抗酸菌属細菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドおよびその用途
【課題】臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定する方法を提供する。
【解決手段】抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行う。プライマーまたは該プライマーの伸長産物と、特定の核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する検出用オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめ、形成した複合体を判別する。
【解決手段】抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行う。プライマーまたは該プライマーの伸長産物と、特定の核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する検出用オリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめ、形成した複合体を判別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床診断上、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をはじめとする抗酸菌属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）細菌を迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌属は抗酸性の性質をもつグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。一般に抗酸菌は発育が遅く、培養にはかなりの時間を要する。
【０００３】
この中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫感染などによって経気道的に感染する。
【０００４】
従来、結核菌の検査は培養法によって行っていた。一般的には小川培地上で結核菌を分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験などの結果から菌種を同定する。しかし、ヒト型結核菌は増殖が遅く、分離培養だけで約３〜４週間を要し、その後の各種試験で、さらに約２〜３週間を要する。そのため、ヒト型結核菌の検出または同定検査は、その臨床上の重要性・緊急性にもかかわらず、約１ヶ月以上を要し、機動的な診断や投薬に大きな制約となっていた。ヒト型結核菌が産生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが開発されてきたが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至っておらず、しかも、感度的に問題があるため分離培養が必要なことは変わりがなかった。
【０００５】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の他にも、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などの非定型抗酸菌が、ヒトに病原性を示すことが知られている。症状は結核に比べて軽く、感染力も弱いが、抗結核剤に耐性であり、有効な薬剤はない。これらは結核菌と同様に、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などを冒し、特に肺感染症が多い。
【０００６】
一般に、肺結核の鑑別は、臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の同定によってなされなければならない。非定型抗酸菌の病原性はマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）＞トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）＞その他の順で大きく、上位３菌種は特に重要である。
【０００７】
従来から、これらの非定型抗酸菌をヒト結核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの結果から菌種を同定している。しかし、これらも一般的に増殖が遅く、菌種の同定までに約１ヶ月以上を要することが多い。
【０００８】
ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は、臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤であるが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンブトール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投与が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性である。菌種の同定は、その後の治療方針を大きく左右するのである。しかしながら前述したように、これらの菌は増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。また、マイコバクテリウム・スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）など、類似の非病原性菌が検出されることもある。迅速で確実な検出及び菌種同定法が望まれるのはこのためである。
【０００９】
最近、ＤＮＡやＲＮＡを人為的に増幅し、増幅後の核酸を検出することによって、高感度に病原体を検出する方法が開発されてきた。既に知られている核酸増幅方法としてＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、ＮＡＳＢＡ（非特許文献１）、ＬＣＲ（特許文献４、特許文献５）、ＳＤＡ（非特許文献２）、ＲＣＲ（特許文献６）、ＴＭＡ（非特許文献３）ＬＡＭＰ（非特許文献４）、ＩＣＡＮ（非特許文献５）などが挙げられる。
【００１０】
なかでもＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、温度の上昇および下降を繰り返すことにより、当該一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる標的核酸の特定領域を指数関数的に増幅させることができる。
【００１１】
通常ＰＣＲ法は特許文献３に示されているように、ａ）９０〜１０５℃の範囲内の温度（好ましくは９０〜１００℃）で０．５〜５分間（好ましくは０．５〜３分間）、変性させる工程、ｂ）３５〜６５℃の範囲内の温度（好ましくは３７〜６０℃）で０．５〜５分間（好ましくは１〜３分間）、プライマーと鋳型のハイブリッドを形成させる（アニーリング）工程、およびｃ）４０〜８０℃の範囲内の温度（好ましくは５０〜７５℃）で０．５〜４０分間（好ましくは１〜３分間）、プライマー伸長生成物を形成させる（伸長）工程、からなる増幅サイクルを用いる。
【００１２】
ＰＣＲ法のサイクルを繰り返し行うことで増幅した核酸断片は、各種の検出方法を用いて検出できるようになる。現在利用されている代表的な検出方法として、アガロースゲル電気泳動法がある。しかしながら、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱う必要があり、コンタミネーションが起こる危険性が高かった。また、操作も煩雑であり検出終了までの時間も１時間以上を要するため、当該検出方法の臨床診断への適用は困難であった。
【００１３】
電気泳動以外の検出方法として、二本鎖核酸に結合した時に蛍光が増強される性質を示すＤＮＡ挿入色素（インターカレーター）を利用する方法が一般的に用いられている。核酸増幅中のＤＮＡ濃度の上昇に伴う蛍光の増強は、反応の進行を測定するために、また標的核酸分子のコピー数を決定するために利用できる。さらに、精密に制御された温度変化に伴う蛍光の変化をモニターすることにより、例えばＰＣＲサイクル反応の終了時点で、ＤＮＡ融解曲線を作成することができる。このような融解曲線解析では二本鎖核酸の性質をある程度識別することができ、融解曲線解析での融解温度が極端に低い場合はプライマーダイマーなど、標的核酸断片より短い核酸断片が増幅されたことが考えられるし、主なピークが一本でない場合は標的核酸断片ではない非特異的な増幅核酸断片が存在することを示している。このように、蛍光を測定する方法によれば、増幅核酸断片の飛散などによりコンタミネーションが起こり正しい判定結果が得られなくなる危険性や、煩雑な操作から起こり得る人為的なミスを防止することができるため、臨床診断に適している。しかし、一般的なインターカレーター法は二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、特に臨床診断など、目的の核酸配列に特異的な検出が必要とされる場合には、当該核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出する可能性があるため、それほど有効ではない。
【００１４】
核酸配列特異的プローブ法は、増幅反応の進行をモニターするために、さらなる核酸反応成分（核酸プローブ）を利用する。この方法は、検出の基本として蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）を利用することが多い。一つあるいはそれ以上の核酸プローブを蛍光色素で標識し、一方のプローブに標識された蛍光色素はエネルギー供与体分子として、もう一方の蛍光色素はエネルギー受容体分子として働くことができるようにする。これらは時として、それぞれレポーター分子および消光分子として知られる。エネルギー供与体分子は励起スペクトラム範囲の特異的波長の光で励起され、引き続いて蛍光放出波長の範囲で光を放出する。エネルギー受容体分子も、様々な距離依存性エネルギー転移機構により、当該供与体分子からエネルギーを受け取ることにより、この波長で励起される。蛍光エネルギー転移の特別な例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がある。一般に、エネルギー受容体分子とエネルギー供与体分子が近接している場合、例えば、これらが同じまたは隣接する分子上にある場合に、受容体分子は供与体分子の放出エネルギーを受け取ることができる。通常、ＦＥＴまたはＦＲＥＴプローブには二つの種類、すなわち、エネルギー受容体からエネルギー供与体を分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体分子と受容体分子の空間的関係を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いるものが利用される。
【００１５】
加水分解を用いるプローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして市販されている。このプローブは、エネルギー供与体およびエネルギー受容体分子で標識されたオリゴヌクレオチドからなり、増幅核酸断片の一方の鎖の特異的領域にハイブリダイズするように設計される。例えばＰＣＲにおいて、プライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑポリメラーゼが５’から３’へのポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。このときＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑによる伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。もしＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが産物の鎖にハイブリダイズしていれば、伸長するＴａｑ分子がプローブを加水分解し、エネルギー受容体とエネルギー供与体を遊離し、検出可能なシグナルが発生する。このシグナルは累積的であり、遊離のエネルギー供与体および受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する。しかし、蛍光シグナルの生成がプローブの加水分解反応の発生に依存するため、この方法には時間的不利益が存在する。また、５０サイクル以上というような多数回の増幅サイクルが必要な場合、加水分解が非特異的に起こり得る問題点も見出されている。
【００１６】
ハイブリダイゼーションを用いるプローブは、数多くの型式のものが利用可能である。例えば、分子ビーコンは、ヘアピンループを形成するような相補的な５’および３’配列を有するオリゴヌクレオチドであり、その末端に標識された蛍光色素は、ヘアピン構造が形成されるためにＦＲＥＴが起こるような近接位置にある。分子ビーコンの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに伴ってエネルギー受容体とエネルギー供与体が分離されるとＦＲＥＴは起こらなくなることを利用して、検出を行う。
【００１７】
また、標識プローブの対合も利用可能である。エネルギー供与体分子を標識したプローブとエネルギー受容体分子を標識したプローブが増幅核酸断片の鎖上で近接してハイブリダイズすることによってＦＲＥＴが生じ、このＦＲＥＴによって生じた波長の蛍光を検出する。このタイプの変種には、標識増幅プライマーと単一の近接する標識プローブの利用が含まれる。しかし、二つの標識オリゴヌクレオチドの使用、または二つの標識分子を含む分子ビーコンの使用は、一般に検出にかかるコストが高いことが問題である。さらに、例えば臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられることが問題である。前述のように、ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は臨床診断上重要であり、迅速で確実な検出および菌種同定法が望まれているが、これらの技術では要望を満たすことができない。
【００１８】
特許文献７では、ＤＮＡ二本鎖結合剤と、ＤＮＡ二本鎖結合剤から蛍光エネルギーを吸収できるあるいは蛍光エネルギーを与えることができる反応性分子を含む核酸プローブを利用し、標的核酸の増幅反応を経て、蛍光をモニターする検出方法が開示されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良いためコストの面で有利であるが、特許文献７に開示された技術を用いても、上述のような、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合に、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【００１９】
特許文献８では、ハイブリダイゼーションの際に蛍光が消光する核酸プローブを用いた検出方法が開示されている。蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの前後において蛍光色素が発する蛍光の減少量を測定する方法、または蛍光色素で標識された核酸プライマーを標的核酸にハイブリダイゼーションさせた後に伸長させ、核酸変性時の蛍光量に対するアニーリング反応および伸長反応時の蛍光量の減少を測定する方法が示されている。さらに当該方法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、および該ＰＣＲ法で得られるデータの解析の際にアニーリング反応時の蛍光強度値を変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法が記載されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良く、さらにインターカレーターも使用しないためコストの面で有利であるが、特許文献８に開示された技術を用いても、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、上述のような非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】国際公開８９／１２６９６号
【特許文献５】特開平２−２９３４号
【特許文献６】国際公開９０／１０６９号公報
【特許文献７】特表２００３−５００００１
【特許文献８】特許第３４３７８１６号
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁（１９９１）
【非特許文献２】Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻、第１６９１頁（１９９２）
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁（１９９３）
【非特許文献４】Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４ 第４２巻：第１，９５６頁
【非特許文献５】Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ： Ｋｅｋｋａｋｕ． ２００３ 第７８巻、第５３３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
前述のように、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱うことから、コンタミネーションが起こり、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２１】
また、インターカレーターを用いる方法ではコンタミネーションの可能性は低減されるが、二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、標的核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出し、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２２】
核酸配列特異的なプローブを用いる方法では、上述したような判定結果の正確性に関する問題点はある程度改善されているが、例えばヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定など、臨床診断上重要である複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられるため臨床診断には適していない。
