ｒ１及びＲ２基は、（１）飽和Ｃ２〜Ｃ２２アルキル基及び（２）１，２又は３個の二重結合を有する不飽和Ｃ２〜Ｃ２２アルケニル基を含む。本開示のカチオン性脂質の好ましい一実施形態では、Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−オクチル、Ｒ３はメチルであり、ｎ＝３、Ｘ−は塩化物イオンである。従って、１番の化合物は本発明に記載の新規カチオン性エストラジオール誘導体の代表例である。
【００４６】
【化６】
【００４７】
（カチオン性エストラジオール誘導体の合成）
スキーム１は、本発明において述べる代表的なカチオン性エストラジオール誘導体１を調製するために用いられる合成方法の概要を示している。
【００４８】
【化７】
Ａ．ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＢＤＭＳトリフラート）、２，６−ルチジン、無水ＤＣＭ
Ｂ．Ｍｇ、臭化アリル、無水ＴＨＦ、１，２−ジブロモエタン（開始剤として）
Ｃ．ボラン−ジメチルスルフィド錯体（ＢＨ３．ＤＭＳ）、３ＮＮａＯＨ、３０％Ｈ２Ｏ２、無水ＴＨＦ
Ｄ．塩化オキサリル、ＤＭＳＯ、トリエチルアミン、−７８℃、無水ＤＣＭ
Ｅ．Ｎ，Ｎ−ジオクチルアミン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、無水ＤＣＭ
Ｆ．ヨウ化メチル、ＤＣＭ＋メタノール（１：１）
Ｇ．テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、ＴＨＦ、ＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６
【００４９】
（代表的化合物１，２及び３の構造体）
【化８】
【００５０】
【化９】
【００５１】
【化１０】
【００５２】
（本発明に記載の新規カチオン性エストラジオール誘導体Ａの癌細胞特異的抗癌特性）
様々なモル濃度（０．５μＭ〜５０μＭ）にわたり、種々の癌及び非癌細胞に対する誘導体Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験が行われた。癌細胞は、乳癌細胞ＭＣＦ−７（原発癌）、Ｔ４７Ｄ（腺管癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（続発性、転移性）；子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ；肺癌細胞Ａ５４９（転移性）のような様々な由来のものから選定された。本試験に選定された非癌細胞はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＣＯＳ−１（サル腎細胞）であった。一連の試験において、細胞は誘導体Ａの様々な濃度にて４時間処理され、洗浄され、血清培地に６日間維持され、４日後にアッセイが行われた一細胞株を除き（図３）、ＭＴＴアッセイを用いて細胞毒性を観察した（図１，２，４，６Ａ及び６Ｂ）。別の一連の試験において、細胞は血清培地の存在下、４８時間連続して処理され、細胞毒性は直ちにアッセイされた（図５）。図１〜３から明らかなように、乳癌細胞は１０μＭの誘導体Ａの４時間のみの最初の曝露に対し、５０％未満の生存率を示した。図４から明らかなように、４時間のみの曝露後、１０μＭの誘導体ＡはＡ５４９、Ｈｅｌａ、ＣＨＯ及びＣＯＳ−１細胞に対して細胞毒性を誘発しなかった。これは、エストロゲン受容体と直接／間接的に関連する乳癌細胞が、誘導体Ａで処理されると、細胞殺滅を受けやすかったことを示す。ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄは天然ＥＲ発現乳癌細胞であり、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は天然ＥＲノックアウト乳癌細胞である。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ乳癌細胞は、エストロゲン曝露後、遺伝子導入の亢進のような非常に興味深い生化学的特性を示し（１４〜１５）、これにより、ＥＲ発現は皆無であるが、この細胞株において外来エストロゲンを用いうる生化学的経路が依然として活性化していることを示す。従って、エストロゲン又は誘導体Ａのようなその誘導体は、もはや天然ＥＲを発現しないある種の乳癌細胞において何らかの未解明の生化学的現象を示す。従って、図１〜４は、誘導体Ａの短時間の曝露であっても、乳癌細胞が直接／間接的にＥＲと関連する、最も作用を受ける細胞であることを示した。
【００５３】
第二の一連の試験において、１０μＭの誘導体Ａの４８時間連続曝露後、乳癌細胞のみならず子宮頸癌細胞Ｈｅｌａも極低生存率を示した（図５）。１０μＭの誘導体Ａの４８時間連続処理であっても、癌細胞Ａ５４９及び非癌細胞ＣＨＯは毒性の徴候を示さなかった。この一連の結果は、誘導体Ａの連続曝露にて、婦人科関連の由来、即ち、乳房、子宮頸部などに由来する癌細胞は、１０μＭの極低濃度であっても５０％又はそれよりはるかに低い生存率を示した。エストロゲンは婦人科関連の臓器の正常な成長に対し、直接／間接的な役割を有する天然リガンドである。ＥＲとの結合後、エストロゲンは乳癌又は他の婦人科関連の癌において、複数の癌促進遺伝子を調節しうる（１）。従って、エストラジ
オールの任意の誘導体が、直接／間接的にＥＲと関連する婦人科関連の臓器への標的送達を示しうることは当然である。本出願人らのエストラジオール誘導体は、おそらく何らかの未解明の遺伝的調節により、婦人科関連の癌細胞のみにおいて抗癌活性を促進し、婦人科に関係しない癌細胞及び非癌細胞には影響を与えない状態におく。
【００５４】
（応用）
本発明は、乳癌、子宮頸癌などのような婦人科関連の癌を治療することに利用できる。本発明の脂質誘導体も、標的治療を目的としてポリアニオン、ポリペプチド又はヌクレオポリマー（nucleopolymer）を、エストロゲン受容体を介して癌細胞のみに送達するよう
に用いられうる。本明細書で開示されるカチオン性エストロゲン誘導体は、治療的使用のために発現ベクターを細胞に送達するように用いられうる。発現ベクターは遺伝子治療プロトコルにおいて、治療上有用な蛋白質を細胞に送達し、或いは治療上有用な蛋白質分子をコードする核酸を送達するために用いられうる。本発明、即ち、カチオン性エストラジオール誘導体は、親油性化合物であるドキソルビシンのような抗癌補助剤を含むアニオン性、両性イオン性及び親油性治療剤と配合され、本発明の誘導体及び治療剤を含む複合体を得ることができる。特に、本発明で開示されるカチオン性エストラジオール誘導体は、癌に対して効果的な今後の標的抗癌治療法の開発の可能性を有する。
【００５５】
（細胞及び細胞培養）
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＭＣＦ−７（ヒト原発性乳腺癌）、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳管癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト続発性乳腺癌）及びＡ−５４９（ヒト肺癌）細胞株は、インド、プネー（Pune）に所在する国立細胞科学センター（National Centre for Cell Sciences）（ＮＣＣＳ）から得られ、マイコプラズマを含まなかった。細胞は、５％ＣＯ２
を含む加湿大気中、１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）［ＭＤＡＭＢ−４６８細胞ではＲＰＭＩ １６４０培地］にて３７℃で培養さ
れた。すべての試験に対し、８５〜９０％の集密度の培養物が用いられた。細胞は、生存率の検討のため、トリプシン処理され、計数され、９６ウェルプレートにて継代培養された。細胞は試験に用いられる前に一晩付着させられた。
【００５６】
（試料の調製及び試料の処理）
カチオン性エストラジオール誘導体は細胞培養グレードのＤＭＳＯ中に溶解され、一次原液を得た。該原液はＤＭＳＯで漸進的に希釈され、二次原液を得る。最後に、１０％ウシ胎仔血清含有細胞培地に該ＤＭＳＯ二次原液を加えることにより、誘導体の実用濃度が得られた。実用溶液中のＤＭＳＯの量は血清含有培地に対して０．２％を超えなかった。それぞれの濃度のカチオン性エストラジオール誘導体を含む細胞培養液１００μｌが、リン酸緩衝生理食塩水で予め洗浄された細胞に付与される。細胞はそれぞれの濃度のエストラジオール誘導体に４時間又は４８時間曝露状態にされた。４時間の処理では、細胞は、洗浄され、場合により４日又は６日間、実用濃度のエストラジオール誘導体を含まない細胞培地の存在下に維持された。次に、細胞はＭＴＴを用いて生存率についてアッセイされた。４８時間連続処理では、細胞は、洗浄され、直ちにＭＴＴを用いて生存率についてアッセイされた。
【００５７】
次の実施例は、実際の実施形態における本発明の運用の例示として挙げられ、従って、本発明の範囲を限定すると読み取り、或いは解釈されるべきではない。
【００５８】
（実施例１）
（カチオン性エストラジオール誘導体の合成（スキーム１））
（ステップＡ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシエストロンの合成：）
無水ＤＣＭ及び無水ＤＭＦ（９：１ｖ／ｖ）中のエストロン（ａ）（１ｇ，３．６９ミリモル）溶液に、２，６ルチジン１．１８ｇ（１１．０９ミリモル）及びＴＢＤＭＳ−トリフラート０．９３ｍｌ（４．０６ミリモル）を０℃で加えた。該反応混合物を室温で３０分攪拌した。該反応混合物をジクロロメタン２０ｍｌに取り込み、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×２０ｍｌ）、水（２×２０ｍｌ）及び食塩水（１×２０ｍｌ）で洗浄した。最後に、該非水性溶媒を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させた。乾燥残留物のカラムクロマトグラフィー精製（溶離溶媒混合物として６０〜１２０メッシュシリカゲル及びヘキサン中２％酢酸エチルを用いて）により、白色固形物（１．０１ｇ、収率７１％、ヘキサン中１０％酢酸エチル中Ｒｆ ０．４）としてａ１が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，１．０［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．４−１．７及び１．９−２．５５［ｍ，１３Ｈ，シクロペンタン及びシクロヘキサン環プロトン］，２．８５［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，６．５２［ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５７［ｄｄ，Ｊ１＝２．６Ｈｚ及びＪ２＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，２−ＣＨ］，７．０９［ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ３６ＳｉＯ２に対して３８４（観測質量）、３８４．６２（計算質量）
【００５９】
（ステップＢ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−プロペニル−１７β−エストラジオールの合成：）
無水ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＭｇ金属（３００ｍｇ，１２．５７ミリモル）の混合物に、１，２−ジブロモエタン（触媒量）及び臭化アリル（１．０７ｍｌ，１２．５７ミリモル）を窒素雰囲気下０℃で滴加した。該反応混合物を室温で３０分攪拌した。上記混合物に、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）中に溶解したａ１（９６７mg，２．５ミリモル）を０℃で加えた。該反応混合物を１６時間環流させた。反応終了後、該反応混合物を、塩化アンモニウム溶液の飽和溶液（２０ｍｌ）を室温で加えることにより急冷し、次に、酢酸エチル（２×２５ｍｌ）で抽出した。その有機層を、水（２×５０ｍｌ）、食塩水（１×５０ｍｌ）で洗浄し、最後に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。残留物のカラムクロマトグラフィー精製（溶離溶媒として６０〜１２０メッシュシリカゲル及びヘキサン中４％エーテルを用いて）により、白色固形物（８９０ｍｇ、収率８３％、ヘキサン中２０％エーテル中Ｒｆ
