抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法
【課題】新規な抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法を提供する。
【解決手段】固相担体に固定化された前記抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、を含む、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングする方法。また、ファージ提示型人工抗体ライブラリーを用いた本スクリーニング方法により得られた特異的抗体の抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内で発現させる工程と、前記宿主細胞又はその培養液から前記抗体を回収する工程とを含む、抗ＲＮＡ抗体の製造方法。
【解決手段】固相担体に固定化された前記抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、を含む、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングする方法。また、ファージ提示型人工抗体ライブラリーを用いた本スクリーニング方法により得られた特異的抗体の抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞内で発現させる工程と、前記宿主細胞又はその培養液から前記抗体を回収する工程とを含む、抗ＲＮＡ抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、生物の発生、分化、及び、がんをはじめとする疾患に関与することが知られており（例えば、非特許文献１、２参照）、医薬開発の標的としても有望である。
【０００３】
生体におけるｎｃＲＮＡを検出するため、現在はＰＣＲ法や核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法が用いられている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、ＰＣＲ法では検査組織をホモジナイズするため、組織や細胞におけるｎｃＲＮＡの局在情報は得ることができない。また、核酸プローブハイブリダイゼーション法は、処理に２〜３日かかることに加え、変性剤を用いることから特異的抗体を用いたタンパク質の検出法と併用することが極めて困難という短所がある。
【０００４】
一方、抗ＲＮＡ抗体を用い、周知の免疫組織化学的手法によってｎｃＲＮＡを検出することができれば、処理時間が短縮できるのに加え、他の抗原に特異的な抗体を用いた多重標識も可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fabbri M., Calin G.A., Beyond genomics: interpreting the 93% of the human genome that does not encode proteins. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., May 13(3): 350-358, 2010
【非特許文献２】Mattick J.S., Makunin I.V., Non-coding RNA, Human Molecular Genetics, Vol. 15, Review Issue 1: R17-R19, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＲＮＡはヌクレアーゼにより容易に分解されるため、ＲＮＡ抗原を宿主動物に免疫する一般的な抗体調製方法によって抗ＲＮＡ抗体を効率的に調製することは大変困難であった。
【０００７】
そこで、本発明は、新たな抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抗体ライブラリーから抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングしようと試みた。しかし、抗原ＲＮＡはタンパク質と異なり直接ウェルに固定化できないことが問題となった。また、抗原ＲＮＡが分解されやすい点も問題となった。
【０００９】
一方、ビオチン標識法、末端ビオチン標識法、あるいはアミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡを使用した場合には、抗体ライブラリーから抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングできた。このようにして、発明者らは、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１１】
ここで、抗体ライブラリーは、ファージ提示型人工抗体ライブラリーであることが好ましい。また、このファージ提示型人工抗体ライブラリーは、（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、（ＩＩ）ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、（ＩＶ）ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、を含む製造方法によって製造された一本鎖抗体ライブラリーであることがより好ましい。
【００１２】
本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡにビオチンが結合しており、固相担体に固定化されているビオチン特異的抗体に対しそのビオチンが結合することによって、抗原ＲＮＡが固相担体に固定化されていることが好ましく、また、非特異的ＲＮＡの存在下で、抗原ＲＮＡと人工抗体とを接触させることがより好ましい。
【００１３】
本発明に係るスクリーニング方法は、工程（ｂ）で回収された抗体を抗体ライブラリーとして用い、一連の工程（ａ）（ｂ）をさらに２回以上行うことが、さらに好ましい。
【００１４】
本発明に係る抗原ＲＮＡに特異的な抗体の製造方法は、本発明に係るスクリーニング方法のいずれかによって、抗原ＲＮＡに特異的なファージ提示型人工抗体をスクリーニングする工程と、そのスクリーニングによって得られたファージから、人工抗体の抗原結合部位をコードするＤＮＡを回収する工程と、回収されたＤＮＡを有し、抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、抗体を発現させる工程と、宿主細胞又はその培養液から抗体を回収する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
なお、本明細書において「抗体」は、任意の抗原と結合する抗原結合部位を有し、その抗原と結合することができる分子を指し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）と定常部（Ｃ部）を有する免疫グロブリン分子、抗原結合部位のみから成る分子、Ｆａｂ抗体分子のように抗原結合部位と定常部の一部分から成る分子、Ｆｖ抗体のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）のみから成る分子、及び、一本鎖抗体等のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）とそれらを連結するリンカー部位から成る分子のいずれも含むものとする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態において、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体をファージ提示型人工抗体ライブラリーからスクリーニングする際に、スクリーニング工程を計２回行った後（Ａ）、及びスクリーニング工程を計３回行った後（Ｂ）に得られた、各ファージ提示型人工抗体のクローンが有するインサートＤＮＡを電気泳動して得られた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、抗原ＲＮＡに特異的な抗体を提示するファージを増幅するために用いた大腸菌が保有するｐＦＳＤ４ａベクターのベクターマップである。
【図３】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgH4zeo発現ベクターのベクターマップである。
【図４】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgK4neo発現ベクターのベクターマップである。
【図５】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgL4neo発現ベクターのベクターマップである。
【図６】本発明の一実施形態において、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧ（Ａ）と、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧ（Ｂ）の抗原に対する特異性を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態において、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡに対する抗体が、ファージ提示型人工抗体である場合と、ＩｇＧである場合の、アミノ基共有結合固定化法により固定化したＲＮＡ抗原（Ａ）あるいはビオチン標識法により固定化したＲＮＡ抗原（Ｂ）に対する特異性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１９】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２０】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
＝＝スクリーニング方法＝＝
本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程とを含む。
【００２２】
（抗体ライブラリー）
本発明に係るスクリーニング方法に使用する抗体ライブラリーには、２種類以上の異なる抗原をそれぞれ認識する複数の抗体が含まれていればよいが、スクリーニングの効率を考慮すると、より多くの種類の抗原に対する抗体が含まれていることが好ましく、例えば、１０５種類以上の抗原に対する抗体が含まれていることが好ましいが、１０１１種類以上であればより好ましく、１０１２種類以上であればさらに好ましい。
【００２３】
抗ＲＮＡ抗体の抗原であるＲＮＡは、生体内で安定に保つことが難しく、よって、宿主動物を抗原ＲＮＡで免疫し、その宿主動物体内で所望の抗ＲＮＡ抗体価を十分上昇させることは一般的に容易ではない。従って、抗体ライブラリーに含まれる抗体は、遺伝子操作により得られた多様性の高い人工抗体であることが好ましい。
【００２４】
ここで、人工抗体は、例えば、脊椎動物の胸腺、骨髄、末梢血等から抽出したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として免疫グロブリンのＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするＤＮＡを増幅し、配列を決定した後、このＶＨ領域及びＶＬ領域から成る抗体結合部位を有する抗体分子を調製することにより、あるいは、ＶＨ領域とＶＬ領域をシャッフリングしたランダムな組み合わせから成る抗体結合部位を有する抗体分子を調製することにより、作製できる（例えば、特許第４１７１８４４号）。
【００２５】
このような人工抗体は、ヒト由来の遺伝子を用いて調製されたヒト型抗体であっても、ヒト以外の脊椎動物の遺伝子を用いて調製された抗体であってもよく、スクリーニングによって取得したい抗体の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００２６】
抗体ライブラリー中の人工抗体の形態は、遊離した抗体であっても、ファージ提示型人工抗体のように、抗体と抗体以外の分子との結合体であってもよいが、スクリーニングで得られた抗体について、その抗体の抗原結合部位を有する免疫グロブリンをコードする組換え遺伝子を製造するためには、人工抗体がファージ提示型人工抗体であることが好ましい。
【００２７】
ファージ提示型人工抗体とは、抗体をコードする外来遺伝子を有するバクテリオファージが、そのファージ表面に抗体を発現した状態の抗体のことである（例えば、Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222(3): 581-597, 1991 参照）。抗体を提示したファージが宿主バクテリア細胞に対する感染能を維持しており、スクリーニングにより選択された抗体を提示するファージを宿主バクテリア細胞に感染させることによって、スクリーニングにより選択された抗体を容易に複製することができる。
【００２８】
ファージ提示型人工抗体ライブラリーを構成する抗体の組成や多様性は、その抗体遺伝子の由来や調製方法により異なる。例えば、免疫ライブラリー、ナイーブライブラリー、合成ライブラリー等の、調製方法の異なるファージ提示型人工抗体ライブラリーが知られているが（例えば、Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222(3): 581-597, 1991；Knappik A. et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; Lee C.V. et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-1093 参照）、本発明において、その調製方法は制限されない。ただし、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体のスクリーニング効率を考慮し、より多様な抗体を均等な組成で含むファージ提示型人工抗体ライブラリーを使用することが好ましく、そのようなファージ提示型人工抗体ライブラリーとして、特許第４１７１８４４号で開示された方法で作製されたファージ提示型人工抗体ライブラリーが例示できる。なお、この方法は、（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、（ＩＩ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、（ＩＶ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、を含む製造方法である。
【００２９】
（抗原ＲＮＡ）
本発明に係るスクリーニングに使用する抗原ＲＮＡは、ＲＮＡである限り特に制限されず、例えば、リボソームＲＮＡであっても、メッセンジャーＲＮＡであっても、核内低分子ＲＮＡであってもよく、また、構成される塩基数あるいは修飾塩基の有無によっても制限されない。
【００３０】
これらの抗原ＲＮＡに結合する抗体を前述の抗体ライブラリーからスクリーニングするため、抗原ＲＮＡを予め固相担体に固定化する。固相担体は、抗原ＲＮＡを固定化できるものであって、本発明に係るスクリーニング方法の工程で溶出することのない素材の担体であれば制限されず、例えば、ガラス固相担体、シリコン固相担体、プラスチック固相担体、金固相担体、銀固相担体、銅固相担体、プラチナ固相担体、Ｆｅ（鉄）固相担体、ＧａＡs（ガリウム・ヒ素）固相担体、ＩｎＰ（インジウム・リン）固相担体等を挙げることができる。固相担体の形状も、本発明に係るスクリーニングの工程に適した形状であればよく、プレート状、ウェル状、繊維状、粉末状、ビーズ状、チップ状等から、適宜当業者が選択できる。
【００３１】
抗原ＲＮＡの固相担体への固定化方法は、抗原ＲＮＡがスクリーニングの工程において固相担体から剥離しない程度の強度で固定化できれば制限されず、アミノ基共有結合固定化法やビオチン標識法等が例示できる。アミノ基共有結合固定化法は、ペプチドの固定化に広く用いられている方法であり、これを応用して、抗原ＲＮＡの５’末端に付加したアミノ基と、固相担体に付加したカルボキシル基との結合を利用して固定化することができる。また、ビオチン標識法では、ビオチン標識した抗原ＲＮＡのビオチンと、固相担体に結合させたビオチン特異的抗体との結合を利用することにより、抗原ＲＮＡを固相担体に固定化することができる。ここで、抗原ＲＮＡのビオチン標識は、Biotin-16-UTPをＲＮＡの塩基配列中にＵＴＰとして取り込ませたり、又は、一本鎖ＲＮＡの３’末端に、Biotin-16-ddUTPを結合させたりする、当業者に周知の方法によって行うことができる。なお、本発明に係るスクリーニング方法による、任意の抗原ＲＮＡに対する特異的抗体の取得効率を考慮すると、抗原ＲＮＡはビオチン標識法により固相担体に固定化されていることが好ましい。
【００３２】
（スクリーニング方法）
［抗原と抗体の接触］
