操作された微小胞を用いた真核細胞のリプログラミング
本発明は、少なくとも一つのリプログラミング転写因子を担持する、操作された微小胞を使用することによって、真核細胞をリプログラミングするための、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を得るための非遺伝的で界面活性剤不含の無細菌法に関し、ここで、該操作された微小胞は、ウイルスフリーである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、真核細胞をリプログラミングするための、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を得るための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
哺乳動物細胞は、診断応用および医学応用におけるin vitroモデルに広く使用される。例えば、哺乳動物細胞は、薬物をスクリーニングするため、分子経路を研究するため、または治療薬の製造に使用されることがある。哺乳動物細胞は、また、細胞療法のために使用することができる。
【０００３】
哺乳動物幹細胞は、全ての哺乳類生物から見出される始原細胞（primal cell）であり、有糸細胞分裂により自己を再生する能力を保持し、多様な範囲の専門化された細胞種類に分化することができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞の内部細胞集塊の胚盤葉上層組織由来細胞の培養物である。
【０００４】
無制限のエクスパンションおよび多能性というそれらの二つの基礎的特質が原因で、幹細胞、特にヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、細胞代償療法および創薬に使用するためにかなりの関心を集めている。
【０００５】
しかしながら、ＥＳ細胞を得るために胚を使用することは議論の余地があり、倫理問題を提起する。したがって、多能性細胞の代替的な供給源が検討されている。
【０００６】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、非多能性の、典型的には成体の体細胞からある種の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって人工的に得られた多能性幹細胞の一種である。
【０００７】
ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から（Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76）、そして２００７年にヒト細胞から（Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72, Yu et al. Science 2007 318 :1917）最初に作出された。これらの著者は、ウイルス発現系を使用してリプログラミング転写因子を体細胞に導入することによって、該体細胞を脱分化することが可能であることを実証した。
【０００８】
しかしながら、ウイルストランスダクションの使用は、治療に使用するためにそのような方法を開発することを妨げるいくつかの問題を提起する。実際に、ターゲット細胞のゲノム変化およびガン遺伝子発現のリスクが存在する。
【０００９】
他の著者は、ウイルスフリーのｉＰＳ細胞を作出するための非組み込み型エピソームベクターの使用を示唆した（Yu et al. Science 2009, vol 324, p 797-801）。しかしながら、リプログラミング効率は低いままである。さらに、結果として生じたｉＰＳクローンの一つにおける核型異常が、後にこれらの著者によって観察された。
【００１０】
最近、Zhouらは、ｉＰＳ細胞を得るための非遺伝的方法を報告した（Zhou et al. Cell Stem Cell 2009, vol 4, p 381-384）。これらの著者は、ターゲット細胞にリプログラミング因子を導入するためにポリアルギニンリコンビナントタンパク質を使用した。しかしながら、この方法は時間を浪費し、大規模生産があまり容易ではない。それは、ターゲット細胞に導入する前に各リコンビナントタンパク質を発現および精製しなけらばならないからである。
【００１１】
したがって、依然として、当技術分野においてターゲット細胞をリプログラミングするための、例えば人工多能性幹細胞を得るための迅速、安全かつ効率的な方法の必要性がある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞に関する。
【００１３】
本発明は、また、本発明による真核細胞によって分泌された微小胞に関し、ここで、該微小胞は、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む。
【００１４】
本発明は、また：
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によって、ターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって、該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００１５】
本発明は、また、リプログラミング転写因子を含む本発明の微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を送達するためのin vitro方法に関する。
【００１６】
本発明は、また、上記微小胞によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００１７】
本発明は、また、上記方法によって入手可能な人工多能性幹細胞に関する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、関心が持たれるタンパク質を発現している真核細胞でのウイルス膜融合タンパク質の過剰発現が、該膜融合タンパク質および関心が持たれる該タンパク質を含む微小胞の分泌に繋がりうることを発見した。さらに本発明者らは、ターゲット細胞に関心が持たれる該タンパク質を効率的に送達するために該微小胞を使用することができることを実証した。
【００１９】
特に本発明者らは、ターゲット細胞にエコトロピックレセプターを送達することによって、該ターゲット細胞を、リプログラミング転写因子を含有するエコトロピックウイルスに許容性にするために、微小胞を使用することができることを実証した。
【００２０】
本発明者らは、また、リプログラミング転写因子の機能を変化させずにターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を直接送達するために、およびそれによって該ターゲット細胞をリプログラミングするために、例えば人工多能性幹細胞を得るために、該微小胞を使用することができることを実証した。
【００２１】
したがって本発明は、ウイルス膜融合タンパク質と、エコトロピックレセプターまたはリプログラミング転写因子とを過剰発現している真核細胞に関する。該真核細胞は、ウイルス膜融合と、エコトロピックレセプターまたは該リプログラミング転写因子とを含む微小胞を分泌可能である。
【００２２】
一態様では、本発明による真核細胞は、ウイルス構造タンパク質を発現せず、そのような真核細胞によって分泌される微小胞は、ウイルス構造タンパク質を含まない。したがって本発明による微小胞は、その局面においてＨＩＶ１ Ｇａｇなどのウイルス構造タンパク質を含む、当技術分野、例えば国際公開公報第２００６／０５９１４１号に記載されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）とは異なる。
【００２３】
本明細書に使用される「ウイルス構造タンパク質」という用語は、ウイルスのキャプシドタンパク質またはタンパク質コアの全体構造に寄与するウイルスタンパク質を表す。「ウイルス構造タンパク質」という用語には、さらに、ウイルスのキャプシドタンパク質またはタンパク質コアの構造に寄与するそのようなウイルスタンパク質の機能的フラグメントまたは誘導体が含まれる。ウイルス構造タンパク質の一例は、ＨＩＶ１ Ｇａｇである。ウイルス膜融合タンパク質は、ウイルス構造タンパク質として見なされない。典型的には、該ウイルス構造タンパク質は、微小胞内に局在する。
【００２４】
本発明者らは、実際に、ウイルス構造タンパク質を発現しないがＶＳＶ−Ｇまたは他の融合誘発タンパク質などの膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を過剰発現する真核細胞において、関心が持たれるタンパク質を含む微小胞が産生できることを示した。
【００２５】
そのうえ本発明による微小胞は、リプログラミング転写因子をコードする核酸を含有しなくてもよい。もちろん、微量の核酸、特にプロデューサー細胞からの微量のｍＲＮＡまたは以前のトランスフェクションに起因するＤＮＡであっても該微小胞中に含有されることを除外することはできない。しかしながら本発明者らは、そのような微量の核酸（存在する場合）が、微小胞によるタンパク質機能の移行の９０％以上の原因になることができないことを実証した。
【００２６】
典型的には真核細胞は、ヒト細胞または昆虫細胞などの哺乳動物細胞である。
【００２７】
適切な哺乳動物細胞の例は、非限定的にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞である。
【００２８】
「過剰発現すること」によって、所与の細胞によって発現されるタンパク質の量を高めるための、当技術分野において公知の任意の手段が意味される。事実上、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子は、真核細胞がウイルス構造タンパク質を発現する必要なしに、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む微小胞を分泌可能であるようなレベルまで発現される。
【００２９】
典型的には、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子の過剰発現は、ウイルス膜融合タンパク質をコードする発現ベクターおよびリプログラミング転写因子をコードする発現ベクターを真核細胞にトランスフェクションすることによって達成することができる。
【００３０】
別の態様では、本発明による該真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質としてとしてのＶＳＶ−Ｇおよびリプログラミング転写因子を過剰発現しているが、他のウイルスタンパク質、特にウイルス構造タンパク質を過剰発現しない。該態様により分泌される微小胞は、ＶＳＶ−Ｇおよび該リプログラミング転写因子を含むが、ウイルス構造タンパク質を含まない。
【００３１】
別の特定の態様では、真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子だけを過剰発現する。この態様では、ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は、細胞中の過剰発現タンパク質の少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％に相当することがある。
【００３２】
一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子は、二つの異なるベクターによってコードされることがある。
【００３３】
一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および関心が持たれる該タンパク質は、２シストロン性発現カセットを含有する単一ベクターによって担持されることがある。関連する態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子は、一緒に共有結合していない。
【００３４】
一態様では、発現ベクターには、エピソーム複製プラスミドおよび例えばＳＶ４０ ＯＲＩまたはＥＢＶ ＯＲＩ配列などのウイルス性起点配列を含むプラスミドが含まれることがある。
【００３５】
発現ベクターによる過剰発現は、分子生物学の技術分野で公知の任意の遺伝子導入法を含むことがある。
【００３６】
好ましい態様では、過剰発現は、外来ＤＮＡのトランスフェクションによって得られる。適切なトランスフェクション法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを使用するトランスフェクション（リポフェクションとしても知られている）またはエレクトロポレーションなどの、技術者に公知の古典的方法である。所与の細胞に適切なトランスフェクション法を選択することは、技術者の能力の範囲内である。
【００３７】
好ましい態様では、過剰発現は、ウイルストランスダクションによって得られない。
【００３８】
過剰発現は、一過性過剰発現または安定過剰発現でありうる。
【００３９】
一過性過剰発現を用いる場合、細胞は、典型的にはトランスフェクションの４８から７２時間後の間に最適量のウイルス膜融合タンパク質および／またはリプログラミング転写因子を過剰発現する。
【００４０】
「過剰発現」という用語は、また、内因性タンパク質、すなわち真核細胞によって自然に発現されるタンパク質の過剰発現を包含する。過剰発現は、該タンパク質をコードする遺伝子の追加的なコピーの導入または内因性タンパク質の発現刺激のいずれかにありうる。一例として、真核細胞は、該内因性タンパク質の発現を高めることが知られている培養条件下に置くことができる。
【００４１】
典型的には、該ウイルス膜融合タンパク質は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのクラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜融合タンパク質またはクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である（クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質に関する総説についてはBackovic et al, Curr Opin Struct Biol 2009, 19(2):189-96またはCourtney et al, Virology Journal 2008, 5:28を参照されたい）。
【００４２】
好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００４３】
クラスＩウイルス膜融合タンパク質の例は、バキュロウイルスＦタンパク質、特にSpodoptera exigua ＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびLymantria dispar ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）Ｆタンパク質などの、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質である。
【００４４】
好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００４５】
クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質の例は、ラブドウイルスＧ（水疱性口内炎ウイルスの融合誘発タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）など）、ヘルペスウイルスｇＢ（単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｂ（ＨＳＶ−１ ｇＢ）など）、ＥＢＶ ｇＢ、トゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（Autographa CaliforniaマルチプルＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４など）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）である。
【００４６】
より好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇまたはバキュロウイルスｇｐ６４である。一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、GenBank ＡＮ：Ｍ３５２１９．１に定義されているようなＶＳＶ−Ｇポリペプチドまたは融合誘発性を保持する任意の機能的フラグメントもしくはそれらの機能的誘導体である。
【００４７】
本明細書に使用される「融合誘発」という用語は、タンパク質がターゲット細胞の膜への微小胞原形質膜の融合を誘導する能力を表す。
【００４８】
本発明の一態様では、本発明による真核細胞は、さらに、膜出芽を誘導するタンパク質を過剰発現する。この態様では、微小胞の産生が高まる。
【００４９】
本明細書に使用される「膜出芽を誘導するタンパク質」という表現は、脂質二重層の変形を促進して小胞形成を仲介することができる任意のタンパク質を表す。
【００５０】
所与の被験タンパク質が膜出芽を誘導する能力は、以下のin vitro試験「Ａ」に従って評価することができる：
【００５１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に被験タンパク質をトランスフェクションするか、または空のベクターを模擬トランスフェクションする。トランスフェクションの２０時間後に、細胞培地をＲ１８含有培地（２０μg/ml）に取り替える。Ｒ１８、すなわちオクタデシルローダミンＢクロリドは、膜と結合し、５６０nmで励起すると５９０nmで蛍光を発する親油性化合物である。６時間インキュベーションして細胞膜にＲ１８を組み入れた後に、Ｒ１８を有さない新鮮培地から培地を交換する。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクションされた細胞からの培地および模擬トランスフェクションされた細胞からの培地を収集し、透明にし、蛍光光度計によって分析する。レザズリン（rezazurin）ベースのアッセイによって計数された生細胞数に対して基準化されたＲ１８関連蛍光の量は、各条件で細胞によって放出された膜の量を反映する。
【００５２】
上記試験「Ａ」によって測定されたとき、被験タンパク質が細胞１個あたりのＲ１８関連蛍光の量を増加させる場合、そのタンパク質は、膜出芽を誘導すると見なされる。
【００５３】
様々な細胞タンパク質およびウイルスタンパク質が、膜出芽を誘導することが知られている。
【００５４】
膜出芽を誘導する細胞タンパク質の例は、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１（Trajkovic et al. 2008 Science, vol 319, p 1244-1247）、クラスリンアダプター複合体ＡＰ１（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）、フロッパーゼ、スクランブラーゼなどの脂質の性質を改変するタンパク質、ＴＳＡＰ６（Yu et al. 2006 Cancer Res vol 66, p4795-4801）およびＣＨＭＰ４Ｃ（Yu et al. 2009, FEBS J. vol 276, p2201-2212）などの非古典的経路を介した分泌を促進するタンパク質である。
【００５５】
膜出芽を誘導するウイルスタンパク質の例は、ＨＩＶのＶｐｕタンパク質などのテザリン（tetherin）／ＣＤ３１７アンタゴニスト（Neil et al. 2008. Nature vol451, p425-4431）、ならびにレトロウイルスＧＡＧ（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）およびエボラＶＰ４０（Timmins et al., Virology 2001）などの様々なウイルス構造タンパク質である。
【００５６】
膜出芽は、また、温度、Ｃａ２＋濃度などの、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング因子を過剰発現している真核細胞の細胞培養条件を改変することによって誘導してもよい。
【００５７】
本発明の一態様では、真核細胞は、２〜５種の異なるリプログラミング因子を過剰発現する。
【００５８】
本明細書に使用される「リプログラミング因子」、「リプログラミング核因子」および「リプログラミング転写因子」という表現は、互換的に使用される。それらは、所与のターゲット細胞に独立してまたは組み合わせで発現された場合に、細胞運命を変更するために、すなわち細胞をリプログラミングするために使用することができる核タンパク質を表す。
【００５９】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を得るためのリプログラミング因子は、先行技術に記載されている。
【００６０】
例えば、リプログラミング因子は、国際公開公報第２００７／０６９６６６号という文書において同定された。リプログラミング因子は、Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76; Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72およびYu et al. Science 2007 318: 1917に記載されている。
【００６１】
リプログラミング転写因子は、任意の哺乳動物起源のことがある。典型的には、それらはマウス起源またはヒト起源のことがある。好ましくは、リプログラミング転写因子は、リプログラミングされるべきターゲット細胞と同じ種に属する。
【００６２】
リプログラミング因子の例には、非限定的に以下が挙げられる：
− Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）：Ｏｃｔ−３／４は、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子ファミリーの１種であり、多能性の維持に重大な役割を果たす。割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞にＯｃｔ−３／４が不在になると、栄養芽層の自然分化に繋がることから、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能の元となる。例示的なＯｃｔ３／４タンパク質は、マウスＯｃｔ３／４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１３６３３）およびヒトＯｃｔ３／４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００２７０１）によってコードされるタンパク質である。
− Ｓｏｘファミリーの因子：Ｓｏｘファミリー遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４に類似して多能性の維持に関連するが、もっとも、多能性幹細胞にのみ発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に、多能性および単能性幹細胞に関連する。Ｓｏｘ２は、誘導のために使用される最初の遺伝子であったが（Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76; Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72; Yu et al. Science 2007 318 :1917）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に誘導過程において作用することが見出されている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と類似の効率でｉＰＳ細胞をもたらし、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８遺伝子もｉＰＳ細胞を生成する。
例示的なｓｏｘ−２タンパク質は、マウスＳｏｘ２遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１１４４３）およびヒトＳｏｘ２遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００３１０６）によってコードされるタンパク質である。
− Ｋｌｆファミリーの因子：Ｋｌｆファミリー遺伝子のＫｌｆ４は、当初、マウスｉＰＳ細胞を生成するための因子として同定され、また、ヒトｉＰＳ細胞を生成するための因子としても実証された。
例示的なＫｌｆ４タンパク質は、マウスｋｌｆ４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１０６３７）およびヒトｋｌｆ４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００４２３５）によってコードされるタンパク質である。
− Ｍｙｃファミリーの因子：Ｍｙｃファミリー遺伝子は、ガンに意味づけられるガン原遺伝子を含有する。ｃ−ｍｙｃは、マウスｉＰＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞の生成に意味づけられる因子であることが示された。
例示的なｃ−ｍｙｃタンパク質は、マウスｃ−ｍｙｃ遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１０８４９）およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００２４６７）によってコードされるタンパク質である。
− Ｎａｎｏｇファミリー：胚性幹細胞では、Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ２に加えてＮａｎｏｇが多能性の促進に必要である。
− ＬＩＮ２８：ＬＩＮ２８は、胚性幹細胞および胚性ガン細胞に発現される、分化および増殖に関連するｍＲＮＡ結合タンパク質である。Yuらは、それが、必須ではないものの、ｉＰＳ生成における因子であることを実証した（Yu et al. Science 2007, vol318:1917-20）。
【００６３】
好都合には、本発明者らは、リプログラミング転写因子がターゲット細胞中に移行した後、その機能性を保持することを示した。
【００６４】
一態様では、ウイルス膜融合タンパク質は、真核細胞から放出された微小胞の精製を可能にするタグを含有することがある。該タグは、例えばウイルス膜融合タンパク質のエクトドメインに局在することがある。
【００６５】
適切なタグには、非限定的に、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓ６タグが挙げられる。適切なタグおよび該タグの適切な精製方法を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６６】
適切な精製方法には、非限定的に、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、および抗タグ特異抗体で被覆された磁気ビーズが挙げられる。
【００６７】
好ましい態様では、本発明による真核細胞は、ウイルスフリーである。
【００６８】
本発明は、また、本発明による真核細胞によって分泌された微小胞であって、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む微小胞に関する。
【００６９】
理論に縛られることを望むわけではないが、該微小胞は、エキソソーム様であり、４０から１５０nmの間、例えば４０から１００nmの間のサイズ、例えば約１００nmの平均サイズを有すると見なされる。典型的には本発明による微小胞は、１．０８g/mlから１．１２g/mlの間の密度を有する。
【００７０】
