抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体
本発明は、抗癌胎児性抗原の抗体、ＦＣペプチドリンカー、抗ヒトＣＤ３抗体、ＨＳＡペプチドリンカー及び抗ヒトＣＤ２８抗体を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成することを特徴とする単鎖の三重特異性抗体に関する。具体的には、本発明は、抗ＣＥＡ、ＣＤ３、ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる単鎖の三重特異性抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂに関する。この抗体は、３つの抗体断片（抗ヒトＣＥＡ単鎖抗体、抗ＣＤ３単鎖及び抗ＣＤ２８単区域抗体）を、２つのペプチドリンカー（ＦＣペプチドリンカー、ＨＳＡペプチドリンカー）を介して、順序的に連接して構築され、また、この抗体のＣ−末端にはｃ−ｍｙｃ−ｔａｇ及びｈｉｓ−ｔａｇ（（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ）を添加することができる。本発明は、更にこの抗体の構築、発現及び精製方法、この抗体をコードするＤＮＡ配列、発現ベタター及びこのベクターを含む宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換え抗体に関する。具体的には、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体、この抗体の構築、発現及び精製方法、この抗体遺伝子を含むベクター及びエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体におけるＴ細胞の活性化は、以下のダブルシグナル伝達経路において必要である。すなわち、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ）の表面のＭＨＣ／抗原ペプチド複合体とＴ細胞により発現されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体とが相互作用して、第１シグナルを産生する伝達経路を形成し、また、ＡＰＣ細胞表面の副刺激因子シグナル分子受容体（例えば、Ｂ７）とＴ細胞表面の副刺激因子シグナル分子（例えば、ＣＤ２８）とが相互作用して、第２シグナルを産生する伝達経路、つまり補助シグナル伝達経路を形成する。通常、第１シグナルだけでは、Ｔ細胞を十分に活性化することができない（Ｂａｘｔｅｒ＆Ｈｏｄｇｋｉｎ，２００２；Ｂｅｍａｒｄｅｔａｌ．，２００２）。
【０００３】
Ｔ細胞は、主に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）及びヘルパーＴ細胞（ＴＨ：Ｔ ｈｅｌｐ ｃｅｌｌｓ）という二種類を含んでいる。その中でも、ＣＴＬ細胞は、細胞性免疫における主要な効果細胞であり、また、ＴＨ細胞は、細胞から分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）により、直接的には、細胞と相互的に作用して、ＣＴＬ細胞の活性を制御し、間接的には細胞性免疫に参加する。腫瘍免疫においては、細胞性免疫は主要な免疫となるので、特異的に活性化されたＣＴＬ細胞を目的として、抗腫瘍薬物を設計することは、腫瘍免疫治療において重要な方法になっている（Ｆｏｓｓ，２００２）。
【０００４】
最近では、Ｔ細胞を活性化する第１シグナル経路に対して、一系列の遺伝子組み換えによる腫瘍抗ＣＤ３に対する二重特異性抗体を設計、構築しており、その−部は臨床実験の段階に入っている（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｍａｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｉｎ Ｆａｎｇ，２００３；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。現在知られている実験データから明らかなように、この二重特異性抗体は、特異的に腫瘍細胞を識別することができるＴ細胞を活性化させ、間接的かつ特異的に腫瘍細胞を殺傷する。しかし、上記の二重特異性抗体には、第１シグナル伝達経路だけが存在するので、Ｔ細胞を完全には活性化させることができない上、Ｔ細胞の活性化誘導による細胞死（ＡＩＣＤ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）が発生するため、腫瘍細胞に対する殺傷効果を低下させることがあった（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０００５】
この二重特異性抗体の欠点を克服するために、他の二重特異性抗体の抗腫瘍抗ＣＤ２８二重特異性抗体が設計、構築された。Ｔ細胞の活性化のために、それを抗腫瘍抗ＣＤ３二重特異性抗体と合用することにより、完全なダブルシグナル経路が提供された（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。この実験では、上記のようにして、広い範囲において腫瘍細胞の殺傷効率が向上した。しかし、二種類の二重特異性抗体を合用する方式では、その応用分野において一系列的な不利益も伴うことがある。例えば、発現と精製の操作工程及び生産においてコスト高となり、臨床試験に応用する際には、この二種類の二重特異性抗体の相対比率等を考慮しなければならない。一方、三種類の抗原（腫瘍抗原ＣＤ３、ＴＣＲ又はＣＤ２８）に対する三重特異性抗体（ＴｓＡｂ：ｔｒｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）分子を構築すると、この三重特異性抗体分子は、上記の二種類の二重特異性抗体の特性を有するようになる。また、この三重特異性抗体分子は、発現、精製及び臨床といった応用分野において、特に優れた応用性を実現した。
【０００６】
三重特異性抗体には、以下の三種類がある。（１）化学共役類（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｆｒｅｎｃｈ，１９９８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２，０００）、（２）遺伝子工程ポリマ類（Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｏｌｅｚａｌ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）、（３）遺伝子工程単鎖コンフューズ分子類（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。上記のうち、三番目の三重特異性抗体の構築方式が、簡単に単一の発現産物を得られ、精製が容易であるので、最も優れている。
【０００７】
この方式において、本願発明者らは、遺伝子組み換え工程による抗卵巣癌、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｚｈａｎｇｅｔ ａｌ．，２００３）を構築することに成功し、しかも、この抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗卵巣癌細胞において特異的な殺傷作用を与えることが既に証明されている。癌胎児性抗原−ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）は、幅広い腫瘍相関を有する抗原である（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｇａｎｊｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｋａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そのため、糸状な単鎖の三重特異性抗体（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）を構築することにより、このような抗体を用いて、複数の腫瘍の予防及び治療に応用することができるようになる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、幅広い腫瘍相関を有する抗原であるＣＥＡを三重特異性抗体の構築に導入し、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体ＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築することにより、三重特異性抗体の腫瘍細胞に対する特異性標識を確立した。この三重特異性抗体は、一方では、三重特異性抗体を腫瘍細胞と生体の正常細胞とを区別させて、可能な限り非特異的な殺傷反応を回避し、他方では、ＣＥＡは幅広い腫瘍相関抗原であるので、複数の腫瘍の免疫治療分野に広く応用することができる。
【０００９】
そこで、本発明は、複数の腫瘍を治療するための抗ＣＥＡ、抗ＣＤ及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換え工程による糸状な単鎖の三重特異性抗体を提供する。
【００１０】
また、本発明は、この三重特異性抗体を構築する方法を提供する。
【００１１】
本発明に開示されたマウス由来の抗ＣＥＡの単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下のようにした。
【００１２】
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＤＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＲＴＤＹＮＥＲＦＫＧＫＡＴＦＴＧＤＶＳＳＮＴＡＹＭＫＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＧＴＴＰＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＴＳＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＳＲＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＴＡＹＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【００１３】
本発明に開示されたマウス由来の抗ＣＤ３の単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列は、以下のようにした。
【００１４】
ＥＶＫＬＶＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＳＶＴＶＳＳＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
【００１５】
本発明に開示されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下のようにした。
【００１６】
１ ＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡ
５１ ＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡ
１０１ ＧＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡ
１５１ ＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧ
２０１ ＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＴ
２５１ ＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣ
３０１ ＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣ
３５１ ＣＧＴＴＴＣＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＧ
４０１ ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ
４５１ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧ
５０１ ＣＣＧＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
５５１ ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣ
６０１ ＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣ
６５１ ＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴ
７０１ ＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣ
７５１ ＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＧＴＣＣＴ
８０１ ＣＡＣＣＧＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡ
８５１ ＧＴＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡ
９０１ ＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡ
９５１ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧ
１００１ ＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧ
１０５１ ＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡ
１１０１ ＡＣＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴ
１１５１ ＣＧＧＧＧＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡ
１２０１ ＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧ
１２５１ ＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡ
１３０１ ＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ
１３５１ ＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡ
１４０１ ＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧ
１４５１ ＴＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣ
１５０１ ＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧ
１５５１ ＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣ
１６０１ ＧＣＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡ
１６５１ ＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡ
１７０１ ＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ
１７５１ ＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧ
１８０１ ＧＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＣ
１８５１ ＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＧＴＧＴＡＡＣＣＴ
１９０１ ＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴ
１９５１ ＴＣＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＣＴＡ
２００１ ＴＴＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴ
２０５１ ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡ
２１０１ ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡ
【００１７】
本発明に開示されたＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、以下のようにした。
【００１８】
ＭＧＬＥＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＤＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＲＴＤＹＮＥＲＦＫＧＫＡＴＦＴＧＤＶＳＳＮＴＡＹＭＫＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＧＴＴＰＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＴＳＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＳＲＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＴＡＹＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＥＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＳＴＥＶＫＬＶＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＳＶＴＶＳＳＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＬＫＲＡＶＤＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＰＶＥＶＳＨＭＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＣＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＥＱ
【００１９】
本発明は、この抗体を発現するためのベクターＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを提供することを目的とする。
【００２０】
また、本発明は、低温誘導により、三重特異性抗体の胞内に可溶性発現を促進する方法を提供することを目的とする。
【００２１】
更に、本発明は、ＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂を使用して、この三重特異性抗体を精製する方法を提供することを目的とする。
【００２２】
なお、本発明は、特に、以下の実施例において公開された本発明の内容を基礎として、本発明の優れた点を、当業者が容易に実現できるようにすることを目的とする。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
以下の説明において使用される用語は、特に説明がなければ、当業者において通常に理解される意味で用いられる。特に、以下の用語は、次の通りの意味で用いられる。
【００２４】
本発明において、構築された遺伝子組み換えによる単鎖の三重特異性抗体は、遺伝子組み換え方法により構築され、また、３種類の抗原の結合特異性を有する単一の抗体分子である。具体的には、本発明において開示された抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体は、３種類の抗体の断片を２種類のペプチドリンカー（ＦＣペプチドリンカー及びＨＳＡ／ペプチドリンカー）（Ｍｉｎ Ｆａｎｇ，２００３）を介して、順序的に連接され、単一分子である三重特異性抗体として作製された。この抗体のＣ−末端には、ｃ−ｍｙｃ及び（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（Ｈｅｎｇｅｎ，１９９５；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を添加することができ、このｔａｇは、活性の検出と抗体の精製に有用であるが、不添加であってもよい。３種類の抗体の断片は、単鎖の抗体の断片（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）としてもよいし、抗体のＦａｂ断片としても、又は、単区域抗体の断片（ＶＨ及びＶＬ）としてもよい。更に具体的には、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、抗ＣＥＡｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２８ＶＨを、ＦＣペプチドリンカー及びＨＳＡペプチドリンカーにより、順序的に連接し、その後で、Ｃ−末端にｃ−ｍｙｃ−ｔａｇ及び（Ｈｉｓ）６−ｔａｇを添加した。この抗体は、以下の優れた点がある。
【００２５】
（１）Ｔ細胞の活性化に対して、ダブルシグナル伝達が必要であるという理論に基づいて構築されており、Ｔ細胞を完全に活性化させることができる。
【００２６】
（２）幅広い相関を持つ抗原であるＣＥＡを識別することができ、ＣＴＬ細胞に対する特異性がある複数の腫瘍細胞を殺傷して、複数の腫瘍細胞を治療する応用が可能である。
【００２７】
本発明において、低温誘導とは、三重特異性抗体の胞内可溶性の発現を促進する方法であって、０．４ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）により、３０℃で、大腸菌における三重特異性抗体の発現を誘導することを指す。この方法では、広い範囲に亘って包封体の形成を低下させることができ、胞内可溶性が発現された三重特異性抗体の割合（全三重特異性抗体における割合）が、５０％以上に達する。この方法により得られた発現産物は、変性や複製を伴わず、直接的に精製され、生産効率の向上及び材料の節約に寄与する。
【００２８】
本発明では、ＤＥＡＥアニオン交換樹脂を採用して、三重特異性抗体を溶出して、最適ｐＨ（ｐＨ８．０）で精製を行なった。上記の胞内可溶性の発現産物を、一度ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィにかけると、殆ど全ての雑蛋白質はＤＥＡＥカラムに付着し、一方、大部分の三重特異性抗体は溶出液と共に流出する。得られた三重特異性抗体の純度は、７５％以上に達した。
【００２９】
本発明の技術方法は、以下のようにした。
【００３０】
まず、特定のポリクローニングｓｉｔｅを有する中間ベクターであるｐＴＲＩを構築した。その後、既存の発現ベクターを用いて、ＰＣＲ法により、抗ＣＤ２８単区域抗体をコードするＤＮＡ断片であるＣＤ２８ＶＨを増幅した。同時に、両末端の制限酵素による切断ｓｉｔｅを、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩに取り替えて、既存のベクターを用いて、抗ＣＤ３単鎖抗体をコードするＤＮＡ断片を増幅すると共に、両末端の制限酵素による切断ｓｉｔｅを、ＳｃａＩ／ＳａｌＩに取り替えて、既存のベクターを用いてＣＥＡｓｃＦｖ（ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ）を切断した。最後に、一定の順序で、制限酵素による切断断片を連接し、形質転換反応により、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築した。
【００３１】
次に、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換した後、ＩＰＴＧを加えて低温誘導によってこれを発現させ、発現産物を超音波処理し、この上清成分に対して、ＤＥＡＥアニオン交換樹脂によるクロマトグラフィを行い、初歩的な精製を行った。続いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によりＣＥＡ−ＴｓＡｂ鈍化産物の抗原結合活性を測定し、また、ＦＩＴＣで標識したＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法により腫瘍細胞の結合特異性を検出した。更に、ＭＴＴ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物に含まれるＴ細胞が、ＣＥＡ腫瘍細胞に対する殺傷効果を有するかを検出した。また、倒立型顕微鏡により上記の殺傷過程における腫瘍細胞の形態変化を記録すると共に、ＭＴＴ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物がＴ細胞を介して、ＣＥＡを発現した腫瘍細胞を殺傷する過程において、Ｔ細胞の増殖状態を検出した。また、ＰＩ／Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖのダブル染色ＦＡＣＳにより、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物がＴ細胞を介して、ＣＥＡを発現した腫瘍細胞に対する殺傷効果を有するか、その細胞のアポトーシス誘導効果を検出する共に、蛍光顕微鏡により、上記の殺傷過程におけるアポトーシス形態又はネクローシス形態を記録した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の具体的な実施例について、図面を参照して説明する。なお、以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、いずれの実施例も、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
＜実施例１＞Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる三重特異性抗体の発現ベクターであるｐＴＲＩベクターを構築するためのポリクローニングＤＮＡ断片の連接
Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲのスケジュールは、図１の記載に基づいて行われる。Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲに使用された核酸断片は、以下のようにした。
【００３４】
１． ５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
２． ５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
３． ５’−ＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
４． ５’−ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
５． ５’−ＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＡＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
６． ５’−ＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
７． ５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
８． ５’−ＣＧＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
９． ５’−ＴＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
１０． ５’−ＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
１１． ５’−ＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
１２． ５’−ＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
【００３５】
操作工程は、以下のようにした。
【００３６】
（１）工程１：断片２−１１について、図１に示されたような反応条件において、プライマー無添加で、別々にアニーリングし、伸長を進める。得られた反応産物を回収せずに、次の反応を行った。
【００３７】
反応条件としては、各１μｌの断片に、２μｌのＰＣＲ用１０倍緩衝液、２μｌのｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）（大通宝生物技術会社製）、０．３μｌのＴａｑポリメラーゼ（１Ｕ）（大連宝生物技術会社製）及び１４μｌの水を加えた。
【００３８】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回繰り返した。
【００３９】
上記工程により、反応産物Ａ（断片２及び３をハイブリダイズ）、Ｂ（断片４及び５をハイブリダイズ）、Ｄ（断片８及び９をハイブリダイズ）及びＥ（断片１０及び１１をハイブリダイズ）が得られた。
【００４０】
（２）工程２；反応産物Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ｃ及びＤ、Ｄ及びＥを、図１に示すように、プライマー無添加で、別々にハイブリダイズして、伸長させた。いずれの反応産物も、１％アガロースゲル電気泳動により回収した。反応産物Ｉ（反応産物Ａ及びＢをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐであり、ＩＩ（反応産物Ｂ及びＣをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐ、ＩＩＩ（反応産物Ｃ及びＤをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐ、ＩＶ（反応産物Ｄ及びＥをハイブリダイズ）は約１００ｂｐであった。