本発明に係るスクリーニング方法では、まず、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させ、抗原ＲＮＡと、抗体ライブラリー中の抗原ＲＮＡに特異的な抗体とが抗原抗体反応を起こすことのできる状態にする。例えば、抗原ＲＮＡがプレート状、ウェル状、チップ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合には、これらの固相担体の抗原ＲＮＡが固定化された表面に対して抗体ライブラリーを滴下すればよい。また、抗原ＲＮＡが粉末状、ビーズ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合には、固定化された抗原ＲＮＡと、抗体ライブラリーとを抗原抗体反応のための容器中で混合すればよい。
【００３３】
ここで、抗原抗体反応のための反応温度は、使用する抗体ライブラリーに含まれる抗体と、抗原ＲＮＡが抗原抗体反応できる範囲の温度であればよく、抗原や抗体の種類に合わせて当業者が適宜設定することができる。なお、抗原抗体反応を促進させるために、抗原ＲＮＡと抗体とを接触させる反応液を攪拌したり、振盪させたりしてもよい。
【００３４】
［特異的抗体の回収］
次に、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する。このために、まず、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに結合しなかった、非特異的抗体を除去する。抗原ＲＮＡがプレート状、ウェル状、チップ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合は、例えば、固相担体を洗浄することで、抗原ＲＮＡに結合しなかった非特異的抗体を除去することができる。一方、抗原ＲＮＡが粉末状、ビーズ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合、例えば、固相担体の重さを利用し、遠心分離法によって固相担体−抗原ＲＮＡ−特異的抗体の複合体を沈殿させた後、上清を除去する工程を繰りかえすことにより、固相担体を洗浄すればよい。なお、洗浄には、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡを剥離する作用を有さず、かつ、抗原ＲＮＡと特異的抗体との結合を解離させないような洗浄液を用いればよく、例えば、ＰＢＳやＴｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ等の生理的緩衝液を用いることができる。
【００３５】
このように、非特異的抗体を除去した後、抗原ＲＮＡと特異的抗体を解離させることにより特異的抗体を回収することができる。抗原ＲＮＡと特異的抗体とを解離させるには、例えば、グアニジン塩酸塩、カオトロピック塩（ドデシル硫酸ナトリウム、ヨウ化カリウム等）、尿素等を用いるような、当業者に周知のｐＨ調整方法を用いて処理すればよい。回収した特異的抗体は、タンパク質の濃縮用フィルター等を用いて適切な濃度に調製し、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体として用いることができる。
【００３６】
又は、スクリーニングに用いた抗体ライブラリーがファージ提示型人工抗体を含むものであって、抗原ＲＮＡに結合した抗体がファージ提示型特異的抗体である場合、前述のように非特異的抗体を除去した後、抗原ＲＮＡに結合したファージ提示型特異的抗体をトリプシンやTryPLE Express (インビトロジェン社)等のプロテアーゼで処理することによりファージ提示型特異的抗体のファージ部分のみを遊離させ、回収することができる。回収したファージは、宿主細胞に感染させることにより、増幅させることができる。
【００３７】
なお、特異的抗体のスクリーニングにおいて、取得された抗体中の特異的抗体の割合を高めるために、スクリーニング工程を複数回繰り返して行うことが好ましい。具体的には、初回のスクリーニングにより回収された抗体を、抗体ライブラリーの代わりに用い、１回目のスクリーニングと同じ抗原を用いてスクリーニング工程を繰り返す。この際、好ましくは合計２回以上、より好ましくは合計３回以上のスクリーニング工程を繰り返すことにより、取得された抗体中の抗原特異的抗体の割合を高めることができる。
【００３８】
また、スクリーニングにおける、抗原ＲＮＡと非特異的抗体との間の非特異的結合を減らすために、抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程において、反応溶液に非特異的ＲＮＡを添加することが好ましい。この際の、非特異的ＲＮＡの添加量は、１０μｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌであることが好ましく、１００μｇ/ｍｌ〜１ｍｇ/ｍｌであることがさらに好ましい。スクリーニング工程を複数回繰り返す場合には、２回目以降のスクリーニングにおいて非特異的ＲＮＡを添加することが好ましく、スクリーニングを繰り返す毎に、異なる非特異的ＲＮＡを添加することがより好ましい。非特異的ＲＮＡとしては、例えば、大腸菌由来ｔＲＮＡもしくは酵母由来ｔＲＮＡを使用することができる。
【００３９】
スクリーニングにおける、抗原ＲＮＡと非特異的抗体との間の非特異的結合をさらに減らすために、抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程の前にブロッキングを行うことが好ましい。具体的には、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに対し、ブロッキング剤を接触させる。使用するブロッキング剤は周知のものから当業者が適宜選択すればよいが、例えば、ＢＳＡ溶液や、市販のブロッキング剤であるPerfectBlock（フナコシ社）BlockAce（雪印乳業）等を使用することができる。なお、スクリーニング工程を複数繰り返す場合には、１回目、２回目、３回目で異なるブロッキング剤を使用することが好ましい。
【００４０】
＝＝抗ＲＮＡ抗体の製造方法＝＝
スクリーニング後、ファージ提示型人工抗体ライブラリーを用いて回収されたファージ提示型特異的人工抗体は、抗原ＲＮＡに特異的な抗原結合部位を有する抗ＲＮＡ抗体の製造に使用することができる（例えば、Kerbs B. et al., J. Immunol. Methods 254 (1-2): 67-84, 2001 参照）。
【００４１】
まず、回収されたファージ提示型特異的人工抗体の抗原結合部位を有する抗ＲＮＡ抗体を発現することのできる組換え発現ベクターを作製する。すなわち、回収したファージから人工抗体をコードするＤＮＡを単離し、発現ベクターに導入する。
【００４２】
抗体の抗原結合部位（Ｖ部）は、重鎖のＶＨ領域と軽鎖のＶＬ領域から構成され、定常部（Ｃ部）は重鎖のＣＨ領域、軽鎖のＣＬ領域、およびＦＣ領域から構成される。完全抗体は重鎖と軽鎖各２本ずつからなる４量体を基本構造としているので、抗原結合部位と定常部を持つ完全抗体を製造するためには、例えば、重鎖を構成する各領域をコードするＤＮＡを有する、重鎖を発現できる組換えベクター、及び、軽鎖を構成する各領域をコードするＤＮＡを有する、軽鎖を発現できる組換え発現ベクターを調製する。又は、複数のタンパク質を発現することのできる発現ベクターに対し、重鎖を構成する領域をコードするＤＮＡ、軽鎖を構成する領域をコードするＤＮＡの両方を導入し、組換え発現ベクターを調製してもよい。あるいは、ＶＨ、ＣＨ領域から構成される重鎖の一部とＶＬ、ＣＬ領域から構成される軽鎖の一部とからなるＦａｂ抗体や、ＶＨ領域から構成される重鎖の一部とＶＬ領域から構成される軽鎖の一部とからなるＦｖ抗体を製造するためには、それぞれ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬの各領域をコードするＤＮＡを１つ又は複数の発現ベクターに導入し、ＶＨ、ＣＨ領域から構成される重鎖の一部、ＶＬ、ＣＬ領域から構成される軽鎖の一部を発現できる組換え発現ベクターを調製する。
【００４３】
ここで、発現ベクターは、宿主細胞の種類、宿主細胞への組換え発現ベクターの導入方法、タンパク質発現効率などを考慮して、当業者が周知の発現ベクターから適宜選択することができ、プラスミドベクターであっても、レトロウイルスやアデノウイルスに由来するウイルスベクターであってもよい。なお、発現ベクターは、導入したＤＮＡを発現するのに適したプロモーターやターミネーター等を予め含んでいることが好ましいが、含んでいない場合には適宜必要なＤＮＡを導入して調製してもよい。
【００４４】
次に、調製した組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する。この際、宿主細胞としては、組換え発現ベクターから所望の抗ＲＮＡ抗体を発現できる細胞であれば制限されず、大腸菌、又は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ−３Ｔ３等の哺乳類培養細胞、又は、ＳＦ９等の昆虫培養細胞であってもよい。
【００４５】
組換え発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、当業者に周知の方法から、宿主細胞や発現ベクターの種類を考慮して適宜選択することができ、例えば、エレクトロポーテーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法や、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、Lipofextamine LTX（インビトロジェン社）、Lipofextamine 2000（インビトロジェン社）、polyethyleneimine等の市販の試薬を用いた方法が挙げられる。
【００４６】
以上のように組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を、その細胞種に適した培地、及び環境下で培養すると、宿主細胞中で組換え発現ベクターが発現した抗ＲＮＡ抗体は宿主細胞の培養液中に放出される。
【００４７】
以上のように培養液中に放出された抗ＲＮＡ抗体は、宿主細胞の培養液を採取することによって回収できる。回収された抗ＲＮＡ抗体は、前述のスクリーニング方法に使用した抗原ＲＮＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーやプロテインＡを用いて、精製したり、必要に応じて濃縮したりしてもよい。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
本実施例では、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに対する特異的抗体を人工抗体ライブラリーからスクリーニングした。
【００４９】
＝＝ＲＮＡ抗原の固相担体への固定化＝＝
（アミノ基共有結合固定化法によるＲＮＡの固定化）
本研究で抗原に用いた一本鎖ＲＮＡの塩基配列は、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４８〜９３ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９２２〜２０２０ ｎｔ領域に相当する。これらの一本鎖ＲＮＡの５’末端にアミノ基を導入した一本鎖ＲＮＡは、Greiner bio-one社により委託合成した。
【００５０】
このようにアミノ基を導入した各ＲＮＡ抗原を、２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、９６穴マイクロプレート（Nunc Immobolizer AMINO plate カタログ番号436013、Nunc 社）の１ウェルあたり５０μｌ（1ウェルあたり１００ｎｇ）加えた。室温で１時間放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、これを抗原ＲＮＡプレートとした。
【００５１】
（ビオチン標識法及び末端ビオチン標識法によるＲＮＡの固定化）
ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９１２〜２０９３ ｎｔ領域、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ（８３ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ（７８ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ（７７ ｎｔ全長）の５種類のＲＮＡをビオチン標識法によって固定化し、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）を末端ビオチン標識法によって固定化した。
【００５２】
具体的には、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９１２〜２０９３ ｎｔ領域、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ（８３ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ（７８ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ（７７ ｎｔ全長）の５種類のＲＮＡについて、各鋳型ＤＮＡを作製するために、それぞれに特異的な以下のプライマーを用い、Expand High FidelityPLUS PCR System (Roche 社)によりＰＣＲを行った。
ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ用プライマーペア：
U1-F: CTTACCTGGCAGGGGAGATA（配列番号１）
U1-R: AAGCGCGAACGCAGTCCCCC（配列番号２）
ヒト２８ＳｒＲＮＡ用プライマーペア：
28S-F: GCTCATCAGACCCCAGAAA（配列番号３）
28S-R: CTCCCGTCCACTCTCGACT（配列番号４）
ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U44-F: TTTTGACTAGGGTGAGGAATCTG（配列番号５）
U44-R: AGACGGGACCAGATCAGACA（配列番号６）
ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U76-F: TGCATATGATGACCCTATTTGCT（配列番号７）
U76-R: TGCTTCAGACAAGGTATTTTGG（配列番号８）
ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U78-F: TTTTGGGTTTTGTGATGCTCT（配列番号９）
U78-R: GGCTTGAGTTTCAGTCAAAGATAA（配列番号１０）
【００５３】
得られたＰＣＲ産物をpGEM-T Easy Vector（pGEM（登録商標）-T Easy Vector System I、Promega 社）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、大腸菌(DH5α)を形質転換した。大腸菌から回収したプラスミドを鋳型ＤＮＡとし、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ (Roche 社)を用いて in vitro 転写した。ここで、in vitro 転写の際、５種類の一本鎖ＲＮＡ(ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ)をビオチン標識するために、基質にBiotin‐16‐UTP（Ambion 社）を含むＮＴＰ（Promega 社）を用いることにより、ＲＮＡの塩基配列中の一部のＵＴＰとしてBiotin-16-UTPを取り込ませた（ビオチン標識法）。また、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを末端ビオチン標識するために、未標識の一本鎖ＲＮＡをin vitro 転写により作製し精製した後、その３’末端にbiotin-16-ddUTP (Roche 社)をターミナルトランスフェラーゼ(Roche 社)により結合させた（末端ビオチン標識法）。
【００５４】
このようにビオチンで標識した各ＲＮＡ抗原を固定化するため、まず、抗ビオチン抗体(B3640-1MG、 SIGMA-ALDRICH 社)を最終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し、９６穴マイクロプレート（Immobolizer AMINO plate カタログ番号436013、Nunc 社、又は、カタログ番号675161、Greiner bio-one 社）の１ウェルあたりに５０μｌ（1ウェルあたり１μｇ）ずつ加えた。室温で１時間放置した後、ＰＢＳＴでウェルを洗浄して、過剰な抗ビオチン抗体を除去した。次に、ＰＢＳに溶解したビオチン標識ＲＮＡを２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、上記抗ビオチン抗体固定化済み９６穴マイクロプレートの１ウェルあたりに５０μｌ（1ウェルあたり１００ｎｇ）ずつ加え、室温で１時間放置した後、ＰＢＳＴで洗浄し、これを抗原ＲＮＡプレートとした。