０．５８）としてａ２が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９１［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，１．０［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−１．７及び２．０５−２．４［ｍ，１３Ｈ，シクロペンタン及びシクロヘキサン環プロトン］，１．８５−２．０［ｄｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２］，２．８５［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，５．１−５．３２［ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２］，５．９５［ｍ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２］，６．５２［ｄ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５７［ｄｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０９［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ４２ＳｉＯ２に対して４２６（観測質量）、４２６．７１（計算質量）
【００６０】
（ステップＣ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−ヒドロキシプロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
１７α−プロペニル−β−エストラジオール（８９０ｍｇ，２．０９ミリモル）の攪拌ＴＨＦ（５ｍｌ）水溶液に、ＤＭＳ中のボラン（９７％水溶液、０．３ｍｌ、４．２８ミリモル）を０℃で加え、窒素下で６時間攪拌した。３ＮＮａＯＨ（６ｍｌ）及びＨ２Ｏ２（４．５ｍｌ，３０％ｗ／ｖ）の水溶液を０℃で加え、その混合物を室温まで加温した。次に、その結果生じた混合物を、水で急冷し、酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を、水（２×２５ｍｌ）、食塩水（１×２５ｍｌ）で洗浄し、最後に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で水分を蒸発させた。溶離溶媒混合物としてヘキサン／酢酸エ
チル（８０：２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにより粗化合物を精製し、４８１ｍｇ（５１．２５％）のアルコール（ａ３）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９１［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１７Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン及び１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ］，２．８０［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．６−３．７５［ｄｍ，２Ｈ，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ４３ＳｉＯ３に対して４４４（観測質量）、４４３．７２（計算質量）
【００６１】
（ステップＤ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の塩化オキサリル（２０５ｍｇ，１．６２ミリモル）の冷却（−７８℃、アセトンドライアイス浴（both））溶液に、無水ジメチルスルホキシド（２５２ｍｇ，３．２４ミリモル）を滴加し、その結果生じた混合物を１５分攪拌し、ジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解したアルコール（４８０ｍｇ，１．０１８ミリモル）を−７８℃で滴加した。その混合物を３０分攪拌し、トリエチルアミン（６５４ｍｇ，１２．５７ミリモル）を滴加し、その結果生じた混合物を室温で２時間、漸進的に加温した。該混合物を、水（５０ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（５０×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。更なる精製を行うことなく、その粗生成物（ａ４）を次の反応に対して継続させた。
【００６２】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎジオクチル（アミノ）プロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
上記のように調製した粗アルデヒド（ａ４）（４００ｍｇ，０．９０４ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジオクチルアミン（２１８ｍｇ，０．９０４ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３２９ｍｇ，４．５２ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及びヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物（ａ５）、１００ｍｇ（２５．２％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ４３Ｈ７７ＳｉＯ２Ｎに対して６６９（観測質量）、６６８．１６（計算質量）Ｃ４３Ｈ７７ＳｉＯ２Ｎ
【００６３】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップＥで得られた化合物（ａ５）（１００ｍｇ，０．１４９ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及びクロロホルム中２％メタノー
ルを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、８０ｍｇ（８０％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００６４】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（スキーム１における構造体１）：）
化合物（ａ６）（８０ｍｇ，０．１１７３ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、３７ｍｇ（４６．２５％）の化合物１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ３８Ｈ６４Ｏ２Ｎに対して５６８（観測質量）、５６６．９４（計算質量）
【００６５】
（実施例２）
（カチオン性エストラジオール誘導体２の合成）
ステップＡ〜Ｄは誘導体１（又は構造体１）の合成に示すものと同じである。
【００６６】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３Ｎ，Ｎジヘキサデシル（アミノ）プロパン］−１７β−エストラジオール：）
（実施例−１における）ステップ−Ｄにおいて調製した粗アルデヒド、（５００ｍｇ，１．１３ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジ−オクタデシリルアミン（５５８ｍｇ，１．４ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２８３ｍｇ，４．５０ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及びヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物、３２１ｍｇ（５７．３％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１
−ＣＨ］．
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ５９Ｈ１０９ＳｉＯ２Ｎに対して８９３（観測質量）、８９２．５４（計算質量）
【００６７】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップＥで得られた化合物（３００ｍｇ，０．３３５ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及びクロロホルム中２％メタノールを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、１７０ｍｇ（５６．６％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００６８】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（構造体２又は誘導体２）：）
上記で得られた化合物（１００ｍｇ，０．１１ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、６０ｍｇ（６０．０％）の構造体−２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ５４Ｈ９６Ｏ２Ｎに対して７９２（観測質量）、７９１．３６（計算質量）
【００６９】
（実施例３）
（カチオン性エストラジオール誘導体３の合成）
ステップＡ〜Ｄは誘導体１（又は構造体１）の合成に示すものと同じである。
【００７０】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン−１７β−エストラジオール：）
（実施例１における）ステップ−Ｅにおいて調製した粗アルデヒド、（５００ｍｇ，１．１３ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジ−ジエチルアミン（９０ｍｇ，１．２３ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２８３ｍｇ，４．５０ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフ
ィー精製（６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及び溶離液としてヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物、１８０ｍｇ（３６．０１％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００７１】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップ−Ｅで得られた化合物（１８０ｍｇ，０．３６ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及び溶離液としてクロロホルム中２％メタノールを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、１２０ｍｇ（６６．６％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００７２】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（構造体３又は誘導体３）：）
上記で得られた化合物（１２０ｍｇ，０．２３３ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、７２ｍｇ（６０．０％）の構造体−３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ４２Ｏ２Ｎに対して３８２（観測質量）、４００．６２（計算質量）
【００７３】
（実施例４）
（細胞生存率パーセント）
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）減少アッセイにより、カチオン性エストラジオール誘導体１の細胞毒
性を評価した。９６ウェルプレートにて該アッセイを行った。試験の継続時間に応じて、８０００〜１５０００個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、一晩維持した。例えば、細胞がプレートの底部に付着した１２時間後、それぞれの濃度の誘導体１を含む溶液を三つ組ウェルに添加した。前述のように、誘導体１の細胞に対する処理は４時間又は４８時間であった。４時間処理では、細胞を洗浄し、４日又は６日間血清培地に維持し、次に、ＭＴＴを細胞に添加した。４８時間処理では、細胞を直ちに洗浄し、次に、ＭＴＴを細胞に添加した。その結果を生存率パーセントとして示した＝［Ａ５４０（処理細胞）−バックグラウンド／Ａ５４０（未処理細胞）−バックグラウンド］×１００。図１〜６は、種々の濃度及び異なる由来の細胞にわたる、１に対するＭＴＴベースの細胞生存率アッセイの結果の概要を示す。