【００４１】
上記の反応産物（Ｉ乃至ＩＶ）は、１０μｌの各反応産物（Ａ乃至Ｅ）について、他の反応成分を添加せず、以下の条件で反応を行うことにより得られた。
【００４２】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回繰り返した。
【００４３】
（３）工程３：反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを、図１に示されるように、以下の反応条件で、別々にアニーリングし、伸長させた。いずれの反応産物も、１％アガロースゲル電気泳動により回収した。反応産物ＵＰ（反応産物Ｉ及びＩＩをハイブリダイズ）は約３４０ｂｐであり、ＤＯＷＮ（反応産物ＩＩＩ及びＩＶをハイブリダイズ）が、約２６０ｂｐであった。
【００４４】
上記の反応産物（ＵＰ及びＤＯＷＮ）は、反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを各１μｌに対して、ＰＣＲ用１０倍緩衝液を２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）を２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（１Ｕ）を０．３μｌ、水を１３μｌ添加した。
【００４５】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。
【００４６】
（４）工程４；反応産物ＵＰとＤＯＷＮをハイブリダイズさせて、断片１及び１２をプライマーとし、Ｏｖｅｒｌａｐにより伸長させた。
【００４７】
本工程では、上記の反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮの各１μｌに対して、プライマーを各１μｌとし、ＰＣＲ用１０倍緩衝液を２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）を２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（１Ｕ）を０．３μｌ、水を１２μｌ添加した。
【００４８】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返し、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物を得た。
【００４９】
最後に、１％アガロースの電気泳動により、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物の大きさを測定し、その断片の大きさが、４３９ｂｐであり（図２参照）、上記の方法により、効果的にポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片をつなぎ合わせた。Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物において、ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片の核酸配列、制限酵素の切断位点及び構成については、図３に示す。
【００５０】
＜実施例２＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂの構築
具体的な構築工程を、図４に示す。また、この構築工程において用いられる各種類ベタターの概略を図５に示す。以下、具体的な構築工程を説明する。
【００５１】
（１）ベクターｐＴＲＩの構築
ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片及びｐＴＭＦ空ベクター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）について、同時に、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩダブル制限酵素による切断反応を行い、ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片の酵素による切断産物及びｐＴＭＦの酵素による切断断片を回収し、ＴＯＰ１０株へ形質転換し、陽性に形質転換されたクローニングのプラスミドを抽出し、ＰＣＲにより連接したプラスミドをｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００５２】
上記の酵素による切断反応、連接反応、細菌のコンピテントセルの作製及び形質転換反応の具体的な操作は、以下のようにした。
【００５３】
酵素による切断反応は、２０μｌのシステムを使用し、約１μｌのｐＴＭＦ空ベタター又はポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片について、夫々ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）ダブル酵素による切断反応を行った。酵素の用量、緩衝液及び反応条件は、その制限酵素の説明書の記載を参照した。酵素による切断産物は、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲル回収キット（上海華舜会社製）により、所定の大きさの断片が回収された。ｐＴＭＦ空ベクターの酵素による切断産物の大ききは、約５，０００ｂｐであり、ポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片の酵素による切断産物の大きさは、約４３０ｂｐであった。
【００５４】
連接反応は、５０−１００ｎｇの酵素により切断したｐＴＭＦベクターの断片及びベクターの３−１０倍の酵素により切断されたポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片に、２μｌの１０×Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ緩衝液、１ＵのＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（大連宝生物会社製）、ｄｄＨ２Ｏを添加し、全体積を２０μｌとし、１６℃でインキュべートし、一晩連接させた。
【００５５】
次に、大腸菌のコンピテントセルを作製した。ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社製）を、２ｍｌのＬＢ培地（（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＧＩＢＣＯ会社製）、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＧＩＢＣＯ会社製）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５））に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。ここでは、１：１００の割合になるよう、２０−４０ｍｌの抗生物質無添加のＬＢ培地に接種した。高速で振とうし、Ａ６００が０．３−０．４（約２．５時間）になるまで培養した。次に、アイス浴を１５分間行った。更に４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、菌体を収集して、上清成分を捨て、１０ｍｌの予冷した０．１ｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ会社製）を添加し、ソフトに菌体を懸濁してミクスチャーを行い、２０分間アイス浴を行った。４℃、４，０００ｒｐｍで遠心分離を１０分間行い、１−２ｍｌの予冷した１２％グリセリンを含む０．１ｍｏｌ／ｍｌ ＣａＣｌ２を添加し、ソフトに菌体を懸濁して、２００μｌを夫々チューブに入れて、−８０℃で保存し、これを備用した。
【００５６】
連接産物の形質転換は、２００μｌのコンピテントセルへ、上記の連接混合物１μｌを添加し、ミクスチャーした後、アイス浴を３０分間行い、４２℃で１００秒間の熱刺激し、その後、急速に２分間のアイス浴に置いた。アイス浴した混合物には、０．８ｍｌのＬＢ培地を添加し、３７℃で、ソフトに４５分間を揺動させる（＜１５０ｒｐｍ）又は静置により回復させた。１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、５０〜１００μｌのＬＢ培地を添加し、沈殿を懸濁し、ＬＢ−Ｋ培地（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／ｌを寒天（ＳＩＧＭＡ会社製）に塗布し、カナマイシン（（ＳＩＧＭＡ会社製）ｐＨ７．５）５０μｇ／ｍｌを添加して、３７℃で一晩培養した。
【００５７】
陽性の組み換えクローンのスクリーン及びその判定は、以下のようにして行った。まず、カナマイシンによる陽性の連接産物のモノクローンを選択し、２ｍｌのＬＢ−Ｋ培地（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン（（ＳＩＧＭＡ会社製）ｐＨ７．５））に接種し、３７℃で一晩培養した後、プラスミド抽出キット（上海華舜会社製）の説明書の記載を参照してプラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐＴＲＩと名付けた。そして、以下の方法に従って、ＰＣＲ判定を行った。
【００５８】
ＰＣＲ判定は、２０μｌの増幅システムに、０．１−１μｌのプラスミドＤＮＡ（約２０〜２００ｎｇ）を添加し、上流側プライマー（Ｔ７−ｕｐ： ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及び下流側プライマー（Ｔ７−ｄｏｗｎ： ５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を別々に１０ｐｍｏｌとし、２μｌの１０×Ｔａｑ酵素緩衝液及び２μｌの２ｍｍｏｌ／ｍｌのｄＮＴＰｓ、１ＵのＴａｑ酵素、水を添加して、全体積を２０μｌとした。具体的な反応工程としては、９４℃で５分間の予備変性を行った後、９４℃で４０秒間の変性を行い、５３℃で４０秒間アニーリングして、７２℃で４０秒間伸長させる工程を２５回繰り返し、５μｌのＰＣＲ産物を採取して、１％アガロースゲル電気泳動による検出を行った。その結果、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさは約５００ｂｐであった。
【００５９】
（２）ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの構築
ＰＣＲ法でプラスミドＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＭＦ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）により、抗ＣＤ２８ＶＨのＤＮＡ断片を増幅し、使用された上流側プライマー（Ｐ１： ５’−ＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）及び下流側プライマー（Ｐ２； ５’−ＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＴＡＣＣＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の５’末端には、夫々に制限酵素の切断位点であるＮｄｅＩとＮｈｅＩがあるので、ＰＣＲ産物の両末端も、これら２つの新しい制限酵素の切断位点を持つようになった。
【００６０】
ＰＣＲ反応混合物の構成は、各プライマーに対して、２μｌのｄＮＴＰｓ（各種類２ｍｏｌ／ｍｌを含む）、２μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌのプラスミドＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＭＦ（約１００ｎｇ）、０．３μｌのＰｆｕ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）、ｄｄＨ２Ｏを補充し、全量を２０μｌとした。ＰＣＲ反応の条件は、以下のようにした。９４℃で３分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。ＰＣＲ産物の大きさは、約５００ｂｐであった。１％アガロースゲル電気泳動の後に、ゲル回収キット（上海華舜会社製）で、約３５０ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。
【００６１】
このＰＣＲ産物とベクターｐＴＲＩについて、ＮｄｅＩ／ＮｈｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）のダブル酵素による切断反応が行われた。具体的な酵素による切断反応条件は、酵素の提供者の説明書の記載を参照し、ゲル回収キットによるＰＣＲ産物の酵素による切断産物（約３５０ｂｐ）とｐＴＲＩの酵素による切断大断片の産物（約５３００ｂｐ）とを連接し、形質転換した。その詳しい反応過程は、上記の工程（１）に準じる。その後、カナマシン耐性陽性クローンを抽出し、ＰＣＲよる判定を行った。判定方法は、上記の工程（１）に準じる。その結果は、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさが７５０ｂｐ程度となったクロニーグは、正しく連接されたのであり、それをＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００６２】
（３）ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲｌの構築
ＰＣＲ法でプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ（▲喜富，粛颯，▼征，等．抗ヒトＣＤ３、単▲抗体与改型単域抗体的表迭．中国科学（Ｃ▼），１９９６，２６（５）：４２８〜４３５））により、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＤＮＡ断片を増幅し、上流側プライマー（Ｐ１； ５’−ＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）及び下流側プライマー（Ｐ２： ５’−ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の５’末端には、夫々制限酵素による切断位点であるＳｃａＩとＳａｌＩがあるので、ＰＣＲ産物の両末端にも、２つの新しい制限酵素による切断位点を持つようになった。
【００６３】
ＰＣＲ反応混合物の構成は、１μｌの各プライマー、２μｌのｄＮＴＰｓ（各種類２ｍｍｏｌ／ｍｌを含む）、２μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌのプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ（約１００ｎｇ）、０．３μｌのＰｆｕ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）、ｄｄＨ２Ｏを補充し、全体積を２０μｌとした。ＰＣＲ反応の条件は、以下のようにした。９４℃で３分間予変性した後、９４℃で３０秒間の変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回線り返した。１％アガロースゲル電気泳動の後に、ゲル回収キット（上海華舜会社製）で、約７５０ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。
【００６４】
このＰＣＲ産物とベクターＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩについて、ＳｃａＩ／ＳａｌＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）ダブル酵素による切断反応を行った。具体的な酵素による切断反応条件は、酵素の供給元の説明書の記載を参照し、ゲル回収キットによるＰＣＲ産物の酵素による切断産物（７５０ｂｐ程度）とＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの酵素による切断大断片の産物（約５７００ｂｐ程度）とを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。その詳しい反応過程は、上記の工程（１）に準じる。その後、カナマシン耐性陽性クローンを選択し、ＰＣＲ判定を行った。このＰＣＲ判定の方法は、上記の工程（１）に準じる。その判定結果は、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさが１４００ｂｐ程度であるクローンが正しく連接したものであり、陽性が現れるているクローンを保留し、プラスミドを抽出し、それをＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００６５】
（４）ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの構築
Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲにより抗ＣＥＡ単鎖抗体を構築した。抗ＣＥＡモノクローン抗体の重鎖と軽鎖の可変区のアミノ酸配列（Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）とをポリペプチド配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で連接し、抗ＣＥＡ単鎖抗体として設計した。その後、大腸菌の偏好なコドン表（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２，０００）に基づいて、ＤＮＡ配列をトランスレーションし、相補的な核酸塩基配列に分けて（以下の配列番号１−２２に示される）、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲにより、抗ＣＥＡ単鎖抗体ＤＮＡ断片の全長をつなぎ合わせた。以下、抗ＣＥＡ単鎖抗体の全遺伝子断片の核酸断片である。
【００６６】
１． ５’−ＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
２． ５’−ＴＣＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
３． ５’−ＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
４． ５’−ＣＡＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
５． ５’−ＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
６． ５’−ＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
７． ５’−ＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
８． ５’−ＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＴＡＣＧＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
９． ５’−ＴＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
１０． ５’−ＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＰＣＧＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
１１． ５’−ＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
１２． ５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）
１３． ５’−ＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）
１４． ５’−ＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
１５． ５’−ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
１６． ５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＩＡＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
１７． ５’−ＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）
１８． ５’−ＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
１９． ５’−ＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
２０． ５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＣＧＧＴＡＴＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
２１． ５’−ＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）
２２． ５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）
ｓ１） ５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）
ｓ１７） ５’−ＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）
ｓ１６） ５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）
ｓ１３） ５’−ＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）
ｓ１２） ５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）
ｓ７） ５’−ＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）
ｓ６） ５’−ＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）
【００６７】
（ｉ）工程１：プライマー無添加で、断片１−２２を別々に、ハイブリダイズして伸長させ、反応産物は回収せず、そのまま、次の反応を行った。１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の反応に使用された各断片に対して、ＰＣＲ用×１０緩衝液を２μｌ、２μｌのｎｏｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）（大通宝生物技術会社製、以下同じ）、０．３μｌのＴａｑポリメラーゼ（１Ｕ）（大連宝生物技術会社製、以下同じ）、１４μｌの水を添加した。９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回線り返した。
【００６８】
上記工程により、反応産物Ａ（断片１及び２をハイブリダイズ）、Ｂ（断片３及び４をハイブリダイズ）、Ｃ（断片５及び６をハイブリダイズ）、Ｄ（断片７及び８をハイブリダイズ）、Ｅ（断片９及び１０をハイブリダイズ）、Ｆ（断片１１及び１２をハイブリダイズ）、Ｇ（断片１３及び１４をハイブリダイズ）、Ｈ（断片１５及び１６をハイブリダイズ）、Ｉ（断片１７及び１８をハイブリダイズ）、Ｊ（断片１９及び２０をハイブリダイズ）、Ｋ（断片２１及び２２をハイブリダイズ）を得た。
【００６９】
（ｉｉ）工程２：プライマー無添加で、Ｏｖｅｒｌａｐにより反応産物ＡとＢ、ＤとＥ、ＧとＨ、ＪとＫを別々にハイブリダイズして伸長させた。各物質の１０μｌ（１０ｐｍｏｌ）について、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒伸長させる工程を１０回繰り返した。また、１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットで反応産物を回収した。この工程では、反応産物ａ（反応産物Ａ及びＢをハイブリダイズ）、ｂ（反応産物Ｃに対応）、ｃ（反応産物Ｄ及びＥをハイブリダイズ）、ｄ（反応産物Ｆに対応）、ｅ（反応産物Ｇ及びＨをハイブリダイズ）、ｆ（Ｉ）、ｇ（反応産物Ｊ及びＫをハイブリダイズ）が得られた。反応産物ａとｇの大きさは約１２０ｂｐであり、ｃ及びｅの大きさは約１７０ｂｐ、ｂ、ｄ及びｆの大ききは約１００ｂｐであった。
【００７０】
（ｉｉｉ）工程３：反応産物ａ及びｂ、ｃ及びｄ、ｆ及びｇを別々にハイブリダイズし、反応産物ｅは単独で使用して、各プライマーを添加し（ｓ１及びｓ６が反応産物ａ及びｂのハイブリダイズ体に対応し、ｓ７及びｓ１２が反応産物ｃ及びｄのハイブリダイズ体に対応し、ｓ１３及びｓ１６が反応産物ｅに対応し、ｓ１７及び２２が反応産物ｆ及びｇのハイブリダイズ体に対応する）、ＰＣＲにより増幅させた。１μｌの反応用の各物質（約１００ｎｇ）に対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰｓ（２ｍＭ ｅａｃｈ）、１μｌの各プライマー（１０ｐｍｏｌ）、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）を添加し、最終的に体積が２０μｌとなるよう水を補充した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットを使用し、反応産物Ｉ（反応産物ａ及びｂをハイブリダイズ）、ＩＩ（反応産物ｃ及びｄをハイブリダイズ）、ＩＩＩ（反応産物ｅに対応）及びＩＶ（反応産物ｆ及びｇをハイブリダイズ）を夫々回収した。反応産物Ｉの大きさが約２００ｂｐ、ＩＩの大きさが約２５０ｂｐ、ＩＩＩの大きさが約１４０ｂｐ、ＩＶの大きさが約２３０ｂｐであった。
【００７１】
（ｉｖ）工程４：反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを別々にハイブリダイズさせて、各プライマーを添加し（ｓ１及びｓ１２が反応産物Ｉ及びＩＩのハイブリダイズ体に対応し、Ｓ１３及び２２が反応産物ＩＩＩ及びＩＶのハイブリダイズ体に対応する）、ＰＣＲ増幅を進めた。１μｌの反応用の各物質（約１００ｎｇ）に対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭｅａｃｈ）、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の各プライマー、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）、１２μｌの水を添加した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。得られた反応産物ＵＰ（反応産物Ｉ及びＩＩをハイブリダイズ）及びＤＯＷＮ（反応産物ＩＩＩ及びＩＶをハイブリダイズ）を１％アガロースゲル電気泳動のより、ゲル回収キットで、回収した。反応産物ＵＰの大きさは約４３０ｂｐ、ＤＯＷＮの大きさが約３４０ｂｐであった。
【００７２】
（ｖ）工程５：反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮをハイブリダイズさせて、プライマー（断片ｓ１及び断片２２）を添加し、ＰＣＲ増幅した。各１μｌ（約１００ｎｇ）の反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮに、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌｄＮＴＰ（２ｍＭ ｅａｃｈ）、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の各プライマー、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）、１２μｌの水を添加した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長させる工程を２５回繰り返した。得られた反応産物ＷＨＯＬＥ（約７５０ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットで、回収した。
【００７３】
上記の工程のステップを図７に示し、上記各工程により得られた反応産物のＰＣＲ検出を図８に示した。
【００７４】
また、上記の７５０ｂｐのＤＮＡ断片及びベクターｐＴＭＦに対して、共にＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）と呼ばれるダブル制限酵素による切断反応を行った。具体的な制限酵素による切断反応条件は、制限酵素の販売元が提供する説明書の記載を参照した。そして、ゲル回収キットにより、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断産物（７５０ｂｐ程度）及びｐＴＭＦの切断大断片産物（５２００ｂｐ程度）を回収し、これらを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。具体的な連接及び形質転換反応の過程は、工程（１）に準じる。その後、カナマシン抗性陽性クローンのプラスミドを抽出し、これをＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦと名付けた。
【００７５】
ＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ及びＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩに対して、共にＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）と呼ばれるダブル制限酵素による切断反応を行った。具体的な制限酵素による切断反応条件は、制限酵素の販売者が提供する説明書の記載を参照した。そして、７５０ｂｐ程度のＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦの小さい切断断片産物（抗ＣＥＡｓｃＦｖ）とＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの大きい切断断片産物（６，０００ｂｐ程度）とを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。具体的な連接及び形質転換反応の過程は、工程（１）に準じる。その後、カナマシン抗性陽性クローンのプラスミドを抽出し、ＰＣＲより判定した。ＰＣＲの判定方法は、工程（１）に準じる。判定した結果を図６に示した。ＰＣＲ産物の大きさは、２１００ｂｐ程度のクローンとなったものが正しく連接したプラスミドであり、それをＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩと名付けた。
【００７６】
＜実施例３＞低温誘導によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの胞内可溶性発現
（１）ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ会社製）への形質転換
実施例２のコンピテントセルの作製方法に従って、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル細胞を作製した。プラスミド抽出キット（上海華舜会社製）の説明書に基づき、プラスミドＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを抽出し、実施例２の工程（１）に準じて形質転換実験を行い、実施例２の通りに判定を進めた。
【００７７】
（２）低温による発現誘導
ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを有するＢＬ２１（ＤＥ３）を含む細菌を、ＬＢ−Ｋ培地を用いて３７℃で一晩培養した後、モノクローンをとり、これを５ｍｌのＬＢ−Ｋ液体培地に移植して、大きいチューブを用いて３７℃で振とうし、一晩培養（２００ｒｐｍ／分）した。翌日、一晩培養したものを１／１００の割合に基づいて、２５０ｍｌのＬＢ−Ｋ液体の培地へ移植し、３７℃で振とう培養（２００ｒｐｍ／分）を続けて、Ａ６００が０．６に達したとき、ＩＰＴＧ（大連宝生物会社製）を添加して、最終濃度を０．４ｍｍｏｌ／ｍｌとし、３０℃で４時間培養を継続し、低温による発現を誘導した。その後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、菌体を採取し、１／５培養体積のＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、菌体の超音波破砕を行った。更に、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行った。遠心分離した上清成分は、胞内に可溶性発現のＣＥＡ−ＴｓＡｂを含み、遠心分離した沈殿成分は、封入体として発現したＣＥＡ−ＴｓＡｂを含む。遠心分離した沈殿成分を１／５培養体積のＰＢＳで懸濁した。「分子クローン実験指南（金冬雁、黎孟楓逢、１９９６、科学出版社）」の記載に基づき、未還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、上記の超音波処理産物の上清成分及び沈殿成分について、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの発現状況を検出し、数字図像分析器（アメリカ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ会社、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅ ２２００ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）により、胞内の可溶性発現と封入体の発現との相対割合を確定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図９に示す）及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ（図１０に示す）の結果は、上記の胞内の可溶性発現の方法により、胞内可溶性発現の割合が、７０％程度に達したことを示す。超音波処理産物の上清成分は、そのまま精製することで、次に説明する体外の活性実験に使用することができるので、変性及び複製の工程を少なくし、生産効率を向上させ、生産時間を低下させることができる。
【００７８】
＜実施例４＞ＤＥＡＥアニオン交換樹脂によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの精製
上記の２５０ｍｌの低温誘導された胞内可溶性の発現産物について、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を採集し、１／５体積（５０ｍｌ）のＤＥＡＥアニオン交換樹脂（ファマシア会社製）、平衡緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｍｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて懸濁し、超音波破砕した。その後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、遠心分離した上清成分をそのまま精製に使用した。
【００７９】
２０ｍｌのＤＥＡＥアニオン交換樹脂を１００ｍｌの平衡緩衝液で懸濁して、カラム（カラムの寸法：１６ｍｍ×２ｃｍ）（上海華舜会社製）に装填し、その後、５倍のカラム体積に相当する平衡緩衝液を流速１ｍｌ／分で流して平衡化した。そして、上記の超音波処理産物を遠心分離した上清成分をそのままカラムに置き、サンプル注入が流速０．２５ｍｌ／分となるようにして、流出した級分、すなわち精製されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを採集した後、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の溶出緩衝液（５００ｍｍｏｌ／ｍｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を流速０．２５ｍｌ／分で流して溶出させた。また、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の０．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨでカラムを洗浄し、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌを流速０．５ｍｌ／分で流してカラムを再生させ、最後に、２×カラム体積（４０ｍｌ）の平衡緩衝液を流速１ｍｌ／分で流してカラムを平衡化し、次の精製に使用した。もし、長時間、使用しないのであれば、細菌が生じないようにするため、４×カラム体積以上の２０％アルコールの水溶液をカラムに流した後、４℃で保存しなけらばならない。
【００８０】
上記の流出した級分をそのまま、未還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製の効果を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図１１に示す）は、ＤＥＡＥアニオン交換により精製を行い、超音波処理により上清成分の大部分の雑蛋白が除去されたことにより、数字図像分析器（アメリカ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ会社、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅ ２２００ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）の分析では、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの純度が７０％程度に達したことを示す。
【００８１】
上記の精製サンプルをＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整し、全量を１ｌとした）で一晩透析（４℃）した。透析の体積は５００ｍｌとし、６時間経過後に、一度、透析液を交換した。そして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により透析したサンプルについて蛋白定量を行った。この具体的な操作は、「精編分子生物学実験指南（顔子穎，王海林逢，金冬雁校，１９９９，科学出版社，）」を参照した。定量のサンプルに、防腐剤として、ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ会社製）を、最終濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるよう添加し、安定剤として、プレスリリース（中国科学院微生物研究所から購入）を最終濃度が０．１５ｍｏｌ／ｌとなるよう添加した。その後、１ｍｌごとに分注し、−８０℃で冷凍保存して備用した。
【００８２】
＜実施例５＞ＥＬＩＳＡ法よるＣＥＡ−ＴｓＡｂの抗原の結合活性の検出
Ｊｕｒｋａｔ細胞膜の抗原の作製：Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞株）（米国典型培養物保蔵中心（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入、番号はＴＩＢ−１５２）を約５×１０６個採集し、１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞の沈殿成分を０．５ｍｌのＰＢＳで懸濁し、超音波処理により破砕した。超音波処理した破砕液を、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、超音波処理した上清成分を保留し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により、蛋白濃度の定量を行った。その後、防腐剤として、ＮａＮ３を最終濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるよう添加し、安定剤として、プレスリリース（中国科学院微生物研究所から購入）を最終濃度が０．１５ｍｏｌ／ｌとなるよう添加した。その後、１００μｌごとに分注し、−８０℃で冷凍保存して備用した。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ法の操作工程を以下に説明する。
（１）コート：抗原濃度は、ＣＥＡを１μｇ／ｍｌ（Ｆｉｔｚｅｒａｌｄ会社製，ドイツ）とし、ＣＤ２８−ＦＣｃｈｉｍｅｒａを１μｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ会社製）とし、Ｊｕｒｋａｔ細胞膜抗原を１０μｇ／ｍｌとした。コート体積としては、１０μｌ／孔でコートした。コートの緩衝液の構成は、１．３６ｇのＮａ２ＣＯ３、７．３５ｇのＮａＨＣＯ３、９５０ｍｌの水、１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ又は１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨで、ｐＨ９．２に調整し、水を補加して１ｌとした。ＰＢＳにより３７℃で２時間のコート又は４℃で一晩のコートを行った。
【００８４】
（２）ブロッキング：ＰＢＳで１−２度洗浄した後、ブロッキング液であるＰＢＳＡ（ＰＢＳ−１％ ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ）を２００μｌ／孔で加えて、３７℃で１−２時間、ブロッキングした。
【００８５】
（３）サンプルの加入：ＰＢＳで３度洗浄した後、精製サンプルを加入し、１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。サンプルの使用法：１０μｇ／ｍｌの精製ＣＥＡ−ＴｓＡｂを起始濃度として、６段階に希釈して、段階毎に３孔を設立した。
【００８６】
（４）第１抗体の加入：ＰＢＳＴ（ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｖ／Ｖ））で３度洗浄した後、ブロッキング液により１／１，０００倍比となるように、抗ｃｍｙｃ−ｔａｇモノ抗体（９Ｅ１０、ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＴＺ会社から購入）を希釈して１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。
【００８７】
（５）第２抗体の添加：ＰＢＳＴで３度洗浄した後、ブロッキング液により１／１，０００倍比となるように、ＨＲＰ標識された羊抗マウスＩｇＧ（華美会社から購入）を希釈して１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。
【００８８】
（６）呈色：ＰＢＳＴで５度洗浄した後、呈色液（４８．６ｍｌの０．１Ｍクエン酸、５１．４ｍｌの０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４及び水を加入して全量１ｌとしたｐＨ５．０の基質緩衝液を製作し、１０ｍｌ基質緩衝液に４ｍｇのＯＰＤ（（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ会社製））と１５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２とを添加し、呈色液を製作した）を１００μ／孔とし、室温の避光条件下で１５−３０分間、呈色させた。
【００８９】
（７）停止反応：停止液（１ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）を添加して５０μｌ／孔とした。
【００９０】
（８）測定の結果：４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡ法の結果（図１２に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと二種類の純抗原（ＣＥＡ及びＣＤ２８）が特異的に結合することを示す。つまり、Ｊｕｒｋａｔは、多くのＣＤ３を発現するので、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ及びＣＤ３共に特異的に結合することを示す。
【００９２】
＜実施例６＞ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂと腫瘍細胞の結合活性の検出
間接ＦＡＣＳ法を用いて、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの各種腫瘍細胞に対する結合特異性を検出した。下記の表１は、使用された各種腫瘍細胞の腫瘍相関性及び由来を示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】
具体的な操作は、以下のようにした。
（１）上記の４種類の細胞を培養、採集し、ＳＷ１１１６細胞を除き、他の３種類の細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０液体培地（ＧＩＢＣＯ会社製）で、１０％ウシ胎児血清（黒尤江江海生物工程技木会社製）を添加して、５％ＣＯ２、３７℃の培養室で培養した。ＳＷ１１１６細胞の培養は、Ｌ１５液体培地（ＧＩＢＣＯ会社製）で、１０％新生仔ウシ血清血清（黒尤江江海生物工程技木会社製）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の培養室で培養した培養した。細胞が対数期になるまで増殖させた後、種類毎の細胞を５×１０５個採集した。
【００９５】
（２）上記の各細胞を１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、更に１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１０μｇ／ｍｌＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間を静置した。種類毎の細胞について抗体無添加の同型コントロールを作製した。以下の各工程において、このコントロールに対しても試料サンプルと同じ操作が行われた。
【００９６】
（３）１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１／１０００希釈した抗ｃｍｙｃ−ｔａｇ抗体（９Ｅ１０、ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＴＺ会社製）のＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間を静置し続けた。
【００９７】
（４）１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を、１００μｌの１／１０００希釈したＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ羊抗マウスＩｇＧ（ＢＤ会社製）のＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間、放置し続けた。
【００９８】
（５）励起光を４８８ｎｍとするフローサイトメトリー（ＢＤ会社、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）検出により、毎度に１０，０００個の細胞を採集した。
【００９９】
上記の実験結果（図１３に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと各種類の腫瘍細胞との結合能力が異なるので、ＳＫＯＶ３、ＳＷ１１１６に対しては強く結合し、Ａ５４９に対しては弱く結合し、ＭＣＦ−７に対しては結合しないことを示す。
【０１００】
＜実施例７＞ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＪｕｒｋａｔ細胞との結合活性の検出
直接的ＦＡＣＳ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（北京市血液センターから購入）とＪｕｒｋａｔ細胞との結合活性を検出した。具体的な実験操作は、以下のようにした。
【０１０１】
（１）ＣＥＡ−ＴｓＡｂを蛍光素ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ会社製）で標識した。蛍光標識法は、「現代免疫学実験技術（沈▲心 周汝麟 主編、湖北科学技術出版社出版）」の記載を参照した。
【０１０２】
（２）Ｆｉｃｏｌ法により、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を採集し、これを１０％の新生仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に加え、ガラスの細胞培養バドルヘ移入し、３７℃で一晩置いて、ミクロファージ細胞等の粘附細胞を除去した。未附着の細胞（主にはＴ細胞）を計数した後、これらの５×１０５個細胞を採集し、ＦＡＣＳ法による検測に使用した。Ｆｉｃｏｌ法は、「現代免疫学実験技術（沈▲心 周汝麟 主編、湖北科学技術出版社出版」のに記載に基づいて操作した。
【０１０３】
（３）１０％新生仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室において、二種類の細胞を培養した。細胞が対数期に達した後、５×１０５個の細胞を採集し、ＦＡＣＳ法に使用した。
【０１０４】
（４）上記の二種類の細胞を１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、更に１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣで標識されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間、放置した。種類毎の細胞について抗体無添加の同型コントロールを作製し、以下の各工程は、このコントロールについても、試料サンプルと同じ操作を行った。
【０１０５】
（５）励起光を４８８ｎｍとするフローサイトメトリー（ＢＤ会社、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）により、夫々１０，０００個の細胞を測定した。
【０１０６】
上記の実験結果（図１４に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂが二種類の細胞と特異的に結合することができることを示す。
【０１０７】
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと腫瘍細胞の結合特異性の実験をまとめると、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと、ＰＢＭＣ及びＪｕｒｋａｔ細胞との結合特異性の実験から、ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞及びＣＥＡを発現した腫瘍細胞と、特異的な結合作用があるという結論が得られた。
【０１０８】
＜実施例８＞ＭＴＴ法よるＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した大腸癌細胞ＳＷ１１１６の殺傷活性の検出
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと特異的に結合する大腸癌細胞ＳＷ１１１６を標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）とし、ＰＢＭＣを効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）とし、ｉｎｖｉｔｒｏで、一定の標的細胞と効果細胞の比率となるように（標的細胞／効果細胞、Ｅ／Ｔ）混合し、同時に、一定濃度のＣＥＡ−ＴｓＡｂを添加し、その後３７℃で４８時間、培養し、更にＭＴＴ法により腫瘍細胞の存活の状況を測定した。これにより、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した大腸癌細胞ＳＷ１１１６の殺傷活性を測定した。具体的な操作は以下のようにした。
【０１０９】
（１）ＰＢＭＣを採集し、具体的な操作は、実施例７と同様とした。
【０１１０】
（２）ＳＷ１１１６細胞を採取し、具体的な操作は、実施例６と同様とした。
【０１１１】
（３）Ｌ１５培地（ＧＩＢＣＯ会社から購入）を用いて効果細胞（ＰＢＭＣ）及び標的細胞（ＳＷ１１１６）の濃度を調整し、ＳＷ１１１６細胞の密度を１×１０５個／ｍｌとし、１０μｌ／孔として、９６孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に加えた。同時に、異なる濃度のＰＢＭＣを添加し、別々に、異なる効果細胞と標的細胞の割合（別々に１、５、１０とする）で、１０μｌ／孔とし、上記の細胞プレートに添加した。また、同時に、Ｌ１５培地でＣＥＡ−ＴｓＡｂの濃度を５倍に濃縮し、使用した抗体濃度（例えば、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの使用濃度は１μｇ／ｍｌであり、その場合、濃縮液の濃度は５μｇ／ｍｌである）とした。抗体の濃縮液を５０μｌ／孔とし、既に効果細胞及び標的細胞を含む９６孔の細胞プレートに添加し、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で４８時間、培養した。種類毎のサンプルについては、４個の複孔がある。同じく、毎種の効果細胞と標的細胞の比率は、抗体不添加の陰性コントロール、単独の効果細胞又は標的細胞の陰性コントロール及び細胞無添加の培地の陰性コントロールを作製した。
【０１１２】
（４）細胞の培地を捨てた後、ＰＢＳ（３００μｌ／孔）で、一度洗浄し、更にＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ会社製）溶液（濃度２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、ＰＢＳ（３００μｌ／孔）で一度洗浄し、ＤＭＳＯ（２００μｌ／孔）（Ｓｉｇｍａ会社製）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、Ａ６００を測定した。
【０１１３】
（５）特異性殺傷率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）は下記の計算式により求められた。
特異性殺傷率（％）＝［Ａ６００（Ｅ／Ｔ）−Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）］／［Ａ６００（Ｅ／Ｔ）−Ａ６００（Ｍ）］×１００％
【０１１４】
上記のＡ６００（Ｅ／Ｔ）は、種類毎の抗体無添加の実標比の毎種類の効果細胞と標的細胞の比率の抗体無添加の陰性コントロールのＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）は、種類毎のサンプルのＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｍ）は、無細胞の培地における陰性コントロールのＡ６００測定値である。
【０１１５】
まず、上記の方法により、効果細胞と標的細胞の比率が異なる（１、５、１０）ＣＥＡ−ＴｓＡｂが、Ｔ細胞を介して腫瘍細胞の殺傷率に与える影響を比べた。その結果（図１５）は、殺傷率は、効果細胞と標的細胞の比率が高くなるに連れて高くなることを示した。効果細胞と標的細胞の比率を１としたとき、特異性殺傷効率は最も低く、効果細胞と標的細胞の比率を５としたときが、２番目であり、効果細胞と標的細胞の比率を１０としたとき、特異性殺傷率は最も高くなった。この最も高い特異性殺傷率は８５％程度に達した。このことは、特異性殺傷率は、単に効果細胞と標的細胞の比率ばかりではなく、他の要素も影響していることを示す。更に、抗体濃度が特異殺傷率に与える影響を検討するため、効果細胞と標的細胞の比率を５とし、特異性殺傷率の抗体濃度（０．４ｎｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌ）による依存性曲線を測定した。その結果（図１６に示す）、特異性殺傷率の変化は、４つ段階に分けられた。すなわち、段階１としては、６μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間としたとき、特異性殺傷率と抗体濃度とは、負相関が現れ、６μｇ／ｍｌとしたときに、特異性殺傷率は最高に達した。段階２としては、特異性殺傷率と抗体濃度とは、正相関が現れ、７５０ｎｇ／ｍｌに達したときには、特異性殺傷率は最低に達した。段階３としては、２４ｎｇ／ｍｌ−７５０ｎｇ／ｍｌの間としたときには、特異性殺傷率と抗体濃度とは、負相関が現れ、２４ｎｇ／ｍｌとしたとき合には、特異性殺傷率が最高に達した。段階４としては、特異性殺傷率と抗体濃度は、再び正相関が現れる。全過程において特異性殺傷率は、２つの最大値がある。すなわち、６μｇ／ｍｌとしたときは、約８５％であり、２４ｎｇ／ｍｌとしたときは、約７０％である。この結果は、低い効果細胞と標的細胞の比率及び極めて低い抗体濃度であっても、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、Ｔ細胞を介して、依然として腫瘍細胞を殺傷する高い能力を保持していることを示す。
【０１１６】
＜実施例９＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程における細胞形態の観察
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと特異的に結合する大腸癌細胞ＳＷ１１１６を標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）として、ＰＢＭＣを効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）とし、これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで効果細胞と標的細胞との比率（Ｅ／Ｔ）が５となるよう混合し、一定濃度（７５０ｎｇ／ｍｌ）のＣＥＡ−ＴｓＡｂを添加し、３７℃で２０−４０時間培養し、更にＯＬＹＭＰＵＳ ＩＭＴ−２ 倒立型顕微鏡により、効果細胞による腫瘍細胞の殺傷状況を観察し、顕微鏡写真を撮影した。４０倍レンズで２０時間、観察及び記録した。その結果（図１８に示す）、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの効果細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程は、以下の４つの工程に分けることができた。まず、標的細胞を順序的に、付着細胞を剥離（図１８Ｂ）し、その後、効果細胞が腫瘍細胞の表面に集まる（図１８Ｃ）。集まっている効果細胞の数の増加に連れて、腫瘍細胞の表面には、突起が発生する（図１８Ｄ）。最後に、細胞の縁がファジーになって、細胞は完全に破砕し、死滅した（図１８Ｅ、Ｆ、Ｇ）。
【０１１７】
＜実施例１０＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程における、ＭＴＴ法によるＴ細胞の増加の検出
ＭＴＴ法によるＴ細胞の増加を検出し、これによりＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程を判断し、Ｔ細胞の活性化の状況を観察した。具体的な操作は、以下のようにした。
【０１１８】
（１）ＰＢＭＣを採集した。具体的な操作は実施例７と同様である。