【００５５】
＝＝特異的抗体のスクリーニング＝＝
各方法により調製した抗原ＲＮＡプレートの各ウェルに対し、ブロッキング剤（ＰＢＳで３％に希釈したＢＳＡ溶液、SIGMA社）を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング剤を除去した後、ファージ提示型人工抗体ライブラリー（特許第４１７１８４４号の実施例に従い調製）を５０μｌずつ各ウェルに加え、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄することにより抗原ＲＮＡに結合しなかったファージ提示型人工抗体を除去した後、TryPLE Express（インビトロジェン社）を各ウェルに５０μｌずつ加え、２５℃で５分間放置した。この処理により、抗原ＲＮＡに結合したファージ提示型人工抗体の抗体部分とファージ部分とが解離し、ファージが液中に放出される。このファージ液をピペットマンで各ウェルから回収した。再度、各ウェルにTryPLE Expressを５０μｌ加え、２５℃で５分間放置した後、ファージ液をピペットマンで回収した。１回目と２回目に回収されたファージ液は混合し、以下の工程に使用した。
【００５６】
このように得られたファージ液をｐＦＳＤ４ａ（図２、配列番号１１）保有大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株液とＰＤＧ培地５ｍｌ (Sp （スペクチノマイシン） 50μ g/ml含有)に加え、５０回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。ここに、濃縮済みヘルパーファージM13AX1を５μｌ（5x109 pfu以上）添加し素早く混ぜ、２５℃で５分間インキュベートした。ＰＤＧ培地（Sp 50 μg/ml、anhydrotetracycline (aTet) 2.5 ng/ml、Arabinose 0.01%、IPTG 1 mM含有）を２０ｍｌ添加し、５０回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。さらに抗生剤液（Carbenicillin (Cr) 50 μg/ml、Chrolamphenicol(Cm) 12.5 μg/ml、Kanamycine (Kn) 50 μg/ml、aTat 10 ng/ml）を加えて１８０回転／分で振盪しながら２５℃で４８時間インキュベートした。これにより、抗原ＲＮＡに特異的な抗体を提示するファージを増幅した。
【００５７】
インキュベート開始から４８時間後、ファージ液を５０ｍｌ遠心管に移し、４℃、８０００×ｇで１０分遠心した。ファージ提示型特異的抗体の含まれる上清を回収し、２０％ＰＥＧ６０００−５Ｍ ＮａＣｌ溶液を上清全量１に対して１／４量加え、４℃で１時間インキュベートした後、４℃、８０００×ｇで１０分遠心することによって、ファージ提示型特異的抗体を沈殿させた。このペレットをＰＢＳ １ｍｌに懸濁した。
【００５８】
このようにして得られたファージ提示型特異的抗体の懸濁液をファージ提示型人工抗体ライブラリーの代わりに用い、ここに酵母の１０μｇ/ウェルのｔＲＮＡを添加した後に抗原ＲＮＡと接触させ、上記方法に従ってスクリーニングをさらに２回繰り返し、合計３回行った。なお、この際、ブロッキング剤に結合する抗体を除くため、スクリーニングを繰り返す毎に異なるブロッキング剤を使用した。１回目には前述のようにＢＳＡ（ＰＢＳで３％に希釈した溶液、SIGMA社）を使用したが、２回目にはPerfectBlock（ＰＢＳで９％に希釈した溶液、フナコシ社）、３回目にはBlockAce（原液、雪印乳業）を用いた。抗原ＲＮＡのプレートのサブトラクションには１０μｇ/ウェルの抗原以外のＲＮＡを用いた。抗Ｕ１ＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目には２８ＳｒＲＮＡ(非標識)を用いた。抗２８ＳｒＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ１ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ４４ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ７６ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ７６ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ７８ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ７８ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ４４ＲＮＡ(非標識)を用いた。
【００５９】
ここで、リン酸バッファーを用いたアミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡに対し、ファージ提示型人工抗体ライブラリー（特許第４１７１８４４号の実施例に従い調製）から特異的抗体のスクリーニングを行う際に、複数のブロッキング剤の導入、ｔＲＮＡの添加、非標識ＲＮＡの添加等の本実施例で採用したような工程を導入しなかった場合には、特異的抗体を得ることができなかった。これは、抗原ＲＮＡとファージ提示型人工抗体との非特異的な反応や、抗原ＲＮＡの分解が生じたためであると考えられた。一方、本実施例に記載の方法によって多数のファージ提示型特異的抗体が得られた。従って、本実施例に記載のスクリーニング方法は、顕著な効果を有しているといえる。
【００６０】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で得られたファージ提示型特異的抗体から、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有するファージ提示型特異的抗体を選択した。
【００６１】
実施例１においてファージを感染させたｐＦＳＤ４ａ保有大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の培養液２０ｍｌから０．１、１、又は１０μｌを、ＬＢ寒天培地（Cr 50 μg/ml、Sp 50 μg/ml含有）に播種した。３０℃で２晩培養し、コロニーを形成させた。下記プライマーペアを用いたＰＣＲ法によって、各コロニーの抗体クローンについてファージ提示型特異的抗体のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡの塩基長を確認した。
pFab5seq-f：5'- GATTTGCGCTGTCGCTCCTTG -3'（配列番号１２）
pFab5seq-r：5'- CCCAGCCAGGCTTCCACATCAC -3'（配列番号１３）
【００６２】
ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするＤＮＡは通常約８００〜９００ｂｐである。従って、約８００〜９００ｂｐの完全長のインサートを有することが確認できた抗体クローンを選択した。実施例１において、ビオチン標識ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られたファージ提示型特異的抗体を用いてインサートの塩基長を確認した結果を図１に示す。スクリーニングを計２回繰り返して得られたファージ提示型特異的抗体では１６クローン中９クローン（５６％）が完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を含んでいたが（図１Ａ）、スクリーニングを計３回繰り返して得られたファージ提示型特異的抗体では１６クローン中全て（１００％）が完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を含んでいた（図１Ｂ）。また、その他のＲＮＡ抗原を用いて、スクリーニングを２回、及び３回行うことにより得られたファージ提示型特異的抗体における、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を有するクローン率（％）を表１に示す。
【表１】
【００６３】
このように、ビオチン標識法又は末端ビオチン標識法により固定化したＲＮＡ抗原を使用して、スクリーニングを前述のように３回行うことにより、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含むファージ提示型人工抗体をより高い確率で得ることができる。
【００６４】
［実施例３］
本実施例では、実施例２で得られた完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有するファージ提示型人工抗体が抗原ＲＮＡに対して抗原特異性を有することを検証した。また、スクリーニングに用いる抗原ＲＮＡの固定化方法の種類と、選択されるファージ提示型人工抗体の抗原特異性について検証した。
【００６５】
＝＝ＥＬＩＳＡ法＝＝
約８００〜９００ｂｐのインサートを有し、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有することが確認されたクローンのファージ提示型特異的抗体について、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗原ＲＮＡに対する抗原特異性（Ｓ／Ｎ比）を調べた。
【００６６】
具体的には、実施例１に記載の方法に従い、アミノ基共有結合固定化法又はビオチン標識法によってヒトＵ１ｓｎＲＮＡ又はヒト２８ＳｒＲＮＡを９６ウェルプレートのウェルに固定化した（固定化ウェル）。一方、対照として、抗原ＲＮＡを固定化しないウェル（対照ウェル）を用いた。固定化ウェルと対照ウェルに対し、ブロッキング剤(Ｎ１０１をＰＢＳで５倍希釈した溶液、日油株式会社)を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ特異的抗体、又は、ヒト２８ＳｒＲＮＡ特異的抗体について、実施例２の方法により、ＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含むことが確認された各９６クローンのファージ提示型特異的抗体２５μｌを添加して３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【００６７】
固定化ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、各ウェルにファージ提示型特異的抗体を含む培養上清２５μｌを加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰なファージ提示型特異的抗体を除去した。さらに、５０００倍希釈した抗ヒトIgG (Fab特異的) POD標識ヤギ宿主抗体（A0293、1mL、SIGMA-ALDRICH 社）２５μｌを加え、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰な二次抗体を除去した。ここに、可視化のための基質としてo-phenylenediamine (5 mg OPD tablet、P6912 SIGMA-ALDRICH 社)１個を４μｌ／１１mｌ過酸化水素水に溶解した溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４９２〜５９５ｎｍ）を測定した。固定化ウェルの吸光度と対照ウェルの吸光度との比を計算し、固定化ウェル／対照ウェル（Ｓ／Ｎ）＝１．２５以上のファージ提示型特異的抗体のクローンを陽性抗体クローンと判断した。
【００６８】
各抗原ＲＮＡに対する特異的抗体のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含む９６クローンのうち、抗原ＲＮＡに対する特異性が陽性と判断されたクローン（陽性抗体クローン）数を表２に示す。
【表２】
【００６９】
本実施例の結果は、抗体ライブラリーからの抗体のスクリーニングにおいて、ビオチン標識法により固定化した抗原ＲＮＡを用いた場合の方が、アミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡを用いた場合に比較して、抗原ＲＮＡに対して特異性を有する抗体をより多く得られることを示している。
【００７０】
［実施例４］
本実施例では、実施例１〜３において得られた抗原ＲＮＡに対して特異的なファージ提示型特異的抗体を利用し、ＩｇＧを作製した。
【００７１】
実施例３で得られた全ての陽性抗体クローンについて、ＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を決定した。このＤＮＡ配列について、統合Ｖ遺伝子データベース（ＶＢＡＳＥ２、http://www.vbase2.org/）においてＢＬＡＳＴ検索を行い、ＶＨ領域とＶＬ領域からなる抗原結合部位における、相補性決定領域（超可変領域、ＣＤＲ）と、それ以外の比較的変化の少ないフレームワーク領域（ＦＲ）を同定した。なお、相補性可変領域はＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の３領域から成り、フレームワーク領域はＦＲ１〜ＦＲ４の４領域から成る。
【００７２】
このように配列決定した全７３の陽性抗体クローンのうち、３５個は新規な抗原結合部位を有していた。これらのフレームワーク領域は９０％以上の相同性を有していた。一方、ＣＤＲ３領域では、ＣＤＲ３領域の全長が０〜２０アミノ酸、そのうち新規に挿入されたのは０〜１７アミノ酸であり、多様性が高かった。前述の新規な抗原結合部位を持つ抗体として、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）抗体は１０種類、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）抗体は１７種類、抗２８ＳｒＲＮＡ抗体（アミノ基共有結合）は８種類が、それぞれ得られた。これらのうち、翻訳フレームのずれ、ストップコドン挿入、ＶＨ領域又はＶＬ領域の欠損等がなく、ＩｇＧ化に必要な配列が欠損していないことが確認された抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）抗体の１０種類、及び、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）抗体の１５種類について、ＩｇＧを調製した。
【００７３】
＝＝ＩｇＧの調製＝＝
このように得られた新規な抗原結合部位を有するＩｇＧを、以下のように作製した。使用した発現ベクターは配列番号１４、１５、１６の塩基配列を有し、そのベクターマップをそれぞれ図３（pHIgH4zeo）、４（pHIgK4neo）、５（pHIgL4neo）に示す。余分なアミノ酸配列が、発現するＩｇＧタンパク質中に挿入されないようするため、ＶＨ領域をコードするＤＮＡとＶＬ領域をコードするＤＮＡのそれぞれを、ベクターと相同的な１５塩基を５’側に有する、以下に示す特異的プライマーを用いて増幅し、クローンテック社製InFusion PCRクローニングキットを用いてベクターのEsp3I部位に組み込んだ。なお、pHIgH4zeoにはＶＨ領域をコードするＤＮＡを、pHIgK4neoにはKappa鎖由来ＶＬ領域ＤＮＡを、pHIgL4neoにはlambda鎖由来ＶＬ領域ＤＮＡを、それぞれ組み込み、ＶＨ領域組換え発現ベクター、Kappa鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター、及び、lambda鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクターを調製した。これらの組換えベクターについて、導入したＤＮＡの塩基配列を確認した後、GenoMed 社EndoFree Midi Plasmid精製キットを用いて精製した。
【００７４】
なお、以下の配列番号１７から３５の塩基配列において、ｄ、ｒ、ｓ、ｎ、ｗ、ｙ、ｈは縮重塩基を示し、ｄはＡ、Ｇ、又はＴ、ｒはＡ又はＧ、ｓはＣ又はＧ、ｎはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ、ｗはＡ又はＴ、ｙはＣ又はＴ、ｈはＡ、Ｃ、又はＴを示す。
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf2：5'- ggtgcctagctccggcGAwATTGTrhTGACnCAGwCT -3'（配列番号２１）
Ｌ鎖用：EXVLr1.2：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATyTCCAGTCGTGTCCCT -3'（配列番号２２）
Ｈ鎖用：ExVHf4：5'- ccttccgtgctgtctCAGrTCACCTTGAAGGAGTC -3'（配列番号２３）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'(配列番号２０)