【００２３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、臨床診断上重要なヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌を迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子における特定領域の菌種特異性が高く、当該遺伝子領域を標的核酸とするプローブを用いることにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００２５】
[項１]
配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［項２］
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項２−１]
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項３]
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値が、互いに３℃以上異なることを特徴とする項２に記載の菌種同定方法。
[項４]
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さが、互いに１塩基以上異なることを特徴とする項２または３に記載の菌種同定方法。
[項５]
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする項２〜４のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項６]
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴とする項２〜５のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項７]
複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする項２〜６のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項８]
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする項７に記載の菌種同定方法。
[項９]
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする項７に記載の菌種同定方法。
[項１０]
少なくとも以下の（１）〜（４）を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、
（２）配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）、
（３）配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）、
（４）プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）およびオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、以上のように、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できるものである。それゆえ、単一種類の蛍光だけを検出する安価なシステムにて、コンタミネーションによる誤判定の危険を冒すことなく、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書において「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」とは、後述のＰＣＲ法を用いて、以下の配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド、
５’−ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３）
および
５’−ＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号４）
をプライマーとして使用した際に、増幅される抗酸菌属細菌の遺伝子領域に含まれる。当該増幅領域について、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）は配列番号１８に、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は配列番号１９に、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）は配列番号２０に、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は配列番号２１に、それぞれ具体的な核酸配列を記載する。
また、上記の「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」は、「領域Ａおよび領域Ｂ」として後述するが、従来公知であるｄｎａＪ遺伝子の部分配列（特許第２９６６４７８号、特許第３１３４９４０号、Ｌ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．第３１巻４４６頁参照）より当該遺伝子の下流に位置し、従来技術において抗酸菌属細菌の検出および／または同定には使用されなかった領域である。
【００２８】
本発明の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法は、上記のような抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を検出する検出工程を含んでいる。
【００２９】
上記検出工程は、抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。当該増幅工程では、試料中の全核酸配列中から増幅したい核酸配列（標的核酸）のみが、その固有の配列に対して相補性を有するプライマーを利用して増幅される。具体的に上記増幅工程では、一本鎖に変性させた抗酸菌属細菌の染色体またはその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび２種類以上のオリゴヌクレオチド（プライマー）等を作用させることによって、上記プライマー間の配列が増幅される。
【００３０】
上記増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、上記核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁、１９９１年参照）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号、特開平２−２９３４号参照）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 第２０巻、第１６９１頁、１９９２年参照）、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号参照）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁、１９９３年参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第４２巻：第１，９５６頁、２００４年参照）、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ． 第７８巻、第５３３頁、２００３年参照）などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記核酸増幅方法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、上記増幅工程に好適に用いることが可能である。
【００３１】
また、試料中の核酸量が少ない場合には、上記増幅工程に先立って、抗酸菌属細菌の染色体またはその断片を上記増幅工程と同じ方法によって増幅しておくことも可能である。
【００３２】
上記増幅工程において用いられる核酸増幅方法としては、上記方法の中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ法は、試料核酸、一対のプライマー（ＡおよびＢ）、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性工程、アニーリング工程、伸長反応の３工程からなる反応サイクルを繰り返すことによって、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）によって挟まれる試料核酸中の領域を、指数関数的に増幅させることができる。すなわち、変性工程にて試料核酸を変性し、続くアニーリング工程にて各プライマーと当該プライマーに相補的な試料核酸中の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程にて各プライマーを起点として、試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。この１サイクルによって、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）で挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。
【００３３】
増幅工程に使用する一対のプライマー（ＡおよびＢ）としては、増幅された核酸断片に上記の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を含んでいれば特に限定されないが、ＧＣ含量が６５％以下の領域に設計することが好適である。より好適には、図５に示される領域Ｃ、領域Ｄまたは領域Ｅの核酸配列中または各配列に相補的な核酸配列中に設計できる。配列番号３及び配列番号４をプライマーとして使用した場合に増幅される核酸配列領域はＧＣ含量が高い（約７０％）。該領域中において、図５で示される領域Ｃ、領域Ｄ、領域Ｅは抗酸菌属細菌ではいずれもＧＣ含量が６５％以下と比較的低い領域である。そのため、ＧＣ含量が高いことによるプライマーの非特異反応が起こりにくく、試料中の標的核酸を特異的に増幅することができる。
例えば、
プライマー（Ａ）としては、
５’−ＡＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＧ−３’（配列番号９）
５’−ＣＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号１０）
プライマー（Ｂ）としては、
５’−ＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１３）
のような配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３４】
少なくともプライマー（Ａ）とプライマー（Ｂ）を用いて増幅させた核酸断片と配列番号１〜６に示される核酸配列または該核酸配列に相補的な核酸配列が「９０％以上一致する」とは、例えばヒト型結核菌をターゲットとした場合は、ヒト型結核菌の株間で該核酸断片に変異が存在する場合の一致率を示している。ヒト型結核菌株間で変異が存在する場合でも、非結核性抗酸菌と区別して、ヒト型結核菌を特異的に検出できることを表している。好適には該一致率は９０％以上である。臨床分離された非結核性抗酸菌３５種の保有する核酸配列と配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率を一例として表１に示す。配列番号１と最も一致している菌種は マイコバクテリウム・マルモエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）で、一致率８８％であり、配列番号２と最も一致している菌種はマイコバクテリウム・チタエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｉｔａｅ）で、一致率８８％である。ヒト型結核菌と同属の非結核性抗酸菌であっても一致率は９０％に満たない。また、ヒト型結核菌２０株の保有する核酸配列と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率は、２０株全て９０％以上である。配列番号３または４のトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、配列番号５または６のマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）においても同様の結果が得られる。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本発明の抗酸菌属細菌の検出方法において、検出工程で使用する検出用オリゴヌクレオチドプローブについて説明する。本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域は、図１に、一例としてヒト型結核菌をはじめとする４種類の抗酸菌属細菌についてｄｎａＪ１遺伝子の部分配列を用いて示したように、領域Ａおよび領域Ｂの２箇所があり、どちらの領域を用いても本発明の効果を得ることができる。なお、図１において、Ｍａは配列番号１８に記載のトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）に由来する核酸配列であり、Ｍｉは配列番号１９に記載のマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）に由来する核酸配列であり、Ｍｋは配列番号２０に記載のマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）に由来する核酸配列であり、Ｍｔは配列番号２１に記載のヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する核酸配列である。
【００３７】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）としては、配列番号１（領域Ａ）または配列番号２（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）の核酸配列がヒト型結核菌以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、ヒト型結核菌に特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号１（領域Ａ）中の、５‘−ＧＧＴＴＴＣＧＧＧＧ−３’（配列番号２２）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号２（領域Ｂ）中の、５‘−ＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号２３）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２２および配列番号２３の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３８】
臨床診断において、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は、トリ型結核菌複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＡＣ）として同様に扱われることが多い。トリ型結核菌またはマイコバクテリウム・イントラセルラーレ、すなわちＭＡＣを特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）としては、配列番号３（領域Ａ）または配列番号４（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）の核酸配列がＭＡＣ以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、ＭＡＣに特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号３（領域Ａ）中の、５‘−ＴＣＡＡＣＧＴＣＧＧ−３’（配列番号２４）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号４（領域Ｂ）中の、５‘−ＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２５）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２４および配列番号２５の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３９】
マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）を特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）としては、配列番号５（領域Ａ）または配列番号６（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）の核酸配列がマイコバクテリウム・カンサシイ以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、マイコバクテリウム・カンサシイに特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号５（領域Ａ）中の、５‘−ＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号２６）または５‘−ＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２７）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号６（領域Ｂ）中の、５‘−ＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡ−３’（配列番号２８）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２６〜２８の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００４０】
上記のプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）は、菌種特異性が高いため検出の際に任意に混合して使用することができるが、より好適には、本明細書の実施例に記載の組み合わせを使用することができる。