好ましくは、本発明による微小胞は、１．０９g/mlから１．１１g/mlの間の密度を有する。典型的には、該密度は、実施例１に定義されるように連続イオジキサノール勾配での沈降によって測定することができる。
【００７１】
ウイルス膜融合タンパク質および／またはリプログラミング転写因子の一過性過剰発現が用いられる場合、微小胞は、典型的にはトランスフェクションの４８〜７２時間後に細胞上清から回収される。
【００７２】
典型的には、本発明による微小胞は、本発明による真核細胞の細胞上清の（例えば孔径０．４５μmのフィルターを用いた）濾過および超遠心分離、例えば１１０，０００ｇで１．５時間の超遠心分離によって単離されることがある。
【００７３】
好都合には、本発明による微小胞は、それらがターゲット細胞に物質を移行させる能力を失わずに凍結および−８０℃で保存することができる。
【００７４】
別の態様では、本発明による該微小胞は、該リプログラミング転写因子をコードする核酸を含まない。
【００７５】
好ましい態様では、本発明による微小胞はウイルスフリーである。
【００７６】
最初に免疫系細胞について記載されたが、細胞から放出された微小胞は、in vivoで多数の体液から見出される（Simpson et al. Proteomics 8, 4083-4099 (2008)）。多数の研究が、免疫反応および細胞間コミュニケーションのモデュレーションに果たすこれらの微小胞の役割を強調した。
【００７７】
理論に縛られることを望むわけではないが、本発明の微小胞がエキソソーム様小胞であって、ウイルス膜融合タンパク質の存在によって、該微小胞が微小胞中に含有される物質をターゲット細胞に効率的に送達できるようになると考えられている。
【００７８】
本発明は、また、以下のステップ：
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によって、ターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって、該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００７９】
本明細書に使用される「エコトロピック」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。エコトロピックウイルスは、それが由来する種のホスト中でのみ複製することができるレトロウイルスである。より具体的には、本明細書に使用される「エコトロピックウイルス」という用語は、そのコグネイトレセプターであるエコトロピックレセプターＥｃｏＲを発現している細胞中でのみ複製することができるげっ歯類ウイルスを表す。
【００８０】
好都合には、該エコトロピックウイルスは、エコトロピックウイルスレセプターを発現している微小胞によってターゲティングされている細胞以外のヒト細胞に感染することができないので、操作者および環境にとって安全である。この向上したバイオセーフティーは、汚染のリスクなしにそれを操作することができることを意味する。
【００８１】
典型的には、該エコトロピックウイルスは、モロニーベースのレトロウイルスであって、該エコトロピックレセプターはｍ−ＣＡＴ１である。ｍ−ＣＡＴ１をコードする遺伝子の一例は、GenbankアクセッションナンバーＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００７５１３．３に示される。
【００８２】
本発明は、また、リプログラミング転写因子を含む本発明の微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を送達するためのin vitro方法に関する。
【００８３】
したがって本発明は、上記微小胞によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００８４】
ターゲット細胞の例は、初代培養物から得られた体細胞である。典型的には、該ターゲット細胞は、体内の任意の起源の線維芽細胞、または培養条件でin vitroで植えた後に増殖可能な任意の他の細胞である。
【００８５】
本発明の微小胞の向性は、使用されるウイルス膜融合タンパク質の向性に依存する。
【００８６】
例えば、ＶＳＶ−Ｇはパントロピックであることから、ＶＳＶ−Ｇを含む本発明による微小胞は、ほぼあらゆる細胞をターゲティングする。呼吸器細胞に向性を有するウイルス膜融合タンパク質を含む微小胞は、好ましくは呼吸器細胞をターゲティングするために使用される。
【００８７】
一態様では、ターゲット細胞は患者特異的である。
【００８８】
この態様では、本発明の方法は、患者特異的ｉＰＳ細胞を生成するために使用することができる。
【００８９】
例えばｉＰＳ細胞は、ファンコーニ貧血（Raya et al. Nature 2009, 460: 53-59）；アデノシンデアミナーゼ免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、ゴーシェ病、筋ジストロフィー、パーキンソン病、ハンチントン病などを患う患者から得ることができる。
【００９０】
患者特異的ｉＰＳ細胞は、疾患を研究するための貴重なモデルとなる。
【００９１】
さらにそれらは、エクスパンションして任意の所与の組織にさらに再分化できる自律性細胞の潜在的に無限の供給源となることから、再生療法における大きな関心対象である。
【００９２】
好ましい態様では、本発明による微小胞は、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される。特定の一態様では、ターゲット細胞および微小胞産生細胞は、真核細胞の直径よりも小さいが、関心が持たれる微小胞の直径よりも大きい直径の孔を有する有孔壁によって分離された二つの異なる区画中に物理的に局在する。好都合には、本発明による真核細胞によって産生される微小胞は、一方の区画から他方の区画に拡散してターゲット細胞に到達することができ、そこで微小胞はリプログラミング因子を送達することができるが、微小胞産生細胞はターゲット細胞から分離されたままである。
【００９３】
この技法は、単離するステップの必要なしにタンパク質をターゲット細胞に送達可能にする。
【００９４】
典型的にはいくつか（例えば、２、３、４、５、６種など）の異なるリプログラミング転写因子は、非限定的にＯｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃなどの該いくつかの異なるリプログラミング転写因子を含む、本発明のいくつかの異なる微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に送達されることがある。
【００９５】
一態様では、本発明は、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃから成る群より選択される少なくとも一つのリプログラミング転写因子を含む微小胞とターゲット細胞を接触させるステップを含む、該ターゲット細胞からｉＰＳを得るための方法に関する。
【００９６】
好都合には、各微小胞は、２種類以下のリプログラミング転写因子、例えば１種類だけのリプログラミング転写因子を含む。
【００９７】
好ましい態様では、本発明は、Ｏｃｔ−４を含む微小胞、ＫＬＦ４を含む微小胞、ｓｏｘ２を含む微小胞、Ｌｉｎ２８を含む微小胞および／またはｃ−ｍｙｃを含む微小胞とターゲット細胞を接触させるステップを含む、該ターゲット細胞からｉＰＳを得るための方法に関する。
【００９８】
典型的には、該いくつかの異なる微小胞を接触させることは、同時または連続的であってもよい。
【００９９】
本発明による微小胞によって送達される少量の物質およびそれらの非遺伝的性質により、微小胞は、リプログラミング転写因子の場合のように、タンパク質の低度で一過性の存在が著しい生物学的作用に繋がりうる応用に有用である。
【０１００】
好都合には、本発明によるｉＰＳ細胞を得るための方法は、ウイルスベクターの使用を必要としないことから安全である。さらに、本発明の微小胞の非遺伝的性質のせいで、ゲノム改変のリスクがない。リコンビナントタンパク質を使用した方法に比べ、発現系（多くの場合に細菌発現系）、または該リコンビナントタンパク質の精製（リプログラミング因子の機能喪失、洗剤の使用など）に結びつくリスクはない。
【０１０１】
好都合には、本発明の方法によって入手可能なｉＰＳ細胞は、ウイルスフリー、細菌フリー、および界面活性剤フリーである。
【０１０２】
したがって本発明は、上記方法によって入手可能な人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に関する。
【０１０３】
本発明は、また、毒性作用について薬物を試験するための、または医薬品工業および化粧品工業用の創薬工程で任意の高／中／低いスループット／含量のスクリーニングを行うための上記ｉＰＳ細胞の使用に関する。本発明は、また、任意の形態の再生医療での同種移植用治療に使用するための上記ｉＰＳ細胞に関する。
【０１０４】
続いて、以下の実施例および図面により本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ａ）ｐＶＳＶ−Ｇ（レーン１）、ｐＶＳＶ−Ｇ Ｖ７２（レーン２）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲ（レーン３）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲおよびｐＶＳＶ−Ｇ（レーン４）をトランスフェクションされた２９３Ｔ−ＹＦＰならびに模擬トランスフェクション（レーン５）された２９３Ｔ−ＹＦＰによって産生された濃縮微小胞のウエスタンブロット分析。ＶＳＶ−Ｇに対するＭａｂ（Ｐ５Ｄ４）、タグ付き版のＥｃｏＲを明らかにする、Sigma ｆｌａｇに対するＭａｂ（Ｍ２）、およびＹＦＰに対するＭａｂ（ＧＳＮ２４）を用いて免疫染色を行った。
【図１Ｂ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｂ）ＹＦＰ単独を発現している細胞由来の微小胞に曝露された細胞に比べた、ＶＳＶ−ＧおよびＹＦＰを発現している細胞由来の微小胞に曝露された細胞のＦＡＣＳ分析。
【図１Ｃ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｃ）野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質（ｗｔ）または融合欠損突然変異体Ｗ７２Ｖ（２種のＤＮＡクローンを試験した）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。エクトドメインを欠失する切断形態のＶＳＶ−Ｇもまた実験に組み込んだ。トランスフェクションの４８時間後に、上清を回収し、細胞を溶解してウエスタンブロット分析に供した。プロデューサー細胞では全てのタンパク質が高度に発現されていた。しかしながら、融合欠損突然変異体ではなく、ｗｔのＶＳＶ−Ｇだけが上清中に検出された。
【図１Ｄ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｄ）上記のようにＨＥＫ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの２０時間後に０．２μg/mlのＲ１８（膜に結合する蛍光親油性化合物）を含有する培地中で６時間インキュベーションした。トランスフェクションの７２時間後に、異なる種類の細胞からの培地を収集し、透明にし、蛍光光度計によって分析して、上清中に放出された膜の量を反映するＲ１８関連蛍光の量を定量した。結果を、生細胞数によって基準化されたＲ１８値として示す。
【図２Ａ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ａ）２９３Ｔプロデューサー細胞上でのＣＤ８１発現。マウスＩｇＧアイソタイプ対照を使用した（網がけした領域）。
【図２Ｂ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｂ）濃縮された微小胞に曝露されたＨｅｐＧ２細胞上の処理１時間後のＣＤ８１発現。未処理ＨｅｐＧ２も同様にラベリングした（灰色に網がけした対照）。
【図２Ｃ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｃ）様々な用量の微小胞で処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＣＶｐｐトランスダクションの増強。ＹＦＯをコードするＨＣＶｐｐを２９３細胞において産生させ、ＨＵＨ７．２細胞に対して８×１０ｅ４トランスダクションユニット（ＴＵ）/mlで予備力価検定した。図にＨｅｐＧ２における力価を示すが、その力価は、ＨｅｐＧ２が曝露された微小胞の量と共に増加する。
【図２Ｄ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｄ）ＣＤ８１担持微小胞の密度分析。膜脂質をラベリングする蛍光体であるオクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）と共に培養された２９３Ｔ細胞において微小胞を産生させた。濃縮された微小胞をイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、ＳＷ４１ローターを用いてそれを４１０００rpmで１２時間遠心分離した。次に、０．５ｍｌの画分２０個を収集し、各画分の１／２０をウエスタンブロットによって半ネイティブ条件下で分析した。画分１３〜２０についてのＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１の免疫ラベルを示すが、他の画分では免疫ラベルが存在しなかった（図示せず）。
【図３Ａ】ゲシクル（gesicle）の特徴づけを示す図である。（Ａ）イオジキサノール密度勾配で収集された画分における膜関連蛍光。濃縮されたＶＳＶ−Ｇゲシクルをイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離した。チューブの底から５００μlの画分２０個を収集した。表示のように画分１は密度１．４６に、画分２０は密度１．０７に対応する。各画分の１／５（１００μl）を秤量し、９６ウェルプレートに移行させてから蛍光光度計で分析した。図に、５６０nmでＲ１８を励起させたときの５９０nmでの発光値を示す。
【図３Ｂ】ゲシクル（gesicle）の特徴づけを示す図である。（Ｂ）ＹＦＰおよびＣＤ８１担持ゲシクルの特徴づけ。上欄：密度勾配で収集された画分におけるＹＦＰ関連蛍光の分析。ＹＦＰ陽性細胞で産生された濃縮ＶＳＶ−Ｇゲシクルをイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離した。チューブの底から５００μｌの画分２０個を収集したが、表示のように画分１は密度１．３に、画分２０は密度１．０９に対応する。各画分の１／５（１００μl）を秤量し、９６ウェルプレートに移行させてから蛍光光度計で分析した。図に、４９５nmでＹＦＰを励起させたときの５３３nmでの発光値を示す。下欄：ヒト細胞におけるＹＦＰの偽トランスダクション（pseudotransduction）の分析。１２ウェルプレート中で培養された１×１０ｅ５個のＨＥＫ細胞上に各画分の１／１０を重ね入れた。２４時間後に細胞をＦＡＣＳによって分析した。図に、異なる画分に曝露された各細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図４Ａ】ＥｃｏＲ担持ゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲ送達を示す図である。（Ａ）ｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドの図示（図中、ｐＣＭＶはヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターを、ＵＳｉＴはユニバーサルｓｉＲＮＡによってターゲティングされる三つの繰り返し配列のコンカテマーを、ＰＡはＳＩＶポリアデニル化シグナルを表す）。下に表示されるｍＲＮＡはＵＳｉＴ配列を備えるが、その配列は、ユニバーサルｓｉＲＮＡによって仲介される分解にｍＲＮＡを高度に感受性にする。
【図４Ｂ】ＥｃｏＲ担持ゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲ送達を示す図である。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１ゲシクルで処理された２９３Ｔ細胞に対する、ＭＬＶエコトロピックエンベロープでシュードタイピングされた、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターの力価。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルで３７℃にて１時間処理した。ＰＢＳで２回洗浄後に、ＭＬＶエコトロピックエンベロープ（レーン１、２および３）またはＶＳＶ−Ｇエンベロープ（レーン４）でシュードタイピングされたＧＦＰレンチベクター調製物１００μlを細胞にトランスダクションした。トランスダクションの３日後に、ＦＡＣＳによって細胞を分析し、ベクター調製物の力価を計算し、３回の異なるトランスダクションアッセイの平均として示す。
【図５】ｍＣＡＴ−１担持ゲシクルの生化学的および機能的分析を示す図である。ＶＳＶ−Ｇおよびマウス白血病ウイルスエコトロピック株についてのレセプターであるタグ付き版ｍＣＡＴ−１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションしてゲシクルを調製した。細胞培地を２４時間後に交換し、その翌日に収集した。上清を透明化してから、ＳＷ−４１ローターを用いて３５０００rpmで１時間３０分超遠心分離した。ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、凍結してから密度精製工程を行った。イオジキサノール連続勾配による速度ゾーン遠心分離：粗濃縮小胞をOptiprep連続勾配（２１５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣＬ（ｐＨ８）中の６％イオジキサノール／５mMスクロース、２mM EDTA、１０mMトリスＨＣＬ（ｐＨ８）中の５６．４％イオジキサノール）上に重層し、ＳＷ４１ローターを用いて４１０００rpｍで１２時間遠心分離した。勾配の底から画分（０．５ml）を順次収集し、４℃で保存してからウエスタンブロット分析および機能アッセイを行った。各画分の１００μlを慎重に秤量することによって画分の密度を測定した。ＭＯＰＳ緩衝液中での４〜１２％ビストリスNuPageゲル（Invitrogen）泳動を用いて、画分１２〜２０のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。各画分５μｌを分析した。ニトロセルロース膜上に電気ブロット後に、１／１０００に希釈された、ＶＳＶ−Ｇに対するペルオキシダーゼコンジュゲーション型抗体（Ｐ５Ｄ４、Sigma）または１／１０００のペルオキシダーゼコンジュゲーション型抗Ｆｌａｇ（Sigma)（両方とも室温で１時間インキュベーション）によってタンパク質を明らかにした。画分の生物学的活性を評価するために、２４ウェルプレートのウェル１個あたり１×１０ｅ５個蒔かれた２９３Ｔ細胞に各試料３０μlを添加した。１時間後に、培地を、エコトロピックエンベロープでシュードタイピングされた、ＧＦＰをコードするレンチベクターを含有する上清２００μlを補充された新鮮培地２００μlに取り替えた。トランスダクションの４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって蛍光値（ＭＦＩ）を分析した。
【図６】ゲシクル処理されたヒト細胞に移行したｍＣＡＴ−１の消失を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を未飽和用量のＥｃｏＲ−ゲシクルに３７°で１時間曝露した。２回洗浄後に、ゲシクル曝露の５分、１２時間、２４時間または４５時間後に、エコトロピックエンベロープでシュードタイピングされたＧＦＰレンチベクターを細胞にトランスダクションした。ＥｃｏＲを安定発現している２９３Ｔ細胞に同じトランスダクションアッセイを行い、ターゲット細胞の分裂によるレンチベクター力価の漸減を測定した。５分の時点で得られたトランスダクション値（１００％）に対するトランスダクション効率のパーセンテージとして結果を示す。全ての値を細胞分裂速度に関して補正した。
【図７Ａ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ａ）ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞におけるｍＣＡＴ−１の免疫染色。
【図７Ｂ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１をトランスフェクションされたターゲット細胞でのＧＦＰレンチベクターを用いたトランスダクションアッセイ。トランスダクションの７２時間後にＦＡＣＳによってトランスダクション値を分析したが、ｓｉ−ＣＴＬ細胞についてのトランスダクション値を効率１００％に設定した。ｓｉ−ｍＣＡＴで処理された細胞ではＥｃｏＬＶトランスダクションの７０％が阻害され、一方でｇＬＶ介在性トランスダクションはほとんど影響されない（８％の阻害）。ターゲット細胞におけるｍＣＡＴ ｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって移行したＥｃｏＲ機能にほとんど影響しない。
【図７Ｃ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ｃ）ｍＣＡＴゲシクルで処理されたヒト細胞におけるＧＦＰエコトロピックレンチベクターを用いたトランスダクションアッセイ。ｍＣＡＴ小胞によって処理され、ｓｉ−ｍＣＡＴを担持する細胞は、ＥｃｏＬＶトランスダクションに高度に許容性のままである（対照の８７％）。これは、ＥｃｏＲの機能が、汚染ｍＲＮＡでもプラスミドＤＮＡでもなく、微小胞中に含有されるｍＣＡＴタンパク質によって主に提供されることを示す。
【図８】ＥｃｏＲ−ゲシクルによって改変された細胞におけるエコトロピックレンチウイルスのトランスダクションに及ぼすクロロキンの作用を示す図である。エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキン（ＣＱ）の存在下または不在下でＥｃｏＲゲシクル（ＥｃｏＲ−Ｇｅｓ）によってｍＣＡＴ−１タンパク質が送達されたトランスデューサーＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、エコトロピックエンベロープ（Ｅｃｏ）でシュードタイピングされた、ＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターを使用した（レーン３）。対照として、ＥｃｏＲが安定発現されているトランスデューサー２９３Ｔ細胞に対してエコトロピックシュードタイプを使用した（安定ＥｃｏＲ、レーン２）。エンドソーム酸性化に及ぼすＣＱの作用を調べるために、ＶＳＶ−Ｇレンチベクターを使用してその薬物で処理されたか、または処理されていないターゲット細胞にトランスダクションを行い、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプの高いｐＨ依存性を説明した（レーン１）が、エコトロピックシュードタイプは薬物処理されても効率的なままである。トランスダクションの７２時間後にＦＡＣＳによって測定されたときの、異なる細胞種類における相対ＹＦＰトランスダクション効率として結果を示す。
【図９】ゲシクルによるｔＴａの送達を示す図である。ＴＥＴトランス活性化タンパク質（ｔＴＡｏｆｆ）の転写機能を検出するために、本発明者らは、ＴＥＴオペレーターのコントロール下でｅＧＦＰを安定発現しているレポーター細胞系を作出した。ｔＴＡのトランスフェクションは、模擬トランスフェクションされた細胞に比べてレポーター細胞系でのｅＧＦＰ発現を活性化した（ｔＴＡレーン）。ｔＴＡとＶＳＶ−Ｇ（ｗｔ）またはその融合非コンピテント突然変異体Ｖ７２とを過剰発現している細胞で産生されたゲシクルを濃縮し、異なる用量でレポーター細胞系上に重ね入れた。ｗｔ ＶＳＶ−Ｇを収容しているｔＴＡゲシクルの用量増加は、ＧＦＰの発現増強を招いた。このシグナルは、培地中にドキシサイクリンを導入することによって打ち消すことができた。ゲシクルの２４時間後のＦＡＣＳによって分析されたＭＦＩとして結果を示す。
【図１０】時間の関数としてのゲシクル介在性ｔＴＡ移行効率を示す図である。ＨＥＫレポーター細胞系Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレートに植え（ウェル１個あたり細胞１×１０ｅ５個）、ｔＴＡゲシクル（総タンパク質５０μg）で処理した。曝露時間は５分から４時間の範囲であった。曝露後に、小胞含有培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、２４時間後のＧＦＰ分析のために培養状態を維持した。ｔＴＡ移行効率は、３時間まで曝露時間と共に徐々に増加し、３時間が最適曝露時間である。
【図１１】ＶＳＶ−Ｇタンパク質が２９３Ｔ細胞からの小胞の放出および関心が持たれるタンパク質の放出を強化することを示す図である。膜タンパク質の放出：ＶＳＶ−Ｇの存在下または不在下で産生された小胞に組み入れられたマルチスパン膜タンパク質であるｍＣＡＴ−１のＷＢ分析。小胞ペレット中のｍＣＡＴ−１の免疫ラベリングから、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞に導入された場合ｍＣＡＴ−１の放出が劇的に増加していることが示される。細胞質タンパク質の放出：細胞質タンパク質アクチンの放出を検討して、異なるバッチの小胞調製物に対して類似の生化学分析を行った。本発明者らは、模擬小胞に比べてＶＳＶ−Ｇがアクチンの放出を著しく強化することを確認する。
【図１２】共培養実験において孔径３μｍのインサートを通過するゲシクル介在性タンパク質の移行を示す図である。本発明者らは、様々な組み合わせのプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ細胞をレポーターＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞系と共に同じ培地中で培養した。図示したように、プロデューサー細胞を下部の６ウェル皿の中に、レポーター細胞系を上部インサート中に入れるように、細胞を孔径３μｍのフィルターによって分離した。担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇコードプラスミドまたは融合欠損ＶＳＶ−Ｇと共にｔＴＡ発現プラスミドをプロデューサー細胞に共トランスフェクションした。４８時間共培養後に、インサートを取り外し、レポーター細胞系をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析してｔＴＡの送達を評価した。結果をＴｅｏ−ＧＦＰ細胞系でのＭＦＩとして示す。
【図１３Ａ】昆虫細胞由来微小胞の特徴づけを示す図である。Ｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させることによってＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に、それらをイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離し、小胞をその密度に応じて沈降させた。チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。密度勾配は、グラフＡからｄ＝１．３〜ｄ＝１．０５の範囲で認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、バキュロウイルスがどこで沈降したかを確認した。感染の３日後に、ＦＡＣＳによってｓｆ９細胞を分析し、バキュロウイルスを力価検定した。Ａ（黒色棒線）に示される結果は、ウイルスが沈降したことを示した。各画分のＧＦＰ移行能を分析した。ＧＦＰは画分１４〜１９中に含有され、これは部分的にウイルス含有画分と重複している。