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン５調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf9：5'- ggtgcctagctccggcTCCTATGwGCTGACwCAGCCA -3'（配列番号２４）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf6：5'- ggtgcctagctccggcCAGdCTGTGGTGACyCAGGAG -3'（配列番号２６）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr5：5'- tgggcccttggtcgacGCsGATGGGCCCTTGGTGGArGC -3'（配列番号２７）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン２８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３０調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf3：5'- ggtgcctagctccggcGAAACGACACTCACGCAGTCT -3'（配列番号２９）
Ｌ鎖用：EXVLr1.2：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATyTCCAGTCGTGTCCCT -3'（配列番号２２）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン７６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr4：5'- tgggcccttggtcgacGCGGTTGGGGCGGATGCACTCC -3'（配列番号３０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf5：5'- ggtgcctagctccggcCAGCCTGTGCTGACTCAryC -3'（配列番号３１）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１７調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン２７調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf1：5'- ggtgcctagctccggcGACATCCCrGdTGACCCAGTC -3'（配列番号３２）
Ｌ鎖用：EXVLr2.1：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATATCCACTTTGGTCCCA -3'（配列番号３３）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン２８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr3：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT -3'（配列番号３４）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３０調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf6：5'- ggtgcctagctccggcCAGdCTGTGGTGACyCAGGAG -3'（配列番号２６）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン４１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン5２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf11：5'- ggtgcctagctccggcTCCTCTGAGCTGAsTCAGGA -3'（配列番号３５）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr4：5'- tgggcccttggtcgacGCGGTTGGGGCGGATGCACTCC -3'（配列番号３０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン６３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf11：5'- ggtgcctagctccggcTCCTCTGAGCTGAsTCAGGA -3'（配列番号３５）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン７４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr3：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT -3'（配列番号３４）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン７６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
【００７５】
ＩｇＧ発現のための宿主細胞として使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培地において、８０％コンフルエントまで５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養した。トランスフェクション当日、常法のトリプシン処理によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、0.5％(w/v)Yeast Extracts (GIBCO社製) 添加及び２%超低ＩｇＧ牛胎児血清（Super Low IgG FBS カタログ番号SH30898.02、HyClone 社製）添加及びGentamycin 50 μg/ml添加MegaCell DMEM/F12培地（カタログ番号M4192、SIGMA-ALDRICH社）に懸濁した。この細胞懸濁培地溶液を、７０〜８０％コンフルエントになるように、コラーゲンコート１０ｃｍディッシュ（カタログ番号11-018-006、IWAKI社）に１０ｍｌ播種した。
【００７６】
このように調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対し、精製した各組換え発現ベクターをポリエチレンイミンによってトランスフェクトした。具体的には、ＶＨ領域組換え発現ベクター、Kappa鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター、及び、lambda鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター各７．５μｇを１ｍｌのOptiMEM培地(インビトロジェン社)に添加、混合した後、Polyethylenimine Max（カタログ番号24765-2、 40 mg/ml 5% Glucose溶液、Polyscience社）１．５μｌを添加して素早く混合した。この混合液を、３０分室温で放置した後、上記のように調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養した。
【００７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に各組換え発現ベクターを添加後２日目に培地を回収して新たな培地に交換し、４日後（培地交換からさらに２日後）まで培養してから再び培地を回収した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が発現、放出したＩｇＧを含む、２日目と４日目に回収した培地は混合し、未精製でＥＬＩＳＡ法による検証に用いた。
【００７８】
＝＝ＩｇＧの抗原ＲＮＡに対する特異性のＥＬＩＳＡ法による検証＝＝
上記のようにして得られた、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧ１０種類、及び、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧ１５種類について、抗原ＲＮＡに対する特異性（Ｓ／Ｎ比）を調べた。まず、実施例１の「アミノ基共有結合固定化法によるＲＮＡの固定化」、及び、「ビオチン標識法及び末端ビオチン標識法によるＲＮＡの固定化」の記載に従い、９６ウェルプレートにヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、あるいはヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化した。
【００７９】
アミノ基共有結合固定化法により抗原ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、対照群としてヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルに対し、ブロッキング剤（Ｎ１０１をＰＢＳで５倍希釈した溶液、日油株式会社）を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。このウェルに対し、５０μｌの１０種類の抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧを添加し、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。過剰なＩｇＧをＰＢＳＴで洗浄し、除去した後、１ウェルあたりＨＲＰ標識プロテインＡ（カタログ番号32400、Thermo scientific社製）を５μｇ加えた。３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰なＨＲＰ標識プロテインＡを除去した。ここに、可視化のための基質としてo-phenylenediamine (5 mg OPD tablet、P6912 SIGMA-ALDRICH 社)１個を４μｌ／１１mｌ過酸化水素水に溶解した溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４９２〜５９５ｎｍ）を測定した。ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを固定化したウェルの吸光度と、対照群のヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルの吸光度との比を計算した（図６Ａ）。
【００８０】
また、ビオチン標識法によりヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、対照群としてヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルに対し、１５種類の抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧを用いて同様にＥＬＩＳＡ法を行った（図６Ｂ）。
【００８１】
図６Ａ、Ｂに示す様に、アミノ基共有結合固定化法により固定化された抗原ＲＮＡを用いてスクリーニングされた抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ抗体では、１０種類の抗体中７種類が有意に特異的であった。一方、ビオチン標識法により固定化された抗原ＲＮＡを用いてスクリーニングされた抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ抗体では、１５種類の抗体中１３種類が有意に特異的であった。
【００８２】
＝＝ファージ提示型人工抗体とＩｇＧとの比較＝＝
ここで、実施例３でＥＬＩＳＡ法により解析したファージ提示型特異的抗体のうち、陽性クローンと判断された抗体の抗原特異性（固定化ウェル／対照ウェル）、及び、本実施例４においてＥＬＩＳＡ法により解析したＩｇＧの抗原特異性（抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ添加群／対照群）を比較した結果を図７に示す。図７Ａはアミノ基共有結合固定化法により固定化したヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られた抗体、図７Ｂはビオチン標識法により固定化したヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られた抗体であるが、どちらの固定化法による場合であっても、ＩｇＧの方がファージ提示型特異的抗体よりも特異性が高い傾向があり、特にビオチン標識法の場合には、ＩｇＧの方がファージ提示型特異的抗体よりも有意に特異性が高かった。また、アミノ基共有結合固定化法の場合とビオチン標識法の場合のＩｇＧについて比較すると、ビオチン標識法の場合に、特異性が顕著に高かった。
【００８３】
この結果は、抗ＲＮＡ抗体の抗体ライブラリーからのスクリーニング方法において、ビオチン標識法によって抗原ＲＮＡを固相担体に固定化した場合に、アミノ基共有結合固定化法により固定化した場合よりもさらに特異性の高い抗体を得ることができることを示している。また、スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合部位を有するＩｇＧを調製することで、抗原ＲＮＡに対する特異性がさらに高く、Ｓ／Ｎの高い優れた抗体を得ることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に翻訳されないノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）は、生物の発生、分化、及び、がんをはじめとする疾患に関与することが知られており（例えば、非特許文献１、２参照）、医薬開発の標的としても有望である。
【０００３】
生体におけるｎｃＲＮＡを検出するため、現在はＰＣＲ法や核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法が用いられている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、ＰＣＲ法では検査組織をホモジナイズするため、組織や細胞におけるｎｃＲＮＡの局在情報は得ることができない。また、核酸プローブハイブリダイゼーション法は、処理に２〜３日かかることに加え、変性剤を用いることから特異的抗体を用いたタンパク質の検出法と併用することが極めて困難という短所がある。
【０００４】
一方、抗ＲＮＡ抗体を用い、周知の免疫組織化学的手法によってｎｃＲＮＡを検出することができれば、処理時間が短縮できるのに加え、他の抗原に特異的な抗体を用いた多重標識も可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fabbri M., Calin G.A., Beyond genomics: interpreting the 93% of the human genome that does not encode proteins. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., May 13(3): 350-358, 2010
【非特許文献２】Mattick J.S., Makunin I.V., Non-coding RNA, Human Molecular Genetics, Vol. 15, Review Issue 1: R17-R19, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＲＮＡはヌクレアーゼにより容易に分解されるため、ＲＮＡ抗原を宿主動物に免疫する一般的な抗体調製方法によって抗ＲＮＡ抗体を効率的に調製することは大変困難であった。
【０００７】
そこで、本発明は、新たな抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、抗体ライブラリーから抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングしようと試みた。しかし、抗原ＲＮＡはタンパク質と異なり直接ウェルに固定化できないことが問題となった。また、抗原ＲＮＡが分解されやすい点も問題となった。
【０００９】
一方、ビオチン標識法、末端ビオチン標識法、あるいはアミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡを使用した場合には、抗体ライブラリーから抗ＲＮＡ抗体をスクリーニングできた。このようにして、発明者らは、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、を含むことを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１１】
ここで、抗体ライブラリーは、ファージ提示型人工抗体ライブラリーであることが好ましい。また、このファージ提示型人工抗体ライブラリーは、（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、（ＩＩ）ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、（ＩＶ）ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、を含む製造方法によって製造された一本鎖抗体ライブラリーであることがより好ましい。