【００７４】
（実施例５）
（ＤＮＡ結合アッセイ）
０．８％アガロースゲル上のゲル遅延アッセイにより、１７α置換エストラジオール誘導体２及び３（構造体２及び３）のＤＮＡ結合能をアッセイした。
総量１６μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、０．４０μｇのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−βｇａｌをカチオン性エストラジオール誘導体（カチオン性エストラジオール誘導体において：ＤＮＡ電荷比８：１，４：１，２：１及び１：１）と複合体形成させ、ロータリーシェーカーにて室温で３０分インキュベートした。これに３μｌの６Ｘローディングバッファー（０．２５％ブロモフェノールブルー、４０％スクロース）を加え、全溶液を各ウェルにローディングした。これらの試料を８０Ｖで約２時間電気泳動させ、臭化エチジウム液で３０分染色することによりＤＮＡバンドを可視化し、次に、水中で３０分脱色した。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、ＭＣＦ−７細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、６日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図２】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、Ｔ４７Ｄ細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、６日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図３】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、４日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図４】様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された１０μＭの誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。
【図５】様々な癌及び非癌細胞において４８時間処理された１０μＭの誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、ＭＴＴにより直ちに生存率がアッセイされた。
【図６】（Ａ）様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された１０μＭの誘導体１，２及び３（即ち、構造体１，２及び３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。（Ｂ）様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された５０μＭの誘導体１，２及び３（即ち、構造体１，２及び３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。
【図７】コリピド（co-lipid）ＤＯＰＥと組み合わせた新規カチオン性１７−α置換エストラジオール−誘導体２及び３（構造体２及び３）が、特に、より高い電荷比４：１及び８：１にて部分的〜全ＤＮＡ凝集性を示していることを示す写真図である。コリピド（co-lipid）をコレステロールとして用いると、誘導体２及び３のＤＮＡ結合性は所定の条件では認められない。（Ａ）誘導体２のＤＮＡ結合性を示す写真図である。それぞれのコリピド（co-lipid）及びＤＮＡとして誘導体２（即ち、構造体２）、コレステロール又はＤＯＰＥを含む脂質ＤＮＡ複合体のゲル遅延アッセイの結果の概略を示す。誘導体２とそれぞれのコリピド（co-lipid）はモル比が１：１である。ＤＮＡ ０．４μｇを用いて総脂質とＤＮＡのモル比（又は電荷比＋／−）は、ゲル写真に示すように、１：１〜８：１にばらついた。最も右側のレーンには純粋なＤＮＡが泳動した。（Ｂ）誘導体３のＤＮＡ結合性を示す写真図である。それぞれのコリピド（co-lipid）及びＤＮＡとして誘導体３（即ち、構造体３）、コレステロール又はＤＯＰＥを含む脂質ＤＮＡ複合体のゲル遅延アッセイの結果の概略を示す。誘導体３とそれぞれのコリピド（co-lipid）はモル比が１：１である。ＤＮＡ ０．４μｇを用いて総脂質とＤＮＡのモル比（又は電荷比＋／−）は、ゲル写真に示すように、１：１〜８：１にばらついた。最も右側のレーンには純粋なＤＮＡが泳動した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤として有用な新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体に関する。特に、本発明は、エストロゲン受容体に対する天然リガンドであるエストラジオールの新規の一連の脂質ベースのカチオン性誘導体に関する。より詳細には、本発明は、化学式Ａの新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体に関する。
【０００２】
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【０００３】
本発明は、化学式Ａの新規カチオン性１７α置換エストラジオール誘導体の調製方法にも関する。本発明は、エストロゲン反応性細胞株におけるこれらの分子の高度に選択的な抗癌活性に関する情報を提供する。本発明から最も恩恵を受けやすい医学分野は標的癌治療である。
【背景技術】
【０００４】
化学療法及び放射線療法は、癌の治療に対して最も一般的に用いられる現行の２つの臨床治療法である。大抵の場合、これらの手法は腫瘍の増殖を阻止するのに有効である。しかし、おそらく、不完全な細胞殺滅、又は薬剤耐性を獲得する細胞のせいで、疾患の再発が頻繁に生じる。正常細胞の非特異的集積及び殺滅という付加的な不利点もあり、ヒトにおいて修復不能な細胞毒性をもたらす。これは主に、通常、細胞傷害性薬物が標的性を有さないためである。現在必要なことは、癌特異的分子標的を用いて、例えば、乳癌細胞を標的としてそれらを殺滅するための乳癌特異的蛋白質、例えば、エストロゲン受容体を用いて、ある特定の由来の癌を標的とする、より新しい薬物を開発することである。
【０００５】
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、癌及び非癌表現型を有する、大部分が婦人科関連の細胞、主に、胸部、子宮及び卵巣細胞に存在する核ホルモン受容体である。ＥＲは血管内皮細胞においても強度に発現することが見出されており、一酸化窒素シンターゼの生成を調節し、故に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の正の生成及び調節に直接役立つ（３）。ＶＥＧＦは腫瘍塊の持続的増殖のための周知の血管新生因子の１つである。
【０００６】
ＥＲは２つのサブタイプα及びβを有する。この受容体はリガンド活性化転写因子であり、活性化と同時に核内に移動する。古典的には、ＥＲはホモ二量体としてエストロゲン
応答配列（ＥＲＥ）と称される特定のＤＮＡ配列に結合し、標的遺伝子の転写を正又は負に調節する。乳癌細胞において、それぞれの遺伝子のＥＲＥプロモーター活性を通じてＥＲはＢＣｌ−２，ＢＲＣＡ−１，ＶＥＧＦのような癌促進遺伝子を調節する（１）。従って、ＥＲは発癌作用の正の調節因子であり、故に、ＥＲは新規のＥＲ標的療法を設計することにより癌を治療するための非常に有用な標的として機能する。
【０００７】
最近、本出願人らは、ＥＲに対する天然リガンドであるエストロゲンが、ステルスカチオン性リポソーム系に結合すると、標的特異的に乳癌細胞への抗癌遺伝子送達を媒介することを示した（２）。ＥＲに対する内因性リガンドであるエストラジオールは化学修飾され、乳癌及び骨粗鬆症を含む様々な疾患を阻止するのに重要性が高いＥＲ機能を調節する。初期、即ち、エストロゲン応答期の間、乳癌は化学療法管理を通じて良好に阻止されうる。乳癌及び骨粗鬆症の治療のための新世代薬物を開発するため、１７−ベータエストラジオールには様々な構造修飾及び複数のプロアクティブな化学的成分が含まれる。この作用に対して挙げることが可能な複数の例がある：エンジイン系間において、ステロイド部分のエンジイン系に結合するエストラジオールの１７α−アルキニル結合体は、エストラジオールに匹敵するＥＲ親和性を有する。該化合物は、既知のクラスの抗癌剤であるエンジイン系のシクロ芳香族化によって生じるジイルラジカルの生成を通じ、抗癌標的プロドラッグとして一時的に機能する（４）。アルキル基サイズを有する１７−アルキルエストラジオールは、メチルからドデシルまでそれらの炭素鎖が広範に異なり、これも合成され試験されてステロイドスルファターゼ、即ち、正常細胞及び癌細胞における硫酸化エストロゲンの遊離エストロゲンへの転化に関与する酵素に対する優れた抑制作用を見出されている（５）。１７−αアジド−アルキニル基を含むエストラジオールはＥＲアゴニスト特性を有することが見出されている（６）。エストラジオールのＣ−１６位もＥＲ標的アンタゴニスト／アゴニストを合成するのに用いられる。該Ｃ−１６位は炭素鎖長及びアミド結合で導入され、抗エストロゲン特性を誘発する（７）。天然ホルモンであるエストラジオールの哺乳動物の内因性代謝産物である２−メトキシエストラジオール（２−ＭＥ２）の合成アナログも広範に合成されて検討され、代謝産物２−ＭＥ２自体が天然に有するものに比べて高い抗有糸分裂活性が見出されている（８〜１２）。該細胞における共有結合性ＤＮＡ付加物の形成により、ＥＲ陽性細胞に対してのみ遺伝毒性を有する、エストラジオールの７−α位におけるアニリンマスタード結合体が開発されている（１３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１７α−エストラジオール及びカチオン性二重鎖脂質部分を含む新規の一連のエストロゲン受容体に結合する化学的化合物の開発に関する。本明細書で述べる、この新規クラスのカチオン性エストラジオールの送達誘発性抗癌特性は、婦人科関連の癌細胞のみ、特に、乳癌細胞、また、子宮頸癌細胞に対して著しく指向性を示す。このクラスの分子の細胞毒性は、非婦人科関連の癌細胞及び非癌系統の場合、最小限から皆無である。これは、それぞれの細胞における細胞毒性が、おそらく、婦人科関連の癌表現型に深く関与するエストロゲン受容体を通じて媒介されるということを示す。従って、本発明のクラスのカチオン性エストラジオール誘導体は、エストロゲン受容体に関連する癌に対する抗癌治療に今後の適用を見出すと思われる。更に、本発明のクラスの化合物はそれらの構造にカチオン性部分を有し、しかも、至適カーボン鎖長を有するカチオン基はカチオン性リポソームのような凝集性を有し得、これは、該分子がＤＮＡ（ポリアニオン性の生物学的に重要な高分子）に結合するのに役立ちうる。従って、本発明のクラスの分子は、癌を治療することを目的に、ＥＲに関連する癌細胞へのＤＮＡ送達剤として機能し得、Carolyn M. Klinge. Nucleic Acid Research, 2001, 29, 2905-2919; Reddy B.S. and Banerjee R. Angewandte Chemie Int. Ed., 2005, 44, 6723-6727; Ken L. Chambliss and Philip W. Shaul, Endocrine Review, 2006, 23, 665-686; Jones et. al. J. Org. Chem., 2001;
66, 3688-3694, and ref. 11 therein; Boivin et. al. J. Med. Chem., 2000, 43, 446
5-4478; Kasiotis et. al. Steroids, 2006, 71 , 249-255; Pelletier et. al. Steroids, 1994, 59, 536- 547; Rao et. al. Steroids, 2002, 67, 1079-1089; Cushman et. al. J. Med. Chem., 1995, 38, 2041-2049; Sachdeva Y. et. al. World Patent No. 9840398, 1998; Purohit A et. al. Int. J. Cancer 2000, 85, 584-589; Brueggemeier R. W.