【図１３Ｂ】昆虫細胞由来微小胞の特徴づけを示す図である。Ｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させることによってＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に、それらをイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離し、小胞をその密度に応じて沈降させた。チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。密度勾配は、グラフＡからｄ＝１．３〜ｄ＝１．０５の範囲で認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、バキュロウイルスがどこで沈降したかを確認した。感染の３日後に、ＦＡＣＳによってｓｆ９細胞を分析し、バキュロウイルスを力価検定した。Ａ（黒色棒線）に示される結果は、ウイルスが沈降したことを示した。各画分のＧＦＰ移行能を分析した。ＧＦＰは画分１４〜１９中に含有され、これは部分的にウイルス含有画分と重複している。
【図１４】ｔＴａ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）を示す図である。ｔＴＡ−バキュロウイルスに感染させたＨｉｇｈ５細胞でｔＴＡ微小胞を産生させた。小胞を濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１０倍希釈し、１００μlのＰＢＳ中で行われるアッセイに供した。０．５当量のリン脂質（Phospholip）ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体（ＧＳＴ）の系列希釈物と共に３７℃で２時間インキュベーションした。次に、小胞をＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（ｔＴＡが細胞に導入された後にＧＦＰを発現）上に重ね入れた。２４時間後に、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、ＧＦＰの発現を定量した。結果を全体集団（global population）ＭＦＩとして示す。
【図１５】ｔＴＡ微小胞を用いた用量反応を示す図である。ｔＴＡ昆虫小胞を濃縮し、前記のように精製し、−８０°で保存した。漸増する用量の小胞を使用してＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞系にｔＴＡを送達し、小胞の２４時間後にターゲット細胞から検出されたＧＦＰシグナルの増加をもたらした。ドキシサイクリン処理細胞は、ＴＥＴ系の予想された誘導性を反映するバックグラウンド蛍光を示した。
【図１６Ａ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ａ）バキュロウイルス構築物。
【図１６Ｂ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｂ）ｔＴＡレポーター細胞系でのプロモーターによって推進されるｔＴＡのＧＦＰ発現。
【図１６Ｃ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｃ）ゲシクル中へのＧＰ６４およびｔＴＡの放出。
【図１６Ｄ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｄ）ｐＨまたはＣＭＶ精製微小胞を用いた処理に対するｔＴＡレポーター細胞系でのＧＦＰ発現。
【図１７】ｉＰＳ因子含有微小胞のウエスタンブロット分析を示す図である。記載したようにＨＥＫ細胞でヒト微小胞を調製し、溶解させ、ＳＤＳ ｐａｇｅによって分析した。各試料の２用量をロードした（Bradfordによって測定するとき４μgおよび２０μgの総タンパク質量に対応する２μlおよび１０μlの１００×調製物）。ａｂｃａｍ抗体を使用して免疫染色を行った（参照を含む）。
【図１８Ａ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ａ：アンホトロピックおよびエコトロピックなリプログラミングプロトコールの図示。エコトロピックなプロトコールでは、感染の１．５時間前にＥｃｏＲレセプターを含有するゲシクルを添加した。両方のプロトコールで、細胞をゼラチン上に再度植えた日を０日目（ｄ０）と定義する。１日目に培地をｈＥＳＣ培地＋ＶＰＡに切り替える。ＶＰＡ処理を１０日間維持し、次にｉＰＳクローンが出現するまで細胞を古典的ｈＥＳＣ培地中で培養する。
【図１８Ｂ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｂ：１日目の感染線維芽細胞（倍率×４）。
【図１８Ｃ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｃ：２１日目に出現中のｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１８Ｄ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｄ：最初の釣り上げから継代３回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１８Ｅ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｅ：アンホトロピックトランスダクションによって得られたクローンのＳＳＥＡ−４免疫染色（多能性マーカー）。
【図１８Ｆ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｆ：エコトロピックトランスダクションによって得られたクローンのＳＳＥＡ−４免疫染色（多能性）。
【図１９Ａ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ａ：リプログラミングプロトコールの図示。ｃ−Ｍｙｃタンパク質を含有するゲシクルを、三つの他のリプログラミング因子（Ｏｃｔ−４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４）を発現しているウイルスによるトランスダクションの６および３６時間後に添加した。細胞をゼラチン上に再度植えた日を０日目（ｄ０）と定義する。１日目に培地をｈＥＳＣ培地＋ＶＰＡに切り替えた。ＶＰＡ処理を１０日間維持し、次にｉＰＳクローンが出現するまで細胞を古典的ｈＥＳＣ培地中で培養した。トランスダクションの４週間後に１個のクローンを釣り上げた。
【図１９Ｂ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｂ：最初の釣り上げから継代５回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×４）。
【図１９Ｃ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｃ：最初の釣り上げから継代５回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１９Ｄ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｄ：未分化マーカーＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１の発現を示す、継代５回目のｉＰＳクローンのフローサイトメトリー分析。
【０１０６】
実施例
実施例１
要約
本実施例は、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で被覆され、外因性タンパク質をヒトターゲット細胞に送達するために使用されたエキソソーム様小胞の操作について記載する。これらの粒子は、密度１．１g/mlで沈降し、細胞質タンパク質、膜タンパク質および転写因子を効率的にパッケージングすることができる。膜ｍＣＡＴ−１タンパク質およびｔｅｔトランス活性化因子を含むモデル分子は、微小胞処理された場合のヒトターゲット細胞に効率的に送達された。小胞介在性の偽トランスダクションは、一過性タンパク質発現に繋がり、ｍＲＮＡまたはＤＮＡの移行を原因としなかった。本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキンがタンパク質の移行を無効にしたことを示したが、これは、ＶＳＶ−Ｇによって誘導される融合が送達メカニズムに関与したことを示している。
【０１０７】
ＶＳＶ−Ｇ融合誘発エンベロープは偽トランスダクションの主要な決定因子である
本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇの発現が偽トランスダクション可能な粒子の産生に繋がることができるかどうかを試験した。ＹＦＰを安定発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｙ）に真核生物発現ベクターであるｐＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションした。２日後に上清を収集し、濾過し、超遠心分離によって濃縮した。対照として、模擬トランスフェクションされた２９３Ｔ−Ｙ細胞の上清に同じ工程を適用した。二つの濃縮調製物をナイーブな２９３Ｔ細胞に添加し、１時間曝露後にそれを洗浄した。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析して、２集団での蛍光を測定した。本発明者らは、対照調製物に曝露された細胞ではなく、ＶＳＶ−Ｇ調製物に曝露された細胞でのＹＦＰの偽トランスダクションを観察することができた（図１−Ｂ）。二つの試料の生化学分析から、ＶＳＶ−Ｇ調製物では大量のＹＦＰが沈降したが（図１−Ａレーン１）、一方で模擬トランスフェクションされた調製物ではＹＦＰがほぼ検出不能であった（レーン５）ことが明らかとなった。これらのデータは、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞の細胞質成分を含有する沈降可能な粒子の激しい放出の原因であることを示している。そのうえ、これらの粒子は、ターゲット細胞にこの物質を送達する能力があるように思われた。細胞が、粒子で処理されたすぐ後に洗浄され、２４時間の成長の後にトリプシン処理および分析されたことから、本発明者らは、ＹＦＰシグナルが細胞内にあって、細胞表面に吸着した蛍光粒子が原因ではないと仮定した。これらのＶＳＶ−Ｇ微小胞を、実施例１全体を通じてゲシクルと呼ぶ。
【０１０８】
追加的な観察：融合をトリガーできないＶＳＶＧ単一アミノ酸突然変異体（ＶＳＶＧ Ｖ７２）１４をこの系で試験したが、その突然変異体は、沈降したペレット中に組み入れられていなかった（図１レーン２）。別のウエスタンブロット実験は、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇが細胞および上清の両方で検出可能であったのとは対照的に、この突然変異体がプロデューサー細胞では発現されたが、上清中からは検出不可能であったことを示した（図１Ｃ）。これは、ＶＳＶ−Ｇ微小胞の産生がプロデューサー細胞における融合コンピテント形態のＶＳＶ−Ｇを必要とすることを実証している。
【０１０９】
ＣＤ８１テトラスパニンタンパク質の偽トランスダクション
濃縮調製物によるＹＦＰなどの細胞質タンパク質の細胞間移行は、２９３Ｔ−Ｙ細胞が、脂質層によって囲まれ、可能性があることには膜タンパク質のような２９３Ｔ細胞の他のタンパク質で被覆されたＹＦＰ担持小胞を産生したという考えを支持している。この仮説を検証するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞にＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションすることによって新しいバッチのゲシクルを調製し、この濃縮調製物を使用して、エキソソームに特徴的で、２９３Ｔ細胞上に豊富に発現されるテトラスパニンタンパク質であるＣＤ８１タンパク質の移行について検討した（図２Ａ）。結果として生じた物質を、ＣＤ８１を欠如したヒト肝細胞系であるＨｅｐＧ２細胞に適用した。本発明者らは、ゲシクルに１時間曝露されたＨｅｐＧ２細胞がＣＤ８１免疫ラベリングで陽性染色されたことを示したが、これは、そのタンパク質がプロデューサーからターゲット細胞に移行したことを示している（図２．Ｂ）。
【０１１０】
ＨｅｐＧ２での外因性ＣＤ８１の導入は、ＨＣＶエンベロープでシュードタイピングされたレトロウイルスベクター（ＨＣＶｐｐ）をこの細胞系にトランスダクションさせることが知られている（Zhang. et al. Journal of virology 78、1448-1455 (2004)）。実際にＣＤ８１は、Ｅ２糖タンパク質によって認識されるＨＣＶレセプターの一つとして記載されている。したがって、ＣＤ８１の移行をさらに検証するために、本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞を様々な用量のゲシクルに曝露し、ＨＣＶｐｐ介在性トランスダクションに対するそれらの許容性をナイーブなＨｅｐＧ２細胞と比較して調べた。本発明者らは、ＨＣＶｐｐトランスダクションに対するＨｅｐＧ２の許容性が細胞に導入されたゲシクルの量と共に増加し（図２．Ｃ）、この実験でＨＣＶｐｐの力価を最大５倍に増加させることを示した。これは、移行したＣＤ８１タンパク質が、ゲシクルを介した輸送および移行後であってもそのＨＣＶ結合能を保持することを示している。
【０１１１】
ＹＦＰおよびＣＤ８１担持ゲシクルの特徴づけ
タンパク質移行の原因となる物質をよりうまく特徴づけるために、膜をラベルする親油性蛍光体であるオクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）と共に培養されたヒト細胞にＶＳＶ−Ｇのトランスフェクションを行ってゲシクルを産生させた。最初の濃縮ステップの後に、Ｒ１８−ゲシクルをイオジキサノールの連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離して、画分のその密度に応じた分離を可能にした。収集された全ての画分１〜２０がＲ１８についての励起および発光値である５６０nmで励起後に５９０nmで蛍光を発光する能力について、それらの画分を分析した。図３Ａに示すように、画分１３〜２０からＲ１８蛍光が検出され、密度１．１１g/mlに対応する画分１７でピークであった。
【０１１２】
別の実験では、２９３Ｔ−Ｙで産生されたゲシクルを類似の方法で加工し、勾配上に重ね入れてから、収集された種々の画分中のＹＦＰ関連蛍光を分析した。図３Ｂは、ＹＦＰが主に密度１．１０〜１．１１に対応する画分１７および１８から検出されたことを示す。次に本発明者らは、どの画分が偽トランスダクションによってＹＦＰを送達することができたかを調べた。各試料の１／１０を２９３Ｔ細胞に適用し、２４時間後に蛍光の移行をＦＡＣＳで分析した。図３に示すように、偽トランスダクション決定因子は、画分１７（ｄ＝１．１１）で本質的に沈降した。別の実験では、ゲシクルを分離し、ウエスタンブロットによって分析した。密度画分の分析により、ＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１が、密度１．１０および１．１１g/mlに対応する画分１７および１８中に明白に豊富に存在したことが明らかになった（図２Ｄ）。ＣＤ８１分子はエキソソームに対するマーカーとして説明されていることから（Lamparski et al. Journal of immunological methods 270、211-226 (2002)）、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ担持ゲシクルが特定の種類のエキソソーム様小胞であると結論することができる。
【０１１３】
総合して、本発明者らの結果は、ＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションされると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、密度１．１０〜１．１１g/mlで沈降可能な、膜で囲まれたゲシクルを産生したこと、およびこれらのエキソソーム様微小胞がプロデューサー細胞からターゲット細胞に送達可能なＣＤ８１などのタンパク質を含有することを示している。
【０１１４】
ヒト細胞でのｍＣＡＴ−１のゲシクル介在性移行
ＹＦＰまたは高発現されたＣＤ８１が２９３Ｔ−Ｙ／２９３Ｔ細胞によって産生されたゲシクル中にパッケージングされるのと同じ方法で、本発明者らは、プロデューサー細胞中で過剰発現された任意のタンパク質を新生ゲシクルに受動的に組み入れることができるかどうか、および少量のこのパッケージングされた物質をヒトターゲット細胞に送達することができるかどうかを試験した。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エコトロピックエンベロープに対するレセプターＥｃｏＲとしても知られているマウス陽イオン性アミノ酸輸送体であるｍＣＡＴ−１タンパク質をモデルとして使用してこの概念を検証した。ｆｌａｇ化版のｍＣＡＴ−１をコードしているプラスミドを構築し（図４に示すＳｗＦｌａｇ ＥｃｏＲ）、２９３Ｔ−Ｙ細胞にＶＳＶ−Ｇと一緒に共トランスフェクションし、ＥｃｏＲ担持濃縮ゲシクルを産生させ、それを続いてヒト細胞に導入した。１時間後に、曝露された細胞を洗浄し、抗Ｆｌａｇ−ＦＩＴＣ抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって明らかになったようにＥｃｏＲの発現について陽性染色した（図示せず）。ｍＣＡＴ−１の移行をさらに検証するために、本発明者らは、ＹＦＰをコードするレンチベクターをＭＬＶ−エコトロピックエンベロープでシュードタイピングしたものに基づくトランスダクションアッセイを開発した。この糖タンパク質の特定の向性が原因で、これらのレンチベクターは、トランスフェクションによってｍＣＡＴ−１が発現しているマウス／ラット細胞またはヒト細胞だけにトランスダクションすることができる。ＥｃｏＲ−ゲシクルがヒト細胞にＥｃｏＲを効率的に送達するならば、これらは、エコトロピックＹＦＰレンチトランスダクションに許容性になるはずである。
【０１１５】
図４に示される結果に、ＥｃｏＲゲシクルで処理されたか、またはされていないヒト細胞で力価検定を行った場合のエコトロピックレンチベクター調製物の力価を与える。ナイーブな細胞はエコトロピックレンチベクターのトランスダクションに限定的であるが（レーン３）、２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルで処理された細胞は、エコトロピックトランスダクションに高度に許容性になる。トランスダクション培地中のエコトロピックレンチベクター上のゲシクル−Ｇタンパク質の組み入れを避けるために、ゲシクル処理細胞を２回洗浄してからトランスダクションした。
【０１１６】
ＥｃｏＲ−ゲシクル調製物を前記密度勾配上に重ね入れ、ｍＣＡＴ−１の移行を担う画分を同定した。収集された画分をウエスタンブロットによって、それがＥｃｏＲの移行を仲介する能力について分析した（図５）。この実験で本発明者らは、密度１．１０に対応する画分１７にＶＳＶ−ＧおよびｍＣＡＴ−１が著しく豊富に存在し、トランスダクションアッセイによって明らかにされたＥｃｏＲの移行を担う主画分であることを示す。これらのデータは、密度１．１０で沈降性のＥｃｏＲ−ゲシクルがｍＣＡＴ−１タンパク質をターゲット細胞の膜に移行させたが、そこでそのタンパク質がエコトロピックエンベロープに対する結合性を保持することを示す。
【０１１７】
そのうえ、本発明者らは、本明細書でゲシクル含量および特にゲシクルの膜によって担持されるタンパク質の性質を、プロデューサー細胞のトランスフェクションによって容易にコントロールできることを示す。
【０１１８】
ゲシクルによるＥｃｏＲ送達のメカニズム
移行したｍＣＡＴ−１の寿命
次に本発明者らは、ゲシクル曝露とトランスダクションアッセイの間の遅れを変動させることによって、ヒト細胞に移行したｍＣＡＴ−１の寿命を調べた。図６に示す結果は、Ｅｃｏレセプターの機能がそのゲシクル介在性移行の約５０時間後に２９３Ｔ細胞表面から消失したことを示している。この実験は、Ｈｅｌａ、ＨＵＨ．７（図示せず）を含めた、異なるヒト細胞種類で再現され、移行したｍＣＡＴ−１の半減期は２４時間近くで不変であった。この一時性は、ゲシクルがタンパク質を送達するが、ゲシクル調製物を汚染するおそれのあるプラスミドＤＮＡを送達しないという考えを支援するものである。実際にプラスミドＤＮＡによるｍＣＡＴ−１のコードは、ターゲット細胞での転写および翻訳ステップを必要とするであろうから、トランスフェクション実験について一般に観察されるように、導入の４８時間後に発現ピークに至るであろう。
【０１１９】
ＥｃｏＲの機能は、ゲシクルに組み入れられた既製のタンパク質によって提供される。
ｍＣＡＴ−１小胞と共に移行した物質の性質を検討するために、本発明者らは、ヒトターゲット細胞をｍＣＡＴ−１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡで処理した。小胞がそれをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡを送達するならば、それは、ｓｉ−ｍＣＡＴ処理細胞で急速に分解するであろう。
【０１２０】
ｍＣＡＴ−１の免疫染色によって明らかとなったように（図７Ａ）、ＨＥＫ細胞で共トランスフェクション実験を行うと、ｍＣＡＴ−１ ｓｉＲＮＡはｍＣＡＴの発現を抑制した。そのうえ、ｍＣＡＴ−１プラスミドをトランスフェクションされた細胞にこの特異的ｓｉＲＮＡを導入することで、細胞がエコトロピックレンチベクターをトランスダクションされる能力が大きく減少した（図７Ｂ）。ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチベクター（ｇＬＶ）は、ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方に効率的にトランスダクションされたが、エコトロピックレンチベクター（ＥｃｏＬＶ）で達成されたトランスダクション効率は、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞では阻害された（７０％阻害）。これらのデータは、ｍＣＡＴ−１がプラスミドによってコードされる場合、ｓｉ−ｍＣＡＴがこのレセプター機能に特異的に影響することを示している。
【０１２１】
次に、本発明者らは、ｍＣＡＴ−ｓｉＲＮＡがｍＣＡＴ−１微小胞によって送達されたレセプター機能に影響したかどうかを調べた。ｍＣＡＴ ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、４８時間後にその細胞をｍＣＡＴ−１小胞で処理した。次に、ＥｃｏＬＶを用いてトランスダクションアッセイを行い、レセプター機能を調べた（図７Ｃ）。ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方にＥｃｏＬＶが効率的にトランスダクションされたことは、ｓｉ−ｍＣＡＴが小胞によって送達されたレセプター機能をほとんど抑制しないことを示している。これは、微小胞がｍＲＮＡでも汚染プラスミドＤＮＡでもなく、既製のタンパク質を移行させることによって本質的にレセプター機能を送達したことを示している。
【０１２２】
ゲシクル介在性ＥｃｏＲ送達はｐＨ依存的である
移行したＥｃｏＲタンパク質がウイルスレセプターとして機能的であるので、これは、ターゲット細胞表面にそれが存在することを意味する。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇエンベロープの性質のせいで、ゲシクルと細胞膜の間の融合は、内部の酸性区画中で起こり、ＥｃｏＲタンパク質が機能する細胞表面ではなく、内部にそれを遊離すると予想される。
【０１２３】
ＥｃｏＲの移行メカニズムを洞察するために、本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させ、ＶＳＶ−Ｇによってトリガーされる膜融合を妨害することが知られている薬物であるクロロキン（ＣＱ）で２３９Ｔターゲット細胞を処理してからゲシクルで処理した。図８に示されるように、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチベクターは、ＣＱ処理細胞をトランスダクションできず（レーン１）、一方でエコトロピックレンチベクターは、ｍＣＡＴ−１を構成性発現している薬物処理２９３Ｔに対して使用された場合に依然として有効である（レーン２）。これらのデータは、ｐＨ依存性を表している。興味深いことに、本発明者らは、ＣＱがゲシクルによるＥｃｏＲ送達を強く阻害することを示している（レーン３）。エコトロピックレポーターレンチベクターによるトランスダクションがＣＱによって減少しないことから、この結果は、表面にＥｃｏＲを送達している細胞メカニズムにおけるＣＱ介在性の不全を反映している。
【０１２４】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、ゲシクルがターゲット細胞にインターナリゼーションされた後に、ＥｃｏＲ放出のために膜融合が必要となるエンドソーム区画中に輸送されるモデルを提案する。それらのタンパク質は、多数の内因性レセプターの運命に従い、続いて細胞膜に向けてリサイクリングされるであろう。
【０１２５】
ＴＥＴトランス活性化因子のゲシクル介在性送達
細胞質タンパク質および膜タンパク質の送達に加えて、本発明者らは、ゲシクルが古典的には核に発現されるタンパク質である転写因子をパッケージングおよび送達する能力を調査した。このために、コグネイトプロモーターであるＴｅｔオペレーター（ＴＥＯ）の転写を活性化する合成転写因子であって、細胞培養培地へのテトラサイクリン／ドキシサイクリンの導入によってスイッチオフすることのできるＴＥＴｏｆｆトランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードするプラスミドを共トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞でゲシクルを産生させた（Gossen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551 (1992)）。次に、ｔＴＡをロードされたゲシクルの漸増する用量を、Ｔｅｔオペレーターのコントロール下のｅＧＦＰ遺伝子から構成される発現カセットを収容するレポーター細胞上に重ね入れた。図９に示される結果は、レポーター細胞系の蛍光が処理の２４時間後にｔＴＡゲシクルによって活性化されることを示している。蛍光シグナルはゲシクルの用量と共に増加し、最高用量では、ｔＴＡ構築物をトランスフェクションされたレポーター細胞で得られたシグナルの約５０％に達する。本発明者らは、処理された細胞での転写活性化が依然としてドキシサイクリン処理を感知可能であることに留意する。これは、ｔｅｔトランス活性化因子タンパク質がゲシクル中にうまくパッケージングされ、レポーター細胞系に移行したことを示す。
【０１２６】
曝露時間の関数としてのゲシクル介在性ｔＴＡの移行効率
ＨＥＫレポーター細胞系Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（細胞１０５個）に植え、ｔＴＡゲシクルで処理した（ウェル１個あたり５０μgの総タンパク質）。曝露時間は５分から４時間の範囲であった。曝露後に、小胞含有培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養を維持して２４時間後にＧＦＰ分析に供した。ｔＴＡ移行効率は、曝露時間と共に３時間まで徐々に増加し、３時間が最適曝露時間である（図１０参照）。
【０１２７】
ゲシクルの産生およびアッセイ（dosage）方法
ヒトＥｃｏＲ−ゲシクルの産生およびアッセイ