【００１２】
本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡにビオチンが結合しており、固相担体に固定化されているビオチン特異的抗体に対しそのビオチンが結合することによって、抗原ＲＮＡが固相担体に固定化されていることが好ましく、また、非特異的ＲＮＡの存在下で、抗原ＲＮＡと人工抗体とを接触させることがより好ましい。
【００１３】
本発明に係るスクリーニング方法は、工程（ｂ）で回収された抗体を抗体ライブラリーとして用い、一連の工程（ａ）（ｂ）をさらに２回以上行うことが、さらに好ましい。
【００１４】
本発明に係る抗原ＲＮＡに特異的な抗体の製造方法は、本発明に係るスクリーニング方法のいずれかによって、抗原ＲＮＡに特異的なファージ提示型人工抗体をスクリーニングする工程と、そのスクリーニングによって得られたファージから、人工抗体の抗原結合部位をコードするＤＮＡを回収する工程と、回収されたＤＮＡを有し、抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、抗体を発現させる工程と、宿主細胞又はその培養液から抗体を回収する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１５】
なお、本明細書において「抗体」は、任意の抗原と結合する抗原結合部位を有し、その抗原と結合することができる分子を指し、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ等のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）と定常部（Ｃ部）を有する免疫グロブリン分子、抗原結合部位のみから成る分子、Ｆａｂ抗体分子のように抗原結合部位と定常部の一部分から成る分子、Ｆｖ抗体のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）のみから成る分子、及び、一本鎖抗体等のように抗原結合部位（可変部、Ｖ部）とそれらを連結するリンカー部位から成る分子のいずれも含むものとする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、抗ＲＮＡ抗体のスクリーニング方法及び抗ＲＮＡ抗体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態において、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体をファージ提示型人工抗体ライブラリーからスクリーニングする際に、スクリーニング工程を計２回行った後（Ａ）、及びスクリーニング工程を計３回行った後（Ｂ）に得られた、各ファージ提示型人工抗体のクローンが有するインサートＤＮＡを電気泳動して得られた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、抗原ＲＮＡに特異的な抗体を提示するファージを増幅するために用いた大腸菌が保有するｐＦＳＤ４ａベクターのベクターマップである。
【図３】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgH4zeo発現ベクターのベクターマップである。
【図４】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgK4neo発現ベクターのベクターマップである。
【図５】本発明の一実施形態において、ＩｇＧ製造のために使用したpHIgL4neo発現ベクターのベクターマップである。
【図６】本発明の一実施形態において、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧ（Ａ）と、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧ（Ｂ）の抗原に対する特異性を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施形態において、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡに対する抗体が、ファージ提示型人工抗体である場合と、ＩｇＧである場合の、アミノ基共有結合固定化法により固定化したＲＮＡ抗原（Ａ）あるいはビオチン標識法により固定化したＲＮＡ抗原（Ｂ）に対する特異性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１９】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２０】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
＝＝スクリーニング方法＝＝
本発明に係るスクリーニング方法は、抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程と、抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程とを含む。
【００２２】
（抗体ライブラリー）
本発明に係るスクリーニング方法に使用する抗体ライブラリーには、２種類以上の異なる抗原をそれぞれ認識する複数の抗体が含まれていればよいが、スクリーニングの効率を考慮すると、より多くの種類の抗原に対する抗体が含まれていることが好ましく、例えば、１０５種類以上の抗原に対する抗体が含まれていることが好ましいが、１０１１種類以上であればより好ましく、１０１２種類以上であればさらに好ましい。
【００２３】
抗ＲＮＡ抗体の抗原であるＲＮＡは、生体内で安定に保つことが難しく、よって、宿主動物を抗原ＲＮＡで免疫し、その宿主動物体内で所望の抗ＲＮＡ抗体価を十分上昇させることは一般的に容易ではない。従って、抗体ライブラリーに含まれる抗体は、遺伝子操作により得られた多様性の高い人工抗体であることが好ましい。
【００２４】
ここで、人工抗体は、例えば、脊椎動物の胸腺、骨髄、末梢血等から抽出したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として免疫グロブリンのＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするＤＮＡを増幅し、配列を決定した後、このＶＨ領域及びＶＬ領域から成る抗体結合部位を有する抗体分子を調製することにより、あるいは、ＶＨ領域とＶＬ領域をシャッフリングしたランダムな組み合わせから成る抗体結合部位を有する抗体分子を調製することにより、作製できる（例えば、特許第４１７１８４４号）。
【００２５】
このような人工抗体は、ヒト由来の遺伝子を用いて調製されたヒト型抗体であっても、ヒト以外の脊椎動物の遺伝子を用いて調製された抗体であってもよく、スクリーニングによって取得したい抗体の種類に応じて当業者が適宜選択することができる。
【００２６】
抗体ライブラリー中の人工抗体の形態は、遊離した抗体であっても、ファージ提示型人工抗体のように、抗体と抗体以外の分子との結合体であってもよいが、スクリーニングで得られた抗体について、その抗体の抗原結合部位を有する免疫グロブリンをコードする組換え遺伝子を製造するためには、人工抗体がファージ提示型人工抗体であることが好ましい。
【００２７】
ファージ提示型人工抗体とは、抗体をコードする外来遺伝子を有するバクテリオファージが、そのファージ表面に抗体を発現した状態の抗体のことである（例えば、Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222(3): 581-597, 1991 参照）。抗体を提示したファージが宿主バクテリア細胞に対する感染能を維持しており、スクリーニングにより選択された抗体を提示するファージを宿主バクテリア細胞に感染させることによって、スクリーニングにより選択された抗体を容易に複製することができる。
【００２８】
ファージ提示型人工抗体ライブラリーを構成する抗体の組成や多様性は、その抗体遺伝子の由来や調製方法により異なる。例えば、免疫ライブラリー、ナイーブライブラリー、合成ライブラリー等の、調製方法の異なるファージ提示型人工抗体ライブラリーが知られているが（例えば、Marks J.D. et al., J. Mol. Biol. 222(3): 581-597, 1991；Knappik A. et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000; Lee C.V. et al., J. Mol. Biol. 340: 1073-1093 参照）、本発明において、その調製方法は制限されない。ただし、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体のスクリーニング効率を考慮し、より多様な抗体を均等な組成で含むファージ提示型人工抗体ライブラリーを使用することが好ましく、そのようなファージ提示型人工抗体ライブラリーとして、特許第４１７１８４４号で開示された方法で作製されたファージ提示型人工抗体ライブラリーが例示できる。なお、この方法は、（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、（ＩＩ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、（ＩＶ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、を含む製造方法である。
【００２９】
（抗原ＲＮＡ）
本発明に係るスクリーニングに使用する抗原ＲＮＡは、ＲＮＡである限り特に制限されず、例えば、リボソームＲＮＡであっても、メッセンジャーＲＮＡであっても、核内低分子ＲＮＡであってもよく、また、構成される塩基数あるいは修飾塩基の有無によっても制限されない。
【００３０】
これらの抗原ＲＮＡに結合する抗体を前述の抗体ライブラリーからスクリーニングするため、抗原ＲＮＡを予め固相担体に固定化する。固相担体は、抗原ＲＮＡを固定化できるものであって、本発明に係るスクリーニング方法の工程で溶出することのない素材の担体であれば制限されず、例えば、ガラス固相担体、シリコン固相担体、プラスチック固相担体、金固相担体、銀固相担体、銅固相担体、プラチナ固相担体、Ｆｅ（鉄）固相担体、ＧａＡs（ガリウム・ヒ素）固相担体、ＩｎＰ（インジウム・リン）固相担体等を挙げることができる。固相担体の形状も、本発明に係るスクリーニングの工程に適した形状であればよく、プレート状、ウェル状、繊維状、粉末状、ビーズ状、チップ状等から、適宜当業者が選択できる。
【００３１】
抗原ＲＮＡの固相担体への固定化方法は、抗原ＲＮＡがスクリーニングの工程において固相担体から剥離しない程度の強度で固定化できれば制限されず、アミノ基共有結合固定化法やビオチン標識法等が例示できる。アミノ基共有結合固定化法は、ペプチドの固定化に広く用いられている方法であり、これを応用して、抗原ＲＮＡの５’末端に付加したアミノ基と、固相担体に付加したカルボキシル基との結合を利用して固定化することができる。また、ビオチン標識法では、ビオチン標識した抗原ＲＮＡのビオチンと、固相担体に結合させたビオチン特異的抗体との結合を利用することにより、抗原ＲＮＡを固相担体に固定化することができる。ここで、抗原ＲＮＡのビオチン標識は、Biotin-16-UTPをＲＮＡの塩基配列中にＵＴＰとして取り込ませたり、又は、一本鎖ＲＮＡの３’末端に、Biotin-16-ddUTPを結合させたりする、当業者に周知の方法によって行うことができる。なお、本発明に係るスクリーニング方法による、任意の抗原ＲＮＡに対する特異的抗体の取得効率を考慮すると、抗原ＲＮＡはビオチン標識法により固相担体に固定化されていることが好ましい。
【００３２】
（スクリーニング方法）
［抗原と抗体の接触］
本発明に係るスクリーニング方法では、まず、固相担体に固定化された抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させ、抗原ＲＮＡと、抗体ライブラリー中の抗原ＲＮＡに特異的な抗体とが抗原抗体反応を起こすことのできる状態にする。例えば、抗原ＲＮＡがプレート状、ウェル状、チップ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合には、これらの固相担体の抗原ＲＮＡが固定化された表面に対して抗体ライブラリーを滴下すればよい。また、抗原ＲＮＡが粉末状、ビーズ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合には、固定化された抗原ＲＮＡと、抗体ライブラリーとを抗原抗体反応のための容器中で混合すればよい。
【００３３】
ここで、抗原抗体反応のための反応温度は、使用する抗体ライブラリーに含まれる抗体と、抗原ＲＮＡが抗原抗体反応できる範囲の温度であればよく、抗原や抗体の種類に合わせて当業者が適宜設定することができる。なお、抗原抗体反応を促進させるために、抗原ＲＮＡと抗体とを接触させる反応液を攪拌したり、振盪させたりしてもよい。
【００３４】
［特異的抗体の回収］
次に、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する。このために、まず、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに結合しなかった、非特異的抗体を除去する。抗原ＲＮＡがプレート状、ウェル状、チップ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合は、例えば、固相担体を洗浄することで、抗原ＲＮＡに結合しなかった非特異的抗体を除去することができる。一方、抗原ＲＮＡが粉末状、ビーズ状等の形状の固相担体の表面に固定化されている場合、例えば、固相担体の重さを利用し、遠心分離法によって固相担体−抗原ＲＮＡ−特異的抗体の複合体を沈殿させた後、上清を除去する工程を繰りかえすことにより、固相担体を洗浄すればよい。なお、洗浄には、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡを剥離する作用を有さず、かつ、抗原ＲＮＡと特異的抗体との結合を解離させないような洗浄液を用いればよく、例えば、ＰＢＳやＴｗｅｅｎ含有ＰＢＳ、Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳ等の生理的緩衝液を用いることができる。
【００３５】
このように、非特異的抗体を除去した後、抗原ＲＮＡと特異的抗体を解離させることにより特異的抗体を回収することができる。抗原ＲＮＡと特異的抗体とを解離させるには、例えば、グアニジン塩酸塩、カオトロピック塩（ドデシル硫酸ナトリウム、ヨウ化カリウム等）、尿素等を用いるような、当業者に周知のｐＨ調整方法を用いて処理すればよい。回収した特異的抗体は、タンパク質の濃縮用フィルター等を用いて適切な濃度に調製し、抗原ＲＮＡに対する特異的抗体として用いることができる。
【００３６】
又は、スクリーニングに用いた抗体ライブラリーがファージ提示型人工抗体を含むものであって、抗原ＲＮＡに結合した抗体がファージ提示型特異的抗体である場合、前述のように非特異的抗体を除去した後、抗原ＲＮＡに結合したファージ提示型特異的抗体をトリプシンやTryPLE Express (インビトロジェン社)等のプロテアーゼで処理することによりファージ提示型特異的抗体のファージ部分のみを遊離させ、回収することができる。回収したファージは、宿主細胞に感染させることにより、増幅させることができる。
【００３７】
なお、特異的抗体のスクリーニングにおいて、取得された抗体中の特異的抗体の割合を高めるために、スクリーニング工程を複数回繰り返して行うことが好ましい。具体的には、初回のスクリーニングにより回収された抗体を、抗体ライブラリーの代わりに用い、１回目のスクリーニングと同じ抗原を用いてスクリーニング工程を繰り返す。この際、好ましくは合計２回以上、より好ましくは合計３回以上のスクリーニング工程を繰り返すことにより、取得された抗体中の抗原特異的抗体の割合を高めることができる。
【００３８】
また、スクリーニングにおける、抗原ＲＮＡと非特異的抗体との間の非特異的結合を減らすために、抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程において、反応溶液に非特異的ＲＮＡを添加することが好ましい。この際の、非特異的ＲＮＡの添加量は、１０μｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌであることが好ましく、１００μｇ/ｍｌ〜１ｍｇ/ｍｌであることがさらに好ましい。スクリーニング工程を複数回繰り返す場合には、２回目以降のスクリーニングにおいて非特異的ＲＮＡを添加することが好ましく、スクリーニングを繰り返す毎に、異なる非特異的ＲＮＡを添加することがより好ましい。非特異的ＲＮＡとしては、例えば、大腸菌由来ｔＲＮＡもしくは酵母由来ｔＲＮＡを使用することができる。
【００３９】