【０１１９】
（２）ＳＷ１１１６細胞を培養、採集した。具体的な操作は実施例６と同様である。
【０１２０】
（３）Ｌ１５培地で、ＳＷ１１１６細胞の濃度を１×１０６個／ｍｌに調整し、その後、マイトマイシンＣ（最終濃度２５μｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ会社製）を添加し、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３度洗浄し、残りのマイトマイシンＣを除去して、これを備用した。
【０１２１】
（４）Ｌ１５培地で、効果細胞（ＰＢＭＣ）の濃度を５×１０５個／ｍｌとし、標的細胞（ＳＷ１１１６）を１×１０５個／ｍｌとなるよう調整した。ミクスチャーした後、１０μｌ／孔とし、９６孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に添加した。また、Ｌ１５培地でＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度（抗体の使用濃度は、最終濃度の５倍であり、例えば、最終濃度が１μｇ／ｍｌであれば、抗体の濃度は５μｇ／ｍｌである）を調整し、５０μｌ／孔で、既に、効果細胞と標的細胞とを含む９６孔の細胞プレートに添加した。その後、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で、４日間培養した。抗体無添加のコントロール、単独の効果細胞又は標的細胞のコントロール及び無細胞培地のコントロールを夫々作製した。上記の試料サンプルについて、サンプル毎に４孔の繰り返しを用意した。
【０１２２】
（５）１，０００ｇで１０分間、遠心分離し、細胞培地の上清成分を捨てて、ＰＢＳ（３０μｌ／孔）で、細胞沈殿成分を懸濁し、更に、１，０００ｇで１０分間、遠心分離し、遠心分離した上清成分を捨てて、更にＭＴＴ溶液（濃度：２５μｇ／ｍｌ、２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、ＰＢＳ（３０μｌ／孔）で、１度を洗浄し、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、Ａ６００を測定した。
【０１２３】
（６）特異性インデックス（ＳＩ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｄｅｘ）の計算式は、以下のようにした。
ＳＩ＝［Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）／Ａ６００（Ｅ／Ｔ）］
上記のＡ６００（Ｅ／Ｔ）は、抗体無添加のコントロール孔のＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）は抗体を添加したサンプル孔のＡ６００測定値である。
【０１２４】
図１７に示されるように、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が変化するに従って、ＳＩの変化は、３つ段階に分けられる。まず、段階１としては、抗体濃度を７５０ｎｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間としたとき、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間には正相関の変化が現れる。ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度を７５０ｎｇ／ｍｌとしたとき、最低に達する。段階２としては、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間には負相関の変化が現れ、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度を４７ｎｇ／ｍｌ程度としたとき、最高に達する。段階３としては、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が４７ｎｇ／ｍｌより小さいとき、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間に正相関の変化が現れ、０．７ｎｇ／ｍｌで、ＳＩは最低に達する。この結果は、低いＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度としたとき、ＣＥＡ／ＴｓＡｂは、依然として、Ｔ細胞を活性化する能力を有することが示された。ＳＩの変化法則を腫瘍細胞の特異性殺傷率の変化法則と比べると、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率は、Ｔ細胞の活性化の程度と直接的に相関しており、Ｔ細胞の活性化の程度が高ければ、腫瘍細胞の殺傷効率が高くなることが発見された。
【０１２５】
上述の実施例４、５、６、７、８、９の実験結果をまとめると、上記の殺傷過程において、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの作用は、主に、二つの方面がある。その一つが、腫瘍細胞及び効果細胞（Ｔ細胞）の間に直接的な連係を立てる、すなわち、標的化作用を現し、腫瘍細胞の回りの効果細胞を活性化させ、腫瘍細胞を殺傷する機能を発現する。この作用は、図１９に示されたメカニズムのモデルにまとめた。すなわち、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、生体に使用されると、Ｔ細胞と、又はＣＥＡを発現した腫瘍細胞と特異的な結合作用を行い、結果的に、Ｔ細胞を腫瘍細胞の回りへ標的化する作用を発揮する。また、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、ＣＤ３と、又はＣＤ２８と特異的に結合し、Ｔ細胞を活性化する。活性化されたＣＴＬ細胞は、直接的に腫瘍細胞を殺傷し、活性化されたＴＨ細胞は、細胞因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γが挙げられる）を分泌し、活性化ＣＴＬ、ＮＫ細胞等の細胞性免疫の効果細胞を補助し、間接的に腫瘍細胞を殺傷する。
【０１２６】
＜実施例１１＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷メカニズムの検出
活性化されたＣＴＬ細胞は、３つの経路により腫瘍細胞を殺傷することができる。そのうち、一つの経路は、ｐｅｒｆｏｒｉｎを分泌し、このｐｅｒｆｏｒｉｎは、腫瘍細胞の表面に微小孔を造成して細胞を破砕させ、更に、細胞をネクローシスさせる。他の活性化されたＣＴＬ細胞から分泌されたＧｒａｎｚｙｍｅが、上記の微小孔から腫瘍細胞内に侵入し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、また、活性化きれたＣＴＬ細胞の表面に誘導されて発現したＦＡＳＬと腫瘍細胞の表面のＦＡＳとが相互的に作用して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介して行う腫瘍細胞の殺傷メカニズムを詳しく分析するため、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）及びＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＤ会社から購入）を使用し、殺傷された腫瘍細胞を標識し、その後、蛍光顕微鏡とＦＡＣＳ法により、腫瘍細胞のネクローシス及びアポトーシスの状況、その割合を観察、検出した。具体的な操作は、以下のようにした。
【０１２７】
（１）ＰＢＭＣを採集し、具体的な操作は、実施例７と同様である。
【０１２８】
（２）ＳＷ１１１６細胞を培養、採集し、具体的な操作は、実施例６と同様である。
【０１２９】
（３）Ｌ１５培地を使用して、効果細胞であるＰＢＭＣと標的細胞であるＳＷ１１１６の濃度とを１×１０５個／ｍｌとなるように調整した。ミクスチャーした後、１．０ｍｌ／孔となるように、４８孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に添加した。何れもＬ１５培地を使用して、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が５μｇ／ｍｌとなるように調整し、２５０μｌ／孔とした細胞培養孔に添加し、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの使用濃度を１μｇ／ｍｌとなるように調整し、３７℃、ＣＯ２（５％）の培養室で２０時間培養した。また、抗体無添加のコントロール、単独の効果細胞及び単独の標的細胞のコントロールを夫々作製した。
【０１３０】
（４）４８孔の細胞プレートを１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、培地の上清成分を捨てて、０．３％トリプシン（Ｓｉｇｍａ会社製）（ｗ／ｖ）を用いて附着細胞を１分間（５０μｌ／孔）かけて消化し、１０％ウシ胎児血清のＲＰＭＩ１６４０を添加（１ｍｌ／孔）し、細胞をソフトに懸濁し、１．５ｍｌの遠心分離チューブに移入して、１，０００ｇで１０分間、遠心分離した。
【０１３１】
（５）ＰＢＳ（５００μｌ／チューブ）で、細胞を一度洗浄し、更に、結合緩衝液（ＢＤ会社から購）（１００μｌ／チューブ）を添加し、細胞沈殿成分を懸濁し、各チューブに、５μｌのＰＩ溶液（５０μｇ／ｍｌ）及び３μｌのＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ溶液を添加し、４℃で避光的に１５分間維持した。
【０１３２】
（６）チューブ毎に、３００μｌの結合緩衝液を添加し、少しの細胞の細胞スライドを採取して、ＬｅｉｃａＤＭＲＡ２蛍光顕微鏡により、殺傷された腫瘍細胞の形態及び蛍光標識状況を観察した。分析は、ＱＦＩＳＨソフトウェア（Ｌｅｉｃａ会社製）を使用して行われた。その結果を図２０に示す。
【０１３３】
（７）ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによりダブル蛍光を検出した（ＦＬ１及びＦＬ２）。その条件は、全２０，０００個の細胞を測定し、励起波長を４８８ｎｍｏｌ／Ｌとした。その結果を図２１に示す。
【０１３４】
図２０は、早期アポトーシス細胞、晩期アポトーシス細胞及びネクローシス細胞の差異を示す。早期アポトーシス細胞の表面には、緑色の蛍光（ＦＩＴＣ）のみが見られるが、晩期アポトーシス細胞の表面には、緑色と同時に、赤色（ＰＩ）の二種類の蛍光が見られ、ネクローシス細胞の表面には、主に赤色の蛍光が見られ、同じく若干の緑色蛍光が見られた。
【０１３５】
図２１は、４つに区分された、夫々異なる４つの状態の細胞を表している。左下区は存活の腫瘍細胞であり、右下区は早期のアポトーシス細胞であり、右上区は晩期アポトーシス細胞であり、左上区はネクローシス細胞である。抗体無添加のコントロールサンプルにおいて、４つ状態の細胞の割合は、順に、９０．１７％、１．６６％、２．２３％、５．９４％であったが、抗体の添加後、４つ状態の細胞の割合は、順に、５２．８３％、１６．１２％、２１．２５％、９．８６％となった。この結果は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの添加後、活性化されたＴ細胞は、腫瘍細胞のネクローシス及びアポトーシスを誘導することにより、殺傷効応を発現する。また、抗体無添加のコントロールと比べて、早期アポトーシス細胞及び晩期アポトーシス細胞の割合が、９倍程度高くなり、ネクローシス細胞の割合が、１倍高くなったことが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによるＣＥＡ−ＴｓＡｂのベクターのポリクローニングＤＮＡを構築するスケジュールの概略図。図中、番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１は、各構築において用いられた合成核酸断片を表し、符合Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及び記号ＵＰ、ＤＯＷＮは、別々の構築工程の中間産物を表し、ＷＨＯＬＥは最終産物を表す。
【図２】図２はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによるＣＥＡ−ＴｓＡｂベクターのポリクローニングＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す図。図中、第１レーンはＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物、第２レーンはＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物及びＤＬ２０００ＤＮＡ分子量マーカー（大連宝生物会社製）。
【図３】図３はポリクローニングサイト（ｓｉｔｅ）のＤＮＡ断片の核酸配列であり、制限酵素の切断位点及びその構成を示す図。
【図４】図４はＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築の操作工程の概略図。
【図５】図５はＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築するための各中間ベクター及び構築されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むベクターの概略図。
【図６】図６はアガロースゲル電気泳動によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの構築過程における各中間産物と最終産物の検出結果を示す図。図中、第１レーンはプラスミドｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第２レーンはプラスミドＣＤ２８／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第３レーンはプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第４レーンはプラスミドＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第５レーンはＤＬ２０００ＤＮＡ分子量マーカー（大連宝生物会社製）。
【図７】図７はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる、マウス由来の抗ＣＥＡ単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂをコードするＤＮＡを構築するためのスケジュールの概略図。図中、数字１−２２は、構築のための合成核酸の断片を示し、符号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及び記号ＵＰ、ＤＯＷＮは、別々に構築過程における中間産物を示し、ＷＨＯＬＥが最終産物を示す。
【図８】図８はアガロースゲル電気泳動によるＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる、抗ＣＥＡ単鎖抗体を構築するためのＤＮＡ断片の検出を示す図。図中、第１及び第９レーンはＤＮＡ分子量マーカーＤＬ２０００（大連宝生物会社製）であり、第２−第５レーンは、順に、構築過程における中間産物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶであり、第６及び第７レーンは、別々の構築の過程における中間産物ＵＰ及びＤＯＷＮであり、第８レーンは、単鎖抗体断片の全長であるＷＨＯＬＥを示す。
【図９】図９はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる低温誘導で胞内に可溶的に発現されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中、第１レーンは超音波処理した沈澱成分であり、第２レーンは超音波処理した上清成分であり、第３レーンは低分子量蛋白質のマーカー（シャツハイ生物化学研究所から購入）であり、第４レーンは超音波処理したｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の沈澱成分であり、第５レーンはｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の上清成分であり、矢印はＣＥＡ−ＴｓＡｂの特異性バンドを示す。
【図１０】図１０はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる低温誘導で発現されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中、第１レーンは予着色蛋白質の分子量マーカー（ＮＥＢ会社製）であり、第２レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの発現産物の沈澱成分であり、第３レーンは超音波処理したｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の沈澱成分であり、第４レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの発現産物の上清成分であり、第５レーンはｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の上清成分を示す。
【図１１】図１１はＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＤＥＡＥアニオン交換精製の検出結果を示す図。図中、第１レーンはｐＴＲＩ空ベクターで表現された産物の超音波処理した上清成分であり、第２レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂで表現された産物の上清成分であり、第３レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたカラムからの流出級分であり、第４レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたＮａＣｌ溶出級分であり、第５レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたＮａＯＨ溶出級分であり、第６レーンは低分子量蛋白質の分子量マーカー（シャッハイ生物化学研究所から購入）であり、矢印は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの特異的なバンドを示す。
【図１２】図１２はＥＬＩＳＡ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中の曲線は、夫々４つの異なる検出結果を示す。第１曲線は１μｇ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞膜抗原、第２曲線は１μｇ／ｍｌのＣＥＡ抗原、第３曲線は１μｇ／ｍｌのＣＤ２８抗原、第４曲線は無抗原の検出結果を示す。
【図１３】図１３はＦＡＣＳ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂと複数の腫瘍細胞との結合特異性の検出結果を示す図。図中、陰影を有するピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体が不添加するコントロール試料の測定結果であり、陰影を有さないピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体が添加する試料の測定結果を示す。
【図１４】図１４はＦＡＣＳ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂとＪｕｒｋａｔ細胞又はＰＢＭＣ細胞との結合特異性の検出結果を示す図。図中、陰影を有するピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体不添加のコントロール試料の測定結果であり、陰影を有さないピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体を添加した試料の測定結果を示す。
【図１５】図１５はＭＴＴ法による、異なる効果細胞と標的細胞の比率でＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率に与える影響の検出結果を示す図。３つの曲線は、夫々異なる効果細胞と標的細胞の比率（Ｅ／Ｔ＝１０、５、１）であり、腫瘍細胞の殺傷効率と抗体濃度との関連性を示す。図中、第１曲線は効果細胞と標的細胞の比率が１０であるとき、第２曲線は効果細胞と標的細胞の比率が５であるとき、第３曲線は効果細胞と標的細胞の比率が１であるときを示す。
【図１６】図１６はＭＴＴ法による抗体濃度がＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率に対する影響を検出した結果を示す図。図中には、特異性殺傷率の変化を４段階に分類して示しており、その段階１は、６μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間において、特異性殺傷率と抗体濃度と負相関的に変化し、６μｇ／ｍｌで特異性殺傷率が最高に達することを、段階２は、特異性殺傷率と抗体濃度とが正相関的に変化して７５０ｎｇ／ｍｌで特異性殺傷率が最低に達することを、段階３は、２４ｎｇ／ｍｌ−７５０ｎｇ／ｍｌの間において、特異性殺傷率と抗体濃度とが負相関的に変化し、２４ｎｇ／ｍｌにおいて特異性殺傷率が最高に達することを、段階４は、特異性殺傷率と抗体濃度とが、再び正相関的な関係となることを示す。
【図１７】図１７はＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程において、抗体濃度がＴ細胞の増殖に与える影響を示す図。図中、ＳＩの変化を３段階に分類して示しており、その段階１は、抗体濃度が、７５μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間において、ＳＩと抗体濃度とが正相関的に変化して、７５μｇ／ｍｌとしたときに、最低に達することを、段階２は、ＳＩと抗体濃度とが負相関的に変化し、４７ｎｇ／ｍｌ程度としたときに、最高に達することを、段階３は、４７ｎｇ／ｍｌより小さいときに、ＳＩと抗体濃度とが正相関的に変化し、０．７ｎｇ／ｍｌとしたときに、最低に達することを示す。
【図１８】図１８は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程における細胞の形態の観察記録を示す図。図中、Ａは、ＳＷ１１１６細胞を単独で２０時間培養した後の細胞形態を、Ｂ−Ｉは、効果細胞と標的細胞の割合を５とし、ＳＷ１１１６細胞及びＰＢＭＣ細胞と共にインキュベートし、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ（最終濃度７５０μｇ／ｍｌ）を添加し、２０時間インキュベートした後の、殺傷段階の異なる各種類の細胞形態を示し、そのうち、Ｂは、標的細胞が壁から剥離し始める様子、Ｃは効果細胞が標的細胞の表面に集まり始める様子、Ｄは標的細胞の表面の局部領域が突出した様子、Ｅは標的細胞の局部領域が破砕された様子、Ｆは標的細胞の全体が破砕された様子、Ｇ−Ｉは標的細胞が漸次的に破砕された様子を示す。
【図１９】図１９はＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介して腫瘍細胞を殺傷するメカニズムの概略図。上図はＣＥＡ−ＴｓＡｂの構造の概略図であり、下図はＣＥＡ−ＴｓＡｂの腫瘍細胞の殺傷するメカニズムであり、すなわち、ＣＥＡ−ＴｓＡｂが、腫瘍細胞及びＣＴＬ細胞と特異的に結合し、ＣＴＬ細胞の活性化により腫瘍細胞を殺すことを示す。
【図２０】図２０はＰＩ及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖでダブル標識した殺傷された腫瘍細胞（ＳＷ１１１６）の蛍光顕微鏡による観察記録を示す図。図中、Ａ、Ｂ及びＣは夫々、３種類の異なる状態で殺傷された腫瘍細胞（順に、ネクローシス細胞、晩期アポトーシス細胞及び早期アポトーシス細胞）であり、第２列が、緑色蛍光の単色による検出結果であり、第３列が、赤色蛍光の単色による検出結果であり、第１列は、Ｌｅｉｃａ ＱＦＩＳＨソフトウェアを用いて、上記２種類の単色蛍光の検出結果を積み重ねて示す。
【図２１】図２１はＦＡＣＳ法によるＰＩ及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖでダブル標識した殺傷された腫瘍細胞（ＳＷ１１１６）の検出結果を示す図。明確に異なる殺傷状態を示ている区；左下区（Ｌｏｗ Ｌｅｆｔ，ＬＬ）が生細胞（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）であり、右下区（Ｌｏｗ Ｒｉｇｈｔ，ＬＲ）が、早期アポトーシス細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）であり、左上区（Ｕｐ Ｌｅｆｔ，ＵＬ）が、ネクローシス細胞（ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）であり、右上区が（Ｕｐ Ｒｉｇｈｔ，ＵＲ）が晩期アポトーシス細胞（ｌａｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換え抗体に関する。具体的には、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体、この抗体の構築、発現及び精製方法、この抗体遺伝子を含むベクター及びエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体におけるＴ細胞の活性化は、以下のダブルシグナル伝達経路において必要である。すなわち、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ）の表面のＭＨＣ／抗原ペプチド複合体とＴ細胞により発現されたＴＣＲ／ＣＤ３複合体とが相互作用して、第１シグナルを産生する伝達経路を形成し、また、ＡＰＣ細胞表面の副刺激因子シグナル分子受容体（例えば、Ｂ７）とＴ細胞表面の副刺激因子シグナル分子（例えば、ＣＤ２８）とが相互作用して、第２シグナルを産生する伝達経路、つまり補助シグナル伝達経路を形成する。通常、第１シグナルだけでは、Ｔ細胞を十分に活性化することができない（Ｂａｘｔｅｒ＆Ｈｏｄｇｋｉｎ，２００２；Ｂｅｍａｒｄｅｔａｌ．，２００２）。
【０００３】
Ｔ細胞は、主に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）及びヘルパーＴ細胞（ＴＨ：Ｔ ｈｅｌｐ ｃｅｌｌｓ）という二種類を含んでいる。その中でも、ＣＴＬ細胞は、細胞性免疫における主要な効果細胞であり、また、ＴＨ細胞は、細胞から分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）により、直接的には、細胞と相互的に作用して、ＣＴＬ細胞の活性を制御し、間接的には細胞性免疫に参加する。腫瘍免疫においては、細胞性免疫は主要な免疫となるので、特異的に活性化されたＣＴＬ細胞を目的として、抗腫瘍薬物を設計することは、腫瘍免疫治療において重要な方法になっている（Ｆｏｓｓ，２００２）。
【０００４】
最近では、Ｔ細胞を活性化する第１シグナル経路に対して、一系列の遺伝子組み換えによる腫瘍抗ＣＤ３に対する二重特異性抗体を設計、構築しており、その−部は臨床実験の段階に入っている（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｍａｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｍａｎｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｉｎ Ｆａｎｇ，２００３；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。現在知られている実験データから明らかなように、この二重特異性抗体は、特異的に腫瘍細胞を識別することができるＴ細胞を活性化させ、間接的かつ特異的に腫瘍細胞を殺傷する。しかし、上記の二重特異性抗体には、第１シグナル伝達経路だけが存在するので、Ｔ細胞を完全には活性化させることができない上、Ｔ細胞の活性化誘導による細胞死（ＡＩＣＤ：ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）が発生するため、腫瘍細胞に対する殺傷効果を低下させることがあった（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【０００５】
この二重特異性抗体の欠点を克服するために、他の二重特異性抗体の抗腫瘍抗ＣＤ２８二重特異性抗体が設計、構築された。Ｔ細胞の活性化のために、それを抗腫瘍抗ＣＤ３二重特異性抗体と合用することにより、完全なダブルシグナル経路が提供された（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｋｏｄａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。この実験では、上記のようにして、広い範囲において腫瘍細胞の殺傷効率が向上した。しかし、二種類の二重特異性抗体を合用する方式では、その応用分野において一系列的な不利益も伴うことがある。例えば、発現と精製の操作工程及び生産においてコスト高となり、臨床試験に応用する際には、この二種類の二重特異性抗体の相対比率等を考慮しなければならない。一方、三種類の抗原（腫瘍抗原ＣＤ３、ＴＣＲ又はＣＤ２８）に対する三重特異性抗体（ＴｓＡｂ：ｔｒｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）分子を構築すると、この三重特異性抗体分子は、上記の二種類の二重特異性抗体の特性を有するようになる。また、この三重特異性抗体分子は、発現、精製及び臨床といった応用分野において、特に優れた応用性を実現した。
【０００６】