リン酸カルシウム法を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによってヒトゲシクルを産生させた。細胞を１０cm皿に３×１０６個蒔き、皿１枚あたり１２μgのＶＳＶ−Ｇコードプラスミドおよび１２μgのｍＣＡＴ−１コードプラスミドを共トランスフェクションした。２４時間後にトランスフェクション培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に小胞含有上清を収集し、プールし、０．４５umフィルターを通過させて濾過し、ＳＷ４１ローターを用いて２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分間超遠心分離した。ペレット化した物質を最終的に冷ＰＢＳ中に再懸濁し、２００倍濃度とした。６枚の１０cm皿を使用して大規模調製を行い、２００×小胞約４００ulを生成させた。
【０１２８】
ＹＦＰ／ＣＤ８１担持小胞は、ＹＦＰを発現しているレンチベクターを予めトランスダクションされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に１５μgのＶＳＶ−Ｇプラスミドをトランスフェクションすることによって産生させた。
【０１２９】
沈降した微小胞中のタンパク質の量を定量するために、本発明者らは、ｆｌａｇ化ｍＣＡＴ−１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。簡潔には、系列希釈した小胞をＰＢＳ／２％トリトンＸ１００中で溶解させ、炭酸塩被覆緩衝液（ｐＨ９．６）に入れて９６ウェルプレート（NUNC.Maxisorp）の中を一晩被覆した。ｆｌａｇ−ペプチド（Sigma）の系列希釈物を並行して無トリトン緩衝液に入れて被覆した。洗浄されたプレートを、１／１０００希釈された抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ抗体（M2 Sigma）と共に１時間インキュベーションし、ＴＭＢ基質で最終的に顕色させることでタンパク質およびペプチドを明らかにした。これらのアッセイは、本発明者らが小胞調製物中のｆｌａｇ化タンパク質の量を設定できるようにした。
【０１３０】
または、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇペプチドの系列希釈物で被覆することにより、ＶＳＶ−Ｇ Ｅｌｉｓａアッセイを計画した。そのペプチドを、ＨＲＰとカップリングした抗ＶＳＶＧ抗体（Ｐ５Ｄ４、Sigma）によって認識した。したがって、全てのＶＳＶ−Ｇ小胞を、小胞調製物１μlあたりのＶＳＶ−Ｇペプチド当量質量として表現することができる。
【０１３１】
考察
本実施例において本発明者らは、操作されたエキソソーム様小胞の使用によってヒト細胞に細胞質タンパク質および膜タンパク質を移行させる独特で簡単な方法を開発した。このゲシクル介在性タンパク質送達技法をさらに使用して、ヒト細胞に機能的転写因子を導入した。これらの微小胞の産生を、ＶＳＶ−Ｇを共トランスフェクションされた２９３Ｔプロデューサー細胞での関心が持たれるタンパク質の過剰発現によって達成した。膜タンパク質ならびに膜脂質およびアクチンが豊富に存在するという上清の分析によって明らかとなったように、ＶＳＶ−Ｇは、２９３Ｔ細胞からの小胞産生を高めると思われる（図１１）。さらに、微小胞の膜で被覆することによって、融合誘発Ｇタンパク質は、それらがターゲット細胞と接触する能力を高め、粒子と細胞膜の間で非常に効率的に融合させる。これは、ターゲット細胞中に微小胞内容物を放出する必要条件である。
【０１３２】
実施例２
共培養実験での孔径３μmのインサートを介する小胞介在性タンパク質の移行
本発明者らは、様々な組み合わせのプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ細胞をＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞系と一緒に同じ培地中で培養した。図示したように、産生細胞を下部の６ウェル皿の中に、レポーター細胞系を上部インサート中に入れるように、細胞を孔径３μmのフィルターによって分離した。担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇコードプラスミドまたは融合欠損ＶＳＶ−Ｇと共にｔＴＡ発現プラスミドを産生細胞に共トランスフェクションした。４８時間共培養後に、インサートを取り外し、レポーター細胞系をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析してｔＴＡの送達を評価した。結果をＴｅｏ−ＧＦＰ細胞系でのＭＦＩとして示す（図１２）。
【０１３３】
この技法は、濃縮ステップの必要なしにターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能にする。濃縮された小胞は、ターゲット細胞の種類に応じて有毒な場合がある。ターゲット細胞を、上部または下部チャンバー中で培養して、一定のタンパク質送達のために小胞産生細胞と共に数日間注入を行うことができる。いくつかの因子を逐次導入しなければならない場合、小胞を含有する別の浴中にインサートを簡単に移すことによって、逐次注入を行うことさえできる。
【０１３４】
実施例３
昆虫細胞の微小胞産生およびアッセイ(dosage)
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen）を製造業者の説明書に従って使用してバキュロウイルスの産生を行った。簡潔には、関心が持たれるｃＤＮＡをｓｐＦＡＳＴ−１シャトルにクローニングしてから、ＤＨ１０−ＢＡＣ細菌に組み換えした。次に、バキュロウイルスＤＮＡを使用してＳＦ−９細胞にトランスフェクションして最初のバキュロ原液を生成させ、それを７２時間後に収集した（継代１回目）。このポリクローナル原液を力価１×１０７pfu/mlに達するまでさらに増幅させ（継代２回目）、それを４℃で保存し、小胞産生のために使用した。
【０１３５】
グルタミン（２０mM）およびペニシリン−ストレプトマイシン（ペニシリン２５Ｕ、ストレプトマイシン２５μg/ml）を補充された１００mlのExpress-five ＳＦＭ培地中で撹拌しながら３０℃で懸濁培養された２００×１０６個のＨＩＧＨ５細胞にバキュロウイルスを感染させて（０．５〜１のＭＯＩ）、昆虫細胞微小胞を産生させた。接種の４８時間後に培地を回収し、透明にし、孔径０．４５ｍｍのフィルターを２回通過させて濾過してから、ＳＷ−３２ローターを用いて２４０００rpm（１００．０００ｇ）で超遠心分離した。次に、沈降した物質を冷ＰＢＳ中に再懸濁し（１００×濃縮）、−８０℃で保存した。
【０１３６】
よりよく精製するために、この濁った調製物を不連続なイオジキサノール勾配上に重ね、異なる密度画分を分離させた。画分の生物学的分析は、活性な小胞が密度１．０９〜１．１１の間で沈降される収容タンパク質を移行可能であることを明らかとした。これらの画分をプールし、冷ＰＢＳを補充した最終濃縮ステップのプール後に（ＳＷ４１で３００００rpm、１時間）、高度に精製された小胞が調製された。
【０１３７】
昆虫細胞由来小胞をリン脂質−酵素ＰＡＰ５０検出キット（Biomerieux）および上記ＶＳＶ−Ｇ ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【０１３８】
昆虫細胞由来微小胞の特徴づけ
記載したようにｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させてＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に小胞をイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離して小胞をその密度に応じて沈降させた。次に、チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。図１３Ａのグラフからｄ＝１．３から１．０５の範囲の密度勾配を認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（図１３Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、ＧＦＰバキュロウイルスがどこで沈降したかを同定した。感染の３日後にＦＡＣＳによってｓｆ９を分析し、バキュロウイルスの力価を計算した。Ａに示される結果（黒色棒線）は、ウイルスが画分１３から画分２０の間で沈降し、ピークが画分１６であったことを示した。本発明者らは、また、ヒト細胞にＧＦＰを送達するためにその画分を使用し、２４時間後に蛍光の移行を分析した（図１３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、ＧＦＰの移行能が画分１４〜１９に含有され、部分的にウイルス含有画分と重複することを見出した。
【０１３９】
ｔＴＡ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）
ｔＴＡ−バキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ５細胞でｔＴＡ微小胞を産生させた。小胞を濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１０倍希釈して、１００μlのＰＢＳ中で行われるアッセイに供した。０．５当量のリン脂質ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）の系列希釈物または対照抗体と共に３７℃で２時間インキュベーションした。次に、小胞をＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現）上に重ね入れた。２４時間後に、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、ＧＦＰの発現を定量した。結果を全般集団ＭＦＩとして示す（図１４参照）。
【０１４０】
ｔＴＡ昆虫微小胞を使用した用量反応
ｔＴＡ昆虫微小胞を濃縮し、前記のように精製し、−８０℃で保存した。漸増する用量の小胞を使用して、ＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞系にｔＴＡを送達し、漸増するＧＦＰシグナルをもたらし、そのシグナルを小胞の２４時間後にターゲット細胞から検出した。ドキシサイクリン処理細胞は、ＴＥＴ系の予想された誘導性を反映するバックグラウンド蛍光を示した（図１５参照）。
【０１４１】
考察
本発明者らは、ヒト細胞由来小胞の産生が、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび関心が持たれるタンパク質（ＹＦＰ、ｍＣＡＴ−１、ｔＴＡなど）をコードする別のプラスミドをプロデューサー細胞に共トランスフェクションすることで達成されたことを示した。産生系の性能を高めるために、本発明者らは、ＶＳＶ−ＧおよびｔＴＡをコードするリコンビナントバキュロウイルスを構築し、バキュロウイルス感染に高度に許容性の昆虫細胞に感染させた。そのうえＨｉｇｈ５細胞およびＳＦ９細胞は、血清なしに、または動物産物を欠如する合成培地であっても最大２×１０６/mlまで容易に懸濁培養することができる。顕著にはバキュロウイルスはヒト細胞では複製せず、導入遺伝子の発現を推進するポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞特異的であって、ヒト細胞において活性でない。
【０１４２】
本発明者らは、ｔＴＡおよびＶＳＶＧに同時感染すると、昆虫細胞がヒト細胞にｔＴＡを移行させることができる微小胞を産生することを見出した。本発明者らは、また、ＶＳＶ−Ｇは有用であるが、この工程になくてもかまわないことを見出したが、これは、別の融合タンパク質がそれと置き替わることができるであろうことを示唆している。全ての感染細胞で発現されるバキュロウイルスのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ６４は、この役割を演じることができよう。中和アッセイを行うことによって、本発明者らは、昆虫微小胞によって仲介されるタンパク質送達をｇｐ６４抗体で中和できることを示した。
【０１４３】
さらに昆虫細胞の小胞を特徴づけるために、本発明者らは、ＧＦＰ昆虫小胞をイオジキサノール勾配上に重ね入れてそれらの密度を測定した。この工程は、混合物中に存在する異なる物質をそれらのそれぞれの密度にしたがって分離させる。この実験は、小胞含有画分がバキュロウイルス含有画分と重複することを示した。バキュロウイルスはヒト細胞中で複製することができないことが一般に認められているが、本発明者らは、ｔＴＡをコードするバキュロウイルスのわずかな発現が、レポーターターゲット細胞でのＧＦＰ発現を活性化するために十分なｔＴＡを産生することができると推測することができる。これを調べるために、本発明者らは、Ｂａｃリコンビナントを構築するために使用されたシャトルプラスミド（ｐＦＡＳＴ）中の昆虫特異的ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）をＣＭＶまたはＥＦＩａプロモーターによって置き換えた（図１６Ａに示す構築物）。ｐＨとは対照的に、ＨＥＫ−Ｔｅｏ ＧＦＰレポーター細胞系でのトランスフェクション実験によって明らかにされたように、それらのプロモーターはヒト細胞で高度に活性である（図１６Ｂ）。次に本発明者らは、ＣＭＶプロモーターを選択して二つのリコンビナントバキュロウイルス（ＣＭＶ１およびＣＭＶ２）を生成させ、そのウイルスを続いて増幅させ、ｓｆ９細胞に感染させるために使用した。両方のＣＭＶリコンビナントは、ｐＨリコンビナントと同じように効率的にｓｆ９細胞に感染した。これは、プロデューサー細胞溶解物で行われたウエスタンブロット分析によって明らかとなった（図１６Ｃ）。バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６４は、使用されたプロモーターの性質に関わらず明らかに細胞溶解物から検出された。微小胞を調製したとき、本発明者らは、微小胞溶解物に同じ染色を行い、ｇｐ６４が三つの試料から高度に検出されることを立証したが、これは、ＣＭＶの取り替えがｓｆ９へのバキュロウイルス感染にもウイルス放出にもあまり影響しなかったことを示している。本発明者らは、予想通りｐＨリコンビナントがｓｆ９細胞で二つのＣＭＶリコンビナントよりも高いレベルのｔＴＡを発現することを見出した。これは、微小胞から検出されたｔＴＡの量がｐＨ溶解物よりもかなり高いことに論理的に影響した。漸増する用量のｐＨ−ｔＴＡおよびＣＭＶ−ｔＴＡ微小胞を最終的にＨＥＫ−ＴｅｏＧＦＰ細胞系上に重ね入れた。２４時間後にｔＴＡ送達の効率を反映しているＭＦＩをＦＡＣＳによって分析したが、それは、ｐＨリコンビナントを用いて産生された小胞が、ＣＭＶリコンビナントを用いて産生された小胞よりも１０倍効率的であることを明らかにした（図１６Ｄ）。これは、効率的なｔＴＡの移行がプロデューサー細胞での高レベルのタンパク質発現と相関することを示している。これは、タンパク質自体がバキュロウイルス関連微小胞によって送出されるという仮説を支持している。そのうえ、プロモータースワップによりヒト細胞でのｔＴＡバキュロウイルスの転写性能を増加させても、ターゲットにおけるｔＴＡ入手性は増加せず、これは、バキュロウイルスによって推進される転写が、送達されたｔＴＡの機能の原因とはならない（またはほとんど関与しない）ことを示している。まとめるとこれらのデータは、ヒト細胞へのｔＴＡ移行が昆虫細胞由来ｇｐ６４微小胞によって達成され、コードするバキュロウイルスによっては達成されないことを示している。
【０１４４】
実施例４：ゲシクルは細胞のリプログラミングおよび人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の産生のために使用することができる
実施例４Ａ． ＥｃｏＲ含有ゲシクルを使用したリプログラミング
細胞培養
ヒト正常成体線維芽細胞（Coriell細胞保管所から取り寄せた）は、１０％ＦＢＳ、１mMピルビン酸ナトリウムおよび２mM GlutaMAX（商標）を補充されたＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。ヒトｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞培地、すなわち２０％ノックアウト血清代替物、１０ng/ml ｂＦＧＦ、０．１mM可欠アミノ酸、５０mM β−メルカプトエタノール、２mM GlutaMAX（商標）および０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたノックアウトＤＭＥＭに入れたマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー細胞上で維持した。
【０１４５】
レトロウイルスの産生
ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４のヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有するモロニーベースのレトロウイルスベクター（ｐＭＩＧ）をAddgeneから得た。これらのプラスミドを、FuGeneを使用してＰＬＡＴ−Ａ（アンホトロピックウイルス産生用）またはＰＬＡＴ−Ｅ（エコトロピックウイルス産生用）パッケージング細胞に個別にトランスフェクションした。ＰＬＡＴ細胞培地をトランスフェクションの２４時間後に取り替えた。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μフィルターを通過させて濾過し、次に１：１：１：１の比で混合した。
【０１４６】
エコトロピックレセプター（ＥｃｏＲ）を含有するゲシクルの産生
上記のようにＶＳＶ−Ｇを安定発現している２９３Ｔ細胞からゲシクルを産生させた。
【０１４７】
多能性幹細胞の誘導
アンホトロピック誘導されたｉＰＳ細胞の生成のために、ウイルス混合物をヒト線維芽細胞に２４時間感染させ、次に、その細胞をゼラチンコートされた６ウェルプレート中のウェル１個あたり細胞３．１０ｅ４個となるように線維芽細胞培地中に再度植え、それを０日目と定義する。
【０１４８】
エコトロピック誘導されたｉＰＳ細胞を生成するために、ＥｃｏＲレセプターを含有するゲシクルを感染の１．５時間前に細胞に添加したことを除き、同じプロトコールに従った。
【０１４９】
感染後１日目から開始して、０．５mM ＶＰＡを補充されたヒトＥＳ細胞培地中で細胞を１０日間培養し、次にｉＰＳコロニーが出現するまで非補充ｈＥＳ細胞培地中で培養した。
【０１５０】
ｉＰＳ細胞系を樹立するために、感染の約３〜５週間後にＥＳ細胞様コロニーの形態に基づいてｉＰＳコロニーを釣り上げた。釣り上げられたコロニーを続いてエクスパンションさせ、ＶＰＡを有さないヒトＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー層上で維持した。解離されたヒトＥＳ単細胞およびｉＰＳ細胞の生存を高めるＲＯＣＫ阻害物質であるＹ−２７６３２を１０μMで使用して、釣り上げ後の最初のコロニーエクスパンションおよび各継代後の初日についてのｉＰＳ細胞の接種効率を高めた。
【０１５１】
アンホトロピックまたはエコトロピックなトランスダクションプロトコールのいずれかを使用して等しい数のクローンを得た。
【０１５２】
いずれかのプロトコールで得られたｉＰＳクローンをｈＥＳＣ培養条件で２０回よりも多く継代してエクスパンションさせたが、形態に変化はなかった。多能性マーカーの免疫細胞化学分析から、両方の種類のクローンでＳＳＥＡ−４についての等しい染色が示されたが（図１８）、これは、多能性幹細胞の特徴と適合した。
【０１５３】
したがって、ターゲット細胞をエコトロピックウイルスに許容性にするために、エコトロピックレセプターを含有するゲシクルを使用することができる。そのうえ、ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するために、エコトロピックウイルスは、アンホトロピックベクターに効率的に取って代わることができる。それらは、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に効率的にリプログラミングするために使用することができ、より安全な代替物に相当する。
【０１５４】
実施例４Ｂ． ｃ−ｍｙｃを含有するゲシクルを使用したリプログラミング
リプログラミング因子ｃ−ｍｙｃを含有するゲシクルの産生
ヒト微小胞を、リン酸カルシウム法を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生させた。細胞を１０cm皿に３×１０ｅ６個となるように蒔き、その細胞に皿１枚あたり１５μgのＶＳＶ−Ｇコードプラスミドおよび１５μｇのｃ−ＭＹＣコードプラスミドを共トランスフェクションした。トランスフェクション培地を２４時間後に取り替え、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に小胞を含有する上清を収集し、プールし、０，４５umフィルターを通過させて濾過し、ＳＷ４１ローターを用いて２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分超遠心分離した。ペレット化した物質を最終的に冷ＰＢＳ中で一晩再懸濁し、２００倍濃縮（上清体積／終体積）とした。６枚の１０cm皿で調製を行い、約４００μlの２００×小胞を生成させた。
【０１５５】
細胞培養
ＩＭＲ−９０ヒト正常線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、１mMピルビン酸ナトリウムおよび２mM GlutaMAX（商標）を補充されたＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。ヒトｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞培地、すなわち２０％ノックアウト血清代替物、１０ng/ml ｂＦＧＦ、０，１mM可欠アミノ酸、５０mM β−メルカプトエタノール、２mM GlutaMAX（商標）および０，１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたノックアウトＤＭＥＭ中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー細胞上で維持した。
【０１５６】
レトロウイルスの産生
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４のヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有するモロニーベースのレトロウイルスベクター（ｐＭＩＧ）をAddgeneから得た。これらのプラスミドを、FuGeneを使用してＰＬＡＴ−Ａ（アンホトロピックウイルス産生用）パッケージング細胞に個別にトランスフェクションした。ＰＬＡＴ−Ａ細胞培地をトランスフェクションの２４時間後に取り替えた。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μmフィルターを通過させて濾過し、次に１：１：１の比で混合した。ヘペスおよびポリブレン（４μg/mL）をそのウイルス混合物に添加した。
【０１５７】
多能性幹細胞の誘導
ＩＭＲ−９０線維芽細胞をウイルス混合物によって感染させ、次にトランスダクションの開始から６時間後に１０μLのｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルをトランスダクション培地に添加した。トランスダクションの２４時間後に細胞をゼラチン被覆６ウェルプレートのウェル１個あたり３．５×１０ｅ４個となるように線維芽細胞培地中に再度植え、その時点を０日目と定義する。１日目に１０μLのｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルを用いた２回目の処理を行った。
【０１５８】
感染１日後から開始して、０．５mM ＶＰＡを補充されたヒトＥＳ細胞培地中で細胞を１０日間培養し、次にｉＰＳコロニーが出現するまで非補充ｈＥＳ細胞培地中で培養した。
【０１５９】
感染の約４週間後にＥＳ細胞様コロニーの形態に基づいて１個のｉＰＳコロニーを釣り上げた。続いて、釣り上げられたコロニーをエクスパンションさせ、ＶＰＡを有さないヒトＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー層上で維持した。解離したヒトＥＳ単細胞およびｉＰＳ細胞の生存を高めるＲＯＣＫ阻害物質であるＹ−２７６３２を１０μMで使用して、釣り上げ後の最初のコロニーエクスパンションおよび各継代後の初日についてのｉＰＳ細胞の接種効率を高めた。
【０１６０】
ｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルを用いて得られたｉＰＳクローンをｈＥＳＣ培養条件で８回よりも多く継代してエクスパンションさせたが、形態に変化はなかった。多能性マーカーのフローサイトメトリー分析から、細胞数の９０％超にＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１についての二重染色が示されたが（図１９）、これは多能性幹細胞の特徴と一致した。
【０１６１】
したがって、リプログラミング転写因子を含有するゲシクルは、ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するためにレンチウイルスベクターに効率的に取って代わることができる。それらは、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に効率的にリプログラミングするために使用することができる。
【０１６２】
参考文献
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示の参照により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、真核細胞をリプログラミングするための、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を得るための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
哺乳動物細胞は、診断応用および医学応用におけるin vitroモデルに広く使用される。例えば、哺乳動物細胞は、薬物をスクリーニングするため、分子経路を研究するため、または治療薬の製造に使用されることがある。哺乳動物細胞は、また、細胞療法のために使用することができる。
【０００３】
哺乳動物幹細胞は、全ての哺乳類生物から見出される始原細胞（primal cell）であり、有糸細胞分裂により自己を再生する能力を保持し、多様な範囲の専門化された細胞種類に分化することができる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞の内部細胞集塊の胚盤葉上層組織由来細胞の培養物である。
【０００４】
無制限のエクスパンションおよび多能性というそれらの二つの基礎的特質が原因で、幹細胞、特にヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、細胞代償療法および創薬に使用するためにかなりの関心を集めている。
【０００５】
しかしながら、ＥＳ細胞を得るために胚を使用することは議論の余地があり、倫理問題を提起する。したがって、多能性細胞の代替的な供給源が検討されている。
【０００６】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、非多能性の、典型的には成体の体細胞からある種の遺伝子の「強制」発現を誘導することによって人工的に得られた多能性幹細胞の一種である。
【０００７】