スクリーニングにおける、抗原ＲＮＡと非特異的抗体との間の非特異的結合をさらに減らすために、抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程の前にブロッキングを行うことが好ましい。具体的には、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに対し、ブロッキング剤を接触させる。使用するブロッキング剤は周知のものから当業者が適宜選択すればよいが、例えば、ＢＳＡ溶液や、市販のブロッキング剤であるPerfectBlock（フナコシ社）BlockAce（雪印乳業）等を使用することができる。なお、スクリーニング工程を複数繰り返す場合には、１回目、２回目、３回目で異なるブロッキング剤を使用することが好ましい。
【００４０】
＝＝抗ＲＮＡ抗体の製造方法＝＝
スクリーニング後、ファージ提示型人工抗体ライブラリーを用いて回収されたファージ提示型特異的人工抗体は、抗原ＲＮＡに特異的な抗原結合部位を有する抗ＲＮＡ抗体の製造に使用することができる（例えば、Kerbs B. et al., J. Immunol. Methods 254 (1-2): 67-84, 2001 参照）。
【００４１】
まず、回収されたファージ提示型特異的人工抗体の抗原結合部位を有する抗ＲＮＡ抗体を発現することのできる組換え発現ベクターを作製する。すなわち、回収したファージから人工抗体をコードするＤＮＡを単離し、発現ベクターに導入する。
【００４２】
抗体の抗原結合部位（Ｖ部）は、重鎖のＶＨ領域と軽鎖のＶＬ領域から構成され、定常部（Ｃ部）は重鎖のＣＨ領域、軽鎖のＣＬ領域、およびＦＣ領域から構成される。完全抗体は重鎖と軽鎖各２本ずつからなる４量体を基本構造としているので、抗原結合部位と定常部を持つ完全抗体を製造するためには、例えば、重鎖を構成する各領域をコードするＤＮＡを有する、重鎖を発現できる組換えベクター、及び、軽鎖を構成する各領域をコードするＤＮＡを有する、軽鎖を発現できる組換え発現ベクターを調製する。又は、複数のタンパク質を発現することのできる発現ベクターに対し、重鎖を構成する領域をコードするＤＮＡ、軽鎖を構成する領域をコードするＤＮＡの両方を導入し、組換え発現ベクターを調製してもよい。あるいは、ＶＨ、ＣＨ領域から構成される重鎖の一部とＶＬ、ＣＬ領域から構成される軽鎖の一部とからなるＦａｂ抗体や、ＶＨ領域から構成される重鎖の一部とＶＬ領域から構成される軽鎖の一部とからなるＦｖ抗体を製造するためには、それぞれ、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬの各領域をコードするＤＮＡを１つ又は複数の発現ベクターに導入し、ＶＨ、ＣＨ領域から構成される重鎖の一部、ＶＬ、ＣＬ領域から構成される軽鎖の一部を発現できる組換え発現ベクターを調製する。
【００４３】
ここで、発現ベクターは、宿主細胞の種類、宿主細胞への組換え発現ベクターの導入方法、タンパク質発現効率などを考慮して、当業者が周知の発現ベクターから適宜選択することができ、プラスミドベクターであっても、レトロウイルスやアデノウイルスに由来するウイルスベクターであってもよい。なお、発現ベクターは、導入したＤＮＡを発現するのに適したプロモーターやターミネーター等を予め含んでいることが好ましいが、含んでいない場合には適宜必要なＤＮＡを導入して調製してもよい。
【００４４】
次に、調製した組換え発現ベクターを宿主細胞に導入する。この際、宿主細胞としては、組換え発現ベクターから所望の抗ＲＮＡ抗体を発現できる細胞であれば制限されず、大腸菌、又は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ−３Ｔ３等の哺乳類培養細胞、又は、ＳＦ９等の昆虫培養細胞であってもよい。
【００４５】
組換え発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、当業者に周知の方法から、宿主細胞や発現ベクターの種類を考慮して適宜選択することができ、例えば、エレクトロポーテーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法や、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（ロシュアプライドサイエンス社）、Lipofextamine LTX（インビトロジェン社）、Lipofextamine 2000（インビトロジェン社）、polyethyleneimine等の市販の試薬を用いた方法が挙げられる。
【００４６】
以上のように組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を、その細胞種に適した培地、及び環境下で培養すると、宿主細胞中で組換え発現ベクターが発現した抗ＲＮＡ抗体は宿主細胞の培養液中に放出される。
【００４７】
以上のように培養液中に放出された抗ＲＮＡ抗体は、宿主細胞の培養液を採取することによって回収できる。回収された抗ＲＮＡ抗体は、前述のスクリーニング方法に使用した抗原ＲＮＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーやプロテインＡを用いて、精製したり、必要に応じて濃縮したりしてもよい。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
本実施例では、固相担体に固定化した抗原ＲＮＡに対する特異的抗体を人工抗体ライブラリーからスクリーニングした。
【００４９】
＝＝ＲＮＡ抗原の固相担体への固定化＝＝
（アミノ基共有結合固定化法によるＲＮＡの固定化）
本研究で抗原に用いた一本鎖ＲＮＡの塩基配列は、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４８〜９３ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９２２〜２０２０ ｎｔ領域に相当する。これらの一本鎖ＲＮＡの５’末端にアミノ基を導入した一本鎖ＲＮＡは、Greiner bio-one社により委託合成した。
【００５０】
このようにアミノ基を導入した各ＲＮＡ抗原を、２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、９６穴マイクロプレート（Nunc Immobolizer AMINO plate カタログ番号436013、Nunc 社）の１ウェルあたり５０μｌ（1ウェルあたり１００ｎｇ）加えた。室温で１時間放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、これを抗原ＲＮＡプレートとした。
【００５１】
（ビオチン標識法及び末端ビオチン標識法によるＲＮＡの固定化）
ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９１２〜２０９３ ｎｔ領域、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ（８３ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ（７８ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ（７７ ｎｔ全長）の５種類のＲＮＡをビオチン標識法によって固定化し、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）を末端ビオチン標識法によって固定化した。
【００５２】
具体的には、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡのステムループII領域（４〜１４７ ｎｔ）、ヒト２８ＳｒＲＮＡの１９１２〜２０９３ ｎｔ領域、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ（８３ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ（７８ ｎｔ全長）、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ（７７ ｎｔ全長）の５種類のＲＮＡについて、各鋳型ＤＮＡを作製するために、それぞれに特異的な以下のプライマーを用い、Expand High FidelityPLUS PCR System (Roche 社)によりＰＣＲを行った。
ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ用プライマーペア：
U1-F: CTTACCTGGCAGGGGAGATA（配列番号１）
U1-R: AAGCGCGAACGCAGTCCCCC（配列番号２）
ヒト２８ＳｒＲＮＡ用プライマーペア：
28S-F: GCTCATCAGACCCCAGAAA（配列番号３）
28S-R: CTCCCGTCCACTCTCGACT（配列番号４）
ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U44-F: TTTTGACTAGGGTGAGGAATCTG（配列番号５）
U44-R: AGACGGGACCAGATCAGACA（配列番号６）
ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U76-F: TGCATATGATGACCCTATTTGCT（配列番号７）
U76-R: TGCTTCAGACAAGGTATTTTGG（配列番号８）
ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ用プライマーペア：
U78-F: TTTTGGGTTTTGTGATGCTCT（配列番号９）
U78-R: GGCTTGAGTTTCAGTCAAAGATAA（配列番号１０）
【００５３】
得られたＰＣＲ産物をpGEM-T Easy Vector（pGEM（登録商標）-T Easy Vector System I、Promega 社）のＴ７プロモーター下流にクローニングし、大腸菌(DH5α)を形質転換した。大腸菌から回収したプラスミドを鋳型ＤＮＡとし、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ (Roche 社)を用いて in vitro 転写した。ここで、in vitro 転写の際、５種類の一本鎖ＲＮＡ(ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ４４ｓｎｏＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ７６ｓｎｏＲＮＡ、ゼブラフィッシュＵ７８ｓｎｏＲＮＡ)をビオチン標識するために、基質にBiotin‐16‐UTP（Ambion 社）を含むＮＴＰ（Promega 社）を用いることにより、ＲＮＡの塩基配列中の一部のＵＴＰとしてBiotin-16-UTPを取り込ませた（ビオチン標識法）。また、ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを末端ビオチン標識するために、未標識の一本鎖ＲＮＡをin vitro 転写により作製し精製した後、その３’末端にbiotin-16-ddUTP (Roche 社)をターミナルトランスフェラーゼ(Roche 社)により結合させた（末端ビオチン標識法）。
【００５４】
このようにビオチンで標識した各ＲＮＡ抗原を固定化するため、まず、抗ビオチン抗体(B3640-1MG、 SIGMA-ALDRICH 社)を最終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶解し、９６穴マイクロプレート（Immobolizer AMINO plate カタログ番号436013、Nunc 社、又は、カタログ番号675161、Greiner bio-one 社）の１ウェルあたりに５０μｌ（1ウェルあたり１μｇ）ずつ加えた。室温で１時間放置した後、ＰＢＳＴでウェルを洗浄して、過剰な抗ビオチン抗体を除去した。次に、ＰＢＳに溶解したビオチン標識ＲＮＡを２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、上記抗ビオチン抗体固定化済み９６穴マイクロプレートの１ウェルあたりに５０μｌ（1ウェルあたり１００ｎｇ）ずつ加え、室温で１時間放置した後、ＰＢＳＴで洗浄し、これを抗原ＲＮＡプレートとした。
【００５５】
＝＝特異的抗体のスクリーニング＝＝
各方法により調製した抗原ＲＮＡプレートの各ウェルに対し、ブロッキング剤（ＰＢＳで３％に希釈したＢＳＡ溶液、SIGMA社）を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング剤を除去した後、ファージ提示型人工抗体ライブラリー（特許第４１７１８４４号の実施例に従い調製）を５０μｌずつ各ウェルに加え、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄することにより抗原ＲＮＡに結合しなかったファージ提示型人工抗体を除去した後、TryPLE Express（インビトロジェン社）を各ウェルに５０μｌずつ加え、２５℃で５分間放置した。この処理により、抗原ＲＮＡに結合したファージ提示型人工抗体の抗体部分とファージ部分とが解離し、ファージが液中に放出される。このファージ液をピペットマンで各ウェルから回収した。再度、各ウェルにTryPLE Expressを５０μｌ加え、２５℃で５分間放置した後、ファージ液をピペットマンで回収した。１回目と２回目に回収されたファージ液は混合し、以下の工程に使用した。
【００５６】
このように得られたファージ液をｐＦＳＤ４ａ（図２、配列番号１１）保有大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株液とＰＤＧ培地５ｍｌ (Sp （スペクチノマイシン） 50μ g/ml含有)に加え、５０回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。ここに、濃縮済みヘルパーファージM13AX1を５μｌ（5x109 pfu以上）添加し素早く混ぜ、２５℃で５分間インキュベートした。ＰＤＧ培地（Sp 50 μg/ml、anhydrotetracycline (aTet) 2.5 ng/ml、Arabinose 0.01%、IPTG 1 mM含有）を２０ｍｌ添加し、５０回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。さらに抗生剤液（Carbenicillin (Cr) 50 μg/ml、Chrolamphenicol(Cm) 12.5 μg/ml、Kanamycine (Kn) 50 μg/ml、aTat 10 ng/ml）を加えて１８０回転／分で振盪しながら２５℃で４８時間インキュベートした。これにより、抗原ＲＮＡに特異的な抗体を提示するファージを増幅した。
【００５７】
インキュベート開始から４８時間後、ファージ液を５０ｍｌ遠心管に移し、４℃、８０００×ｇで１０分遠心した。ファージ提示型特異的抗体の含まれる上清を回収し、２０％ＰＥＧ６０００−５Ｍ ＮａＣｌ溶液を上清全量１に対して１／４量加え、４℃で１時間インキュベートした後、４℃、８０００×ｇで１０分遠心することによって、ファージ提示型特異的抗体を沈殿させた。このペレットをＰＢＳ １ｍｌに懸濁した。
【００５８】
このようにして得られたファージ提示型特異的抗体の懸濁液をファージ提示型人工抗体ライブラリーの代わりに用い、ここに酵母の１０μｇ/ウェルのｔＲＮＡを添加した後に抗原ＲＮＡと接触させ、上記方法に従ってスクリーニングをさらに２回繰り返し、合計３回行った。なお、この際、ブロッキング剤に結合する抗体を除くため、スクリーニングを繰り返す毎に異なるブロッキング剤を使用した。１回目には前述のようにＢＳＡ（ＰＢＳで３％に希釈した溶液、SIGMA社）を使用したが、２回目にはPerfectBlock（ＰＢＳで９％に希釈した溶液、フナコシ社）、３回目にはBlockAce（原液、雪印乳業）を用いた。抗原ＲＮＡのプレートのサブトラクションには１０μｇ/ウェルの抗原以外のＲＮＡを用いた。抗Ｕ１ＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目には２８ＳｒＲＮＡ(非標識)を用いた。抗２８ＳｒＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ１ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ４４ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ７６ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ７６ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ７８ＲＮＡ(非標識)を用いた。抗Ｕ７８ｓｎｏＲＮＡ抗体のスクリーニングの２回目には酵母のｔＲＮＡ(非標識)、スクリーニング３回目にはＵ４４ＲＮＡ(非標識)を用いた。
【００５９】