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照しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明は、一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体を提供する。
【００１０】
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００１１】
本発明の一実施形態では、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は脂肪族炭化水素鎖であり、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ１及びＲ２が独立して水素又は脂肪族炭化水素鎖であると、Ｒ３はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基又は水素原子であり、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。
【００１４】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ３はアルキル基であり、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１５】
本発明の更に別の実施形態では、Ｒ３は水素原子であり、Ｒ１及びＲ２は脂肪族炭化水素鎖である。
【００１６】
本発明の更に別の実施形態では、化学式Ａの代表的化合物は次のようになる：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
【００１７】
本発明の更に別の実施形態では、該化合物は、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞株由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態では、１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）は、５０μＭの前記化合物の濃度にて４時間の処理及び６日間のアッセイ期後、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、Ｈｅｌａ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８からなる群より選択される癌細胞株に対し、２〜１０％の範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率パーセントを示す。
【００１９】
本発明は、更に、
ａ）カチオン性エストラジオール誘導体、
ｂ）コリピド（co-lipid）並びに
ｃ）医薬的に許容可能な担体、補助剤又は添加剤を任意に有するポリアニオン化合物
を含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
一実施形態では、
ａ．カチオン性エストラジオール誘導体、
ｂ．コリピド（co-lipid）並びに
ｃ．医薬的に許容可能な担体、補助剤又は添加剤を任意に有するポリアニオン化合物を含む該医薬組成物は、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す。
【００２１】
本発明の更に別の実施形態では、カチオン性エストラジオール誘導体とコリピド（co-lipid）のモル比は約１：１である。
【００２２】
本発明の更に別の実施形態では、カチオン性エストラジオール誘導体及びコリピド（co-lipid）を含む総脂質とポリアニオン化合物（ＤＮＡ）のモル比は１：１〜８：１の範囲である。
【００２３】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるカチオン性エストラジオール誘導体は一般化学式Ａの化合物を含む。
【００２４】
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油
性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００２５】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるコリピド（co-lipid）は、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）からなる群より選択される。
【００２６】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるポリアニオン化合物は、治療上重要な蛋白質、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド又は蛋白質をコードすることが可能である。
【００２７】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるポリアニオン化合物は、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドからなる群より選択される。
【００２８】
本発明の更に別の実施形態では、用いられる核酸は環状若しくは線状プラスミド又はリボ核酸である。
【００２９】
本発明は、更に、一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体の合成のための方法を提供する。
【００３０】
【化４】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７の整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から任意に選択される。）
前記方法は、
ａ．既知の方法によりエストロンから３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールを調製するステップ、
ｂ．無水有機溶媒中、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、上述の前記３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールのアルデヒド化合物をモノ−又はジ−アルキルアミンと反応させ、対応する二級又は三級アミンを得て、次に、有機溶媒中、ハロゲン化アルキルと反応させ、これに伴う三級又は四級化アミンをそれぞれ得て、中間体三級アミンの四級化が−１０℃〜５０℃の範囲の温度にて行われることを特徴とするステップ、
ｃ．既知の方法によりステップ（ｂ）において得られる上述の前記三級又は四級化アミンの芳香族ヒドロキシル基のシリル保護を脱保護し、次に、ハロゲン化物イオン交換樹脂を
用いてイオン交換クロマトグラフィーを行い、所望の化合物を得るステップを含む。
【００３１】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−又はジ−アルキルアミンは飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖を有する。
【００３２】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−又はジ−アルキルアミンの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖は、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素鎖からなる群より選択される。
【００３３】
本発明の更に別の実施形態では、用いられるモノ−、ジ−アルキルアミンの炭化水素鎖は、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素からなる群より選択される。
【００３４】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ａ）において用いられる有機溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン及び酢酸エチルからなる群より選択される。
【００３５】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｂ）において用いられる有機溶媒は、ジクロロメタン、メタノール及びこれらの混合物からなる群より選択される。
【００３６】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｂ）において用いられるハロゲン化アルキルは、Ｃ１〜Ｃ５ハロゲン化アルキルから選択される。
【００３７】
本発明の更に別の実施形態では、ステップ（ｃ）において用いられるハロゲン化物イオン交換樹脂は、塩化物、臭化物及びヨウ化物イオン交換樹脂からなる群より選択される。
【００３８】
本発明の更に別の実施形態では、化学式Ａの代表的化合物は次のようになる：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、一連の新規カチオン性エストラジオール誘導体の合成方法、並びに種々のヒト乳癌及び子宮頸癌細胞における、それらのエストロゲン受容体媒介性抗癌活性の評価に関する。１７β−エストラジオール部分を含む新規の脂質ベースのカチオン性誘導体は、エストロゲン受容体と直接／間接的に関連する癌細胞を標的として特異的に作用する抗癌剤として機能する。本発明から最も恩恵を受けやすい科学分野は標的癌治療である。
【００４０】
本発明において開示されるカチオン性エストラジオール誘導体に一般的な顕著な新規構造的特徴は、（１）正荷電窒素原子に直接結合する疎水基の存在及び（２）エストロゲン受容体に結合する１７β−エストラジオール基の存在を含む。これらの独特な構造的特徴が、本明細書で開示される新規カチオン性エストラジオール誘導体のエストロゲン受容体媒介性抗癌活性に直接的／間接的に有意に寄与すると考えられる。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、「カチオン性」とは四級化窒素又はプロトン化窒素原子上の正電荷を意味する。本発明の脂質ベースの誘導体のカチオン特性は、脂質ベースの誘導体と、特に、乳癌及び子宮頸癌細胞における原形質膜糖蛋白質のような細胞構成物との亢進的で選択的な相互作用に寄与しうる。この見地から生じる特異性の理由は未だ解明されていないが、このような脂質ベースのカチオン性誘導体と細胞膜構成物との相互作用の亢進は、分子に結合した状態である対象治療成分を癌細胞に良好に輸送するのにも重要な役
割を果たしうる。
【００４２】
本発明のカチオン性エストラジオール誘導体は、特定の一般的な構造的及び機能的な基を有する。そのようなものとして、前記カチオン性エストラジオール誘導体は次の一般化学式（Ａ）によって示されうる。
【００４３】
【化５】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はアルキル（Ｃ１〜Ｃ５、直鎖又は分枝鎖）である。；ｎは２から７の整数であり、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【００４４】
本発明のカチオン性エストラジオール誘導体は、水溶液中にて脂質複合体又は凝集体の形成を促進し、或いは促進し得ない親油性ドメインを有する。しかし、エストラジオール部分の存在のため、分子は血清関連のＩｎ ｖｉｖｏ模倣状態において安定した可溶性状態を維持する。これは、主に疎水性の分子であるエストロゲンが、自然に「ポケットに入る」状態として血清蛋白質中に残留することにより、卵巣の外部へ自由に移動し、血管及びリンパ管体中を進み、乳房及び子宮のような対象臓器へ向かうという事実と一致する。
【００４５】
例示的な親油性Ｒ１及びＲ２基は、（１）飽和Ｃ２〜Ｃ２２アルキル基及び（２）１，２又は３個の二重結合を有する不飽和Ｃ２〜Ｃ２２アルケニル基を含む。本開示のカチオン性脂質の好ましい一実施形態では、Ｒ１＝Ｒ２＝ｎ−オクチル、Ｒ３はメチルであり、ｎ＝３、Ｘ−は塩化物イオンである。従って、１番の化合物は本発明に記載の新規カチオン性エストラジオール誘導体の代表例である。
【００４６】
【化６】
【００４７】
（カチオン性エストラジオール誘導体の合成）
スキーム１は、本発明において述べる代表的なカチオン性エストラジオール誘導体１を調製するために用いられる合成方法の概要を示している。
【００４８】
【化７】
Ａ．ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＢＤＭＳトリフラート）、２，６−ルチジン、無水ＤＣＭ