ｉＰＳ細胞は、２００６年にマウス細胞から（Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76）、そして２００７年にヒト細胞から（Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72, Yu et al. Science 2007 318 :1917）最初に作出された。これらの著者は、ウイルス発現系を使用してリプログラミング転写因子を体細胞に導入することによって、該体細胞を脱分化することが可能であることを実証した。
【０００８】
しかしながら、ウイルストランスダクションの使用は、治療に使用するためにそのような方法を開発することを妨げるいくつかの問題を提起する。実際に、ターゲット細胞のゲノム変化およびガン遺伝子発現のリスクが存在する。
【０００９】
他の著者は、ウイルスフリーのｉＰＳ細胞を作出するための非組み込み型エピソームベクターの使用を示唆した（Yu et al. Science 2009, vol 324, p 797-801）。しかしながら、リプログラミング効率は低いままである。さらに、結果として生じたｉＰＳクローンの一つにおける核型異常が、後にこれらの著者によって観察された。
【００１０】
最近、Zhouらは、ｉＰＳ細胞を得るための非遺伝的方法を報告した（Zhou et al. Cell Stem Cell 2009, vol 4, p 381-384）。これらの著者は、ターゲット細胞にリプログラミング因子を導入するためにポリアルギニンリコンビナントタンパク質を使用した。しかしながら、この方法は時間を浪費し、大規模生産があまり容易ではない。それは、ターゲット細胞に導入する前に各リコンビナントタンパク質を発現および精製しなけらばならないからである。
【００１１】
したがって、依然として、当技術分野においてターゲット細胞をリプログラミングするための、例えば人工多能性幹細胞を得るための迅速、安全かつ効率的な方法の必要性がある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞に関する。
【００１３】
本発明は、また、本発明による真核細胞によって分泌された微小胞に関し、ここで、該微小胞は、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む。
【００１４】
本発明は、また：
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によって、ターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって、該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００１５】
本発明は、また、リプログラミング転写因子を含む本発明の微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を送達するためのin vitro方法に関する。
【００１６】
本発明は、また、上記微小胞によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００１７】
本発明は、また、上記方法によって入手可能な人工多能性幹細胞に関する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、関心が持たれるタンパク質を発現している真核細胞でのウイルス膜融合タンパク質の過剰発現が、該膜融合タンパク質および関心が持たれる該タンパク質を含む微小胞の分泌に繋がりうることを発見した。さらに本発明者らは、ターゲット細胞に関心が持たれる該タンパク質を効率的に送達するために該微小胞を使用することができることを実証した。
【００１９】
特に本発明者らは、ターゲット細胞にエコトロピックレセプターを送達することによって、該ターゲット細胞を、リプログラミング転写因子を含有するエコトロピックウイルスに許容性にするために、微小胞を使用することができることを実証した。
【００２０】
本発明者らは、また、リプログラミング転写因子の機能を変化させずにターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を直接送達するために、およびそれによって該ターゲット細胞をリプログラミングするために、例えば人工多能性幹細胞を得るために、該微小胞を使用することができることを実証した。
【００２１】
したがって本発明は、ウイルス膜融合タンパク質と、エコトロピックレセプターまたはリプログラミング転写因子とを過剰発現している真核細胞に関する。該真核細胞は、ウイルス膜融合と、エコトロピックレセプターまたは該リプログラミング転写因子とを含む微小胞を分泌可能である。
【００２２】
一態様では、本発明による真核細胞は、ウイルス構造タンパク質を発現せず、そのような真核細胞によって分泌される微小胞は、ウイルス構造タンパク質を含まない。したがって本発明による微小胞は、その局面においてＨＩＶ１ Ｇａｇなどのウイルス構造タンパク質を含む、当技術分野、例えば国際公開公報第２００６／０５９１４１号に記載されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）とは異なる。
【００２３】
本明細書に使用される「ウイルス構造タンパク質」という用語は、ウイルスのキャプシドタンパク質またはタンパク質コアの全体構造に寄与するウイルスタンパク質を表す。「ウイルス構造タンパク質」という用語には、さらに、ウイルスのキャプシドタンパク質またはタンパク質コアの構造に寄与するそのようなウイルスタンパク質の機能的フラグメントまたは誘導体が含まれる。ウイルス構造タンパク質の一例は、ＨＩＶ１ Ｇａｇである。ウイルス膜融合タンパク質は、ウイルス構造タンパク質として見なされない。典型的には、該ウイルス構造タンパク質は、微小胞内に局在する。
【００２４】
本発明者らは、実際に、ウイルス構造タンパク質を発現しないがＶＳＶ−Ｇまたは他の融合誘発タンパク質などの膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を過剰発現する真核細胞において、関心が持たれるタンパク質を含む微小胞が産生できることを示した。
【００２５】
そのうえ本発明による微小胞は、リプログラミング転写因子をコードする核酸を含有しなくてもよい。もちろん、微量の核酸、特にプロデューサー細胞からの微量のｍＲＮＡまたは以前のトランスフェクションに起因するＤＮＡであっても該微小胞中に含有されることを除外することはできない。しかしながら本発明者らは、そのような微量の核酸（存在する場合）が、微小胞によるタンパク質機能の移行の９０％以上の原因になることができないことを実証した。
【００２６】
典型的には真核細胞は、ヒト細胞または昆虫細胞などの哺乳動物細胞である。
【００２７】
適切な哺乳動物細胞の例は、非限定的にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｈｅｌａ細胞およびＨＥＫ−２９３細胞である。
【００２８】
「過剰発現すること」によって、所与の細胞によって発現されるタンパク質の量を高めるための、当技術分野において公知の任意の手段が意味される。事実上、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子は、真核細胞がウイルス構造タンパク質を発現する必要なしに、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む微小胞を分泌可能であるようなレベルまで発現される。
【００２９】
典型的には、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子の過剰発現は、ウイルス膜融合タンパク質をコードする発現ベクターおよびリプログラミング転写因子をコードする発現ベクターを真核細胞にトランスフェクションすることによって達成することができる。
【００３０】
別の態様では、本発明による該真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質としてとしてのＶＳＶ−Ｇおよびリプログラミング転写因子を過剰発現しているが、他のウイルスタンパク質、特にウイルス構造タンパク質を過剰発現しない。該態様により分泌される微小胞は、ＶＳＶ−Ｇおよび該リプログラミング転写因子を含むが、ウイルス構造タンパク質を含まない。
【００３１】
別の特定の態様では、真核細胞は、ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子だけを過剰発現する。この態様では、ウイルス膜融合タンパク質、例えばＶＳＶ−Ｇの発現は、細胞中の過剰発現タンパク質の少なくとも３０％、例えば少なくとも５０％に相当することがある。
【００３２】
一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子は、二つの異なるベクターによってコードされることがある。
【００３３】
一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および関心が持たれる該タンパク質は、２シストロン性発現カセットを含有する単一ベクターによって担持されることがある。関連する態様では、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子は、一緒に共有結合していない。
【００３４】
一態様では、発現ベクターには、エピソーム複製プラスミドおよび例えばＳＶ４０ ＯＲＩまたはＥＢＶ ＯＲＩ配列などのウイルス性起点配列を含むプラスミドが含まれることがある。
【００３５】
発現ベクターによる過剰発現は、分子生物学の技術分野で公知の任意の遺伝子導入法を含むことがある。
【００３６】
好ましい態様では、過剰発現は、外来ＤＮＡのトランスフェクションによって得られる。適切なトランスフェクション法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームを使用するトランスフェクション（リポフェクションとしても知られている）またはエレクトロポレーションなどの、技術者に公知の古典的方法である。所与の細胞に適切なトランスフェクション法を選択することは、技術者の能力の範囲内である。
【００３７】
好ましい態様では、過剰発現は、ウイルストランスダクションによって得られない。
【００３８】
過剰発現は、一過性過剰発現または安定過剰発現でありうる。
【００３９】
一過性過剰発現を用いる場合、細胞は、典型的にはトランスフェクションの４８から７２時間後の間に最適量のウイルス膜融合タンパク質および／またはリプログラミング転写因子を過剰発現する。
【００４０】
「過剰発現」という用語は、また、内因性タンパク質、すなわち真核細胞によって自然に発現されるタンパク質の過剰発現を包含する。過剰発現は、該タンパク質をコードする遺伝子の追加的なコピーの導入または内因性タンパク質の発現刺激のいずれかにありうる。一例として、真核細胞は、該内因性タンパク質の発現を高めることが知られている培養条件下に置くことができる。
【００４１】
典型的には、該ウイルス膜融合タンパク質は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのクラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜融合タンパク質またはクラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である（クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質に関する総説についてはBackovic et al, Curr Opin Struct Biol 2009, 19(2):189-96またはCourtney et al, Virology Journal 2008, 5:28を参照されたい）。
【００４２】
好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００４３】
クラスＩウイルス膜融合タンパク質の例は、バキュロウイルスＦタンパク質、特にSpodoptera exigua ＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびLymantria dispar ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）Ｆタンパク質などの、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質である。
【００４４】
好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質である。
【００４５】
クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質の例は、ラブドウイルスＧ（水疱性口内炎ウイルスの融合誘発タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）など）、ヘルペスウイルスｇＢ（単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｂ（ＨＳＶ−１ ｇＢ）など）、ＥＢＶ ｇＢ、トゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（Autographa CaliforniaマルチプルＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４など）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）である。
【００４６】
より好ましい態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇまたはバキュロウイルスｇｐ６４である。一態様では、該ウイルス膜融合タンパク質は、GenBank ＡＮ：Ｍ３５２１９．１に定義されているようなＶＳＶ−Ｇポリペプチドまたは融合誘発性を保持する任意の機能的フラグメントもしくはそれらの機能的誘導体である。
【００４７】
本明細書に使用される「融合誘発」という用語は、タンパク質がターゲット細胞の膜への微小胞原形質膜の融合を誘導する能力を表す。
【００４８】
本発明の一態様では、本発明による真核細胞は、さらに、膜出芽を誘導するタンパク質を過剰発現する。この態様では、微小胞の産生が高まる。
【００４９】
本明細書に使用される「膜出芽を誘導するタンパク質」という表現は、脂質二重層の変形を促進して小胞形成を仲介することができる任意のタンパク質を表す。
【００５０】
所与の被験タンパク質が膜出芽を誘導する能力は、以下のin vitro試験「Ａ」に従って評価することができる：
【００５１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に被験タンパク質をトランスフェクションするか、または空のベクターを模擬トランスフェクションする。トランスフェクションの２０時間後に、細胞培地をＲ１８含有培地（２０μg/ml）に取り替える。Ｒ１８、すなわちオクタデシルローダミンＢクロリドは、膜と結合し、５６０nmで励起すると５９０nmで蛍光を発する親油性化合物である。６時間インキュベーションして細胞膜にＲ１８を組み入れた後に、Ｒ１８を有さない新鮮培地から培地を交換する。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクションされた細胞からの培地および模擬トランスフェクションされた細胞からの培地を収集し、透明にし、蛍光光度計によって分析する。レザズリン（rezazurin）ベースのアッセイによって計数された生細胞数に対して基準化されたＲ１８関連蛍光の量は、各条件で細胞によって放出された膜の量を反映する。
【００５２】
上記試験「Ａ」によって測定されたとき、被験タンパク質が細胞１個あたりのＲ１８関連蛍光の量を増加させる場合、そのタンパク質は、膜出芽を誘導すると見なされる。
【００５３】
様々な細胞タンパク質およびウイルスタンパク質が、膜出芽を誘導することが知られている。
【００５４】
膜出芽を誘導する細胞タンパク質の例は、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１（Trajkovic et al. 2008 Science, vol 319, p 1244-1247）、クラスリンアダプター複合体ＡＰ１（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）、フロッパーゼ、スクランブラーゼなどの脂質の性質を改変するタンパク質、ＴＳＡＰ６（Yu et al. 2006 Cancer Res vol 66, p4795-4801）およびＣＨＭＰ４Ｃ（Yu et al. 2009, FEBS J. vol 276, p2201-2212）などの非古典的経路を介した分泌を促進するタンパク質である。
【００５５】
膜出芽を誘導するウイルスタンパク質の例は、ＨＩＶのＶｐｕタンパク質などのテザリン（tetherin）／ＣＤ３１７アンタゴニスト（Neil et al. 2008. Nature vol451, p425-4431）、ならびにレトロウイルスＧＡＧ（Camus et al., 2007. Mol Biol Cell vol 18, p3193-3203）およびエボラＶＰ４０（Timmins et al., Virology 2001）などの様々なウイルス構造タンパク質である。
【００５６】
膜出芽は、また、温度、Ｃａ２＋濃度などの、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング因子を過剰発現している真核細胞の細胞培養条件を改変することによって誘導してもよい。
【００５７】
本発明の一態様では、真核細胞は、２〜５種の異なるリプログラミング因子を過剰発現する。
【００５８】
本明細書に使用される「リプログラミング因子」、「リプログラミング核因子」および「リプログラミング転写因子」という表現は、互換的に使用される。それらは、所与のターゲット細胞に独立してまたは組み合わせで発現された場合に、細胞運命を変更するために、すなわち細胞をリプログラミングするために使用することができる核タンパク質を表す。
【００５９】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を得るためのリプログラミング因子は、先行技術に記載されている。
【００６０】
例えば、リプログラミング因子は、国際公開公報第２００７／０６９６６６号という文書において同定された。リプログラミング因子は、Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76; Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72およびYu et al. Science 2007 318: 1917に記載されている。
【００６１】
リプログラミング転写因子は、任意の哺乳動物起源のことがある。典型的には、それらはマウス起源またはヒト起源のことがある。好ましくは、リプログラミング転写因子は、リプログラミングされるべきターゲット細胞と同じ種に属する。
【００６２】
リプログラミング因子の例には、非限定的に以下が挙げられる：
− Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）：Ｏｃｔ−３／４は、オクタマー（「Ｏｃｔ」）転写因子ファミリーの１種であり、多能性の維持に重大な役割を果たす。割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ−３／４＋細胞にＯｃｔ−３／４が不在になると、栄養芽層の自然分化に繋がることから、Ｏｃｔ−３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能の元となる。例示的なＯｃｔ３／４タンパク質は、マウスＯｃｔ３／４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１３６３３）およびヒトＯｃｔ３／４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００２７０１）によってコードされるタンパク質である。
− Ｓｏｘファミリーの因子：Ｓｏｘファミリー遺伝子は、Ｏｃｔ−３／４に類似して多能性の維持に関連するが、もっとも、多能性幹細胞にのみ発現されるＯｃｔ−３／４とは対照的に、多能性および単能性幹細胞に関連する。Ｓｏｘ２は、誘導のために使用される最初の遺伝子であったが（Takahashi et al Cell 2006 126: 663-76; Takahashi et al. Cell 2007 131-861-72; Yu et al. Science 2007 318 :1917）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に誘導過程において作用することが見出されている。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と類似の効率でｉＰＳ細胞をもたらし、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８遺伝子もｉＰＳ細胞を生成する。
例示的なｓｏｘ−２タンパク質は、マウスＳｏｘ２遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１１４４３）およびヒトＳｏｘ２遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００３１０６）によってコードされるタンパク質である。
− Ｋｌｆファミリーの因子：Ｋｌｆファミリー遺伝子のＫｌｆ４は、当初、マウスｉＰＳ細胞を生成するための因子として同定され、また、ヒトｉＰＳ細胞を生成するための因子としても実証された。
例示的なＫｌｆ４タンパク質は、マウスｋｌｆ４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１０６３７）およびヒトｋｌｆ４遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００４２３５）によってコードされるタンパク質である。
− Ｍｙｃファミリーの因子：Ｍｙｃファミリー遺伝子は、ガンに意味づけられるガン原遺伝子を含有する。ｃ−ｍｙｃは、マウスｉＰＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞の生成に意味づけられる因子であることが示された。
例示的なｃ−ｍｙｃタンパク質は、マウスｃ−ｍｙｃ遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿０１０８４９）およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子（GenbankアクセッションナンバーＮＭ＿００２４６７）によってコードされるタンパク質である。
− Ｎａｎｏｇファミリー：胚性幹細胞では、Ｏｃｔ−３／４およびＳｏｘ２に加えてＮａｎｏｇが多能性の促進に必要である。
− ＬＩＮ２８：ＬＩＮ２８は、胚性幹細胞および胚性ガン細胞に発現される、分化および増殖に関連するｍＲＮＡ結合タンパク質である。Yuらは、それが、必須ではないものの、ｉＰＳ生成における因子であることを実証した（Yu et al. Science 2007, vol318:1917-20）。
【００６３】
好都合には、本発明者らは、リプログラミング転写因子がターゲット細胞中に移行した後、その機能性を保持することを示した。
【００６４】
一態様では、ウイルス膜融合タンパク質は、真核細胞から放出された微小胞の精製を可能にするタグを含有することがある。該タグは、例えばウイルス膜融合タンパク質のエクトドメインに局在することがある。
【００６５】
適切なタグには、非限定的に、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓ６タグが挙げられる。適切なタグおよび該タグの適切な精製方法を選択することは、当業者の能力の範囲内である。
【００６６】
適切な精製方法には、非限定的に、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、および抗タグ特異抗体で被覆された磁気ビーズが挙げられる。
【００６７】
好ましい態様では、本発明による真核細胞は、ウイルスフリーである。
【００６８】
本発明は、また、本発明による真核細胞によって分泌された微小胞であって、該ウイルス膜融合タンパク質および該リプログラミング転写因子を含む微小胞に関する。
【００６９】
理論に縛られることを望むわけではないが、該微小胞は、エキソソーム様であり、４０から１５０nmの間、例えば４０から１００nmの間のサイズ、例えば約１００nmの平均サイズを有すると見なされる。典型的には本発明による微小胞は、１．０８g/mlから１．１２g/mlの間の密度を有する。
【００７０】
好ましくは、本発明による微小胞は、１．０９g/mlから１．１１g/mlの間の密度を有する。典型的には、該密度は、実施例１に定義されるように連続イオジキサノール勾配での沈降によって測定することができる。
【００７１】
ウイルス膜融合タンパク質および／またはリプログラミング転写因子の一過性過剰発現が用いられる場合、微小胞は、典型的にはトランスフェクションの４８〜７２時間後に細胞上清から回収される。
【００７２】
典型的には、本発明による微小胞は、本発明による真核細胞の細胞上清の（例えば孔径０．４５μmのフィルターを用いた）濾過および超遠心分離、例えば１１０，０００ｇで１．５時間の超遠心分離によって単離されることがある。
【００７３】
好都合には、本発明による微小胞は、それらがターゲット細胞に物質を移行させる能力を失わずに凍結および−８０℃で保存することができる。
【００７４】
別の態様では、本発明による該微小胞は、該リプログラミング転写因子をコードする核酸を含まない。
【００７５】
好ましい態様では、本発明による微小胞はウイルスフリーである。
【００７６】
最初に免疫系細胞について記載されたが、細胞から放出された微小胞は、in vivoで多数の体液から見出される（Simpson et al. Proteomics 8, 4083-4099 (2008)）。多数の研究が、免疫反応および細胞間コミュニケーションのモデュレーションに果たすこれらの微小胞の役割を強調した。
【００７７】
理論に縛られることを望むわけではないが、本発明の微小胞がエキソソーム様小胞であって、ウイルス膜融合タンパク質の存在によって、該微小胞が微小胞中に含有される物質をターゲット細胞に効率的に送達できるようになると考えられている。
【００７８】
本発明は、また、以下のステップ：
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によって、ターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって、該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００７９】
本明細書に使用される「エコトロピック」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有する。エコトロピックウイルスは、それが由来する種のホスト中でのみ複製することができるレトロウイルスである。より具体的には、本明細書に使用される「エコトロピックウイルス」という用語は、そのコグネイトレセプターであるエコトロピックレセプターＥｃｏＲを発現している細胞中でのみ複製することができるげっ歯類ウイルスを表す。
【００８０】
好都合には、該エコトロピックウイルスは、エコトロピックウイルスレセプターを発現している微小胞によってターゲティングされている細胞以外のヒト細胞に感染することができないので、操作者および環境にとって安全である。この向上したバイオセーフティーは、汚染のリスクなしにそれを操作することができることを意味する。
【００８１】
典型的には、該エコトロピックウイルスは、モロニーベースのレトロウイルスであって、該エコトロピックレセプターはｍ−ＣＡＴ１である。ｍ−ＣＡＴ１をコードする遺伝子の一例は、GenbankアクセッションナンバーＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００７５１３．３に示される。