ここで、リン酸バッファーを用いたアミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡに対し、ファージ提示型人工抗体ライブラリー（特許第４１７１８４４号の実施例に従い調製）から特異的抗体のスクリーニングを行う際に、複数のブロッキング剤の導入、ｔＲＮＡの添加、非標識ＲＮＡの添加等の本実施例で採用したような工程を導入しなかった場合には、特異的抗体を得ることができなかった。これは、抗原ＲＮＡとファージ提示型人工抗体との非特異的な反応や、抗原ＲＮＡの分解が生じたためであると考えられた。一方、本実施例に記載の方法によって多数のファージ提示型特異的抗体が得られた。従って、本実施例に記載のスクリーニング方法は、顕著な効果を有しているといえる。
【００６０】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で得られたファージ提示型特異的抗体から、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有するファージ提示型特異的抗体を選択した。
【００６１】
実施例１においてファージを感染させたｐＦＳＤ４ａ保有大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の培養液２０ｍｌから０．１、１、又は１０μｌを、ＬＢ寒天培地（Cr 50 μg/ml、Sp 50 μg/ml含有）に播種した。３０℃で２晩培養し、コロニーを形成させた。下記プライマーペアを用いたＰＣＲ法によって、各コロニーの抗体クローンについてファージ提示型特異的抗体のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡの塩基長を確認した。
pFab5seq-f：5'- GATTTGCGCTGTCGCTCCTTG -3'（配列番号１２）
pFab5seq-r：5'- CCCAGCCAGGCTTCCACATCAC -3'（配列番号１３）
【００６２】
ＶＨ領域及びＶＬ領域をコードするＤＮＡは通常約８００〜９００ｂｐである。従って、約８００〜９００ｂｐの完全長のインサートを有することが確認できた抗体クローンを選択した。実施例１において、ビオチン標識ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られたファージ提示型特異的抗体を用いてインサートの塩基長を確認した結果を図１に示す。スクリーニングを計２回繰り返して得られたファージ提示型特異的抗体では１６クローン中９クローン（５６％）が完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を含んでいたが（図１Ａ）、スクリーニングを計３回繰り返して得られたファージ提示型特異的抗体では１６クローン中全て（１００％）が完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を含んでいた（図１Ｂ）。また、その他のＲＮＡ抗原を用いて、スクリーニングを２回、及び３回行うことにより得られたファージ提示型特異的抗体における、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域を有するクローン率（％）を表１に示す。
【表１】
【００６３】
このように、ビオチン標識法又は末端ビオチン標識法により固定化したＲＮＡ抗原を使用して、スクリーニングを前述のように３回行うことにより、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含むファージ提示型人工抗体をより高い確率で得ることができる。
【００６４】
［実施例３］
本実施例では、実施例２で得られた完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有するファージ提示型人工抗体が抗原ＲＮＡに対して抗原特異性を有することを検証した。また、スクリーニングに用いる抗原ＲＮＡの固定化方法の種類と、選択されるファージ提示型人工抗体の抗原特異性について検証した。
【００６５】
＝＝ＥＬＩＳＡ法＝＝
約８００〜９００ｂｐのインサートを有し、完全長のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを有することが確認されたクローンのファージ提示型特異的抗体について、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗原ＲＮＡに対する抗原特異性（Ｓ／Ｎ比）を調べた。
【００６６】
具体的には、実施例１に記載の方法に従い、アミノ基共有結合固定化法又はビオチン標識法によってヒトＵ１ｓｎＲＮＡ又はヒト２８ＳｒＲＮＡを９６ウェルプレートのウェルに固定化した（固定化ウェル）。一方、対照として、抗原ＲＮＡを固定化しないウェル（対照ウェル）を用いた。固定化ウェルと対照ウェルに対し、ブロッキング剤(Ｎ１０１をＰＢＳで５倍希釈した溶液、日油株式会社)を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ特異的抗体、又は、ヒト２８ＳｒＲＮＡ特異的抗体について、実施例２の方法により、ＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含むことが確認された各９６クローンのファージ提示型特異的抗体２５μｌを添加して３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。
【００６７】
固定化ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、各ウェルにファージ提示型特異的抗体を含む培養上清２５μｌを加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰なファージ提示型特異的抗体を除去した。さらに、５０００倍希釈した抗ヒトIgG (Fab特異的) POD標識ヤギ宿主抗体（A0293、1mL、SIGMA-ALDRICH 社）２５μｌを加え、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰な二次抗体を除去した。ここに、可視化のための基質としてo-phenylenediamine (5 mg OPD tablet、P6912 SIGMA-ALDRICH 社)１個を４μｌ／１１mｌ過酸化水素水に溶解した溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４９２〜５９５ｎｍ）を測定した。固定化ウェルの吸光度と対照ウェルの吸光度との比を計算し、固定化ウェル／対照ウェル（Ｓ／Ｎ）＝１．２５以上のファージ提示型特異的抗体のクローンを陽性抗体クローンと判断した。
【００６８】
各抗原ＲＮＡに対する特異的抗体のＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡを含む９６クローンのうち、抗原ＲＮＡに対する特異性が陽性と判断されたクローン（陽性抗体クローン）数を表２に示す。
【表２】
【００６９】
本実施例の結果は、抗体ライブラリーからの抗体のスクリーニングにおいて、ビオチン標識法により固定化した抗原ＲＮＡを用いた場合の方が、アミノ基共有結合固定化法により固定化した抗原ＲＮＡを用いた場合に比較して、抗原ＲＮＡに対して特異性を有する抗体をより多く得られることを示している。
【００７０】
［実施例４］
本実施例では、実施例１〜３において得られた抗原ＲＮＡに対して特異的なファージ提示型特異的抗体を利用し、ＩｇＧを作製した。
【００７１】
実施例３で得られた全ての陽性抗体クローンについて、ＶＨ領域とＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列を決定した。このＤＮＡ配列について、統合Ｖ遺伝子データベース（ＶＢＡＳＥ２、http://www.vbase2.org/）においてＢＬＡＳＴ検索を行い、ＶＨ領域とＶＬ領域からなる抗原結合部位における、相補性決定領域（超可変領域、ＣＤＲ）と、それ以外の比較的変化の少ないフレームワーク領域（ＦＲ）を同定した。なお、相補性可変領域はＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の３領域から成り、フレームワーク領域はＦＲ１〜ＦＲ４の４領域から成る。
【００７２】
このように配列決定した全７３の陽性抗体クローンのうち、３５個は新規な抗原結合部位を有していた。これらのフレームワーク領域は９０％以上の相同性を有していた。一方、ＣＤＲ３領域では、ＣＤＲ３領域の全長が０〜２０アミノ酸、そのうち新規に挿入されたのは０〜１７アミノ酸であり、多様性が高かった。前述の新規な抗原結合部位を持つ抗体として、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）抗体は１０種類、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）抗体は１７種類、抗２８ＳｒＲＮＡ抗体（アミノ基共有結合）は８種類が、それぞれ得られた。これらのうち、翻訳フレームのずれ、ストップコドン挿入、ＶＨ領域又はＶＬ領域の欠損等がなく、ＩｇＧ化に必要な配列が欠損していないことが確認された抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）抗体の１０種類、及び、抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）抗体の１５種類について、ＩｇＧを調製した。
【００７３】
＝＝ＩｇＧの調製＝＝
このように得られた新規な抗原結合部位を有するＩｇＧを、以下のように作製した。使用した発現ベクターは配列番号１４、１５、１６の塩基配列を有し、そのベクターマップをそれぞれ図３（pHIgH4zeo）、４（pHIgK4neo）、５（pHIgL4neo）に示す。余分なアミノ酸配列が、発現するＩｇＧタンパク質中に挿入されないようするため、ＶＨ領域をコードするＤＮＡとＶＬ領域をコードするＤＮＡのそれぞれを、ベクターと相同的な１５塩基を５’側に有する、以下に示す特異的プライマーを用いて増幅し、クローンテック社製InFusion PCRクローニングキットを用いてベクターのEsp3I部位に組み込んだ。なお、pHIgH4zeoにはＶＨ領域をコードするＤＮＡを、pHIgK4neoにはKappa鎖由来ＶＬ領域ＤＮＡを、pHIgL4neoにはlambda鎖由来ＶＬ領域ＤＮＡを、それぞれ組み込み、ＶＨ領域組換え発現ベクター、Kappa鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター、及び、lambda鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクターを調製した。これらの組換えベクターについて、導入したＤＮＡの塩基配列を確認した後、GenoMed 社EndoFree Midi Plasmid精製キットを用いて精製した。
【００７４】
なお、以下の配列番号１７から３５の塩基配列において、ｄ、ｒ、ｓ、ｎ、ｗ、ｙ、ｈは縮重塩基を示し、ｄはＡ、Ｇ、又はＴ、ｒはＡ又はＧ、ｓはＣ又はＧ、ｎはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ、ｗはＡ又はＴ、ｙはＣ又はＴ、ｈはＡ、Ｃ、又はＴを示す。
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf2：5'- ggtgcctagctccggcGAwATTGTrhTGACnCAGwCT -3'（配列番号２１）
Ｌ鎖用：EXVLr1.2：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATyTCCAGTCGTGTCCCT -3'（配列番号２２）
Ｈ鎖用：ExVHf4：5'- ccttccgtgctgtctCAGrTCACCTTGAAGGAGTC -3'（配列番号２３）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'(配列番号２０)
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン５調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf9：5'- ggtgcctagctccggcTCCTATGwGCTGACwCAGCCA -3'（配列番号２４）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf6：5'- ggtgcctagctccggcCAGdCTGTGGTGACyCAGGAG -3'（配列番号２６）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr5：5'- tgggcccttggtcgacGCsGATGGGCCCTTGGTGGArGC -3'（配列番号２７）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン２８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３０調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン３８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf3：5'- ggtgcctagctccggcGAAACGACACTCACGCAGTCT -3'（配列番号２９）
Ｌ鎖用：EXVLr1.2：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATyTCCAGTCGTGTCCCT -3'（配列番号２２）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン４６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(アミノ基共有結合)ＩｇＧ クローン７６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr4：5'- tgggcccttggtcgacGCGGTTGGGGCGGATGCACTCC -3'（配列番号３０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf5：5'- ggtgcctagctccggcCAGCCTGTGCTGACTCAryC -3'（配列番号３１）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン１７調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン２７調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf1：5'- ggtgcctagctccggcGACATCCCrGdTGACCCAGTC -3'（配列番号３２）
Ｌ鎖用：EXVLr2.1：5'- gaagacagatggggcCGCCACAGTTCGTTTrATATCCACTTTGGTCCCA -3'（配列番号３３）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン２８調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf8：5'- ggtgcctagctccggcCAGTCTGyyCTGAyTCAGCCT -3'（配列番号２８）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr3：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT -3'（配列番号３４）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３０調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf6：5'- ggtgcctagctccggcCAGdCTGTGGTGACyCAGGAG -3'（配列番号２６）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン３４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン４１調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン5２調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf11：5'- ggtgcctagctccggcTCCTCTGAGCTGAsTCAGGA -3'（配列番号３５）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr4：5'- tgggcccttggtcgacGCGGTTGGGGCGGATGCACTCC -3'（配列番号３０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン６３調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf11：5'- ggtgcctagctccggcTCCTCTGAGCTGAsTCAGGA -3'（配列番号３５）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン７４調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr4：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTTGGTGC -3'（配列番号２５）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９）