Ｂ．Ｍｇ、臭化アリル、無水ＴＨＦ、１，２−ジブロモエタン（開始剤として）
Ｃ．ボラン−ジメチルスルフィド錯体（ＢＨ３．ＤＭＳ）、３ＮＮａＯＨ、３０％Ｈ２Ｏ２、無水ＴＨＦ
Ｄ．塩化オキサリル、ＤＭＳＯ、トリエチルアミン、−７８℃、無水ＤＣＭ
Ｅ．Ｎ，Ｎ−ジオクチルアミン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、無水ＤＣＭ
Ｆ．ヨウ化メチル、ＤＣＭ＋メタノール（１：１）
Ｇ．テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、ＴＨＦ、ＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６
【００４９】
（代表的化合物１，２及び３の構造体）
【化８】
【００５０】
【化９】
【００５１】
【化１０】
【００５２】
（本発明に記載の新規カチオン性エストラジオール誘導体Ａの癌細胞特異的抗癌特性）
様々なモル濃度（０．５μＭ〜５０μＭ）にわたり、種々の癌及び非癌細胞に対する誘導体Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験が行われた。癌細胞は、乳癌細胞ＭＣＦ−７（原発癌）、Ｔ４７Ｄ（腺管癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（続発性、転移性）；子宮頸癌細胞Ｈｅｌａ；肺癌細胞Ａ５４９（転移性）のような様々な由来のものから選定された。本試験に選定された非癌細胞はＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＣＯＳ−１（サル腎細胞）であった。一連の試験において、細胞は誘導体Ａの様々な濃度にて４時間処理され、洗浄され、血清培地に６日間維持され、４日後にアッセイが行われた一細胞株を除き（図３）、ＭＴＴアッセイを用いて細胞毒性を観察した（図１，２，４，６Ａ及び６Ｂ）。別の一連の試験において、細胞は血清培地の存在下、４８時間連続して処理され、細胞毒性は直ちにアッセイされた（図５）。図１〜３から明らかなように、乳癌細胞は１０μＭの誘導体Ａの４時間のみの最初の曝露に対し、５０％未満の生存率を示した。図４から明らかなように、４時間のみの曝露後、１０μＭの誘導体ＡはＡ５４９、Ｈｅｌａ、ＣＨＯ及びＣＯＳ−１細胞に対して細胞毒性を誘発しなかった。これは、エストロゲン受容体と直接／間接的に関連する乳癌細胞が、誘導体Ａで処理されると、細胞殺滅を受けやすかったことを示す。ＭＣＦ−７及びＴ４７Ｄは天然ＥＲ発現乳癌細胞であり、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８は天然ＥＲノックアウト乳癌細胞である。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ乳癌細胞は、エストロゲン曝露後、遺伝子導入の亢進のような非常に興味深い生化学的特性を示し（１４〜１５）、これにより、ＥＲ発現は皆無であるが、この細胞株において外来エストロゲンを用いうる生化学的経路が依然として活性化していることを示す。従って、エストロゲン又は誘導体Ａのようなその誘導体は、もはや天然ＥＲを発現しないある種の乳癌細胞において何らかの未解明の生化学的現象を示す。従って、図１〜４は、誘導体Ａの短時間の曝露であっても、乳癌細胞が直接／間接的にＥＲと関連する、最も作用を受ける細胞であることを示した。
【００５３】
第二の一連の試験において、１０μＭの誘導体Ａの４８時間連続曝露後、乳癌細胞のみならず子宮頸癌細胞Ｈｅｌａも極低生存率を示した（図５）。１０μＭの誘導体Ａの４８時間連続処理であっても、癌細胞Ａ５４９及び非癌細胞ＣＨＯは毒性の徴候を示さなかった。この一連の結果は、誘導体Ａの連続曝露にて、婦人科関連の由来、即ち、乳房、子宮頸部などに由来する癌細胞は、１０μＭの極低濃度であっても５０％又はそれよりはるかに低い生存率を示した。エストロゲンは婦人科関連の臓器の正常な成長に対し、直接／間接的な役割を有する天然リガンドである。ＥＲとの結合後、エストロゲンは乳癌又は他の婦人科関連の癌において、複数の癌促進遺伝子を調節しうる（１）。従って、エストラジ
オールの任意の誘導体が、直接／間接的にＥＲと関連する婦人科関連の臓器への標的送達を示しうることは当然である。本出願人らのエストラジオール誘導体は、おそらく何らかの未解明の遺伝的調節により、婦人科関連の癌細胞のみにおいて抗癌活性を促進し、婦人科に関係しない癌細胞及び非癌細胞には影響を与えない状態におく。
【００５４】
（応用）
本発明は、乳癌、子宮頸癌などのような婦人科関連の癌を治療することに利用できる。本発明の脂質誘導体も、標的治療を目的としてポリアニオン、ポリペプチド又はヌクレオポリマー（nucleopolymer）を、エストロゲン受容体を介して癌細胞のみに送達するよう
に用いられうる。本明細書で開示されるカチオン性エストロゲン誘導体は、治療的使用のために発現ベクターを細胞に送達するように用いられうる。発現ベクターは遺伝子治療プロトコルにおいて、治療上有用な蛋白質を細胞に送達し、或いは治療上有用な蛋白質分子をコードする核酸を送達するために用いられうる。本発明、即ち、カチオン性エストラジオール誘導体は、親油性化合物であるドキソルビシンのような抗癌補助剤を含むアニオン性、両性イオン性及び親油性治療剤と配合され、本発明の誘導体及び治療剤を含む複合体を得ることができる。特に、本発明で開示されるカチオン性エストラジオール誘導体は、癌に対して効果的な今後の標的抗癌治療法の開発の可能性を有する。
【００５５】
（細胞及び細胞培養）
ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＭＣＦ−７（ヒト原発性乳腺癌）、Ｔ４７Ｄ（ヒト乳管癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト続発性乳腺癌）及びＡ−５４９（ヒト肺癌）細胞株は、インド、プネー（Pune）に所在する国立細胞科学センター（National Centre for Cell Sciences）（ＮＣＣＳ）から得られ、マイコプラズマを含まなかった。細胞は、５％ＣＯ２
を含む加湿大気中、１０％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）［ＭＤＡＭＢ−４６８細胞ではＲＰＭＩ １６４０培地］にて３７℃で培養さ
れた。すべての試験に対し、８５〜９０％の集密度の培養物が用いられた。細胞は、生存率の検討のため、トリプシン処理され、計数され、９６ウェルプレートにて継代培養された。細胞は試験に用いられる前に一晩付着させられた。
【００５６】
（試料の調製及び試料の処理）
カチオン性エストラジオール誘導体は細胞培養グレードのＤＭＳＯ中に溶解され、一次原液を得た。該原液はＤＭＳＯで漸進的に希釈され、二次原液を得る。最後に、１０％ウシ胎仔血清含有細胞培地に該ＤＭＳＯ二次原液を加えることにより、誘導体の実用濃度が得られた。実用溶液中のＤＭＳＯの量は血清含有培地に対して０．２％を超えなかった。それぞれの濃度のカチオン性エストラジオール誘導体を含む細胞培養液１００μｌが、リン酸緩衝生理食塩水で予め洗浄された細胞に付与される。細胞はそれぞれの濃度のエストラジオール誘導体に４時間又は４８時間曝露状態にされた。４時間の処理では、細胞は、洗浄され、場合により４日又は６日間、実用濃度のエストラジオール誘導体を含まない細胞培地の存在下に維持された。次に、細胞はＭＴＴを用いて生存率についてアッセイされた。４８時間連続処理では、細胞は、洗浄され、直ちにＭＴＴを用いて生存率についてアッセイされた。
【００５７】
次の実施例は、実際の実施形態における本発明の運用の例示として挙げられ、従って、本発明の範囲を限定すると読み取り、或いは解釈されるべきではない。
【００５８】
（実施例１）
（カチオン性エストラジオール誘導体の合成（スキーム１））
（ステップＡ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシエストロンの合成：）
無水ＤＣＭ及び無水ＤＭＦ（９：１ｖ／ｖ）中のエストロン（ａ）（１ｇ，３．６９ミリモル）溶液に、２，６ルチジン１．１８ｇ（１１．０９ミリモル）及びＴＢＤＭＳ−トリフラート０．９３ｍｌ（４．０６ミリモル）を０℃で加えた。該反応混合物を室温で３０分攪拌した。該反応混合物をジクロロメタン２０ｍｌに取り込み、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×２０ｍｌ）、水（２×２０ｍｌ）及び食塩水（１×２０ｍｌ）で洗浄した。最後に、該非水性溶媒を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で乾燥させた。乾燥残留物のカラムクロマトグラフィー精製（溶離溶媒混合物として６０〜１２０メッシュシリカゲル及びヘキサン中２％酢酸エチルを用いて）により、白色固形物（１．０１ｇ、収率７１％、ヘキサン中１０％酢酸エチル中Ｒｆ ０．４）としてａ１が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，１．０［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．４−１．７及び１．９−２．５５［ｍ，１３Ｈ，シクロペンタン及びシクロヘキサン環プロトン］，２．８５［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，６．５２［ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５７［ｄｄ，Ｊ１＝２．６Ｈｚ及びＪ２＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，２−ＣＨ］，７．０９［ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ３６ＳｉＯ２に対して３８４（観測質量）、３８４．６２（計算質量）
【００５９】
（ステップＢ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−プロペニル−１７β−エストラジオールの合成：）
無水ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＭｇ金属（３００ｍｇ，１２．５７ミリモル）の混合物に、１，２−ジブロモエタン（触媒量）及び臭化アリル（１．０７ｍｌ，１２．５７ミリモル）を窒素雰囲気下０℃で滴加した。該反応混合物を室温で３０分攪拌した。上記混合物に、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）中に溶解したａ１（９６７mg，２．５ミリモル）を０℃で加えた。該反応混合物を１６時間環流させた。反応終了後、該反応混合物を、塩化アンモニウム溶液の飽和溶液（２０ｍｌ）を室温で加えることにより急冷し、次に、酢酸エチル（２×２５ｍｌ）で抽出した。その有機層を、水（２×５０ｍｌ）、食塩水（１×５０ｍｌ）で洗浄し、最後に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。残留物のカラムクロマトグラフィー精製（溶離溶媒として６０〜１２０メッシュシリカゲル及びヘキサン中４％エーテルを用いて）により、白色固形物（８９０ｍｇ、収率８３％、ヘキサン中２０％エーテル中Ｒｆ
０．５８）としてａ２が得られた。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９１［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，１．０［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−１．７及び２．０５−２．４［ｍ，１３Ｈ，シクロペンタン及びシクロヘキサン環プロトン］，１．８５−２．０［ｄｍ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２］，２．８５［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，５．１−５．３２［ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２］，５．９５［ｍ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２］，６．５２［ｄ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５７［ｄｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０９［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ４２ＳｉＯ２に対して４２６（観測質量）、４２６．７１（計算質量）