【００４１】
本発明の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法において、検出にＩＦＰ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法など蛍光色素を用いる方法を用いれば、核酸増幅後の反応容器の蓋を開けることなく検出または菌種同定を行う、いわゆるホモジニアス検出が可能となり、臨床診断において致命的なコンタミネーションによる誤判定の危険性を抑制することができる。
【００４２】
また、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、上述のように、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）を検出の際に混合して使用する場合、各プローブが標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、および（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する方法としては特に限定されず、従来公知の種々の方法を用いることができるが、融解曲線解析を用いることが好ましい。融解曲線解析におけるシグナルの検出には、ＩＦＰ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法などを用いることができる。
【００４３】
ここで、図２を用いて、融解曲線解析の原理について説明する。図２は融解曲線解析の原理を模式的に示す図であり、（ａ）は検出にＩＦＰ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｂ）は検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｃ）は融解曲線解析で核酸増幅の結果を確認した結果の一例を示す。
【００４４】
図２（ａ）に示すように、ＩＦＰ法では、特許文献７に記載のように、二本鎖核酸に結合する化合物（インターカレーター）と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに、発する蛍光が変化する反応分子で標識したプローブとを用いる。つまり、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよく、解離していない状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよい。
【００４５】
インターカレーターは二本鎖核酸に特異的に結合し蛍光を発する物質であれば良く、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］を用いても良い。
【００４６】
二本鎖核酸構造は、標的核酸中の塩基とその相補的な核酸配列中の塩基の間で起こる塩基対生成によって形成される。塩基対生成はＣ（シトシン）とＧ（グアニン）、Ａ（アデニン）とＴ（チミン）またはＡ（アデニン）とＵ（ウラシル）の間で起こる水素結合により生じる。インターカレーターはこの二本鎖核酸構造を標的に結合し、蛍光を生じるようになる。
【００４７】
核酸プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは減衰しなければよく、蛍光検出工程で検出できればよい。蛍光物質としてはＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等があるが、好ましくはＦＲＥＴを生じる蛍光物質であり、より好ましくはインターカレーターと相互作用して特異的に検出できればよく、特に好ましい蛍光物質としてはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）が挙げられるがこの限りではない。ＦＲＥＴ現象を利用すれば、蛍光検出工程において核酸プローブの存在のみで発する蛍光が抑えられ、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブの発する蛍光を特異的に検出することが可能となる。
【００４８】
本発明に用いられる、好ましいインターカレーターと核酸プローブに標識する蛍光物質の組み合わせは、（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））または（［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ− ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））である。
【００４９】
図２（ｂ）に示すように、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法では、特許文献８に記載のように、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプローブを用いる。核酸増幅後に温度を徐々に上昇させて、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離すると、消光していた蛍光色素が再度発光する。この蛍光を検出すれば、核酸増幅の確認を行うことができる。
【００５０】
標識プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰してなくならなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＲＹ（商標） シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなど二本鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、またＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。標識プローブの塩基配列中の蛍光物質の標識位置は特に限定されないが、末端部に標識されていることが好ましく、末端に標識されていることがより好ましい。
【００５１】
標識プローブの塩基配列とそれに対し相補的な標的核酸の塩基配列の選択はハイブリダイゼーション時に蛍光の消光を生じるために重要である。標識プローブの塩基配列は標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる塩基配列であればよく、二本鎖核酸構造形成時に、蛍光物質が修飾されている標識プローブ末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在するように設計すればよい。標識プローブの末端が標識されている場合は、その末端塩基がＧ（グアニン）もしくはＣ（シトシン）であること、または標識プローブの末端と塩基対を形成する標的核酸の塩基から１もしくは３塩基離れてＧ（グアニン）が存在するように標識プローブの塩基配列が設計されていることがより好ましい。標識プローブの末端が標識されており、かつ末端塩基がＣ（シトシン）であるように設計することがさらに好ましい。
【００５２】
図２（ｃ）に示すように融解曲線解析の結果は、温度および蛍光強度の変化量によってアウトプットすればよい。図２（ｃ）は縦軸を蛍光強度の変化量としている。これは、上述のＩＦＰ法では、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態で、上記反応分子が発する蛍光を検出した場合を示す。また、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法での蛍光色素の発光を検出した場合でもある。ＩＦＰ法で、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出する場合は、解離した状態で発する蛍光を検出した場合と比べて、蛍光強度の変化量の正負が反対になる。つまり、得られる表の形は、図２（ｃ）に示す表の各線の形を、温度軸を対象に反転させた形となる。換言すれば、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出して、縦軸を、蛍光強度の変化量のマイナスとすれば、図２（ｃ）に示す表の各線の形と同じになる。
【００５３】
また、図２（ｃ）では３通りの試料に対して核酸増幅を行なった結果を示している。つまり、形成される二本鎖核酸の配列によって解離する温度が異なるため、各線のピークを示す温度が異なることが試料中に含まれた核酸の塩基配列が異なっていたことを示している。実線及び破線の結果を示した試料には、それぞれ異なる塩基配列を有する標的核酸が、１種類ずつ含まれていたことを示す。一点鎖線の結果を示した試料には、実線及び破線の結果を示した試料に含まれていた標的核酸が共に含まれていたことを示す。このように融解曲線解析を行なうことで、核酸増幅による増幅及び試料中に含まれていた標的核酸の塩基配列すなわち抗酸菌属細菌の種類を判別することができる。
【００５４】
本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、上記のような融解曲線解析を行う場合、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）がそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、および（Ｐｋ）の融解温度、すなわち当該複合体において二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離する温度が重要である。
【００５５】
一般に、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析における融解温度は、当該プローブのＴｍ値に依存する。Ｔｍ値とはプライマーが相補塩基とアニーリングし解離する時の温度を表す。Ｔｍ値は計算により算出することも可能である。Ｔｍ値の計算方法は、ハイブリダイゼーションにおける塩濃度等をパラメーターにして各種の計算方法が考案されている。一般的に良く用いられる計算方法としては、最近接塩基対法（Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ Ｃ．， Ｌｉｆｓｏｎ Ｓ． （１９６５） Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ − Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３， １９５−２０８ 、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．， Ｆｒａｎｋ Ｒ．， Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｈ．， Ｍａｒｋｅｙ Ｌ．Ａ． （１９８６） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ − Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ３７４６−３７５０）やＷａｌｌａｎｃｅ法（Ｗａｌｌａｃｅ， Ｒ．Ｂ．； Ｓｈａｆｆｅｒ， Ｊ．； Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ．Ｆ．； Ｂｏｎｎｅｒ， Ｊ．； Ｈｉｒｏｓｅ， Ｔ．； Ｉｔａｋｕｒａ， Ｋ．； （１９７９） Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ６， ３５４３）、ＧＣ％法（Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ Ｓａｌｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ Ｃ．，Ｌｉｆｓｏｎ Ｓ． （１９６５） ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ ３．１９５−２０８、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｋ、 Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０） １８（２１）６４０９−６４１２）などを用いることができ、標的核酸の配列または検出の条件などによっては計算方法によるＴｍ値の差異が影響するが、当業者にとって容易に想到し得る検討により実験的に当該Ｔｍ値の差異を修正し、本発明の効果を有するプローブを設定することができる。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．， Ｆｒａｎｋ Ｒ．， Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｈ．， Ｍａｒｋｅｙ Ｌ．Ａ． （１９８６） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ − Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ３７４６−３７５０に記載の方法にて計算したＴｍ値を用いることが好ましい。
【００５６】
本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値は、互いに３℃以上異なることが好ましい。一例として、プローブのＴｍ値が大きい順に、（Ｃｔ）＞（Ｃｍ）＞（Ｃｋ）である場合には、プローブ（Ｃｔ）と（Ｃｍ）のＴｍ値の差が３℃以上であり、プローブ（Ｃｍ）と（Ｃｋ）のＴｍ値の差が３℃以上であればよい。Ｔｍ値が互いに３℃以上異なっていれば、融解曲線解析などを用いて、各プローブがそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を明確に判別することができる。
【００５７】
このように、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、３℃以上のＴｍ値の差で複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を判別できる理由として、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の菌種特異性が高い、すなわち本発明で発見したｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いことが挙げられる。
【００５８】
抗酸菌属細菌の菌種同定には、１６ＳリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子が従来より広く用いられてきた。しかし、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は菌種特異性が本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域に比べて低く、したがってプローブの菌種特異性が低いため検出の際に非特異的なシグナルが生成し、本発明のように複数のプローブを検出の際に混合して使用することは困難であった。換言すれば、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法では、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いため、当該遺伝子を標的とするプローブの菌種特異性も高く、複数の菌種について同時に判別を行うことができる。
【００５９】
図３に本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示した。進化系統樹は菌種間で遺伝子配列に差異が生じる確率を示す指標であり、数値が大きいほど菌種間で遺伝子配列の差異が大きいことを表している。図３のように、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に比べ、菌種による遺伝子配列の違いが約１０倍高く、抗酸菌属細菌の菌種を同定するための遺伝子として優れていることが分かる。遺伝子の進化系統樹は、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティクス製）などを用いて、遺伝子配列より計算することができる。
【００６０】
また、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、Ｔｍ値の他にも、プローブの長さを指標として、当該プローブの設計を簡易的に行うこともできる。プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さは、互いに１塩基以上異なることが好ましい。一例として、プローブが長い順に、（Ｃｔ）＞（Ｃｍ）＞（Ｃｋ）である場合には、プローブ（Ｃｔ）と（Ｃｍ）の長さの差が１塩基以上であり、プローブ（Ｃｍ）と（Ｃｋ）の長さの差が１塩基以上であればよい。プローブの長さが互いに１塩基以上異なっていれば、融解曲線解析などを用いて、各プローブがそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を明確に判別することができる。このような簡易的なプローブ設計法も従来技術では困難であり、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いことに由来する。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６２】
〔実施例１：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌およびＭＡＣの同定〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００６３】
（２）プライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１４〜１７に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１４〜１７と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）など）に依頼した。オリゴ１４がプライマー（Ａ）であり、オリゴ１５がプライマー（Ｂ）であり、オリゴ１６がプローブ（Ｃｔ）であり、オリゴ１７がプローブ（Ｃｍ）である。オリゴ１６は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、オリゴ１７は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、かつ３’末端がリン酸化されている。