Ｈ鎖用：ExVHr3：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT -3'（配列番号３４）
抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ(ビオチン標識)ＩｇＧ クローン７６調製用プライマー：
Ｌ鎖用：ExVLf12：5'- ggtgcctagctccggcAATTTTATGCTGACTCAGCCC -3'（配列番号１７）
Ｌ鎖用：EXVLr5：5'- gaagacagatggggcACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGC -3'（配列番号１８）
Ｈ鎖用：ExVHf1：5'- ccttccgtgctgtctCAGGTGCAGCTrCAGsAGT -3'（配列番号１９
Ｈ鎖用：ExVHr1：5'- tgggcccttggtcgacGCTGAGGAGACrGTGACCAGGGT -3'（配列番号２０）
【００７５】
ＩｇＧ発現のための宿主細胞として使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培地において、８０％コンフルエントまで５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養した。トランスフェクション当日、常法のトリプシン処理によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、0.5％(w/v)Yeast Extracts (GIBCO社製) 添加及び２%超低ＩｇＧ牛胎児血清（Super Low IgG FBS カタログ番号SH30898.02、HyClone 社製）添加及びGentamycin 50 μg/ml添加MegaCell DMEM/F12培地（カタログ番号M4192、SIGMA-ALDRICH社）に懸濁した。この細胞懸濁培地溶液を、７０〜８０％コンフルエントになるように、コラーゲンコート１０ｃｍディッシュ（カタログ番号11-018-006、IWAKI社）に１０ｍｌ播種した。
【００７６】
このように調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対し、精製した各組換え発現ベクターをポリエチレンイミンによってトランスフェクトした。具体的には、ＶＨ領域組換え発現ベクター、Kappa鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター、及び、lambda鎖由来ＶＬ領域組換え発現ベクター各７．５μｇを１ｍｌのOptiMEM培地(インビトロジェン社)に添加、混合した後、Polyethylenimine Max（カタログ番号24765-2、 40 mg/ml 5% Glucose溶液、Polyscience社）１．５μｌを添加して素早く混合した。この混合液を、３０分室温で放置した後、上記のように調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、５％ＣＯ２存在下で３７℃で培養した。
【００７７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に各組換え発現ベクターを添加後２日目に培地を回収して新たな培地に交換し、４日後（培地交換からさらに２日後）まで培養してから再び培地を回収した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が発現、放出したＩｇＧを含む、２日目と４日目に回収した培地は混合し、未精製でＥＬＩＳＡ法による検証に用いた。
【００７８】
＝＝ＩｇＧの抗原ＲＮＡに対する特異性のＥＬＩＳＡ法による検証＝＝
上記のようにして得られた、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧ１０種類、及び、抗Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧ１５種類について、抗原ＲＮＡに対する特異性（Ｓ／Ｎ比）を調べた。まず、実施例１の「アミノ基共有結合固定化法によるＲＮＡの固定化」、及び、「ビオチン標識法及び末端ビオチン標識法によるＲＮＡの固定化」の記載に従い、９６ウェルプレートにヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、あるいはヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化した。
【００７９】
アミノ基共有結合固定化法により抗原ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、対照群としてヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルに対し、ブロッキング剤（Ｎ１０１をＰＢＳで５倍希釈した溶液、日油株式会社）を加え、５００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間ブロッキングした。このウェルに対し、５０μｌの１０種類の抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（アミノ基共有結合）ＩｇＧを添加し、３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。過剰なＩｇＧをＰＢＳＴで洗浄し、除去した後、１ウェルあたりＨＲＰ標識プロテインＡ（カタログ番号32400、Thermo scientific社製）を５μｇ加えた。３００回転／分で振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄し、過剰なＨＲＰ標識プロテインＡを除去した。ここに、可視化のための基質としてo-phenylenediamine (5 mg OPD tablet、P6912 SIGMA-ALDRICH 社)１個を４μｌ／１１mｌ過酸化水素水に溶解した溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、吸光度（４９２〜５９５ｎｍ）を測定した。ヒトＵ１ｓｎＲＮＡを固定化したウェルの吸光度と、対照群のヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルの吸光度との比を計算した（図６Ａ）。
【００８０】
また、ビオチン標識法によりヒトＵ１ｓｎＲＮＡ、対照群としてヒト２８ＳｒＲＮＡを固定化したウェルに対し、１５種類の抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ（ビオチン標識）ＩｇＧを用いて同様にＥＬＩＳＡ法を行った（図６Ｂ）。
【００８１】
図６Ａ、Ｂに示す様に、アミノ基共有結合固定化法により固定化された抗原ＲＮＡを用いてスクリーニングされた抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ抗体では、１０種類の抗体中７種類が有意に特異的であった。一方、ビオチン標識法により固定化された抗原ＲＮＡを用いてスクリーニングされた抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ抗体では、１５種類の抗体中１３種類が有意に特異的であった。
【００８２】
＝＝ファージ提示型人工抗体とＩｇＧとの比較＝＝
ここで、実施例３でＥＬＩＳＡ法により解析したファージ提示型特異的抗体のうち、陽性クローンと判断された抗体の抗原特異性（固定化ウェル／対照ウェル）、及び、本実施例４においてＥＬＩＳＡ法により解析したＩｇＧの抗原特異性（抗ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ添加群／対照群）を比較した結果を図７に示す。図７Ａはアミノ基共有結合固定化法により固定化したヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られた抗体、図７Ｂはビオチン標識法により固定化したヒトＵ１ｓｎＲＮＡを抗原として得られた抗体であるが、どちらの固定化法による場合であっても、ＩｇＧの方がファージ提示型特異的抗体よりも特異性が高い傾向があり、特にビオチン標識法の場合には、ＩｇＧの方がファージ提示型特異的抗体よりも有意に特異性が高かった。また、アミノ基共有結合固定化法の場合とビオチン標識法の場合のＩｇＧについて比較すると、ビオチン標識法の場合に、特異性が顕著に高かった。
【００８３】
この結果は、抗ＲＮＡ抗体の抗体ライブラリーからのスクリーニング方法において、ビオチン標識法によって抗原ＲＮＡを固相担体に固定化した場合に、アミノ基共有結合固定化法により固定化した場合よりもさらに特異性の高い抗体を得ることができることを示している。また、スクリーニングによって得られた抗体の抗原結合部位を有するＩｇＧを調製することで、抗原ＲＮＡに対する特異性がさらに高く、Ｓ／Ｎの高い優れた抗体を得ることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、
固相担体に固定化された前記抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、
前記抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記抗体ライブラリーが、ファージ提示型人工抗体ライブラリーであることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ファージ提示型人工抗体ライブラリーが、
（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、
（ＩＩ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、
（ＩＶ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、
（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、
を含む製造方法によって製造された一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記抗原ＲＮＡにビオチンが結合しており、前記固相担体に固定化されているビオチン特異的抗体に対し前記ビオチンが結合することによって、前記抗原ＲＮＡが前記固相担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
非特異的ＲＮＡの存在下で、前記抗原ＲＮＡと人工抗体とを接触させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）で回収された抗体を抗体ライブラリーとして用い、一連の工程（ａ）（ｂ）をさらに２回以上行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗原ＲＮＡに特異的な抗体の製造方法であって、
請求項２〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって、前記抗原ＲＮＡに特異的なファージ提示型人工抗体をスクリーニングする工程と、
前記スクリーニングによって得られたファージから、前記人工抗体の抗原結合部位をコードするＤＮＡを回収する工程と、
前記ＤＮＡを有し、前記抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、
前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記抗体を発現させる工程と、
前記宿主細胞又はその培養液から前記抗体を回収する工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１】
抗原ＲＮＡに対して特異的な抗体を得るためのスクリーニング方法であって、
固相担体に固定化された前記抗原ＲＮＡと抗体ライブラリーに含まれる抗体とを接触させる工程（ａ）と、
前記抗原ＲＮＡに結合した特異的抗体を回収する工程（ｂ）と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
前記抗体ライブラリーが、ファージ提示型人工抗体ライブラリーであることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ファージ提示型人工抗体ライブラリーが、
（Ｉ）ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてイムノグロブリン遺伝子のＶＨ領域又はＶＬ領域のＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをそれぞれＰＣＲ法により増幅する工程、
（ＩＩ）前記ＶＨ領域及びＶＬ領域における、それぞれのＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域を含む断片と、ＣＤＲ３領域を含む断片とをシャッフリングし、ＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをそれぞれ作製する工程と、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）により得られたＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーを異なる２つの非発現系ベクターに組み込む工程と、
（ＩＶ）前記ＶＨライブラリーが組み込まれた非発現ベクターと、ＶＬライブラリーが組み込まれた非発現ベクターを共に宿主内に導入し、ＶＨライブラリーにおけるＶＨ領域とＶＬライブラリーにおけるＶＬ領域をシャッフリングし、ＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体を発現する発現ベクターを作製する工程と、
（Ｖ）シャッフリングにより得られたＶＨ領域とＶＬ領域を有する一本鎖抗体をファージ表面にディスプレイさせる工程と、
を含む製造方法によって製造された一本鎖抗体ライブラリーであることを特徴とする、請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記抗原ＲＮＡにビオチンが結合しており、前記固相担体に固定化されているビオチン特異的抗体に対し前記ビオチンが結合することによって、前記抗原ＲＮＡが前記固相担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
非特異的ＲＮＡの存在下で、前記抗原ＲＮＡと人工抗体とを接触させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）で回収された抗体を抗体ライブラリーとして用い、一連の工程（ａ）（ｂ）をさらに２回以上行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗原ＲＮＡに特異的な抗体の製造方法であって、
請求項２〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によって、前記抗原ＲＮＡに特異的なファージ提示型人工抗体をスクリーニングする工程と、
前記スクリーニングによって得られたファージから、前記人工抗体の抗原結合部位をコードするＤＮＡを回収する工程と、
前記ＤＮＡを有し、前記抗原結合部位を有する抗体を発現する組換え発現ベクターを作製する工程と、
前記組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記抗体を発現させる工程と、
前記宿主細胞又はその培養液から前記抗体を回収する工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２２８２０９（Ｐ２０１２−２２８２０９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９８６９８（Ｐ２０１１−９８６９８）
【出願日】平成２３年４月２６日（２０１１．４．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、重点地域研究開発推進プログラム（シーズ発掘試験）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２６日（２０１１．４．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、重点地域研究開発推進プログラム（シーズ発掘試験）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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