【００６０】
（ステップＣ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−ヒドロキシプロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
１７α−プロペニル−β−エストラジオール（８９０ｍｇ，２．０９ミリモル）の攪拌ＴＨＦ（５ｍｌ）水溶液に、ＤＭＳ中のボラン（９７％水溶液、０．３ｍｌ、４．２８ミリモル）を０℃で加え、窒素下で６時間攪拌した。３ＮＮａＯＨ（６ｍｌ）及びＨ２Ｏ２（４．５ｍｌ，３０％ｗ／ｖ）の水溶液を０℃で加え、その混合物を室温まで加温した。次に、その結果生じた混合物を、水で急冷し、酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で抽出した。有機層を、水（２×２５ｍｌ）、食塩水（１×２５ｍｌ）で洗浄し、最後に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空下で水分を蒸発させた。溶離溶媒混合物としてヘキサン／酢酸エ
チル（８０：２０）を用いたカラムクロマトグラフィーにより粗化合物を精製し、４８１ｍｇ（５１．２５％）のアルコール（ａ３）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．９１［ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１７Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン及び１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ］，２．８０［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．６−３．７５［ｄｍ，２Ｈ，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］，
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ２７Ｈ４３ＳｉＯ３に対して４４４（観測質量）、４４３．７２（計算質量）
【００６１】
（ステップＤ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の塩化オキサリル（２０５ｍｇ，１．６２ミリモル）の冷却（−７８℃、アセトンドライアイス浴（both））溶液に、無水ジメチルスルホキシド（２５２ｍｇ，３．２４ミリモル）を滴加し、その結果生じた混合物を１５分攪拌し、ジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解したアルコール（４８０ｍｇ，１．０１８ミリモル）を−７８℃で滴加した。その混合物を３０分攪拌し、トリエチルアミン（６５４ｍｇ，１２．５７ミリモル）を滴加し、その結果生じた混合物を室温で２時間、漸進的に加温した。該混合物を、水（５０ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（５０×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。更なる精製を行うことなく、その粗生成物（ａ４）を次の反応に対して継続させた。
【００６２】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎジオクチル（アミノ）プロパン］−１７β−エストラジオールの合成：）
上記のように調製した粗アルデヒド（ａ４）（４００ｍｇ，０．９０４ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジオクチルアミン（２１８ｍｇ，０．９０４ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３２９ｍｇ，４．５２ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及びヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物（ａ５）、１００ｍｇ（２５．２％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ４３Ｈ７７ＳｉＯ２Ｎに対して６６９（観測質量）、６６８．１６（計算質量）Ｃ４３Ｈ７７ＳｉＯ２Ｎ
【００６３】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップＥで得られた化合物（ａ５）（１００ｍｇ，０．１４９ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及びクロロホルム中２％メタノー
ルを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、８０ｍｇ（８０％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００６４】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（スキーム１における構造体１）：）
化合物（ａ６）（８０ｍｇ，０．１１７３ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、３７ｍｇ（４６．２５％）の化合物１を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，４１Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）６−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ３８Ｈ６４Ｏ２Ｎに対して５６８（観測質量）、５６６．９４（計算質量）
【００６５】
（実施例２）
（カチオン性エストラジオール誘導体２の合成）
ステップＡ〜Ｄは誘導体１（又は構造体１）の合成に示すものと同じである。
【００６６】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３Ｎ，Ｎジヘキサデシル（アミノ）プロパン］−１７β−エストラジオール：）
（実施例−１における）ステップ−Ｄにおいて調製した粗アルデヒド、（５００ｍｇ，１．１３ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジ−オクタデシリルアミン（５５８ｍｇ，１．４ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２８３ｍｇ，４．５０ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及びヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物、３２１ｍｇ（５７．３％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１
−ＣＨ］．
ＦＡＢＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：ｍ／ｚ：Ｃ５９Ｈ１０９ＳｉＯ２Ｎに対して８９３（観測質量）、８９２．５４（計算質量）
【００６７】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップＥで得られた化合物（３００ｍｇ，０．３３５ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（溶離液として１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及びクロロホルム中２％メタノールを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、１７０ｍｇ（５６．６％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００６８】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（構造体２又は誘導体２）：）
上記で得られた化合物（１００ｍｇ，０．１１ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、６０ｍｇ（６０．０％）の構造体−２を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，７３Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ５４Ｈ９６Ｏ２Ｎに対して７９２（観測質量）、７９１．３６（計算質量）
【００６９】
（実施例３）
（カチオン性エストラジオール誘導体３の合成）
ステップＡ〜Ｄは誘導体１（又は構造体１）の合成に示すものと同じである。
【００７０】
（ステップＥ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン−１７β−エストラジオール：）
（実施例１における）ステップ−Ｅにおいて調製した粗アルデヒド、（５００ｍｇ，１．１３ミリモル）及びＮ，Ｎ−ジ−ジエチルアミン（９０ｍｇ，１．２３ミリモル）を、ジクロロメタン１０ｍＬ中に溶解し、窒素下にて室温で０．５時間攪拌した。その反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２８３ｍｇ，４．５０ミリモル）を加え、窒素雰囲気下にて更に２４時間攪拌を継続した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフ
ィー精製（６０〜１２０メッシュサイズのシリカゲル及び溶離液としてヘキサン／酢酸エチル（８０：２０）を用いて）後、残留物により標記化合物、１８０ｍｇ（３６．０１％）を半固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．７２−２．８４［ｍ，８Ｈ，６−ＣＨ２，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００７１】
（ステップＦ：３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７βエストラジオールの合成：）
ステップ−Ｅで得られた化合物（１８０ｍｇ，０．３６ミリモル）を、（４ｍＬ）ジクロロメタン＋メタノール（１：１）中の過剰のヨウ化メチル（３ｍＬ）で処理し、室温で３時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー精製（１００〜２００メッシュサイズのシリカゲル及び溶離液としてクロロホルム中２％メタノールを用いて）後、残留物により標記化合物（ａ６）、１２０ｍｇ（６６．６％）を淡黄色固形物として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．１９［ｓ，６Ｈ，Ｓｉ（ＣＨ３）
２］，０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，０．９９［ｓ，９Ｈ，ＳｉＣ（ＣＨ３）３］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．３−３．６［ｍ，９Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋及びＣＨ３−Ｎ＋］，６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
【００７２】
（ステップＧ：１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオールの合成（構造体３又は誘導体３）：）
上記で得られた化合物（１２０ｍｇ，０．２３３ミリモル）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、ＴＨＦ（２ｍＬ）中の過剰のテトラブチルフッ化アンモニウムを、０℃で加え、窒素雰囲気下にて６時間攪拌した。その混合物を、水（１５ｍＬ）で急冷しジクロロメタン（２５×３）で抽出し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。６０〜１２０メッシュシリカゲル、溶離液としてメタノール：クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、次に、溶離液としてメタノールを用いたＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６における塩化物イオン交換を行い、７２ｍｇ（６０．０％）の構造体−３を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．８７−０．９３［ｍ，９Ｈ，１８