【００６４】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００６５】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ１６（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）２００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μｌ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００６６】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００６７】
（４）結果
図４は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合にヒト型結核菌（ＭＴ）とは異なる位置に明瞭なピークが観察され、マイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）およびプローブ（Ｃｍ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）およびプローブ（Ｃｍ）を組み合わせて用いることで、一度の測定でヒト型結核菌およびＭＡＣを同定できることを示している。
【００６８】
〔実施例２：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定１〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００６９】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号２９、３０に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２９、３０と示す）を合成した。オリゴ２９はプローブ（Ｃｋ）オリゴ３０はプローブ（Ｃｔ）である。オリゴ２９は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、かつ３’末端がリン酸化されている。オリゴ３０は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００７０】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７１】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） １００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００７２】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００７３】
（４）結果
図６は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３０、１７、２９はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブは全て同じプライマーを用いて伸長させた伸長産物とハイブリダイズすることになる。図６より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６８℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６３℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には５９℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００７４】
〔実施例３：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定２〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００７５】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号３１に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ３１と示す）を合成した。オリゴ３１はプローブ（Ｃｔ）である。オリゴ３１は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００７６】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７７】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３１（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００７８】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００７９】
（４）結果
図７は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３１はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ１７、２９はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｔ）は、プローブ（Ｃｍ）および（Ｃｋ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図７より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６６℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６３℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には５９℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００８０】
〔実施例４：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定３〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８１】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号３２、３３に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ３２、３３と示す）を合成した。オリゴ３２はプローブ（Ｃｍ）であり、オリゴ３３はプローブ（Ｃｋ）である。オリゴ３２は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。オリゴ３３は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され３’末端がリン酸化されている。
【００８２】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００８３】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ３２（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１６０ｎＭ、
オリゴ３３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００８４】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００８５】
（４）結果
図８は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３２はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３０、３３はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｍ）は、プローブ（Ｃｔ）および（Ｃｋ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図８より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６８℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６０℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には６３℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００８６】
〔実施例５：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定４〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８７】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００８８】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３１（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ３２（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１６０ｎＭ、
オリゴ３３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００８９】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００９０】
（３）結果
図９は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３１、３２はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３３はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｋ）は、プローブ（Ｃｔ）および（Ｃｍ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図９より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６６℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６０℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には６３℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００９１】
〔実施例６：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いた抗酸菌属からのヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定〕
（１）試料の調製
３６種類の抗酸菌属細菌をそれぞれマクファランドＮｏ．１の濃度となるようにＴＥバッファーに懸濁し、ＡＭＲ社製ＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ用ビーズ充填チューブに入れた。チューブを９５℃１０分間加熱し、ボルテックスにより５分間菌体破砕処理を行った。その後破砕処理後の液を１００倍希釈して菌体破砕液とし、これを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００９２】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
３６種類の抗酸菌属細菌菌体破砕液および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００９３】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） １００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化） ８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化） ３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００９４】
核酸増幅増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６２℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００９５】
（３）結果
表２に３６種類の抗酸菌属細菌の検出結果を示す。検出欄への数値の記載は検出可能な菌種であることを示す。例えば「６８」は６８℃に検出ピークが見られることを示している。５５℃以上においてピークが検出できない菌種は「−」と記載する。オリゴ３０（Ｃｔ）、オリゴ１７（Ｃｍ）およびオリゴ２９（Ｃｋ）の組み合わせで検出可能な菌種は、図６で特異的な検出ピークが得られているＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫである。実施例２の結果と同様にＭＴの菌体破砕液を試料とした場合には６８℃、ＭＡＣの菌体破砕液を試料とした場合には６３℃、ＭＫの菌体破砕液を試料とした場合には５９℃の検出ピークが観察された。しかし、ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫ以外の抗酸菌種３２種類の菌体破砕液を試料とした場合では陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、オリゴ３０（Ｃｔ）、オリゴ１７（Ｃｍ）およびオリゴ２９（Ｃｋ）を組み合わせることによって、臨床上重要であるＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫの三種を特異的に検出でき、かつ三種を１つの試薬により明確に同定できることを示している。
【００９６】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によれば、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できるものである。それゆえ、単一種類の蛍光だけを検出する安価なシステムにて、コンタミネーションによる誤判定の危険を冒すことなく、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定することができるという効果を奏するため、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を示す図である。
【図２】融解曲線解析の原理を模式的に示す図である。
【図３】本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示す図である。
【図４】実施例１の結果を示す図である。
【図５】本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において領域Ｃ、領域Ｄおよび領域Ｅを示す図である。
【図６】実施例２の結果を示す図である。
【図７】実施例３の結果を示す図である。
【図８】実施例４の結果を示す図である。
【図９】実施例５の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床診断上、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をはじめとする抗酸菌属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）細菌を迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌属は抗酸性の性質をもつグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。一般に抗酸菌は発育が遅く、培養にはかなりの時間を要する。
【０００３】
この中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫感染などによって経気道的に感染する。
【０００４】
従来、結核菌の検査は培養法によって行っていた。一般的には小川培地上で結核菌を分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験などの結果から菌種を同定する。しかし、ヒト型結核菌は増殖が遅く、分離培養だけで約３〜４週間を要し、その後の各種試験で、さらに約２〜３週間を要する。そのため、ヒト型結核菌の検出または同定検査は、その臨床上の重要性・緊急性にもかかわらず、約１ヶ月以上を要し、機動的な診断や投薬に大きな制約となっていた。ヒト型結核菌が産生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが開発されてきたが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至っておらず、しかも、感度的に問題があるため分離培養が必要なことは変わりがなかった。
【０００５】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の他にも、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などの非定型抗酸菌が、ヒトに病原性を示すことが知られている。症状は結核に比べて軽く、感染力も弱いが、抗結核剤に耐性であり、有効な薬剤はない。これらは結核菌と同様に、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などを冒し、特に肺感染症が多い。
【０００６】
一般に、肺結核の鑑別は、臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の同定によってなされなければならない。非定型抗酸菌の病原性はマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）＞トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）＞その他の順で大きく、上位３菌種は特に重要である。
【０００７】
従来から、これらの非定型抗酸菌をヒト結核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの結果から菌種を同定している。しかし、これらも一般的に増殖が遅く、菌種の同定までに約１ヶ月以上を要することが多い。