三重特異性抗体には、以下の三種類がある。（１）化学共役類（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｆｒｅｎｃｈ，１９９８；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２，０００）、（２）遺伝子工程ポリマ類（Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｏｌｅｚａｌ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）、（３）遺伝子工程単鎖コンフューズ分子類（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。上記のうち、三番目の三重特異性抗体の構築方式が、簡単に単一の発現産物を得られ、精製が容易であるので、最も優れている。
【０００７】
この方式において、本願発明者らは、遺伝子組み換え工程による抗卵巣癌、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｚｈａｎｇｅｔ ａｌ．，２００３）を構築することに成功し、しかも、この抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて抗卵巣癌細胞において特異的な殺傷作用を与えることが既に証明されている。癌胎児性抗原−ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）は、幅広い腫瘍相関を有する抗原である（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｇａｎｊｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２，０００；Ｋａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そのため、糸状な単鎖の三重特異性抗体（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）を構築することにより、このような抗体を用いて、複数の腫瘍の予防及び治療に応用することができるようになる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、幅広い腫瘍相関を有する抗原であるＣＥＡを三重特異性抗体の構築に導入し、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換えによる糸状な単鎖の三重特異性抗体ＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築することにより、三重特異性抗体の腫瘍細胞に対する特異性標識を確立した。この三重特異性抗体は、一方では、三重特異性抗体を腫瘍細胞と生体の正常細胞とを区別させて、可能な限り非特異的な殺傷反応を回避し、他方では、ＣＥＡは幅広い腫瘍相関抗原であるので、複数の腫瘍の免疫治療分野に広く応用することができる。
【０００９】
そこで、本発明は、複数の腫瘍を治療するための抗ＣＥＡ、抗ＣＤ及び抗ＣＤ２８の遺伝子組み換え工程による糸状な単鎖の三重特異性抗体を提供する。
【００１０】
また、本発明は、この三重特異性抗体を構築する方法を提供する。
【００１１】
本発明に開示されたマウス由来の抗ＣＥＡの単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下のようにした。
【００１２】
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＤＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＲＴＤＹＮＥＲＦＫＧＫＡＴＦＴＧＤＶＳＳＮＴＡＹＭＫＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＧＴＴＰＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＴＳＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＳＲＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＴＡＹＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【００１３】
本発明に開示されたマウス由来の抗ＣＤ３の単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列は、以下のようにした。
【００１４】
ＥＶＫＬＶＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＳＶＴＶＳＳＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＬＫＲＡ
【００１５】
本発明に開示されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、以下のようにした。
【００１６】
１ ＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡ
５１ ＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡ
１０１ ＧＣＧＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡ
１５１ ＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧ
２０１ ＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＧＴ
２５１ ＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣ
３０１ ＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣ
３５１ ＣＧＴＴＴＣＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＧ
４０１ ＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧ
４５１ ＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧ
５０１ ＣＣＧＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴ
５５１ ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣ
６０１ ＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣ
６５１ ＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴ
７０１ ＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣ
７５１ ＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＧＴＣＣＴ
８０１ ＣＡＣＣＧＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡ
８５１ ＧＴＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡ
９０１ ＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＡ
９５１ ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧ
１００１ ＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧ
１０５１ ＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡ
１１０１ ＡＣＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＴ
１１５１ ＣＧＧＧＧＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＧＴＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡ
１２０１ ＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧ
１２５１ ＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＣＡ
１３０１ ＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧ
１３５１ ＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡ
１４０１ ＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧ
１４５１ ＴＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣ
１５０１ ＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧ
１５５１ ＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＣ
１６０１ ＧＣＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡ
１６５１ ＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡ
１７０１ ＧＣＴＡＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣ
１７５１ ＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＡＴＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧ
１８０１ ＧＴＡＣＧＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＣＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＡＴＧＧＧＣ
１８５１ ＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＣＧＴＧＴＡＡＣＣＴ
１９０１ ＣＴＴＣＣＧＡＣＧＡＴＡＣＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴ
１９５１ ＴＣＣＧＴＡＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＣＴＡ
２００１ ＴＴＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＧＴＡＴＣＴＴ
２０５１ ＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡ
２１０１ ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡ
【００１７】
本発明に開示されたＣＥＡ−ＴｓＡｂのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は、以下のようにした。
【００１８】
ＭＧＬＥＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＤＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＲＴＤＹＮＥＲＦＫＧＫＡＴＦＴＧＤＶＳＳＮＴＡＹＭＫＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＴＧＴＴＰＦＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＴＳＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＳＲＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＱＳＶＳＴＳＳＹＴＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＫＹＡＳＮＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＮＩＨＰＶＥＥＥＤＴＡＹＹＹＣＱＨＳＷＥＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＥＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＳＴＥＶＫＬＶＥＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＥＷＭＧＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＳＶＴＶＳＳＴＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＲＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＫＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＡＧＧＴＫＬＥＬＫＲＡＶＤＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＰＶＥＶＳＨＭＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＣＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＲＶＴＳＳＤＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＬＳＳＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨＥＱ
【００１９】
本発明は、この抗体を発現するためのベクターＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを提供することを目的とする。
【００２０】
また、本発明は、低温誘導により、三重特異性抗体の胞内に可溶性発現を促進する方法を提供することを目的とする。
【００２１】
更に、本発明は、ＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂を使用して、この三重特異性抗体を精製する方法を提供することを目的とする。
【００２２】
なお、本発明は、特に、以下の実施例において公開された本発明の内容を基礎として、本発明の優れた点を、当業者が容易に実現できるようにすることを目的とする。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
以下の説明において使用される用語は、特に説明がなければ、当業者において通常に理解される意味で用いられる。特に、以下の用語は、次の通りの意味で用いられる。
【００２４】
本発明において、構築された遺伝子組み換えによる単鎖の三重特異性抗体は、遺伝子組み換え方法により構築され、また、３種類の抗原の結合特異性を有する単一の抗体分子である。具体的には、本発明において開示された抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体は、３種類の抗体の断片を２種類のペプチドリンカー（ＦＣペプチドリンカー及びＨＳＡ／ペプチドリンカー）（Ｍｉｎ Ｆａｎｇ，２００３）を介して、順序的に連接され、単一分子である三重特異性抗体として作製された。この抗体のＣ−末端には、ｃ−ｍｙｃ及び（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（Ｈｅｎｇｅｎ，１９９５；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を添加することができ、このｔａｇは、活性の検出と抗体の精製に有用であるが、不添加であってもよい。３種類の抗体の断片は、単鎖の抗体の断片（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）としてもよいし、抗体のＦａｂ断片としても、又は、単区域抗体の断片（ＶＨ及びＶＬ）としてもよい。更に具体的には、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、抗ＣＥＡｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２８ＶＨを、ＦＣペプチドリンカー及びＨＳＡペプチドリンカーにより、順序的に連接し、その後で、Ｃ−末端にｃ−ｍｙｃ−ｔａｇ及び（Ｈｉｓ）６−ｔａｇを添加した。この抗体は、以下の優れた点がある。
【００２５】
（１）Ｔ細胞の活性化に対して、ダブルシグナル伝達が必要であるという理論に基づいて構築されており、Ｔ細胞を完全に活性化させることができる。
【００２６】
（２）幅広い相関を持つ抗原であるＣＥＡを識別することができ、ＣＴＬ細胞に対する特異性がある複数の腫瘍細胞を殺傷して、複数の腫瘍細胞を治療する応用が可能である。
【００２７】
本発明において、低温誘導とは、三重特異性抗体の胞内可溶性の発現を促進する方法であって、０．４ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）により、３０℃で、大腸菌における三重特異性抗体の発現を誘導することを指す。この方法では、広い範囲に亘って包封体の形成を低下させることができ、胞内可溶性が発現された三重特異性抗体の割合（全三重特異性抗体における割合）が、５０％以上に達する。この方法により得られた発現産物は、変性や複製を伴わず、直接的に精製され、生産効率の向上及び材料の節約に寄与する。
【００２８】
本発明では、ＤＥＡＥアニオン交換樹脂を採用して、三重特異性抗体を溶出して、最適ｐＨ（ｐＨ８．０）で精製を行なった。上記の胞内可溶性の発現産物を、一度ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィにかけると、殆ど全ての雑蛋白質はＤＥＡＥカラムに付着し、一方、大部分の三重特異性抗体は溶出液と共に流出する。得られた三重特異性抗体の純度は、７５％以上に達した。
【００２９】
本発明の技術方法は、以下のようにした。
【００３０】
まず、特定のポリクローニングｓｉｔｅを有する中間ベクターであるｐＴＲＩを構築した。その後、既存の発現ベクターを用いて、ＰＣＲ法により、抗ＣＤ２８単区域抗体をコードするＤＮＡ断片であるＣＤ２８ＶＨを増幅した。同時に、両末端の制限酵素による切断ｓｉｔｅを、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩに取り替えて、既存のベクターを用いて、抗ＣＤ３単鎖抗体をコードするＤＮＡ断片を増幅すると共に、両末端の制限酵素による切断ｓｉｔｅを、ＳｃａＩ／ＳａｌＩに取り替えて、既存のベクターを用いてＣＥＡｓｃＦｖ（ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ）を切断した。最後に、一定の順序で、制限酵素による切断断片を連接し、形質転換反応により、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の糸状な単鎖の三重特異性抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築した。
【００３１】
次に、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換した後、ＩＰＴＧを加えて低温誘導によってこれを発現させ、発現産物を超音波処理し、この上清成分に対して、ＤＥＡＥアニオン交換樹脂によるクロマトグラフィを行い、初歩的な精製を行った。続いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によりＣＥＡ−ＴｓＡｂ鈍化産物の抗原結合活性を測定し、また、ＦＩＴＣで標識したＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）法により腫瘍細胞の結合特異性を検出した。更に、ＭＴＴ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物に含まれるＴ細胞が、ＣＥＡ腫瘍細胞に対する殺傷効果を有するかを検出した。また、倒立型顕微鏡により上記の殺傷過程における腫瘍細胞の形態変化を記録すると共に、ＭＴＴ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物がＴ細胞を介して、ＣＥＡを発現した腫瘍細胞を殺傷する過程において、Ｔ細胞の増殖状態を検出した。また、ＰＩ／Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖのダブル染色ＦＡＣＳにより、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ精製産物がＴ細胞を介して、ＣＥＡを発現した腫瘍細胞に対する殺傷効果を有するか、その細胞のアポトーシス誘導効果を検出する共に、蛍光顕微鏡により、上記の殺傷過程におけるアポトーシス形態又はネクローシス形態を記録した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明の具体的な実施例について、図面を参照して説明する。なお、以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、いずれの実施例も、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
＜実施例１＞Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる三重特異性抗体の発現ベクターであるｐＴＲＩベクターを構築するためのポリクローニングＤＮＡ断片の連接
Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲのスケジュールは、図１の記載に基づいて行われる。Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲに使用された核酸断片は、以下のようにした。
【００３４】
１． ５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
２． ５’−ＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＣＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
３． ５’−ＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＡＣＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
４． ５’−ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
５． ５’−ＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＧＴＡＣＡＴＴＣＴＡＧＡＡＧＴＡＣＴ−３’（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
６． ５’−ＡＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
７． ５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
８． ５’−ＣＧＣＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＡＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
９． ５’−ＴＣＧＣＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＧＣＧＧＧＡＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
１０． ５’−ＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＴＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
１１． ５’−ＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
１２． ５’−ＣＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
【００３５】
操作工程は、以下のようにした。
【００３６】
（１）工程１：断片２−１１について、図１に示されたような反応条件において、プライマー無添加で、別々にアニーリングし、伸長を進める。得られた反応産物を回収せずに、次の反応を行った。
【００３７】
反応条件としては、各１μｌの断片に、２μｌのＰＣＲ用１０倍緩衝液、２μｌのｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）（大通宝生物技術会社製）、０．３μｌのＴａｑポリメラーゼ（１Ｕ）（大連宝生物技術会社製）及び１４μｌの水を加えた。
【００３８】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回繰り返した。
【００３９】
上記工程により、反応産物Ａ（断片２及び３をハイブリダイズ）、Ｂ（断片４及び５をハイブリダイズ）、Ｄ（断片８及び９をハイブリダイズ）及びＥ（断片１０及び１１をハイブリダイズ）が得られた。
【００４０】
（２）工程２；反応産物Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ｃ及びＤ、Ｄ及びＥを、図１に示すように、プライマー無添加で、別々にハイブリダイズして、伸長させた。いずれの反応産物も、１％アガロースゲル電気泳動により回収した。反応産物Ｉ（反応産物Ａ及びＢをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐであり、ＩＩ（反応産物Ｂ及びＣをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐ、ＩＩＩ（反応産物Ｃ及びＤをハイブリダイズ）は約１８０ｂｐ、ＩＶ（反応産物Ｄ及びＥをハイブリダイズ）は約１００ｂｐであった。
【００４１】
上記の反応産物（Ｉ乃至ＩＶ）は、１０μｌの各反応産物（Ａ乃至Ｅ）について、他の反応成分を添加せず、以下の条件で反応を行うことにより得られた。
【００４２】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回繰り返した。
【００４３】
（３）工程３：反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを、図１に示されるように、以下の反応条件で、別々にアニーリングし、伸長させた。いずれの反応産物も、１％アガロースゲル電気泳動により回収した。反応産物ＵＰ（反応産物Ｉ及びＩＩをハイブリダイズ）は約３４０ｂｐであり、ＤＯＷＮ（反応産物ＩＩＩ及びＩＶをハイブリダイズ）が、約２６０ｂｐであった。
【００４４】
上記の反応産物（ＵＰ及びＤＯＷＮ）は、反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを各１μｌに対して、ＰＣＲ用１０倍緩衝液を２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）を２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（１Ｕ）を０．３μｌ、水を１３μｌ添加した。
【００４５】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。
【００４６】
（４）工程４；反応産物ＵＰとＤＯＷＮをハイブリダイズさせて、断片１及び１２をプライマーとし、Ｏｖｅｒｌａｐにより伸長させた。
【００４７】
本工程では、上記の反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮの各１μｌに対して、プライマーを各１μｌとし、ＰＣＲ用１０倍緩衝液を２μｌ、ｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）を２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（１Ｕ）を０．３μｌ、水を１２μｌ添加した。
【００４８】
９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返し、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物を得た。
【００４９】
最後に、１％アガロースの電気泳動により、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物の大きさを測定し、その断片の大きさが、４３９ｂｐであり（図２参照）、上記の方法により、効果的にポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片をつなぎ合わせた。Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物において、ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片の核酸配列、制限酵素の切断位点及び構成については、図３に示す。
【００５０】
＜実施例２＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂの構築
具体的な構築工程を、図４に示す。また、この構築工程において用いられる各種類ベタターの概略を図５に示す。以下、具体的な構築工程を説明する。
【００５１】
（１）ベクターｐＴＲＩの構築
ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片及びｐＴＭＦ空ベクター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）について、同時に、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩダブル制限酵素による切断反応を行い、ポリクローニングｓｉｔｅのＤＮＡ断片の酵素による切断産物及びｐＴＭＦの酵素による切断断片を回収し、ＴＯＰ１０株へ形質転換し、陽性に形質転換されたクローニングのプラスミドを抽出し、ＰＣＲにより連接したプラスミドをｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００５２】
上記の酵素による切断反応、連接反応、細菌のコンピテントセルの作製及び形質転換反応の具体的な操作は、以下のようにした。
【００５３】
酵素による切断反応は、２０μｌのシステムを使用し、約１μｌのｐＴＭＦ空ベタター又はポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片について、夫々ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）ダブル酵素による切断反応を行った。酵素の用量、緩衝液及び反応条件は、その制限酵素の説明書の記載を参照した。酵素による切断産物は、１％アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲル回収キット（上海華舜会社製）により、所定の大きさの断片が回収された。ｐＴＭＦ空ベクターの酵素による切断産物の大ききは、約５，０００ｂｐであり、ポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片の酵素による切断産物の大きさは、約４３０ｂｐであった。
【００５４】
連接反応は、５０−１００ｎｇの酵素により切断したｐＴＭＦベクターの断片及びベクターの３−１０倍の酵素により切断されたポリクローニングｓｉｔｅＤＮＡの断片に、２μｌの１０×Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ緩衝液、１ＵのＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（大連宝生物会社製）、ｄｄＨ２Ｏを添加し、全体積を２０μｌとし、１６℃でインキュべートし、一晩連接させた。
【００５５】
次に、大腸菌のコンピテントセルを作製した。ＴＯＰ１０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社製）を、２ｍｌのＬＢ培地（（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＧＩＢＣＯ会社製）、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＧＩＢＣＯ会社製）、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５））に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。ここでは、１：１００の割合になるよう、２０−４０ｍｌの抗生物質無添加のＬＢ培地に接種した。高速で振とうし、Ａ６００が０．３−０．４（約２．５時間）になるまで培養した。次に、アイス浴を１５分間行った。更に４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、菌体を収集して、上清成分を捨て、１０ｍｌの予冷した０．１ｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ会社製）を添加し、ソフトに菌体を懸濁してミクスチャーを行い、２０分間アイス浴を行った。４℃、４，０００ｒｐｍで遠心分離を１０分間行い、１−２ｍｌの予冷した１２％グリセリンを含む０．１ｍｏｌ／ｍｌ ＣａＣｌ２を添加し、ソフトに菌体を懸濁して、２００μｌを夫々チューブに入れて、−８０℃で保存し、これを備用した。
【００５６】
連接産物の形質転換は、２００μｌのコンピテントセルへ、上記の連接混合物１μｌを添加し、ミクスチャーした後、アイス浴を３０分間行い、４２℃で１００秒間の熱刺激し、その後、急速に２分間のアイス浴に置いた。アイス浴した混合物には、０．８ｍｌのＬＢ培地を添加し、３７℃で、ソフトに４５分間を揺動させる（＜１５０ｒｐｍ）又は静置により回復させた。１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨て、５０〜１００μｌのＬＢ培地を添加し、沈殿を懸濁し、ＬＢ−Ｋ培地（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／ｌを寒天（ＳＩＧＭＡ会社製）に塗布し、カナマイシン（（ＳＩＧＭＡ会社製）ｐＨ７．５）５０μｇ／ｍｌを添加して、３７℃で一晩培養した。
【００５７】
陽性の組み換えクローンのスクリーン及びその判定は、以下のようにして行った。まず、カナマイシンによる陽性の連接産物のモノクローンを選択し、２ｍｌのＬＢ−Ｋ培地（１０ｇ／ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン（（ＳＩＧＭＡ会社製）ｐＨ７．５））に接種し、３７℃で一晩培養した後、プラスミド抽出キット（上海華舜会社製）の説明書の記載を参照してプラスミドＤＮＡを抽出し、これをｐＴＲＩと名付けた。そして、以下の方法に従って、ＰＣＲ判定を行った。
【００５８】
ＰＣＲ判定は、２０μｌの増幅システムに、０．１−１μｌのプラスミドＤＮＡ（約２０〜２００ｎｇ）を添加し、上流側プライマー（Ｔ７−ｕｐ： ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及び下流側プライマー（Ｔ７−ｄｏｗｎ： ５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）を別々に１０ｐｍｏｌとし、２μｌの１０×Ｔａｑ酵素緩衝液及び２μｌの２ｍｍｏｌ／ｍｌのｄＮＴＰｓ、１ＵのＴａｑ酵素、水を添加して、全体積を２０μｌとした。具体的な反応工程としては、９４℃で５分間の予備変性を行った後、９４℃で４０秒間の変性を行い、５３℃で４０秒間アニーリングして、７２℃で４０秒間伸長させる工程を２５回繰り返し、５μｌのＰＣＲ産物を採取して、１％アガロースゲル電気泳動による検出を行った。その結果、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさは約５００ｂｐであった。
【００５９】
（２）ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの構築
ＰＣＲ法でプラスミドＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＭＦ（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）により、抗ＣＤ２８ＶＨのＤＮＡ断片を増幅し、使用された上流側プライマー（Ｐ１： ５’−ＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）及び下流側プライマー（Ｐ２； ５’−ＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＡＣＧＧＴＡＣＣＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）の５’末端には、夫々に制限酵素の切断位点であるＮｄｅＩとＮｈｅＩがあるので、ＰＣＲ産物の両末端も、これら２つの新しい制限酵素の切断位点を持つようになった。
【００６０】
ＰＣＲ反応混合物の構成は、各プライマーに対して、２μｌのｄＮＴＰｓ（各種類２ｍｏｌ／ｍｌを含む）、２μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌのプラスミドＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＭＦ（約１００ｎｇ）、０．３μｌのＰｆｕ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）、ｄｄＨ２Ｏを補充し、全量を２０μｌとした。ＰＣＲ反応の条件は、以下のようにした。９４℃で３分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。ＰＣＲ産物の大きさは、約５００ｂｐであった。１％アガロースゲル電気泳動の後に、ゲル回収キット（上海華舜会社製）で、約３５０ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。
【００６１】
このＰＣＲ産物とベクターｐＴＲＩについて、ＮｄｅＩ／ＮｈｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）のダブル酵素による切断反応が行われた。具体的な酵素による切断反応条件は、酵素の提供者の説明書の記載を参照し、ゲル回収キットによるＰＣＲ産物の酵素による切断産物（約３５０ｂｐ）とｐＴＲＩの酵素による切断大断片の産物（約５３００ｂｐ）とを連接し、形質転換した。その詳しい反応過程は、上記の工程（１）に準じる。その後、カナマシン耐性陽性クローンを抽出し、ＰＣＲよる判定を行った。判定方法は、上記の工程（１）に準じる。その結果は、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさが７５０ｂｐ程度となったクロニーグは、正しく連接されたのであり、それをＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００６２】
（３）ＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲｌの構築
ＰＣＲ法でプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ（▲喜富，粛颯，▼征，等．抗ヒトＣＤ３、単▲抗体与改型単域抗体的表迭．中国科学（Ｃ▼），１９９６，２６（５）：４２８〜４３５））により、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＤＮＡ断片を増幅し、上流側プライマー（Ｐ１； ５’−ＡＡＧＡＧＴＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）及び下流側プライマー（Ｐ２： ５’−ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＧＣＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）の５’末端には、夫々制限酵素による切断位点であるＳｃａＩとＳａｌＩがあるので、ＰＣＲ産物の両末端にも、２つの新しい制限酵素による切断位点を持つようになった。
【００６３】
ＰＣＲ反応混合物の構成は、１μｌの各プライマー、２μｌのｄＮＴＰｓ（各種類２ｍｍｏｌ／ｍｌを含む）、２μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌのプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ（約１００ｎｇ）、０．３μｌのＰｆｕ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）、ｄｄＨ２Ｏを補充し、全体積を２０μｌとした。ＰＣＲ反応の条件は、以下のようにした。９４℃で３分間予変性した後、９４℃で３０秒間の変性を行い、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で５０秒間伸長させる工程を２５回線り返した。１％アガロースゲル電気泳動の後に、ゲル回収キット（上海華舜会社製）で、約７５０ｂｐのＰＣＲ産物を回収した。
【００６４】
このＰＣＲ産物とベクターＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩについて、ＳｃａＩ／ＳａｌＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）ダブル酵素による切断反応を行った。具体的な酵素による切断反応条件は、酵素の供給元の説明書の記載を参照し、ゲル回収キットによるＰＣＲ産物の酵素による切断産物（７５０ｂｐ程度）とＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの酵素による切断大断片の産物（約５７００ｂｐ程度）とを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。その詳しい反応過程は、上記の工程（１）に準じる。その後、カナマシン耐性陽性クローンを選択し、ＰＣＲ判定を行った。このＰＣＲ判定の方法は、上記の工程（１）に準じる。その判定結果は、図６に示されるように、ＰＣＲ産物の大きさが１４００ｂｐ程度であるクローンが正しく連接したものであり、陽性が現れるているクローンを保留し、プラスミドを抽出し、それをＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩと名付け、次の操作に使用した。
【００６５】
（４）ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの構築
Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲにより抗ＣＥＡ単鎖抗体を構築した。抗ＣＥＡモノクローン抗体の重鎖と軽鎖の可変区のアミノ酸配列（Ｋｏｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）とをポリペプチド配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）で連接し、抗ＣＥＡ単鎖抗体として設計した。その後、大腸菌の偏好なコドン表（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２，０００）に基づいて、ＤＮＡ配列をトランスレーションし、相補的な核酸塩基配列に分けて（以下の配列番号１−２２に示される）、Ｏｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲにより、抗ＣＥＡ単鎖抗体ＤＮＡ断片の全長をつなぎ合わせた。以下、抗ＣＥＡ単鎖抗体の全遺伝子断片の核酸断片である。
【００６６】
１． ５’−ＴＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
２． ５’−ＴＣＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
３． ５’−ＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＴＡＣＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
４． ５’−ＣＡＣＣＣＡＴＴＣＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＴＡＧＣＣＧＧＴＣＧＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
５． ５’−ＡＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）
６． ５’−ＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）
７． ５’−ＣＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）
８． ５’−ＴＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＴＡＣＧＣＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）
９． ５’−ＴＧＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）
１０． ５’−ＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＴＡＡＣＣＧＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＰＣＧＣＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）
１１． ５’−ＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）
１２． ５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＣＧＣＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＣＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）
１３． ５’−ＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）
１４． ５’−ＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）
１５． ５’−ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
１６． ５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＩＡＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
１７． ５’−ＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）
１８． ５’−ＧＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＡＡＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
１９． ５’−ＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＣＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
２０． ５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＡＣＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＡＡＴＡＣＧＣＧＧＴＡＴＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
２１． ５’−ＴＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）
２２． ５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）
ｓ１） ５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）
ｓ１７） ５’−ＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）
ｓ１６） ５’−ＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）
ｓ１３） ５’−ＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）
ｓ１２） ５’−ＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）
ｓ７） ５’−ＧＴＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）
ｓ６） ５’−ＡＣＧＴＴＣＧＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＴＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）
【００６７】
（ｉ）工程１：プライマー無添加で、断片１−２２を別々に、ハイブリダイズして伸長させ、反応産物は回収せず、そのまま、次の反応を行った。１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の反応に使用された各断片に対して、ＰＣＲ用×１０緩衝液を２μｌ、２μｌのｎｏｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅａｃｈ）（大通宝生物技術会社製、以下同じ）、０．３μｌのＴａｑポリメラーゼ（１Ｕ）（大連宝生物技術会社製、以下同じ）、１４μｌの水を添加した。９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を１０回線り返した。
【００６８】
上記工程により、反応産物Ａ（断片１及び２をハイブリダイズ）、Ｂ（断片３及び４をハイブリダイズ）、Ｃ（断片５及び６をハイブリダイズ）、Ｄ（断片７及び８をハイブリダイズ）、Ｅ（断片９及び１０をハイブリダイズ）、Ｆ（断片１１及び１２をハイブリダイズ）、Ｇ（断片１３及び１４をハイブリダイズ）、Ｈ（断片１５及び１６をハイブリダイズ）、Ｉ（断片１７及び１８をハイブリダイズ）、Ｊ（断片１９及び２０をハイブリダイズ）、Ｋ（断片２１及び２２をハイブリダイズ）を得た。
【００６９】
（ｉｉ）工程２：プライマー無添加で、Ｏｖｅｒｌａｐにより反応産物ＡとＢ、ＤとＥ、ＧとＨ、ＪとＫを別々にハイブリダイズして伸長させた。各物質の１０μｌ（１０ｐｍｏｌ）について、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒伸長させる工程を１０回繰り返した。また、１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットで反応産物を回収した。この工程では、反応産物ａ（反応産物Ａ及びＢをハイブリダイズ）、ｂ（反応産物Ｃに対応）、ｃ（反応産物Ｄ及びＥをハイブリダイズ）、ｄ（反応産物Ｆに対応）、ｅ（反応産物Ｇ及びＨをハイブリダイズ）、ｆ（Ｉ）、ｇ（反応産物Ｊ及びＫをハイブリダイズ）が得られた。反応産物ａとｇの大きさは約１２０ｂｐであり、ｃ及びｅの大きさは約１７０ｂｐ、ｂ、ｄ及びｆの大ききは約１００ｂｐであった。
【００７０】
（ｉｉｉ）工程３：反応産物ａ及びｂ、ｃ及びｄ、ｆ及びｇを別々にハイブリダイズし、反応産物ｅは単独で使用して、各プライマーを添加し（ｓ１及びｓ６が反応産物ａ及びｂのハイブリダイズ体に対応し、ｓ７及びｓ１２が反応産物ｃ及びｄのハイブリダイズ体に対応し、ｓ１３及びｓ１６が反応産物ｅに対応し、ｓ１７及び２２が反応産物ｆ及びｇのハイブリダイズ体に対応する）、ＰＣＲにより増幅させた。１μｌの反応用の各物質（約１００ｎｇ）に対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰｓ（２ｍＭ ｅａｃｈ）、１μｌの各プライマー（１０ｐｍｏｌ）、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）を添加し、最終的に体積が２０μｌとなるよう水を補充した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットを使用し、反応産物Ｉ（反応産物ａ及びｂをハイブリダイズ）、ＩＩ（反応産物ｃ及びｄをハイブリダイズ）、ＩＩＩ（反応産物ｅに対応）及びＩＶ（反応産物ｆ及びｇをハイブリダイズ）を夫々回収した。反応産物Ｉの大きさが約２００ｂｐ、ＩＩの大きさが約２５０ｂｐ、ＩＩＩの大きさが約１４０ｂｐ、ＩＶの大きさが約２３０ｂｐであった。
【００７１】
（ｉｖ）工程４：反応産物Ｉ及びＩＩ、反応産物ＩＩＩ及びＩＶを別々にハイブリダイズさせて、各プライマーを添加し（ｓ１及びｓ１２が反応産物Ｉ及びＩＩのハイブリダイズ体に対応し、Ｓ１３及び２２が反応産物ＩＩＩ及びＩＶのハイブリダイズ体に対応する）、ＰＣＲ増幅を進めた。１μｌの反応用の各物質（約１００ｎｇ）に対して、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ（２ｍＭｅａｃｈ）、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の各プライマー、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）、１２μｌの水を添加した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で３０秒間伸長させる工程を２５回繰り返した。得られた反応産物ＵＰ（反応産物Ｉ及びＩＩをハイブリダイズ）及びＤＯＷＮ（反応産物ＩＩＩ及びＩＶをハイブリダイズ）を１％アガロースゲル電気泳動のより、ゲル回収キットで、回収した。反応産物ＵＰの大きさは約４３０ｂｐ、ＤＯＷＮの大きさが約３４０ｂｐであった。
【００７２】
（ｖ）工程５：反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮをハイブリダイズさせて、プライマー（断片ｓ１及び断片２２）を添加し、ＰＣＲ増幅した。各１μｌ（約１００ｎｇ）の反応産物ＵＰ及びＤＯＷＮに、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μｌｄＮＴＰ（２ｍＭ ｅａｃｈ）、１μｌ（１０ｐｍｏｌ）の各プライマー、０．３μｌのＴａｑ（１Ｕ）、１２μｌの水を添加した。反応条件は、９４℃で１分間の予備変性を行った後、９４℃で３０秒間の変性を行い、４５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長させる工程を２５回繰り返した。得られた反応産物ＷＨＯＬＥ（約７５０ｂｐ）を１％アガロースゲル電気泳動により、ゲル回収キットで、回収した。
【００７３】
上記の工程のステップを図７に示し、上記各工程により得られた反応産物のＰＣＲ検出を図８に示した。
【００７４】
また、上記の７５０ｂｐのＤＮＡ断片及びベクターｐＴＭＦに対して、共にＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）と呼ばれるダブル制限酵素による切断反応を行った。具体的な制限酵素による切断反応条件は、制限酵素の販売元が提供する説明書の記載を参照した。そして、ゲル回収キットにより、ＰＣＲ産物の制限酵素による切断産物（７５０ｂｐ程度）及びｐＴＭＦの切断大断片産物（５２００ｂｐ程度）を回収し、これらを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。具体的な連接及び形質転換反応の過程は、工程（１）に準じる。その後、カナマシン抗性陽性クローンのプラスミドを抽出し、これをＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦと名付けた。
【００７５】
ＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦ及びＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩに対して、共にＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ会社製）と呼ばれるダブル制限酵素による切断反応を行った。具体的な制限酵素による切断反応条件は、制限酵素の販売者が提供する説明書の記載を参照した。そして、７５０ｂｐ程度のＣＥＡｓｃＦｖ／ｐＴＭＦの小さい切断断片産物（抗ＣＥＡｓｃＦｖ）とＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩの大きい切断断片産物（６，０００ｂｐ程度）とを連接し、ＴＯＰ１０株へ形質転換した。具体的な連接及び形質転換反応の過程は、工程（１）に準じる。その後、カナマシン抗性陽性クローンのプラスミドを抽出し、ＰＣＲより判定した。ＰＣＲの判定方法は、工程（１）に準じる。判定した結果を図６に示した。ＰＣＲ産物の大きさは、２１００ｂｐ程度のクローンとなったものが正しく連接したプラスミドであり、それをＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩと名付けた。
【００７６】
＜実施例３＞低温誘導によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの胞内可溶性発現
（１）ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ会社製）への形質転換
実施例２のコンピテントセルの作製方法に従って、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル細胞を作製した。プラスミド抽出キット（上海華舜会社製）の説明書に基づき、プラスミドＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを抽出し、実施例２の工程（１）に準じて形質転換実験を行い、実施例２の通りに判定を進めた。
【００７７】
（２）低温による発現誘導
ＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを有するＢＬ２１（ＤＥ３）を含む細菌を、ＬＢ−Ｋ培地を用いて３７℃で一晩培養した後、モノクローンをとり、これを５ｍｌのＬＢ−Ｋ液体培地に移植して、大きいチューブを用いて３７℃で振とうし、一晩培養（２００ｒｐｍ／分）した。翌日、一晩培養したものを１／１００の割合に基づいて、２５０ｍｌのＬＢ−Ｋ液体の培地へ移植し、３７℃で振とう培養（２００ｒｐｍ／分）を続けて、Ａ６００が０．６に達したとき、ＩＰＴＧ（大連宝生物会社製）を添加して、最終濃度を０．４ｍｍｏｌ／ｍｌとし、３０℃で４時間培養を継続し、低温による発現を誘導した。その後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、菌体を採取し、１／５培養体積のＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、菌体の超音波破砕を行った。更に、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行った。遠心分離した上清成分は、胞内に可溶性発現のＣＥＡ−ＴｓＡｂを含み、遠心分離した沈殿成分は、封入体として発現したＣＥＡ−ＴｓＡｂを含む。遠心分離した沈殿成分を１／５培養体積のＰＢＳで懸濁した。「分子クローン実験指南（金冬雁、黎孟楓逢、１９９６、科学出版社）」の記載に基づき、未還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔにより、上記の超音波処理産物の上清成分及び沈殿成分について、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの発現状況を検出し、数字図像分析器（アメリカ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ会社、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅ ２２００ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）により、胞内の可溶性発現と封入体の発現との相対割合を確定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（図９に示す）及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ（図１０に示す）の結果は、上記の胞内の可溶性発現の方法により、胞内可溶性発現の割合が、７０％程度に達したことを示す。超音波処理産物の上清成分は、そのまま精製することで、次に説明する体外の活性実験に使用することができるので、変性及び複製の工程を少なくし、生産効率を向上させ、生産時間を低下させることができる。
【００７８】
＜実施例４＞ＤＥＡＥアニオン交換樹脂によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの精製
上記の２５０ｍｌの低温誘導された胞内可溶性の発現産物について、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、菌体を採集し、１／５体積（５０ｍｌ）のＤＥＡＥアニオン交換樹脂（ファマシア会社製）、平衡緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｍｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を加えて懸濁し、超音波破砕した。その後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、遠心分離した上清成分をそのまま精製に使用した。
【００７９】
２０ｍｌのＤＥＡＥアニオン交換樹脂を１００ｍｌの平衡緩衝液で懸濁して、カラム（カラムの寸法：１６ｍｍ×２ｃｍ）（上海華舜会社製）に装填し、その後、５倍のカラム体積に相当する平衡緩衝液を流速１ｍｌ／分で流して平衡化した。そして、上記の超音波処理産物を遠心分離した上清成分をそのままカラムに置き、サンプル注入が流速０．２５ｍｌ／分となるようにして、流出した級分、すなわち精製されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを採集した後、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の溶出緩衝液（５００ｍｍｏｌ／ｍｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を流速０．２５ｍｌ／分で流して溶出させた。また、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の０．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨでカラムを洗浄し、２×カラム体積（約４０ｍｌ）の１ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌを流速０．５ｍｌ／分で流してカラムを再生させ、最後に、２×カラム体積（４０ｍｌ）の平衡緩衝液を流速１ｍｌ／分で流してカラムを平衡化し、次の精製に使用した。もし、長時間、使用しないのであれば、細菌が生じないようにするため、４×カラム体積以上の２０％アルコールの水溶液をカラムに流した後、４℃で保存しなけらばならない。
【００８０】
上記の流出した級分をそのまま、未還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、精製の効果を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図１１に示す）は、ＤＥＡＥアニオン交換により精製を行い、超音波処理により上清成分の大部分の雑蛋白が除去されたことにより、数字図像分析器（アメリカ Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ会社、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅ ２２００ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）の分析では、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの純度が７０％程度に達したことを示す。
【００８１】
上記の精製サンプルをＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４及び０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整し、全量を１ｌとした）で一晩透析（４℃）した。透析の体積は５００ｍｌとし、６時間経過後に、一度、透析液を交換した。そして、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により透析したサンプルについて蛋白定量を行った。この具体的な操作は、「精編分子生物学実験指南（顔子穎，王海林逢，金冬雁校，１９９９，科学出版社，）」を参照した。定量のサンプルに、防腐剤として、ＮａＮ３（Ｓｉｇｍａ会社製）を、最終濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるよう添加し、安定剤として、プレスリリース（中国科学院微生物研究所から購入）を最終濃度が０．１５ｍｏｌ／ｌとなるよう添加した。その後、１ｍｌごとに分注し、−８０℃で冷凍保存して備用した。
【００８２】
＜実施例５＞ＥＬＩＳＡ法よるＣＥＡ−ＴｓＡｂの抗原の結合活性の検出
Ｊｕｒｋａｔ細胞膜の抗原の作製：Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞株）（米国典型培養物保蔵中心（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）から購入、番号はＴＩＢ−１５２）を約５×１０６個採集し、１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞の沈殿成分を０．５ｍｌのＰＢＳで懸濁し、超音波処理により破砕した。超音波処理した破砕液を、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した後、超音波処理した上清成分を保留し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により、蛋白濃度の定量を行った。その後、防腐剤として、ＮａＮ３を最終濃度が０．０５％（Ｗ／Ｖ）となるよう添加し、安定剤として、プレスリリース（中国科学院微生物研究所から購入）を最終濃度が０．１５ｍｏｌ／ｌとなるよう添加した。その後、１００μｌごとに分注し、−８０℃で冷凍保存して備用した。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ法の操作工程を以下に説明する。
（１）コート：抗原濃度は、ＣＥＡを１μｇ／ｍｌ（Ｆｉｔｚｅｒａｌｄ会社製，ドイツ）とし、ＣＤ２８−ＦＣｃｈｉｍｅｒａを１μｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ会社製）とし、Ｊｕｒｋａｔ細胞膜抗原を１０μｇ／ｍｌとした。コート体積としては、１０μｌ／孔でコートした。コートの緩衝液の構成は、１．３６ｇのＮａ２ＣＯ３、７．３５ｇのＮａＨＣＯ３、９５０ｍｌの水、１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ又は１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨで、ｐＨ９．２に調整し、水を補加して１ｌとした。ＰＢＳにより３７℃で２時間のコート又は４℃で一晩のコートを行った。
【００８４】
（２）ブロッキング：ＰＢＳで１−２度洗浄した後、ブロッキング液であるＰＢＳＡ（ＰＢＳ−１％ ＢＳＡ（Ｗ／Ｖ）を２００μｌ／孔で加えて、３７℃で１−２時間、ブロッキングした。
【００８５】
（３）サンプルの加入：ＰＢＳで３度洗浄した後、精製サンプルを加入し、１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。サンプルの使用法：１０μｇ／ｍｌの精製ＣＥＡ−ＴｓＡｂを起始濃度として、６段階に希釈して、段階毎に３孔を設立した。
【００８６】
（４）第１抗体の加入：ＰＢＳＴ（ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｖ／Ｖ））で３度洗浄した後、ブロッキング液により１／１，０００倍比となるように、抗ｃｍｙｃ−ｔａｇモノ抗体（９Ｅ１０、ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＴＺ会社から購入）を希釈して１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。
【００８７】
（５）第２抗体の添加：ＰＢＳＴで３度洗浄した後、ブロッキング液により１／１，０００倍比となるように、ＨＲＰ標識された羊抗マウスＩｇＧ（華美会社から購入）を希釈して１００μｌ／孔とし、３７℃で１−２時間、インキュベートした。
【００８８】
（６）呈色：ＰＢＳＴで５度洗浄した後、呈色液（４８．６ｍｌの０．１Ｍクエン酸、５１．４ｍｌの０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４及び水を加入して全量１ｌとしたｐＨ５．０の基質緩衝液を製作し、１０ｍｌ基質緩衝液に４ｍｇのＯＰＤ（（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ会社製））と１５μｌの３０％Ｈ２Ｏ２とを添加し、呈色液を製作した）を１００μ／孔とし、室温の避光条件下で１５−３０分間、呈色させた。
【００８９】
（７）停止反応：停止液（１ｍｏｌ／ｌ ＨＣｌ）を添加して５０μｌ／孔とした。
【００９０】
（８）測定の結果：４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡ法の結果（図１２に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと二種類の純抗原（ＣＥＡ及びＣＤ２８）が特異的に結合することを示す。つまり、Ｊｕｒｋａｔは、多くのＣＤ３を発現するので、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ及びＣＤ３共に特異的に結合することを示す。
【００９２】
＜実施例６＞ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂと腫瘍細胞の結合活性の検出
間接ＦＡＣＳ法を用いて、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの各種腫瘍細胞に対する結合特異性を検出した。下記の表１は、使用された各種腫瘍細胞の腫瘍相関性及び由来を示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】
具体的な操作は、以下のようにした。
（１）上記の４種類の細胞を培養、採集し、ＳＷ１１１６細胞を除き、他の３種類の細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０液体培地（ＧＩＢＣＯ会社製）で、１０％ウシ胎児血清（黒尤江江海生物工程技木会社製）を添加して、５％ＣＯ２、３７℃の培養室で培養した。ＳＷ１１１６細胞の培養は、Ｌ１５液体培地（ＧＩＢＣＯ会社製）で、１０％新生仔ウシ血清血清（黒尤江江海生物工程技木会社製）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の培養室で培養した培養した。細胞が対数期になるまで増殖させた後、種類毎の細胞を５×１０５個採集した。
【００９５】
（２）上記の各細胞を１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、更に１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１０μｇ／ｍｌＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間を静置した。種類毎の細胞について抗体無添加の同型コントロールを作製した。以下の各工程において、このコントロールに対しても試料サンプルと同じ操作が行われた。
【００９６】
（３）１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１／１０００希釈した抗ｃｍｙｃ−ｔａｇ抗体（９Ｅ１０、ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＴＺ会社製）のＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間を静置し続けた。
【００９７】
（４）１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を、１００μｌの１／１０００希釈したＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ羊抗マウスＩｇＧ（ＢＤ会社製）のＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間、放置し続けた。
【００９８】
（５）励起光を４８８ｎｍとするフローサイトメトリー（ＢＤ会社、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）検出により、毎度に１０，０００個の細胞を採集した。
【００９９】
上記の実験結果（図１３に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと各種類の腫瘍細胞との結合能力が異なるので、ＳＫＯＶ３、ＳＷ１１１６に対しては強く結合し、Ａ５４９に対しては弱く結合し、ＭＣＦ−７に対しては結合しないことを示す。
【０１００】
＜実施例７＞ＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＪｕｒｋａｔ細胞との結合活性の検出
直接的ＦＡＣＳ法により、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（北京市血液センターから購入）とＪｕｒｋａｔ細胞との結合活性を検出した。具体的な実験操作は、以下のようにした。
【０１０１】
（１）ＣＥＡ−ＴｓＡｂを蛍光素ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ会社製）で標識した。蛍光標識法は、「現代免疫学実験技術（沈▲心 周汝麟 主編、湖北科学技術出版社出版）」の記載を参照した。
【０１０２】
（２）Ｆｉｃｏｌ法により、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を採集し、これを１０％の新生仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に加え、ガラスの細胞培養バドルヘ移入し、３７℃で一晩置いて、ミクロファージ細胞等の粘附細胞を除去した。未附着の細胞（主にはＴ細胞）を計数した後、これらの５×１０５個細胞を採集し、ＦＡＣＳ法による検測に使用した。Ｆｉｃｏｌ法は、「現代免疫学実験技術（沈▲心 周汝麟 主編、湖北科学技術出版社出版」のに記載に基づいて操作した。
【０１０３】
（３）１０％新生仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室において、二種類の細胞を培養した。細胞が対数期に達した後、５×１０５個の細胞を採集し、ＦＡＣＳ法に使用した。
【０１０４】
（４）上記の二種類の細胞を１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、ＰＢＳで細胞を懸濁し、更に１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、細胞沈殿物を１００μｌの１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣで標識されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むＰＢＳで懸濁し、４℃で３０分間、放置した。種類毎の細胞について抗体無添加の同型コントロールを作製し、以下の各工程は、このコントロールについても、試料サンプルと同じ操作を行った。
【０１０５】
（５）励起光を４８８ｎｍとするフローサイトメトリー（ＢＤ会社、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）により、夫々１０，０００個の細胞を測定した。
【０１０６】
上記の実験結果（図１４に示す）は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂが二種類の細胞と特異的に結合することができることを示す。
【０１０７】
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと腫瘍細胞の結合特異性の実験をまとめると、ＣＥＡ−ＴｓＡｂと、ＰＢＭＣ及びＪｕｒｋａｔ細胞との結合特異性の実験から、ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞及びＣＥＡを発現した腫瘍細胞と、特異的な結合作用があるという結論が得られた。
【０１０８】
＜実施例８＞ＭＴＴ法よるＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した大腸癌細胞ＳＷ１１１６の殺傷活性の検出
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと特異的に結合する大腸癌細胞ＳＷ１１１６を標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）とし、ＰＢＭＣを効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）とし、ｉｎｖｉｔｒｏで、一定の標的細胞と効果細胞の比率となるように（標的細胞／効果細胞、Ｅ／Ｔ）混合し、同時に、一定濃度のＣＥＡ−ＴｓＡｂを添加し、その後３７℃で４８時間、培養し、更にＭＴＴ法により腫瘍細胞の存活の状況を測定した。これにより、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した大腸癌細胞ＳＷ１１１６の殺傷活性を測定した。具体的な操作は以下のようにした。
【０１０９】
（１）ＰＢＭＣを採集し、具体的な操作は、実施例７と同様とした。
【０１１０】
（２）ＳＷ１１１６細胞を採取し、具体的な操作は、実施例６と同様とした。
【０１１１】
（３）Ｌ１５培地（ＧＩＢＣＯ会社から購入）を用いて効果細胞（ＰＢＭＣ）及び標的細胞（ＳＷ１１１６）の濃度を調整し、ＳＷ１１１６細胞の密度を１×１０５個／ｍｌとし、１０μｌ／孔として、９６孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に加えた。同時に、異なる濃度のＰＢＭＣを添加し、別々に、異なる効果細胞と標的細胞の割合（別々に１、５、１０とする）で、１０μｌ／孔とし、上記の細胞プレートに添加した。また、同時に、Ｌ１５培地でＣＥＡ−ＴｓＡｂの濃度を５倍に濃縮し、使用した抗体濃度（例えば、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの使用濃度は１μｇ／ｍｌであり、その場合、濃縮液の濃度は５μｇ／ｍｌである）とした。抗体の濃縮液を５０μｌ／孔とし、既に効果細胞及び標的細胞を含む９６孔の細胞プレートに添加し、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で４８時間、培養した。種類毎のサンプルについては、４個の複孔がある。同じく、毎種の効果細胞と標的細胞の比率は、抗体不添加の陰性コントロール、単独の効果細胞又は標的細胞の陰性コントロール及び細胞無添加の培地の陰性コントロールを作製した。
【０１１２】
（４）細胞の培地を捨てた後、ＰＢＳ（３００μｌ／孔）で、一度洗浄し、更にＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ会社製）溶液（濃度２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、ＰＢＳ（３００μｌ／孔）で一度洗浄し、ＤＭＳＯ（２００μｌ／孔）（Ｓｉｇｍａ会社製）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、Ａ６００を測定した。
【０１１３】
（５）特異性殺傷率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）は下記の計算式により求められた。
特異性殺傷率（％）＝［Ａ６００（Ｅ／Ｔ）−Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）］／［Ａ６００（Ｅ／Ｔ）−Ａ６００（Ｍ）］×１００％
【０１１４】
上記のＡ６００（Ｅ／Ｔ）は、種類毎の抗体無添加の実標比の毎種類の効果細胞と標的細胞の比率の抗体無添加の陰性コントロールのＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）は、種類毎のサンプルのＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｍ）は、無細胞の培地における陰性コントロールのＡ６００測定値である。
【０１１５】
まず、上記の方法により、効果細胞と標的細胞の比率が異なる（１、５、１０）ＣＥＡ−ＴｓＡｂが、Ｔ細胞を介して腫瘍細胞の殺傷率に与える影響を比べた。その結果（図１５）は、殺傷率は、効果細胞と標的細胞の比率が高くなるに連れて高くなることを示した。効果細胞と標的細胞の比率を１としたとき、特異性殺傷効率は最も低く、効果細胞と標的細胞の比率を５としたときが、２番目であり、効果細胞と標的細胞の比率を１０としたとき、特異性殺傷率は最も高くなった。この最も高い特異性殺傷率は８５％程度に達した。このことは、特異性殺傷率は、単に効果細胞と標的細胞の比率ばかりではなく、他の要素も影響していることを示す。更に、抗体濃度が特異殺傷率に与える影響を検討するため、効果細胞と標的細胞の比率を５とし、特異性殺傷率の抗体濃度（０．４ｎｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌ）による依存性曲線を測定した。その結果（図１６に示す）、特異性殺傷率の変化は、４つ段階に分けられた。すなわち、段階１としては、６μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間としたとき、特異性殺傷率と抗体濃度とは、負相関が現れ、６μｇ／ｍｌとしたときに、特異性殺傷率は最高に達した。段階２としては、特異性殺傷率と抗体濃度とは、正相関が現れ、７５０ｎｇ／ｍｌに達したときには、特異性殺傷率は最低に達した。段階３としては、２４ｎｇ／ｍｌ−７５０ｎｇ／ｍｌの間としたときには、特異性殺傷率と抗体濃度とは、負相関が現れ、２４ｎｇ／ｍｌとしたとき合には、特異性殺傷率が最高に達した。段階４としては、特異性殺傷率と抗体濃度は、再び正相関が現れる。全過程において特異性殺傷率は、２つの最大値がある。すなわち、６μｇ／ｍｌとしたときは、約８５％であり、２４ｎｇ／ｍｌとしたときは、約７０％である。この結果は、低い効果細胞と標的細胞の比率及び極めて低い抗体濃度であっても、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、Ｔ細胞を介して、依然として腫瘍細胞を殺傷する高い能力を保持していることを示す。
【０１１６】
＜実施例９＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程における細胞形態の観察
ＣＥＡ−ＴｓＡｂと特異的に結合する大腸癌細胞ＳＷ１１１６を標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ）として、ＰＢＭＣを効果細胞（Ｅｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌｓ）とし、これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで効果細胞と標的細胞との比率（Ｅ／Ｔ）が５となるよう混合し、一定濃度（７５０ｎｇ／ｍｌ）のＣＥＡ−ＴｓＡｂを添加し、３７℃で２０−４０時間培養し、更にＯＬＹＭＰＵＳ ＩＭＴ−２ 倒立型顕微鏡により、効果細胞による腫瘍細胞の殺傷状況を観察し、顕微鏡写真を撮影した。４０倍レンズで２０時間、観察及び記録した。その結果（図１８に示す）、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの効果細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程は、以下の４つの工程に分けることができた。まず、標的細胞を順序的に、付着細胞を剥離（図１８Ｂ）し、その後、効果細胞が腫瘍細胞の表面に集まる（図１８Ｃ）。集まっている効果細胞の数の増加に連れて、腫瘍細胞の表面には、突起が発生する（図１８Ｄ）。最後に、細胞の縁がファジーになって、細胞は完全に破砕し、死滅した（図１８Ｅ、Ｆ、Ｇ）。
【０１１７】
＜実施例１０＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程における、ＭＴＴ法によるＴ細胞の増加の検出
ＭＴＴ法によるＴ細胞の増加を検出し、これによりＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介してＳＷ１１１６細胞を殺傷する過程を判断し、Ｔ細胞の活性化の状況を観察した。具体的な操作は、以下のようにした。
【０１１８】
（１）ＰＢＭＣを採集した。具体的な操作は実施例７と同様である。
【０１１９】
（２）ＳＷ１１１６細胞を培養、採集した。具体的な操作は実施例６と同様である。
【０１２０】
（３）Ｌ１５培地で、ＳＷ１１１６細胞の濃度を１×１０６個／ｍｌに調整し、その後、マイトマイシンＣ（最終濃度２５μｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ会社製）を添加し、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで３度洗浄し、残りのマイトマイシンＣを除去して、これを備用した。
【０１２１】
（４）Ｌ１５培地で、効果細胞（ＰＢＭＣ）の濃度を５×１０５個／ｍｌとし、標的細胞（ＳＷ１１１６）を１×１０５個／ｍｌとなるよう調整した。ミクスチャーした後、１０μｌ／孔とし、９６孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に添加した。また、Ｌ１５培地でＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度（抗体の使用濃度は、最終濃度の５倍であり、例えば、最終濃度が１μｇ／ｍｌであれば、抗体の濃度は５μｇ／ｍｌである）を調整し、５０μｌ／孔で、既に、効果細胞と標的細胞とを含む９６孔の細胞プレートに添加した。その後、３７℃でＣＯ２（５％）の培養室で、４日間培養した。抗体無添加のコントロール、単独の効果細胞又は標的細胞のコントロール及び無細胞培地のコントロールを夫々作製した。上記の試料サンプルについて、サンプル毎に４孔の繰り返しを用意した。
【０１２２】
（５）１，０００ｇで１０分間、遠心分離し、細胞培地の上清成分を捨てて、ＰＢＳ（３０μｌ／孔）で、細胞沈殿成分を懸濁し、更に、１，０００ｇで１０分間、遠心分離し、遠心分離した上清成分を捨てて、更にＭＴＴ溶液（濃度：２５μｇ／ｍｌ、２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で４時間インキュベートした後、ＰＢＳ（３０μｌ／孔）で、１度を洗浄し、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、２００μｌ／孔）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、Ａ６００を測定した。
【０１２３】
（６）特異性インデックス（ＳＩ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｄｅｘ）の計算式は、以下のようにした。
ＳＩ＝［Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）／Ａ６００（Ｅ／Ｔ）］
上記のＡ６００（Ｅ／Ｔ）は、抗体無添加のコントロール孔のＡ６００測定値であり、Ａ６００（Ｅ／Ｔ／Ａ）は抗体を添加したサンプル孔のＡ６００測定値である。
【０１２４】