−ＣＨ３，Ｎ−（ＣＨ２−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，１．２−２．３［ｍ，１６Ｈ，シクロペンタン，シクロヘキサン環プロトン，１７α−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ２−ＣＨ３）２］，２．８４［ｍ，２Ｈ，６−ＣＨ２］，３．０［Ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−Ｎ＋］，３．２［ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−Ｎ＋］６．５０［ｓ，１Ｈ，４−ＣＨ］，６．５５［ｄ，１Ｈ，２−ＣＨ］７．０５［ｄ，１Ｈ，１−ＣＨ］．
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ４２Ｏ２Ｎに対して３８２（観測質量）、４００．６２（計算質量）
【００７３】
（実施例４）
（細胞生存率パーセント）
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）減少アッセイにより、カチオン性エストラジオール誘導体１の細胞毒
性を評価した。９６ウェルプレートにて該アッセイを行った。試験の継続時間に応じて、８０００〜１５０００個の細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、一晩維持した。例えば、細胞がプレートの底部に付着した１２時間後、それぞれの濃度の誘導体１を含む溶液を三つ組ウェルに添加した。前述のように、誘導体１の細胞に対する処理は４時間又は４８時間であった。４時間処理では、細胞を洗浄し、４日又は６日間血清培地に維持し、次に、ＭＴＴを細胞に添加した。４８時間処理では、細胞を直ちに洗浄し、次に、ＭＴＴを細胞に添加した。その結果を生存率パーセントとして示した＝［Ａ５４０（処理細胞）−バックグラウンド／Ａ５４０（未処理細胞）−バックグラウンド］×１００。図１〜６は、種々の濃度及び異なる由来の細胞にわたる、１に対するＭＴＴベースの細胞生存率アッセイの結果の概要を示す。
【００７４】
（実施例５）
（ＤＮＡ結合アッセイ）
０．８％アガロースゲル上のゲル遅延アッセイにより、１７α置換エストラジオール誘導体２及び３（構造体２及び３）のＤＮＡ結合能をアッセイした。
総量１６μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中、０．４０μｇのｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ−βｇａｌをカチオン性エストラジオール誘導体（カチオン性エストラジオール誘導体において：ＤＮＡ電荷比８：１，４：１，２：１及び１：１）と複合体形成させ、ロータリーシェーカーにて室温で３０分インキュベートした。これに３μｌの６Ｘローディングバッファー（０．２５％ブロモフェノールブルー、４０％スクロース）を加え、全溶液を各ウェルにローディングした。これらの試料を８０Ｖで約２時間電気泳動させ、臭化エチジウム液で３０分染色することによりＤＮＡバンドを可視化し、次に、水中で３０分脱色した。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、ＭＣＦ−７細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、６日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図２】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、Ｔ４７Ｄ細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、６日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図３】血清培地の存在下、０．５μＭ〜５０μＭの濃度変化にわたる、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞における誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルの概略を示すグラフ図である。該細胞は処理後４時間にて洗浄され、４日間維持され、最後に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。該毒性プロファイルは、裸の１７β−エストラジオール及び血清培地中の裸の誘導体Ａを処理するために用いられる最大量のＤＭＳＯとも比較される。
【図４】様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された１０μＭの誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。
【図５】様々な癌及び非癌細胞において４８時間処理された１０μＭの誘導体１のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、ＭＴＴにより直ちに生存率がアッセイされた。
【図６】（Ａ）様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された１０μＭの誘導体１，２及び３（即ち、構造体１，２及び３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。（Ｂ）様々な癌及び非癌細胞において４時間処理された５０μＭの誘導体１，２及び３（即ち、構造体１，２及び３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性比較の概略を示すグラフ図である。処理後、細胞は洗浄され、血清培地に６日間維持され、次に、ＭＴＴにより生存率がアッセイされた。
【図７】コリピド（co-lipid）ＤＯＰＥと組み合わせた新規カチオン性１７−α置換エストラジオール−誘導体２及び３（構造体２及び３）が、特に、より高い電荷比４：１及び８：１にて部分的〜全ＤＮＡ凝集性を示していることを示す写真図である。コリピド（co-lipid）をコレステロールとして用いると、誘導体２及び３のＤＮＡ結合性は所定の条件では認められない。（Ａ）誘導体２のＤＮＡ結合性を示す写真図である。それぞれのコリピド（co-lipid）及びＤＮＡとして誘導体２（即ち、構造体２）、コレステロール又はＤＯＰＥを含む脂質ＤＮＡ複合体のゲル遅延アッセイの結果の概略を示す。誘導体２とそれぞれのコリピド（co-lipid）はモル比が１：１である。ＤＮＡ ０．４μｇを用いて総脂質とＤＮＡのモル比（又は電荷比＋／−）は、ゲル写真に示すように、１：１〜８：１にばらついた。最も右側のレーンには純粋なＤＮＡが泳動した。（Ｂ）誘導体３のＤＮＡ結合性を示す写真図である。それぞれのコリピド（co-lipid）及びＤＮＡとして誘導体３（即ち、構造体３）、コレステロール又はＤＯＰＥを含む脂質ＤＮＡ複合体のゲル遅延アッセイの結果の概略を示す。誘導体３とそれぞれのコリピド（co-lipid）はモル比が１：１である。ＤＮＡ ０．４μｇを用いて総脂質とＤＮＡのモル比（又は電荷比＋／−）は、ゲル写真に示すように、１：１〜８：１にばらついた。最も右側のレーンには純粋なＤＮＡが泳動した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【請求項２】
前記Ｒ１及びＲ２の各々が独立して、水素又は脂肪族炭化水素鎖であり、但し、前記Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｒ１及びＲ２が独立して水素又は脂肪族炭化水素鎖であると、前記Ｒ３がＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基又は水素原子であり、但し、前記Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｒ３がアルキル基であり、前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は４に記載の化合物。
【請求項６】
前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は４に記載の化合物。
【請求項７】
化学式Ａの代表的化合物が、以下：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
のようになる、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エスト
ラジオール（１）が、５０μＭの前記化合物の濃度にて４時間の処理及び６日間のアッセイ期後、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、Ｈｅｌａ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８からなる群より選択される癌細胞株に対し、２〜１０％の範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率パーセントを示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ａ．カチオン性エストラジオール誘導体と、
ｂ．コリピド（co-lipid）と、
ｃ. 医薬的に許容可能な担体、補助剤及び添加剤を任意に有するポリアニオン化合物とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記カチオン性エストラジオール誘導体と前記コリピド（co-lipid）とのモル比が約１：１である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオン性エストラジオール誘導体及びコリピド（co-lipid）を含む総脂質とポリアニオン化合物（ＤＮＡ）とのモル比が１：１〜８：１の範囲である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
用いられる前記カチオン性エストラジオール誘導体が、一般化学式Ａの化合物を含む、請求項１０に記載の組成物。
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【請求項１４】
用いられる前記コリピド（co-lipid）が、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
用いられる前記ポリアニオン化合物が、治療上重要な蛋白質、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド又は蛋白質をコードすることが可能である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
用いられる前記ポリアニオン化合物が、リボソームＲＮＡと、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドと、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドとからなる群より選択される、請求項１０又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
用いられる前記核酸が、環状若しくは線状プラスミド又はリボ核酸である、請求項１０、１５、１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
一般化学式Ａ
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７の整数である；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から任意に選択される。）を有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体の合成方法であって、
（ａ）既知の方法によりエストロンから３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールを調製するステップと、（ｂ）無水有機溶媒中、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、前記３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールのアルデヒド化合物をモノ−又はジ−アルキルアミンと反応させ、対応する二級又は三級アミンを得て、次に、有機溶媒中、ハロゲン化アルキルと反応させ、これに伴う三級又は四級化アミンをそれぞれ得て、中間体三級アミンの四級化が−１０℃〜５０℃の範囲の温度にて行われることを特徴とするステップと、