【０００８】
ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は、臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤であるが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンブトール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投与が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性である。菌種の同定は、その後の治療方針を大きく左右するのである。しかしながら前述したように、これらの菌は増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。また、マイコバクテリウム・スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）など、類似の非病原性菌が検出されることもある。迅速で確実な検出及び菌種同定法が望まれるのはこのためである。
【０００９】
最近、ＤＮＡやＲＮＡを人為的に増幅し、増幅後の核酸を検出することによって、高感度に病原体を検出する方法が開発されてきた。既に知られている核酸増幅方法としてＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、ＮＡＳＢＡ（非特許文献１）、ＬＣＲ（特許文献４、特許文献５）、ＳＤＡ（非特許文献２）、ＲＣＲ（特許文献６）、ＴＭＡ（非特許文献３）ＬＡＭＰ（非特許文献４）、ＩＣＡＮ（非特許文献５）などが挙げられる。
【００１０】
なかでもＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、温度の上昇および下降を繰り返すことにより、当該一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる標的核酸の特定領域を指数関数的に増幅させることができる。
【００１１】
通常ＰＣＲ法は特許文献３に示されているように、ａ）９０〜１０５℃の範囲内の温度（好ましくは９０〜１００℃）で０．５〜５分間（好ましくは０．５〜３分間）、変性させる工程、ｂ）３５〜６５℃の範囲内の温度（好ましくは３７〜６０℃）で０．５〜５分間（好ましくは１〜３分間）、プライマーと鋳型のハイブリッドを形成させる（アニーリング）工程、およびｃ）４０〜８０℃の範囲内の温度（好ましくは５０〜７５℃）で０．５〜４０分間（好ましくは１〜３分間）、プライマー伸長生成物を形成させる（伸長）工程、からなる増幅サイクルを用いる。
【００１２】
ＰＣＲ法のサイクルを繰り返し行うことで増幅した核酸断片は、各種の検出方法を用いて検出できるようになる。現在利用されている代表的な検出方法として、アガロースゲル電気泳動法がある。しかしながら、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱う必要があり、コンタミネーションが起こる危険性が高かった。また、操作も煩雑であり検出終了までの時間も１時間以上を要するため、当該検出方法の臨床診断への適用は困難であった。
【００１３】
電気泳動以外の検出方法として、二本鎖核酸に結合した時に蛍光が増強される性質を示すＤＮＡ挿入色素（インターカレーター）を利用する方法が一般的に用いられている。核酸増幅中のＤＮＡ濃度の上昇に伴う蛍光の増強は、反応の進行を測定するために、また標的核酸分子のコピー数を決定するために利用できる。さらに、精密に制御された温度変化に伴う蛍光の変化をモニターすることにより、例えばＰＣＲサイクル反応の終了時点で、ＤＮＡ融解曲線を作成することができる。このような融解曲線解析では二本鎖核酸の性質をある程度識別することができ、融解曲線解析での融解温度が極端に低い場合はプライマーダイマーなど、標的核酸断片より短い核酸断片が増幅されたことが考えられるし、主なピークが一本でない場合は標的核酸断片ではない非特異的な増幅核酸断片が存在することを示している。このように、蛍光を測定する方法によれば、増幅核酸断片の飛散などによりコンタミネーションが起こり正しい判定結果が得られなくなる危険性や、煩雑な操作から起こり得る人為的なミスを防止することができるため、臨床診断に適している。しかし、一般的なインターカレーター法は二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、特に臨床診断など、目的の核酸配列に特異的な検出が必要とされる場合には、当該核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出する可能性があるため、それほど有効ではない。
【００１４】
核酸配列特異的プローブ法は、増幅反応の進行をモニターするために、さらなる核酸反応成分（核酸プローブ）を利用する。この方法は、検出の基本として蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）を利用することが多い。一つあるいはそれ以上の核酸プローブを蛍光色素で標識し、一方のプローブに標識された蛍光色素はエネルギー供与体分子として、もう一方の蛍光色素はエネルギー受容体分子として働くことができるようにする。これらは時として、それぞれレポーター分子および消光分子として知られる。エネルギー供与体分子は励起スペクトラム範囲の特異的波長の光で励起され、引き続いて蛍光放出波長の範囲で光を放出する。エネルギー受容体分子も、様々な距離依存性エネルギー転移機構により、当該供与体分子からエネルギーを受け取ることにより、この波長で励起される。蛍光エネルギー転移の特別な例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がある。一般に、エネルギー受容体分子とエネルギー供与体分子が近接している場合、例えば、これらが同じまたは隣接する分子上にある場合に、受容体分子は供与体分子の放出エネルギーを受け取ることができる。通常、ＦＥＴまたはＦＲＥＴプローブには二つの種類、すなわち、エネルギー受容体からエネルギー供与体を分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体分子と受容体分子の空間的関係を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いるものが利用される。
【００１５】
加水分解を用いるプローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして市販されている。このプローブは、エネルギー供与体およびエネルギー受容体分子で標識されたオリゴヌクレオチドからなり、増幅核酸断片の一方の鎖の特異的領域にハイブリダイズするように設計される。例えばＰＣＲにおいて、プライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑポリメラーゼが５’から３’へのポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。このときＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑによる伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。もしＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが産物の鎖にハイブリダイズしていれば、伸長するＴａｑ分子がプローブを加水分解し、エネルギー受容体とエネルギー供与体を遊離し、検出可能なシグナルが発生する。このシグナルは累積的であり、遊離のエネルギー供与体および受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する。しかし、蛍光シグナルの生成がプローブの加水分解反応の発生に依存するため、この方法には時間的不利益が存在する。また、５０サイクル以上というような多数回の増幅サイクルが必要な場合、加水分解が非特異的に起こり得る問題点も見出されている。
【００１６】
ハイブリダイゼーションを用いるプローブは、数多くの型式のものが利用可能である。例えば、分子ビーコンは、ヘアピンループを形成するような相補的な５’および３’配列を有するオリゴヌクレオチドであり、その末端に標識された蛍光色素は、ヘアピン構造が形成されるためにＦＲＥＴが起こるような近接位置にある。分子ビーコンの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに伴ってエネルギー受容体とエネルギー供与体が分離されるとＦＲＥＴは起こらなくなることを利用して、検出を行う。
【００１７】
また、標識プローブの対合も利用可能である。エネルギー供与体分子を標識したプローブとエネルギー受容体分子を標識したプローブが増幅核酸断片の鎖上で近接してハイブリダイズすることによってＦＲＥＴが生じ、このＦＲＥＴによって生じた波長の蛍光を検出する。このタイプの変種には、標識増幅プライマーと単一の近接する標識プローブの利用が含まれる。しかし、二つの標識オリゴヌクレオチドの使用、または二つの標識分子を含む分子ビーコンの使用は、一般に検出にかかるコストが高いことが問題である。さらに、例えば臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられることが問題である。前述のように、ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は臨床診断上重要であり、迅速で確実な検出および菌種同定法が望まれているが、これらの技術では要望を満たすことができない。
【００１８】
特許文献７では、ＤＮＡ二本鎖結合剤と、ＤＮＡ二本鎖結合剤から蛍光エネルギーを吸収できるあるいは蛍光エネルギーを与えることができる反応性分子を含む核酸プローブを利用し、標的核酸の増幅反応を経て、蛍光をモニターする検出方法が開示されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良いためコストの面で有利であるが、特許文献７に開示された技術を用いても、上述のような、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合に、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【００１９】
特許文献８では、ハイブリダイゼーションの際に蛍光が消光する核酸プローブを用いた検出方法が開示されている。蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの前後において蛍光色素が発する蛍光の減少量を測定する方法、または蛍光色素で標識された核酸プライマーを標的核酸にハイブリダイゼーションさせた後に伸長させ、核酸変性時の蛍光量に対するアニーリング反応および伸長反応時の蛍光量の減少を測定する方法が示されている。さらに当該方法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、および該ＰＣＲ法で得られるデータの解析の際にアニーリング反応時の蛍光強度値を変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法が記載されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良く、さらにインターカレーターも使用しないためコストの面で有利であるが、特許文献８に開示された技術を用いても、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、上述のような非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】国際公開８９／１２６９６号
【特許文献５】特開平２−２９３４号
【特許文献６】国際公開９０／１０６９号公報
【特許文献７】特表２００３−５００００１
【特許文献８】特許第３４３７８１６号
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁（１９９１）
【非特許文献２】Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻、第１６９１頁（１９９２）
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁（１９９３）
【非特許文献４】Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４ 第４２巻：第１，９５６頁
【非特許文献５】Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ： Ｋｅｋｋａｋｕ． ２００３ 第７８巻、第５３３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
前述のように、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱うことから、コンタミネーションが起こり、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２１】
また、インターカレーターを用いる方法ではコンタミネーションの可能性は低減されるが、二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、標的核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出し、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２２】
核酸配列特異的なプローブを用いる方法では、上述したような判定結果の正確性に関する問題点はある程度改善されているが、例えばヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定など、臨床診断上重要である複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられるため臨床診断には適していない。
【００２３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、臨床診断上重要なヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌を迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法ならびにそれらの試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子における特定領域の菌種特異性が高く、当該遺伝子領域を標的核酸とするプローブを用いることにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００２５】
[項１]
配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
［項２］
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項２−１]
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
[項３]
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値が、互いに３℃以上異なることを特徴とする項２に記載の菌種同定方法。
[項４]
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さが、互いに１塩基以上異なることを特徴とする項２または３に記載の菌種同定方法。
[項５]
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする項２〜４のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項６]
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴とする項２〜５のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項７]
複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする項２〜６のいずれかに記載の菌種同定方法。
[項８]
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする項７に記載の菌種同定方法。
[項９]
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする項７に記載の菌種同定方法。
[項１０]
少なくとも以下の（１）〜（４）を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、
（２）配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）、
（３）配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）、
（４）プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）およびオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、以上のように、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できるものである。それゆえ、単一種類の蛍光だけを検出する安価なシステムにて、コンタミネーションによる誤判定の危険を冒すことなく、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書において「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」とは、後述のＰＣＲ法を用いて、以下の配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド、
５’−ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３）
および
５’−ＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号４）