【００８２】
本発明は、また、リプログラミング転写因子を含む本発明の微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に該リプログラミング転写因子を送達するためのin vitro方法に関する。
【００８３】
したがって本発明は、上記微小胞によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法に関する。
【００８４】
ターゲット細胞の例は、初代培養物から得られた体細胞である。典型的には、該ターゲット細胞は、体内の任意の起源の線維芽細胞、または培養条件でin vitroで植えた後に増殖可能な任意の他の細胞である。
【００８５】
本発明の微小胞の向性は、使用されるウイルス膜融合タンパク質の向性に依存する。
【００８６】
例えば、ＶＳＶ−Ｇはパントロピックであることから、ＶＳＶ−Ｇを含む本発明による微小胞は、ほぼあらゆる細胞をターゲティングする。呼吸器細胞に向性を有するウイルス膜融合タンパク質を含む微小胞は、好ましくは呼吸器細胞をターゲティングするために使用される。
【００８７】
一態様では、ターゲット細胞は患者特異的である。
【００８８】
この態様では、本発明の方法は、患者特異的ｉＰＳ細胞を生成するために使用することができる。
【００８９】
例えばｉＰＳ細胞は、ファンコーニ貧血（Raya et al. Nature 2009, 460: 53-59）；アデノシンデアミナーゼ免疫不全（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、ゴーシェ病、筋ジストロフィー、パーキンソン病、ハンチントン病などを患う患者から得ることができる。
【００９０】
患者特異的ｉＰＳ細胞は、疾患を研究するための貴重なモデルとなる。
【００９１】
さらにそれらは、エクスパンションして任意の所与の組織にさらに再分化できる自律性細胞の潜在的に無限の供給源となることから、再生療法における大きな関心対象である。
【００９２】
好ましい態様では、本発明による微小胞は、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される。特定の一態様では、ターゲット細胞および微小胞産生細胞は、真核細胞の直径よりも小さいが、関心が持たれる微小胞の直径よりも大きい直径の孔を有する有孔壁によって分離された二つの異なる区画中に物理的に局在する。好都合には、本発明による真核細胞によって産生される微小胞は、一方の区画から他方の区画に拡散してターゲット細胞に到達することができ、そこで微小胞はリプログラミング因子を送達することができるが、微小胞産生細胞はターゲット細胞から分離されたままである。
【００９３】
この技法は、単離するステップの必要なしにタンパク質をターゲット細胞に送達可能にする。
【００９４】
典型的にはいくつか（例えば、２、３、４、５、６種など）の異なるリプログラミング転写因子は、非限定的にＯｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃなどの該いくつかの異なるリプログラミング転写因子を含む、本発明のいくつかの異なる微小胞とターゲット細胞を接触させることによって、該ターゲット細胞に送達されることがある。
【００９５】
一態様では、本発明は、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃから成る群より選択される少なくとも一つのリプログラミング転写因子を含む微小胞とターゲット細胞を接触させるステップを含む、該ターゲット細胞からｉＰＳを得るための方法に関する。
【００９６】
好都合には、各微小胞は、２種類以下のリプログラミング転写因子、例えば１種類だけのリプログラミング転写因子を含む。
【００９７】
好ましい態様では、本発明は、Ｏｃｔ−４を含む微小胞、ＫＬＦ４を含む微小胞、ｓｏｘ２を含む微小胞、Ｌｉｎ２８を含む微小胞および／またはｃ−ｍｙｃを含む微小胞とターゲット細胞を接触させるステップを含む、該ターゲット細胞からｉＰＳを得るための方法に関する。
【００９８】
典型的には、該いくつかの異なる微小胞を接触させることは、同時または連続的であってもよい。
【００９９】
本発明による微小胞によって送達される少量の物質およびそれらの非遺伝的性質により、微小胞は、リプログラミング転写因子の場合のように、タンパク質の低度で一過性の存在が著しい生物学的作用に繋がりうる応用に有用である。
【０１００】
好都合には、本発明によるｉＰＳ細胞を得るための方法は、ウイルスベクターの使用を必要としないことから安全である。さらに、本発明の微小胞の非遺伝的性質のせいで、ゲノム改変のリスクがない。リコンビナントタンパク質を使用した方法に比べ、発現系（多くの場合に細菌発現系）、または該リコンビナントタンパク質の精製（リプログラミング因子の機能喪失、洗剤の使用など）に結びつくリスクはない。
【０１０１】
好都合には、本発明の方法によって入手可能なｉＰＳ細胞は、ウイルスフリー、細菌フリー、および界面活性剤フリーである。
【０１０２】
したがって本発明は、上記方法によって入手可能な人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に関する。
【０１０３】
本発明は、また、毒性作用について薬物を試験するための、または医薬品工業および化粧品工業用の創薬工程で任意の高／中／低いスループット／含量のスクリーニングを行うための上記ｉＰＳ細胞の使用に関する。本発明は、また、任意の形態の再生医療での同種移植用治療に使用するための上記ｉＰＳ細胞に関する。
【０１０４】
続いて、以下の実施例および図面により本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ａ）ｐＶＳＶ−Ｇ（レーン１）、ｐＶＳＶ−Ｇ Ｖ７２（レーン２）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲ（レーン３）、ＳｗＦｌａｇＥｃｏＲおよびｐＶＳＶ−Ｇ（レーン４）をトランスフェクションされた２９３Ｔ−ＹＦＰならびに模擬トランスフェクション（レーン５）された２９３Ｔ−ＹＦＰによって産生された濃縮微小胞のウエスタンブロット分析。ＶＳＶ−Ｇに対するＭａｂ（Ｐ５Ｄ４）、タグ付き版のＥｃｏＲを明らかにする、Sigma ｆｌａｇに対するＭａｂ（Ｍ２）、およびＹＦＰに対するＭａｂ（ＧＳＮ２４）を用いて免疫染色を行った。
【図１Ｂ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｂ）ＹＦＰ単独を発現している細胞由来の微小胞に曝露された細胞に比べた、ＶＳＶ−ＧおよびＹＦＰを発現している細胞由来の微小胞に曝露された細胞のＦＡＣＳ分析。
【図１Ｃ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｃ）野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質（ｗｔ）または融合欠損突然変異体Ｗ７２Ｖ（２種のＤＮＡクローンを試験した）のいずれかをコードするプラスミドをＨＥＫ細胞にトランスフェクションした。エクトドメインを欠失する切断形態のＶＳＶ−Ｇもまた実験に組み込んだ。トランスフェクションの４８時間後に、上清を回収し、細胞を溶解してウエスタンブロット分析に供した。プロデューサー細胞では全てのタンパク質が高度に発現されていた。しかしながら、融合欠損突然変異体ではなく、ｗｔのＶＳＶ−Ｇだけが上清中に検出された。
【図１Ｄ】ＶＳＶ−Ｇ担持微小胞へのＹＦＰ組み入れを示す図である。（Ｄ）上記のようにＨＥＫ細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションの２０時間後に０．２μg/mlのＲ１８（膜に結合する蛍光親油性化合物）を含有する培地中で６時間インキュベーションした。トランスフェクションの７２時間後に、異なる種類の細胞からの培地を収集し、透明にし、蛍光光度計によって分析して、上清中に放出された膜の量を反映するＲ１８関連蛍光の量を定量した。結果を、生細胞数によって基準化されたＲ１８値として示す。
【図２Ａ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ａ）２９３Ｔプロデューサー細胞上でのＣＤ８１発現。マウスＩｇＧアイソタイプ対照を使用した（網がけした領域）。
【図２Ｂ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｂ）濃縮された微小胞に曝露されたＨｅｐＧ２細胞上の処理１時間後のＣＤ８１発現。未処理ＨｅｐＧ２も同様にラベリングした（灰色に網がけした対照）。
【図２Ｃ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｃ）様々な用量の微小胞で処理されたＨｅｐＧ２細胞におけるＨＣＶｐｐトランスダクションの増強。ＹＦＯをコードするＨＣＶｐｐを２９３細胞において産生させ、ＨＵＨ７．２細胞に対して８×１０ｅ４トランスダクションユニット（ＴＵ）/mlで予備力価検定した。図にＨｅｐＧ２における力価を示すが、その力価は、ＨｅｐＧ２が曝露された微小胞の量と共に増加する。
【図２Ｄ】ＣＤ８１／ＶＳＶ−Ｇでコーティングされた微小胞の生化学的および機能的分析を示す図である。（Ｄ）ＣＤ８１担持微小胞の密度分析。膜脂質をラベリングする蛍光体であるオクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）と共に培養された２９３Ｔ細胞において微小胞を産生させた。濃縮された微小胞をイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、ＳＷ４１ローターを用いてそれを４１０００rpmで１２時間遠心分離した。次に、０．５ｍｌの画分２０個を収集し、各画分の１／２０をウエスタンブロットによって半ネイティブ条件下で分析した。画分１３〜２０についてのＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１の免疫ラベルを示すが、他の画分では免疫ラベルが存在しなかった（図示せず）。
【図３Ａ】ゲシクル（gesicle）の特徴づけを示す図である。（Ａ）イオジキサノール密度勾配で収集された画分における膜関連蛍光。濃縮されたＶＳＶ−Ｇゲシクルをイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離した。チューブの底から５００μlの画分２０個を収集した。表示のように画分１は密度１．４６に、画分２０は密度１．０７に対応する。各画分の１／５（１００μl）を秤量し、９６ウェルプレートに移行させてから蛍光光度計で分析した。図に、５６０nmでＲ１８を励起させたときの５９０nmでの発光値を示す。
【図３Ｂ】ゲシクル（gesicle）の特徴づけを示す図である。（Ｂ）ＹＦＰおよびＣＤ８１担持ゲシクルの特徴づけ。上欄：密度勾配で収集された画分におけるＹＦＰ関連蛍光の分析。ＹＦＰ陽性細胞で産生された濃縮ＶＳＶ−Ｇゲシクルをイオジキサノール連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離した。チューブの底から５００μｌの画分２０個を収集したが、表示のように画分１は密度１．３に、画分２０は密度１．０９に対応する。各画分の１／５（１００μl）を秤量し、９６ウェルプレートに移行させてから蛍光光度計で分析した。図に、４９５nmでＹＦＰを励起させたときの５３３nmでの発光値を示す。下欄：ヒト細胞におけるＹＦＰの偽トランスダクション（pseudotransduction）の分析。１２ウェルプレート中で培養された１×１０ｅ５個のＨＥＫ細胞上に各画分の１／１０を重ね入れた。２４時間後に細胞をＦＡＣＳによって分析した。図に、異なる画分に曝露された各細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図４Ａ】ＥｃｏＲ担持ゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲ送達を示す図である。（Ａ）ｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドの図示（図中、ｐＣＭＶはヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターを、ＵＳｉＴはユニバーサルｓｉＲＮＡによってターゲティングされる三つの繰り返し配列のコンカテマーを、ＰＡはＳＩＶポリアデニル化シグナルを表す）。下に表示されるｍＲＮＡはＵＳｉＴ配列を備えるが、その配列は、ユニバーサルｓｉＲＮＡによって仲介される分解にｍＲＮＡを高度に感受性にする。
【図４Ｂ】ＥｃｏＲ担持ゲシクルによるヒト細胞へのＥｃｏＲ送達を示す図である。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１ゲシクルで処理された２９３Ｔ細胞に対する、ＭＬＶエコトロピックエンベロープでシュードタイピングされた、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターの力価。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルで３７℃にて１時間処理した。ＰＢＳで２回洗浄後に、ＭＬＶエコトロピックエンベロープ（レーン１、２および３）またはＶＳＶ−Ｇエンベロープ（レーン４）でシュードタイピングされたＧＦＰレンチベクター調製物１００μlを細胞にトランスダクションした。トランスダクションの３日後に、ＦＡＣＳによって細胞を分析し、ベクター調製物の力価を計算し、３回の異なるトランスダクションアッセイの平均として示す。
【図５】ｍＣＡＴ−１担持ゲシクルの生化学的および機能的分析を示す図である。ＶＳＶ−Ｇおよびマウス白血病ウイルスエコトロピック株についてのレセプターであるタグ付き版ｍＣＡＴ−１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションしてゲシクルを調製した。細胞培地を２４時間後に交換し、その翌日に収集した。上清を透明化してから、ＳＷ−４１ローターを用いて３５０００rpmで１時間３０分超遠心分離した。ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、凍結してから密度精製工程を行った。イオジキサノール連続勾配による速度ゾーン遠心分離：粗濃縮小胞をOptiprep連続勾配（２１５mMスクロース、２mM ＥＤＴＡ、１０mMトリスＨＣＬ（ｐＨ８）中の６％イオジキサノール／５mMスクロース、２mM EDTA、１０mMトリスＨＣＬ（ｐＨ８）中の５６．４％イオジキサノール）上に重層し、ＳＷ４１ローターを用いて４１０００rpｍで１２時間遠心分離した。勾配の底から画分（０．５ml）を順次収集し、４℃で保存してからウエスタンブロット分析および機能アッセイを行った。各画分の１００μlを慎重に秤量することによって画分の密度を測定した。ＭＯＰＳ緩衝液中での４〜１２％ビストリスNuPageゲル（Invitrogen）泳動を用いて、画分１２〜２０のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。各画分５μｌを分析した。ニトロセルロース膜上に電気ブロット後に、１／１０００に希釈された、ＶＳＶ−Ｇに対するペルオキシダーゼコンジュゲーション型抗体（Ｐ５Ｄ４、Sigma）または１／１０００のペルオキシダーゼコンジュゲーション型抗Ｆｌａｇ（Sigma)（両方とも室温で１時間インキュベーション）によってタンパク質を明らかにした。画分の生物学的活性を評価するために、２４ウェルプレートのウェル１個あたり１×１０ｅ５個蒔かれた２９３Ｔ細胞に各試料３０μlを添加した。１時間後に、培地を、エコトロピックエンベロープでシュードタイピングされた、ＧＦＰをコードするレンチベクターを含有する上清２００μlを補充された新鮮培地２００μlに取り替えた。トランスダクションの４８時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって蛍光値（ＭＦＩ）を分析した。
【図６】ゲシクル処理されたヒト細胞に移行したｍＣＡＴ−１の消失を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を未飽和用量のＥｃｏＲ−ゲシクルに３７°で１時間曝露した。２回洗浄後に、ゲシクル曝露の５分、１２時間、２４時間または４５時間後に、エコトロピックエンベロープでシュードタイピングされたＧＦＰレンチベクターを細胞にトランスダクションした。ＥｃｏＲを安定発現している２９３Ｔ細胞に同じトランスダクションアッセイを行い、ターゲット細胞の分裂によるレンチベクター力価の漸減を測定した。５分の時点で得られたトランスダクション値（１００％）に対するトランスダクション効率のパーセンテージとして結果を示す。全ての値を細胞分裂速度に関して補正した。
【図７Ａ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ａ）ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞におけるｍＣＡＴ−１の免疫染色。
【図７Ｂ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ｂ）ｍＣＡＴ−１をトランスフェクションされたターゲット細胞でのＧＦＰレンチベクターを用いたトランスダクションアッセイ。トランスダクションの７２時間後にＦＡＣＳによってトランスダクション値を分析したが、ｓｉ−ＣＴＬ細胞についてのトランスダクション値を効率１００％に設定した。ｓｉ−ｍＣＡＴで処理された細胞ではＥｃｏＬＶトランスダクションの７０％が阻害され、一方でｇＬＶ介在性トランスダクションはほとんど影響されない（８％の阻害）。ターゲット細胞におけるｍＣＡＴ ｍＲＮＡの特異的分解は、ゲシクルによって移行したＥｃｏＲ機能にほとんど影響しない。
【図７Ｃ】ＥｃｏＲ ｍＲＮＡの特異的分解はゲシクルによって導入されたＥｃｏＲの機能に影響しないことを示す図である。ｓｉ−ｍＣＡＴの機能検証。ｍＣＡＴ−１に対して設計された合成ｓｉＲＮＡを、ｆｌａｇ付きｍＣＡＴ−１をコードするプラスミドと共にヒト細胞にトランスフェクションした。次に、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞およびｓｉ−ＣＴＬ細胞のｍＣＡＴ発現ならびにエコトロピックレンチウイルスベクター（ＥｃｏＬＶ）（黒棒線）およびパントロピック対照レンチウイルスベクター（ｇＬＶ）（灰色棒線）のトランスダクションに対するそれらの細胞の許容性についてそれらの細胞を調べた。（Ｃ）ｍＣＡＴゲシクルで処理されたヒト細胞におけるＧＦＰエコトロピックレンチベクターを用いたトランスダクションアッセイ。ｍＣＡＴ小胞によって処理され、ｓｉ−ｍＣＡＴを担持する細胞は、ＥｃｏＬＶトランスダクションに高度に許容性のままである（対照の８７％）。これは、ＥｃｏＲの機能が、汚染ｍＲＮＡでもプラスミドＤＮＡでもなく、微小胞中に含有されるｍＣＡＴタンパク質によって主に提供されることを示す。
【図８】ＥｃｏＲ−ゲシクルによって改変された細胞におけるエコトロピックレンチウイルスのトランスダクションに及ぼすクロロキンの作用を示す図である。エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキン（ＣＱ）の存在下または不在下でＥｃｏＲゲシクル（ＥｃｏＲ−Ｇｅｓ）によってｍＣＡＴ−１タンパク質が送達されたトランスデューサーＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して、エコトロピックエンベロープ（Ｅｃｏ）でシュードタイピングされた、ＹＦＰをコードするレンチウイルスベクターを使用した（レーン３）。対照として、ＥｃｏＲが安定発現されているトランスデューサー２９３Ｔ細胞に対してエコトロピックシュードタイプを使用した（安定ＥｃｏＲ、レーン２）。エンドソーム酸性化に及ぼすＣＱの作用を調べるために、ＶＳＶ−Ｇレンチベクターを使用してその薬物で処理されたか、または処理されていないターゲット細胞にトランスダクションを行い、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプの高いｐＨ依存性を説明した（レーン１）が、エコトロピックシュードタイプは薬物処理されても効率的なままである。トランスダクションの７２時間後にＦＡＣＳによって測定されたときの、異なる細胞種類における相対ＹＦＰトランスダクション効率として結果を示す。
【図９】ゲシクルによるｔＴａの送達を示す図である。ＴＥＴトランス活性化タンパク質（ｔＴＡｏｆｆ）の転写機能を検出するために、本発明者らは、ＴＥＴオペレーターのコントロール下でｅＧＦＰを安定発現しているレポーター細胞系を作出した。ｔＴＡのトランスフェクションは、模擬トランスフェクションされた細胞に比べてレポーター細胞系でのｅＧＦＰ発現を活性化した（ｔＴＡレーン）。ｔＴＡとＶＳＶ−Ｇ（ｗｔ）またはその融合非コンピテント突然変異体Ｖ７２とを過剰発現している細胞で産生されたゲシクルを濃縮し、異なる用量でレポーター細胞系上に重ね入れた。ｗｔ ＶＳＶ−Ｇを収容しているｔＴＡゲシクルの用量増加は、ＧＦＰの発現増強を招いた。このシグナルは、培地中にドキシサイクリンを導入することによって打ち消すことができた。ゲシクルの２４時間後のＦＡＣＳによって分析されたＭＦＩとして結果を示す。
【図１０】時間の関数としてのゲシクル介在性ｔＴＡ移行効率を示す図である。ＨＥＫレポーター細胞系Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレートに植え（ウェル１個あたり細胞１×１０ｅ５個）、ｔＴＡゲシクル（総タンパク質５０μg）で処理した。曝露時間は５分から４時間の範囲であった。曝露後に、小胞含有培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、２４時間後のＧＦＰ分析のために培養状態を維持した。ｔＴＡ移行効率は、３時間まで曝露時間と共に徐々に増加し、３時間が最適曝露時間である。
【図１１】ＶＳＶ−Ｇタンパク質が２９３Ｔ細胞からの小胞の放出および関心が持たれるタンパク質の放出を強化することを示す図である。膜タンパク質の放出：ＶＳＶ−Ｇの存在下または不在下で産生された小胞に組み入れられたマルチスパン膜タンパク質であるｍＣＡＴ−１のＷＢ分析。小胞ペレット中のｍＣＡＴ−１の免疫ラベリングから、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞に導入された場合ｍＣＡＴ−１の放出が劇的に増加していることが示される。細胞質タンパク質の放出：細胞質タンパク質アクチンの放出を検討して、異なるバッチの小胞調製物に対して類似の生化学分析を行った。本発明者らは、模擬小胞に比べてＶＳＶ−Ｇがアクチンの放出を著しく強化することを確認する。
【図１２】共培養実験において孔径３μｍのインサートを通過するゲシクル介在性タンパク質の移行を示す図である。本発明者らは、様々な組み合わせのプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ細胞をレポーターＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞系と共に同じ培地中で培養した。図示したように、プロデューサー細胞を下部の６ウェル皿の中に、レポーター細胞系を上部インサート中に入れるように、細胞を孔径３μｍのフィルターによって分離した。担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇコードプラスミドまたは融合欠損ＶＳＶ−Ｇと共にｔＴＡ発現プラスミドをプロデューサー細胞に共トランスフェクションした。４８時間共培養後に、インサートを取り外し、レポーター細胞系をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析してｔＴＡの送達を評価した。結果をＴｅｏ−ＧＦＰ細胞系でのＭＦＩとして示す。
【図１３Ａ】昆虫細胞由来微小胞の特徴づけを示す図である。Ｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させることによってＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に、それらをイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離し、小胞をその密度に応じて沈降させた。チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。密度勾配は、グラフＡからｄ＝１．３〜ｄ＝１．０５の範囲で認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、バキュロウイルスがどこで沈降したかを確認した。感染の３日後に、ＦＡＣＳによってｓｆ９細胞を分析し、バキュロウイルスを力価検定した。Ａ（黒色棒線）に示される結果は、ウイルスが沈降したことを示した。各画分のＧＦＰ移行能を分析した。ＧＦＰは画分１４〜１９中に含有され、これは部分的にウイルス含有画分と重複している。
【図１３Ｂ】昆虫細胞由来微小胞の特徴づけを示す図である。Ｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させることによってＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に、それらをイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離し、小胞をその密度に応じて沈降させた。チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。密度勾配は、グラフＡからｄ＝１．３〜ｄ＝１．０５の範囲で認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、バキュロウイルスがどこで沈降したかを確認した。感染の３日後に、ＦＡＣＳによってｓｆ９細胞を分析し、バキュロウイルスを力価検定した。Ａ（黒色棒線）に示される結果は、ウイルスが沈降したことを示した。各画分のＧＦＰ移行能を分析した。ＧＦＰは画分１４〜１９中に含有され、これは部分的にウイルス含有画分と重複している。
【図１４】ｔＴａ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）を示す図である。ｔＴＡ−バキュロウイルスに感染させたＨｉｇｈ５細胞でｔＴＡ微小胞を産生させた。小胞を濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１０倍希釈し、１００μlのＰＢＳ中で行われるアッセイに供した。０．５当量のリン脂質（Phospholip）ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）または対照抗体（ＧＳＴ）の系列希釈物と共に３７℃で２時間インキュベーションした。次に、小胞をＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（ｔＴＡが細胞に導入された後にＧＦＰを発現）上に重ね入れた。２４時間後に、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、ＧＦＰの発現を定量した。結果を全体集団（global population）ＭＦＩとして示す。
【図１５】ｔＴＡ微小胞を用いた用量反応を示す図である。ｔＴＡ昆虫小胞を濃縮し、前記のように精製し、−８０°で保存した。漸増する用量の小胞を使用してＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞系にｔＴＡを送達し、小胞の２４時間後にターゲット細胞から検出されたＧＦＰシグナルの増加をもたらした。ドキシサイクリン処理細胞は、ＴＥＴ系の予想された誘導性を反映するバックグラウンド蛍光を示した。
【図１６Ａ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ａ）バキュロウイルス構築物。
【図１６Ｂ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｂ）ｔＴＡレポーター細胞系でのプロモーターによって推進されるｔＴＡのＧＦＰ発現。