図１７に示されるように、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が変化するに従って、ＳＩの変化は、３つ段階に分けられる。まず、段階１としては、抗体濃度を７５０ｎｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間としたとき、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間には正相関の変化が現れる。ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度を７５０ｎｇ／ｍｌとしたとき、最低に達する。段階２としては、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間には負相関の変化が現れ、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度を４７ｎｇ／ｍｌ程度としたとき、最高に達する。段階３としては、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が４７ｎｇ／ｍｌより小さいとき、ＳＩとＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度との間に正相関の変化が現れ、０．７ｎｇ／ｍｌで、ＳＩは最低に達する。この結果は、低いＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度としたとき、ＣＥＡ／ＴｓＡｂは、依然として、Ｔ細胞を活性化する能力を有することが示された。ＳＩの変化法則を腫瘍細胞の特異性殺傷率の変化法則と比べると、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率は、Ｔ細胞の活性化の程度と直接的に相関しており、Ｔ細胞の活性化の程度が高ければ、腫瘍細胞の殺傷効率が高くなることが発見された。
【０１２５】
上述の実施例４、５、６、７、８、９の実験結果をまとめると、上記の殺傷過程において、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの作用は、主に、二つの方面がある。その一つが、腫瘍細胞及び効果細胞（Ｔ細胞）の間に直接的な連係を立てる、すなわち、標的化作用を現し、腫瘍細胞の回りの効果細胞を活性化させ、腫瘍細胞を殺傷する機能を発現する。この作用は、図１９に示されたメカニズムのモデルにまとめた。すなわち、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、生体に使用されると、Ｔ細胞と、又はＣＥＡを発現した腫瘍細胞と特異的な結合作用を行い、結果的に、Ｔ細胞を腫瘍細胞の回りへ標的化する作用を発揮する。また、ＣＥＡ−ＴｓＡｂは、ＣＤ３と、又はＣＤ２８と特異的に結合し、Ｔ細胞を活性化する。活性化されたＣＴＬ細胞は、直接的に腫瘍細胞を殺傷し、活性化されたＴＨ細胞は、細胞因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γが挙げられる）を分泌し、活性化ＣＴＬ、ＮＫ細胞等の細胞性免疫の効果細胞を補助し、間接的に腫瘍細胞を殺傷する。
【０１２６】
＜実施例１１＞ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷メカニズムの検出
活性化されたＣＴＬ細胞は、３つの経路により腫瘍細胞を殺傷することができる。そのうち、一つの経路は、ｐｅｒｆｏｒｉｎを分泌し、このｐｅｒｆｏｒｉｎは、腫瘍細胞の表面に微小孔を造成して細胞を破砕させ、更に、細胞をネクローシスさせる。他の活性化されたＣＴＬ細胞から分泌されたＧｒａｎｚｙｍｅが、上記の微小孔から腫瘍細胞内に侵入し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、また、活性化きれたＣＴＬ細胞の表面に誘導されて発現したＦＡＳＬと腫瘍細胞の表面のＦＡＳとが相互的に作用して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。ＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介して行う腫瘍細胞の殺傷メカニズムを詳しく分析するため、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）及びＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ（ＢＤ会社から購入）を使用し、殺傷された腫瘍細胞を標識し、その後、蛍光顕微鏡とＦＡＣＳ法により、腫瘍細胞のネクローシス及びアポトーシスの状況、その割合を観察、検出した。具体的な操作は、以下のようにした。
【０１２７】
（１）ＰＢＭＣを採集し、具体的な操作は、実施例７と同様である。
【０１２８】
（２）ＳＷ１１１６細胞を培養、採集し、具体的な操作は、実施例６と同様である。
【０１２９】
（３）Ｌ１５培地を使用して、効果細胞であるＰＢＭＣと標的細胞であるＳＷ１１１６の濃度とを１×１０５個／ｍｌとなるように調整した。ミクスチャーした後、１．０ｍｌ／孔となるように、４８孔の細胞プレート（Ｎｕｎｃ会社製）に添加した。何れもＬ１５培地を使用して、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ濃度が５μｇ／ｍｌとなるように調整し、２５０μｌ／孔とした細胞培養孔に添加し、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの使用濃度を１μｇ／ｍｌとなるように調整し、３７℃、ＣＯ２（５％）の培養室で２０時間培養した。また、抗体無添加のコントロール、単独の効果細胞及び単独の標的細胞のコントロールを夫々作製した。
【０１３０】
（４）４８孔の細胞プレートを１，０００ｇで１０分間、遠心分離した後、培地の上清成分を捨てて、０．３％トリプシン（Ｓｉｇｍａ会社製）（ｗ／ｖ）を用いて附着細胞を１分間（５０μｌ／孔）かけて消化し、１０％ウシ胎児血清のＲＰＭＩ１６４０を添加（１ｍｌ／孔）し、細胞をソフトに懸濁し、１．５ｍｌの遠心分離チューブに移入して、１，０００ｇで１０分間、遠心分離した。
【０１３１】
（５）ＰＢＳ（５００μｌ／チューブ）で、細胞を一度洗浄し、更に、結合緩衝液（ＢＤ会社から購）（１００μｌ／チューブ）を添加し、細胞沈殿成分を懸濁し、各チューブに、５μｌのＰＩ溶液（５０μｇ／ｍｌ）及び３μｌのＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ溶液を添加し、４℃で避光的に１５分間維持した。
【０１３２】
（６）チューブ毎に、３００μｌの結合緩衝液を添加し、少しの細胞の細胞スライドを採取して、ＬｅｉｃａＤＭＲＡ２蛍光顕微鏡により、殺傷された腫瘍細胞の形態及び蛍光標識状況を観察した。分析は、ＱＦＩＳＨソフトウェア（Ｌｅｉｃａ会社製）を使用して行われた。その結果を図２０に示す。
【０１３３】
（７）ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒによりダブル蛍光を検出した（ＦＬ１及びＦＬ２）。その条件は、全２０，０００個の細胞を測定し、励起波長を４８８ｎｍｏｌ／Ｌとした。その結果を図２１に示す。
【０１３４】
図２０は、早期アポトーシス細胞、晩期アポトーシス細胞及びネクローシス細胞の差異を示す。早期アポトーシス細胞の表面には、緑色の蛍光（ＦＩＴＣ）のみが見られるが、晩期アポトーシス細胞の表面には、緑色と同時に、赤色（ＰＩ）の二種類の蛍光が見られ、ネクローシス細胞の表面には、主に赤色の蛍光が見られ、同じく若干の緑色蛍光が見られた。
【０１３５】
図２１は、４つに区分された、夫々異なる４つの状態の細胞を表している。左下区は存活の腫瘍細胞であり、右下区は早期のアポトーシス細胞であり、右上区は晩期アポトーシス細胞であり、左上区はネクローシス細胞である。抗体無添加のコントロールサンプルにおいて、４つ状態の細胞の割合は、順に、９０．１７％、１．６６％、２．２３％、５．９４％であったが、抗体の添加後、４つ状態の細胞の割合は、順に、５２．８３％、１６．１２％、２１．２５％、９．８６％となった。この結果は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの添加後、活性化されたＴ細胞は、腫瘍細胞のネクローシス及びアポトーシスを誘導することにより、殺傷効応を発現する。また、抗体無添加のコントロールと比べて、早期アポトーシス細胞及び晩期アポトーシス細胞の割合が、９倍程度高くなり、ネクローシス細胞の割合が、１倍高くなったことが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによるＣＥＡ−ＴｓＡｂのベクターのポリクローニングＤＮＡを構築するスケジュールの概略図。図中、番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１は、各構築において用いられた合成核酸断片を表し、符合Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及び記号ＵＰ、ＤＯＷＮは、別々の構築工程の中間産物を表し、ＷＨＯＬＥは最終産物を表す。
【図２】図２はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによるＣＥＡ−ＴｓＡｂベクターのポリクローニングＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動の検出結果を示す図。図中、第１レーンはＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物、第２レーンはＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲ産物及びＤＬ２０００ＤＮＡ分子量マーカー（大連宝生物会社製）。
【図３】図３はポリクローニングサイト（ｓｉｔｅ）のＤＮＡ断片の核酸配列であり、制限酵素の切断位点及びその構成を示す図。
【図４】図４はＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築の操作工程の概略図。
【図５】図５はＣＥＡ−ＴｓＡｂを構築するための各中間ベクター及び構築されたＣＥＡ−ＴｓＡｂを含むベクターの概略図。
【図６】図６はアガロースゲル電気泳動によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの構築過程における各中間産物と最終産物の検出結果を示す図。図中、第１レーンはプラスミドｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第２レーンはプラスミドＣＤ２８／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第３レーンはプラスミドＣＤ３ｓｃＦｖ／ＣＤ２８ＶＨ／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第４レーンはプラスミドＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩを鋳型としたＰＣＲ産物、第５レーンはＤＬ２０００ＤＮＡ分子量マーカー（大連宝生物会社製）。
【図７】図７はＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる、マウス由来の抗ＣＥＡ単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂをコードするＤＮＡを構築するためのスケジュールの概略図。図中、数字１−２２は、構築のための合成核酸の断片を示し、符号Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ローマ数字Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及び記号ＵＰ、ＤＯＷＮは、別々に構築過程における中間産物を示し、ＷＨＯＬＥが最終産物を示す。
【図８】図８はアガロースゲル電気泳動によるＯｖｅｒｌａｐ−ＰＣＲによる、抗ＣＥＡ単鎖抗体を構築するためのＤＮＡ断片の検出を示す図。図中、第１及び第９レーンはＤＮＡ分子量マーカーＤＬ２０００（大連宝生物会社製）であり、第２−第５レーンは、順に、構築過程における中間産物Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶであり、第６及び第７レーンは、別々の構築の過程における中間産物ＵＰ及びＤＯＷＮであり、第８レーンは、単鎖抗体断片の全長であるＷＨＯＬＥを示す。
【図９】図９はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる低温誘導で胞内に可溶的に発現されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中、第１レーンは超音波処理した沈澱成分であり、第２レーンは超音波処理した上清成分であり、第３レーンは低分子量蛋白質のマーカー（シャツハイ生物化学研究所から購入）であり、第４レーンは超音波処理したｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の沈澱成分であり、第５レーンはｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の上清成分であり、矢印はＣＥＡ−ＴｓＡｂの特異性バンドを示す。
【図１０】図１０はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによる低温誘導で発現されたＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中、第１レーンは予着色蛋白質の分子量マーカー（ＮＥＢ会社製）であり、第２レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの発現産物の沈澱成分であり、第３レーンは超音波処理したｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の沈澱成分であり、第４レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂ／ｐＴＲＩの発現産物の上清成分であり、第５レーンはｐＴＲＩ空ベクターにより発現された産物の上清成分を示す。
【図１１】図１１はＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＤＥＡＥアニオン交換精製の検出結果を示す図。図中、第１レーンはｐＴＲＩ空ベクターで表現された産物の超音波処理した上清成分であり、第２レーンは超音波処理したＣＥＡ−ＴｓＡｂで表現された産物の上清成分であり、第３レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたカラムからの流出級分であり、第４レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたＮａＣｌ溶出級分であり、第５レーンはＤＥＡＥアニオン交換で精製されたＮａＯＨ溶出級分であり、第６レーンは低分子量蛋白質の分子量マーカー（シャッハイ生物化学研究所から購入）であり、矢印は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂの特異的なバンドを示す。
【図１２】図１２はＥＬＩＳＡ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂの検出結果を示す図。図中の曲線は、夫々４つの異なる検出結果を示す。第１曲線は１μｇ／ｍｌのＪｕｒｋａｔ細胞膜抗原、第２曲線は１μｇ／ｍｌのＣＥＡ抗原、第３曲線は１μｇ／ｍｌのＣＤ２８抗原、第４曲線は無抗原の検出結果を示す。
【図１３】図１３はＦＡＣＳ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂと複数の腫瘍細胞との結合特異性の検出結果を示す図。図中、陰影を有するピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体が不添加するコントロール試料の測定結果であり、陰影を有さないピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体が添加する試料の測定結果を示す。
【図１４】図１４はＦＡＣＳ法によるＣＥＡ−ＴｓＡｂとＪｕｒｋａｔ細胞又はＰＢＭＣ細胞との結合特異性の検出結果を示す図。図中、陰影を有するピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体不添加のコントロール試料の測定結果であり、陰影を有さないピークは、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ抗体を添加した試料の測定結果を示す。
【図１５】図１５はＭＴＴ法による、異なる効果細胞と標的細胞の比率でＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率に与える影響の検出結果を示す図。３つの曲線は、夫々異なる効果細胞と標的細胞の比率（Ｅ／Ｔ＝１０、５、１）であり、腫瘍細胞の殺傷効率と抗体濃度との関連性を示す。図中、第１曲線は効果細胞と標的細胞の比率が１０であるとき、第２曲線は効果細胞と標的細胞の比率が５であるとき、第３曲線は効果細胞と標的細胞の比率が１であるときを示す。
【図１６】図１６はＭＴＴ法による抗体濃度がＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷効率に対する影響を検出した結果を示す図。図中には、特異性殺傷率の変化を４段階に分類して示しており、その段階１は、６μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間において、特異性殺傷率と抗体濃度と負相関的に変化し、６μｇ／ｍｌで特異性殺傷率が最高に達することを、段階２は、特異性殺傷率と抗体濃度とが正相関的に変化して７５０ｎｇ／ｍｌで特異性殺傷率が最低に達することを、段階３は、２４ｎｇ／ｍｌ−７５０ｎｇ／ｍｌの間において、特異性殺傷率と抗体濃度とが負相関的に変化し、２４ｎｇ／ｍｌにおいて特異性殺傷率が最高に達することを、段階４は、特異性殺傷率と抗体濃度とが、再び正相関的な関係となることを示す。
【図１７】図１７はＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程において、抗体濃度がＴ細胞の増殖に与える影響を示す図。図中、ＳＩの変化を３段階に分類して示しており、その段階１は、抗体濃度が、７５μｇ／ｍｌ−１２μｇ／ｍｌの間において、ＳＩと抗体濃度とが正相関的に変化して、７５μｇ／ｍｌとしたときに、最低に達することを、段階２は、ＳＩと抗体濃度とが負相関的に変化し、４７ｎｇ／ｍｌ程度としたときに、最高に達することを、段階３は、４７ｎｇ／ｍｌより小さいときに、ＳＩと抗体濃度とが正相関的に変化し、０．７ｎｇ／ｍｌとしたときに、最低に達することを示す。
【図１８】図１８は、ＣＥＡ−ＴｓＡｂのＴ細胞を介した腫瘍細胞の殺傷過程における細胞の形態の観察記録を示す図。図中、Ａは、ＳＷ１１１６細胞を単独で２０時間培養した後の細胞形態を、Ｂ−Ｉは、効果細胞と標的細胞の割合を５とし、ＳＷ１１１６細胞及びＰＢＭＣ細胞と共にインキュベートし、ＣＥＡ−ＴｓＡｂ（最終濃度７５０μｇ／ｍｌ）を添加し、２０時間インキュベートした後の、殺傷段階の異なる各種類の細胞形態を示し、そのうち、Ｂは、標的細胞が壁から剥離し始める様子、Ｃは効果細胞が標的細胞の表面に集まり始める様子、Ｄは標的細胞の表面の局部領域が突出した様子、Ｅは標的細胞の局部領域が破砕された様子、Ｆは標的細胞の全体が破砕された様子、Ｇ−Ｉは標的細胞が漸次的に破砕された様子を示す。
【図１９】図１９はＣＥＡ−ＴｓＡｂがＴ細胞を介して腫瘍細胞を殺傷するメカニズムの概略図。上図はＣＥＡ−ＴｓＡｂの構造の概略図であり、下図はＣＥＡ−ＴｓＡｂの腫瘍細胞の殺傷するメカニズムであり、すなわち、ＣＥＡ−ＴｓＡｂが、腫瘍細胞及びＣＴＬ細胞と特異的に結合し、ＣＴＬ細胞の活性化により腫瘍細胞を殺すことを示す。
【図２０】図２０はＰＩ及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖでダブル標識した殺傷された腫瘍細胞（ＳＷ１１１６）の蛍光顕微鏡による観察記録を示す図。図中、Ａ、Ｂ及びＣは夫々、３種類の異なる状態で殺傷された腫瘍細胞（順に、ネクローシス細胞、晩期アポトーシス細胞及び早期アポトーシス細胞）であり、第２列が、緑色蛍光の単色による検出結果であり、第３列が、赤色蛍光の単色による検出結果であり、第１列は、Ｌｅｉｃａ ＱＦＩＳＨソフトウェアを用いて、上記２種類の単色蛍光の検出結果を積み重ねて示す。
【図２１】図２１はＦＡＣＳ法によるＰＩ及びＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖでダブル標識した殺傷された腫瘍細胞（ＳＷ１１１６）の検出結果を示す図。明確に異なる殺傷状態を示ている区；左下区（Ｌｏｗ Ｌｅｆｔ，ＬＬ）が生細胞（ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）であり、右下区（Ｌｏｗ Ｒｉｇｈｔ，ＬＲ）が、早期アポトーシス細胞（ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）であり、左上区（Ｕｐ Ｌｅｆｔ，ＵＬ）が、ネクローシス細胞（ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）であり、右上区が（Ｕｐ Ｒｉｇｈｔ，ＵＲ）が晩期アポトーシス細胞（ｌａｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｅｌｌｓ）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖の三重特異性抗体であって、抗癌胎児性抗原の抗体、ペプチドリンカー、抗ヒトＣＤ３抗体、ペプチドリンカー及び抗ヒトＣＤ２８抗体を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成することを特徴とする単鎖の三重特異性抗体。
【請求項２】
前記抗癌胎児性抗原の抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体は、単鎖抗体の断片、抗体のＦａｂ断片又は抗体の単区域（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）断片とすることを特徴とする請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項３】
前記糸状な単鎖の三重特異性抗体は、Ｃ−末端にｃ−ｍｙｃ−ｔａｇ及び／又はｈｉｓ−ｔａｇを有する／有さないことを特徴とする請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項４】
前記糸状な単鎖の三重特異性抗体は、抗癌胎児性抗原の単鎖抗体、ＦＣペプチドリンカー、抗ヒトＣＤ３単鎖抗体、ＨＳＡペプチドリンカー及び抗ＣＤ２８抗体の重鎖の断片を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列を有するＣＥＡ−ＴｓＡｂであることを特徴とする請求項２に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項５】
前記抗癌胎児性抗原の単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項６】
前記抗ヒトＣＤ３単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項７】
請求頂４に記載の単鎖の三重特異性抗体をコードするＤＮＡであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表される核酸配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
発現ベクターであって、請求項４に記載の単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂをベクターｐＴＲＩにクローニングして構築されることを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１１】
単鎖の三重特異性抗体が発現される菌体を１／５培養体積の超音波緩衝液で懸濁し、超音波による破砕処理を行った後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、前記超音波緩衝液は、２０ｍｍｏｌ／ｍｌのＮａＣｌと５０ｍｍｏｌ／ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌとから成り、この混合液のｐＨを８．０とする工程と、
前記遠心分離した上清成分を、５倍カラム体積の平衡緩衝液により平衡化したＤＥＡＥアニオン交換カラムに置いて、流出した級分を採集し、初歩的な精製を行って単鎖の三重特異性抗体を得る工程と、を含むことを特徴とする単鎖の三重特異性抗体の精製方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体及び薬理学的に容許されるキャリアーを含むことを特徴とする抗癌胎児性抗原を発現する腫瘍の治療用又は予防用薬品組合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体の抗癌胎児性抗原を発現する腫瘍の治療又は予防用薬品としての使用。
【請求項１】
単鎖の三重特異性抗体であって、抗癌胎児性抗原の抗体、ペプチドリンカー、抗ヒトＣＤ３抗体、ペプチドリンカー及び抗ヒトＣＤ２８抗体を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成することを特徴とする単鎖の三重特異性抗体。
【請求項２】
前記抗癌胎児性抗原の抗体、抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ３抗体及び抗ヒトＣＤ２８抗体は、単鎖抗体の断片、抗体のＦａｂ断片又は抗体の単区域（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）断片とすることを特徴とする請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項３】
前記糸状な単鎖の三重特異性抗体は、Ｃ−末端にｃ−ｍｙｃ−ｔａｇ及び／又はｈｉｓ−ｔａｇを有する／有さないことを特徴とする請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項４】
前記糸状な単鎖の三重特異性抗体は、抗癌胎児性抗原の単鎖抗体、ＦＣペプチドリンカー、抗ヒトＣＤ３単鎖抗体、ＨＳＡペプチドリンカー及び抗ＣＤ２８抗体の重鎖の断片を順序的に連接し、糸状な単鎖の融合蛋白質を形成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列を有するＣＥＡ−ＴｓＡｂであることを特徴とする請求項２に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項５】
前記抗癌胎児性抗原の単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項６】
前記抗ヒトＣＤ３単鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単鎖の三重特異性抗体。
【請求項７】
請求頂４に記載の単鎖の三重特異性抗体をコードするＤＮＡであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表される核酸配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
発現ベクターであって、請求項４に記載の単鎖抗体であるＣＥＡ−ＴｓＡｂをベクターｐＴＲＩにクローニングして構築されることを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１１】
単鎖の三重特異性抗体が発現される菌体を１／５培養体積の超音波緩衝液で懸濁し、超音波による破砕処理を行った後、室温、１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、前記超音波緩衝液は、２０ｍｍｏｌ／ｍｌのＮａＣｌと５０ｍｍｏｌ／ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌとから成り、この混合液のｐＨを８．０とする工程と、
前記遠心分離した上清成分を、５倍カラム体積の平衡緩衝液により平衡化したＤＥＡＥアニオン交換カラムに置いて、流出した級分を採集し、初歩的な精製を行って単鎖の三重特異性抗体を得る工程と、を含むことを特徴とする単鎖の三重特異性抗体の精製方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体及び薬理学的に容許されるキャリアーを含むことを特徴とする抗癌胎児性抗原を発現する腫瘍の治療用又は予防用薬品組合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の単鎖の三重特異性抗体の抗癌胎児性抗原を発現する腫瘍の治療又は予防用薬品としての使用。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００７−５３５９１５（Ｐ２００７−５３５９１５Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０５３５９（Ｐ２００７−５０５３５９）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００４０８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５４５６
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０６３３２３４０）北京安波特基因工程技▲術▼有限公司 (1)
【出願人】（５０６３３２９８２）▲東▼莞豪▲發▼生物工程技▲術▼▲開▼▲發▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００４０８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５４５６
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５０６３３２３４０）北京安波特基因工程技▲術▼有限公司 (1)
【出願人】（５０６３３２９８２）▲東▼莞豪▲發▼生物工程技▲術▼▲開▼▲發▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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