をプライマーとして使用した際に、増幅される抗酸菌属細菌の遺伝子領域に含まれる。当該増幅領域について、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）は配列番号１８に、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は配列番号１９に、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）は配列番号２０に、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は配列番号２１に、それぞれ具体的な核酸配列を記載する。
また、上記の「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」は、「領域Ａおよび領域Ｂ」として後述するが、従来公知であるｄｎａＪ遺伝子の部分配列（特許第２９６６４７８号、特許第３１３４９４０号、Ｌ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．第３１巻４４６頁参照）より当該遺伝子の下流に位置し、従来技術において抗酸菌属細菌の検出および／または同定には使用されなかった領域である。
【００２８】
本発明の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法は、上記のような抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を検出する検出工程を含んでいる。
【００２９】
上記検出工程は、抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。当該増幅工程では、試料中の全核酸配列中から増幅したい核酸配列（標的核酸）のみが、その固有の配列に対して相補性を有するプライマーを利用して増幅される。具体的に上記増幅工程では、一本鎖に変性させた抗酸菌属細菌の染色体またはその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび２種類以上のオリゴヌクレオチド（プライマー）等を作用させることによって、上記プライマー間の配列が増幅される。
【００３０】
上記増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、上記核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁、１９９１年参照）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号、特開平２−２９３４号参照）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 第２０巻、第１６９１頁、１９９２年参照）、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号参照）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁、１９９３年参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第４２巻：第１，９５６頁、２００４年参照）、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ． 第７８巻、第５３３頁、２００３年参照）などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記核酸増幅方法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、上記増幅工程に好適に用いることが可能である。
【００３１】
また、試料中の核酸量が少ない場合には、上記増幅工程に先立って、抗酸菌属細菌の染色体またはその断片を上記増幅工程と同じ方法によって増幅しておくことも可能である。
【００３２】
上記増幅工程において用いられる核酸増幅方法としては、上記方法の中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ法は、試料核酸、一対のプライマー（ＡおよびＢ）、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性工程、アニーリング工程、伸長反応の３工程からなる反応サイクルを繰り返すことによって、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）によって挟まれる試料核酸中の領域を、指数関数的に増幅させることができる。すなわち、変性工程にて試料核酸を変性し、続くアニーリング工程にて各プライマーと当該プライマーに相補的な試料核酸中の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程にて各プライマーを起点として、試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。この１サイクルによって、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）で挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。
【００３３】
増幅工程に使用する一対のプライマー（ＡおよびＢ）としては、増幅された核酸断片に上記の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を含んでいれば特に限定されないが、ＧＣ含量が６５％以下の領域に設計することが好適である。より好適には、図５に示される領域Ｃ、領域Ｄまたは領域Ｅの核酸配列中または各配列に相補的な核酸配列中に設計できる。配列番号３及び配列番号４をプライマーとして使用した場合に増幅される核酸配列領域はＧＣ含量が高い（約７０％）。該領域中において、図５で示される領域Ｃ、領域Ｄ、領域Ｅは抗酸菌属細菌ではいずれもＧＣ含量が６５％以下と比較的低い領域である。そのため、ＧＣ含量が高いことによるプライマーの非特異反応が起こりにくく、試料中の標的核酸を特異的に増幅することができる。
例えば、
プライマー（Ａ）としては、
５’−ＡＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＧ−３’（配列番号９）
５’−ＣＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号１０）
プライマー（Ｂ）としては、
５’−ＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１１）
５’−ＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴ−３’（配列番号１２）
５’−ＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＴ−３’（配列番号１３）
のような配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３４】
少なくともプライマー（Ａ）とプライマー（Ｂ）を用いて増幅させた核酸断片と配列番号１〜６に示される核酸配列または該核酸配列に相補的な核酸配列が「９０％以上一致する」とは、例えばヒト型結核菌をターゲットとした場合は、ヒト型結核菌の株間で該核酸断片に変異が存在する場合の一致率を示している。ヒト型結核菌株間で変異が存在する場合でも、非結核性抗酸菌と区別して、ヒト型結核菌を特異的に検出できることを表している。好適には該一致率は９０％以上である。臨床分離された非結核性抗酸菌３５種の保有する核酸配列と配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率を一例として表１に示す。配列番号１と最も一致している菌種は マイコバクテリウム・マルモエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）で、一致率８８％であり、配列番号２と最も一致している菌種はマイコバクテリウム・チタエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｉｔａｅ）で、一致率８８％である。ヒト型結核菌と同属の非結核性抗酸菌であっても一致率は９０％に満たない。また、ヒト型結核菌２０株の保有する核酸配列と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率は、２０株全て９０％以上である。配列番号３または４のトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、配列番号５または６のマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）においても同様の結果が得られる。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本発明の抗酸菌属細菌の検出方法において、検出工程で使用する検出用オリゴヌクレオチドプローブについて説明する。本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域は、図１に、一例としてヒト型結核菌をはじめとする４種類の抗酸菌属細菌についてｄｎａＪ１遺伝子の部分配列を用いて示したように、領域Ａおよび領域Ｂの２箇所があり、どちらの領域を用いても本発明の効果を得ることができる。なお、図１において、Ｍａは配列番号１８に記載のトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）に由来する核酸配列であり、Ｍｉは配列番号１９に記載のマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）に由来する核酸配列であり、Ｍｋは配列番号２０に記載のマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）に由来する核酸配列であり、Ｍｔは配列番号２１に記載のヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する核酸配列である。
【００３７】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）としては、配列番号１（領域Ａ）または配列番号２（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）の核酸配列がヒト型結核菌以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、ヒト型結核菌に特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号１（領域Ａ）中の、５‘−ＧＧＴＴＴＣＧＧＧＧ−３’（配列番号２２）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号２（領域Ｂ）中の、５‘−ＡＡＣＣＧＧＣＧＧＴ−３’（配列番号２３）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２２および配列番号２３の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３８】
臨床診断において、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は、トリ型結核菌複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＡＣ）として同様に扱われることが多い。トリ型結核菌またはマイコバクテリウム・イントラセルラーレ、すなわちＭＡＣを特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）としては、配列番号３（領域Ａ）または配列番号４（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）の核酸配列がＭＡＣ以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、ＭＡＣに特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号３（領域Ａ）中の、５‘−ＴＣＡＡＣＧＴＣＧＧ−３’（配列番号２４）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号４（領域Ｂ）中の、５‘−ＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２５）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２４および配列番号２５の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３９】
マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）を特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）としては、配列番号５（領域Ａ）または配列番号６（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）の核酸配列がマイコバクテリウム・カンサシイ以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、マイコバクテリウム・カンサシイに特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号５（領域Ａ）中の、５‘−ＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号２６）または５‘−ＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２７）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号６（領域Ｂ）中の、５‘−ＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡ−３’（配列番号２８）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２６〜２８の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００４０】
上記のプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）は、菌種特異性が高いため検出の際に任意に混合して使用することができるが、より好適には、本明細書の実施例に記載の組み合わせを使用することができる。
【００４１】
本発明の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定方法において、検出にＩＦＰ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法など蛍光色素を用いる方法を用いれば、核酸増幅後の反応容器の蓋を開けることなく検出または菌種同定を行う、いわゆるホモジニアス検出が可能となり、臨床診断において致命的なコンタミネーションによる誤判定の危険性を抑制することができる。
【００４２】
また、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、上述のように、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）を検出の際に混合して使用する場合、各プローブが標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、および（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する方法としては特に限定されず、従来公知の種々の方法を用いることができるが、融解曲線解析を用いることが好ましい。融解曲線解析におけるシグナルの検出には、ＩＦＰ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法などを用いることができる。
【００４３】
ここで、図２を用いて、融解曲線解析の原理について説明する。図２は融解曲線解析の原理を模式的に示す図であり、（ａ）は検出にＩＦＰ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｂ）は検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｃ）は融解曲線解析で核酸増幅の結果を確認した結果の一例を示す。
【００４４】
図２（ａ）に示すように、ＩＦＰ法では、特許文献７に記載のように、二本鎖核酸に結合する化合物（インターカレーター）と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに、発する蛍光が変化する反応分子で標識したプローブとを用いる。つまり、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよく、解離していない状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよい。
【００４５】
インターカレーターは二本鎖核酸に特異的に結合し蛍光を発する物質であれば良く、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］を用いても良い。
【００４６】
二本鎖核酸構造は、標的核酸中の塩基とその相補的な核酸配列中の塩基の間で起こる塩基対生成によって形成される。塩基対生成はＣ（シトシン）とＧ（グアニン）、Ａ（アデニン）とＴ（チミン）またはＡ（アデニン）とＵ（ウラシル）の間で起こる水素結合により生じる。インターカレーターはこの二本鎖核酸構造を標的に結合し、蛍光を生じるようになる。
【００４７】
核酸プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは減衰しなければよく、蛍光検出工程で検出できればよい。蛍光物質としてはＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等があるが、好ましくはＦＲＥＴを生じる蛍光物質であり、より好ましくはインターカレーターと相互作用して特異的に検出できればよく、特に好ましい蛍光物質としてはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標）が挙げられるがこの限りではない。ＦＲＥＴ現象を利用すれば、蛍光検出工程において核酸プローブの存在のみで発する蛍光が抑えられ、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブの発する蛍光を特異的に検出することが可能となる。