【図１６Ｃ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｃ）ゲシクル中へのＧＰ６４およびｔＴＡの放出。
【図１６Ｄ】ヒト細胞でのｔＴＡの移行が、バキュロウイルスにコードさせることによってではなく、昆虫細胞由来微小胞によって達成されることを示す図である。（Ｄ）ｐＨまたはＣＭＶ精製微小胞を用いた処理に対するｔＴＡレポーター細胞系でのＧＦＰ発現。
【図１７】ｉＰＳ因子含有微小胞のウエスタンブロット分析を示す図である。記載したようにＨＥＫ細胞でヒト微小胞を調製し、溶解させ、ＳＤＳ ｐａｇｅによって分析した。各試料の２用量をロードした（Bradfordによって測定するとき４μgおよび２０μgの総タンパク質量に対応する２μlおよび１０μlの１００×調製物）。ａｂｃａｍ抗体を使用して免疫染色を行った（参照を含む）。
【図１８Ａ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ａ：アンホトロピックおよびエコトロピックなリプログラミングプロトコールの図示。エコトロピックなプロトコールでは、感染の１．５時間前にＥｃｏＲレセプターを含有するゲシクルを添加した。両方のプロトコールで、細胞をゼラチン上に再度植えた日を０日目（ｄ０）と定義する。１日目に培地をｈＥＳＣ培地＋ＶＰＡに切り替える。ＶＰＡ処理を１０日間維持し、次にｉＰＳクローンが出現するまで細胞を古典的ｈＥＳＣ培地中で培養する。
【図１８Ｂ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｂ：１日目の感染線維芽細胞（倍率×４）。
【図１８Ｃ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｃ：２１日目に出現中のｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１８Ｄ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｄ：最初の釣り上げから継代３回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１８Ｅ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｅ：アンホトロピックトランスダクションによって得られたクローンのＳＳＥＡ−４免疫染色（多能性マーカー）。
【図１８Ｆ】ＥｃｏＲゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｆ：エコトロピックトランスダクションによって得られたクローンのＳＳＥＡ−４免疫染色（多能性）。
【図１９Ａ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ａ：リプログラミングプロトコールの図示。ｃ−Ｍｙｃタンパク質を含有するゲシクルを、三つの他のリプログラミング因子（Ｏｃｔ−４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４）を発現しているウイルスによるトランスダクションの６および３６時間後に添加した。細胞をゼラチン上に再度植えた日を０日目（ｄ０）と定義する。１日目に培地をｈＥＳＣ培地＋ＶＰＡに切り替えた。ＶＰＡ処理を１０日間維持し、次にｉＰＳクローンが出現するまで細胞を古典的ｈＥＳＣ培地中で培養した。トランスダクションの４週間後に１個のクローンを釣り上げた。
【図１９Ｂ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｂ：最初の釣り上げから継代５回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×４）。
【図１９Ｃ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｃ：最初の釣り上げから継代５回目の樹立ｉＰＳクローン（倍率×１０）。
【図１９Ｄ】ｃ−Ｍｙｃゲシクルを使用した線維芽細胞のｉＰＳへのリプログラミングを示す図である。Ｄ：未分化マーカーＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１の発現を示す、継代５回目のｉＰＳクローンのフローサイトメトリー分析。
【０１０６】
実施例
実施例１
要約
本実施例は、水疱性口内炎ウイルスのＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で被覆され、外因性タンパク質をヒトターゲット細胞に送達するために使用されたエキソソーム様小胞の操作について記載する。これらの粒子は、密度１．１g/mlで沈降し、細胞質タンパク質、膜タンパク質および転写因子を効率的にパッケージングすることができる。膜ｍＣＡＴ−１タンパク質およびｔｅｔトランス活性化因子を含むモデル分子は、微小胞処理された場合のヒトターゲット細胞に効率的に送達された。小胞介在性の偽トランスダクションは、一過性タンパク質発現に繋がり、ｍＲＮＡまたはＤＮＡの移行を原因としなかった。本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させる薬物であるクロロキンがタンパク質の移行を無効にしたことを示したが、これは、ＶＳＶ−Ｇによって誘導される融合が送達メカニズムに関与したことを示している。
【０１０７】
ＶＳＶ−Ｇ融合誘発エンベロープは偽トランスダクションの主要な決定因子である
本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇの発現が偽トランスダクション可能な粒子の産生に繋がることができるかどうかを試験した。ＹＦＰを安定発現しているＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｙ）に真核生物発現ベクターであるｐＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションした。２日後に上清を収集し、濾過し、超遠心分離によって濃縮した。対照として、模擬トランスフェクションされた２９３Ｔ−Ｙ細胞の上清に同じ工程を適用した。二つの濃縮調製物をナイーブな２９３Ｔ細胞に添加し、１時間曝露後にそれを洗浄した。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析して、２集団での蛍光を測定した。本発明者らは、対照調製物に曝露された細胞ではなく、ＶＳＶ−Ｇ調製物に曝露された細胞でのＹＦＰの偽トランスダクションを観察することができた（図１−Ｂ）。二つの試料の生化学分析から、ＶＳＶ−Ｇ調製物では大量のＹＦＰが沈降したが（図１−Ａレーン１）、一方で模擬トランスフェクションされた調製物ではＹＦＰがほぼ検出不能であった（レーン５）ことが明らかとなった。これらのデータは、ＶＳＶ−Ｇがプロデューサー細胞の細胞質成分を含有する沈降可能な粒子の激しい放出の原因であることを示している。そのうえ、これらの粒子は、ターゲット細胞にこの物質を送達する能力があるように思われた。細胞が、粒子で処理されたすぐ後に洗浄され、２４時間の成長の後にトリプシン処理および分析されたことから、本発明者らは、ＹＦＰシグナルが細胞内にあって、細胞表面に吸着した蛍光粒子が原因ではないと仮定した。これらのＶＳＶ−Ｇ微小胞を、実施例１全体を通じてゲシクルと呼ぶ。
【０１０８】
追加的な観察：融合をトリガーできないＶＳＶＧ単一アミノ酸突然変異体（ＶＳＶＧ Ｖ７２）１４をこの系で試験したが、その突然変異体は、沈降したペレット中に組み入れられていなかった（図１レーン２）。別のウエスタンブロット実験は、ｗｔ−ＶＳＶ−Ｇが細胞および上清の両方で検出可能であったのとは対照的に、この突然変異体がプロデューサー細胞では発現されたが、上清中からは検出不可能であったことを示した（図１Ｃ）。これは、ＶＳＶ−Ｇ微小胞の産生がプロデューサー細胞における融合コンピテント形態のＶＳＶ−Ｇを必要とすることを実証している。
【０１０９】
ＣＤ８１テトラスパニンタンパク質の偽トランスダクション
濃縮調製物によるＹＦＰなどの細胞質タンパク質の細胞間移行は、２９３Ｔ−Ｙ細胞が、脂質層によって囲まれ、可能性があることには膜タンパク質のような２９３Ｔ細胞の他のタンパク質で被覆されたＹＦＰ担持小胞を産生したという考えを支持している。この仮説を検証するために、本発明者らは、２９３Ｔ細胞にＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションすることによって新しいバッチのゲシクルを調製し、この濃縮調製物を使用して、エキソソームに特徴的で、２９３Ｔ細胞上に豊富に発現されるテトラスパニンタンパク質であるＣＤ８１タンパク質の移行について検討した（図２Ａ）。結果として生じた物質を、ＣＤ８１を欠如したヒト肝細胞系であるＨｅｐＧ２細胞に適用した。本発明者らは、ゲシクルに１時間曝露されたＨｅｐＧ２細胞がＣＤ８１免疫ラベリングで陽性染色されたことを示したが、これは、そのタンパク質がプロデューサーからターゲット細胞に移行したことを示している（図２．Ｂ）。
【０１１０】
ＨｅｐＧ２での外因性ＣＤ８１の導入は、ＨＣＶエンベロープでシュードタイピングされたレトロウイルスベクター（ＨＣＶｐｐ）をこの細胞系にトランスダクションさせることが知られている（Zhang. et al. Journal of virology 78、1448-1455 (2004)）。実際にＣＤ８１は、Ｅ２糖タンパク質によって認識されるＨＣＶレセプターの一つとして記載されている。したがって、ＣＤ８１の移行をさらに検証するために、本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞を様々な用量のゲシクルに曝露し、ＨＣＶｐｐ介在性トランスダクションに対するそれらの許容性をナイーブなＨｅｐＧ２細胞と比較して調べた。本発明者らは、ＨＣＶｐｐトランスダクションに対するＨｅｐＧ２の許容性が細胞に導入されたゲシクルの量と共に増加し（図２．Ｃ）、この実験でＨＣＶｐｐの力価を最大５倍に増加させることを示した。これは、移行したＣＤ８１タンパク質が、ゲシクルを介した輸送および移行後であってもそのＨＣＶ結合能を保持することを示している。
【０１１１】
ＹＦＰおよびＣＤ８１担持ゲシクルの特徴づけ
タンパク質移行の原因となる物質をよりうまく特徴づけるために、膜をラベルする親油性蛍光体であるオクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）と共に培養されたヒト細胞にＶＳＶ−Ｇのトランスフェクションを行ってゲシクルを産生させた。最初の濃縮ステップの後に、Ｒ１８−ゲシクルをイオジキサノールの連続勾配上に重ね入れ、３時間遠心分離して、画分のその密度に応じた分離を可能にした。収集された全ての画分１〜２０がＲ１８についての励起および発光値である５６０nmで励起後に５９０nmで蛍光を発光する能力について、それらの画分を分析した。図３Ａに示すように、画分１３〜２０からＲ１８蛍光が検出され、密度１．１１g/mlに対応する画分１７でピークであった。
【０１１２】
別の実験では、２９３Ｔ−Ｙで産生されたゲシクルを類似の方法で加工し、勾配上に重ね入れてから、収集された種々の画分中のＹＦＰ関連蛍光を分析した。図３Ｂは、ＹＦＰが主に密度１．１０〜１．１１に対応する画分１７および１８から検出されたことを示す。次に本発明者らは、どの画分が偽トランスダクションによってＹＦＰを送達することができたかを調べた。各試料の１／１０を２９３Ｔ細胞に適用し、２４時間後に蛍光の移行をＦＡＣＳで分析した。図３に示すように、偽トランスダクション決定因子は、画分１７（ｄ＝１．１１）で本質的に沈降した。別の実験では、ゲシクルを分離し、ウエスタンブロットによって分析した。密度画分の分析により、ＶＳＶ−ＧおよびＣＤ８１が、密度１．１０および１．１１g/mlに対応する画分１７および１８中に明白に豊富に存在したことが明らかになった（図２Ｄ）。ＣＤ８１分子はエキソソームに対するマーカーとして説明されていることから（Lamparski et al. Journal of immunological methods 270、211-226 (2002)）、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ担持ゲシクルが特定の種類のエキソソーム様小胞であると結論することができる。
【０１１３】
総合して、本発明者らの結果は、ＶＳＶ−Ｇをトランスフェクションされると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、密度１．１０〜１．１１g/mlで沈降可能な、膜で囲まれたゲシクルを産生したこと、およびこれらのエキソソーム様微小胞がプロデューサー細胞からターゲット細胞に送達可能なＣＤ８１などのタンパク質を含有することを示している。
【０１１４】
ヒト細胞でのｍＣＡＴ−１のゲシクル介在性移行
ＹＦＰまたは高発現されたＣＤ８１が２９３Ｔ−Ｙ／２９３Ｔ細胞によって産生されたゲシクル中にパッケージングされるのと同じ方法で、本発明者らは、プロデューサー細胞中で過剰発現された任意のタンパク質を新生ゲシクルに受動的に組み入れることができるかどうか、および少量のこのパッケージングされた物質をヒトターゲット細胞に送達することができるかどうかを試験した。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）エコトロピックエンベロープに対するレセプターＥｃｏＲとしても知られているマウス陽イオン性アミノ酸輸送体であるｍＣＡＴ−１タンパク質をモデルとして使用してこの概念を検証した。ｆｌａｇ化版のｍＣＡＴ−１をコードしているプラスミドを構築し（図４に示すＳｗＦｌａｇ ＥｃｏＲ）、２９３Ｔ−Ｙ細胞にＶＳＶ−Ｇと一緒に共トランスフェクションし、ＥｃｏＲ担持濃縮ゲシクルを産生させ、それを続いてヒト細胞に導入した。１時間後に、曝露された細胞を洗浄し、抗Ｆｌａｇ−ＦＩＴＣ抗体を使用したＦＡＣＳ分析によって明らかになったようにＥｃｏＲの発現について陽性染色した（図示せず）。ｍＣＡＴ−１の移行をさらに検証するために、本発明者らは、ＹＦＰをコードするレンチベクターをＭＬＶ−エコトロピックエンベロープでシュードタイピングしたものに基づくトランスダクションアッセイを開発した。この糖タンパク質の特定の向性が原因で、これらのレンチベクターは、トランスフェクションによってｍＣＡＴ−１が発現しているマウス／ラット細胞またはヒト細胞だけにトランスダクションすることができる。ＥｃｏＲ−ゲシクルがヒト細胞にＥｃｏＲを効率的に送達するならば、これらは、エコトロピックＹＦＰレンチトランスダクションに許容性になるはずである。
【０１１５】
図４に示される結果に、ＥｃｏＲゲシクルで処理されたか、またはされていないヒト細胞で力価検定を行った場合のエコトロピックレンチベクター調製物の力価を与える。ナイーブな細胞はエコトロピックレンチベクターのトランスダクションに限定的であるが（レーン３）、２μg（レーン１）または４μg（レーン２）の濃縮ゲシクルで処理された細胞は、エコトロピックトランスダクションに高度に許容性になる。トランスダクション培地中のエコトロピックレンチベクター上のゲシクル−Ｇタンパク質の組み入れを避けるために、ゲシクル処理細胞を２回洗浄してからトランスダクションした。
【０１１６】
ＥｃｏＲ−ゲシクル調製物を前記密度勾配上に重ね入れ、ｍＣＡＴ−１の移行を担う画分を同定した。収集された画分をウエスタンブロットによって、それがＥｃｏＲの移行を仲介する能力について分析した（図５）。この実験で本発明者らは、密度１．１０に対応する画分１７にＶＳＶ−ＧおよびｍＣＡＴ−１が著しく豊富に存在し、トランスダクションアッセイによって明らかにされたＥｃｏＲの移行を担う主画分であることを示す。これらのデータは、密度１．１０で沈降性のＥｃｏＲ−ゲシクルがｍＣＡＴ−１タンパク質をターゲット細胞の膜に移行させたが、そこでそのタンパク質がエコトロピックエンベロープに対する結合性を保持することを示す。
【０１１７】
そのうえ、本発明者らは、本明細書でゲシクル含量および特にゲシクルの膜によって担持されるタンパク質の性質を、プロデューサー細胞のトランスフェクションによって容易にコントロールできることを示す。
【０１１８】
ゲシクルによるＥｃｏＲ送達のメカニズム
移行したｍＣＡＴ−１の寿命
次に本発明者らは、ゲシクル曝露とトランスダクションアッセイの間の遅れを変動させることによって、ヒト細胞に移行したｍＣＡＴ−１の寿命を調べた。図６に示す結果は、Ｅｃｏレセプターの機能がそのゲシクル介在性移行の約５０時間後に２９３Ｔ細胞表面から消失したことを示している。この実験は、Ｈｅｌａ、ＨＵＨ．７（図示せず）を含めた、異なるヒト細胞種類で再現され、移行したｍＣＡＴ−１の半減期は２４時間近くで不変であった。この一時性は、ゲシクルがタンパク質を送達するが、ゲシクル調製物を汚染するおそれのあるプラスミドＤＮＡを送達しないという考えを支援するものである。実際にプラスミドＤＮＡによるｍＣＡＴ−１のコードは、ターゲット細胞での転写および翻訳ステップを必要とするであろうから、トランスフェクション実験について一般に観察されるように、導入の４８時間後に発現ピークに至るであろう。
【０１１９】
ＥｃｏＲの機能は、ゲシクルに組み入れられた既製のタンパク質によって提供される。
ｍＣＡＴ−１小胞と共に移行した物質の性質を検討するために、本発明者らは、ヒトターゲット細胞をｍＣＡＴ−１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡで処理した。小胞がそれをコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡを送達するならば、それは、ｓｉ−ｍＣＡＴ処理細胞で急速に分解するであろう。
【０１２０】
ｍＣＡＴ−１の免疫染色によって明らかとなったように（図７Ａ）、ＨＥＫ細胞で共トランスフェクション実験を行うと、ｍＣＡＴ−１ ｓｉＲＮＡはｍＣＡＴの発現を抑制した。そのうえ、ｍＣＡＴ−１プラスミドをトランスフェクションされた細胞にこの特異的ｓｉＲＮＡを導入することで、細胞がエコトロピックレンチベクターをトランスダクションされる能力が大きく減少した（図７Ｂ）。ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチベクター（ｇＬＶ）は、ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方に効率的にトランスダクションされたが、エコトロピックレンチベクター（ＥｃｏＬＶ）で達成されたトランスダクション効率は、ｓｉ−ｍＣＡＴ細胞では阻害された（７０％阻害）。これらのデータは、ｍＣＡＴ−１がプラスミドによってコードされる場合、ｓｉ−ｍＣＡＴがこのレセプター機能に特異的に影響することを示している。
【０１２１】
次に、本発明者らは、ｍＣＡＴ−ｓｉＲＮＡがｍＣＡＴ−１微小胞によって送達されたレセプター機能に影響したかどうかを調べた。ｍＣＡＴ ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、４８時間後にその細胞をｍＣＡＴ−１小胞で処理した。次に、ＥｃｏＬＶを用いてトランスダクションアッセイを行い、レセプター機能を調べた（図７Ｃ）。ｓｉ−ＣＴＬ細胞およびｓｉ−ｍＣＡＴ細胞の両方にＥｃｏＬＶが効率的にトランスダクションされたことは、ｓｉ−ｍＣＡＴが小胞によって送達されたレセプター機能をほとんど抑制しないことを示している。これは、微小胞がｍＲＮＡでも汚染プラスミドＤＮＡでもなく、既製のタンパク質を移行させることによって本質的にレセプター機能を送達したことを示している。
【０１２２】
ゲシクル介在性ＥｃｏＲ送達はｐＨ依存的である
移行したＥｃｏＲタンパク質がウイルスレセプターとして機能的であるので、これは、ターゲット細胞表面にそれが存在することを意味する。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇエンベロープの性質のせいで、ゲシクルと細胞膜の間の融合は、内部の酸性区画中で起こり、ＥｃｏＲタンパク質が機能する細胞表面ではなく、内部にそれを遊離すると予想される。
【０１２３】
ＥｃｏＲの移行メカニズムを洞察するために、本発明者らは、エンドソームｐＨを上昇させ、ＶＳＶ−Ｇによってトリガーされる膜融合を妨害することが知られている薬物であるクロロキン（ＣＱ）で２３９Ｔターゲット細胞を処理してからゲシクルで処理した。図８に示されるように、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたレンチベクターは、ＣＱ処理細胞をトランスダクションできず（レーン１）、一方でエコトロピックレンチベクターは、ｍＣＡＴ−１を構成性発現している薬物処理２９３Ｔに対して使用された場合に依然として有効である（レーン２）。これらのデータは、ｐＨ依存性を表している。興味深いことに、本発明者らは、ＣＱがゲシクルによるＥｃｏＲ送達を強く阻害することを示している（レーン３）。エコトロピックレポーターレンチベクターによるトランスダクションがＣＱによって減少しないことから、この結果は、表面にＥｃｏＲを送達している細胞メカニズムにおけるＣＱ介在性の不全を反映している。
【０１２４】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、ゲシクルがターゲット細胞にインターナリゼーションされた後に、ＥｃｏＲ放出のために膜融合が必要となるエンドソーム区画中に輸送されるモデルを提案する。それらのタンパク質は、多数の内因性レセプターの運命に従い、続いて細胞膜に向けてリサイクリングされるであろう。
【０１２５】
ＴＥＴトランス活性化因子のゲシクル介在性送達
細胞質タンパク質および膜タンパク質の送達に加えて、本発明者らは、ゲシクルが古典的には核に発現されるタンパク質である転写因子をパッケージングおよび送達する能力を調査した。このために、コグネイトプロモーターであるＴｅｔオペレーター（ＴＥＯ）の転写を活性化する合成転写因子であって、細胞培養培地へのテトラサイクリン／ドキシサイクリンの導入によってスイッチオフすることのできるＴＥＴｏｆｆトランス活性化因子（ｔＴＡ）をコードするプラスミドを共トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞でゲシクルを産生させた（Gossen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 5547-5551 (1992)）。次に、ｔＴＡをロードされたゲシクルの漸増する用量を、Ｔｅｔオペレーターのコントロール下のｅＧＦＰ遺伝子から構成される発現カセットを収容するレポーター細胞上に重ね入れた。図９に示される結果は、レポーター細胞系の蛍光が処理の２４時間後にｔＴＡゲシクルによって活性化されることを示している。蛍光シグナルはゲシクルの用量と共に増加し、最高用量では、ｔＴＡ構築物をトランスフェクションされたレポーター細胞で得られたシグナルの約５０％に達する。本発明者らは、処理された細胞での転写活性化が依然としてドキシサイクリン処理を感知可能であることに留意する。これは、ｔｅｔトランス活性化因子タンパク質がゲシクル中にうまくパッケージングされ、レポーター細胞系に移行したことを示す。
【０１２６】
曝露時間の関数としてのゲシクル介在性ｔＴＡの移行効率
ＨＥＫレポーター細胞系Ｔｅｏ−ＧＦＰを１２ウェルプレート（細胞１０５個）に植え、ｔＴＡゲシクルで処理した（ウェル１個あたり５０μgの総タンパク質）。曝露時間は５分から４時間の範囲であった。曝露後に、小胞含有培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、培養を維持して２４時間後にＧＦＰ分析に供した。ｔＴＡ移行効率は、曝露時間と共に３時間まで徐々に増加し、３時間が最適曝露時間である（図１０参照）。
【０１２７】
ゲシクルの産生およびアッセイ（dosage）方法
ヒトＥｃｏＲ−ゲシクルの産生およびアッセイ
リン酸カルシウム法を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによってヒトゲシクルを産生させた。細胞を１０cm皿に３×１０６個蒔き、皿１枚あたり１２μgのＶＳＶ−Ｇコードプラスミドおよび１２μgのｍＣＡＴ−１コードプラスミドを共トランスフェクションした。２４時間後にトランスフェクション培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に小胞含有上清を収集し、プールし、０．４５umフィルターを通過させて濾過し、ＳＷ４１ローターを用いて２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分間超遠心分離した。ペレット化した物質を最終的に冷ＰＢＳ中に再懸濁し、２００倍濃度とした。６枚の１０cm皿を使用して大規模調製を行い、２００×小胞約４００ulを生成させた。
【０１２８】
ＹＦＰ／ＣＤ８１担持小胞は、ＹＦＰを発現しているレンチベクターを予めトランスダクションされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に１５μgのＶＳＶ−Ｇプラスミドをトランスフェクションすることによって産生させた。
【０１２９】
沈降した微小胞中のタンパク質の量を定量するために、本発明者らは、ｆｌａｇ化ｍＣＡＴ−１タンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイを開発した。簡潔には、系列希釈した小胞をＰＢＳ／２％トリトンＸ１００中で溶解させ、炭酸塩被覆緩衝液（ｐＨ９．６）に入れて９６ウェルプレート（NUNC.Maxisorp）の中を一晩被覆した。ｆｌａｇ−ペプチド（Sigma）の系列希釈物を並行して無トリトン緩衝液に入れて被覆した。洗浄されたプレートを、１／１０００希釈された抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ抗体（M2 Sigma）と共に１時間インキュベーションし、ＴＭＢ基質で最終的に顕色させることでタンパク質およびペプチドを明らかにした。これらのアッセイは、本発明者らが小胞調製物中のｆｌａｇ化タンパク質の量を設定できるようにした。
【０１３０】
または、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇペプチドの系列希釈物で被覆することにより、ＶＳＶ−Ｇ Ｅｌｉｓａアッセイを計画した。そのペプチドを、ＨＲＰとカップリングした抗ＶＳＶＧ抗体（Ｐ５Ｄ４、Sigma）によって認識した。したがって、全てのＶＳＶ−Ｇ小胞を、小胞調製物１μlあたりのＶＳＶ−Ｇペプチド当量質量として表現することができる。
【０１３１】
考察
本実施例において本発明者らは、操作されたエキソソーム様小胞の使用によってヒト細胞に細胞質タンパク質および膜タンパク質を移行させる独特で簡単な方法を開発した。このゲシクル介在性タンパク質送達技法をさらに使用して、ヒト細胞に機能的転写因子を導入した。これらの微小胞の産生を、ＶＳＶ−Ｇを共トランスフェクションされた２９３Ｔプロデューサー細胞での関心が持たれるタンパク質の過剰発現によって達成した。膜タンパク質ならびに膜脂質およびアクチンが豊富に存在するという上清の分析によって明らかとなったように、ＶＳＶ−Ｇは、２９３Ｔ細胞からの小胞産生を高めると思われる（図１１）。さらに、微小胞の膜で被覆することによって、融合誘発Ｇタンパク質は、それらがターゲット細胞と接触する能力を高め、粒子と細胞膜の間で非常に効率的に融合させる。これは、ターゲット細胞中に微小胞内容物を放出する必要条件である。
【０１３２】
実施例２
共培養実験での孔径３μmのインサートを介する小胞介在性タンパク質の移行
本発明者らは、様々な組み合わせのプラスミドをトランスフェクションされたＨＥＫ細胞をＴｅｏ−ＧＦＰレポーター細胞系と一緒に同じ培地中で培養した。図示したように、産生細胞を下部の６ウェル皿の中に、レポーター細胞系を上部インサート中に入れるように、細胞を孔径３μmのフィルターによって分離した。担体ＤＮＡ、ＶＳＶ−Ｇコードプラスミドまたは融合欠損ＶＳＶ−Ｇと共にｔＴＡ発現プラスミドを産生細胞に共トランスフェクションした。４８時間共培養後に、インサートを取り外し、レポーター細胞系をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析してｔＴＡの送達を評価した。結果をＴｅｏ−ＧＦＰ細胞系でのＭＦＩとして示す（図１２）。