（ｃ）既知の方法によりステップ（ｂ）において得られる前記三級又は四級化アミンの芳香族ヒドロキシル基のシリル保護を脱保護し、次に、ハロゲン化物イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行い、所望の化合物を得るステップと
を含む方法。
【請求項２０】
用いられる前記モノ又はジ−アルキルアミンが、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
用いられる前記モノ又はジ−アルキルアミンの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖が、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素鎖からなる群より選択される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ａ）において用いられる有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン及び酢酸エチルからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）において用いられる有機溶媒が、ジクロロメタン、メタノール及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｂ）において用いられるハロゲン化アルキルが、Ｃ１〜Ｃ５ハロゲン化アルキルから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｃ）において用いられるハロゲン化物イオン交換樹脂が、塩化物、臭化物及びヨウ化物イオン交換樹脂からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
得られる前記化学式Ａの代表的化合物が、以下：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
のようになる、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
一般化学式Ａを有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体。
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【請求項２】
前記Ｒ１及びＲ２の各々が独立して、水素又は脂肪族炭化水素鎖であり、但し、前記Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｒ１及びＲ２が独立して水素又は脂肪族炭化水素鎖であると、前記Ｒ３がＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基又は水素原子であり、但し、前記Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｒ３がアルキル基であり、前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は４に記載の化合物。
【請求項６】
前記Ｒ３が水素原子であり、前記Ｒ１及びＲ２が脂肪族炭化水素鎖である、請求項１又は４に記載の化合物。
【請求項７】
化学式Ａの代表的化合物が、以下：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
のようになる、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エスト
ラジオール（１）が、５０μＭの前記化合物の濃度にて４時間の処理及び６日間のアッセイ期後、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、Ｈｅｌａ及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８からなる群より選択される癌細胞株に対し、２〜１０％の範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率パーセントを示す、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ａ．カチオン性エストラジオール誘導体と、
ｂ．コリピド（co-lipid）と、
ｃ. 医薬的に許容可能な担体、補助剤及び添加剤を任意に有するポリアニオン化合物とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記カチオン性エストラジオール誘導体と前記コリピド（co-lipid）とのモル比が約１：１である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオン性エストラジオール誘導体及びコリピド（co-lipid）を含む総脂質とポリアニオン化合物（ＤＮＡ）とのモル比が１：１〜８：１の範囲である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
用いられる前記カチオン性エストラジオール誘導体が、一般化学式Ａの化合物を含む、請求項１０に記載の組成物。
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７に変動する整数である。；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から選択される。）
【請求項１４】
用いられる前記コリピド（co-lipid）が、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
用いられる前記ポリアニオン化合物が、治療上重要な蛋白質、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド又は蛋白質をコードすることが可能である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
用いられる前記ポリアニオン化合物が、リボソームＲＮＡと、ＲＮＡ又はＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドと、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのポリヌクレオチドとからなる群より選択される、請求項１０又は１５に記載の組成物。
【請求項１７】
用いられる前記核酸が、環状若しくは線状プラスミド又はリボ核酸である、請求項１０、１５、１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ（エストロゲン受容体陽性細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（エストロゲン受容体ノックアウト細胞株）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌）からなる群より選択される癌細胞種由来の婦人科関連の癌細胞株に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
一般化学式Ａ
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、水素又は少なくとも２個の炭素原子を含む親油性部分であり、前記親油性部分は２〜２２個の炭素を含むアルキル、モノ−、ジ−及びトリ−不飽和アルケニル（Ｃ２〜Ｃ２２）から任意に選択され、但し、Ｒ１及びＲ２の両方が水素というわけではないとする。；Ｒ３は独立して水素又はＣ１〜Ｃ５直鎖若しくは分枝鎖アルキル基である。；ｎは２から７の整数である；Ｘは塩素、臭素又はヨウ素原子から任意に選択される。）を有する新規のカチオン性エストラジオール誘導体の合成方法であって、
（ａ）既知の方法によりエストロンから３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールを調製するステップと、（ｂ）無水有機溶媒中、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、前記３−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１７α−［３−アルデヒドプロパン］−１７β−エストラジオールのアルデヒド化合物をモノ−又はジ−アルキルアミンと反応させ、対応する二級又は三級アミンを得て、次に、有機溶媒中、ハロゲン化アルキルと反応させ、これに伴う三級又は四級化アミンをそれぞれ得て、中間体三級アミンの四級化が−１０℃〜５０℃の範囲の温度にて行われることを特徴とするステップと、
（ｃ）既知の方法によりステップ（ｂ）において得られる前記三級又は四級化アミンの芳香族ヒドロキシル基のシリル保護を脱保護し、次に、ハロゲン化物イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行い、所望の化合物を得るステップと
を含む方法。
【請求項２０】
用いられる前記モノ又はジ−アルキルアミンが、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
用いられる前記モノ又はジ−アルキルアミンの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖が、Ｃ２〜Ｃ２２炭化水素鎖からなる群より選択される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ステップ（ａ）において用いられる有機溶媒が、クロロホルム、ジクロロメタン及び酢酸エチルからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ）において用いられる有機溶媒が、ジクロロメタン、メタノール及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（ｂ）において用いられるハロゲン化アルキルが、Ｃ１〜Ｃ５ハロゲン化アルキルから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｃ）において用いられるハロゲン化物イオン交換樹脂が、塩化物、臭化物及びヨウ化物イオン交換樹脂からなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
得られる前記化学式Ａの代表的化合物が、以下：
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジオクチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（１）；
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジヘキサデシル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（２）及び
１７α−［３−Ｎ，Ｎ−ジエチル（メチル）アミノプロパン］−１７β−エストラジオール（３）
のようになる、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５１８０７１（Ｐ２０１０−５１８０７１Ａ）
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４８７９９（Ｐ２００９−５４８７９９）
【出願日】平成１９年１２月３１日（２００７．１２．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００７／０００６１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９４１４
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月３１日（２００７．１２．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００７／０００６１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９４１４
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
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