【００４８】
本発明に用いられる、好ましいインターカレーターと核酸プローブに標識する蛍光物質の組み合わせは、（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））または（［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ− ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））である。
【００４９】
図２（ｂ）に示すように、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法では、特許文献８に記載のように、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプローブを用いる。核酸増幅後に温度を徐々に上昇させて、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離すると、消光していた蛍光色素が再度発光する。この蛍光を検出すれば、核酸増幅の確認を行うことができる。
【００５０】
標識プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰してなくならなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＲＹ（商標） シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなど二本鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、またＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。標識プローブの塩基配列中の蛍光物質の標識位置は特に限定されないが、末端部に標識されていることが好ましく、末端に標識されていることがより好ましい。
【００５１】
標識プローブの塩基配列とそれに対し相補的な標的核酸の塩基配列の選択はハイブリダイゼーション時に蛍光の消光を生じるために重要である。標識プローブの塩基配列は標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる塩基配列であればよく、二本鎖核酸構造形成時に、蛍光物質が修飾されている標識プローブ末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在するように設計すればよい。標識プローブの末端が標識されている場合は、その末端塩基がＧ（グアニン）もしくはＣ（シトシン）であること、または標識プローブの末端と塩基対を形成する標的核酸の塩基から１もしくは３塩基離れてＧ（グアニン）が存在するように標識プローブの塩基配列が設計されていることがより好ましい。標識プローブの末端が標識されており、かつ末端塩基がＣ（シトシン）であるように設計することがさらに好ましい。
【００５２】
図２（ｃ）に示すように融解曲線解析の結果は、温度および蛍光強度の変化量によってアウトプットすればよい。図２（ｃ）は縦軸を蛍光強度の変化量としている。これは、上述のＩＦＰ法では、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態で、上記反応分子が発する蛍光を検出した場合を示す。また、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法での蛍光色素の発光を検出した場合でもある。ＩＦＰ法で、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出する場合は、解離した状態で発する蛍光を検出した場合と比べて、蛍光強度の変化量の正負が反対になる。つまり、得られる表の形は、図２（ｃ）に示す表の各線の形を、温度軸を対象に反転させた形となる。換言すれば、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出して、縦軸を、蛍光強度の変化量のマイナスとすれば、図２（ｃ）に示す表の各線の形と同じになる。
【００５３】
また、図２（ｃ）では３通りの試料に対して核酸増幅を行なった結果を示している。つまり、形成される二本鎖核酸の配列によって解離する温度が異なるため、各線のピークを示す温度が異なることが試料中に含まれた核酸の塩基配列が異なっていたことを示している。実線及び破線の結果を示した試料には、それぞれ異なる塩基配列を有する標的核酸が、１種類ずつ含まれていたことを示す。一点鎖線の結果を示した試料には、実線及び破線の結果を示した試料に含まれていた標的核酸が共に含まれていたことを示す。このように融解曲線解析を行なうことで、核酸増幅による増幅及び試料中に含まれていた標的核酸の塩基配列すなわち抗酸菌属細菌の種類を判別することができる。
【００５４】
本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、上記のような融解曲線解析を行う場合、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）がそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、および（Ｐｋ）の融解温度、すなわち当該複合体において二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離する温度が重要である。
【００５５】
一般に、オリゴヌクレオチドプローブを用いた融解曲線解析における融解温度は、当該プローブのＴｍ値に依存する。Ｔｍ値とはプライマーが相補塩基とアニーリングし解離する時の温度を表す。Ｔｍ値は計算により算出することも可能である。Ｔｍ値の計算方法は、ハイブリダイゼーションにおける塩濃度等をパラメーターにして各種の計算方法が考案されている。一般的に良く用いられる計算方法としては、最近接塩基対法（Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ Ｃ．， Ｌｉｆｓｏｎ Ｓ． （１９６５） Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ ｓａｌｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ − Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３， １９５−２０８ 、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．， Ｆｒａｎｋ Ｒ．， Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｈ．， Ｍａｒｋｅｙ Ｌ．Ａ． （１９８６） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ − Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ３７４６−３７５０）やＷａｌｌａｎｃｅ法（Ｗａｌｌａｃｅ， Ｒ．Ｂ．； Ｓｈａｆｆｅｒ， Ｊ．； Ｍｕｒｐｈｙ Ｒ．Ｆ．； Ｂｏｎｎｅｒ， Ｊ．； Ｈｉｒｏｓｅ， Ｔ．； Ｉｔａｋｕｒａ， Ｋ．； （１９７９） Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ６， ３５４３）、ＧＣ％法（Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｏｎ Ｓａｌｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ Ｃ．，Ｌｉｆｓｏｎ Ｓ． （１９６５） ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ ３．１９５−２０８、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｋ、 Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０） １８（２１）６４０９−６４１２）などを用いることができ、標的核酸の配列または検出の条件などによっては計算方法によるＴｍ値の差異が影響するが、当業者にとって容易に想到し得る検討により実験的に当該Ｔｍ値の差異を修正し、本発明の効果を有するプローブを設定することができる。Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ Ｋ．Ｊ．， Ｆｒａｎｋ Ｒ．， Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｈ．， Ｍａｒｋｅｙ Ｌ．Ａ． （１９８６） Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ − Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ３７４６−３７５０に記載の方法にて計算したＴｍ値を用いることが好ましい。
【００５６】
本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値は、互いに３℃以上異なることが好ましい。一例として、プローブのＴｍ値が大きい順に、（Ｃｔ）＞（Ｃｍ）＞（Ｃｋ）である場合には、プローブ（Ｃｔ）と（Ｃｍ）のＴｍ値の差が３℃以上であり、プローブ（Ｃｍ）と（Ｃｋ）のＴｍ値の差が３℃以上であればよい。Ｔｍ値が互いに３℃以上異なっていれば、融解曲線解析などを用いて、各プローブがそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を明確に判別することができる。
【００５７】
このように、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、３℃以上のＴｍ値の差で複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を判別できる理由として、プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の菌種特異性が高い、すなわち本発明で発見したｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いことが挙げられる。
【００５８】
抗酸菌属細菌の菌種同定には、１６ＳリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子が従来より広く用いられてきた。しかし、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は菌種特異性が本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域に比べて低く、したがってプローブの菌種特異性が低いため検出の際に非特異的なシグナルが生成し、本発明のように複数のプローブを検出の際に混合して使用することは困難であった。換言すれば、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法では、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いため、当該遺伝子を標的とするプローブの菌種特異性も高く、複数の菌種について同時に判別を行うことができる。
【００５９】
図３に本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示した。進化系統樹は菌種間で遺伝子配列に差異が生じる確率を示す指標であり、数値が大きいほど菌種間で遺伝子配列の差異が大きいことを表している。図３のように、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に比べ、菌種による遺伝子配列の違いが約１０倍高く、抗酸菌属細菌の菌種を同定するための遺伝子として優れていることが分かる。遺伝子の進化系統樹は、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティクス製）などを用いて、遺伝子配列より計算することができる。
【００６０】
また、本発明の抗酸菌属細菌の菌種同定方法において、Ｔｍ値の他にも、プローブの長さを指標として、当該プローブの設計を簡易的に行うこともできる。プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さは、互いに１塩基以上異なることが好ましい。一例として、プローブが長い順に、（Ｃｔ）＞（Ｃｍ）＞（Ｃｋ）である場合には、プローブ（Ｃｔ）と（Ｃｍ）の長さの差が１塩基以上であり、プローブ（Ｃｍ）と（Ｃｋ）の長さの差が１塩基以上であればよい。プローブの長さが互いに１塩基以上異なっていれば、融解曲線解析などを用いて、各プローブがそれぞれ標的核酸または増幅核酸断片とハイブリダイズした複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の種類を明確に判別することができる。このような簡易的なプローブ設計法も従来技術では困難であり、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いことに由来する。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６２】
〔実施例１：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌およびＭＡＣの同定〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００６３】
（２）プライマーの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１４〜１７に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１４〜１７と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）など）に依頼した。オリゴ１４がプライマー（Ａ）であり、オリゴ１５がプライマー（Ｂ）であり、オリゴ１６がプローブ（Ｃｔ）であり、オリゴ１７がプローブ（Ｃｍ）である。オリゴ１６は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、オリゴ１７は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、かつ３’末端がリン酸化されている。
【００６４】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００６５】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ１６（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）２００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μｌ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００６６】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００６７】
（４）結果
図４は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合にヒト型結核菌（ＭＴ）とは異なる位置に明瞭なピークが観察され、マイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）およびプローブ（Ｃｍ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）およびプローブ（Ｃｍ）を組み合わせて用いることで、一度の測定でヒト型結核菌およびＭＡＣを同定できることを示している。
【００６８】
〔実施例２：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定１〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００６９】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号２９、３０に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２９、３０と示す）を合成した。オリゴ２９はプローブ（Ｃｋ）オリゴ３０はプローブ（Ｃｔ）である。オリゴ２９は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、かつ３’末端がリン酸化されている。オリゴ３０は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００７０】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７１】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） １００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００７２】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００７３】
（４）結果
図６は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３０、１７、２９はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブは全て同じプライマーを用いて伸長させた伸長産物とハイブリダイズすることになる。図６より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６８℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６３℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には５９℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００７４】