【０１３３】
この技法は、濃縮ステップの必要なしにターゲット細胞へのタンパク質の送達を可能にする。濃縮された小胞は、ターゲット細胞の種類に応じて有毒な場合がある。ターゲット細胞を、上部または下部チャンバー中で培養して、一定のタンパク質送達のために小胞産生細胞と共に数日間注入を行うことができる。いくつかの因子を逐次導入しなければならない場合、小胞を含有する別の浴中にインサートを簡単に移すことによって、逐次注入を行うことさえできる。
【０１３４】
実施例３
昆虫細胞の微小胞産生およびアッセイ(dosage)
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系（Invitrogen）を製造業者の説明書に従って使用してバキュロウイルスの産生を行った。簡潔には、関心が持たれるｃＤＮＡをｓｐＦＡＳＴ−１シャトルにクローニングしてから、ＤＨ１０−ＢＡＣ細菌に組み換えした。次に、バキュロウイルスＤＮＡを使用してＳＦ−９細胞にトランスフェクションして最初のバキュロ原液を生成させ、それを７２時間後に収集した（継代１回目）。このポリクローナル原液を力価１×１０７pfu/mlに達するまでさらに増幅させ（継代２回目）、それを４℃で保存し、小胞産生のために使用した。
【０１３５】
グルタミン（２０mM）およびペニシリン−ストレプトマイシン（ペニシリン２５Ｕ、ストレプトマイシン２５μg/ml）を補充された１００mlのExpress-five ＳＦＭ培地中で撹拌しながら３０℃で懸濁培養された２００×１０６個のＨＩＧＨ５細胞にバキュロウイルスを感染させて（０．５〜１のＭＯＩ）、昆虫細胞微小胞を産生させた。接種の４８時間後に培地を回収し、透明にし、孔径０．４５ｍｍのフィルターを２回通過させて濾過してから、ＳＷ−３２ローターを用いて２４０００rpm（１００．０００ｇ）で超遠心分離した。次に、沈降した物質を冷ＰＢＳ中に再懸濁し（１００×濃縮）、−８０℃で保存した。
【０１３６】
よりよく精製するために、この濁った調製物を不連続なイオジキサノール勾配上に重ね、異なる密度画分を分離させた。画分の生物学的分析は、活性な小胞が密度１．０９〜１．１１の間で沈降される収容タンパク質を移行可能であることを明らかとした。これらの画分をプールし、冷ＰＢＳを補充した最終濃縮ステップのプール後に（ＳＷ４１で３００００rpm、１時間）、高度に精製された小胞が調製された。
【０１３７】
昆虫細胞由来小胞をリン脂質−酵素ＰＡＰ５０検出キット（Biomerieux）および上記ＶＳＶ−Ｇ ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【０１３８】
昆虫細胞由来微小胞の特徴づけ
記載したようにｓｆ９細胞にリコンビナントバキュロウイルスを７２時間感染させてＧＦＰ微小胞を産生させた。濃縮後に小胞をイオジキサノール勾配上に重ね入れ、２１５０００ｇで１０時間遠心分離して小胞をその密度に応じて沈降させた。次に、チューブの底から画分を順次収集し、秤量によってその密度を測定した。図１３Ａのグラフからｄ＝１．３から１．０５の範囲の密度勾配を認識することができる。全ての画分を蛍光光度計によって分析してＧＦＰ（Ｅｘｃ４８５、Ｅｍ５１５）を検出し、ＧＦＰは本質的に画分２１から検出された（図１３Ａ、白色棒線）。画分の希釈物も使用してｓｆ９細胞に感染させ、ＧＦＰバキュロウイルスがどこで沈降したかを同定した。感染の３日後にＦＡＣＳによってｓｆ９を分析し、バキュロウイルスの力価を計算した。Ａに示される結果（黒色棒線）は、ウイルスが画分１３から画分２０の間で沈降し、ピークが画分１６であったことを示した。本発明者らは、また、ヒト細胞にＧＦＰを送達するためにその画分を使用し、２４時間後に蛍光の移行を分析した（図１３Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、ＧＦＰの移行能が画分１４〜１９に含有され、部分的にウイルス含有画分と重複することを見出した。
【０１３９】
ｔＴＡ昆虫微小胞の中和アッセイ（ＮＡ）
ｔＴＡ−バキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ５細胞でｔＴＡ微小胞を産生させた。小胞を濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁し、１０倍希釈して、１００μlのＰＢＳ中で行われるアッセイに供した。０．５当量のリン脂質ｔＴＡを、抗ｇｐ６４抗体（クローンＡｃＶ１）の系列希釈物または対照抗体と共に３７℃で２時間インキュベーションした。次に、小胞をＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞（ｔＴＡが細胞に導入されるとＧＦＰを発現）上に重ね入れた。２４時間後に、小胞に曝露された細胞をＦＡＣＳ分析し、ＧＦＰの発現を定量した。結果を全般集団ＭＦＩとして示す（図１４参照）。
【０１４０】
ｔＴＡ昆虫微小胞を使用した用量反応
ｔＴＡ昆虫微小胞を濃縮し、前記のように精製し、−８０℃で保存した。漸増する用量の小胞を使用して、ＨＥＫ ｔＴＡレポーター細胞系にｔＴＡを送達し、漸増するＧＦＰシグナルをもたらし、そのシグナルを小胞の２４時間後にターゲット細胞から検出した。ドキシサイクリン処理細胞は、ＴＥＴ系の予想された誘導性を反映するバックグラウンド蛍光を示した（図１５参照）。
【０１４１】
考察
本発明者らは、ヒト細胞由来小胞の産生が、ＶＳＶ−Ｇをコードするプラスミドおよび関心が持たれるタンパク質（ＹＦＰ、ｍＣＡＴ−１、ｔＴＡなど）をコードする別のプラスミドをプロデューサー細胞に共トランスフェクションすることで達成されたことを示した。産生系の性能を高めるために、本発明者らは、ＶＳＶ−ＧおよびｔＴＡをコードするリコンビナントバキュロウイルスを構築し、バキュロウイルス感染に高度に許容性の昆虫細胞に感染させた。そのうえＨｉｇｈ５細胞およびＳＦ９細胞は、血清なしに、または動物産物を欠如する合成培地であっても最大２×１０６/mlまで容易に懸濁培養することができる。顕著にはバキュロウイルスはヒト細胞では複製せず、導入遺伝子の発現を推進するポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞特異的であって、ヒト細胞において活性でない。
【０１４２】
本発明者らは、ｔＴＡおよびＶＳＶＧに同時感染すると、昆虫細胞がヒト細胞にｔＴＡを移行させることができる微小胞を産生することを見出した。本発明者らは、また、ＶＳＶ−Ｇは有用であるが、この工程になくてもかまわないことを見出したが、これは、別の融合タンパク質がそれと置き替わることができるであろうことを示唆している。全ての感染細胞で発現されるバキュロウイルスのエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ６４は、この役割を演じることができよう。中和アッセイを行うことによって、本発明者らは、昆虫微小胞によって仲介されるタンパク質送達をｇｐ６４抗体で中和できることを示した。
【０１４３】
さらに昆虫細胞の小胞を特徴づけるために、本発明者らは、ＧＦＰ昆虫小胞をイオジキサノール勾配上に重ね入れてそれらの密度を測定した。この工程は、混合物中に存在する異なる物質をそれらのそれぞれの密度にしたがって分離させる。この実験は、小胞含有画分がバキュロウイルス含有画分と重複することを示した。バキュロウイルスはヒト細胞中で複製することができないことが一般に認められているが、本発明者らは、ｔＴＡをコードするバキュロウイルスのわずかな発現が、レポーターターゲット細胞でのＧＦＰ発現を活性化するために十分なｔＴＡを産生することができると推測することができる。これを調べるために、本発明者らは、Ｂａｃリコンビナントを構築するために使用されたシャトルプラスミド（ｐＦＡＳＴ）中の昆虫特異的ポリヘドリンプロモーター（ｐＨ）をＣＭＶまたはＥＦＩａプロモーターによって置き換えた（図１６Ａに示す構築物）。ｐＨとは対照的に、ＨＥＫ−Ｔｅｏ ＧＦＰレポーター細胞系でのトランスフェクション実験によって明らかにされたように、それらのプロモーターはヒト細胞で高度に活性である（図１６Ｂ）。次に本発明者らは、ＣＭＶプロモーターを選択して二つのリコンビナントバキュロウイルス（ＣＭＶ１およびＣＭＶ２）を生成させ、そのウイルスを続いて増幅させ、ｓｆ９細胞に感染させるために使用した。両方のＣＭＶリコンビナントは、ｐＨリコンビナントと同じように効率的にｓｆ９細胞に感染した。これは、プロデューサー細胞溶解物で行われたウエスタンブロット分析によって明らかとなった（図１６Ｃ）。バキュロウイルスタンパク質ｇｐ６４は、使用されたプロモーターの性質に関わらず明らかに細胞溶解物から検出された。微小胞を調製したとき、本発明者らは、微小胞溶解物に同じ染色を行い、ｇｐ６４が三つの試料から高度に検出されることを立証したが、これは、ＣＭＶの取り替えがｓｆ９へのバキュロウイルス感染にもウイルス放出にもあまり影響しなかったことを示している。本発明者らは、予想通りｐＨリコンビナントがｓｆ９細胞で二つのＣＭＶリコンビナントよりも高いレベルのｔＴＡを発現することを見出した。これは、微小胞から検出されたｔＴＡの量がｐＨ溶解物よりもかなり高いことに論理的に影響した。漸増する用量のｐＨ−ｔＴＡおよびＣＭＶ−ｔＴＡ微小胞を最終的にＨＥＫ−ＴｅｏＧＦＰ細胞系上に重ね入れた。２４時間後にｔＴＡ送達の効率を反映しているＭＦＩをＦＡＣＳによって分析したが、それは、ｐＨリコンビナントを用いて産生された小胞が、ＣＭＶリコンビナントを用いて産生された小胞よりも１０倍効率的であることを明らかにした（図１６Ｄ）。これは、効率的なｔＴＡの移行がプロデューサー細胞での高レベルのタンパク質発現と相関することを示している。これは、タンパク質自体がバキュロウイルス関連微小胞によって送出されるという仮説を支持している。そのうえ、プロモータースワップによりヒト細胞でのｔＴＡバキュロウイルスの転写性能を増加させても、ターゲットにおけるｔＴＡ入手性は増加せず、これは、バキュロウイルスによって推進される転写が、送達されたｔＴＡの機能の原因とはならない（またはほとんど関与しない）ことを示している。まとめるとこれらのデータは、ヒト細胞へのｔＴＡ移行が昆虫細胞由来ｇｐ６４微小胞によって達成され、コードするバキュロウイルスによっては達成されないことを示している。
【０１４４】
実施例４：ゲシクルは細胞のリプログラミングおよび人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の産生のために使用することができる
実施例４Ａ． ＥｃｏＲ含有ゲシクルを使用したリプログラミング
細胞培養
ヒト正常成体線維芽細胞（Coriell細胞保管所から取り寄せた）は、１０％ＦＢＳ、１mMピルビン酸ナトリウムおよび２mM GlutaMAX（商標）を補充されたＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。ヒトｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞培地、すなわち２０％ノックアウト血清代替物、１０ng/ml ｂＦＧＦ、０．１mM可欠アミノ酸、５０mM β−メルカプトエタノール、２mM GlutaMAX（商標）および０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたノックアウトＤＭＥＭに入れたマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー細胞上で維持した。
【０１４５】
レトロウイルスの産生
ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４のヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有するモロニーベースのレトロウイルスベクター（ｐＭＩＧ）をAddgeneから得た。これらのプラスミドを、FuGeneを使用してＰＬＡＴ−Ａ（アンホトロピックウイルス産生用）またはＰＬＡＴ−Ｅ（エコトロピックウイルス産生用）パッケージング細胞に個別にトランスフェクションした。ＰＬＡＴ細胞培地をトランスフェクションの２４時間後に取り替えた。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μフィルターを通過させて濾過し、次に１：１：１：１の比で混合した。
【０１４６】
エコトロピックレセプター（ＥｃｏＲ）を含有するゲシクルの産生
上記のようにＶＳＶ−Ｇを安定発現している２９３Ｔ細胞からゲシクルを産生させた。
【０１４７】
多能性幹細胞の誘導
アンホトロピック誘導されたｉＰＳ細胞の生成のために、ウイルス混合物をヒト線維芽細胞に２４時間感染させ、次に、その細胞をゼラチンコートされた６ウェルプレート中のウェル１個あたり細胞３．１０ｅ４個となるように線維芽細胞培地中に再度植え、それを０日目と定義する。
【０１４８】
エコトロピック誘導されたｉＰＳ細胞を生成するために、ＥｃｏＲレセプターを含有するゲシクルを感染の１．５時間前に細胞に添加したことを除き、同じプロトコールに従った。
【０１４９】
感染後１日目から開始して、０．５mM ＶＰＡを補充されたヒトＥＳ細胞培地中で細胞を１０日間培養し、次にｉＰＳコロニーが出現するまで非補充ｈＥＳ細胞培地中で培養した。
【０１５０】
ｉＰＳ細胞系を樹立するために、感染の約３〜５週間後にＥＳ細胞様コロニーの形態に基づいてｉＰＳコロニーを釣り上げた。釣り上げられたコロニーを続いてエクスパンションさせ、ＶＰＡを有さないヒトＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー層上で維持した。解離されたヒトＥＳ単細胞およびｉＰＳ細胞の生存を高めるＲＯＣＫ阻害物質であるＹ−２７６３２を１０μMで使用して、釣り上げ後の最初のコロニーエクスパンションおよび各継代後の初日についてのｉＰＳ細胞の接種効率を高めた。
【０１５１】
アンホトロピックまたはエコトロピックなトランスダクションプロトコールのいずれかを使用して等しい数のクローンを得た。
【０１５２】
いずれかのプロトコールで得られたｉＰＳクローンをｈＥＳＣ培養条件で２０回よりも多く継代してエクスパンションさせたが、形態に変化はなかった。多能性マーカーの免疫細胞化学分析から、両方の種類のクローンでＳＳＥＡ−４についての等しい染色が示されたが（図１８）、これは、多能性幹細胞の特徴と適合した。
【０１５３】
したがって、ターゲット細胞をエコトロピックウイルスに許容性にするために、エコトロピックレセプターを含有するゲシクルを使用することができる。そのうえ、ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するために、エコトロピックウイルスは、アンホトロピックベクターに効率的に取って代わることができる。それらは、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に効率的にリプログラミングするために使用することができ、より安全な代替物に相当する。
【０１５４】
実施例４Ｂ． ｃ−ｍｙｃを含有するゲシクルを使用したリプログラミング
リプログラミング因子ｃ−ｍｙｃを含有するゲシクルの産生
ヒト微小胞を、リン酸カルシウム法を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって産生させた。細胞を１０cm皿に３×１０ｅ６個となるように蒔き、その細胞に皿１枚あたり１５μgのＶＳＶ−Ｇコードプラスミドおよび１５μｇのｃ−ＭＹＣコードプラスミドを共トランスフェクションした。トランスフェクション培地を２４時間後に取り替え、トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に小胞を含有する上清を収集し、プールし、０，４５umフィルターを通過させて濾過し、ＳＷ４１ローターを用いて２５０００rpm（１１００００ｇ）で１時間３０分超遠心分離した。ペレット化した物質を最終的に冷ＰＢＳ中で一晩再懸濁し、２００倍濃縮（上清体積／終体積）とした。６枚の１０cm皿で調製を行い、約４００μlの２００×小胞を生成させた。
【０１５５】
細胞培養
ＩＭＲ−９０ヒト正常線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ、１mMピルビン酸ナトリウムおよび２mM GlutaMAX（商標）を補充されたＤＭＥＭ高グルコース中で維持した。ヒトｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞培地、すなわち２０％ノックアウト血清代替物、１０ng/ml ｂＦＧＦ、０，１mM可欠アミノ酸、５０mM β−メルカプトエタノール、２mM GlutaMAX（商標）および０，１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたノックアウトＤＭＥＭ中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー細胞上で維持した。
【０１５６】
レトロウイルスの産生
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４のヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含有するモロニーベースのレトロウイルスベクター（ｐＭＩＧ）をAddgeneから得た。これらのプラスミドを、FuGeneを使用してＰＬＡＴ−Ａ（アンホトロピックウイルス産生用）パッケージング細胞に個別にトランスフェクションした。ＰＬＡＴ−Ａ細胞培地をトランスフェクションの２４時間後に取り替えた。トランスフェクションの４８時間後にウイルス上清を収集し、０．４５μmフィルターを通過させて濾過し、次に１：１：１の比で混合した。ヘペスおよびポリブレン（４μg/mL）をそのウイルス混合物に添加した。
【０１５７】
多能性幹細胞の誘導
ＩＭＲ−９０線維芽細胞をウイルス混合物によって感染させ、次にトランスダクションの開始から６時間後に１０μLのｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルをトランスダクション培地に添加した。トランスダクションの２４時間後に細胞をゼラチン被覆６ウェルプレートのウェル１個あたり３．５×１０ｅ４個となるように線維芽細胞培地中に再度植え、その時点を０日目と定義する。１日目に１０μLのｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルを用いた２回目の処理を行った。
【０１５８】
感染１日後から開始して、０．５mM ＶＰＡを補充されたヒトＥＳ細胞培地中で細胞を１０日間培養し、次にｉＰＳコロニーが出現するまで非補充ｈＥＳ細胞培地中で培養した。
【０１５９】
感染の約４週間後にＥＳ細胞様コロニーの形態に基づいて１個のｉＰＳコロニーを釣り上げた。続いて、釣り上げられたコロニーをエクスパンションさせ、ＶＰＡを有さないヒトＥＳ細胞培地中のマイトマイシンＣ成長停止ＭＥＦフィーダー層上で維持した。解離したヒトＥＳ単細胞およびｉＰＳ細胞の生存を高めるＲＯＣＫ阻害物質であるＹ−２７６３２を１０μMで使用して、釣り上げ後の最初のコロニーエクスパンションおよび各継代後の初日についてのｉＰＳ細胞の接種効率を高めた。
【０１６０】
ｃ−Ｍｙｃ含有ゲシクルを用いて得られたｉＰＳクローンをｈＥＳＣ培養条件で８回よりも多く継代してエクスパンションさせたが、形態に変化はなかった。多能性マーカーのフローサイトメトリー分析から、細胞数の９０％超にＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−８１についての二重染色が示されたが（図１９）、これは多能性幹細胞の特徴と一致した。
【０１６１】
したがって、リプログラミング転写因子を含有するゲシクルは、ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するためにレンチウイルスベクターに効率的に取って代わることができる。それらは、体細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に効率的にリプログラミングするために使用することができる。
【０１６２】
参考文献
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示の参照により本明細書に組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞によって分泌される微小胞とターゲット細胞を接触させることによる、該ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するための方法。
【請求項２】
前記微小胞が、前記リプログラミング転写因子をコードする核酸を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微小胞が、ウイルス構造タンパク質を含有しない、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス膜融合タンパク質がＶＳＶ−Ｇである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記リプログラミング転写因子が、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃから成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
Ｏｃｔ−４を含む微小胞、ＫＬＦ４を含む微小胞、ｓｏｘ２を含む微小胞、および／またはｃ−ｍｙｃを含む微小胞と前記ターゲット細胞を接触させるステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記微小胞が、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の方法に使用するための、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞。
【請求項９】
前記ウイルス膜融合タンパク質および前記リプログラミング転写因子を含む、請求項８記載の真核細胞によって分泌される微小胞。
【請求項１０】
ウイルス構造タンパク質を含有しない、請求項９記載の微小胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項記載の方法によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法。
【請求項１２】
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によってターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；ならびに
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む、人工多能性幹細胞を得るための方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の方法によって入手可能な人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項１４】
患者特異的である、請求項１３記載の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項１】
ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞によって分泌される微小胞とターゲット細胞を接触させることによる、該ターゲット細胞にリプログラミング転写因子を送達するための方法。
【請求項２】
前記微小胞が、前記リプログラミング転写因子をコードする核酸を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記微小胞が、ウイルス構造タンパク質を含有しない、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス膜融合タンパク質がＶＳＶ−Ｇである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記リプログラミング転写因子が、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびｃ−ｍｙｃから成る群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
Ｏｃｔ−４を含む微小胞、ＫＬＦ４を含む微小胞、ｓｏｘ２を含む微小胞、および／またはｃ−ｍｙｃを含む微小胞と前記ターゲット細胞を接触させるステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記微小胞が、ターゲット細胞と微小胞産生細胞との共培養によってin situで産生される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の方法に使用するための、ウイルス膜融合タンパク質およびリプログラミング転写因子を過剰発現している真核細胞。
【請求項９】
前記ウイルス膜融合タンパク質および前記リプログラミング転写因子を含む、請求項８記載の真核細胞によって分泌される微小胞。
【請求項１０】
ウイルス構造タンパク質を含有しない、請求項９記載の微小胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項記載の方法によってターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップを含む、人工多能性幹細胞を得るための方法。
【請求項１２】
− ウイルス膜融合タンパク質およびＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを含む微小胞によってターゲット細胞に該ＥｃｏＲエコトロピックウイルスレセプターを送達するステップ；ならびに
− リプログラミング因子をコードする少なくとも一つの遺伝子を含むエコトロピックウイルスによって該ターゲット細胞に少なくとも一つのリプログラミング因子を送達するステップ
を含む、人工多能性幹細胞を得るための方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の方法によって入手可能な人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【請求項１４】
患者特異的である、請求項１３記載の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞。
【図４Ａ】
【図１６Ａ】
【図１７】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１８Ａ】
【図１９Ａ】
【図１６Ａ】
【図１７】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１８Ａ】
【図１９Ａ】
【公表番号】特表２０１３−５１０５６３（Ｐ２０１３−５１０５６３Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３８３２６（Ｐ２０１２−５３８３２６）
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８０６４
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１０日（２０１０．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６７２２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０５８０６４
【国際公開日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【出願人】（５９１１００５９６）アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル (59)
【Ｆターム（参考）】
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