〔実施例３：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定２〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００７５】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号３１に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ３１と示す）を合成した。オリゴ３１はプローブ（Ｃｔ）である。オリゴ３１は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００７６】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７７】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３１（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００７８】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００７９】
（４）結果
図７は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３１はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ１７、２９はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｔ）は、プローブ（Ｃｍ）および（Ｃｋ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図７より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６６℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６３℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には５９℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００８０】
〔実施例４：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定３〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８１】
（２）プライマーの合成
実施例１と同様の方法にて、配列番号３２、３３に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ３２、３３と示す）を合成した。オリゴ３２はプローブ（Ｃｍ）であり、オリゴ３３はプローブ（Ｃｋ）である。オリゴ３２は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。オリゴ３３は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され３’末端がリン酸化されている。
【００８２】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００８３】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ３２（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１６０ｎＭ、
オリゴ３３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００８４】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００８５】
（４）結果
図８は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３２はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３０、３３はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｍ）は、プローブ（Ｃｔ）および（Ｃｋ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図８より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６８℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６０℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には６３℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００８６】
〔実施例５：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定４〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８７】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００８８】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ５００ｎＭ、
オリゴ１５ ５００ｎＭ、
オリゴ３１（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１００ｎＭ、
オリゴ３２（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）１６０ｎＭ、
オリゴ３３（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化）３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００８９】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００９０】
（３）結果
図９は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。プライマー（Ａ）として用いたオリゴ１４の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３１、３２はハイブリダイズし、プライマー（Ｂ）として用いたオリゴ１５の伸長産物に対して、標識プローブであるオリゴ３３はハイブリダイズする。つまり検出に用いる３種類の標識プローブのうち、プローブ（Ｃｋ）は、プローブ（Ｃｔ）および（Ｃｍ）とは「異なるプライマーを用いて伸長させた伸長産物」とハイブリダイズすることになる。図９より明らかなように、ヒト型結核菌（ＭＴ）試料とした場合に６６℃に明瞭なピークが観察され、またトリ型結核菌（ＭＡ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、すなわちＭＡＣのＤＮＡを試料とした場合に６０℃に明瞭なピークが観察され、さらにマイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合には６３℃にピークが観察された。ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫのそれぞれに特異的な検出ピークが観察された。陰性コントロール（ＮＣ）はピークが得られなかった。これは、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（Ｃｔ）、プローブ（Ｃｍ）およびプローブ（Ｃｋ）の三種類のプローブを組み合わせて用いることで、一度の測定で抗酸菌の中で臨床診断上特に重要となるヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイを一度に同定できることを示している。
【００９１】
〔実施例６：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いた抗酸菌属からのヒト型結核菌、ＭＡＣおよびマイコバクテリウム・カンサシイの同定〕
（１）試料の調製
３６種類の抗酸菌属細菌をそれぞれマクファランドＮｏ．１の濃度となるようにＴＥバッファーに懸濁し、ＡＭＲ社製ＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ用ビーズ充填チューブに入れた。チューブを９５℃１０分間加熱し、ボルテックスにより５分間菌体破砕処理を行った。その後破砕処理後の液を１００倍希釈して菌体破砕液とし、これを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００９２】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
３６種類の抗酸菌属細菌菌体破砕液および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００９３】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１４ ２５０ｎＭ、
オリゴ１５ １５００ｎＭ、
オリゴ３０（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） １００ｎＭ、
オリゴ１７（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化） ８０ｎＭ、
オリゴ２９（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識、３’末端をリン酸化） ３００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００９４】
核酸増幅増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６２℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００９５】
（３）結果
表２に３６種類の抗酸菌属細菌の検出結果を示す。検出欄への数値の記載は検出可能な菌種であることを示す。例えば「６８」は６８℃に検出ピークが見られることを示している。５５℃以上においてピークが検出できない菌種は「−」と記載する。オリゴ３０（Ｃｔ）、オリゴ１７（Ｃｍ）およびオリゴ２９（Ｃｋ）の組み合わせで検出可能な菌種は、図６で特異的な検出ピークが得られているＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫである。実施例２の結果と同様にＭＴの菌体破砕液を試料とした場合には６８℃、ＭＡＣの菌体破砕液を試料とした場合には６３℃、ＭＫの菌体破砕液を試料とした場合には５９℃の検出ピークが観察された。しかし、ＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫ以外の抗酸菌種３２種類の菌体破砕液を試料とした場合では陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、オリゴ３０（Ｃｔ）、オリゴ１７（Ｃｍ）およびオリゴ２９（Ｃｋ）を組み合わせることによって、臨床上重要であるＭＴ、ＭＡＣ、ＭＫの三種を特異的に検出でき、かつ三種を１つの試薬により明確に同定できることを示している。
【００９６】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明によれば、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、従来技術では困難であった、複数の抗酸菌属細菌の検出または菌種同定を単一の種類の蛍光色素により達成できるものである。それゆえ、単一種類の蛍光だけを検出する安価なシステムにて、コンタミネーションによる誤判定の危険を冒すことなく、抗酸菌属細菌を検出または菌種同定することができるという効果を奏するため、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を示す図である。
【図２】融解曲線解析の原理を模式的に示す図である。
【図３】本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示す図である。
【図４】実施例１の結果を示す図である。
【図５】本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において領域Ｃ、領域Ｄおよび領域Ｅを示す図である。
【図６】実施例２の結果を示す図である。
【図７】実施例３の結果を示す図である。
【図８】実施例４の結果を示す図である。
【図９】実施例５の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
【請求項３】
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値が、互いに３℃以上異なることを特徴とする請求項２に記載の菌種同定方法。
【請求項４】
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さが、互いに１塩基以上異なることを特徴とする請求項２または３に記載の菌種同定方法。
【請求項５】
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項６】
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項７】
複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項８】
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする請求項７に記載の菌種同定方法。
【請求項９】
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする請求項７に記載の菌種同定方法。
【請求項１０】
少なくとも以下の（１）〜（４）を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、
（２）配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）、
（３）配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）、
（４）プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）およびオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）。
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち、少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）と、該プライマー（Ａ）の伸長産物の一部と相補的な少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）と、を用いて配列番号１〜６のいずれかに示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅する第一工程、
（２）第一工程で得られうるプライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｔ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｍ）を形成せしめ、
該プライマー（Ａ）または（Ｂ）の伸長産物と、配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別する第三工程。
【請求項３】
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）のＴｍ値が、互いに３℃以上異なることを特徴とする請求項２に記載の菌種同定方法。
【請求項４】
プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の長さが、互いに１塩基以上異なることを特徴とする請求項２または３に記載の菌種同定方法。
【請求項５】
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項６】
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項７】
複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）から発せられる蛍光を測定しながら、連続的な温度上昇または下降を伴う融解曲線解析を行い、該複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）のうち、どの複合体が形成したかを判別することを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の菌種同定方法。
【請求項８】
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする請求項７に記載の菌種同定方法。
【請求項９】
融解曲線解析を行う際の複合体（Ｐｔ）、（Ｐｍ）、または（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする請求項７に記載の菌種同定方法。
【請求項１０】
少なくとも以下の（１）〜（４）を含むことを特徴とする抗酸菌属細菌の菌種同定方法。
（１）配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）、
（２）配列番号３または４に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｍ）、
（３）配列番号５または６に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を含有する少なくとも１種類の検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）、
（４）プローブ（Ｃｔ）、（Ｃｍ）、および（Ｃｋ）の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列と９０％以上一致する核酸配列を含む核酸断片を増幅することが可能なオリゴヌクレオチドプライマー（Ａ）およびオリゴヌクレオチドプライマー（Ｂ）。
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開２００９−３９１０６（Ｐ２００９−３９１０６Ａ）
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８０１２８（Ｐ２００８−１８０１２８）
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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